KR101620148B1 - 항균펩타이드 베타-디펜신 ３ 및 ３ｈ의 라우릭산 융합을 통한 장기지속형 유도체, 세포투과성 펩타이드 융합을 통한 피부투과형 유도체 개발과 이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents
항균펩타이드 베타-디펜신 ３ 및 ３ｈ의 라우릭산 융합을 통한 장기지속형 유도체, 세포투과성 펩타이드 융합을 통한 피부투과형 유도체 개발과 이를 함유하는 화장료 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101620148B1 KR101620148B1 KR1020130159482A KR20130159482A KR101620148B1 KR 101620148 B1 KR101620148 B1 KR 101620148B1 KR 1020130159482 A KR1020130159482 A KR 1020130159482A KR 20130159482 A KR20130159482 A KR 20130159482A KR 101620148 B1 KR101620148 B1 KR 101620148B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- beta
- defensin
- peptide
- seq
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 title claims abstract description 49
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 49
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 102100026887 Beta-defensin 103 Human genes 0.000 title claims description 52
- 101710125296 Beta-defensin 3 Proteins 0.000 title claims description 51
- 238000011161 development Methods 0.000 title abstract description 7
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 title description 2
- 125000000400 lauroyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 67
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 61
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 102000012265 beta-defensin Human genes 0.000 claims description 40
- 108050002883 beta-defensin Proteins 0.000 claims description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 208000001840 Dandruff Diseases 0.000 claims description 5
- 241000555676 Malassezia Species 0.000 claims description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 claims description 4
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 claims description 4
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 4
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 3
- 230000003658 preventing hair loss Effects 0.000 claims description 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 abstract description 24
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 abstract description 24
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 abstract description 23
- 206010000496 acne Diseases 0.000 abstract description 23
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 5
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 27
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 25
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 9
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 8
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000020154 Acnes Diseases 0.000 description 3
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 3
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 3
- 206010021531 Impetigo Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 3
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 231100000245 skin permeability Toxicity 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DQNLFLGFZAUIOW-FXQIFTODSA-N Arg-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DQNLFLGFZAUIOW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N Arg-Gly-Arg Chemical compound N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- HBHMVBGGHDMPBF-GARJFASQSA-N Cys-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N HBHMVBGGHDMPBF-GARJFASQSA-N 0.000 description 2
- DQGIAOGALAQBGK-BWBBJGPYSA-N Cys-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)N)O DQGIAOGALAQBGK-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010016936 Folliculitis Diseases 0.000 description 2
- DQLVHRFFBQOWFL-JYJNAYRXSA-N Gln-Lys-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O DQLVHRFFBQOWFL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- AAHSHTLISQUZJL-QSFUFRPTSA-N Gly-Ile-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O AAHSHTLISQUZJL-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 2
- 101000912247 Homo sapiens Beta-defensin 103 Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- CFVQPNSCQMKDPB-CIUDSAMLSA-N Lys-Cys-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N CFVQPNSCQMKDPB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 108060003100 Magainin Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N Val-Leu-Ser Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000000686 essence Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000055779 human DEFB103A Human genes 0.000 description 2
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 2
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 239000006097 ultraviolet radiation absorber Substances 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- NBDTZVVEDLDLSG-UHFFFAOYSA-N 4,6,6-trimethylheptan-2-yl acetate Chemical compound CC(C)(C)CC(C)CC(C)OC(C)=O NBDTZVVEDLDLSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEVAGZCKULD-XPUUQOCRSA-N Ala-Gly-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BTBUEVAGZCKULD-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 102400000237 Alpha-neoendorphin Human genes 0.000 description 1
- 101800001617 Alpha-neoendorphin Proteins 0.000 description 1
- HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- BTJVOUQWFXABOI-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N BTJVOUQWFXABOI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 108050004290 Cecropin Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- XGIAHEUULGOZHH-GUBZILKMSA-N Cys-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)N XGIAHEUULGOZHH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101710178508 Defensin 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000541 Defensins Human genes 0.000 description 1
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 description 1
- 241000723298 Dicentrarchus labrax Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- YRWWJCDWLVXTHN-LAEOZQHASA-N Gln-Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N YRWWJCDWLVXTHN-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- HNVFSTLPVJWIDV-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Gln Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HNVFSTLPVJWIDV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ADZGCWWDPFDHCY-ZETCQYMHSA-N Gly-His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 ADZGCWWDPFDHCY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- DAKSMIWQZPHRIB-BZSNNMDCSA-N His-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DAKSMIWQZPHRIB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- PDTMWFVVNZYWTR-NHCYSSNCSA-N Ile-Gly-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PDTMWFVVNZYWTR-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UBZGNBKMIJHOHL-BZSNNMDCSA-N Leu-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 UBZGNBKMIJHOHL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N Leu-Phe-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N Leu-Val-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- PBIPLDMFHAICIP-DCAQKATOSA-N Lys-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PBIPLDMFHAICIP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- ZEDVFJPQNNBMST-CYDGBPFRSA-N Met-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ZEDVFJPQNNBMST-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N Met-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- LRBSWBVUCLLRLU-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LRBSWBVUCLLRLU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- BQMFWUKNOCJDNV-HJWJTTGWSA-N Phe-Val-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BQMFWUKNOCJDNV-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- LGMBKOAPPTYKLC-JYJNAYRXSA-N Pro-Phe-Arg Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(=N)N)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 LGMBKOAPPTYKLC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ZMLRZBWCXPQADC-TUAOUCFPSA-N Pro-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 ZMLRZBWCXPQADC-TUAOUCFPSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- 239000004902 Softening Agent Substances 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 108010070741 Tachypleus tridentatus tachyplesin peptide Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KLGFILUOTCBNLJ-IHRRRGAJSA-N Tyr-Cys-Arg Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O KLGFILUOTCBNLJ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ICFRWCLVYFKHJV-FXQIFTODSA-N Val-Cys-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N ICFRWCLVYFKHJV-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N Val-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC([O-])=O AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- AOILQMZPNLUXCM-AVGNSLFASA-N Val-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN AOILQMZPNLUXCM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- OFHCOWSQAMBJIW-AVJTYSNKSA-N alfacalcidol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C OFHCOWSQAMBJIW-AVJTYSNKSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003255 anti-acne Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 108010036533 arginylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012754 barrier agent Substances 0.000 description 1
- 108010066270 beta-lactorphin Proteins 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007809 chemical reaction catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000004088 foaming agent Substances 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 108010090333 leucyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000260 male genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003132 peptidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001818 polyoxyethylene sorbitan monostearate Substances 0.000 description 1
- 235000010989 polyoxyethylene sorbitan monostearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000013097 stability assessment Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- ZJQFYZCNRTZAIM-PMXBASNASA-N tachyplesin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(N[C@H]2CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC=CC=3)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)C(=O)N1)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZJQFYZCNRTZAIM-PMXBASNASA-N 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 150000004992 toluidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 229940099259 vaseline Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- KZTDMJBCZSGHOG-XJIZABAQSA-N α-neoendorphin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 KZTDMJBCZSGHOG-XJIZABAQSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
- A61Q17/005—Antimicrobial preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Birds (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
Abstract
본 발명은 항균펩타이드 베타-디펜신 ３ 및 ３Ｈ의 라우릭산 융합을 통한 장기지속형 유도체, 세포투과성 펩타이드 융합을 통한 피부투과형 유도체 개발과 이를 함유하는 화장품 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 항균 펩타이드인 라우로일 베타-디펜신 3 및 3H, 신규 세포투과성 펩타이드, 및 이를 함유한 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 라우로일이 결합된 베타 디펜신 3 또는 3H(homolog) 펩타이드 유도체는 항균 활성이 있고, 아토피 피부염 및 여드름 개선능이 있어, 아토피 피부염을 비롯한 다양한 피부 개선용 화장품, 의약외품 및 의약소재로 응용가능하다.
본 발명에 따른 라우로일이 결합된 베타 디펜신 3 또는 3H(homolog) 펩타이드 유도체는 항균 활성이 있고, 아토피 피부염 및 여드름 개선능이 있어, 아토피 피부염을 비롯한 다양한 피부 개선용 화장품, 의약외품 및 의약소재로 응용가능하다.
Description
본 발명은 항균펩타이드 베타-디펜신 ３ 및 ３Ｈ의 라우릭산 융합을 통한 장기지속형 유도체, 세포투과성 펩타이드 융합을 통한 피부투과형 유도체 개발과 이를 함유하는 화장품 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 항균 펩타이드인 라우로일 베타-디펜신 3 및 3H, 신규 세포투과성 펩타이드, 및 이를 함유한 화장료 조성물에 관한 것이다.
