KR101614558B1

KR101614558B1 - 인간 소르틸린의 결정 구조 및 소르틸린에 대한 리간드를 확인하기 위한 이의 용도

Info

Publication number: KR101614558B1
Application number: KR1020107026378A
Authority: KR
Inventors: 페터센 옌스 클라우스 문크; 포울 니쎈; 마드센 페데르 쇤데르가르드; 회그 퀴스트가르드 에스벤 멜드가르드; 그뢰프테하우게 모르텐 켈러; 티루프 쇠렌 스코우; 크라머 야콥 플뤼브호름; 안데르센 야콥 라우링
Original assignee: 하. 룬드벡 아크티에셀스카브
Priority date: 2008-04-27
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2016-04-22
Anticipated expiration: 2029-04-27
Also published as: KR20110018324A; JP2011518791A; EP2274327B1; WO2009132656A3; WO2009132656A2; CN102131826B; US20110160439A1; CN102131826A; JP5715045B2; EP2274327A2; ES2730972T3; HK1160148A1; US8377701B2

Abstract

본 발명은 소르틸린 결정 및 상기 결정의 증대 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 소르틸린의 결정 구조를 기초로 하는, 특이적 리간드의 설계 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 중추 신경계 및 말초 신경계의 질환, 손상 또는 장애 치료용 약제의 제조를 위한 상기 리간드의 제조 및 용도에 관한 것이다.

Description

인간 소르틸린의 결정 구조 및 소르틸린에 대한 리간드를 확인하기 위한 이의 용도 {CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN SORTILIN AND USES THEREOF FOR IDENTIFYING LIGANDS TO SORTILIN}

출원 또는 본 출원에서 인용되는 모든 특허 및 비-특허 참고문헌은 그 전문이 참고문헌으로 본원에 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 인간 수용체 소르틸린 (Sortilin) 의 X-선 결정학에 의해 수득된 원자 좌표에 의해 기술되는 Vps10p-도메인 수용체의 3 차원 구조에 관한 것이다. 본 발명은 또한 소르틸린 결정의 증대 방법에 관한 것이다. 3 차원 구조를 기초로 하여, 소르틸린의 특이적 관능성에 대한 상세한 정보가 수득된다. 본 발명은 또한 소르틸린의 결정 구조를 기초로 하는, Vps10p-도메인 수용체의 특이적 리간드의 스크리닝, 확인 및/또는 설계 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 소르틸린, p75^NTR 과 프로뉴로트로핀 예컨대 proNGF 및 proBDNF 사이에서의 3 성분 복합체의 형성을 저해하기 위한 상기 리간드의 용도 및 제조에 관한 것이다. 본 발명은 또한 소르틸린의 아고니스트로서 작용할 수 있는 리간드의 확인에 관한 것이다. 본 발명은 또한 중추 신경계 및 말초 신경계의 질환, 손상 또는 장애를 치료하기 위한 상기 리간드의 용도 및 제조에 관한 것이다.

뉴로텐신 (Neurotensin) 수용체 3 (NTR3), 당단백질 (Glycoprotein) 95 (Gp95) 또는 Swiss Prot ID NO.Q99523 의 100 kDa NT 수용체로 지칭되는 소르틸린은 신경영양 인자 및 신경펩티드에 결합하는 다른 리간드 중에서 고유한 Vps10p-도메인 (Vps10p-D) 에 의해 정의되는 뉴런 수용체 (1-3) 의 포유류 패밀리의 원형적 멤버이다 (4-8). 이러한 도메인은 소르틸린의 전체 관강내 (luminal) 부분 (s소르틸린) 을 구성하며, 효소적 프로펩티드 절단에 의한 리간드 결합을 위해 활성화된다 (4, 5). 소르틸린은 세포내 이입 뿐 아니라 세포내 분류 (sorting) 가 가능한 다관능성 타입-1 수용체이며 (9-11), 최근 나타나는 바와 같이, p75^NTR-매개 뉴런 세포자멸사의 프로-뉴로트로핀-유도 촉발에 의한 신호에 또한 관계된다 (6, 7, 12, 13). 소르틸린은 효소적 절단 및 짧은 N-말단 프로펩티드의 제거에 의해 성숙 소르틸린으로 전환되는 프로단백질로서 합성된다. 오직 성숙한 수용체만이 리간드에 결합하며, 흥미롭게도, 알려져 있는 모든 리간드, 예를 들어 뉴로텐신 (NT), 지질단백질 리파아제, 신경 성장 인자-β (proNGF) 및 뇌 유래 신경영양 인자 (proBDNF) 의 전구형, 수용체 관련 단백질 (RAP) 및 이의 고유한 프로펩티드는 결합을 위해 경쟁하는데 (5-7, 10), 이는 다양한 리간드가 공유 또는 부분적으로 공유된 결합 위치를 목표로 한다는 것을 나타낸다. NT 는 소르틸린, SorLA (또 다른 Vps10p-D 수용체) 및 두 가지 G-단백질 결합 수용체 NTR1 및 NTR2 에 결합하는 트리데카펩티드이다 (4, 14-16). 소르틸린과 관련된 NT 의 생리학적 역할은 완전히 밝혀지지 않았으며 (17), NT 는, 모든 다른 리간드가 소르틸린 Vps10p-D 에 결합하는 것을 저해하기 때문에 여전히 중요한 수단이다.

발명의 요약

주요한 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 결정에 관한 것이다:

a) SEQ ID NO.1 의 폴리펩티드;

b) 상기 SEQ ID NO.1 과 60% 이상의 서열 동일성을 갖는, 상기 폴리펩티드의 서열 변이체;

c) 소르틸린 활성을 나타내는, a) 에서 b) 중 임의의 200 개 이상의 근접 아미노산을 포함하는 절편,

d) 하나 이상의 리간드와의 복합체에서의 a) 에서 c) 중 임의의 것.

추가적인 측면에서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 결정 증대 방법에 관한 것이다:

a. 50 mM Tris-HCl pH 7.9 및 150 mM NaCl 을 포함하는 완충액 중 SEQ ID NO.1 의 폴리펩티드 또는 이의 절편 또는 변이체 4.5 내지 5.5 mg/㎖ 를 포함하는 조성물을 수득하는 단계;

b. 상기 조성물을 하기의 몰 비율로 뉴로텐신과 혼합하는 단계:

i. 1:1.5 내지 1:15 (s소르틸린:NT), 또는

ii. 1:4 (s소르틸린:프로펩티드),

c. 상기 조성물 및 결정화 용액을 각각 동등한 부피로 하는 단계로서, 상기 결정화 용액이 하기를 함유함:

i. 18-21% w/v PEG 6000, 및

ii. 0-15% 글리세롤, 및

iii. Tris-HEPES pH 7.2-7.8 (40-93 mM Tris 및 100 mM HEPES) 또는 100 mM Tris-HCl pH 7.9, 3-6% 글리세롤 및

iv. 300-900 mM NaCl 또는 150-400 mM C₃H₂Na₂O₄ (상기 C₃H₂Na₂O₄ 는 말론산으로 pH 6-7.5 로 조정됨), 또는 300-500 mM LiSO₄ 또는 500-700 mM KCl, 및

d. SEQ ID NO.1 또는 이의 절편 또는 변이체를 포함하는 결정을 수득하는 단계.

또 다른 측면에서, 본 발명은 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 설명한 바와 같은 소르틸린의 구조 좌표 (structure coordinates) 의 일부 이상으로 인코딩된 데이터 저장 물질을 포함하는 컴퓨터-판독가능 데이터 저장 매체에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 것 중 하나 이상에 결합할 수 있는 리간드를 확인하는 방법에서의, 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 바와 같은 원자 좌표, 또는 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차 (root mean square deviation) 에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 바와 같은 3 차원 구조에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표의 용도에 관한 것이다:

a. 결합 위치 1, 또는

b. 결합 위치 2, 또는

c. 결합 위치 3,

또는 c 까지의 것의 절편 또는 변이체.

추가적인 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, SEQ ID NO.1 (소르틸린) 의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체에 결합할 수 있는 리간드의 확인 방법에 관한 것이다:

a) 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 바와 같은 원자 좌표, 또는 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 3 차원 구조에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표를 사용하여 컴퓨터 스크린 상에서 결합 위치의 공간 구조를 생성하는 단계,

b) 컴퓨터 스크린 상에서 그의 공간 구조를 갖는 잠재적 리간드를 생성하는 단계, 및

c) 입체 간섭이 없는 결합 상호 작용 위치 세트의 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 리간드를 선별하는 단계.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 프로세서, 데이터 저장 시스템, 데이터 입력 장치 및 데이터 출력 장치를 포함하는 프로그래밍된 컴퓨터를 사용하여 SEQ ID NO.1 (소르틸린) 의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체에 결합할 수 있는 소르틸린의 리간드를 확인하기 위한 컴퓨터-지원 방법에 관한 것이다:

a) 프로그래밍된 컴퓨터에, 상기 입력 장치를 통해 소르틸린의 원자 서브세트의 원자 좌표를 포함하는 데이터를 입력함으로써 기준 데이터 세트를 생성하는 단계 (상기 원자 좌표는 도 17 내지 20 중 임의의 것에 나타낸 3 차원 구조에서 선택되거나, 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 3 차원 구조에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표임),

b) 상기 프로세서를 사용하여, 데이터 저장 시스템에 저장된 저분자량 유기 화학 구조 및 펩티드 절편의 컴퓨터 데이터베이스와 기준 데이터 세트를 비교하는 단계, 및

c) 컴퓨터 방법을 사용하여, 기준 데이터 세트와 구조적으로 상보적인 부분을 가지며 수용체 소르틸린으로의 입체 간섭을 갖지 않는 화학 구조를 상기 데이터베이스로부터 선별하는 단계.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 리간드 확인 방법에 관한 것이다:

a) SEQ ID NO.1 (소르틸린) 의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체 내의 결합 상호 작용 위치 세트에 잠재적 리간드를 도킹 (상기 결합 상호 작용은 컴퓨터 모델링에 의해 생성됨) 하고, 소르틸린의 상기 결합 상호 작용 위치 세트에서의 하나 이상의 아미노산에 결합할 수 있는 잠재적 리간드를 선별함으로써, 컴퓨터 모델링과 함께 원자 좌표를 사용하여 잠재적 리간드를 선별하는 단계 (상기 원자 좌표는 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 원자 좌표이거나, 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 3 차원 구조에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택됨),

b) 상기 잠재적 리간드 및 상기 수용체 소르틸린을 제공하는 단계,

c) 잠재적 리간드를 상기 수용체 소르틸린과 접촉시키는 단계, 및

d) 잠재적 리간드에 의해 상기 수용체 소르틸린의 결합을 검출하는 단계.

추가적인 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 소르틸린의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체의 잠재적 리간드의 확인 방법에 관한 것이다:

a) 3 차원 구조 결정을 기초로, SEQ ID NO.1 (소르틸린) 의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체의 배좌를 정의하는 원자 좌표에서 유래한 정보를 컴퓨터에 도입함으로써 컴퓨터 프로그램이 상기 배좌의 구조를 이용하거나 컴퓨터 스크린 상에 디스플레이하는 단계 (상기 원자 좌표는 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 3 차원 구조에서 선택되거나, 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것으로 표시한 3 차원 구조 중 임의 하나에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표임);

b) 상기 컴퓨터 프로그램에 의해 컴퓨터 스크린 상에 소르틸린의 결합 위치 1, 결합 위치 2 또는 결합 위치 3 의 3 차원 표시를 생성하는 단계,

c) 상기 결합 위치 1, 결합 위치 2 및 결합 위치 3 의 표시 위에 잠재적 리간드의 모델을 겹쳐 놓는 단계,

d) 소르틸린의 결합 위치 1 (고친화성 뉴로텐신 결합 위치), 결합 위치 2 (저친화성 뉴로텐신 결합 위치), 결합 위치 3 (프로-뉴로트로핀 결합 위치), 또는 이의 절편 또는 변이체로 잠재적 리간드의 입체 간섭의 부재 및 결합 가능성을 평가하는 단계,

e) 상기 수용체 소르틸린의 결합 검정에서 상기 잠재적 리간드 화합물을 혼입하는 단계, 및

f) 상기 잠재적 리간드가, SEQ ID NO.6 의 아미노산 잔기 19 내지 241 (proNGF), SEQ ID NO.6 의 아미노산 잔기 19 내지 121 (NGF 프로 도메인), SEQ ID NO.7 의 아미노산 잔기 19 내지 246 (proBDNF), SEQ ID NO.7 의 아미노산 잔기 19 내지 127 (BDNF 프로 도메인), SEQ ID NO.8 의 아미노산 잔기 17 내지 257 (proNT3), SEQ ID NO.8 의 아미노산 잔기 17 내지 140 (NT3 프로 도메인), SEQ ID NO.9 의 아미노산 잔기 25 내지 210 (proNT4/5), SEQ ID NO.9 의 아미노산 잔기 25 내지 80 (NT4/5 프로 도메인), SEQ ID NO.10 (뉴로텐신), SEQ ID NO.11 (PYIL), SEQ ID NO.10 의 아미노산 잔기 11 내지 13 (YIL) 및 SEQ ID NO.12 (NT69L) 로 이루어지는 군에서 선택되는 경쟁 리간드의 결합을 저해하는지 여부를 측정하는 단계.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, Vps10p-도메인 수용체 단백질 분자 원자 모델의 구축 방법에 관한 것이다:

a. SEQ ID NO.1 과 20% 이상의 서열 동일성을 갖는 Vps10p-도메인 수용체 또는 이의 절편 또는 변이체를 확인하는 단계, 및

b. 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 바와 같은 원자 좌표, 또는 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것에 나타낸 3 차원 구조에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표를 이용하여, 상동성 모델링에 의해 확인된 Vps10p-도메인 수용체 원자 모델을 수득하는 단계.

중요한 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 방법에 의해 확인되는 리간드 화합물에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 방법에 의해 확인된 리간드에 관한 것이며, 상기 리간드는 상기 결합 위치 1 의 하나 이상의 상호 작용 지점에 결합할 수 있고, 상기 상호 작용 지점은 하기와 같은, 도 14 의 X₁, X₂, X₃, X₄, R₁, R₂, J₁, J₂ 및 J₃ 을 포함한다:

X₁ 은 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 R325, S316 및 Y351 을 포함하고,

X₂ 는 Y351 의 골격 카르보닐을 포함하고,

X₃ 은 I353 의 골격을 포함하고,

X₄ 는 K260 의 아미노기를 포함하고,

R₁ 은 아미노산 잔기 I327, F314, Y351, I353 및 M363 을 포함하고,

R₂ 는 F350, 및 아미노산 잔기 T397 내지 E401 을 포함하는 루프로부터의 하나 이상의 아미노산을 포함하고,

J₁ 은 S305 를 포함하고,

J₂ 는 F306 의 골격 아미드를 포함하고,

J₃ 은 F306 의 골격 카르보닐을 포함함.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같이 확인된 소르틸린의 저해제를 포함하는 약제에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 개인에서의 신경계의 질환, 장애 또는 손상 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 기재된 방법에 의해 확인된 하나 이상의 리간드의 용도에 관한 것이다.

