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KR101636316B1 - 미세유체 분리장치, 이를 이용한 분리방법 및 이를 포함하는 혈액 내 순환희소세포 분리키트 - Google Patents

미세유체 분리장치, 이를 이용한 분리방법 및 이를 포함하는 혈액 내 순환희소세포 분리키트 Download PDF

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KR101636316B1
KR101636316B1 KR1020140125986A KR20140125986A KR101636316B1 KR 101636316 B1 KR101636316 B1 KR 101636316B1 KR 1020140125986 A KR1020140125986 A KR 1020140125986A KR 20140125986 A KR20140125986 A KR 20140125986A KR 101636316 B1 KR101636316 B1 KR 101636316B1
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정효일
현경아
이태윤
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연세대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 미세유체 분리장치, 이를 이용한 분리방법 및 이를 포함하는 혈액 내 순환희소세포 분리키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혼합시료 내에서 처리된 자성나노입자와 특이적인 친화성을 갖는 타겟입자를 자성체를 통해 장치 내부에 고정시키고, 타겟입자가 제거된 시료를 수득하는 미세유체(Microfluidic) 기반의 분리기술에 관한 것이다.
본 발명은 혈액 시료 내 순환희소세포(Circulating rere cells, CRC), 구체적으로는 순환종양세포(Circulating tumor cells, CTC)를 수득하기 위하여 백혈구를 제거하는데 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

미세유체 분리장치, 이를 이용한 분리방법 및 이를 포함하는 혈액 내 순환희소세포 분리키트{MICROFLUIDIC APPARATUS FOR ISOLATION, METHOD FOR ISOLATION USING THE SAME, AND ISOLATION KIT FOR CIRCULATING RARE CELLS USING THE SAME}
본 발명은 미세유체 분리장치, 이를 이용한 분리방법 및 이를 포함하는 혈액 내 순환희소세포 분리키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혼합시료 내에서 처리된 자성나노입자와 특이적인 친화성을 갖는 타겟입자를 자성체를 통해 장치 내부에 고정시키고, 타겟입자가 제거된 시료를 수득하는 미세유체(Microfluidic) 기반의 분리기술에 관한 것이다.
본 발명은 혈액 시료 내 순환희소세포(Circulating rere cells, CRC), 구체적으로는 순환종양세포(Circulating tumor cells, CTC)를 수득하기 위하여 백혈구를 제거하는데 효과적으로 적용될 수 있다.
일반적으로 생화학 시료는 이종 이상의 물질이 혼재되어 존재하기 때문에 원하는 성분만을 분석하거나 혼합물에서 특정 성분만을 정제하기 위한 분리 기술은 시료의 전처리 과정에서 매우 중요하다. 특히 미세 채널, 혼합기, 펌프, 밸브 등을 단일 칩에 집적화하여 소량의 시료를 고속, 고효율로 처리하고자 하는 개념인 랩온어칩(Lab-on-a-chip) 기술이 주목받고 있다.
또한 생물학 또는 의학적 분석에 있어 중요한 세포에 기반한 임상진단(Cell-based diagnostics)은 혈액 분석, 세포 연구, 미생물 분석 등의 형태로 이루어진다. 최근 세포 연구/분석, 단백질과 DNA의 분석 기술의 발전으로 인해 이러한 임상진단 절차를 미세유체 소자(Microfluidic device)의 형태로 단일화, 집적화하려는 연구가 진행되고 있다.
미세유체 기술은 1~100㎛ 수준의 크기를 갖는 채널에서 10-6~10-12 리터의 적은 시료를 다루는 기술로서, 적은 시료의 양에도 불구하고 높은 민감도를 가지며 다른 기술들과 접목이 쉬워 효율을 극대화할 수 있을 뿐만 아니라, 제작이 용이하고 저렴하여 다양한 분야에서 사용되고 있다.
순환희소세포(Circulating rere cells, CRC)는 혈액을 따라 순환하는 세포로 혈액 1㎖당 1000개 미만으로 매우 희소하게 존재하는 세포이다. 이러한 순환희소세포에는 순환종양세포(Circulating tumor cells, CTC), 유핵적혈구(Nucleated red blood cells, nRBC), 순환내피세포(Circulating endothelial cells, CEC) 및 순환줄기세포(Circulating stem cells, CSC) 등이 있으며, 이들은 다양한 질병의 지표로서 질병의 조기 진단 및 예후 진단에 사용될 수 있다.
특히 최근 종양에서 떨어져 나온 상피세포인 혈중종양세포를 검출하여 전이성 암을 조기 진단하거나 암 치료의 결과를 모니터링 하는 연구가 증가하고 있다. 이러한 방식은 직접 체내에서 암 조직을 떼어내는 것과 같은 생검(biopsy)을 하지 않아도 되는 장점이 있어, 특히 조직검사가 어려운 폐암 환자에게는 절대적으로 유리한 방식이다. 그러나 환자의 혈액 내에서 혈중 종양세포는 (1 CTC / 109 혈액세포) 정도의 극히 적은 농도로 존재하므로, 이를 효율적으로 포획하여 검출하는 데에는 많은 어려움이 있었다.
