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KR101671325B1 - 신규한 고리형 뎁시펩타이드계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물 - Google Patents

신규한 고리형 뎁시펩타이드계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물 Download PDF

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KR101671325B1 KR1020150003397A KR20150003397A KR101671325B1 KR 101671325 B1 KR101671325 B1 KR 101671325B1 KR 1020150003397 A KR1020150003397 A KR 1020150003397A KR 20150003397 A KR20150003397 A KR 20150003397A KR 101671325 B1 KR101671325 B1 KR 101671325B1
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김종원
김승민
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Abstract

본 발명은 신규한 고리형 뎁시펩타이드계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규한 고리형 뎁시펩타이드계 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 살모넬라균(Salmonella typhimurium)에 대한 저해활성을 나타내므로, 항균용 조성물, 항균용 약학적 조성물, 항균용 사료 조성물 또는 항균용 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

신규한 고리형 뎁시펩타이드계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물{Novel cyclic depsipeptide-based compound, separation method thereof, and antibacterial pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient}
본 발명은 신규한 고리형 뎁시펩타이드계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물에 관한 것이다.
항생제의 고전적 의미는 미생물에 의해 생산되는 2차 대사 산물로서, 매우 낮은 농도에서 미생물을 죽이거나 성장을 저해하는 물질을 말한다. 항생제라는 용어는 1940년대 왁스만(Waksman)에 의해 처음 사용되기 시작한 것으로, 초기에는 당시에 주로 사용되던 합성물질 설폰아미드류(sulfonamide)와 페니실린 곰팡이(Penicillium sp.)에 의해 생산되는 페니실린(Penicillin)을 구별하기 위해 사용되었다. 그 후 항균활성 (antimicrobial activity)을 나타내는 많은 물질들이 발견되고 합성됨에 따라 항생제의 의미를 일의적으로 정의하는 것이 어려워지고 있는데, 현재는 일반적으로 항생제가 낮은 농도에서 효과적으로 항생활성을 갖는 천연, 반합성 또는 합성의 화합물을 의미하는 것으로 받아들여지고 있다.
천연물의 탐색과 이용에 관한 연구는 바로 유기체의 생합성 능력을 탐색하고 이용하는 것으로서, 지금까지 주로 식물과 미생물이 그 대상의 주종을 이루어 왔다. 특히 미생물은 종의 다양성과 함께 독특하고 흥미로운 생리활성 물질을 생산하는 예가 많고 세대기간이 짧으며 대량생산이 용이하고 산업적 이용 가능성이 높아 매력있는 생리활성물질의 탐색원이 되어왔다. 미생물이 생산하는 유용물질탐색은 주로 육상미생물을 중심으로 활발하게 진행되어 그 중에는 발효공업과 의약 등에서 유용성이 확립된 것도 많이 존재한다. 또한, 최근 기존의 항생제에 내성을 보여 약효가 듣지 않는 항생제 내성세균이 출현하고 있으며, 후천성 면역 결핍증(AIDS)과 같은 새로운 질병이 증가하면서, 기존 항생제를 대체할 수 있는 새로운 약제의 개발이 시급히 요구되고 있다.
이와 관련하여, 특허문헌 1(대한민국 공개특허 10-2007-0086038)에서는 뎁시펩타이드 모핵을 갖는 화합물과 이를 함유하는 항균용 조성물에 관한 내용을 개시하고 있다. 또한, 특허문헌 2(대한민국 공개특허 10-1986-0000382)에서는 뎁시펩타이드 모핵을 갖는 화합물과 이를 함유하는 항종양 또는 항생 조성물에 관한 내용을 개시하고 있다.
기존에 개발된 항생제로는 베타-락탐계 항생제(beta-lactam class of antibiotics)로 분류되는 것으로, 페니실린보다 효과가 탁월한 것으로 인정되는 메티실린(methicillin)이 있으며, 상기 메티실린에 대해 내성을 갖게 된 세균, 구체적으로 메티실린 내성 황색 포도상구균(methicilline resistance staphyllococus aureus, MRSA)에 대한 항균효과를 갖는 것으로 개발된 반코마이신(vancomycin) 등이 있다.