중요한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 (I) 의 일반적 구조를 갖는, 상기 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다:

[식 중,

X 는 N, O, S, P 로 이루어지는 군에서 선택되는, 수소 공여체로서 역할하는 원자이고,

Y 는 O, N, S, F, Cl, Br, I 로 이루어지는 군에서 선택되는 수소 결합 수용체로서 역할하는 음전성 원자이고,

R₁ 은 C3-6 알킬, C4-6 시클릴, 각각 1 개 고리, 4 내지 6 개 고리원 및 1 내지 3 개 헤테로원자를 갖는 헤테로시클릭 또는 헤테로방향족 구조, 또는 N, O, S(O)_0-2 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 3 개 헤테로원자를 포함하는 헤테로알킬이고,

R₂ 는 수소, C1-12 알킬, 또는 각각 1-3 개 고리, 3-8 개 고리원 및 0 내지 4 개 헤테로원자를 갖는 방향족, 카르보시클릭, 헤테로시클릭 또는 헤테로방향족 구조, 또는 N, O, S(O)_0- ₂ 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 8 개 헤테로원자를 포함하는 헤테로알킬이고,

R₃ 은 수소, SH, 이미다졸, C1-12 알킬, 또는 각각 1-3 개 고리, 3-8 개 고리원 및 0 내지 4 개 헤테로원자를 갖는 방향족, 카르보시클릭, 헤테로시클릭 또는 헤테로방향족 구조, 또는 N, O, S 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 8 개 헤테로원자를 포함하는 헤테로알킬이고,

R₄ 는 관능기 C1-100 선형 또는 분지형 알킬, 선형 또는 분지형 알케닐, 선형 또는 분지형 알키닐, 페닐, 벤질, 할로알칸, 클로로알칸, 브로모알칸, 요오도알칸, 할로포르밀, 히드록실, 카르보닐, 알데히드, 카르보네이트 에스테르, 카르복실레이트, 카르복실, 에테르, 에스테르, 히드로퍼옥시, 퍼옥시, 카르복사미드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 암모늄, 1차 케티민, 2차 케티민, 1차 알디민, 2차 알디민, 이미드, 아지드, 아조 (디이미드), 시아네이트, 이소시아니드, 이소티오시아네이트, 니트레이트, 니트릴, 니트로소옥시, 니트로, 니트로소, 피리이딜, 포스피노, 포스페이트, 포스포노, 술포닐, 술피닐, 술프히드릴 (SH), 티오시아네이트, 디술피드, 링커 L2 또는 L3, 및 SEQ ID NO:10 과 50% 이상 동일한 아미노산 서열 또는 이의 절편에서 선택됨].

보다 중요한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 (II) 의 일반적 구조를 갖는, 상기 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다:

[식 중,

Z 는 카르보닐, 히드록실, 아미노, 이미노, 아미드, 술프히드릴, 클로로, 플루오로로 이루어지는 군에서 선택되는 수소 결합 공여체 또는 수용체이고,

R₅ 는 H, CH₃ 및 링커 L2 로 이루어지는 군에서 선택되고,

R₆ 은 H, -CH₃, -CH₂CH₃ 및 -OCH₃ 으로 이루어지는 군에서 선택되고,

R₇ 은 글루타메이트, 글루타민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 티로신, 메티오닌, 시스테인, 지방족 C4-6 기의 측쇄로 이루어지는 군에서 선택되고,

R₈ 은 티로신, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 아스파르테이트, 아스파라긴, 시스테인, 페닐알라닌, 요오도-티로신 및 -CH₂-NH₂ 의 측쇄로 이루어지는 군에서 선택되고,

R₉ 는 리신, 아르기닌, 글루타민, C3-8 지방족 및 헤테로지방족기, 카르보시클릭 및 헤테로시클릭기 (5 또는 6 원 고리 포함) 의 측쇄로 이루어지는 군에서 선택되고,

R₁₀ 은 10 이상의 길이의 피로글루타메이트, 폴리-카르보히드레이트 및 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택되고,

R₁₁ 및 R₁₂ 는 개별적으로, H, C1-12 선형 또는 분지형 알킬, 선형 또는 분지형 알케닐, 선형 또는 분지형 알키닐, 페닐, 벤질, 할로알칸, 클로로알칸, 브로모알칸, 요오도알칸, 할로포르밀, 히드록실, 카르보닐, 알데히드, 카르보네이트 에스테르, 카르복실레이트, 카르복실, 에테르, 에스테르, 히드로퍼옥시, 퍼옥시, 카르복사미드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 암모늄, 1차 케티민, 2차 케티민, 1차 알디민, 2차 알디민, 이미드, 아지드, 아조 (디이미드), 시아네이트, 이소시아니드, 이소티오시아네이트, 니트레이트, 니트릴, 니트로소옥시, 니트로, 니트로소, 피리이딜, 포스피노, 포스페이트, 포스포노, 술포닐, 술피닐, 술프히드릴 (SH) 로이루어지는 군에서 선택되고,

공유 결합 (1) 및 (2) 는 개별적으로, 단일 결합 및 이중 결합으로 이루어지는 군에서 선택됨].

매우 중요한 측면에서 본 발명은, 하기 화학식 (III) 의 일반적 구조를 갖는, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다:

[식 중,

R₁₃ 은 H, C1-12 알킬, 알케닐, 알키닐 및 링커 L3 으로 이루어지는 군에서 선택되고,

R₁₄, R₁₅, R₁₇, R₁₉, R₂₀ 은 개별적으로, H, C1-12 알킬, 알케닐 및 알키닐로 이루어지는 군에서 선택되고,

R₁₆ 은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 히스티딘, 시스테인, 리신 및 지방족 C3-7 의 측쇄로 이루어지는 군에서 선택되고,

R₁₈ 은 H, -CH₃ 및 -CH₂OH 로 이루어지는 군에서 선택되고,

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현된 RRPYI(chg) 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현된 iodoYIL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현된 QIL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현된 YCL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현된 dYIL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현된 YHL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현된 RRPYI(acc) 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현된 RRPYI(nMe)L 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현된 YIL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 본원에서 기재된 치료적 유효량의 약제를, 이를 필요로 하는 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 병리학적 상태의 치료 방법에 관한 것이다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 포유류 뉴런 세포를 상기 본원에서 정의한 바와 같은 리간드 분자에 노출시키는 것을 포함하는, 포유류 뉴런 세포에서의 세포자멸사의 방지 방법에 관한 것이다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 포유류 뉴런 세포를 상기 본원에서 정의한 바와 같은 리간드 분자에 노출시키는 것을 포함하는, 포유류 뉴런 세포의 생존 증강 방법에 관한 것이다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 포유류 세포의 조성물에 상기 본원에서 정의한 바와 같은 리간드 분자를 투여하는 것을 포함하는, 포유류 세포 조성물의 확장 방법에 관한 것이다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 포유류 세포의 조성물에 상기 본원에서 정의한 바와 같은 리간드 분자를 투여하는 것을 포함하는, 포유류 세포 조성물의 분화 방법에 관한 것이다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO.1 의 결합 위치 1 에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO.1 의 결합 위치 2 에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO.1 의 결합 위치 3 에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은 상기 본원에서 기재한 바와 같은 항체, 및 세포독성제 예컨대 화학요법제, 독소 또는 방사성 동위원소; 특이적 결합쌍의 일원, 예컨대 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 항원; 검출가능한 생성물을 만들어낼 수 있는 효소로 이루어지는 군에서 선택되는 접합체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

정의

보강제: 투여된 면역성 결정인자 / 항원과 혼합되어 상기 결정인자에 대한 면역 반응을 증가시키거나 다르게는 변형시키는 임의의 물질.

친화성: 대부분의 리간드와 이의 결합 위치와의 상호 작용은 결합 친화성에 의해 특징지어질 수 있다. 일반적으로, 고친화성 리간드 결합은 리간드와 이의 수용체 사이의 더 큰 분자내 힘으로 인한 것인 반면, 저친화성 리간드 결합은 리간드와 이의 수용체 사이의 더 적은 분자내 힘을 수반한다. 일반적으로, 고친화성 결합은 저친화성 결합의 경우에서보다, 이의 수용체 결합 위치에서 리간드에 대한 더 긴 잔류 시간을 수반한다. 일부 결합 에너지가 수용체에서의 배좌 변화를 일으키는데 사용되어, 연관된 이온 채널 또는 효소의 거동을 변경시킬 수 있는 경우, 리간드의 수용체에 대한 고친화성 결합은 종종 생리학적으로 중요하다.

수용체에 결합할 수 있고, 수용체의 기능을 변형시키고 생리학적 반응을 촉발할 수 있는 리간드를 상기 수용체에 대한 아고니스트라고 지칭한다. 수용체에 결합하는 아고니스트는, 얼마나 많은 생리학적 반응이 촉발될 수 있는지와, 생리학적 반응을 생성하기에 필요한 아고니스트의 농도에 의해 특징지어질 수 있다.고친화성 리간드 결합은, 상대적으로 낮은 농도의 리간드가 리간드 결합 위치를 최대로 점유하고 생리학적 반응을 촉발하기에 적절하다는 것을 뜻한다. 저친화성 결합은, 결합 위치가 최대로 점유되고 리간드에 대한 최대의 생리학적 반응이 달성되기 전에 상대적으로 높은 농도의 리간드가 필요하다는 것을 뜻한다. 리간드 결합은 종종, 절반의 수용체 결합 위치가 점유되는, 해리 상수 (k_d) 로 알려지는 리간드의 농도에 의해 특징지어진다.

알코올: 하나 이상의 히드록실기 (OH) 를 함유하는 유기 화합물의 부류. 본 문맥에서는, 큰 분자 상에서 치환기로서 존재하는 포화 또는 불포화, 분지 또는 미분지된 탄화수소기.

지환족기: 용어 "지환족기" 는 지방족기와 유사한 특성을 갖는 시클릭 탄화수소기를 의미한다.

지방족기: 본 발명의 문맥에서는, 용어 "지방족기" 는 포화 또는 불포화 선형 또는 분지형 탄화수소기를 의미한다. 상기 용어는 예를 들어 알킬, 알케닐, 및 알키닐기를 포함하는데 사용된다.

알킬기: 용어 "알킬기" 는 예를 들어 메틸, 에틸, 이소프로필, t-부틸, 헵틸, 도데실, 옥타데실, 아밀, 2-에틸헥실 등을 포함하는 포화된 선형 또는 분지형 탄화수소기를 의미한다.

알케닐기: 용어 "알케닐기" 는 비닐기와 같은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화, 선형 또는 분지형 탄화수소기를 의미한다.

알키닐기: 용어 "알키닐기" 는 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화, 선형 또는 분지형 탄화수소기를 의미한다.

암피필 ( Amphiphil ): 극성, 수용성기 및 비극성, 비수용성기를 모두 함유하는 물질.

아고니스트: 아고니스트는 수용체와 같은 효과기의 활성을 증가시킬 수 있는 화합물이다. 특히, 소르틸린 아고니스트는 하나 이상의 결합 위치 1, 2 및 3 에 결합하여 주어진 내인성 아고니스트 리간드 화합물과 동일한 생리학적 반응을 유도할 수 있는 화합물이다.

길항제: 길항제는 수용체와 같은 효과기의 활성을 감소시킬 수 있는 화합물이다. 특히, 소르틸린 길항제는 하나 이상의 결합 위치 1, 2 및 3 에 결합하여 또 다른 리간드의 결합을 저해함으로써 생리학적 반응을 저해할 수 있는 화합물이다.

세포자멸사: 세포자멸사는 다세포 유기체에서의 세포에 의한 자살 과정이다. 이는 세포예정사 (PCD) 의 주요 유형 중 하나이며, 특징적 세포 형태 및 사멸을 일으키는 편성된 일련의 생화학적 사건을 포함한다.

세포자멸사 저해제: 세포자멸사 과정을 감소시킬 수 있는 임의의 화합물.

방향족기: 용어 "방향족기" 또는 "아릴기" 는 모노- 또는 폴리-시클릭 방향족 탄화수소기를 의미한다.

결합: 용어 "결합" 또는 "연관" 은 화학적 부분 또는 화합물 또는 이의 일부 사이의 근접함의 상태를 의미한다. 결합은 비공유 (수소 결합 또는 반 데르 발스 또는 정전 상호 작용에 의해 병치가 에너지적으로 바람직한) 결합일 수 있거나, 공유 결합일 수 있다.

결합 위치: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "결합 위치" 또는 "결합 포켓" 은, 이의 형상의 결과로서 바람직하게는 또 다른 분자, 분자 복합체, 화학적 부분 또는 화합물과 연관되는 분자 또는 분자 복합체의 부위를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 포켓은 하나 이상의 깊은 중공 및, 임의로는 얕은 중공을 포함한다.

결합 위치 1: 뉴로텐신의 고친화성 결합 위치 또는 동의적인 결합 위치 1 은, 뉴로텐신 또는 뉴로텐신의 절편 또는 변이체에 대해 높은 친화성을 가지며 소르틸린 프로펩티드 또는 이의 절편 (SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 34-77) 에 대해 친화성을 갖는 소르틸린 (SEQ ID NO.1) 의 결합 위치이며, 상기 결합 위치는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 내지 M363, S305, F306, T398 내지 G400, I303-G309, Q349-A356, Y395 및 T402 를 포함한다. 보다 바람직하게는, 결합 위치 1 은 SEQ ID NO.1 의 아미노산 R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 내지 M363, S305, F306 및 T398 내지 G400 을 포함한다. 가장 바람직하게는, 소르틸린의 결합 위치 1 은 SEQ ID NO.1 의 아미노산 R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314 및 F350 내지 M363 을 포함한다. 결합 위치 1 은 불규칙한 (promiscuous) 결합 위치이다.

결합 위치 2: 뉴로텐신 또는 뉴로텐신의 절편 또는 변이체에 대해 낮은 친화성을 갖는 소르틸린의 결합 위치이며, 상기 결합 위치는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 L572, L114, V112, R109 내지 S111, S115 내지 G118, T570, G571, W586, W597, T168-I174, L572, A573 및 S584 내지 F588 을 포함한다. 보다 바람직하게는, 뉴로텐신의 소르틸린 저친화성 결합 위치는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 L572, L114, V112, R109 내지 S111, S115 내지 G118, T570, G571, W586 및 W597 를 포함한다. 가장 바람직하게는, 뉴로텐신의 소르틸린 저친화성 결합 위치는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 L572, L114 및 V112 를 포함한다. 결합 위치 2 는 불규칙하며, 소르틸린의 프로펩티드 (SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 34-77) 에 결합할 수 있다.

결합 위치 3: SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 D403, S420, D422, N423, S424, I425, E426, T451, Y466, E470, I498, S499 및 V500, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 D403, N423, S424, I425, T451, Y466, I498 및 V500, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 T451, Y466, I498 및 V500 을 포함하는 소르틸린의 불규칙한 결합 위치.

생물반응제: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "생물활성제" 는 예를 들어 환자에서의 질환 존재 또는 부재의 진단 방법 및/또는 환자에서의 질환의 치료 방법과 같은 치료 또는 진단적 적용과 관련하여 사용될 수 있는 임의의 한 물질을 의미한다. "생물활성제" 는 시험관내 및/또는 생체내에서 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 물질을 의미한다. 생물활성제는 중성, 양성 또는 음성으로 하전될 수 있다. 적합한 생물활성제는 예를 들어, 전구약물, 진단제, 치료제, 약학제, 약물, 산소 전달제, 혈액 대체물, 합성 유기 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 비타민, 스테로이드, 스테로이드 유사체, 및 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적 결정인자를 포함한다.