이에 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0107583호("혈중종양세포 진단용 조성물 및 이를 이용한 혈중종양세포 검출방법", 2013.10.02.자 공개)에서는 혈중종양세포의 포획효율을 높이고 혈액 세포에 대한 비특이적 결합을 최소화하여 검출 순도를 높이기 위해 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 EpCAM 항체 등의 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자 및 상기 1차 항체와 결합하는 protein A 등의 2차 항체가 부착되어 있는 100㎚~1㎛ 크기의 자성비드를 포함하는 혈중종양세포 진단용 조성물을 제시하고 있다.
한편, 종래의 자성나노입자(Magnetic Nanoparticle, MNP)를 이용한 입자 분리 방법(Magnetic activated cell sorter, MACS)은, 피펫을 이용하여 입자가 들어있는 용액에 자성나노입자가 들어있는 용액을 섞어 일정 기간 정치하여 MNP복합체를 형성시킨 후, 이를 자석으로 둘러싸인 용기에 옮긴 뒤 일정 시간 후에 용기의 벽면으로 끌려가지 않은 입자를 피펫으로 조심스럽게 흡인하여 얻는 과정으로 수행된다. 그러나 이러한 종래 방식은 여러 번의 단계(multi-stage)가 포함되어 있고, 모두 수작업(manual process)으로 진행되므로 분리하고자 하는 입자를 잃을 수 있다는 문제가 있다.
대한민국 공개특허공보 제10-2013-0107583호("혈중종양세포 진단용 조성물 및 이를 이용한 혈중종양세포 검출방법", 2013.10.02.자 공개)
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 창안된 것으로, 본 발명의 목적은 혼합시료 내에서 처리된 자성나노입자와 특이적인 친화성을 갖는 타겟입자를 자성체를 통해 장치 내부에 고정시키고, 타겟입자가 제거된 시료를 수득하는 미세유체(Microfluidic) 기반의 분리기술을 제공하는데 있다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따라 자성나노입자(Magnetic nanoparticle, MNP)와 타겟입자가 결합된 MNP복합체를 형성하고, 자기력을 이용해 상기 MNP복합체를 포획하여 분리하기 위한 미세유체 분리장치(A)에 있어서, 상기 미세유체 분리장치(A)는 혼합 채널(100), 인큐베이션(incubation) 채널(200) 및 분리 채널(300)이 순차적으로 연결되어 소통되도록 형성되며, 상기 혼합 채널(100)은 상류 측에 구비되는 적어도 하나 이상의 유입구(110) 및 상기 유입구(110)와 소통되며 적어도 둘 이상의 만곡부(121)가 형성된 파동(wave) 형상의 만곡 채널(120)을 포함하고, 상기 인큐베이션 채널(200)은 소정 구간 동안 채널의 단면적이 확장된 제1 체류부(210)를 포함하며, 상기 분리 채널(300)은 채널 일 측에 구비되는 적어도 하나 이상의 자성체(310) 및 하류 측에 구비되는 배출구(320)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치를 제공한다.
상기 혼합 채널(100)은, 상기 만곡 채널(120) 상에 형성되며, 소정 구간 동안 채널의 너비가 확장된 적어도 하나 이상의 확장 채널(130)을 더 포함할 수 있으며, 상기 만곡 채널(120)의 너비와 상기 확장 채널(130)의 너비의 비가 1:6 ~ 1:7인 것이 바람직하고, 상기 확장 채널(130)은 상기 만곡 채널(120) 상에 6~8 군데 형성되는 것이 바람직하며, 상기 확장 채널(130)은 상기 만곡 채널(120) 상에 형성되되, 상기 만곡부(121)가 다음 만곡부(121)로 전환되는 지점에 형성되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 혼합 채널(100)의 유입구(110)는 자성나노입자 유입구(111) 및 시료 유입구(112)를 포함할 수 있다. 상기 인큐베이션 채널(200)에서, 상기 제1 체류부(210) 단면적과 상기 혼합 채널(100)의 만곡 채널(120) 단면적의 비가 1000:1 ~ 1500:1 일 수 있으며, 상기 분리 채널(300)은, 소정 구간 동안 채널의 단면적이 확장된 적어도 하나 이상의 제2 체류부(330)가 직렬로 연결될 수 있고, 이때 상기 분리 채널(300)에서, 상기 자성체(310)는 상기 분리 채널(300)의 제2 체류부(330) 상부와 하부 외측 면에 복수 개가 장착되는 것이 바람직하다.