그러나, 최근에는 슈퍼박테리아라고 불리우는 반코마이신 내성 황색 포도상구균(vancomycin resistance staphyllococus aureus, VRSA) 등 기존 항생물질에 대한 내성균이 증가하면서, 기존에 보고된 항생제에 대한 내성을 갖는 물질 또는 약제의 개발 필요성이 더욱 강조되고 있는 실정이다. 즉, 기존 항생제를 대체할 수 있는 새로운 작용 메카니즘을 가진 약제의 개발에 관심이 집중되고 있다. 따라서 새로운 활성물질의 개발을 위한 표적 특이적인 탐색방법 및 새로운 자원의 확보가 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 특정 세균에 대한 저해활성이 우수한 화합물을 연구하던 중, 본 발명에 따른 신규한 고리형 뎁시펩타이드계 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 살모넬라균(Salmonella typhimurium)에 대한 저해활성이 우수하여 항균용 조성물, 항균용 약학적 조성물, 항균용 사료 조성물 또는 항균용 화장료 조성물로 유용함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 살모넬라균(Salmonella typhimurium)에 대한 저해활성을 갖는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 생산하는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015002384603-pat00001
상기 화학식 1에서,
R1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, C1 -10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1 -10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주를 배양하여 균주 배양물을 얻는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 얻은 균주 배양물을 추출하여 추출물을 얻는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2에서 얻은 추출물을 정제하는 단계(단계 3);을 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화합물을 생산하는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 고리형 뎁시펩타이드계 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 살모넬라균(Salmonella typhimurium)에 대한 저해활성을 나타내므로, 항균용 조성물, 항균용 약학적 조성물, 항균용 사료 조성물 또는 항균용 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 실시예 4에서 제조한 화학식 A로 표시되는 화합물의 1H NMR 스펙트럼(800 MHz, DMSO-d6)을 나타내는 이미지이고;
도 2는 실시예 4에서 제조한 화학식 A로 표시되는 화합물의 13C NMR 스펙트럼(200 MHz, DMSO-d6)을 나타내는 이미지이고;
도 3은 실시예 4에서 제조한 화학식 B로 표시되는 화합물의 1H NMR 스펙트럼(700 MHz, DMSO-d6)을 나타내는 이미지이고; 및
도 4는 실시예 4에서 제조한 화학식 B로 표시되는 화합물의 13C NMR 스펙트럼(225 MHz, DMSO-d6)을 나타내는 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015002384603-pat00002
상기 화학식 1에서,
R1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, C1 -10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1 -10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이다.
바람직하게는,
R1은 -H, -OH, 할로겐, C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이다.
더욱 바람직하게는,
R1은 -H 또는 -OH이다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다.
본 발명의 신규한 고리형 뎁시펩타이드계 화합물들은 육상 토양 방선균, 바람직하게는 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.), 더욱 바람직하게는 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.) KCB13F003 균주로부터 제조한 화합물들로서 기존에 알려지지 않은 화학구조를 가지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주를 배양하여 균주 배양물을 얻는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 얻은 균주 배양물을 추출하여 추출물을 얻는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2에서 얻은 추출물을 정제하는 단계(단계 3);을 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주를 배양하여 균주 배양물을 얻는 단계이다. 구체적으로, 상기 균주의 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 영양원으로는 종래 방선균의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용한다. 예를 들어, 탄소원으로는 글루코오스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로는 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모 추출물, 황산 암모늄, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨가하면 매우 효과적이다. 배양방법으로는 호기적 조건에서는 진탕배양 혹은 정치배양이 가능하다.
배양 온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 조금씩 상이하지만, 일반적으로 20 내지 37℃에서 배양하는 것이 바람직하며, 25 내지 30℃에서 배양하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 균주 배양물을 용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계이다. 일반적으로 고리형 뎁시펩타이드계 화합물은 균주의 배양액뿐만 아니라 균체 부분에도 존재한다. 따라서, 균주의 배양액 및 균체에 용매를 가하여 배양액 및 균체로부터 유효성분을 추출한 후 수득된 추출액을 감압증발 방법으로 농축한다.