자연계에 존재하는 많은 종류의 생물체들이 생체적 방어 시스템의 일환으로 항균 펩타이드를 체내외로 생산한다. 이러한 항균 펩타이드들은 일반적인 단백질에 비해 비교적 짧은 아미노산 서열 (10여개에서 100여개)로 이루어져 있으며, 알짜 전하 (net charge)가 +2에서 +9 정도를 띠고 있다. 단, 세포 생물체에서 인간에 이르는 거의 모든 생명체가 만들어 내는 일련의 항균 펩타이드들은 현재 전 세계 연구자들에 의하여 Magainin, Cecropin, Defensin, Buforin, Protegrin, Tachyplesin을 비롯한 300종 이상이 발견되었으며, 그람 양성균 (Gram +), 그람 음성균 (Gram -)과 진균류 (fungi), 암세포 (tumor cell)에 이르기까지 폭넓은 항균활성을 나타내는 펩타이드이다. 진핵 다세포 생물에서 발견되는 항균펩타이드들은 알파 헬릭스 (alpha-helix), 베타 시트 (beta-sheet) 또는 무작위 코일 (random coil) 구조를 가지고 있다. 일반적인 항균펩타이드들의 작용 기작을 보면 이들 펩타이드가 세포막에 결합하면 세포막에 이온채널 (ion channel)을 형성하여 미생물의 에너지 생성을 저해하거나, 세포막에 큰 구멍을 만들게 되어 결과적으로 세포가 죽게 된다. 이와 같이 짧은 시간 내에 비특이적이면서 효과적인 물리적 방법으로 세포막을 파괴하는 작용기작을 가지고 있어서, 미생물의 세포벽이나 세포내 고분자 합성을 저해하는 기존의 항생제들과는 달리 미생물들이 항균펩타이드에 대한 내성을 갖게 되기는 매우 어려우며, 현재까지도 항균펩타이드에 의해서는 내성이 생기지 않는 것으로 보고되어 왔다. 이러한 항균 펩타이드들의 생체 내외의 발현은 항시적인 경우도 있으며, 내재성 면역 (innate immune)을 자극하는 염증유발성 싸이토카인들, 세균들, 그리고 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides, LPS) 같은 세균 유래 물질에 의해서 유도되기도 한다.
항균 펩타이드의 일종으로 피부를 포함 다양한 조직에서 발현되는 인간 베타 디펜신 (beta-defensin)은 분자 내부에 세 개의 시스테인 간 결합 (S-S 결합, 이황화 결합)을 가지고 있으며, 알파와 베타 디펜신 간에 결합 양상에 차이가 있을 뿐 같은 그룹 안에서는 그 결합 양상 또한 일정하다. 베타 디펜신들은 1-5, 2-4, 3-6 사이에 세 개의 시스테인 간 결합 (S-S 결합, 이황화 결합) 존재하며, 좀 더 긴 40여개에서 50여개의 아미노산 잔기들로 구성되어 있다. 기본적으로 세 개의 베타 시트와 하나의 알파 헬릭스 구조를 유지하지만, 시스테인 사이의 아미노산 숫자 등이 어느 정도 다양하여 3차구조의 양상 및 활성도가 좀 더 다양한 것으로 알려져 있다. 20여 년 전 1980년대 발표된 알파 디펜신에 비해, 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신-1 (HBD-1)이 1995년도에 인간의 혈청에서 처음 분리 동정된 이후 지금까지 11개가 생화학적으로 동정되었다. 인간 베타 디펜신들의 유전체는 인간 염색체 8번에 위치해 있으며, 인간 유전체 프로젝트의 완성 후, schutte 등이 HMMER (a Computational search tool based on hidden Markov models)라는 프로그램을 BLAST와 병렬 연결하여 조사한 결과, 이 8번 염색체에 28개의 인간 베타 디펜신 유전자들이 추가적으로 존재할 수 있음을 확인하였다. 특히 그중 인간 베타 디펜신-25에서 -29 (HBD25-29)는 전립선등에만 유전자가 존재하는 등 매우 조직 특이적인 발현 양상을 보이고 있다. 인간 베타 디펜신-1(HBD-1)은 신장, 여성 생식기, 호흡기, 췌장, 잇몸, 혀, 중이 등의 상피세포에서 발현되며, 인간 베타 디펜신-2 (HBD-2)는 1997년 건선 (psoriasis) 환자의 상처부위에서 처음 발견된 후, 피부, 폐, 기도, 잇몸, 중이에서 발현되는 것으로 보고되었고 특이하게도 신장, 방광 등의 비뇨기관이나 침샘 등에는 전혀 존재하지 않는 것으로 알려져 있다. 인간 베타 디펜신-3 (HBD-3)은 생화학적 동정과 유전체 분석으로부터 거의 동시에 보고되어 피부 등에 발현됨이 알려졌으며, 인간 베타 디펜신-4 (HBD-4)는 BLAST 조사결과 유전자 서열이 먼저 알려진 후, 인간 베타 디펜신-1에서 -3 (HBD1-3)과는 달리 남성의 생식기 및 위장에서 발현되는 양상을 보인다. 최근에 본 발명자들은 인간 베타 디펜신 3와 C-말단은 유사하나 N-말단이 상이한 77개의 아미노산으로 구성된 베타 디펜신 3 유사체를 보고하고 특허등록하였다 (특허문헌 1).
아직까지 베타 디펜신을 포함한 다양한 항균 펩타이드들은 내성에 관한 보고가 없어서, 심각한 문제로 대두되고 있는 기존 항생제에 대한 내성 문제를 해결할 대안으로서의 차세대 항생제로서 항균펩타이드가 부각되고 있다. 또한 단백질에 비하여 크기가 작아서 화학 합성이나 펩타이드 합성 및 재조합 단백질로의 합성 등의 방법에 의하여 아미노산 서열에 여러 가지 변이를 쉽게 줄 수 있기 때문에 원래의 펩타이드보다 우수한 다양한 활성을 가진 펩타이드의 탐색이 가능하므로, 항생제, 기존 항생제의 활성을 촉진시켜 주는 보조제, 항암제, 항바이러스제, 식품첨가제, 농약 등에 이르기까지 다양하게 개발될 수 있는 가능성을 지니고 있으며, Magainin Pharmaceutical Inc., Micrologix Biotech Inc., Intrabiotics, Xoma를 포함하는 많은 회사에서 항균펩타이드를 개발하고 있다. 이러한 개발의 일환으로 최근 수십 개의 아미노산으로 구성된 항균 펩타이드들을 재조합 단백질로 생산하려는 노력은 꾸준히 이어지고 있다. 특히 대장균 (Escherichia coli)을 이용한 재조합 단백질로의 생산은 대장균의 빠른 증식, 높은 발현 수율 그리고 잘 연구된 단백질 생산 시스템이라는 이유로 많이 이용되고 있다. 그러나 목적 단백질이 항균 펩타이드인 경우 1) 축적된 단백질 산물이 생산 숙주에도 독성을 보일 가능성이 높다는 점, 2) 발현 산물의 독성을 피하기 위해 생산 숙주는 수용액상 (soluble) 단백질을 생산하는 대신 변성된 봉입체 (inclusion body) 단백질로 생산할 가능성 이 높다는 점, 그리고 3) 발현 산물의 독성을 피하기 위해 생산 숙주는 증대된 단백질 가수분해활성 (hydrolysis activity)으로 목적 단백질을 분해할 가능성이 높다는 점 등의 한계가 존재한다. 그러한 한계를 극복하기 위해, 대장균에서 잘 발생되지 않는 코돈 (codon)을 대장균에서 흔히 발생되는 코돈으로 대체하거나, 수용액상 발현을 증대시킬 수 있는 다른 단백질과 융합 단백질 (fusion protein) 형태로 생산하거나, 혹은 목적 단백질을 여러 개 연결적으로 반복시켜 (tendem repeat) 발현 정도를 증가시키기도 한다.