대뇌 허혈: 포괄적인 대뇌 허혈은 뇌가 정상적인 신경 기능을 유지하기에 충분한 혈류를 받지 못하는 허혈 상태이다.

양이온기: 화학기를 포함하는 화합물이 용매, 바람직하게는 물에 용해되는 경우 양자 공여체로서 기능할 수 있는 화학기.

복합체: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "복합체" 는 화학적 부분과 연관된 분자 또는 단백질, 이의 보존적 유사체 또는 절단물을 의미한다.

좌표: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "좌표" 는 단백질 구조에 기여하는 원자의 3 차원적 조직의 정보를 의미한다. 결정 구성물의 원자 좌표를 함유하는 최종 맵 (map) 은 데이터 캐리어에 저장될 수 있고; 전형적으로는 상기 데이터는 PDB 포맷 또는 mmCIF 포맷으로 저장되며, 이들 둘 모두는 당업자에게 알려져 있는 것이다. 그러나, 결정 좌표는 또한 단순한 표 또는 텍스트 포맷으로 저장될 수 있다. PDB 포맷은 [Research Collaboratory for Structural Biology] 에 의해 주어진 지시사항 및 가이드라인에 따라 조직화된다.

결정: 용어 "결정" 은 물질의 정돈된 상태를 의미한다. 단백질은, 그의 성질에 의해 균등물로 정제하기가 어렵다. 심지어 고도로 정제된 단백질이라도, 변형, 리간드의 결합 또는 다른 효과의 호스트로 인해 만성적으로는 이종성일 수 있다. 또한, 단백질은 표적 분자 뿐 아니라 완충액, 염, 침전제, 물 및 임의 수의 작은 결합 단백질을 포함할 수 있는 일반적으로 복합적인 용액으로부터 결정화된다. 단백질 결정이 단백질 뿐 아니라 큰 백분율의 용매 분자, 특히 물로 구성된다는 것에 주의하는 것이 중요하다. 이는 30% 내지 심지어 90% 로 가변적일 수 있다. 단백질 결정은 본원에서 열거되거나 상세히 예견될 수 없는 다량이고 다양한 범위의 불순물을 축적할 수 있다. 종종, 이종의 덩어리는 핵형성 중심으로서 역할하며, 결정은 단순히 이들을 둘러싸며 증대된다. 당업자는 일부 결정이 다른 것들보다 양호하게 회절한다는 것을 숙지하고 있다. 결정은 크기에 있어서, 가까스로 관찰가능한 20 마이크론 내지 1 mm 이상으로 가변적이다. X-선 분석에 유용한 결정은 전형적으로 단일한, 0.05 mm 이상이고 흠 및 결점이 없는 것이다.

시클릭기: 용어 "시클릭기" 는 지환족기, 방향족기 또는 헤테로시클릭기로서 분류되는 폐환 탄화수소기를 의미한다.

시클로알케닐: 히드록시, 시아노, 저급 알케닐, 저급 알콕시, 저급 할로알콕시, 알케닐티오, 할로, 할로알케닐, 히드록시알케닐, 니트로, 알콕시카르보네닐, 아미노, 알케닐아미노, 알케닐술포닐, 아릴술포닐, 알케닐아미노술포닐, 아릴아미노술포닐, 알킬술포닐아미노, 아릴술포닐아미노, 알케닐아미노카르보닐, 아릴아미노카르보닐, 알케닐카르보닐아미노 및 아릴카르보닐아미노로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 개 치환기로 임의 치환될 수 있는, 고리 당 3 내지 8 개 탄소의, 1, 2 또는 3 개 고리로 이루어지는 1 가 불포화 카르보시클릭 라디칼을 의미한다.

시클로알킬: 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 할로알콕시, 알킬티오, 할로, 할로알킬, 히드록시알킬, 니트로, 알콕시카르보닐, 아미노, 알킬아미노, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 알킬아미노술포닐, 아릴아미노술포닐, 알킬술포닐아미노, 아릴술포닐아미노, 알킬아미노카르보닐, 아릴아미노카르보닐, 알킬카르보닐아미노 및 아릴카르보닐아미노로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 개 치환기로 임의 치환될 수 있는, 고리 당 3 내지 8 개 탄소의, 1, 2 또는 3 개 고리로 이루어지는 1 가 포화 카르보시클릭 라디칼을 의미한다.

쌍극 - 쌍극 상호 작용: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "쌍극-쌍극 상호 작용" 은 둘 이상의 극성 분자 사이에서 발생할 수 있는 인력을 의미한다. 따라서, "쌍극-쌍극 상호 작용" 은 제 1 극성 분자의 비하전된, 부분적 양성 말단의, 제 2 극성 분자의 비하전된, 부분적 음성 말단으로의 인력을 의미한다. "쌍극-쌍극 상호 작용" 은 또한 분자내 수소 결합을 의미한다.

정전 상호 작용: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "정전 상호 작용" 은, 반대 전하 성분이 서로 유인되는 경우 인력에 의해 하전된 성분, 분자 또는 이온 사이에 발생하는 임의의 상호 작용을 의미한다. 이의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 이온성 상호 작용, 공유 상호 작용, 이온과 쌍극 (이온과 극성 분자) 사이의 상호 작용, 두 쌍극 (극성 분자의 부분적 전하) 사이의 상호 작용, 수소 결합 및 런던 분산 결합 (London dispersion bond) (분극가능 분자의 유도된 쌍극). 따라서, 예를 들어 "이온성 상호 작용" 또는 "정전 상호 작용" 은 제 1 의, 양전하를 띤 분자 및 제 2 의, 음전하를 띤 분자 사이의 인력을 의미한다. 이온성 또는 정전 상호 작용은, 예를 들어 음전하를 띤 생물활성제 사이의 인력을 포함한다.

고리 형성: 고리 구조가 형성될 때, 언급한 원자가 결합을 통해 연결되는 것을 의미한다.

절편: 본 발명에 따른 폴리펩티드 절편 (이의 임의의 기능적 동등물 포함) 은, 한 구현예에서 500 개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 450 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 400 개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 350 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 300 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 250 개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 240 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 225 아미노산 잔기, 예컨대 200 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 180 개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 160 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 150 개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 140 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 130 개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 120 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 110 개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 100 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 90 개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 85 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 80 개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 75 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 70 개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 65 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 60 개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 55 개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 50 개 미만의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 뉴로텐신의 절편은 비제한적으로, 뉴로텐신 PYIL 및 YIL 의 C-말단 아미노산을 포함한다.

기: (부분 / 치환) 이러한 기술 분야에서 널리 이해되는 바와 같이, 큰 정도의 치환은 용인될 뿐 아니라 종종 권장된다. 치환은 본 발명의 물질에서 예견되는 것이다. 본 출원에서 사용된 특정 용어의 인용 및 토의를 단순화하기 위한 수단으로서, 용어 "기" 및 "부분" 은 치환을 허용하거나 치환될 수 있는 화학적 종류와, 치환을 허용하지 않거나 또한 치환될 수 없는 종류 사이를 구별하는데 사용된다. 따라서, 용어 "기" 가 화학적 치환기를 기술하는데 사용되는 경우, 기술된 화학적 물질은 비치환기, 및 예를 들어 사슬 내에 O, N 또는 S 원자를 갖는 기 뿐 아니라 카르보닐기 또는 기타 통상적 치환을 포함한다. 용어 "부분" 이 화학적 화합물 또는 치환기를 기술하는데 사용되는 경우, 오직 비치환된 화학적 물질만이 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 어구 "알킬기" 는 순수한 개방쇄 포화 탄화수소 알킬 치환기 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, t-부틸 등 뿐 아니라, 당업계에 알려져 있는 추가적인 치환기를 포함하는 알킬 치환기 예컨대 히드록시, 알콕시, 알킬술포닐, 할로겐 원자, 시아노, 니트로, 아미노, 카르복실 등을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, "알킬기" 는 에테르기, 할로알킬, 니트로알킬, 카르복시알킬, 히드록시알킬, 술포알킬 등을 포함한다. 한편, 어구 "알킬 부분" 은 오직 순수한 개방쇄 포화 탄화수소 알킬 치환기 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, t-부틸 등을 포함하는 것으로 한정된다. 동일한 정의가 "알케닐기" 및 "알케닐 부분"; "알키닐기" 및 "알키닐 부분"; "시클릭기" 및 "시클릭 부분; "지환족기" 및 "지환족 부분"; "방향족기" 또는 "아릴기" 및 "방향족 부분" 또는 "아릴 부분"; 뿐 아니라 "헤테로시클릭기" 및 "헤테로시클릭 부분" 에도 적용된다.

헤테로시클릭기: 용어 "헤테로시클릭기" 는 고리 내의 하나 이상의 원자가 탄소 외의 원소 (예를 들어 질소, 산소, 황 등) 인 폐환 탄화수소를 의미한다.

헤테로시클릴은 고리 당 3 내지 8 개 원자의, 1 내지 2 개 고리로 이루어지며 1 또는 2 개 고리 헤테로원자 (N, O 또는 S(O)_0- ₂ 에서 선택됨) 를 포함하고, 히드록실, 옥소, 시아노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 할로알콕시, 알킬티오, 할로, 할로알킬, 히드록시알킬, 니트로, 알콕시카르보닐, 아미노, 알킬아미노, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 알킬아미노술포닐, 아릴아미노술포닐, 알킬술포닐아미노, 아릴술포닐아미노, 알킬아미노파르보닐, 아릴아미노카르보닐, 알킬카르보닐아미노, 또는 아릴카르보닐아미노로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 개 치환기로 임의 치환될 수 있는 1 가 포화 시클릭 라디칼을 의미한다.

헤테로아릴은 고리 당 4 내지 8 개 원자의, 1 내지 3 개 고리를 가지며 고리 내에 1 또는 2 개 고리 헤테로원자 (질소, 산소 또는 황에서 선택됨) 를 포함하는, 히드록시, 시아노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 할로알콕시, 알킬티오, 할로, 할로알킬, 히드록시알킬, 니트로, 알콕시카르보닐, 아미노, 알킬아미노, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 알킬아미노술포닐, 아릴아미노술포닐, 알킬술포닐아미노, 아릴술포닐아미노, 알킬아미노카르보닐, 아릴아미노카르보닐, 알킬카르보닐아미노 및 아릴카르보닐아미노로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 개 치환기로 임의 치환될 수 있는 1 가 방향족 시클릭 라디칼을 의미한다.

상동: 아미노산 서열 사이의 상동은 BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85 및 BLOSUM 90 중 임의 하나와 같은 널리 알려져 있는 측정 행렬 (scoring matrix) 을 사용하여 계산될 수 있다.

SEQ ID NO:1 내지 13 의 절편과 상동성을 공유하는 절편은 각각, 이들이 상기 지정 절편 서열과 각각 바람직하게는 약 60% 이상 상동, 예를 들어 65% 이상 상동, 예를 들어 70% 이상 상동, 예를 들어 75% 이상 상동, 예를 들어 80% 이상 상동, 예를 들어 85% 이상 상동, 예를 들어 90% 상동, 예를 들어 92% 이상 상동, 예컨대 94% 상동, 예를 들어 95% 이상 상동, 예컨대 96% 이상 상동, 예를 들어 97% 이상 상동, 예컨대 98% 이상 상동, 예를 들어 99% 이상 상동인 경우 본 발명의 범주 내에 해당되는 것으로서 고려된다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상동 % 는 동일성 % 를 의미한다.

펩티드 절편의 구조 및 기능 관계를 측정하기 위한, 보다 적합하게 순응될 수 있는 방법은 참고문헌으로 본원이 포함되는 US 6,013,478 에 기재되어 있다. 또한, 아미노산 서열의 수용체 부분으로의 결합을 검정하는 방법은 숙련된 기술자에게 알려져 있는 것이다.

바람직한 지정 프로-뉴로트로핀 활성 조절자 또는 이의 절편의 임의 위치에 도입된 보존적 치환에 추가적으로, 이러한 프로-뉴로트로핀 활성 조절자의 임의의 하나 이상의 위치에 비-보존적 치환을 도입하는 것이 또한 바람직할 수 있다.

프로-뉴로트로핀 활성 조절자의 기능적으로 동등한 절편의 형성을 일으키는 비-보존적 치환은 예를 들어, i) 극성에 있어서 실질적으로 상이 (예를 들어, 비-극성 측쇄를 갖는 잔기 (Ala, Leu, Pro, Trp, Val, Ile, Leu, Phe 또는 Met) 가 Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn 또는 Gln 과 같은 극성 측쇄를 갖는 잔기 또는 Asp, Glu, Arg 또는 Lys 과 같은 하전된 아미노산에 대해 치환되거나, 하전된 또는 극성 잔기가 비-극성 잔기에 대해 치환됨) 하고/하거나; ii) 또 다른 잔기에 의한 Pro 또는 Gly 에 대한 치환과 같은 폴리펩티드 골격 동향에 대한 이의 효과에 있어서 실질적으로 상이하고/하거나; iii) 전하에 있어서 실질적으로 상이 (예를 들어, Lys, His 또는 Arg 과 같은 양전하를 띤 잔기에 대한 Glu 또는 Asp 와 같은 음전하를 띤 잔기의 치환 (반대로도 동일)) 하고/하거나; iv) 입체적 벌크에 있어서 상이 (예를 들어, Ala, Gly 또는 Ser 과 같은 소수 측쇄를 갖는 것에 대한 His, Trp, Phe 또는 Tyr 과 같은 벌키한 잔기의 치환 (반대로도 동일)) 하다.

한 바람직한 구현예에서, 아미노산의 치환에 의해 수득된 변이체는 소수성 및 친수성 값, 및 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성 (전하, 크기 등 포함) 을 기준으로 생성된다. 고려되는 전술한 다양한 특징을 갖는 예시적 아미노산 치환은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.

본원에 기재된 변이체에 추가적으로, 변이체 구조의 중요한 부분을 모방하도록 입체적으로 유사한 변이체가 고안될 수 있으며, 이러한 화합물은 또한 본 발명의 변이체로서 동일한 방법으로 사용될 수 있다. 이는 당업자에게 알려져 있는 모델링 및 화학적 설계 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 모든 입체적으로 유사한 구성물들이 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것이 이해될 것이다.

추가적인 구현예에서 본 발명은 치환된 아미노산 값의 +/-4.9 이내, 예를 들어 +/-4.7 이내, 예컨대 +/-4.5 이내, 예를 들어 +/-4.3 이내, 예컨대 +/-4.1 이내, 예를 들어 +/-3.9 이내, 예컨대 +/-3.7 이내, 예를 들어 +/- 3.5 이내, 예컨대 +/-3.3 이내, 예를 들어 +/- 3.1 이내, 예컨대 +/- 2.9 이내, 예를 들어 +/- 2.7 이내, 예컨대 +/-2.5 이내, 예를 들어 +/- 2.3 이내, 예컨대 +/- 2.1 이내, 예를 들어 +/- 2.0 이내, 예컨대 +/- 1.8 이내, 예를 들어 +/- 1.6 이내, 예컨대 +/- 1.5 이내, 예를 들어 +/- 1.4 이내, 예컨대 +/- 1.3 이내, 예를 들어 +/- 1.2 이내, 예컨대 +/- 1.1 이내, 예를 들어 +/- 1.0 이내, 예컨대 +/- 0.9 이내, 예를 들어 +/- 0.8 이내, 예컨대 +/- 0.7 이내, 예를 들어 +/- 0.6 이내, 예컨대 +/- 0.5 이내, 예를 들어 +/- 0.4 이내, 예컨대 +/- 0.3 이내, 예를 들어 +/- 0.25 이내, 예컨대 +/- 0.2 이내인 친수성 값 또는 수치료 지수를 갖는 치환된 아미노산을 포함하는 기능적 변이체에 관한 것이다.