이때, 상기 용매는 에틸아세테이트를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 얻은 추출물을 정제하는 단계이다. 구체적으로, 상기 단계 2에서 얻은 추출물을 메탄올:물 혼합용매를 이용하여 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 실시한 후, 고속액체크로마토그래피로 정제하여 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 세균은 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 세균 또는 살모넬라 속(Salmonella sp.) 세균일 수 있으며, 더욱 바람직하게 상기 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 세균 또는 살모넬라 속(Salmonella sp.) 세균은 각각 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 또는 살모넬라균(Salmonella typhimurium)일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.
이와 관련하여, 본 발명에 따른 화학식 A 및 화학식 B로 표시되는 화합물의 항균활성을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 본 발명에 따른 화학식 A 및 화학식 B로 표시되는 화합물은 살모넬라균 및 황색포도상구균에 대하여 특이적인 항생효과를 갖는 것으로 나타났다(실험예 2의 표 4 참조).
따라서 본 발명에 따른 신규한 고리형 뎁시펩타이드계 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 살모넬라균(Salmonella typhimurium)에 대한 저해활성을 나타내므로, 항균용 조성물, 항균용 약학적 조성물, 항균용 사료 조성물 또는 항균용 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물들은 일반적으로, 본 발명의 활성 화합물을 포함하고 약학적 조제물에서 사용하기에 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 운반체를 포함하는 약학 조성물의 형태로 투여된다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 생산하는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp .) KCB13F003 균주의 분리
본 균주는 2013년 8월 울릉도 토양 시료로부터 분리하였다. 채집한 토양시료는 채집 즉시 멸균된 플라스틱 백에 넣어 실험에 사용하기까지 냉장보관하였다. 토양 시료는 멸균된 증류수를 이용하여 10배 희석하였다. 희석액 1ml를 스타치-이스트 익스트렉트 아가(Starch-Yeast extract agar) 배지에 도말하여 28℃에서 5일간 배양하여 나타난 집락을 순수분리 하였다.
< 실시예 2> 균주의 동정 및 명명
본 균주의 rRNA 서열 분석을 통하여 얻어진 염기서열의 GenBack 검색 결과, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 대하여 99.58%의 상동성을 보였다(서열변호 1). 이에, 본 균주를 스트렙토마이세스 속으로 동정하였고, 이를 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 (수탁번호 : KCTC12731BP)로 명명하였다.
< 실시예 3> 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp .) KCB13F003 균주의 배양
본 방선균 균주를 배양하기 위하여, 통상적으로 미생물이 이용하는 영양원을 함유한 배지를 준비하였다. 방선균의 조 배지 및 생산 배지로서 2.0% (w/v) 글리세롤, 1.0% (w/v) 락토스, 0.5% (w/v) 맥아추출물, 0.5% (w/v) 효모추출물, 0.1% (w/v) 칼슘카보네이트가 함유된 GLY 배지를 사용하였다.
상기 배지가 100 ml 담긴 500 ml 용량의 삼각플라스크를 121℃에서 15분 간 멸균한 후, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주의 사면배양 시험관으로부터 백금이 접종하여 3일간 진탕 배양하여 종 배양으로 하였다. 생산배지 250 ml가 담긴 1,000 ml 용량의 삼각플라스크 30개에 각각 종 배양액 3 ml를 접종하여 28℃에서 5일간 진탕 배양하였다.