본 발명자들은 피부에서 주로 발현되어 광범위한 항균능력을 보이는 인간 베타 디펜신-3 그리고 이와 유사한 구조와 활성을 가지고 있는 인간 베타 디펜신-3 유사체(homolog)에 생체 내 결합 펩타이드의 물리적 안정성을 증대시키고, 장기간 활성을 유지하기 위하여, 라우릭산(lauric acid)를 융합함으로써, 장기 지속형 및 화장품 원료형 베타 디펜신-3 유도체인 라우로일 베타-디펜신 3 및 3H (lauroyl beta-defensin 3 및 lauroyl beta-defensin 3H (homolog))를 개발하고, 또, 세포투과성이 높은 짧은 서열의 펩타이드를 개발하여 피부투과형 유도체로 개발하였으며, 이들이 항균 활성이 있고, 이렇게 개발된 라우로일 베타-디펜신 3H(lauroyl beta-defensin 3H)를 함유하는 화장료 조성물이 아토피 피부염 및 여드름의 증상 개선에 유의적인 개선 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은, 라우로일이 결합된 베타 디펜신 3 또는 3H(homolog) 펩타이드 유도체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 유도체를 포함하는 여드름 또는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 유도체를 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 IWFGW의 아미노산 서열을 가지는 세포 투과성 펩타이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포투과성 펩타이드와 카페오일-알파-네오-엔돌핀이 결합된 펩타이드 유도체를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은, 라우로일이 결합된 베타 디펜신 3 또는 3H(homolog) 펩타이드 유도체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 베타 디펜신 3 또는 3H(homolog)는 인간 유래인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 베타 디펜신 3는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 베타 디펜신 3H는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 상기 펩타이드 유도체를 포함하는 여드름 또는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 펩타이드 유도체를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명은 IWFGW의 아미노산 서열을 가지는 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 상기 세포투과성 펩타이드와 카페오일-알파-네오-엔돌핀이 결합된 펩타이드 유도체를 제공한다.
본 발명에 따른 라우로일이 결합된 베타 디펜신 3 또는 3H(homolog) 펩타이드 유도체는 항균 활성이 있고, 아토피 피부염 및 여드름 개선능이 있어, 아토피 피부염을 비롯한 다양한 피부 개선용 화장품, 의약외품 및 의약소재로 응용가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 베타 디펜신 3 유사체 클로닝시의 발현 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 NHS로 활성화된 lauric acid와 beta-defensin 3H의 lauroylation 결과를 보여주는 HPLC 분석 결과 그래프이다.
도 3은 Lauroylation 반응 전 beta-defensin 3 및 -3H (A와 C)및 반응후 정제된 lauroyl beta-defensin-3 및 -3H (B와 D)의 HPLC 분석 결과 그래프이다.
도 4는 DMAP가 사용된 lauroylation 반응 시 beta-defensin 3H와 NHS-lauroic acid 몰비가 반응효율에 미치는 영향을 분석한 HPLC 분석 결과 그래프로, 반응몰비가 베타 디펜신 3H:라우로일기가 1:1인 경우(A), 1:2(B), 그리고 1:5(C)의 반응후 HPLC 크로마토그램을 보이는 결과이다.
도 5는 Lauroyl beta-defensin 3의 증대된 물리적 안정성에 관한 실험 결과이다. (좌) beta-defensin 3의 변온 안정성, (우) Lauroyl beta-defensin 3의 변온 안전성
도 6은 Lauroyl beta-defensin 3H의 증대된 물리적 안정성에 관한 실험 결과이다. (좌) Beta-defensin 3H의 변온 안정성, (우) Lauroyl beta-defensin 3H의 변온 안전성
도 7은 피부 각질형성세포에 대한 lauroyl beta-defensin 3의 세포 안전성을 실험한 결과 그래프이다.
도 8은 피부 각질형성세포에 대한 lauroyl beta-defensin 3H의 세포 안전성을 실험한 결과 그래프이다.
도 9는 피부 섬유아세포에 대한 lauroyl beta-defensin 3의 세포 안전성을 실험한 결과이다.
도 10은 피부 섬유아세포에 대한 lauroyl beta-defensin 3H의 세포 안전성을 실험한 결과이다.
도 11은 피부 섬유아세포에 대한 lauroyl beta-defensin 3및 -3H의 세포 안전성 (48시간, 37도)을 확인한 현미경 사진이다. A: 무첨가 대조군, B: lauroyl beta-defensin 3 1% 처리군, C: 무첨가 대조군, D: lauroyl beta-defensin 3H 1% 처리군
도 12는 Beta-defensin 3(black circle)와 -3H(black square) 및 lauroyl beta-defensin 3(black triangle) 와 -3H(black lozenge)의 항균 효과를 확인한 결과 그래프이다. (좌상) Propioneium acnes에 대한 항균 효과, (우상) Pseudomonas aeruginosa에 대한 항균 효과, (좌중) Streptococcus pygenes에 대한 항균 효과, (우중) Staphylococcus aureus에 대한 항균 효과, (좌하) Malassezia species에 대한 항균 효과, (우하) Candida albicanss에 대한 항균 효과
도 13은 Beta-defensin 3(black circle)와 -3H(black square) 및 lauroyl beta-defensin 3(black triangle) 와 -3H(black lozenge)의 항균 효과를 확인한 결과 그래프이다. (상) Bacillus subtilis에 대한 항균 효과, (중) Escherichi coli에 대한 항균 효과, (하) Salmonella typhymurium에 대한 항균 효과
도 14는 세포투과성펩타이드의 피부 투과능을 나타낸 현미경사진이다. (상) 선별된 세포투과성펩타이드의 세포 투과능, (하) 마우스 피부내 펩타이드 분포
도 2는 NHS로 활성화된 lauric acid와 beta-defensin 3H의 lauroylation 결과를 보여주는 HPLC 분석 결과 그래프이다.
도 3은 Lauroylation 반응 전 beta-defensin 3 및 -3H (A와 C)및 반응후 정제된 lauroyl beta-defensin-3 및 -3H (B와 D)의 HPLC 분석 결과 그래프이다.
도 4는 DMAP가 사용된 lauroylation 반응 시 beta-defensin 3H와 NHS-lauroic acid 몰비가 반응효율에 미치는 영향을 분석한 HPLC 분석 결과 그래프로, 반응몰비가 베타 디펜신 3H:라우로일기가 1:1인 경우(A), 1:2(B), 그리고 1:5(C)의 반응후 HPLC 크로마토그램을 보이는 결과이다.
도 5는 Lauroyl beta-defensin 3의 증대된 물리적 안정성에 관한 실험 결과이다. (좌) beta-defensin 3의 변온 안정성, (우) Lauroyl beta-defensin 3의 변온 안전성
도 6은 Lauroyl beta-defensin 3H의 증대된 물리적 안정성에 관한 실험 결과이다. (좌) Beta-defensin 3H의 변온 안정성, (우) Lauroyl beta-defensin 3H의 변온 안전성
도 7은 피부 각질형성세포에 대한 lauroyl beta-defensin 3의 세포 안전성을 실험한 결과 그래프이다.
도 8은 피부 각질형성세포에 대한 lauroyl beta-defensin 3H의 세포 안전성을 실험한 결과 그래프이다.
도 9는 피부 섬유아세포에 대한 lauroyl beta-defensin 3의 세포 안전성을 실험한 결과이다.
도 10은 피부 섬유아세포에 대한 lauroyl beta-defensin 3H의 세포 안전성을 실험한 결과이다.
도 11은 피부 섬유아세포에 대한 lauroyl beta-defensin 3및 -3H의 세포 안전성 (48시간, 37도)을 확인한 현미경 사진이다. A: 무첨가 대조군, B: lauroyl beta-defensin 3 1% 처리군, C: 무첨가 대조군, D: lauroyl beta-defensin 3H 1% 처리군
도 12는 Beta-defensin 3(black circle)와 -3H(black square) 및 lauroyl beta-defensin 3(black triangle) 와 -3H(black lozenge)의 항균 효과를 확인한 결과 그래프이다. (좌상) Propioneium acnes에 대한 항균 효과, (우상) Pseudomonas aeruginosa에 대한 항균 효과, (좌중) Streptococcus pygenes에 대한 항균 효과, (우중) Staphylococcus aureus에 대한 항균 효과, (좌하) Malassezia species에 대한 항균 효과, (우하) Candida albicanss에 대한 항균 효과
도 13은 Beta-defensin 3(black circle)와 -3H(black square) 및 lauroyl beta-defensin 3(black triangle) 와 -3H(black lozenge)의 항균 효과를 확인한 결과 그래프이다. (상) Bacillus subtilis에 대한 항균 효과, (중) Escherichi coli에 대한 항균 효과, (하) Salmonella typhymurium에 대한 항균 효과
도 14는 세포투과성펩타이드의 피부 투과능을 나타낸 현미경사진이다. (상) 선별된 세포투과성펩타이드의 세포 투과능, (하) 마우스 피부내 펩타이드 분포
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 라우로일이 결합된 베타 디펜신 3 또는 3H(homolog) 펩타이드 유도체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "라우로일"은 라우릭산(Lauric acid)에서 -OH기가 제거된 라디칼인 라우로일(Lauroyl)기를 의미한다.