단백질에 상호 작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서의 친수성 및 수치료 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 잘 이해되고 있다 (Kyte & Doolittle, 1982 및 Hopp, 미국 특허 제 4,554,101 호, 각각 본원에 참고문헌으로 포함됨).

본원에서 사용되는 바와 같은 아미노산 수치료 지수 값은 하기와 같다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4 ); 트레오닌 (-0.7 ); 세린 (-0.8 ); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5) (Kyte & Doolittle, 1982).

아미노산 친수성 값은 하기와 같다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0.+-.1); 글루타메이트 (+3.0.+-.1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5.+-.1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4) (U.S. 4,554,101).

본원에서 기재된 펩티딜 화합물에 추가적으로, 펩티드 구조의 중요한 부분을 모방하도록 입체적으로 유사한 화합물이 고안될 수 있으며, 이러한 화합물은 또한 본 발명의 펩티드로서 동일한 방법으로 사용될 수 있다. 이는 당업자에게 알려져 있는 모델링 및 화학적 설계 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 테트라 펩티드 구조를 모방하기 위해, 에스테르화 및 다른 알킬화가 사용되어 예를 들어 디-아르기닌 펩티드 골격의 아미노 말단을 개질할 수 있다. 이러한 모든 입체적으로 유사한 구성물들이 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것이 이해될 것이다.

N-말단 알킬화 및 C-말단 에스테르화를 갖는 펩티드가 또한 본 발명 내에 포함된다. 기능적 동등물은 또한, 동일 또는 다른 프로-뉴로트로핀 활성 조절자 절편 및/또는 프로-뉴로트로핀 활성 조절자 분자 (이량체 또는 비관련된 화학적 부분 포함) 로 형성된 글리코실화되고 공유결합성 또는 응집성인 접합체를 포함한다. 상기 기능적 동등물은, 당업계에 알려져 있는 수단에 의해 N- 및 C-말단 중 임의 하나 또는 둘 모두를 포함하는 절편에서 발견되는 기에 관능기를 결합시킴으로써 제조된다.

따라서, 기능적 동등물은 지방족 또는 아실 에스테르 또는 카르복실 말단의 아미드, 알킬아민 또는 카르복실 측쇄를 포함하는 잔기에 접합된 절편 (예를 들어 아스파르트산 잔기에서 알킬아민에 접합됨); 히드록실기-포함 잔기의 O-아실 유도체, 및 잔기를 포함하는 아미노기 또는 아미노 말단 아미노산의 N-아실 유도체에 접합된 절편 (예를 들어 fMet-Leu-Phe 또는 면역성 단백질에 접합됨) 을 포함할 수 있다. 아실기의 유도체는 알킬-부분의 군 (C3 내지 C10 노르말 알킬 포함) 에서 선택되어, 그로 인해 알카노일 종류, 및 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 화합물을 형성함으로써, 아로일 종류를 형성한다. 반응성 기는 바람직하게는, 반응성 측기를 통해 불용성 매트릭스에 단백질을 가교시키는데 사용하기 위해 자체적으로 알려져 있는 이관능성 화합물이다.

공유결합성 또는 응집성 기능적 동등물 또는 이의 유도체는 면역검정에서의 시약으로서, 또는 친화성 정제 절차에 유용하다. 예를 들어, 본 발명에 따른 프로-뉴로트로핀 활성 조절자의 절편은 항-뉴로트로핀 활성 조절자 항체 또는 세포 표면 수용체의 검정 또는 정제에서 사용하기 위해, 자체적으로 알려져 있는 방법에 의해 시아노겐 브로마이드-활성 세파로오스에 공유 결합되어 불용성화될 수 있거나, 글루타르알데히드 가교 없이 또는 이와 함께 폴레올레핀 표면에 흡수될 수 있다. 절편은 또한 검출 가능한 기로 표지될 수 있는데, 예를 들어 클로라민 T 절차에 의해 방사성요오드화되고, 희토류 킬레이트에 공유 결합되거나, 예를 들어 진단 검정에서 사용하기 위해 또 다른 형광 부분에 접합된다.

프로-뉴로트로핀 활성 조절자의 바람직한 지정 절편의 돌연변이유발은, 통상적으로 약 1 내지 10 개 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 1 내지 5 개 아미노산 잔기의 아미노산 삽입, 또는 약 1 내지 10 개 잔기, 예컨대 약 2 내지 5 개 잔기의 결실을 생성시킴으로써 수행될 수 있다.

한 구현예에서 결합 위치 1, 2 또는 3 의 리간드는 자동화된 합성에 의해 합성된 올리고펩티드이다. 아미노산이 증대하는 아미노산 사슬에 순차적으로 첨가되는, 메리필드 (Merrifield) 고체상 합성 방법과 같은 임의의 상업적으로 이용가능한 고체-상 기술이 사용될 수 있다 (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963 참조).

폴리펩티드의 자동화된 합성을 위한 기기는 Applied Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) 와 같은 공급자로부터 시판되며, 일반적으로 제조사의 지시사항에 따라 작동될 수 있다. 고체상 합성으로, 원하는 아미노산 치환물을 본 발명에 따른 프로-뉴로트로핀 활성 조절자의 임의의 절편에 혼입시킬 수 있다. 치환, 결실, 삽입 또는 이의 임의의 하위조합이 기능적 동등물의 최종 서열에 도달하도록 조합될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 삽입은 아미노-말단 및/또는 카르복실-말단 융합물 (예를 들어 소수성 또는 면역성 단백질 또는 담체 예컨대 담체로서 역할할 수 있는 폴리펩티드 또는 스캐폴드 구조를 갖는) 을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명에 따른 소르틸린 저해제의 절편의 단일이량체 및 이종이량체를 포함하는 올리고머가 또한 제공되며, 이는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 프로-뉴로트로핀 활성 조절자 기능적 동등물 및 변이체는 다른 아미노산 서열 또는 자연적 소르틸린 저해제 서열과의 단일이량체 또는 이종이량체로서 생성될 수 있다. 이종이량체는 면역반응성 소르틸린 저해 절편 뿐 아니라 소르틸린 저해 절편 (어떠한 생물학적 활성도 가지거나 발휘할 필요가 없음) 을 함유하는 이량체를 포함한다.

소르틸린 저해 펩티드 절편은 시험관내 및 생체내 모두에서 합성될 수 있다. 시험관내 합성 방법은 널리 알려져 있으며, 소르틸린 저해제의 생체내 합성에 적합하거나 적합하게 순응될 수 있는 방법은 선행 기술에서 기술된다. 생체내에서 합성되는 경우, 숙주 세포는 소르틸린 펩티드 저해제 또는 이의 절편을 인코딩하는 DNA 를 포함하는 벡터로 형질전환된다. 벡터는 복제가능한 핵산 구성물로서 정의된다. 벡터는 프로-뉴로트로핀 활성 조절자의 발현을 매개하는데 사용된다. 발현 벡터는, 지정 소르틸린 저해제 절편 또는 생체내에서 발현될 수 있는 이의 임의의 기능적 동등물을 인코딩하는 핵산 서열이, 적합한 숙주 내에서 절편 또는 동등물의 발현에 영향을 줄 수 있는 적합한 조절 서열에 작동적으로 연결된, 복제가능한 DNA 구성물이다. 이러한 조절 서열은 당업계에 널리 알려져 있다. 원핵 생물 세포 및 진핵 생물 세포 모두 리간드 합성에 사용될 수 있다.

그러나, 다세포 유기체에서 유래하는 세포의 배양물이 바람직한 숙주 세포를 나타낸다. 원칙적으로는, 척추 동물 또는 무척추 동물의 배양물로부터의 임의의 고등한 진핵 생물 세포 배양물이 활용가능하다. 유용한 숙주 세포주의 예는 VERO 및 HeLa 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주, 및 WI38, BHK, COS-7, 293 및 MDCK 세포주이다. 바람직한 숙주 세포는 내인성 소르틸린 저해제를 합성하는 것으로 알려져 있는 진핵 생물 세포이다. 이러한 숙주 세포의 배양물은 절편의 공급원으로서 단리 및 사용될 수 있거나, 인간 또는 동물 신체에 대해 실행되는 진단 방법, 또는 성장 상태를 촉진 또는 저해하는 것을 목표로 하는 치료 방법을 포함하는 처리의 치료적 방법에 사용될 수 있다.

소수성 결합: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "수소 결합" 은 음전성 원자, 예를 들어 산소, 황 또는 질소에 공유 결합하는 수소 원자와 또 다른 음전성 원자 사이에 발생할 수 있는 인력 또는 브릿지를 의미한다. 수소 결합은 제 1 분자 내의 수소 원자와 제 2 분자 내의 음전성 원자 사이에 발생할 수 있다 (세포간 수소 결합). 또한, 수소 결합은 단일 분자 내에 모두 포함되는 수소 원자와 음전성 원자 사이에 발생할 수 있다 (세포내 수소 결합).

소수성 상호 작용: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "소수성 상호 작용" 은 극성 환경 (예를 들어 물) 에서 서로 인력 범위 내에 위치한 본질적으로 비-극성 (소수성) 성분 사이에 발생하는 임의의 상호 작용을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 인력 범위는 0.1 내지 2 nm 의 규모이다. 소수성 상호 작용의 특정 유형은 "반 데르 발스 힘", 즉, 양자역학에 의해 설명되는 비-극성 분자 사이의 인력에 의해 발휘된다. 반 데르 발스 힘은 일반적으로, 인접 분자에 의해 유도되며 전자 분포에서의 변화를 포함하는 일시적인 쌍극 모멘트과 연관된다.

저해: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "저해" 는 둘 이상의 성분 사이의 결합을 방지하는 것을 의미한다. 본 발명에 의해 확인되는 리간드는 Vps10p-도메인 수용체와 프로-뉴로트로핀 사이의 결합을 저해할 수 있다.

결합 저해: 본원에서 사용되는 바와 같은 프로-뉴로트로핀과 소르틸린 사이의 "결합 억제" 라는 용어는 본 발명에 의해 확인되는 리간드를 제공하는 방법을 의미하며, 상기 리간드는 프로-뉴로트로핀의, 소르틸린의 결합 위치 3 에 대한 결합을 방지함으로써, 소르틸린, proNGF 와 p75^NTR, 또는 이의 임의의 절편 또는 변이체 사이의 3 성분 복합체의 형성을 방지할 수 있다. 용어 "결합 저해" 는 또한, 뉴로텐신 및/또는 소르틸린 프로펩티드의, Vps10p-도메인 수용체 소르틸린의 결합 위치 1 또는 2 에 대한 결합을 저해하는 것을 의미할 수 있다.

시험관내 / 생체내: 상기 용어는 이의 통상적 의미로 사용된다.

인 실리코 ( In silico ): 컴퓨터 시뮬레이션에 의해 시험관내 또는 생체내 작업을 수행하는 방법.

허혈: 혈액 공급의 제한의 결과로 인한 조직의 손상 또는 부전.

허혈성 조직 손상: 허혈로 인한 조직 손상.

리간드: 생물학적 목적을 수행하도록 생체분자에 결합하고 이와의 복합체를 형성할 수 있는 물질 또는 화합물. 좁은 관점에서는, 이는 이온 결합, 수소 결합 및 반 데르 발스 힘과 같은 분자간 힘에 의해 표적 단백질 상의 위치에 결합하는 신호 촉발 분자이다. 도킹 (결합) 은 통상 가역적이다 (해리). 리간드와 이의 표적 분자 사이의 실제적인 불가역적 공유 결합은 생물계에서 드물다. 금속유기 및 무기 화학에서의 의미와 대조적으로, 헤모글로빈의 경우에서와 같이, 이는 리간드가 금속 위치에 실제적으로 결합하는지 여부와는 관계가 없다. 수용체에 결합하는 리간드는 화학적 배좌, 즉 수용체 단백질의 3 차원 형상을 변형할 수 있다. 수용체 단백질의 배좌 상태는 수용체의 기능적 상태를 결정한다. 결합의 경향 또는 강도를 친화성이라고 지칭한다. 리간드는 기질, 저해제, 활성제 및 신경전달물질을 포함한다. 방사성리간드는 방사성 동위원소로 표지된 화합물이며, PET 연구에서 추적자로서 생체내에서 사용되고, 시험관내 결합 연구에 사용된다.

특정 화합물의 부분은 상기 특정 화합물의 기(들) 또는 일부(들) 를 포함한다.

약학제: 용어 "약학제" 또는 "약물" 또는 "약제" 는 환자에서의 질병, 고난, 병상, 질환 또는 상해의 치료 (예방, 진단, 경감 또는 치유 포함) 에 사용될 수 있는 임의의 치료제 또는 예방제를 의미한다. 치료적으로 유용한 유전적 결정인자, 펩티드, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 약학물 또는 약물이라는 용어의 의미 내에 포함될 수 있다. 상기 정의되는 바와 같이, "치료제", "약학제" 또는 "약물" 또는 "약제" 는 생물활성제의 유형이다.

약학 조성물: 또는 약물, 약제 또는 작용제는 환자에게 적절히 투여되는 경우 원하는 치료적 효과를 유도할 수 있는 임의의 화학적 또는 생물학적 물질, 화합물 또는 조성물을 의미한다. 일부 약물은 생체내에서 약학적 활성을 갖는 대사 산물로 전환되는 불활성 형태로 시판된다. 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "약학 조성물" 및 "약제" 는 불활성 약물 및 활성 대사 산물을 모두 포함한다.

폴리펩티드: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩티드" 는 둘 이상의 아미노산을 포함하는 분자를 의미한다. 상기 아미노산은 자연적인 것이거나 합성된 것일 수 있다. "올리고펩티드" 는 본원에서 100 개 아미노산 이하의 길이의 폴리펩티드인 것으로 정의된다. 용어 "폴리펩티드" 는 또한 단백질, 즉 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 기능적 생체 분자를 포함하는 것으로 의도되며; 둘 이상의 폴리펩티드를 포함하는 경우, 이는 공유 결합되거나 비-공유 결합될 수 있는 복합체를 형성할 수 있다. 단백질 내의 폴리펩티드는 글리코실화 및/또는 지질화될 수 있고/있거나 보결기를 포함한다.

폴리뉴클레오티드: 본원에서 사용되는 바와 같은 "폴리뉴클레오티드" 는 둘 이상의 핵산을 포함하는 분자를 의미한다. 상기 핵산은 자연 발생적인 것이거나 개질된 것 (예를 들어 잠금 핵산 (locked nucleic acid (LNA)) 또는 펩티드 핵산 (PNA)) 일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 하기와 관계가 있다:

i) 지정 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는

ii) 지정 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는

iii) 폴리뉴클레오티드들 (i) 또는 (ii) 에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 절편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 (상기 절편은 본원에서 구체화된 바와 같은 하나 이상의 지정된 활성을 가짐);

iv) 이의 상보적 가닥이 엄격한 조건 하에 (i), (ii) 및 (iii) 중 임의 하나에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화되며, 본원에서 구체화된 바와 같은 하나 이상의 지정된 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드; 및

v) (iii) 또는 (iv) 의 뉴클레오티드 서열로 변성되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;

또는 상기 폴리뉴클레오티드의 상보적 가닥.