< 실시예 4> 고리형 뎁시펩타이드계 화합물의 제조
상기 실시예 3에서 배양한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주의 배양물을 에틸아세테이트(15 L)로 추출하고, 수득 된 추출액을 감압건조기를 이용하여 감압증발 방법으로 농축하였다. 상기 농축액을 오디에스 알피 18에 흡착시켜 오디에스 알피 18 플래쉬 컬럼크로마토그래피(ODS RP-18 flash column chromatography)를 실시하였으며, 이때 메탄올/물(8:2-10/0, v/v)을 혼합용매로 하여 단계적으로 메탄올 농도를 증가시키면서 용출하였다. 이때 하기 화학식 A(울릉가마이드 A로 명명하였다) 및 화학식 B(울릉가마이드 B로 명명하였다)로 표시되는 화합물을 함유한 분획은 80% 메탄올에서 용출하였다. 상기 분획을 감압 농축한 후, 고속액체크로마토그래피(컬럼 : Optimapak C18, 길이 25 mm, 직경 10 mm)를 이용하여 용매로 아세토나이트릴과 물을 40:60 - 80:20 농도 구배로 용출 유속 3 ml/분 조건으로 용출하여 210 nm의 UV 흡수 피크를 17분에서 보이는 하기 화학식 A로 표시되는 화합물을 제조하였다.
[화학식 A]
Figure 112015002384603-pat00003

동일 분획을 동일한 컬럼을 이용하여 아세토나이트릴과 물을 40:60 - 52:48 농도 구배로 용출 유속 3 ml/분 조건으로 용출하여 210 nm의 UV 흡수 피크를 19분에서 보이는 하기 화학식 B로 표시되는 화합물을 제조하였다.
[화학식 B]
Figure 112015002384603-pat00004

< 실험예 1> 고리형 뎁시펩타이드계 화합물의 구조분석
상기 방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주의 배양액으로부터 제조한 화학식 A로 표시되는 화합물은 ESIMS 질량분석기(Electrospray Ionization mass spectrometer)를 사용하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한, 핵자기공명(NMR) 분석(Bruker Biospin Advance II 900 NMR spectrometer, Bruker AVANCE HD 800 NMR spectrometer, Bruker AVANCE HD 700 NMR spectrometer)을 통하여 1H NMR, 13C NMR, COSY(Correlation Spectroscopy), HMQC (1H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization), NOESY (Nuclear Overhauser effect spectroscopy) 스펙트럼을 얻고, 화합물의 분자구조를 결정하였다.
측정 결과는 하기와 같으며, 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주의 배양액으로부터 제조한 물질은 상기 화학식 A 및 화학식 B로 표시되는 신규한 고리형 뎁시펩타이드 화합물로 동정하였다.
화학식 A로 표시되는 화합물은 페닐알라닌, 글라이신, 트레오닌, N-메틸-페닐알라닌, 2-이소프로필숙신산, 5-하이드록시-6-메틸-2,3-데하이드로피페콜산, 피페콜산, 4-하이드록시피페콜산으로 구성되어 있는 신규한 뎁시펩타이드계 화합물임을 규명하였다(1H, 13C NMR 데이터를 하기 표 1에 나타내었다).
화학식 A로 표시되는 화합물 : 흰색 분말; [α]D +88.4 (c 0.05, MeOH); UV(MeOH) λmax (log ε) 204 (3.6), 210 (3.3); HRESIMS m/z 986.4861 [M+H]+ (calcd for C51H68N7O13, 986.4875).