본 발명에 있어서, 베타 디펜신 3 또는 3H는 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드이다. 베타 디펜신 3H는 베타 디펜신 3의 homolog(유사체)를 의미하며, 구체적으로는 본 발명자들이 출원하여 등록받은 특허(대한민국 등록특허 제10-0991293호)의 펩타이드이며, 상기 등록특허 제10-0991293호 명세서에 기재된 내용을 포함한다.
본 발명에 있어서, 기존에 베타 디펜신 3 또는 3H에 라우로일기를 결합(conjugate)한 새로운 펩타이드 유도체를 제작함으로써, 이러한 펩타이드 유도체는 생물학적 안정성, 물리적 안정성 등이 개선되고, 이는 하기 실시예를 통해서도 입증하였다.
구체적으로 라우로일이 결합된 베타 디펜신 3 또는 3H 유도체는 실시예 1에 제시된 바와 같이, 베타-디펜신 3 또는 3H를 생산한 다음, NHS로 활성화한 라우릭산을 이용해 laurylation을 유도한다. 이때, NHS로 활성화된 라우릭산과 베타-디펜신 3 및 3H의 반응 몰비는 라우릭산 : 베타-디펜신 3의 반응 몰비가 1:1 보다는, 1:4~5의 몰비가 바람직하다.
이렇게 제조된 라우로일이 결합된 베타-디펜신 3, 또는 3H는 다양한 변온 가속조건을 통해 물리적 안정성이 우수한 것이 실험예 결과를 통해 입증되었고, 각질형성세포 및 섬유아세포에 대한 세포독성 여부에서도 생물학적으로 매우 안정한 것으로 나타났다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드 유도체를 함유한 아토피 피부염, 또는 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 조성물은 아토피 피부염의 개선, 예방, 또는 치료의 효과를 가져오는 용량 범위로 라우로일이 결합된 베타-디펜신 3 또는 3H 펩타이드 유도체를 함유하는 것을 의미하고, 중증도 및 제형에 따라 용량범위는 변할 수 있으며, 적용횟수도 적용 대상의 연령, 체중 및 체질에 따라 변할 수 있다.
본 발명에서 “아토피 피부염”, "여드름"은, 아토피 피부염, 여드름에 의해 피부의 감염 부위가 변화된 상태를 의미하며, 이러한 상태는 피부 질환으로 간주되는 상태와 피부질환으로 간주되지 않은 상태를 모두 포함한다.
본 발명에서 “개선”은 본 발명의 화장료 조성물을 여드름 또는 아토피 피부염 부위에 적용한 결과로서 아토피 피부염 증세의 부분적 완치, 호전 및 경감을 포함한다.
본 발명에서 “예방”은 본 발명의 화장료 조성물을 피부, 특히 여드름, 아토피 피부염에 적용하여 피부에의 여드름, 아토피 피부염 증세를 억제 또는 차단함으로써, 여드름, 아토피 피부염 증세가 사전에 발생되지 않도록 하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드 유도체는 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001 내지 1,또는 내지 5, 또는 내지 10중량%를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 0.0001 중량% 미만인 경우, 그 효과가 미미하며, 10중량%를 초과하는 경우 안전성과 제형 안정성의 문제점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드 유도체는 화장료 조성물에 유효성분으로 적용되기 위해 본 기술분야의 공지 기술을 이용해 바람직한 형태로 변형, 가공되어 함유될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드 유도체를 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 특히, Propioneium acnes (ATCC or KTCC) (여드름), Pseudomonas aeruginosa (ATCC or KTCC) (화상감염, 농피염, 구내염), Streptococcus pygenes (ATCC or KTCC) (피부화농성질환, 농가진), Staphylococcus aureus (ATCC or KTCC) (아토피 피부염, 모낭염, 농가진), Malassezia species (ATCC or KTCC) (비듬, 탈모), Candida albicans (ATCC or KTCC) (칸디다증), Bacillus subtilis (ATCC or KTCC), Escherichia coli (ATCC or KTCC), Salmonella typhimurium (ATCC or KTCC) 등에 항균 효능이 있어, 이들 균의 감염에 의해 발생하는 다양한 질환에 대한 개선, 예방, 치료를 위한 항균용 조성물이 본 발명의 범위에 포함된다.
더 나아가, 비듬, 탈모를 유발하는 Malassezia species 에 대한 항균 효능이 있어, 비듬 개선, 비듬 억제, 탈모 방지, 탈모 억제를 위한 조성물, 헤어 제품으로써도 적용가능할 것이다.
본 발명은 또한, IWFGW의 아미노산 서열을 가지는 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 상기 세포투과성 펩타이드와 카페오일-알파-네오-엔돌핀이 결합된 펩타이드 유도체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 카페오일-알파-네오-엔돌핀은 카페오일(caffeoyl)기가 결합된 알파네오엔돌핀(티로신-글리신-글리신-페닐알라닌-루신-아르기닌-리신-티로신-프롤린-리신(YGGFLRKYPK)) 펩타이드 유도체로, 이에 대해서는 대한민국공개특허 10-2013-0032099에 제조과정 및 구조식에 대한 설명이 기재되어 있으며, 이러한 설명 내용은 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.
상기 담체는 본 발명의 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 두류 태좌 세포 배양 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 화장료 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드 유도체 함유 화장료 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 함유 화장료 조성물을 제조할 수 있다.
특히, 상기 화장료 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.
화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
이러한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 아토피 피부염, 여드름개선, 항균용 등을 비롯한 기능성 화장품의 형태를 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
재조합단백질 beta-defensin 3 및 -3H의 lauroylation 합성 개발
본 발명에서는 앞서 설명한 선행 특허기술 (발명의 명칭: 항균펩타이드 베타 디펜신 3 및 그 유사체의 재조합 단백질로의 대량 생산 방법, 출 원 번 호 10-2012-0119521)로 생산되는 재조합단백질 beta-defensin 3 및 -3H에 hydrosuccinimide (NHS) acylation으로 lauric acid를 conjugation하는 기술을 개발하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다.
1.1 재조합단백질 beta-defensin 3H 대량 생산
인간 베타 디펜신 3 유사체(beta-defensin 3H, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가짐)를 재조합 단백질로 발현하기 위한 발현벡터로의 클로닝은, 대한민국 등록특허 10-0991293호의 등록공보에 기재된 제조과정을 기반으로 하여, 다음과 같이 수행하였다.
우선 유전자 서열(서열번호 3로 확인된 인간 베타 디펜신 3 유사체(betadefensin 3H)의 cDNA 서열을 바탕으로 sense와 antisense의 각각 말단에 BamH I과 Nde I 제한효소 인식서열을 함유하는 프라이머를 디자인하고, 상기의 정제된 TA cloning 플라스미드를 주형으로하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 산물을 agarose gel에서 정제한 후, BamHI과 NdeI 제한효소들로 동시 절단하였다. 인간 베타 디펜신 3 유사체(beta-defensin 3H)를 pET-41b(+) 단백질 발현용 벡터로 클로닝하기 위하여 pET-41b(+) 벡터를 역시 BamHI과 NdeI 제한효소들로 동시 절단하였다. 이 제한효소 처리 산물을 agarose gel 전기영동 후 제한효소 절단이 확인된 벡터들만을 gel extraction으로 분리 정제하였다. 상기에서 제한 효소 동시 처리 후 준비된 인간 베타 디펜신 3 유사체(beta-defensin 3H)와 pET-41b(+) 단백질 발현용 벡터를 1:1 몰비로 ligation하여 BL21에 형질전환 하였다. 형질전환 시킨 후 kanamycin이 100 ug/ml 농도로 첨가된 LB agar plate에 도말하한 다음 37℃에서 배양하였다. 잘자란 콜로니들을 골라 동일 농도의 kanamycin이 함유한 LB배지 10 ml에 접종한 후 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양액에서 플라스미드를 정제하고, 정제된 플라스미드를 주형으로 하여 다시 sense primer와 anti-sense primer(서열번호 4 및 서열번호 5)
sense primer: 5'-AGTTATTTGAGGAATTCCAC (서열번호 4),
antisense primer: 5'-TTATTTCTTTCTTCGGCAGCA (서열번호 5)
를 사용한 PCR에서 정확한 PCR product를 보이는 콜로니를 선별하였다. 이 콜로니를 적절히 길러 glycerol을 첨가하여 발현 균주 stock을 만들고, 본 항균 단백질을 생산하는 종균으로 사용하였다. 단백질 발현용 pET-41b(+) 벡터로의 클로닝을 위한 발현벡터의 개열지도는 도 1과 같다.