정제된 항체: 용어 "정제된 항체" 는 이의 60 중량% 이상이 폴리펩티드, 및 그와 자연적으로 연관되는 자연 발생적 유기 분자가 없는 항체이다. 바람직하게는, 제제는 75 중량% 이상, 보다 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상의 양으로 항체를 포함한다.

실효 편차: 용어 "실효 편차" (rmsd) 는 2 가지의 밀접하게 관련된 구조를 비교하는 수단으로서 사용되며, 정렬에서의 2 가지 구조의 관련된 원자 사이의 거리를 구조적으로 최소화한 후 이러한 거리에 있어서의 편차에 관한 것이다. 밀접하게 관련된 구조를 갖는 관련된 단백질은 상대적으로 낮은 RMSD 값으로 특징지어지는 반면, 더 큰 상이함은 RMSD 값을 증가시킬 것이다.

서열 동일성: 서열 동일성은, 25 개 이상의 근접 아미노산을 포함하며 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10 중 임의의 아미노산 서열과 각각 80% 이상, 예컨대 85%, 예를 들어 90%, 예를 들어 91%, 예컨대 92%, 예를 들어 93%, 예를 들어 94%, 예컨대 95%, 예를 들어 96%, 예컨대 97%, 예를 들어 98%, 예컨대 99% 동일한 아미노산 서열 또는 상기 임의의 SEQ ID NO:s 의 절편을 갖는 프로-뉴로트로핀 활성 조절자 펩티드의 절편을 이용함으로써, 한 구현예에서 측정되며, 상기 동일성 % 는 디폴트 갭 무게 (gap weight) 를 사용하여 Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 에서의 알고리즘 GAP, BESTFIT 또는 FASTA 로 측정된다.

하기의 용어들은 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 관계를 기술하는데 사용된다: "지정 서열", "비교 윈도우", "서열 동일성", "서열 동일성 %" 및 "실질적 동일성".

"지정 서열" 은 서열 비교를 위한 기준으로서 사용되는 정의된 서열이며; 지정 서열은 큰 서열의 서브세트, 예를 들어 SEQ ID NO:1 의 폴리뉴클레오티드 서열과 같은 서열 목록에 주어진 유전자 서열 또는 전체 길이 DNA 의 조각일 수 있거나, 완전한 DNA 또는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 지정 서열은 20 개 뉴클레오티드 이상의 길이, 자주 25 개 뉴클레오티드 이상의 길이이며, 종종 50 개 뉴클레오티드 이상의 길이이다.

2 개의 폴리뉴클레오티드는 각각 (1) 2 개의 폴리뉴클레오티드 사이의 유사한 서열 (즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 일부) 를 포함할 수 있고, (2) 2 개의 폴리뉴클레오티드 사이의 다른 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 2 개 (또는 그 이상) 의 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 비교는 전형적으로, 서열 유사성의 국소적 부위를 확인하고 비교하기 위해 "비교 윈도우" 에 대해 2 개의 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "비교 윈도우" 는 20 개 이상의 근접 뉴클레오티드 위치의 개념적 조각을 의미하며, 폴리뉴클레오티드 서열은 20 개 이상의 근접 뉴클레오티드의 지정 서열과 비교될 수 있고, 비교 윈도우에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2 개 서열의 최적 정렬에 대한 지정 서열 (삽입 또는 결실을 포함하지 않음) 과 비교하여 20% 이하의 삽입 또는 결실 (즉, 갭) 을 포함할 수 있다.

비교 윈도우를 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482] 의 국소적 상동 알고리즘, [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443] 의 상동 정렬 알고리즘, [Pearson and Lip-man (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444] 의 유사성 방법에 대한 탐색, 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 검사에 의해 수행될 수 있으며, 다양한 방법에 의해 생성된 최상의 정렬 (즉, 비교 윈도우에 대해 상동성의 최고 % 를 야기하는) 이 선택된다.

용어 "서열 동일성" 은 2 개의 폴리뉴클레오티드 서열이 비교 윈도우에 대해 동일 (즉, 뉴클레오티드-뉴클레오티드 기준으로) 하다는 것을 의미한다. 용어 "서열 동일성 %" 는, 비교 윈도우에 대해 최적으로 정렬된 2 개의 서열을 비교하고, 매치되는 위치의 수를 수득하기 위해 동일한 핵산 염기 (예를 들어 A, T, C, G, U 또는 I) 가 2 개 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 측정하고, 매치되는 위치의 수를 비교 윈도우에서의 위치 총 수 (즉, 윈도우 크기) 로 나누고, 서열 동일성 % 를 수득하기 위해 그 결과에 100 을 곱하여 계산된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "실질적 동일성" 은 폴리뉴클레오티드 서열의 특징을 뜻하는데, 상기 폴리뉴클레오티드는 20 개 이상의 뉴클레오티드 위치, 종종 25-50 개 이상의 뉴클레오티드의 비교 윈도우에 대한 지정 서열과 비교하여 85% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90 내지 95% 이상의 서열 동일성, 보다 통상적으로는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 서열 동일성의 % 는 지정 서열을 결실 또는 삽입을 포함할 수 있는 (비교 윈도우에 대해 지정 서열의 총 20% 이하) 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 계산된다. 지정 서열은 큰 서열의 서브세트, 예를 들어 본원에서 설명된 전체 길이 SEQ ID NO:1 폴리뉴클레오티드 서열의 조각일 수 있다.

폴리펩티드에 적용되는 바와 같이, 아미노산 서열의 동일성 정도는 아미노산 서열에 의해 공유된 위치에서의 동일한 아미노산 수의 함수이다. 아미노산 서열의 상동성 또는 유사성 정도는 아미노산 서열에 의해 공유된 위치에서의 아미노산, 즉 구조적으로 관련된 아미노산 수의 함수이다.

"비-관련된" 또는 "비-상동" 서열은 본 발명의 프로-뉴로트로핀 활성 조절자 폴리펩티드 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 바람직하게는 25% 미만의 동일성을 공유한다. 용어 "실질적 동일성" 은 예를 들어 GAP 또는 BESTFIT 와 같은 프로그램에 의해 디폴트 갭 무게를 사용하여 최적으로 정렬되었을 때 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성 또는 그 이상 (예를 들어, 99% 서열 동일성) 을 공유하는 2 개의 펩티드 서열을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다.

보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 호환성을 의미한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 세린 및 트레오닌이고, 아미드-포함 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-포함 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환군은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다.

추가적으로, 변이체는 또한 본원에서 하기에 정의한 바와 같은 지정된 수의 보존적 아미노산 치환을 기초로 하여 결정된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 보존적 아미노산 치환은 한 아미노산 (아미노산의 지정군 내에 있는) 의 또 다른 아미노산 (동일한 군 내에 있는) 에 대한 치환에 관한 것이며, 상기 아미노산은 유사하거나 실질적으로 유사한 특징을 나타낸다.

본원에 적용되는 바와 같은 용어 "보존적 아미노산 치환" 의 의미 내에서, 한 아미노산은 본원에서 하기에 나타낸 아미노산의 군 내의 또 다른 것으로 치환될 수 있다:

i) 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr 및 Cys)

ii) 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산 (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro 및 Met)

iii) 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 (Gly, Ala Val, Leu, Ile)

iv) 시클릭 측쇄를 갖는 아미노산 (Phe, Tyr, Trp, His, Pro)

v) 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (Phe, Tyr, Trp)

vi) 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (Asp, Glu)

vii) 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (Lys, Arg, His)

viii) 아미드 측쇄를 갖는 아미노산 (Asn, Gln)

ix) 히드록시 측쇄를 갖는 아미노산 (Ser, Thr)

x) 황-포함 측쇄를 갖는 아미노산 (Cys, Met),

xi) 중성, 약한 소수성 아미노산 (Pro, Ala, Gly, Ser, Thr)

xii) 친수성, 산성 아미노산 (Gln, Asn, Glu, Asp), 및

xiii) 소수성 아미노산 (Leu, Ile, Val)

따라서, 본 발명에 따른 변이체 또는 이의 절편은 서열의 동일한 변이체 또는 이의 절편 내에서, 또는 서열의 상이한 변이체 또는 이의 절편 중에, 하나 이상의 치환 (예를 들어 서로에게 독립적으로 도입된 다수의 치환) 을 포함할 수 있다.

상기 개요에서, 동일한 변이체 또는 이의 절편이 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 보존적 아미노산 군으로부터 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다는 것이 명백하다.

하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 결실은, 바람직하게는 2 내지 250 개 아미노산, 예컨대 10 내지 20 개 아미노산, 예를 들어 20 내지 30 개 아미노산, 예컨대 40 내지 50 개 아미노산의 삽입 또는 결실일 수 있다. 그러나, 50 개 초과의 아미노산의 삽입 또는 결실, 예컨대 50 내지 100 개 아미노산의 삽입, 100 내지 150 개 아미노산의 삽입, 150-250 개 아미노산의 삽입이 또한 본 발명에 포함된다. 결실 및/또는 삽입은 서로 독립적으로 서열 내 및/또는 서열 말단에서의 결실 및/또는 삽입일 수 있다.

치환된 저급 알킬은 히드록실, 알콕시, 아미노, 아미도, 카르복실, 아실, 할로겐, 시아노, 니트로 및 티올로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 3 개 치환기를 갖는 저급 알킬을 의미한다.

치료: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료" 는 인간 또는 동물 신체를 포함하는 개인에서의 임상적 상태의 수술을 포함하는 치료요법을 포함하는 방법을 의미한다. 치료요법은 질환을 얻는 위험성을 경감, 치유 또는 예방, 즉 감소시킬 수 있다.

변이체: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "변이체" 는 임의의 지정 서열과 바람직하게는 60% 이상의 동일성, 예를 들어 63% 이상의 동일성, 예컨대 66% 이상의 동일성, 예를 들어 70% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 72% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 75% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 80% 이상의 서열 동일성, 예컨대 85% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 90% 이상의 서열 동일성, 예컨대 91% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 91% 이상의 서열 동일성, 예컨대 92% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 93% 이상의 서열 동일성, 예컨대 94% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 95% 이상의 서열 동일성, 예컨대 96% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 97% 이상의 서열 동일성, 예컨대 98% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 99% 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 변이체를 의미한다. 뉴로텐신의 변이체 및 이의 절편의 예는 도 26 에 열거되며, 비제한적으로 RRPYI(chg), iodoYIL, QIL, YCL, dYIL, YHL, RRPYI(acc), RRPYI(nMe)L, YIL 을 포함한다. 본 발명의 한 구현예에서는, 리간드는 NT69L, NT8-13 또는 자연적 뉴로텐신이 아니다.

발현의 상향-조절: 유전자, 바람직하게는 내인성 유전자의 발현 증가를 일으키는 과정.

소르틸린 결정

특히, Vps10p-도메인 및 인간 소르틸린의 구조적 조직 및 리간드 결합을 명백히 하기 위하여, 본 발명자들은 NT 및 이의 고유한 프로펩티드의 잔기 4-29 를 갖는 복합체 내 s소르틸린의 결정 구조를 측정하였다 (각각 2.0 및 3.2 Å 의 해상도에서). s소르틸린:NT 복합체에 대한 데이터를 약간의 과량의 NT (몰 비율 1:1.5) 뿐 아니라 과다량의 NT (몰 비율 1:15) 로 증대된 결정으로부터 수득하였다 (실시예 5 참조). 또한, 발명자들은 신경 성장 인자 (NGF) 의 프로-도메인을 갖는 복합체 내 s소르틸린의 구조를 측정하였다.

따라서, 한 구현예에서 본 발명은 하기를 포함하는 결정에 관한 것이다:

a) SEQ ID NO.1 의 폴리펩티드; 및/또는

b) 상기 SEQ ID NO.1 과 60% 이상의 서열 동일성을 갖는, 상기 폴리펩티드의 서열 변이체; 및/또는

c) 소르틸린 활성을 나타내는, a) 에서 b) 중 임의의 200 개 이상의 근접 아미노산을 포함하는 절편, 및

d) 임의로 하나 이상의 리간드와의 복합체에서의 a) 에서 c) 중 임의의 것.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

추가적인 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 60% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 63% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 75% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 91% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 92% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 93% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 94% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 96% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 97% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 98% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO.1 의 서열 변이체를 포함한다.

한 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 중 임의의 50 개 이상의 근접 아미노산을 포함하는 절편을 포함한다.

추가적인 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 중 임의의 100 개 이상의 근접 아미노산을 포함하는 절편을 포함한다.

추가적인 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 중 임의의 200 개 이상의 근접 아미노산을 포함하는 절편을 포함한다.

추가적인 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 중 임의의 300 개 이상의 근접 아미노산을 포함하는 절편을 포함한다.

추가적인 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 중 임의의 400 개 이상의 근접 아미노산을 포함하는 절편을 포함한다.

추가적인 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 중 임의의 500 개 이상의 근접 아미노산을 포함하는 절편을 포함한다.

추가적인 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 중 임의의 600 개 이상의 근접 아미노산을 포함하는 절편을 포함한다.

추가적인 구현예에서 본 발명의 결정은 SEQ ID NO.1 중 임의의 700 개 이상의 근접 아미노산을 포함하는 절편을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서 하나 이상의 리간드는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 내지 M363, S305, F306 및 T398 내지 G400 을 포함하는 결합 위치 1 (고친화성 뉴로텐신 결합 위치 및 소르틸린 프로펩티드 결합 위치) 에 결합한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에서 하나 이상의 리간드는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314 및 F350 내지 M363 을 포함하는 결합 위치 1 (고친화성 뉴로텐신 결합 위치 및 소르틸린 프로펩티드 결합 위치) 에 결합한다.

본 발명의 고도로 바람직한 구현예에서 하나 이상의 리간드는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314 및 F350 내지 M363 을 포함하는 결합 위치 1 (고친화성 뉴로텐신 결합 위치 및 소르틸린 프로펩티드 결합 위치) 에 결합한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 하나 이상의 리간드는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 L572, L114, V112, R109 내지 S111, S115 내지 G118, T570, G571, W586, W597, T168-I174, L572, A573 및 S584 내지 F588 을 포함하는 결합 위치 2 (저친화성 뉴로텐신 결합 위치 및 소르틸린 프로펩티드 결합 위치) 에 결합한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 하나 이상의 리간드는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 L572, L114, V112, R109 내지 S111, S115 내지 G118, T570, G571, W586 및 W597 을 포함하는 결합 위치 2 (저친화성 뉴로텐신 결합 위치 및 소르틸린 프로펩티드 결합 위치) 에 결합한다.

바람직한 구현예에서 본 발명의 하나 이상의 리간드는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 L572, L114 및 V112 를 포함하는 결합 위치 2 (저친화성 뉴로텐신 결합 위치 및 소르틸린 프로펩티드 결합 위치) 에 결합한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서 하나 이상의 리간드는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 D403, S420, D422, N423, S424, I425, E426, T451, Y466, E470, I498, S499 및 V500 을 포함하는 결합 위치 3 (뉴로트로핀-프로펩티드 결합 위치) 에 결합한다. 결합 위치 3 이 뉴로트로핀의 프로-도메인에 결합하기 때문에, 상기 결합 위치 3 은 전체 프로-뉴로트로핀에 또한 결합할 수 있다. 따라서 결합 위치 3 은 프로-뉴로트로핀 결합 위치 또는 뉴로트로핀 프로도메인 결합 위치 또는 동일한 생화학적 의미의 동의적 표현을 의미할 수 있다.