한편, 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 다른 실시예에 따라 미세유체 분리장치(A)를 이용하여 자성나노입자(MNP)와 타겟입자가 결합된 MNP복합체를 형성하고, 자기력을 이용해 상기 MNP복합체를 포획하여 분리하기 위한 분리방법(B)에 있어서, 상기 미세유체 분리장치(A)의 유입구(110)로 시료와 자성나노입자를 주입하는 단계(S10); 주입된 시료와 자성나노입자가 상기 미세유체 분리장치(A)의 혼합 채널(100) 내를 흐르며 혼합 및충돌하여 MNP복합체를 형성하는 단계(S20); 형성된 MNP복합체가 상기 미세유체 분리장치(A)의 인큐베이션 채널(200) 내를 흐르며 상기 MNP복합체의 결합력이 강화되는 단계(S30); 상기 MNP복합체가 채널 일 측에 구비되는 적어도 하나 이상의 자성체(310)가 구비된 상기 미세유체 분리장치(A)의 분리 채널(300) 내를 흐르며 상기 자성체(310)에 포획되는 단계(S40); 및 상기 MNP복합체가 제거된 시료가 상기 분리 채널(300)의 배출구(320)를 통해 배출되는 단계(S50);를 포함하는 미세유체 분리장치를 이용한 분리방법을 제공한다.
상기 혼합 채널(100)은 적어도 둘 이상의 만곡부(121)가 형성된 파동 형상의 만곡 채널(120)을 포함하여, MNP복합체 형성단계(S20)에서 주입된 시료와 자성나노입자가 상기 만곡 채널(120)로 인해 형성되는 제1 와류(vortex)에 의해 충돌하도록 할 수 있다.
또한 상기 혼합 채널(100)은, 상기 만곡 채널(120) 상에 형성되며 소정 구간 동안 채널의 너비가 확장된 적어도 하나 이상의 확장 채널(130)을 더 포함하여, MNP복합체 형성단계(S20)에서 주입된 시료와 자성나노입자가 상기 확장 채널(120)로 인해 형성되는 제2 와류에 의해 충돌하도록 할 수 있다.
또, 상기 인큐베이션 채널(200)은 소정 구간 동안 채널의 단면적이 확장된 제1 체류부(210)를 포함하여, MNP복합체 결합력 강화단계(S30)에서 형성된 MNP복합체가 상기 제1 체류부(210) 내에서 소정 기간 동안 체류하면서 상기 MNP복합체의 결합력이 강화되도록 할 수 있다.
상기 시료 및 자성나노입자 주입단계(S10)에서, 상기 시료 및 자성나노입자를 300~400 ㎕/min의 유속으로 주입하는 것이 바람직하다.
그리고, 상기 타겟입자는 백혈구이고, 상기 자성나노입자에는 백혈구에 특이적으로 결합하는 인체 백혈구 공통항원(CD45)에 대한 항체(CD45 항체)가 부착되어 있어, 상기 배출단계(S50) 이후에, 상기 MNP복합체가 제거된 시료 내 순환희소세포(Circulating rare cells, CRC)를 수득하는 단계(S60)를 더 포함할 수 있으며, 이때 상기 순환희소세포는 순환종양세포(Circulating tumor cells, CTC)인 것이 더욱 바람직하다.
한편, 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 상술한 바와 같은 미세유체 분리장치(A)를 포함하는 혈액 시료 내 순환희소세포 분리키트를 제공한다.
상술한 바와 같은 본 발명의 미세유체 분리장치, 이를 이용한 분리방법 및 이를 포함하는 혈액 내 순환희소세포 분리키트는, 시료의 분리 등 일련의 전처리 과정이 하나의 미세유체 칩 내에서 연속적, 자동적으로 이루어지기 때문에 추출 대상 입자의 손실을 최소화하면서 동시에 고효율 및 고속으로 분리 작업을 용이하게 수행할 수 있다는 효과가 있다.
특히, 본 발명의 미세유체 분리기술은 혈액 내 존재하는 순환희소세포, 구체적으로는 각종 질병의 지표가 되는 순환종양세포를 수득하기 위해 백혈구를 제거하는 과정에서 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 미세유체 분리장치(A)에 대한 전체적인 개략도이다.
도 2는 본 발명의 만곡 채널(120) 및 확장 채널(130)이 형성된 혼합 채널(100)의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 인큐베이션 채널(200)의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 미세유체 분리장치를 이용한 분리방법(B)에 대한 흐름도(flowchart)이다.
도 5의 좌측은 실시예 1의 실험에 따라 측정된 결과이며, 도 5의 우측은 혼합 유체가 확장 채널(130) 내에서 거동하는 모습을 촬영한 사진이다.
도 6은 실시예 2의 실험에 따라 자성나노입자 없이 시료만을 주입하였을 때의 주입 유속에 따른 시료 회수율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 3의 실험에 따라 주입 유속과 백혈구 농도에 따른 백혈구 제거율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 4의 실험에 따라 일정 백혈구 농도의 시료 내에 포함된 암세포(MCF-7 cells)의 개수에 따른 암세포 회수율 및 순도를 나타낸 스피킹(spiking) 실험의 결과표이다.