위와 같이 얻어진 6X histidine tag를 갖는 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)를 함유하는 발현벡터를 갖는 BL21(DE3)를 100 ug/ml 농도의 kanamycin을 함유하는 2X LB 액체 배지 10ml에 접종한 후 30℃에서 하룻밤 배양하였다(전배양 하였다). 다음날 아침 동일한 농도의 kanamycin을 함유하는 2x LB배지 (조성 tryptone 20 g/liter, NaCl 20 g/liter, yeast extract 10 g/liter) 1L에 배양된 배양액 10 ml을 접종하여 (1/100 접종), 30℃에서 200 rpm으로 흔들면서 배양하였다. 660 nm에서 흡광도가 0.8에 도달하였을 때 최종 농도 1 mM에 해당하는 IPTG (Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 30℃에서 5시간 추가로 배양하였다.
인간 베타 디펜신 3 (beta-defensin 3, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가짐)도 상기와 동일한 과정을 통해 대량 생산하였다.
1.2 Lauric acid와 conjugation을 통한 lauroyl beta-defensin 3, 3H 생산
NHS로 활성화한 lauric aicd(C12H24O2, dodecanoic acid) 와 상기 1.1에서 얻어진 beta-defensin 3 및 -3H에 존재하는 lysine 잔기들간의 laurylation을 organic solvent 내에서 유도하였다. 간략하게 NHS로 활성화된 lauric aicd를 0.5mg/ml로 dimethylsulfoxide (DMSO)에 현탁한 후, 0.3% (v/v) triethylamine (TEA)를 첨가하고 상온에서 충분히 교반하였다. 동량의 부피로 재조합단백질로 정제된 beta-defensin 3 및 -3H를 DMSO에 2.5mg/ml로 녹여 혼합 처리하며 상온에서 1시간 교반하였다. 이 반응을 촉매하기위해 dimethylaminopyridine (DMAP)를 첨가하였다. 이때 NHS로 활성화된 lauric acid와 정제된 beta-defensin 3 및 -3H의 반응 몰비 및 반응 촉매로써 첨가된 DMAP가 lauroylation의 효율에 영향을 미침을 확인하고 최적의 반응 비율을 확인하였다.
반응후 목적하는 lauroyl beta-defensin 3 및 -3H를 순수하게 분리정제하기 위하여 reverse-phase HPLC를 사용하였으며, 동결 건조 후 적당한 농도로 재 현탁하여 추가 실험에 사용하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 제시된 바와 같이, HPLC 분석을 통해 베타 디펜신 3, 3H에 라우로일기를 붙이기 전과 붙인 후의 피크값들을 보면, Rt가 라우로일기 붙이기 전에는 Rt 10분경에 나타났으나, 붙인 후에는 18~20분경에 나타나 라우로일 베타 디펜신 3, 라우로일 베타 디펜신 3H가 생산, 정제되었음을 확인할 수 있었다. 그래프 내에서 X축은 HPLC의 retention time(머무름 시간)이고, Y축은 흡광도 강도(intensity)이다.
아울러, 상기와 같은 라우릭산과 베타디펜신 3, 3H의 반응시 반응 몰비를 다양하게 실험하였고, 구체적인 몰비 조건과 그에 따른 반응 결과 (도 4) 및 반응 수율은 아래 표 1과 같았다.
| 구분 | Molar ratio (beta-defensin 3H: NHS-Lauric Acid ratio) |
반응수율(%) ((-)DMAP대비) |
| - DMAP | 1:1 | 100 % (as control) |
| - DMAP |
1:2 | 124 % |
| - DMAP |
1:5 | 137 % |
| + DMAP (1 mole ratio) | 1:1 | 349 % |
| + DMAP (1 mole ratio) | 1:2 | 467 % |
| + DMAP (1 mole ratio) | 1:5 | 649 % |
따라서, 1:1로 반응시보다 약 6.5배 정도 반응 효율이 높은 1:5의 결과 등을 고려해보면, 반응시에 베타디펜신 3, 또는 3H와 라우릭산의 반응 몰비는 1:4~5가 바람직한 것으로 나타났다.
실험예
1:
Lauroyl
beta
-
defensin
3와
-3H의 물리적 및 생물학적 안정성 평가
1.1 물리적 안정성 평가
피부 유래 천연 항균펩타이드로써 뛰어난 생체 안전성과 피부 친화성을 갖는 신규한 lauroyl beta-defensin 3와 -3H의 증대된 물리적 안정성 평가를 beta-defensin 3 및 -3H와의 비교를 통해 수행하였다. 물리적 안정성을 평가하기 위하여 높은 순도로 정제된 항균펩타이드들을 5mg/ml로 조제한 후, 이를 대상으로 다양한 변온 가속조건 (10℃, 8시간 - 25℃ 8시간 - 45℃ 8시간, 변온싸이클 30회)에서 자연적으로 발생하는 물리적 순도 감소를 비교 평가하였다. 즉, 보관하여 처리 전, 10일째, 20일째, 그리고 30일째 샘플을 100ul씩 채취하여 Bio-analyzer (agilent Bio-analyzer 2100)을 사용하여 capillary electrophoresis로 분석하고 상대 함량(각 해당일에 라우로일기를 반응하지 않은 것 대비 라우로일기를 반응한 경우의 상대 존재량)을 평가함으로써 물리적 안정성을 평가하였다.
그 결과, lauric acid와 conjugation을 하지 않은 beta-defensin 3는 변온 가속조건 (10도, 8시간 - 25도 8시간 - 45도 8시간, 변온싸이클 30회)에서 20일째 그 함량이 24 12 %로 감소한 후, 30일째 8 15%로 크게 감소하였다. 그러나 lauric acid가 conjugation된 lauroyl beta-defensin 3의 경우는 20일째 그 함량이 72 11%로 안정성이 크게 증가하였으며, 30일째까지 43 9%로 lauric acid를 conjugation하지 않는 경우보다 5배 이상 안정함을 확인할 수 있었다 (도 5). beta-defensin 3H의 안정성에 관한 시험도 beta-defensin 3와 유사한 결과를 보였으며, lauric acid와 conjugation을 하지 않은 beta defensin 3H는 변온 가속조건 (10℃, 8시간 - 25℃ 8시간 - 45℃ 8시간, 변온싸이클 30회)에서 10일째, 20일째 그 함량이 52±16%, 28± 8%로 감소한 후, 30일째 10± 6%로 크게 감소하였다. 그러나 lauric acid가 conjugation된 lauroyl beta-defensin 3H의 경우는 20일째 그 함량이 80±14%로 안정성이 크게 증가하였으며, 30일째까지 51±17%로 lauric acid를 conjugation하지 않는 경우보다 역시 5배 이상 안정함을 확인할 수 있었다 (도 6).
1.2 생물학적 안정성 평가
피부 천연 항균펩타이드로써 beta-defensin 3와 -3H에 lauric acid를 결합함으로써 long acting and stable 개량형 소재로 개발된 lauroyl beta-defensin 3와 -3H 항균펩타이드들의 안전성을 인간의 피부를 구성하는 각질형성세포 (keratinocyte)와 섬유아세포 (fibroblast)에 대한 세포독성으로 시험하였다.
피부에 적용되어 피부 세포로 유도되었을 때 발생할 수 있는 피부세포가 분비하는 펩타이드 분해효소에 대한 생물학적 안정성을 확인하기 위하여 피부세포 파쇄액과 일정 기간 반응시켰다. 즉, 생물학적 안정성을 평가하기 위해서 인간의 피부세포를 구성하는 1×109의 keratinocyte와 fibroblast 세포 파쇄액과의 37℃에서 4시간 배양한 후 잔여된 항균펩타이드의 상대함량을 평가하는 방법(상기 1.1과 동일한 방법으로, 라우로일 베타 디펜신 3, 3H를 5mg/ml 농도로 조제한 후 보관하여 세포 유래 분해효소에 노출시키고, 노출 후 100ul씩 취하여 bio-analyzer로 측정)으로 생물학적 안정성을 평가하였다.