보다 바람직한 구현예에서 본 발명의 하나 이상의 리간드는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 D403, N423, S424, I425, T451, Y466, I498 및 V500 을 포함하는 결합 위치 3 (뉴로트로핀-프로펩티드 결합 위치) 에 결합한다.

본 발명의 고도로 바람직한 구현예에서 하나 이상의 리간드는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 T451, Y466, I498 및 V500 을 포함하는 결합 위치 3 (뉴로트로핀-프로펩티드 결합 위치) 에 결합한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 결합 위치 3 (프로-뉴로트로핀 결합 위치) 은 proNGF 결합 위치이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 결합 위치 3 (프로-뉴로트로핀 결합 위치) 은 proBDNF 결합 위치이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 결합 위치 3 (프로-뉴로트로핀 결합 위치) 은 proNT3 결합 위치이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 결합 위치 3 (프로-뉴로트로핀 결합 위치) 은 proNT4/5 결합 위치이다.

청구항 제 1 항에 따른 결정에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 번호 78 내지 755 를 포함한다.

또 다른 구현예에서 상기 본원에서 정의된 결정은 단사정계 공간군의 결정이다.

한 구현예에서 단사정계 공간군의 결정은 공간군 C2 에 속한다.

또 다른 구현예에서 상기 본원에서 정의된 결정은 사방정계 공간군의 결정이다.

한 구현예에서 사방정계 공간군의 결정은 P2₁2₁2₁ 이다.

또 다른 구현예에서 상기 본원에서 정의된 결정은 삼사정계 공간군의 결정이다.

한 구현예에서 삼사정계 공간군의 결정은 P1 이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 본원에서 정의된 결정은 SEQ ID NO.1 의 아미노산 잔기 78 내지 755 (s소르틸린) 또는 이의 절편 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드 변이체를 포함한다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 본원에서 정의된 결정은 하나 이상 또는 모든 메티오닌(들) 이 Se-메티오닌 (셀레노-메티오닌) 으로 대체된 소르틸린 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 본원에서 정의된 결정은 SEQ ID NO.6 의 아미노산 잔기 19 내지 241 (proNGF), SEQ ID NO.6 의 아미노산 잔기 19 내지 121 (NGF 프로 도메인), SEQ ID NO.7 의 아미노산 잔기 19 내지 246 (proBDNF), SEQ ID NO.7 의 아미노산 잔기 19 내지 127 (BDNF 프로 도메인), SEQ ID NO.8 의 아미노산 잔기 17 내지 257 (proNT3), SEQ ID NO.8 의 아미노산 잔기 17 내지 140 (NT3 프로 도메인), SEQ ID NO.9 의 아미노산 잔기 25 내지 210 (proNT4/5), SEQ ID NO.9 의 아미노산 잔기 25 내지 80 (NT4/5 프로 도메인), SEQ ID NO.10 (뉴로텐신), SEQ ID NO.11 (PYIL), SEQ ID NO.10 의 아미노산 잔기 11 내지 13 (YIL), 또는 이의 절편 또는 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리펩티드 리간드를 포함한다.

소르틸린 결정의 증대 방법

추가적인 측면에서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 소르틸린 결정의 증대 방법에 관한 것이다:

i. 1:1.5 내지 1:15 (s소르틸린:NT), 또는

ii. 1:4 (s소르틸린:프로펩티드),

iii. 18-21% w/v PEG 6000, 및

iv. 0-15% 글리세롤, 및

v. Tris-HEPES pH 7.2-7.8 (40-93 mM Tris 및 100 mM HEPES) 또는 100 mM Tris-HCl pH 7.9, 3-6% 글리세롤 및

vi. 300-900 mM NaCl 또는 150-400 mM C₃H₂Na₂O₄ (상기 C₃H₂Na₂O₄ 는 말론산으로 pH 6-7.5 로 조정됨), 또는 300-500 mM LiSO₄ 또는 500-700 mM KCl, 및

본 발명의 추가적인 구현예에서 SEQ ID NO.1 의 시스테인 잔기는 셀레노-메티오닌으로 대체된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 본원에서 정의된 결정의 수득 방법은 하기의 단계를 추가로 포함한다:

a. 초기 침전물을 단리하는 단계, 및

b. 현적으로부터의 증기 확산 (vapour diffusion from hanging drops) 에 의해 이를 증대하는 단계.

본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 본원에서 정의된 결정은, 리간드와의 복합체 내 소르틸린 또는 이의 절편 또는 변이체의 3 차원 구조의 측정을 위해, 소르틸린에 결합한 리간드를 추가로 포함한다.

소르틸린 구조

발명자는 소르틸린 (SEQ ID NO.1) 의 잔기 78-609 가 10-블레이드 β-프로펠러의 제 1 예를 이루는 것을 발견하였다. 네 가닥의 오르내리는 블레이드 사이와 블레이드의 개별적인 β-가닥 사이에서 모두 긴 확장이 발견된다 (도 1a). C-말단 부분을 함유하는 작은 10 개 시스테인 (10CC), 잔기 610-758 은 p75^NTR (18) 에서 발견되는 시스테인-풍부 도메인의 전체 형상 및 구성 연상을 갖는 2 개의 유사한 구조적 도메인으로서 자체적으로 나타난다 (도 1b). 2 개의 10CC 도메인과 프로펠러 도메인 사이의 경계면은 광범위한 소수성 및 정전 상호 작용을 포함하며, 프로펠러의 한 면의 약 180°를 커버한다.

전체 프로펠러 도메인은 타원형이고 10CC-상호 작용면 쪽으로 좁아지는 약간 넓은 원추 터널을 형성한다. 적도면에서 터널의 횡단면은 대략 40 Å 로 기운 25 Å 이다 (도 1c + d). 협소한 10CC-상호 작용면으로부터의 터널에 대한 접근은 또한 블레이드 7 중 하나의 가닥의 말단에서 내부 가장자리 상에 위치한 Asn406-연결 글리코실화에 의해 부분적으로 차단된다 (도 1c + d). 2 개의 글리코실화가 프로펠러의 10CC 상호 작용면에서 모두, 및 외부 가장자리에서 모두, Asn162 및 Asn582 에서 더 발견된다. 두드러지게, 블레이드 1 과 10 중 2 및 3 개 가닥을 연결하는 2 개의 튀어나온 소수성 루프가 반대면에서 나타나는데 (도 1b), 이는 상기 면 및 루프가 특히, 세포 멤브레인과의 접촉을 매개하거나 다른 단백질과의 상호 작용에서 역할한다는 것을 제시한다.

NT 와의 복합체 내 s소르틸린의 구조 모두에서, 발명자는 NT 의 4 개 C-말단 잔기 (Pro10-Tyr11-Ile12-Leu13) 가 블레이드 6 중 하나의 가닥에 대해 짧은 β-가닥을 형성한다는 것을 발견하였다 (본원에서 고친화성 NT 결합 위치로서 나타냄). Tyr11 의 히드록실기는 소르틸린의 Lys260 에 대해 수소 결합을 형성하고, C-말단 류신은 Phe314, Ile327 및 Ile353 에 의해 형성된 소수성 포켓에 들어맞게 된다. 그러나, 결합에 대한 주요한 기여는 명백히 NT 의 C-말단 카르복실레이트인데, 이는 Arg325 의 구아니디늄 기와의 염 브릿지, 및 Ser316 의 측쇄 및 Tyr351 의 주쇄 아미드에 대해 수소 결합을 형성한다 (도 2b).

과다량의 NT 로 결정된 구조에서, 2 개의 추가적인 결합 위치가 발견된다. 결합 위치 2 (도 2a) 는 프로펠러의 내부 가장자리에서 발견된다. 본원에서 뉴로텐신의 N-말단 절반 (잔기 2-6) 은 블레이드 1 의 제 1 가닥과 상호 작용하는 짧은 β-가닥으로서 모델링된다. 수용체와의 특이적 측쇄 상호 작용은 상기 위치에서 관찰되지 않는다 (도 2b). Lys6 의 Cα 에서 Pro10 의 Cα 까지의 거리는 17.7 Å 이며, 간섭 부위에는 전자 밀도가 존재하지 않는다. 따라서, 발명자들은 고농도의 NT 에서 2 개 분자가 프로펠러 내부에 결합한다고 결론내렸다.

상기 제시한 결과는 소르틸린이 NT 의 C-말단에 대한 고친화성 결합 위치, 및 펩티드의 N-말단 부분을 참여시키는 제 2 의 저친화성 하부위치를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서, 발명자들은 고유한 프로펩티드 (Sort-pro) 의 소르틸린 결합을 저해하기 위한 NT-유래 절편의 능력을 검사하였다. Sort-pro 의 결합이 5 배 과다한 NT 의 존재 하에 완전히 무효로 되며, C-말단 펩티드 Arg9-Pro-Tyr-Ile-Leu13 이 동일하게 효과적이라는 것이 이전에 나타난 바 있다 (5) (도 3a). 반대로, 본 발명자들은 N-말단 펩티드 NT (1-8) 과 Arg8-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu13-NH2 (즉, 아미드에 의해 대체된 말단 카르복실레이트를 갖는) 모두가 저해에 실패한 한편 (도 3a+b), C-말단 트리펩티드 Tyr11-Ile-Leu13 이 Sort-pro 결합의 전체 억제에 충분하다는 것을 증명한다는 것을 발견하였다 (도 3b). Tyr11-Ile-Leu13 은 또한, 전체 길이 NT 만큼 효과적이지 않지만, NGF (도 3c) 및 RAP (도 3d) 의 프로도메인의 결합을 방해한다. 이는 proNGF 및 RAP 가 입체 방해되며 Tyr11-Ile-Leu13 보다 더 확장되거나 상이한 결합 위치를 갖는다는 것을 나타낸다.

뉴로텐신 및 Sort-pro 는 서열 유사성을 갖지 않는다. 이제, Sort-pro (잔기 4-29) 의 절편을 갖는 복합체 내 s소르틸린의 구조는 점유될 프로펠러 내부의 결합 위치를 모두 나타낸다 (도 2c-e). 펩티드에 대한 밀도는 강하지만, 펩티드의 모델링을 가능하게 하기에는 충분히 정의되지 않는다. 그러나, s소르틸린:NT 구조로의 오버레이는 Sort-pro 밀도가 NT 의 C- 및 N-말단 부분의 것과 겹치며 (도 2c+d) 그 사이의 공간을 채운다 (도 2e) 는 것을 명백히 보여준다. 프로펩티드가 Tyr-Ile-Leu 모티프를 포함하지 않으며 이의 결합이 자유 C-말단에 비의존적이기 때문에 (8), Sort-pro 또는 다른 리간드 예를 들어 proNGF 내의 본질적 산성 잔기가 NT 의 C-말단 Leu-카르복실레이트의 것과 유사한 결합에 있어서 역할할 수 있음을 추측할 수 있다.

이를 조사하기 위해, 발명자들은 Ser316 또는 Arg325 가 각각 Glu 및 Ala 로 교환된 s소르틸린-돌연변이 구성물을 생성하였다. S316E 돌연변이는 이후 발현 및 정제된 한편, R325A 돌연변이는 정제 절차 동안 불안정하고 분해되었음이 증명되었다. 흥미롭게도, 두 돌연변이 모두 분비에 있어서 심각하게 지연되어 (도 4a), 프로펩티드 없이 발현된 소르틸린에 대한 효과가 또한 관찰되었다 (8). S316E 는 Sort-pro 에는 결합하지 않았으나, NGF-프로도메인 및 BDNF 에는 wt 소르틸린의 친화성과 유사한 친화성으로 결합하였다. 예측되는 바와 같이, NT 의 존재는 NGF-프로도메인이 S316E 돌연변이에 결합하는 것에 대해 효과를 갖지 않았다. 이러한 결과는, Sort-pro 및 NT 가 동일한 구조적 위치 (결합 위치 1 및 2) 에 결합하고, 다른 리간드, 예를 들어 뉴로트로핀의 프로-도메인 예컨대 비제한적으로 NGF-프로도메인 및 전체 프로-NGF 가 가까이 위치하나 독립적인 별개의 위치 (결합 위치 3) 에 결합한다는 발견을 강력하게 지지한다.

따라서, 본 발명의 구현예에서, 리간드는 3 개의 소르틸린의 결합 위치 중 하나 이상에 특이적으로 결합하도록 설계된다. 따라서 상기 리간드는 내인성 리간드가 동일한 위치에 결합하는 것을 저해할 수 있다. 상기 내인성 리간드는 뉴로텐신, 소르틸린의 프로펩티드, p75^NTR 및 프로-뉴로트로핀 (상기 프로-뉴로트로핀은 proNGF, proBDNF, proNT3 및 proNT4/5 로 이루어지는 군에서 선택됨) 으로 이루어지는 군에서 선택된다.

8 개 종류로부터의 소르틸린 사이의 쌍별 서열 동일성은 60-95% 내이다. 서열 정렬 (도 5) 은 프로펠러 중공의 내부 표면에 대해 큰 패치의 보존된 잔기를 맵핑하고, 외부 및 10CC 도메인에 대해 작은 산재된 패치를 맵핑한다 (도 1e). 중공 내의 보존 패턴은 추가적 또는 부가적 결합 위치의 존재와 일치하며 이러한 대안적 위치가 β-가닥 상호 작용의 형성에서의 다른 프로펠러 블레이드를 관계시킬 수 있다는 것을 제시한다. 대안적 위치의 존재는 여러 리간드 표적 소르틸린으로서 명백한 중요점이다. 전체 길이 리간드가 결합에 대해 모두 경쟁적이라는 것이 잘 알려져 있으나, 경쟁의 효율은 다양하며 모두가 Tyr-Ile-Leu 트리펩티드에 의해 효과적으로 길항화되는 것은 아니다. 따라서, 모든 리간드가 겹치는 위치 내의 프로펠러 중공 내에 결합해야 할 것으로 보인다. 그러므로, Tyr-Ile-Leu 와 같은 작은 펩티드는 고도로 특이적인 공유된 위치를 점유함으로써 저해할 수 있는 반면, 큰 리간드는 중공의 한정된 공간에 대한 접근을 차단함으로써 추가적인 저해를 제공할 수 있다.

요약하여, 발명자들은 Vps10p-D 단백질 부류 및 NT-결합 수용체의 일원의 첫 번째 알려진 구조를 측정하였다. 결과는 사실상 Vps10p-D 가 2 개의 별개이지만 구조적으로 상호 의존적인 도메인 (즉, 10 개 블레이드의 β-프로펠러, 및 2 개의 유사한 구조적 도메인으로 구성되는 10CC 의 제 1 예) 으로 이루어진다는 것을 개시한다. 프로펠러 터널은 소르틸린의 리간드 결합 부위를 포함하며, 발명자들은 이의 NT 와의 상호 작용을 위한 특이적 위치 및 이의 고유의 프로펩티드를 맵핑하였다. 또한 발명자들은 프로-뉴로트로핀에 대한 인지 위치의 필수적인 부분이 또한 상기 영역 내에 위치한다는 것을 입증하였다. 트리펩티드 Tyr-Ile-Leu 가 고친화성으로 소르틸린을 표적으로 한다는 발견은, 소르틸린, SorLA 와 G-단백질 결합된 NTR 사이를 구별시키는 가능성을 갖는 제 1 의 NT-유래 리간드를 제공하며, 이는 소르틸린:p75^NTR:proNGF 복합체에 의해 매개되는 세포자멸사를 감소시킬 수 있는 특이적 저해제의 설계를 가능하게 한다. 최종적으로, 이러한 구조 및 결합 분석은 다른 Vps10p-D 수용체의 상호 작용 및 구조의 미래 모델링, 및 당뇨병 및 알츠하이머 질환과 같은 질환에서의 이의 추정되는 역할의 연구에 있어서 유용하다는 것을 증명할 수 있다 (19-21).