δ C b , type δ H c , mult (J in Hz) δ C b , type δ H c , mult(J in Hz)
5- 하이드록시 -6- 메틸 -
2,3- 데하이드로피페콜산 		글라이신
1 162.3, C 29 168.0, C
2 129.4, C 30 40.5, CH2 4.54, m
3 120.2, CH 5.98, s 3.48, m
4 27.3, CH2
2.28, ovl a
2.01, ovl a 		30-NH 8.04, d (7.5)
트레오닌
5 65.2, CH 3.75, s 31 167.4, C
6 53.6, CH 3.93 d (5.7) 32 54.6, CH 4.77, d (9.1)
7 14.5, CH3 0.97, ovl a 33 71.4, CH 5.48, bd (3.1)
5-OH 4.79, ovl a 34 15.9, CH3 0.97, ovl a
피페콜산 32-NH 7.69, d (8.1)
8 170.6, C N- 메틸 -페닐알라닌
9 50.2, CH 5.56, ovl a 35 170.9, C
10 26.7, CH2 1.94, m
1.59, ovl a 		36 56.7, CH 5.57, ovl a
37 34.7, CH2 3.20, dd (14.4, 5.4)
11 19.6, CH2 1.53, ovl a
1.31, m		 2.90, dd (13.8, 11.0)
38 137.8, C
12 24.7, CH2 1.52, ovl a
1.24, m
39 129.4, CH 7.20, ovl a
40 128.8, CH 7.23, ovl a
13 42.7, CH2 3.89, bd (13.3)
3.10, t (12.5)
41 126.1, CH 7.16, ovl a
페닐알라닌 42 128.8, CH 7.23, ovl a
14 170.0, C 43 129.4, CH 7.20, ovl a
15 48.4, CH 5.15, dd (16.2, 8.4) 44 31.3, CH3 2.94, s
16 37.6, CH2 3.00, ovl a
2.82, dd (13.6, 8.5)		 2- 이소프로필숙신산
45 172.0, C
17 137.6, C 46 31.8, CH2 2.52, ovl a
18 129.4, CH 7.20, ovl a 2.10, d (14.9)
19 128.8, CH 7.23, ovl a 47 46.8, CH 2.48, ovl a
20 126.2 7.16, ovl a 48 29.2, CH 1.73, m
21 128.8 7.23, ovl a 49 19.7, CH3 0.78, d (6.4)
22 129.4 7.20, ovl a 50 19.7, CH3 0.76, d (6.4)
15-NH 8.90, d (9.4) 51 175.6, C
4- 하이드록시피페콜산
23 170.8, C
24 52.4, CH 4.29, m
25 33.2, CH2 1.82, ovl a
1.41, m
26 61.9, CH 3.65, bs
27 31.3, CH2 1.59, ovl a
1.45, m
28 34.1, CH2 4.17, m
3.19, ovl a
26-OH 4.43, bs
상기 표 1에서,
- a 겹친 신호를 나타내고;
- b 200MHz에서 측정한 것을 나타내고; 및
- c 800MHz에서 측정한 것을 나타낸다.
화학식 B로 표시되는 화합물은 페닐알라닌, 글라이신, 트레오닌, N-메틸-페닐알라닌, 2-이소프로필숙신산, 피페콜산, 4-하이드록시피페콜산의 구성은 상기 화학식 A로 표시되는 화합물과 동일하나, 화학식 A로 표시되는 화합물의 5-하이드록시-6-메틸-2,3-데하이드로피페콜산이 4,5-디하이드록시-6-메틸-2,3-데하이드로피페콜산으로 변환된 신규한 구조를 가짐을 규명하였다(1H, 13C NMR 데이터를 하기 표 2에 나타내었다).
화학식 B로 표시되는 화합물 : 흰색 분말; [α]D +69.6 (c 0.05, MeOH); UV(MeOH) λmax (log ε) 204 (3.6); HRESIMS m/z 1002.4818 [M+H]+ (calcd for C51H68N7O14, 1002.4824).