이하 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
"제 1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로, 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소도 제 1 구성요소로 명명될 수 있다.
각 단계들에 있어 식별부호는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.
본 발명은 바람직한 일 실시예에 따라 자성나노입자(Magnetic nanoparticle, MNP)와 타겟입자가 결합된 MNP복합체를 형성하고, 자기력을 이용해 MNP복합체를 채널 내부에서 포획하여 분리하기 위한 미세유체 분리장치(A)를 제공한다. 본 발명의 미세유체 분리장치(A)는 혼합 채널(100), 인큐베이션 채널(200) 및 분리 채널(300)이 순차적으로 연결되어 소통되도록 형성된 미세유체 칩(microfluidic chip) 기반의 장치이며, 본 발명의 미세유체 분리장치(A)에 전체적인 개략도가 도 1에 도시되어 있다.
본 발명과 같은 미세유체 칩 기반의 입자 분리 플랫폼은 피펫팅, 시약처리, 시료 용기의 교체 등의 과정이 포함되는 종래의 수동(manual) 타입의 다단계(multi-stage) 분리 플랫폼에 비해, 분리 과정에서 입자의 발생되는 입자의 손실을 최소화할 수 있다. 또한, 분리 및 분석이 하나의 칩 안에서 연속적으로 이루어지기 때문에 입자의 손실을 더욱 줄일 수 있다.
먼저 본 발명의 전체적인 개념을 간략히 설명한다.
본 발명의 미세유체 분리장치(A)는 유입구(110) 및 만곡 채널(120)을 포함하는 혼합 채널(100)과, 제1 체류부(210)를 포함하는 인큐베이션 채널(200)과, 자성체(310) 및 배출구(320)를 포함하는 분리 채널(300)로 구성될 수 있다.
혼합 채널(100)의 유입구(110)로 주입되는 시료와 자성나노입자는 만곡 채널(120)과 후술할 확장 채널(130)이 구비된 혼합 채널(100) 내부를 흐르며 관성력, 원심력, 유체 점성효과 등의 상호 작용로 인해 형성되는 각종 와류에 의해 혼합 및 충돌되어 MNP복합체를 형성하게 되고, 이후 인큐베이션 채널(200)의 제1 체류부(210)를 통과할 때 일정 이상의 체류시간이 확보되어 MNP복합체의 결합력이 보다 향상되며, 이후 자성체(310)가 구비된 분리 채널(300)에서 MNP복합체가 포획 및 제거됨으로써, 최종적으로 타겟입자가 제거된 시료를 배출구(320)를 통해 수득하게 된다.
이하 각 구성에 대하여 상세히 설명한다.
먼저, 혼합 채널(100)은 상류 측에 유입구(110)가 구비되고, 유입구(110)에 채널이 소통되는 형태이다. 이때 채널의 일부 또는 전체는 만곡부(121)가 형성된 파동 형상의 만곡 채널(120)로 구성될 수 있다. 만곡부(121)란 어떤 부재에 있어 활 모양으로 굽은 부분을 의미하며, 만곡부(121)가 적어도 둘 이상 연결되면서 전체적으로 파동 형상으로 굽이진 형태의 만곡 채널(120)이 형성될 수 있다.
만곡 채널(120) 내에서 유체는 관성력, 원심력, 유체 점성력 등 간의 상호 작용으로 인해 수직한 평면으로 제1 와류(vortex), 구체적으로는 딘 와류(Dean Vortices)가 형성되어 수직한 평면 상에서 유체의 혼합 및 충돌이 촉진된다..
만곡 채널(120)의 만곡부(121)가 형성되는 각도(θ)는 만곡부(121)의 시작점(일자형의 채널이 굽어지기 시작하는 지점)에서부터 만곡부(121)의 종료점(다시 일자형의 채널로 변경되는 지점)까지의 휘어진 각도를 의미하며, 130° 내지 180° 정도로 형성될 수 있고, 형성되는 관성력, 원심력 등을 이용하여 딘 와류를 최대한 효과적으로 형성시키기 위해서는 150°로 형성되는 것이 가장 바람직하다.