그 결과, 안정성 시험에서도 lauroylation이 펩타이드의 안정성을 증대 시키는 결과를 확인하였다. lauric acid의 conjugation이 피부 세포 파쇄액에서 유래되는 peptidase 및 protease로 부터 항균 펩타이드의 생물학적 안정성을 통계적으로 유의하게 보호하는 것으로 확인할 수 있었다 (표 2).
| beta-defensin 3 | lauroyl beta-defensin 3 | beta-defensin 3H | lauroyl beta-defensin 3H | |
| relative content (%) | 23±7 % | 43±4 % | 31±7 % | 55±9 % |
실험예
2:
Lauroyl
beta
-
defensin
3와
-3H의 생물학적 안전성 평가
피부 구성 세포들에 대한 세포 독성을 검사하기 위하여 in vitro MTT 시험을 수행하였다. 이를 위해, 인간 각질형성세포 cell line인 HaCat cell과 인간 섬유아세포 cell line인 CCD-986sk cell들을 사용하였으며, 다양한 항균펩타이드 농도에서의 세포독성 여부를 측정하였다. 일반적으로 피부 세포 배양을 이용한 안전성 실험은 인간의 피부를 직접 활용하는 실험보다 적게는 100배에서 많게는 1000배 이상 민감한 방법으로 알려져 있으며, 이는 시험물질이 피부 각질을 투과해야 하는 임상시험 환경에서 보다 직접 타겟 세포에 영향을 미칠 수 있으므로 매우 낮은 농도에서도 가능한 세포 독성을 쉽게 확인할 수 있다. 본 실험에서도 피부 세포들을 37℃, 5% CO2와 습윤화 된 배양기내에서 DMEM 배양액 (56℃에서 30분간 열처리한 FBS 10%와 1x antibiotic-antimycotic 항생제를 포함)을 함유한 배양플라스크에서 부착 배양한 후, 다양한 농도의 항균펩타이드들을 처리하여 24시간 동안 추가 배양한 후 MTT를 첨가한 후 Biotek사의 Microplate Spectrophotomer를 이용하여 세포독성 여부를 측정하였다.
2.1 각질형성세포에 대한 안전성 확인
Lauroyl-defensin 3를 1% (10,000 ppm), 0.1% (1,000 ppm), 0.01% (100 ppm), 0.001% (10 ppm), 그리고 0.0001% (1 ppm) 농도로 피부의 각질형성세포 세포주인 HaCaT 세포에 처리하여 실험한 결과, 피부를 구성하는 주요한 구성 세포인 각질형성세포 (keratinocyte)에 0.1% (1,000 ppm)까지 거의 세포 독성이 없이 안전한 것으로 확인되었다 (도 7). 0.0001%와 0.001%의 beta-defensin 3를 keratinocyte에 처리한 경우 각각 101±7.5%와 94±3.8%의 생존율을 보여 대조군과 비교하여 독성도 보이지 않았다. 0.01%와 0.1% 처리군들에서도 평균 생존율은 자체적으로 세포 독성이 없다고 판단하는 기준치인 90% 기준에 근소히 미달되는 89.1±5.7%와 89.5±7.8%를 보였지만, 표준편차를 고려해 보면 통계적으로 유의적인 독성이 없어, 세포에 안전한 것으로 확인되었다. 단지 1% 처리군에서는 62±8.2%로 독성이 나타났으나, 1%의 처리 농도는 화장품 원료 관점에서 10,000 ppm에 해당되는 매우 높은 농도이며, 세포 실험의 민감도가 100배 ~ 1,000배까지 민감하다고 고려할 때 본 연구개발의 주요 소재인 lauroyl beta-denfsin 3의 각질형성세포에 세포 독성은 없어 안전한 소재로 확인되었다.
Lauroyl beta-defensin 3H를 1% (10,000 ppm), 0.1% (1,000 ppm), 0.01% (100 ppm), 0.001% (10 ppm), 그리고 0.0001% (1 ppm) 농도로 피부의 각질형성세포 세포주인 HaCaT 세포에 처리하여 실험한 결과, lauroyl beta-defensin 3와 유사하게 0.1% (1,000 ppm)까지 거의 세포 독성이 없이 안전한 것으로 확인되었다 (도 8). 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 그리고 0.1% 농도를 fibroblast에 처리한 경우 각각 101.6±7.5%, 99.1±9.3%, 100.2±6.7%, 96.1±9.1%로 자체적으로 세포 독성이 없다고 판단하는 기준치인 90% 기준을 넘어 피부 구성 세포에 안전한 것으로 확인되었다. 단지 1% 처리군에서는 76±11.9%로 독성이 나타났으나, 1%의 처리 농도는 화장품 원료 관점에서 10,000 ppm에 해당되는 매우 높은 농도이며, 세포 실험의 민감도가 100배 ~ 1,000배까지 민감하다고 고려할 때 본 발명에 따른 lauroyl beta-denfsin 3의 세포 독성은 없어 안전한 소재로 확인되었다.
2.2 섬유아세포에 대한 안전성 확인
피부구성 세포들 중 진피를 구성하는 섬유아세포에 대한 세포 독성을 확인하기 위하여, lauroyl beta-defensin 3를 1% (10,000 ppm), 0.1% (1,000 ppm), 0.01% (100 ppm), 0.001% (10 ppm), 그리고 0.0001% (1 ppm) 농도로 CCD-986나 세포에 처리하여 실험한 결과, 시험에 사용된 1% (10,000 ppm)까지 거의 세포 독성이 없이 안전한 것으로 확인되었다 (도 9). Beta-defensin 3H에 laruic acid를 융합한 lauroyl beta-defensin 3H도 피부구성 세포들 중 진피를 구성하는 섬유아세포에 대한 세포 독성을 확인하기 위하여, lauroyl beta-defensin 3H를 1% (10,000 ppm), 0.1% (1,000 ppm), 0.01% (100 ppm), 0.001% (10 ppm), 그리고 0.0001% (1 ppm) 농도로 CCD-986나 세포에 처리하였다. MTT 시험법으로 세포 독성을 실험한 결과, 또한, 피부섬유아세포에 처리 후 (48시간, 37℃)를 톨루이딘 불루 염색 후 현미경으로 관찰한 결과, 시험에 사용된 1% (10,000 ppm)까지 거의 세포 독성이 없이 안전한 것으로 확인되었다 (도 10, 11).
실험예
3 :
Lauroyl
beta
-
defensin
3와
-3H의 항균 유효성 검증
피부 천연 항균펩타이드로써 long acting and stable 개량형으로 신규하게 연구개발된 lauroyl beta-defensin 3와 -3H 항균펩타이드들의 항균 유효성을 검증하였다. 이를 위해, 다양한 피부 질환 원인성 미생물들에 대한 항균 유효성을 항균 및 항진균 활성을 측정하는 일반적인 실험법들인 항균 최소저해농도법 (MIC assay)으로 측정하였다. 즉, MIC assasy의 경우 아래의 피부 질환 원인성 세균 혹은 진균들을 사용하여 미생물들의 농도가 600nm에서 optical density가 0.5에 도달할 때까지 배양한 다음 정제된 beta-defensin 3와 -3H 그리고 lauroyl-beta-defensin 3 및 -3H를 1mg/ml 농도 처리하였다. 처리 후 12시간동안 추가적으로 배양하면서, 이 배양 용액의 OD600nm에서 흡광도를 1시간 간격으로 측정하여 균체 생육의 저해 정도를 파악하였다. 측정에 사용한 미생물로 Propioneium acnes (ATCC or KTCC) (여드름), Pseudomonas aeruginosa (ATCC or KTCC) (화상감염, 농피염, 구내염), Streptococcus pygenes (ATCC or KTCC) (피부화농성질환, 농가진), Staphylococcus aureus (ATCC or KTCC) (아토피 피부염, 모낭염, 농가진), Malassezia species (ATCC or KTCC) (비듬, 탈모), Candida albicans (ATCC or KTCC) (칸디다증), Bacillus subtilis (ATCC or KTCC), Escherichia coli (ATCC or KTCC), Salmonella typhimurium (ATCC or KTCC) 등 다양한 인체 피부 및 피부 질환에 연관된 미생물을 대상으로 시험을 수행하였다.
그 결과, 합성 정제된 lauroyl beta-defensin들을 사용하여 시험관상에서 다양한 미생물들에 대한 항균 활성을 시험한 결과, lauroylation을 통해 거의 모든 시험 세균에 대한 항균활성과 시간에 따른 지속성이 증가됨을 확인하였다 (도 12 및 도 13) 그래프 내에 X축은 시간이고, Y축은 OD 값이다.
실험예
4 : 피부투과성
펩타이드
개발
5개 아미노산으로 이루어진 신규한 세포투과성펩타이드를 개발하기 위해, 20종의 아미노산을 무작위적인 서열로 합성하고 형광물질인 FITC를 표지한 후, 세포 투과도 활성이 가장 뛰어난 펩타이드를 선별하였다.
이를 위해 인간각질형성세포인 HaCaT 세포를 12 well plate에 2×105 cells/well 씩 분주하여 48시간 배양하고 PBS로 washing한 후, FBS가 함유되어 있지 않은 DMEM 배지를 넣었다. 형광물질 FITC가 표지된 펩타이드 50 uM을 1시간 동안 처리하였다. 세포막에 결합된 펩타이드는 proteinase K (10ug/ml)를 37℃에서 10분 동안 처리하여 제거한 후 유세포 분석기(FACs analysis)를 사용하여 분석하였다.