δ C b , type δ H c , mult (J in Hz) δ C b , type δ H c , mult(J in Hz)
4,5-디하이드록시-6-메틸-
2,3-데하이드로피페콜산 		글라이신
1 162.4, C 29 168.1, C
2 130.4, C 30 40.4, CH2 4.56, dd (18.0, 7.4)
3 121.4, CH 5.73, s 3.43, ovl a
4 62.9, CH 4.16 30-NH 8.04, d (7.7)
5 66.9, CH 3.60, bs 트레오닌
6 56.0, CH 4.08, m 31 167.3, C
7 14.5, CH3 1.09, d (6.6) 32 54.5, CH 4.77, dd (9.1, 2.3)
4-OH Not detected 33 71.7, CH 5.49, dd (6.0, 3.1)
5-OH 4.82, ovl a 34 15.7, CH3 0.97, d (6.2)
피페콜산 32-NH 7.79, d (8.2)
8 170.9, C N- 메틸 -페닐알라닌
9 50.2, CH 5.54, ovl a 35 170.9, C
10 26.9, CH2 1.89, m
1.57, m		 36 56.8, CH 5.53, ovl a
37 34.8, CH2 3.22, dd (14.1, 5.7)
11 19.6, CH2 1.54, ovl a
1.28, ovl a 		2.89, dd (14.1, 10.5)
38 137.8, C
12 24.7, CH2 1.50, ovl a
1.24, ovl a
39 129.3, CH 7.20, ovl a
40 128.8, CH 7.26, ovl a
13 42.6, CH2 3.91, t (14.0)
3.08, t (12.2)
41 126.2, CH 7.16, ovl a
페닐알라닌 42 128.8, CH 7.26, ovl a
14 169.8, C 43 129.3, CH 7.20, ovl a
15 48.4, CH 5.13, ovl a 44 31.5, CH3 2.92, s
16 37.6, CH2 3.00, ovl a
2.82, dd (13.6, 8.5)		 2- 이소프로필숙신산
45 171.9, C
17 137.6, C 46 31.9, CH2 2.53, ovl a
18 129.3, CH 7.20, ovl a 2.09, dd (16.1, 3.5)
19 128.8, CH 7.26, ovl a 47 46.8, CH 2.46, m
20 126.2, CH 7.16, ovl a 48 29.3, CH 1.73, m
21 128.8, CH 7.26, ovl a 49 19.7, CH3 0.78, ovl a
22 129.3, CH 7.20, ovl a 50 19.7, CH3 0.76, ovl a
15-NH 8.95, d (9.8) 51 175.6, C
4- 하이드록시피페콜산
23 170.8, C
24 52.5, CH 4.27, m
25 33.3, CH2 1.81, m
1.39, m
26 61.9, CH 3.65, bs
27 31.3, CH2 1.60, m
1.43, m
28 34.3, CH2 4.17, m
3.16, t (12.8)
26-OH 4.43, ovl a
상기 표 2에서,
- a 겹친 신호를 나타내고;
- b 200 MHz에서 측정한 것을 나타내고; 및
- c 800 MHz에서 측정한 것을 나타낸다.
< 실험예 2> 항균활성 평가
한국 유전자은행(KCTC)의 축적 배양 컬렉션에서 얻어진 균주들을 항균활성 평가 연구에 사용하였으며, 이를 하기 표 3에 나타내었다.
균주 배지
살모넬라균
(Salmonella typhimurium, KCTC 1926)		 NA
황색포도상구균
(Staphylococcus aureus, KCTC 1916)		 LB agar
엔테로코쿠스 패칼리스
(Enterococcus faecalis, KCTC 3206)		 Brain Heart Infusion Agar
바실러스 서브틸리스
(Bacillus subtilis, KCTC 1022)		 NA
대장균
(Escherichia coli, KCTC 1039)		 Brain Heart Infusion Agar
미크로코카스 루테우스
(Micrococcus luteus, IAM 1056)		 ENB Agar
캔디다 알비칸스
(Candida albicans, KCTC 7678)		 YM Agar
페니실리움 그리세오플범
(Penicillium griseofulvum, KCTC 6435)		 Malt Extract Agar
상기 표 3에서,
- NA (Nutrient Agar): [0.3% (w/v) 육 추출물(beef extract), 0.5% (w/v) 펩톤, 1.5% (w/v) 한천]을 나타내고;
- LB (Lysogeny broth) Agar: [1% (w/v) 트립톤(tryptone), 0.5% (w/v) 효모 추출물(yeast extract), 1% (w/v) NaCl, 1.5% (w/v) 한천]을 나타내고;
- Brain Heart Infusion Agar: [3.7% (w/v) BHI 배지(brain heart infusion broth, Difco 0037), 1.5% (w/v) 한천]을 나타내고;
- ENB (Enriched Nutrient Broth) Agar: [1.25% (w/v) HI 배지(heart infusion broth, difco 0038), 0.54% (w/v) 영양 배지(nutrient broth, Difco 0003), 0.25% (w/v) 효모 추출물(yeast extract)]을 나타내고;
- YM Agar : [0.3% (w/v) 효모 추출물(yeast extract), 0.3% (w/v) 맥아 추출물(malt extract), 0.5% (w/v) 펩톤, 1% (w/v) 덱스트로오스, 2% (w/v) 한천]을 나타내고; 및
- Malt Extract Agar: [2% (w/v) 맥아 추출물(malt extract), 2% (w/v) 글루코스, 0.1% (w/v) 펩톤, 2% (w/v) 한천]을 나타낸다.