한편, 혼합 채널(100)의 만곡 채널(120) 상에는 적어도 하나 이상의 확장 채널(130)이 간헐적으로 구비될 수 있다. 확장 채널(130)은 소정 구간 동안 채널의 너비가 확장된 영역을 의미하며, 이러한 오리피스(orifice) 형태의 확장 채널(130)로 혼합 시료가 진입되면 채널의 너비가 갑작스럽게 넓어짐에 따라 수평 평면으로 제2 와류, 구체적으로는 확장 와류(Expansion Vortices)가 형성되어 수평 평면상에서 유체의 혼합 및 충돌이 촉진된다. 이렇듯, 파동 형상의 만곡 채널(120)에서 수직 평면상의 제1 와류(딘 와류)와 확장 채널(130)에서 수평 평면상의 제2 와류(확장 와류)로 인해 주입되는 시료와 자성나노입자의 혼합, 충돌 및 결합이 효과적으로 일어나게 된다. 최적으로 확장 와류를 발생시키기 위해서는 확장 채널(130)의 너비(D2)와 만곡 채널(120)의 너비(D1)의 비(D1:D2)는 1:6 ~ 1:7인 것이 바람직하다.
본 발명의 만곡 채널(120) 및 확장 채널(130)이 형성된 혼합 채널(100)의 모식도가 도 2에 도시되어 있다. 파동 형상으로 만곡 채널(120)이 이어지면서 간헐적으로, 만곡부(121)의 휘어진 방향이 바뀌는 일자형 채널 부근에 확장 채널(130)이 형성되는 것이 제1 와류와 제2 와류 간의 시너지 효과가 최적으로 발휘될 수 있다. 혼합 채널(100) 내부에서의 유체 거동은 레이놀즈 수(Reynolds Number)가 1보다 크도록 제어하는 것이 혼합 및 결합 측면에서 유리하다. 또한, 만곡 채널(120) 상에 형성되는 확장 채널(130)은 6~8 군데에 형성되는 것이 바람직하며, 이를 뒷받침하는 실험 결과는 하기의 실시예에서 후술한다.
다음으로, 인큐베이션 채널(200)은 혼합 채널(100)에 하류 측에 연결된 채널로, 인큐베이션 채널(200)에는 소정 구간 동안 채널의 단면적이 확장된 제1 체류부(210)가 형성되어 있다. 이로써, 최종적으로 MNP복합체를 자성체(310)를 이용해 제거하기 이전에 MNP복합체의 결합력 즉, 자성나노입자와 타겟입자 간의 결합력을 향상시키기 위하여 일정 체류 시간 및 체류 공간을 확보할 수 있다. 본 발명의 인큐베이션 채널(200)의 모식도가 도 3에 도시되어 있다.
위와 같은 체류 효과를 극대화하기 위해서는 인큐베이션 채널(200)의 제1 체류부(210) 단면적(S1)과 혼합 채널(100)의 만곡 채널(120) 단면적(S2)의 비(S1:S2)는 1000:1 ~ 1500:1인 것이 바람직하다. 또한, 충분한 체류 시간 및 체류 공간을 확보하기 위하여 제1 체류부(210)의 길이는 30~40 ㎜인 것이 바람직하다.
끝으로, 분리 채널(300)은 인큐베이션 채널(200)의 후단에 연결되어, MNP복합체를 포획하기 위한 자성체(310)와 최종 처리된 시료가 배출되는 배출구(320)가 구비될 수 있다. 분리 채널(300)의 일 측, 더욱 바람직하게는 상부와 하부 외측 면에 복수 개 장착되는 자성체(310)에 의해 상류 측에서 형성된 MNP복합체가 포획 및 제거됨으로써, 최종적으로 MNP복합체가 제거된 시료가 수득된다.
채널의 형상(physical property)는 인큐베이션 채널(200)과 동일 내지 유사하게 구비하는 것이 바람직하며, 인큐베이션 채널(200)과 마찬가지로 일정 이상의 체류 시간 및 체류 공간을 확보하여 MNP복합체의 분리 효율을 향상시키기 위해서, 소정 구간 동안 채널의 단면적이 확장된 적어도 하나 이상의 제2 체류부(330)가 직렬로 연결되도록 구성하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 이때 제2 체류부(330)의 상부, 하부 또는 상부와 하부 모두에 자성체(310)가 복수 개 장착되도록 구성할 수 있다.
본 발명의 미세유체 분리장치(A)는 3개의 미세유체 칩을 외부 지그를 사용하지 않고 양면 테이프 등의 간단한 부착수단을 통해 결합하여 제조할 수 있어, 저렴하고 제조가 용이하다. 또한, 세 가지 기능이 하나의 칩 유닛에서 구현되므로 종래 피펫팅, 시료 용기 교체 등에서 발생되는 시료 입자의 손실을 최소화할 수 있으며, 빠른시간 내에 시료의 전처리부터 최종 분리에 이르기까지 완료할 수 있다는 장점이 있다.
한편, 본 발명은 바람직한 다른 실시예에 따라 미세유체 분리장치(A)를 이용하여 자성나노입자와 타겟입자가 결합된 MNP복합체를 형성하고, 자기력을 이용해 MNP복합체를 포획하여 분리하기 위한 분리방법(B)을 제공한다. 본 발명의 분리방법(B)에 대한 흐름도(flowchart)가 도 4에 도시되어 있다. 본 발명의 분리방법(B)은 크게 시료 및 자성나노입자 주입단계(S10), MNP복합체 형성단계(S20), MNP복합체 결합력 강화단계(S30) 및 MNP복합체 포획단계(S40)로 구성될 수 있다.