또 다른 측면에서 본 발명은 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 설명한 바와 같은 소르틸린의 구조 좌표의 일부 이상으로 인코딩된 데이터 저장 물질을 포함하는 컴퓨터-판독가능한 데이터 저장 매체에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 하기 중 하나 이상에 결합할 수 있는 리간드를 확인하는 방법에서의, 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 바와 같은 원자 좌표, 또는 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 바와 같은 3 차원 구조에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표의 용도에 관한 것이다:

a. 결합 위치 1, 또는

b. 결합 위치 2, 또는

c. 결합 위치 3,

또는 c 까지의 것의 절편 또는 변이체.

또 다른 측면에서 본 발명은 소르틸린 또는 이의 절편 또는 변이체의 3 차원 구조의 측정을 위한, 상기 본원에서 기재된 바와 같은 결정의 용도에 관한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 하기 중 하나 이상에 결합할 수 있는 리간드를 확인하는 방법에서의, 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 바와 같은 원자 좌표, 또는 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 바와 같은 3 차원 구조에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표의 용도에 관한 것이다:

a. 결합 위치 1, 또는

b. 결합 위치 2, 또는

c. 결합 위치 3,

또는 c 까지의 것의 절편 또는 변이체.

리간드 확인 및 설계 방법

본 발명은 상기 본원에서 정의된 소르틸린의 3 개의 결합 위치 (1, 2 및 3) 중 임의의 것에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드의 확인 및 설계 방법을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 확인되고 설계된 리간드는 소르틸린의 잠재적 저해제이므로, 뉴로트로핀의 프로-도메인, 특히 proNGF 및 proBDNF 의 프로-도메인에 소르틸린이 결합하는 것을 방지한다.

잠재적 저해제는 이후 컴퓨터 모델링과 함께 새로이 (de novo) 설계될 수 있다. 화학 구조 또는 분자 절편의 모델은 컴퓨터 데이터베이스에 저장된 알려져 있는 저분자량 유기 화학 구조에서 유래한 정보를 사용하여 컴퓨터 스크린 상에서 생성될 수 있거나, 결합 유형, 배좌 등에 대한 유기 화학자의 일반적 지식을 사용하여 구축된다. 실제적인 기하학적 형상의 화학 구조를 구축하기 위해, 적합한 컴퓨터 프로그램을 이러한 과정에서 보조로 사용할 수 있다. 상기 서브세트 또는 기준 데이터 세트에 대한 바람직한 상호 작용이 가능해지도록 잠재적 저해제를 구성하기 위해 화학 구조 또는 분자 절편을 선택 및/또는 사용할 수 있다. 보다 바람직한 상호 작용이 가능해져, 이것이 강해질수록 잠재적 저해재가 소르틸린에 결합할 것이다. 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 바람직한 상호 작용이 가능해질 것이다. 이러한 바람직한 상호 작용은 아미노산 잔기의 임의 원자, 예를 들어 펩티드 골격의 원자 및/또는 측쇄의 원자와 함께 발생할 수 있다.

바람직한 상호 작용은 화학 구조 사이에 존재할 수 있는 임의의 비-공유 인력 예컨대 소수성 또는 반 데르 발스 상호 작용 및 극성 상호 작용 예컨대 수소 결합, 염-브릿지 등이다. 바람직하지 않은 상호 작용 예컨대 소수성-친수성 상호 작용은 회피되어야 하지만, 이들이 인력의 합보다 약하다면 허용될 수 있다. 단백질 부분으로 구성되거나 선택되는 저해제 일부의 겹침 또는 충돌과 같은 입체 간섭은, 배좌 변화에 의해 분해가능한 한 결합을 방지할 것이다. 이에 따라 생성된 잠재적 저해제의 결합 강도는 컴퓨터 스크린 상에서 바람직한 상호 작용과 바람직하지 않은 상호 작용을 비교하거나, 상업적 컴퓨터 프로그램에서 실행되는 컴퓨터 방법을 사용하여 평가될 수 있다.

소르틸린의 아미노산 측쇄 및 잠재적 저해제의 배좌 자유가 고려되어야 한다. 잠재적 저해제의 접근가능한 배좌는 분자 기하학 및 명백하게는 비틀림 각 의 알려진 규칙을 사용하거나, 분자 역학 및/또는 동력학 또는 양자 역학의 실행된 절차를 갖는 컴퓨터 프로그램, 또는 이의 조합을 사용하여 컴퓨터적으로 측정될 수 있다.

잠재적 저해제는 형상 및 친수성 또는 소수성 특성에 의해 소르틸린의 결합 위치 1, 결합 위치 2 또는 결합 위치 3 의 일부 이상에 적어도 부분적으로 상보적이다.

화학 구조 (예를 들어, 캠브리지 구조적 데이터베이스 (cambridge structural database) 또는 Chemical Abstracts Service 로부터; 개관을 위해서는 다음을 참조한다: Rusinko (1993) Chem. Des. Auto. News 8,44-47) 가 범위를 다양하게 하는데 사용될 수 있다. 모두 자동인 구현예에서, 데이터베이스 내의 모든 구조는 컴퓨터 프로세서 및 적합한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 상보성 및 입체간섭의 결여에 대해 소르틸린의 결합 포켓 또는 활성 위치와 컴퓨터적으로 비교될 수 있다. 이러한 경우, 컴퓨터 스크린에서의 수동적 사용자 상호 작용을 포함하는 컴퓨터 모델링은 필요하지 않을 수 있다. 대안적으로, 분자 절편은 데이터 베이스에서 선택될 수 있으며 컴퓨터 스크린 상에서 예를 들어 수동적으로 조립되거나 구성될 수 있다. 또한, 선별 절차 내에서의 자동화 대 당업자에 의한 수동적 상호 작용의 비율은 매우 다양할 수 있다. 약물 설계 및 서로에 대한 분자의 도킹을 위한 컴퓨터 프로그램이 더욱 양호해지고 있기 때문에, 수동적 상호 작용에 대한 필요는 감소하고 있다.

컴퓨터 모델링에 사용할 수 있는 프로그램은 Quanta (Molecular Simulations,Inc.) 및 Sibyl (Tripos Associates) 을 포함한다. 다른 유용한 프로그램은 Autodock (Scripps Research Institute, La Jolla, [Goodsell and Olsen (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics, 8, 195-201] 에 기재됨), Dock (University of California, San Francisco, [Kuntz et al. (1982) J. Mol. Biol. 161,269-288] 에 기재됨) 이다.

추가적인 측면에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, SEQ ID NO.1 (소르틸린) 의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체에 결합할 수 있는 리간드의 확인 방법에 관한 것이다:

a. 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 바와 같은 원자 좌표, 또는 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 3 차원 구조에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표를 사용하여 컴퓨터 스크린 상에서 결합 위치의 공간 구조를 생성하는 단계,

b. 컴퓨터 스크린 상에서 그의 공간 구조를 갖는 잠재적 리간드를 생성하는 단계, 및

c. 입체 간섭이 없는 결합 상호 작용 위치 세트의 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 리간드를 선별하는 단계.

또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 프로세서, 데이터 저장 시스템, 데이터 입력 장치 및 데이터 출력 장치를 포함하는 프로그래밍된 컴퓨터를 사용하여 SEQ ID NO.1 (소르틸린) 의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체에 결합할 수 있는 소르틸린의 리간드를 확인하기 위한 컴퓨터-지원 방법에 관한 것이다:

a. 프로그래밍된 컴퓨터에, 상기 입력 장치를 통해 소르틸린의 원자 서브세트의 원자 좌표를 포함하는 데이터를 입력함으로써 기준 데이터 세트를 생성하는 단계 (상기 원자 좌표는 도 17 내지 20 중 임의의 것에 나타낸 3 차원 구조에서 선택되거나, 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 3 차원 구조에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표임),

b. 상기 프로세서를 사용하여, 데이터 저장 시스템에 저장된 저분자량 유기 화학 구조 및 펩티드 절편의 컴퓨터 데이터베이스와 기준 데이터 세트를 비교하는 단계, 및

c. 컴퓨터 방법을 사용하여, 기준 데이터 세트와 구조적으로 상보적인 부분을 가지며 수용체 소르틸린으로의 입체 간섭을 갖지 않는 화학 구조를 상기 데이터베이스로부터 선별하는 단계.

a. SEQ ID NO.1 (소르틸린) 의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체 내의 결합 상호 작용 위치 세트에 잠재적 리간드를 도킹 (상기 결합 상호 작용은 컴퓨터 모델링에 의해 생성됨) 하고, 소르틸린의 상기 결합 상호 작용 위치 세트에서의 하나 이상의 아미노산에 결합할 수 있는 잠재적 리간드를 선별함으로써, 컴퓨터 모델링과 함께 원자 좌표를 사용하여 잠재적 리간드를 선별하는 단계 (상기 원자 좌표는 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 원자 좌표이거나, 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 3 차원 구조에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택됨),

b. 상기 잠재적 리간드 및 상기 수용체 소르틸린을 제공하는 단계,

c. 잠재적 리간드를 상기 수용체 소르틸린과 접촉시키는 단계, 및

d. 잠재적 리간드에 의해 상기 수용체 소르틸린의 결합을 검출하는 단계.

본 발명의 한 구현예에서 잠재적 리간드 분자의 도킹은 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 3 차원 구조의 원자 좌표에 의해 정의되는 3 차원 구조를 이용하여 수행되며, 상기 잠재적 리간드는 SEQ ID NO.1 (소르틸린) 의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체에서 3 개 이상의 아미노산에 결합할 수 있다.

추가적인 측면에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 소르틸린의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체의 잠재적 리간드의 확인 방법에 관한 것이다:

a. 3 차원 구조 결정을 기초로, SEQ ID NO.1 (소르틸린) 의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체의 배좌를 정의하는 원자 좌표에서 유래한 정보를 컴퓨터에 도입함으로써 컴퓨터 프로그램이 상기 배좌의 구조를 이용하거나 컴퓨터 스크린 상에 디스플레이하는 단계 (상기 원자 좌표는 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 3 차원 구조에서 선택되거나, 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것으로 표시한 3 차원 구조 중 임의 하나에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표임);

b. 상기 컴퓨터 프로그램에 의해 컴퓨터 스크린 상에 소르틸린의 결합 위치 1, 결합 위치 2 또는 결합 위치 3 의 3 차원 표시를 생성하는 단계;

c. 소르틸린의 상기 결합 위치 1, 결합 위치 2 및 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체의 표시 위에 잠재적 리간드의 모델을 겹쳐 놓는 단계;

d. 고친화성 뉴로텐신 결합 위치, 저친화성 뉴로텐신 결합 위치, 소르틸린 프로펩티드 결합 위치 또는 소르틸린의 프로-뉴로트로핀 결합 위치로 잠재적 리간드의 입체 간섭의 부재 및 결합 가능성을 평가하는 단계;

e. 상기 수용체 소르틸린의 결합 검정에서 상기 잠재적 리간드 화합물을 혼입하는 단계, 및

f. 상기 잠재적 리간드가, 비제한적으로 SEQ ID NO.6 의 아미노산 잔기 19 내지 241 (proNGF), SEQ ID NO.6 의 아미노산 잔기 19 내지 121 (NGF 프로 도메인), SEQ ID NO.7 의 아미노산 잔기 19 내지 246 (proBDNF), SEQ ID NO.7 의 아미노산 잔기 19 내지 127 (BDNF 프로 도메인), SEQ ID NO.8 의 아미노산 잔기 17 내지 257 (proNT3), SEQ ID NO.8 의 아미노산 잔기 17 내지 140 (NT3 프로 도메인), SEQ ID NO.9 의 아미노산 잔기 25 내지 210 (proNT4/5), SEQ ID NO.9 의 아미노산 잔기 25 내지 80 (NT4/5 프로 도메인), SEQ ID NO.10 (뉴로텐신), SEQ ID NO.11 (PYIL) 및 SEQ ID NO.10 의 아미노산 잔기 11 내지 13 (YIL) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 경쟁 리간드의 결합을 저해하는지 여부를 측정하는 단계.

본 발명의 추가적인 구현예에서, 결합 위치 1 의 하기의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 원자 좌표에서 유래한 정보가 사용된다: SEQ ID NO.1 의 R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 내지 M363, S305, F306, T398 내지 G400, I303-G309, Q349-A356, Y395 및 T402.

본 발명의 추가적인 구현예에서, 결합 위치 2 의 하기의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 원자 좌표에서 유래한 정보가 리간드 예측 및/또는 설계에 사용된다: SEQ ID NO.1 의 L572, L114, V112, R109 내지 S111, S115 내지 G118, T570, G571, W586, W597, T168-I174, L572, A573 및 S584 내지 F588.

본 발명의 추가적인 구현예에서, 결합 위치 3 의 하기의 아미노산 잔기중 하나 이상의 원자 좌표에서 유래한 정보가 사용된다: SEQ ID NO.1 의 D403, S420, D422, N423, S424, I425, E426, T451, Y466, E470, I498, S499 및 V500.

본 발명의 추가적인 구현예에서, 데이터 기준 세트 또는 결합 상호 작용 세트는 확인된 군에서 선택되는 3 개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 원자 좌표는 5 Å 이상의 해상도로 측정된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 원자 좌표는 4 Å 이상의 해상도로 측정된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 원자 좌표는 3 Å 이상의 해상도로 측정된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 원자 좌표는 2 Å 이상의 해상도로 측정된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 원자 좌표는 1.5 Å 이상의 해상도로 측정된다.

Vps10p -도메인 수용체 리간드의 특성

상기 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 리간드는 소르틸린의 결정 구조를 통해 확인된 결합 위치에 특이적으로 결합한다. Vps10p-도메인 부류의 5 개 일원 사이에서의 Vps10p-도메인의 상동성으로 인해, 소르틸린의 결합 위치 1-3 에 대한 결합으로서 확인되는 리간드는 다른 Vps10-p 도메인 수용체의 Vps10p-도메인과 또한 상호 작용할 수 있을 것으로 보인다.