선별된 펩타이드에 의한 소재의 피부 투과능 증대 여부를 확인하기 위해, 모델 분자로써 효과가 알려진 생리활성 물질 중 caffeoyl-neo-endorphin에 적용하였다. 선별한 펩타이드를 caffeoyl-neo-endorphin의 카르복실 말단에 융합된 형태로 합성(합성 과정은 대한민국공개특허 10-2013-0032099에 기재된 바에 따라 수행)한 후, 사람의 피부와 가장 가까워 경피 흡수 시험에 널리 사용되는 HR-1 마우스(중앙실험동물, 한국)에 에 시료를 처리하여 확인하였다. 이를 위해 친수성 형광물질인 FNR-552(Bioacts社)로 표지한 펩타이드를 마취한 HR-1 마우스 허벅지 피부에 50㎕ (0.25mg/ml)를 처리하고, 1시간 후 마우스 피부 부분을 취하여 OCT(Optimum Cutting Temperature)용액에 조직을 고정시켰다. 조직을 수직으로 놓고 10um 크기로 cryosection하여 슬라이드 글라스에 고정시킨 후, 공초점현미경 (confocal microscopy)을 통해 피부 내 펩타이드 분포를 관찰하였다.
무작위적으로 합성된 펩타이드 중 IWFGW의 아미노산 서열을 가지고 있는 펩타이드가 세포투과 활성을 가지고 있었다. 선별된 펩타이드를 caffeoyl-neo-endorphin (CANE)에 융합하여 피부 전달능을 확인한 결과, 투여된 CANE은 대부분 피부 표면에 머물러 있고 투과가 거의 되지 않는 반면, 세포투과성펩타이드가 융합된 CANE (CANE-IWFGW)은 피부 침투가 잘 됨을 확인할 수 있었다 (도 14).
실험예
5 :
Lauroyl
beta
-
defensin
3H를 함유하는 화장품 조성물과
항아토피
및
항
여드름 효과
lauroyl beta-defensin-3H 항균펩타이드를 함유하는 화장품 조성물을 개발하고 이 조성물이 항아토피 및 항여드름 개선효과를 갖음을 검증하였다.
본 실험에서 아토피 피부염 및 여드름 개선효과를 확인하기 위하여 아토피 피부염과 여드름이 있는 성인 남녀 9명을 대상으로 14일간 lauroyl beta-defensin-3H 항균펩타이드를 화장품의 최종 농도로써 100ppm (100mg/Kg) 함유하는 화장품 조성물(아래 표 3의 조성)을 1일 2회 1 ml씩 혹은 1g씩 화장솜에 적셔 환부에 도포하는 방법으로 시험하였다. 14일간 도포 후 개선 효과는 매우효과, 약간 효과, 무효과, 악화의 4단계로 수치화 하였다.
| 번호 | 원 료 명 | 처방예 1 (%) | 대조예 1 (%) |
| 1 | lauroyl beta-defensin-3H | 0.0 (100ppm) | 0 (0ppm) |
| 2 | 식물성경화유 | 10.00 | 10.00 |
| 3 | 바세린 | 10.00 | 10.00 |
| 4 | 글리세린 | 10.00 | 10.00 |
| 5 | 모노스테아린산 폴리옥시에틸렌 소르비탄 | 0.10 | 0.10 |
| 9 | 산화방지제 | 3.00 | 3.00 |
| 11 | 부틸렌글라이콜 | 1.00 | 1.00 |
| 12 | 구연산 | 0.10 | 0.10 |
| 13 | 방부제 | 적량 | 적량 |
| 14 | 향료 | 적량 | 적량 |
| 15 | 정제수 | up to 100% | up to 100% |
그 결과, 아토피 피부염을 갖는 피험자 9명과 여드름을 갖는 피험자 9명에 대해 lauroyl beta-defensin 3를 100ppm 함유하는 화장품 조성료를 14일간, 1일 2회 사용한 결과, lauroyl beta-defensin 3를 함유하는 않은 대조용 화장품을 사용한 동일 피험자의 피부 부위에 대비하여 유의적인 개선을 확인할 수 있었다.
시험한 결과, 표 4에서처럼 아토피 피부염을 갖는 9명 전체 중 매우 효과 2명과 약간 효과 6명으로 개선 효과 있음이 전체의 88%에 해당하였다. 매우 효과의 개선 정도를 보인 대상자들의 경우 일반적으로 가려움증을 동반한 아토피성 피부염이 도포 4일째 상당히 진정되고 8일째 많은 짙무름등이 사라지고 피험자가 느끼는 개선정도가 매우 큼을 확인할 수 있었다.
| Lauroyl beta-defensin 3H 100ppm을 함유하는 화장품 조성물 | 매우 효과 | 2 명 | 22.2 % |
| 약간 효과 | 6 명 | 66.6 % | |
| 효과 없음 | 1 명 | 11.1 % | |
| 악화 | 0 명 | 0.0 % | |
| 비교 화장료 처방 | 매우 효과 | 0 명 | 0.0 % |
| 약간 효과 | 1 명 | 11.1 % | |
| 효과 없음 | 8 명 | 88.8 % | |
| 악화 | 0 명 | 0.0 % |
여드름의 개선효과에서는 표 5에서처럼 여드름을 갖는 9명 전체 중 매우 효과 4명과 약간 효과 3명으로 개선 효과 있음이 전체의 77%에 해당하였다. 매우 효과의 개선 정도를 보인 대상자들의 경우 일반적으로 발달된 염증을 동반한 여드름이 도포 6일째부터 상당히 진정되고 11일째 많은 부종이 사라지고 피험자가 느끼는 개선정도가 매우 큼을 확인할 수 있었다.
| Lauroyl beta-defensin 3H 100ppm을 함유하는 화장품 조성물 | 매우 효과 | 4 명 | 44.4 % |
| 약간 효과 | 3 명 | 33.3 % | |
| 효과 없음 | 2 명 | 22.2 % | |
| 악화 | 0 명 | 0.0 % | |
| 비교 화장료 처방 | 매우 효과 | 0 명 | 0.0 % |
| 약간 효과 | 1 명 | 11.1 % | |
| 효과 없음 | 8 명 | 88.8 % | |
| 악화 | 0 명 | 0.0 % |
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> BIO FD&C
<120> Development of long acting and cell permeable beta-defensin 3 and
-3H by conjugating lauric acid and cell permeable peptide
respectively and cosmetic compostion comprising the same
<130> 2013-12
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 67
<212> PRT
<213> beta defension 3
<400> 1
Met Arg Ile His Tyr Leu Leu Phe Ala Leu Leu Phe Leu Phe Leu Val
1 5 10 15
Pro Val Pro Gly His Gly Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr
20 25 30
Cys Arg Val Arg Gly Gly Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys
35 40 45
Glu Glu Gln Ile Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg
50 55 60
Arg Lys Lys
65
<210> 2
<211> 77
<212> PRT
<213> beta defensin 3 derivative
<400> 2
Met Ser Tyr Leu Arg Asn Ser Thr Ser Leu Val Arg Val Pro Lys Ala
1 5 10 15
Phe Leu Lys Pro Phe Arg Val Cys Cys Phe Val Ile Ala Gly His Gly
20 25 30
Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly Gly
35 40 45
Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gln Ile Gly Lys
50 55 60
Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys
65 70 75
<210> 3
<211> 231
<212> DNA
<213> beta defensin 3 derivative
<400> 3
agttatttga ggaattccac aagccttgta cgtgtaccaa aagccttcct aaaacctttc 60
cgtgtgtgct gttttgtcat tgcaggtcat ggaggaatca taaacacatt acagaaatat 120
tattgcagag tcagaggcgg ccggtgtgct gtgctcagct gccttccaaa ggaggaacag 180
atcggcaagt gctcgacgcg tggccgaaaa tgctgccgaa gaaagaaata a 231
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer
<400> 4
agttatttga ggaattccac 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense primer
<400> 5
ttatttcttt cttcggcagc a 21
Claims (8)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3H(homolog) 펩타이드에 라우로일(lauroyl)기가 결합된 펩타이드 유도체를 포함하는, 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스트렙토코커스 피오제네스 (Streptococcus pygenes), 말라쎄지아(Malassezia species), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 균에 대한 항균용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3H(homolog) 펩타이드에 라우로일(lauroyl)기가 결합된 펩타이드 유도체는,
상기 베타-디펜신(beta-defensin) 3 펩타이드 또는 베타-디펜신(beta-defensin) 3H(homolog) 펩타이드와 라우릭산이 1 : 1 내지 1: 5의 몰비로 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3H(homolog) 펩타이드에 라우로일(lauroyl)기가 결합된 펩타이드 유도체를 포함하는, 비듬 개선 또는 비듬 억제용 화장료 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3H(homolog) 펩타이드에 라우로일(lauroyl)기가 결합된 펩타이드 유도체는,
상기 베타-디펜신(beta-defensin) 3 펩타이드 또는 베타-디펜신(beta-defensin) 3H(homolog) 펩타이드와 라우릭산이 1 : 1 내지 1: 5의 몰비로 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3H(homolog) 펩타이드에 라우로일(lauroyl)기가 결합된 펩타이드 유도체를 포함하는, 말라쎄지아균에 의해 유발되는 탈모 방지용 화장료 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 베타-디펜신(beta-defensin) 3H(homolog) 펩타이드에 라우로일(lauroyl)기가 결합된 펩타이드 유도체는,