시료 및 자성나노입자 주입단계(S10)에서는 미세유체 분리장치(A)의 유입구(110)로 시료와 자성나노입자를 주입하는 단계이다. 이때 유입구(110)는 자성나노입자 유입구(111)(110) 및 시료 유입구(112)(110)가 별도로 구비될 수 있다 시료와 자성나노입자의 주입 유속은 300~400 ㎕/min인 것이 바람직하며, 이를 뒷받침하는 실험 결과는 하기의 실시예에서 후술한다.
유입구(110)를 통해 주입된 혼합 유체는 미세유체 분리장치(A)의 혼합 채널(100) 내를 흐르게 되면서 혼합되고 상호 충돌되어 MNP복합체를 형성(S20)하게 된다. 이때 만곡 채널(120)과 확장 채널(130)을 통해 와류가 형성되어 혼합과 충돌이 촉진됨은 위에서 이미 언급하였다.
형성된 MNP복합체는 미세유체 분리장치(A)의 인큐베이션 채널(200) 내를 흐르게 되면서 충분한 체류 시간 및 체류 장소가 확보되어 결합력이 강화(S30)된다. 이러한 과정은 인큐베이션 채널(200) 내의 제1 체류부(210)를 통해 이루어지며 이에 대해서는 위에서 이미 언급하였다.
결합력이 강화된 MNP복합체는 미세유체 분리장치(A)의 분리 채널(300) 내를 흐르게 되면서 분리 채널(300)에 구비된 자성체(310)에 포획되어 제거되고, 최종적으로 MNP복합체가 제거된 시료가 배출구(320)를 통해 배출(S50)된다.
이로써, 제거 대상인 타겟입자를 자성나노입자와 결합시켜 자성체(310)를 통해 포획, 제거함으로써, 최종적으로 타겟입자가 제거된 시료를 수득할 수 있다. 이때, 분리의 대상 즉, 수득하고자 하는 대상 입자는 자성나노입자와 결합되는 타겟입자 일 수도 있으며, 타겟입자가 제거된 시료 내 입자일 수도 있다. 전자의 경우 자성체(310)에 의해 포획된 MNP복합체를 별도로 수집하여 자성나노입자를 분리하는 후속 과정이 수반되어야 하고, 후자의 경우 배출구(320)로 배출되는 시료를 수집하여 별도의 후속 과정 없이 수득하고자 하는 대상 입자를 얻을 수 있다.
본 발명의 미세유체 분리장치(A) 및 분리방법(B)은 특히, 혈액 시료 내 존재하는 순환희소세포(Circulating rare cells, CRC)를 수득하는데 사용될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 순환종양세포(Circulating tumor cells, CTC)를 수득하는데 사용될 수 있다.
이때, 타겟입자는 백혈구이고 자성나노입자에는 백혈구에 특이적으로 결합하는 인체 백혈구 공통항원(CD45)에 대한 항체(CD45 항체)가 부착될 수 있다. 이로써, 백혈구와 CD45 항체가 부착된 자성나노입자가 결합하여 MNP복합체를 형성하게 되고, 효과적으로 백혈구를 제거하여 최종적으로 순한종양세포를 수득할 수 있다.
한편, 본 발명은 또 다른 실시예에 따라 상술한 바와 같은 미세유체 분리장치(A)를 포함하는 혈액 시료 내 순환희소세포 분리키트를 제공한다.
이하 본 발명의 미세유체 분리장치, 이를 이용한 분리방법 및 이를 포함하는 혈액 내 순환희소세포 분리키트에 대한 실시예를 살펴본다. 그러나 이는 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 발명의 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
<혼합 채널(100) 효율 실험>
만곡 채널(120)에서 확장 채널(130)로의 너비 변화에 따른 시료와 자성나노입자의 혼합 효율을 모사실험을 통해 확인하고자 한다.
먼저, 만곡 채널(120)의 너비를 0.1㎜로, 만곡 채널(120)의 휘어진 각도(θ)를 150°로 형성하고, 만곡 채널(120)의 만곡부(121)가 교체되는 지점에 다수의 확장 채널(130)을 형성하였다. 각 채널의 모두 동일하게 높이는 40㎛로 형성하였다. 이후, 7㎛의 녹색형광입자(시료 모사, 도 5의 ② 부분)와 주황색의 형광유체(자성나노입자 모사, 도 5의 ① 부분)를 이용하여 채널 내 두 색의 강도(intensity) 차이를 Image J 프로그램으로 측정하였다.