항균활성 평가는 페이퍼 디스크법(paper disc method)을 이용하였다. 각 시험균액이 첨가된 아가 배지를 페트리 디쉬에 붓고 평판 배지를 만든 다음, 화학식 A 및 화학식 B로 표시되는 화합물을 멸균된 페이퍼 디스크(paper disc)에 100㎍, 50㎍, 30㎍씩 흡수시킨 후, 준비된 활성평가용 평판 배지에 올려놓고, 37℃ (살모넬라균, 황색포도상구균, 엔테로코쿠스 패칼리스, 대장균) 및 28℃ (바실러스 서브틸리스, 미크로코카스 루테우스, 캔디다 알비칸스, 페니실리움 그리세오플범)의 정치배양기에서 18시간 배양하여 디스크 주변의 클리어존(clear zone, mm)을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
균주 클리어존 (mm)
화학식 A 화합물
(㎍/disc)		 화학식 B 화합물
(㎍/disc)
100 50 30 100 50 30
살모넬라균
(Salmonella typhimurium, KCTC 1926)		 12.7 9.8 - - - -
황색포도상구균
(Staphylococcus aureus, KCTC 1916)		 17.6 13.7 10.8 13.0 - -
엔테로코쿠스 패칼리스
(Enterococcus faecalis, KCTC 3206)		 - - - - - -
바실러스 서브틸리스
(Bacillus subtilis, KCTC 1022)		 - - - - - -
대장균
(Escherichia coli, KCTC 1039)		 - - - - - -
미크로코카스 루테우스
(Micrococcus luteus, IAM 1056)		 - - - - - -
캔디다 알비칸스
(Candida albicans, KCTC 7678)		 - - - - - -
페니실리움 그리세오플범
(Penicillium griseofulvum, KCTC 6435)		 - - - - - -
상기 표 4에서,
기호 "-"는 균주에 대한 활성이 없는 것을 나타낸다.
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 A 및 화학식 B로 표시되는 화합물은 살모넬라균 및 황색포도상구균에 대하여 특이적인 항생효과를 갖는 것으로 나타났다.
따라서 본 발명에 따른 신규한 고리형 뎁시펩타이드계 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 살모넬라균(Salmonella typhimurium)에 대한 저해활성을 나타내므로, 항균용 조성물, 항균용 약학적 조성물, 항균용 사료 조성물 또는 항균용 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 화합물들은 목적에 따라 여러 형태로 제형화가 가능하다. 하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
< 제제예 1> 유연 화장수의 제조
정제수에 부틸렌 글리콜, 글리세린, 폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유, 베타인, 구연산, 구연산나트륨 및 방부제를 첨가하여 교반한 후 용해시킨 다음, 에탄올에 향료를 넣어 용해시킨 혼합물을 첨가하였다. 여기에 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물을 가하여 충분히 교반한 후, 숙성시켜 유연 화장수를 제조하였다. 하기 표 5에 각 성분의 함량을 나타내었다.