상기 베타-디펜신(beta-defensin) 3 펩타이드 또는 베타-디펜신(beta-defensin) 3H(homolog) 펩타이드와 라우릭산이 1 : 1 내지 1: 5의 몰비로 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2013/011904 WO2015093661A1 (ko) | 2013-12-19 | 2013-12-19 | 항균펩타이드 베타-디펜신 ３ 및 ３ｈ의 라우릭산 융합을 통한 장기지속형 유도체, 세포투과성 펩타이드 융합을 통한 피부투과형 유도체 개발과 이를 함유하는 화장료 조성물 |
| KR1020130159482A KR101620148B1 (ko) | 2013-12-19 | 2013-12-19 | 항균펩타이드 베타-디펜신 ３ 및 ３ｈ의 라우릭산 융합을 통한 장기지속형 유도체, 세포투과성 펩타이드 융합을 통한 피부투과형 유도체 개발과 이를 함유하는 화장료 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130159482A KR101620148B1 (ko) | 2013-12-19 | 2013-12-19 | 항균펩타이드 베타-디펜신 ３ 및 ３ｈ의 라우릭산 융합을 통한 장기지속형 유도체, 세포투과성 펩타이드 융합을 통한 피부투과형 유도체 개발과 이를 함유하는 화장료 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150072144A KR20150072144A (ko) | 2015-06-29 |
| KR101620148B1 true KR101620148B1 (ko) | 2016-05-12 |
Family
ID=53402993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130159482A Active KR101620148B1 (ko) | 2013-12-19 | 2013-12-19 | 항균펩타이드 베타-디펜신 ３ 및 ３ｈ의 라우릭산 융합을 통한 장기지속형 유도체, 세포투과성 펩타이드 융합을 통한 피부투과형 유도체 개발과 이를 함유하는 화장료 조성물 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101620148B1 (ko) |
| WO (1) | WO2015093661A1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101873827B1 (ko) | 2016-10-25 | 2018-07-03 | 주식회사 라파스 | 여드름 개선용 마이크로니들 패취 및 그 제조방법 |
| KR102068521B1 (ko) | 2018-10-29 | 2020-01-21 | 대한민국(농촌진흥청장) | 테레오그릴루신 2 펩타이드를 함유하는 여드름 또는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100991293B1 (ko) * | 2008-08-11 | 2010-11-01 | (주)바이오에프디엔씨 | 신규한 인간 베타 디펜신 유사 항균 펩타이드 및 이의 아토피 피부염 개선 소재로서의 활용 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2843125B1 (fr) * | 2002-08-02 | 2012-11-16 | Coletica | Principes actifs stimulant les beta-defensives humaines de type 2 et/ou de type 3, et compositions cosmetiques ou pharmaceutiques comprenant de tels principes actifs |
| KR100998081B1 (ko) * | 2008-04-23 | 2010-12-03 | 한국생명공학연구원 | 라우릭산을 유효성분으로 함유하는 항바이러스제 조성물 |
| CA2840215A1 (en) * | 2011-06-22 | 2012-12-27 | Abhijit S. BAPAT | Conjugate-based antifungal and antibacterial prodrugs |
| WO2013042811A1 (ko) * | 2011-09-22 | 2013-03-28 | (주)바이오에프디엔씨 | 카페오일알파네오엔돌핀 펩타이드 유도체 및 이의 항가려움 및 항아토피 소재로의 활용 |
-
2013
- 2013-12-19 KR KR1020130159482A patent/KR101620148B1/ko active Active
- 2013-12-19 WO PCT/KR2013/011904 patent/WO2015093661A1/ko active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100991293B1 (ko) * | 2008-08-11 | 2010-11-01 | (주)바이오에프디엔씨 | 신규한 인간 베타 디펜신 유사 항균 펩타이드 및 이의 아토피 피부염 개선 소재로서의 활용 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Nakatsuji T., et al., J Invest Dermatol. 130(4): 985-994 (2011. 3.15. 공개).* |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101873827B1 (ko) | 2016-10-25 | 2018-07-03 | 주식회사 라파스 | 여드름 개선용 마이크로니들 패취 및 그 제조방법 |
| KR102068521B1 (ko) | 2018-10-29 | 2020-01-21 | 대한민국(농촌진흥청장) | 테레오그릴루신 2 펩타이드를 함유하는 여드름 또는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20150072144A (ko) | 2015-06-29 |
| WO2015093661A1 (ko) | 2015-06-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101899552B1 (ko) | 전복에서 유래한 항균 펩타이드 유사체 및 이를 포함하는 항균용 약학 조성물 | |
| CN104379177B (zh) | 短抗微生物脂肽 | |
| KR101944388B1 (ko) | 피부 투과성 펩티드 및 그 이용방법 | |
| CN111518163B (zh) | 一类脂肽化合物在抗新型冠状病毒中的应用 | |
| KR101620148B1 (ko) | 항균펩타이드 베타-디펜신 ３ 및 ３ｈ의 라우릭산 융합을 통한 장기지속형 유도체, 세포투과성 펩타이드 융합을 통한 피부투과형 유도체 개발과 이를 함유하는 화장료 조성물 | |
| US10858395B2 (en) | Skin-penetrating peptide and method for using same | |
| KR100991293B1 (ko) | 신규한 인간 베타 디펜신 유사 항균 펩타이드 및 이의 아토피 피부염 개선 소재로서의 활용 | |
| KR102206808B1 (ko) | 신규한 세포-투과 펩타이드 및 이를 포함하는 피부 개선용 조성물 | |
| KR101430084B1 (ko) | 프로피오니박테리움 아크네스에 작용하는 신규한 항생 펩타이드 및 이의 용도 | |
| KR101433823B1 (ko) | 부챗말 추출물 또는 분획물을 이용한 피부 외용제 조성물 | |
| DE60125809T2 (de) | Diastereomere peptide und diese umfassende arzneimittel | |
| KR102093209B1 (ko) | 이소트레티노인과 펩타이드의 결합체 | |
| KR101977800B1 (ko) | 슈도모나스 속 균주 특이적 항균펩타이드 및 이를 포함하는 항균용 조성물 | |
| KR102215798B1 (ko) | 항균 펩타이드를 포함하는 보존제 및 이를 이용한 화장료 조성물 | |
| KR102540598B1 (ko) | 태평양굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이의 용도 | |
| KR102541856B1 (ko) | Fk-13 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물 | |
| KR101326164B1 (ko) | 항균성 피부 외용제 조성물 | |
| KR102114842B1 (ko) | 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자를 함유하는 피부 생리활성 피부외용제 조성물 | |
| KR102554966B1 (ko) | 인돌리시딘 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물 | |
| KR102114845B1 (ko) | 세포 투과형 혈관내피세포성장인자 융합 단백질을 함유하는 피부 생리활성 피부외용제 조성물 | |
| KR20110040371A (ko) | 세포투과성 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 융합단백질의 세포투과도를 증가시키는 들쭉 추출물 | |
| KR20230094681A (ko) | 폴리아미도아민 덴드리머 유도체를 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물 | |
| KR20090026382A (ko) | 세포 도입성 ｐｔｅｎ 융합 단백질 | |
| KR101791286B1 (ko) | 키틴질 분해효소를 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| KR20240124177A (ko) | 신규한 양친매성 항진균 펩타이드 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20131219 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20150514 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Final Notice of Reason for Refusal Patent event date: 20151125 Patent event code: PE09021S02D |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20160428 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20160503 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20160503 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190415 Year of fee payment: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20190415 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20200519 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20210422 Start annual number: 6 End annual number: 6 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20240429 Start annual number: 9 End annual number: 9 |