도 5의 좌측은 측정한 결과이며, 도 5의 우측은 혼합 유체가 확장 채널(130)에서 흐르는 모습을 촬영한 사진이다. 유속이 100 ㎕/min (Re=37) 일 때, 0.7㎜ 너비의 확장 채널(130)에서는 6번째 사이클 즉, 6개의 확장 채널(130)을 통과할 때 100%에 가까운 혼합 효율을 보인 반면, 0.6㎜ 너비의 확장 채널(130)에서는 8번째 사이클에서부터 그와 비슷한 혼합 효율을 보였다.
<자성나노입자 없이 시료만을 주입하였을 때의 유속에 따른 회수율 실험>
도 6은 자성나노입자 없이 시료만을 주입하였을 때의 주입 유속에 따른 시료 회수율을 나타낸 그래프이다. 본 실험을 수행한 이유는 본 발명의 일 목적이 자성나노입자를 이용하여 제거 대상 입자를 칩 내에 부착시켜 제거하고, 자성나노입자와 결합되지 않은 추출 대상 입자가 장치 외부로 안정적으로 배출되도록 하는 것이기 때문이다.
본 실험에 사용된 미세유체 분리장치(A)의 디멘젼(dimension)은 혼합 채널(100)의 경우 상기 실시예 1과 동일하게(0.7㎜ 너비의 확장 채널(130)) 형성하였고, 인큐베이션 채널(200)의 경우 너비가 8㎜, 높이가 0.7㎜인 제1 체류부(210)를 30㎜ 길이로 형성하였으며, 분리 채널(300)의 경우 위의 인큐베이션 채널(200)과 동일한 디멘젼으로 4 개의 제2 체류부(330)를 직렬로 연결하여 구성하였다.
본 실험을 통해 300 ㎕/min 이상의 유속에서 최대 90% 이상의 시료 회수율을 확인하였다.
<유속과 농도에 따른 백혈구 제거율 실험>
CD45 항체가 부착된 자성나노입자와 혈액 시료를 주입하여 혈액 시료 내 백혈구를 자성나노입자와 결합시켜 칩 내에 부착시킴으로써, 최종적으로 배출되는 시료 내 백혈구가 제거된 정도를 측정하는 실험을 수행하였다. 변수는 주입 유속(㎕/min)과 주입되는 시료 내 백혈구 농도(cells/㎖)이다. 본 실험에 사용된 미세유체 분리장치(A)의 디멘젼(dimension)은 상기 실시예 2와 동일하다.
도 7은 주입 유속과 백혈구 농도에 따른 백혈구 제거율을 나타낸 그래프이다. 300 ㎕/min의 유속에서는 107 cells/㎖의 고농도에서도 99% 이상의 백혈구 제거율을 보였으니, 400 ㎕/min의 유속에서는 높은 유속에 의해 백혈구가 제거되지 않고 배출구(320)로 빠져 나오는 것을 확인하였다.
<암세포와 백혈구 세포의 스피킹(spiking) 실험>
도 8은 일정 백혈구 농도 시료 내에 포함된 암세포(MCF-7 cells)의 개수에 따른 암세포 회수율 및 순도를 나타낸 스피킹(spiking) 실험 결과표이다. 구체적으로, 106 cells/㎖ 농도의 백혈구가 포함된 시료에 스피킹을 통해 암세포를 50개, 100개, 500개 및 1000개를 투입하고, 본 발명의 미세유체 분리장치(A)를 통해 분리한 결과이다. 본 실험에 사용된 미세유체 분리장치(A)의 디멘젼(dimension)은 상기 실시예 2와 동일하다.
전체적으로 80% 이상의 암세포를 회수하였고, 최대 6.09%의 높은 순도로 암세포를 분리할 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.