원료 함량(w/w%)
화학식 1로 표시되는 화합물 50.0
부틸렌 글리콜 7.0
글리세린 5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화 피마자유 0.2
에탄올 5.0
베타인 2.0
구연산 0.02
구연산 나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 미량
< 제제예 2> 영양 화장수의 제조
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물, 부틸렌 글리콜, 글리세린, 카르복시비닐폴리머, 아르기닌, 방부제 및 정제수를 70 내지 75 ℃에서 교반하면서 가열하였다. 여기에 75 내지 80 ℃에서 교반하여 가열시킨 스쿠알란, 부틸렌글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트, 소르비탄스테아레이트, 포리소르베이트 60, 글리세릴스테아레이트 및 스테아릴글리세레티네이트 혼합물을 가하여 유화시킨 후, 교반하면서 45 ℃정도로 냉각하면서 향료를 첨가하여 교반하였다. 그 후, 30 ℃까지 냉각한 후 숙성시켜 영양화장수를 제조하였다. 하기 표 6에 각 성분의 함량을 나타내었다.
원료 함량(w/w%)
화학식 1로 표시되는 화합물 40.0
부틸렌 글리콜 8.0
글리세린 5.0
스쿠알란 10.0
부틸렌글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트 5.0
소르비탄스테아레이트 1.5
폴리소르베이트 60 1.0
글리세릴스테아레이트 0.5
스테아릴글리시레티네이트 0.2
카르복시비닐폴리머 0.1
아르기닌 0.1
방부제 미량
향료 미량
정제수 미량
< 제제예 3> 에센스의 제조
시토 시테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 세테아레스-4 및 콜레스테롤을 교반하여 혼합한 다음, 시토 시테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 세테아레스-4 및 콜레스테롤을 교반하여 혼합하고, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물, 디세틸포스페이트, 농글리세린 및 정제수 혼합 용액을 첨가하여 유화시켰다. 그 후, 교반하면서 45℃로 냉각되면 향료를 첨가하여 교반하고 30 ℃까지 냉각시켜 숙성시켰다. 여기에 카르복시비닐폴리머, 산탄검 및 방부제를 첨가하여 안정화시킨 후 숙성시켜 에센스를 제조하였다. 하기 표 7에 각 성분의 함량을 나타내었다.
원료 함량(w/w%)
화학식 1로 표시되는 화합물 10.0
시토 스테로 1.7
폴리글리세릴 2-올레이트 1.5
세라마이드 0.7
세테아레스-4 1.2
콜레스테롤 1.5
디세틸포스페이트 0.4
농글리세린 0.5
카르복시비닐폴리머 0.2
산탄검 0.2
방부제 미량
향료 미량
정제수 미량
< 제제예 4> 연고의 제조
하기 표 8에 나타난 배합 처방에 따라, 통상의 방법에 의해 연고를 제조하였다.
성분명 역할 배합량
(중량%)
바셀린 40.0
스테아릴알코올 15.0
목랍 15.0
POE(10)올레이트 0.25
글리세릴모노스테아레이트 0.25
알란토인 항염증성분(미백성분) 1.0
소르비톨 보습성분 5.0
프로필렌글리콜 5.0
겐티아나 추출물 *1 보습성분 0.3
화학식 1로 표시되는 화합물 6.0
방부제 적당량
이온교환수 잔량
*1 : 겐티아나 추출물로서 겐티아나 추출액 BG(마루젠 제약사 제품)를 사용하였다.
한국생명공학연구소 유전자은행(KCTC) KCTC12731BP 20141209
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Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure 112015002384603-pat00005

    (상기 화학식 1에서,
    R1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, C1 -10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1 -10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이다).
  2. 제1항에 있어서,
    R1은 -H, -OH, 할로겐, C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시인 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    R1은 -H 또는 -OH인 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주를 배양하여 균주 배양물을 얻는 단계(단계 1);
    상기 단계 1에서 얻은 균주 배양물을 추출하여 추출물을 얻는 단계(단계 2); 및
    상기 단계 2에서 얻은 추출물을 정제하는 단계(단계 3);을 포함하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법.
  5. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세균은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 또는 살모넬라균(Salmonella typhimurium)인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  7. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물.
  8. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 조성물.
  9. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물.
  10. 제1항의 화합물을 생산하는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCB13F003 균주.
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