A : 미세유체 분리장치
B : 미세유체 분리장치를 이용한 분리방법
100 : 혼합 채널
110 : 유입구
111 : 자성나노입자 유입구
112 : 시료 유입구
120 : 만곡 채널
121 : 만곡부
130 : 확장 채널
200 : 인큐베이션 채널
210 : 제1 체류부
300 : 분리 채널
310 : 자성체
320 : 배출구
330 : 제2 체류부

Claims (23)

  1. 자성나노입자(Magnetic nanoparticle, MNP)와 백혈구가 결합된 MNP복합체를 형성하고, 자기력을 이용해 상기 MNP복합체를 포획하여 분리하기 위한 미세유체 분리장치(A)에 있어서,
    상기 미세유체 분리장치(A)는 혼합 채널(100), 인큐베이션(incubation) 채널(200) 및 분리 채널(300)이 순차적으로 연결되어 소통되도록 형성되며,
    상기 혼합 채널(100)은 상류 측에 구비되는 적어도 하나 이상의 유입구(110) 및 상기 유입구(110)와 소통되며 적어도 둘 이상의 만곡부(121)가 형성된 파동(wave) 형상의 만곡 채널(120)을 포함하고,
    상기 인큐베이션 채널(200)은 소정 구간 동안 채널의 단면적이 확장된 제1 체류부(210)를 포함하며,
    상기 분리 채널(300)은 채널 일 측에 구비되는 적어도 하나 이상의 자성체(310) 및 하류 측에 구비되는 배출구(320)를 포함하고,
    상기 분리 채널(300)은,
    상기 MNP복합체의 체류 시간 및 체류 공간이 확보되도록 소정 구간 동안 채널의 단면적이 확장된 복수의 제2 체류부(330)가 직렬로 연결되고,
    상기 분리 채널(300)에서,
    상기 자성체(310)는 상기 분리 채널(300)의 제2 체류부(330) 상부와 하부 외측 면에 복수 개가 장착되는 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혼합 채널(100)은,
    상기 만곡 채널(120) 상에 형성되며, 소정 구간 동안 채널의 너비가 확장된 적어도 하나 이상의 확장 채널(130)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 혼합 채널(100)에서,
    상기 만곡 채널(120)의 너비와 상기 확장 채널(130)의 너비의 비가 1:6 ~ 1:7인 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 확장 채널(130)은 상기 만곡 채널(120) 상에 6~8 군데 형성되는 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 확장 채널(130)은 상기 만곡 채널(120) 상에 형성되되, 상기 만곡부(121)가 다음 만곡부(121)로 전환되는 지점에 형성되는 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 혼합 채널(100)의 유입구(110)는 자성나노입자 유입구(111) 및 시료 유입구(112)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 인큐베이션 채널(200)에서,
    상기 제1 체류부(210) 단면적과 상기 혼합 채널(100)의 만곡 채널(120) 단면적의 비가 1000:1 ~ 1500:1 인 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 미세유체 분리장치(A)를 이용하여 자성나노입자(MNP)와 백혈구가 결합된 MNP복합체를 형성하고, 자기력을 이용해 상기 MNP복합체를 포획하여 분리하기 위한 분리방법(B)에 있어서,
    상기 미세유체 분리장치(A)의 유입구(110)로 시료와 자성나노입자를 주입하는 단계(S10);
    주입된 시료와 자성나노입자가 상기 미세유체 분리장치(A)의 혼합 채널(100) 내를 흐르며 혼합 및충돌하여 MNP복합체를 형성하는 단계(S20);
    형성된 MNP복합체가 상기 미세유체 분리장치(A)의 인큐베이션 채널(200) 내를 흐르며 상기 MNP복합체의 결합력이 강화되는 단계(S30);
    상기 MNP복합체가 채널 일 측에 구비되는 적어도 하나 이상의 자성체(310)가 구비되고, 상기 MNP복합체의 체류 시간 및 체류 공간이 확보되도록 소정 구간 동안 채널의 단면적이 확장된 복수의 제2 체류부(330)가 직렬로 연결되고, 자성체(310)가 상기 복수의 분리 채널(300) 각각의 상기 제2 체류부(330)의 상부와 하부 외측 면에 복수 개가 장착된 상기 미세유체 분리장치(A)의 분리 채널(300) 내를 흐르며 상기 자성체(310)에 포획되는 단계(S40); 및
    상기 MNP복합체가 제거된 시료가 상기 분리 채널(300)의 배출구(320)를 통해 배출되는 단계(S50);
    를 포함하는 미세유체 분리장치를 이용한 분리방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 혼합 채널(100)은 적어도 둘 이상의 만곡부(121)가 형성된 파동 형상의 만곡 채널(120)을 포함하여,
    MNP복합체 형성단계(S20)에서 주입된 시료와 자성나노입자가 상기 만곡 채널(120)로 인해 형성되는 제1 와류(vortex)에 의해 충돌하는 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치를 이용한 분리방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 혼합 채널(100)은, 상기 만곡 채널(120) 상에 형성되며 소정 구간 동안 채널의 너비가 확장된 적어도 하나 이상의 확장 채널(130)을 더 포함하여,
    MNP복합체 형성단계(S20)에서 주입된 시료와 자성나노입자가 상기 확장 채널(130)로 인해 형성되는 제2 와류에 의해 충돌하는 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치를 이용한 분리방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제10항에 있어서,
    상기 인큐베이션 채널(200)은 소정 구간 동안 채널의 단면적이 확장된 제1 체류부(210)를 포함하여,
    MNP복합체 결합력 강화단계(S30)에서 형성된 MNP복합체가 상기 제1 체류부(210) 내에서 소정 기간 동안 체류하면서 상기 MNP복합체의 결합력이 강화되는 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치를 이용한 분리방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제10항에 있어서,
    상기 시료 및 자성나노입자 주입단계(S10)에서,
    상기 시료 및 자성나노입자를 300~400 ㎕/min의 유속으로 주입하는 것을 특징으로 하는 미세유체 분리장치를 이용한 분리방법.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 미세유체 분리장치(A)를 포함하는 혈액 시료 내 순환희소세포 분리키트.
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