본 발명의 한 구현예에서 잠재적 리간드 분자는 SEQ ID NO.1 의 고친화성 뉴로텐신 결합 위치에서 적어도 아미노산들과 상호 작용한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 잠재적 리간드 분자는 SEQ ID NO.1 의 저친화성 뉴로텐신 결합 위치에서 적어도 아미노산들과 상호 작용한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 잠재적 리간드 분자는 SEQ ID NO.1 의 소르틸린 프로펩티드 결합 위치에서 적어도 아미노산들과 상호 작용한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 잠재적 리간드 분자는 SEQ ID NO.1 의 프로-뉴로트로핀 결합 위치에서 적어도 아미노산들과 상호 작용한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 잠재적 리간드는 비-가수분해가능 펩티드 및 펩티드 유사체, 유기 화합물 및 무기 화합물로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 소 유기 분자의 라이브러리가 스크리닝된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 잠재적 펩티드 리간드의 라이브러리가 스크리닝된다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 상기 본원에서 기재된 방법에 의해 확인되는 리간드에 관한 것이며, 상기 리간드는 상기 결합 위치 1 의 하나 이상의 상호 작용 지점에 결합할 수 있고, 상기 상호 작용 지점은 하기와 같은, 도 14 의 X₁, X₂, X₃, X₄, R₁, R₂, J₁, J₂ 및 J₃ 을 포함한다:

X₂ 는 Y351 의 골격 카르보닐을 포함하고,

X₃ 은 I353 의 골격을 포함하고,

X₄ 는 K260 의 아미노기를 포함하고,

R₁ 은 아미노산 잔기 I327, F314, Y351, I353 및 M363 을 포함하고,

J₁ 은 S305 를 포함하고,

J₂ 는 F306 의 골격 아미드를 포함하고,

J₃ 은 F306 의 골격 카르보닐을 포함함.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상호 작용 지점 X₁ 은 음전하 및/또는 수소 수용체 특성을 포함하며, 상기 음전하 및/또는 수소 수용체 특성은 카르복실레이트, 술폰산, 디-플루오로 (상기 디-플루오로는 아르기닌, 디-클로로의 양전하를 상쇄하기 위해 음전하가 없으며, 상기 디-클로로는 아르기닌의 양전하를 상쇄하기 위해 음전하가 없음) 로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 리간드는 상호 작용 지점 X₂ 에서 히드록실, 아미노 및 아미도로 이루어지는 군에서 선택되는 수소 결합 공여체를 포함한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 리간드는 상호 작용 지점 X₃ 에서 카르보닐, 클로로 및 플루오로로 이루어지는 군에서 선택되는 수소 결합 수용체를 포함한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 리간드는 상호 작용 지점 R₁ 에서 시클로헥실-알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌 및 페닐알라닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 벌키 소수성기를 포함한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 리간드는 상호 작용 지점 R₂ 에서 이소류신, 류신, 시스테인으로 이루어지는 군에서 선택되는 소수성 아미노산 잔기, 또는 히스티딘, 글루타민, 리신, 아르기닌 및 글루타메이트로 이루어지는 군에서 선택되는 부분적인 소수성기를 포함한다.

중요한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 (I) 의 일반적 구조를 갖는, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다:

[식 중,

보다 중요한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 (II) 의 일반적 구조를 갖는, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다:

[식 중,

R₅ 는 H, CH₃ 및 링커 L2 로 이루어지는 군에서 선택되고,

[식 중,

R₁₈ 은 H, -CH₃ 및 -CH₂OH 로 이루어지는 군에서 선택되고,

본 발명의 한 구현예에서 화학식 (I) 의 리간드는 링커 L2 에 의해 화학식 (II) 의 리간드에 연결되어, 일반적 화학식 (IV) 를 형성한다:

[화학식 (I)] - [링커 L2] - [화학식 (II)] (IV)

식 중, 상기 화학식 (IV) 는 소르틸린의 결합 위치 1 및 2 를 동시에 차단할 수 있으며, 상기 본원에서 언급된 링커 L2 는 5 내지 6 개 잔기의 펩티드 골격, C15-20 알킬, C15-20 알케닐 및 C15-20 알키닐로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 한 구현예에서 화학식 (I) 의 리간드는 링커 L3 에 의해 화학식 (III) 의 리간드에 연결되어, 일반적 화학식 (V) 를 형성한다:

[화학식 (I)] - [링커 L3] - [화학식 (III)] (V)

식 중, 상기 화학식 (V) 는 소르틸린의 결합 위치 1 및 3 을 동시에 차단할 수 있으며, 링커 L3 은 12 내지 20 개 잔기의 펩티드 골격, C30-60 알킬, C30-60 알케닐, C30-60 알키닐로 이루어지는 군에서 선택된다.

추가적인 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 확인되는 리간드는 도 26 에서 표현되는 RRPYI(chg), iodoYIL, QIL, YCL, dYIL, YHL, RRPYI(acc), RRPYI(nMe)L, YIL 로 이루어지는 군에서 선택된다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현되는 RRPYI(chg) 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현되는 iodoYIL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현되는 QIL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현되는 YCL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현되는 dYIL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현되는 YHL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현되는 RRPYI(acc) 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현되는 RRPYI(nMe)L 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 도 26 에서 표현되는 YIL 인, 본원에서 정의한 방법에 의해 확인되는 Vps10p-도메인 수용체 리간드에 관한 것이다.

한 구현예에서, 리간드는 자연적 뉴로텐신, NT(8-13) 또는 NT69L 로 이루어지는 군에서 선택되지 않는다.

본 발명의 추가적인 구현예에서, 상기 본원에서 기재된 방법에 의해 확인되는 바와 같은 리간드는 Vps10p-도메인 수용체 소르틸린의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체에 결합하는 것을 저해할 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, Vps10p-도메인 수용체 단백질 분자의 원자 모델을 구축하는 방법에 관한 것이다:

b. 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 바와 같은 원자 좌표, 또는 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 3 차원 구조에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표를 이용하여, 상동성 모델링에 의해 확인된 Vps10p-도메인 수용체의 원자 모델을 수득하는 단계.

본 발명의 추가적인 구현예에서 본원에서 정의한 방법에 따라 구축되는 Vps10p-도메인 수용체는 SEQ ID NO.2 (SorLA), SEQ ID NO.3 (SorCS1), SEQ ID NO.4 (SorCS2) 및 SEQ ID NO.5 (SorCS3) 또는 이의 절편 또는 변이체로 이루어지는 군에서 선택된다.

추가적인 측면에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, Vps10p-도메인 수용체 또는 이의 절편 또는 변이체의 잠재적 리간드의 확인 방법에 관한 것이다:

a) 3 차원 구조 결정을 기초로, SEQ ID NO.1 (소르틸린) 의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체와 20% 이상의 서열 동일성을 갖는 결합 위치의 배좌를 정의하는 원자 좌표에서 유래한 정보를 컴퓨터에 도입함으로써 컴퓨터 프로그램이 상기 배좌의 구조를 이용하거나 컴퓨터 스크린 상에 디스플레이하는 단계 (상기 원자 좌표는 도 17 내지 20 중 임의의 것에서 나타낸 3 차원 구조에서 선택되거나, 3 Å 이하의 단백질 골격 원자에 대한 실효 편차에 의해 도 17 내지 20 중 임의의 것으로 표시한 3 차원 구조 중 임의 하나에서 벗어나는 3 차원 구조에서 선택되는 원자 좌표임);

b) 상기 컴퓨터 프로그램에 의해 컴퓨터 스크린 상에 소르틸린의 결합 위치 1, 결합 위치 2 또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체와 20% 이상의 서열 동일성을 갖는 결합 위치의 3 차원 표시를 생성하는 단계;

c) 소르틸린의 결합 위치 1, 결합 위치 2 및 결합 위치 3 과 20% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 결합 위치 표시 위에 잠재적 리간드의 모델을 겹쳐 놓는 단계의 표시 위에 잠재적 리간드의 모델을 겹쳐 놓는 단계;

d) 소르틸린의 결합 위치 1, 결합 위치 2 또는 결합 위치 3, 또는 이의 절편 또는 변이체와 20% 이상의 서열 동일성을 갖는 결합 위치로 잠재적 리간드의 입체 간섭의 부재 및 결합 가능성을 평가하는 단계;

e) 상기 Vps10p-도메인 수용체의 결합 검정에서 상기 잠재적 리간드 화합물을 혼입하는 단계, 및

f) 생화학적 또는 생물리학적인 경쟁적 결합 검정을 수행하여 상기 잠재적 리간드가 SEQ ID NO.1 의 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3 과 20% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 결합 위치에 결합할 수 있는지 여부를 측정하는 단계로서, 경쟁 리간드는 SEQ ID NO.6 의 아미노산 잔기 19 내지 241 (proNGF), SEQ ID NO.6 의 아미노산 잔기 19 내지 121 (NGF 프로 도메인), SEQ ID NO.7 의 아미노산 잔기 19 내지 246 (proBDNF), SEQ ID NO.7 의 아미노산 잔기 19 내지 127 (BDNF 프로 도메인), SEQ ID NO.8 의 아미노산 잔기 17 내지 257 (proNT3), SEQ ID NO.8 의 아미노산 잔기 17 내지 140 (NT3 프로 도메인), SEQ ID NO.9 의 아미노산 잔기 25 내지 210 (proNT4/5), SEQ ID NO.9 의 아미노산 잔기 25 내지 80 (NT4/5 프로 도메인), SEQ ID NO.10 (뉴로텐신), SEQ ID NO.11 (PYIL), SEQ ID NO.10 의 아미노산 잔기 11 내지 13 (YIL) 및 SEQ ID NO.12 (NT69L) 또는 상기 경쟁 리간드의 절편 또는 변이체로 이루어지는 군에서 선택됨.

표시

한 측면에서 본 발명은 소르틸린의 저해제 및/또는 소르틸린:proNGF:p75^NTR 유도 세포자멸사의 저해제를 포함하는 약제에 관한 것이다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 본원에서 기재된 방법에 의해 확인되는 하나 이상의 리간드는, 개인에서의 신경계의 질환, 장애 또는 손상 치료 및 예방, 또는 이의 치료 및 예방 및/또는 이에 대한 보호용 약제의 제조에 사용된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 언급된 개인은 인간이다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 언급된 약제는 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에 대한 상해를 포함하는 질환, 장애 또는 손상의 치료를 위한 것이다.

본 발명의 구현예에서 상기 본원에서 정의된 상해는 뇌졸중, 외상성 뇌 상해, 척수 상해, 미만성 축삭 상해 및 간질로 인한 것이다.

본 발명의 구현예에서 신경계 장애는 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에서의 뉴런의 변성 및 이의 과정을 포함한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 뉴런의 변성은 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 노인성 치매, 헌팅턴 병, 근위축성 측삭 경화증, 및 다발성 경화증과 연관된 뉴런 상해로 인한 것이다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 본원에서 기재한 바와 같은 신경변성 질환은 파킨슨 병이다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 본원에서 기재한 바와 같은 신경변성 질환은 헌팅턴 병이다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 본원에서 기재한 바와 같은 신경변성 질환은 근위축성 측삭 경화증이다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 본원에서 기재한 바와 같은 신경계 장애는 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에서의 뉴런의 부전 및/또는 손실을 포함하는 질환, 장애 또는 손상이다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에서의 뉴런의 부전 및/또는 손실을 포함하는 상기 언급한 질환, 장애 또는 손상은, 당뇨병, 신부전, 알코올 중독, 화학요법, 화학제, 약물 남용, 비타민 결핍 및 감염을 비제한적으로 포함하는 대사 질환, 영양 결핍, 독성 손상, 악성 종양 및/또는 유전적 또는 특발성 상태에 의해 야기되는 상태로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 한 구현예에서 신경계 장애는 뇌, 뇌간, 척수 및 말초 신경에서의 희돌기아교세포, 성상 세포 및 슈반 세포 (Schwann cell) 로 이루어지는 군에서 선택되는 신경교의 변성 또는 경화증을 포함하는 질환, 장애 또는 손상이다.

본 발명의 한 구현예에서 신경교의 변성 또는 경화증을 포함하는 상기 질환, 장애 또는 손상은 다발성 경화증, 시신경염, 대뇌 경화증, 감염 후 뇌척수염 및 간질로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 한 구현예에서 질환 또는 장애는 다발성 경화증, 감각성 실조, 신경변성 척수소뇌성 장애, 유전적 운동실조, 소뇌 위축증 및 알코올 중독이다.

본 발명의 한 구현예에서 신경계 장애, 질환 또는 손상은 망막, 광수용체 및 연관 신경을 포함한다.

본 발명의 한 구현예에서 망막, 광수용체 및 연관 신경을 포함하는 신경계 장애, 질환 또는 손상은 망막세포변성, 황반 변성, 녹내장 및 당뇨병성 망막증으로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 한 구현예에서 신경계 장애, 질환 또는 손상은 음향신경 복합체의 연관 신경절 및 감각 상피를 포함한다.

본 발명의 한 구현예에서 음향신경 복합체의 연관 신경절 및 감각 상피를 포함하는 상기 신경계 장애, 질환 또는 손상은 소음성 난청, 난청, 이명, 이염, 내이염, 유전성 및 청각 전정 위축증, 및 메니에르 병 (Menieres Disease) 으로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 약제는 약학적으로 허용가능한 담체를 임의로 포함한다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 본원에서 기재된 바와 같은 약제는 SEQ ID NO.1 의 고친화성 뉴로텐신 결합 위치 (결합 위치 1) 에 결합할 수 있는 리간드, SEQ ID NO.1 의 저친화성 뉴로텐신 결합 위치 (결합 위치 2) 에 결합할 수 있는 리간드, SEQ ID NO.1 의 소르틸린 프로펩티드 결합 위치 (결합 위치 1 및 2) 에 결합할 수 있는 리간드 및 SEQ ID NO.1 의 프로-뉴로트로핀 결합 위치 (결합 위치 3) 에 결합할 수 있는 리간드로 이루어지는 군에서 선택되는 제 2 의 활성 성분을 포함한다.

투여 형태

치료 방법에서의 약물 전달 주요 경로는 정맥내, 경구 및 국소이다. 약물을 표적 위치에 전달하거나 약물을 혈류 내에 도입하기에 효과적인, 피하 주사 또는 흡입을 통한 것과 같은 다른 약물 투여 방법이 또한 고찰된다.

본 발명의 약학 제제가 투여되는 점막은 생물학적 활성 물질이 예를 들어 코, 질, 눈, 입, 생식기, 폐, 위장관, 또는 직장에 주어지는, 포유류의 임의의 점막, 바람직하게는 코, 입 또는 질의 점막일 수 있다.

본 발명의 화합물은 비경구적으로, 즉 정맥내, 근육내, 피하, 비강내, 직장내, 질내 또는 복강내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구적 투여의 피하 및 근육내 형태가 일반적으로 바람직하다. 이러한 투여를 위한 적절한 투약 형태는 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 화합물은 또한 흡입 (비강내 및 경구 흡입 투여에 의한) 에 의해 투여될 수 있다. 분무 제형 또는 정량식 흡입기와 같은, 이러한 투여를 위한 적절한 투약 형태는 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 하나 이상의 다른 화합물과 함께 투여될 수 있다. 화합물은 개별적 제형으로서 또는 단위 투약 형태로 조합되어 동시에 투여될 수 있거나, 연속적으로 투여될 수 있다.

제형

본 발명의 화합물 또는 염을 원료 화합물로서 투여할 수 있지만, 이를 약학 제형의 형태로 제시하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 본원에서 정의한 바와 같은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 의학적 적용을 위한 약학 제형을 추가로 제공한다.

본 발명의 화합물은 다양한 경구 투여 투약 형태로 제형화될 수 있다. 약학 조성물 및 투약 형태는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 결정 형태를 활성 성분으로서 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 형태 제제는 분말, 정제, 알약, 캡슐, 교갑 (cachet), 좌약 및 분산 가능 과립을 포함한다. 고체 담체는 희석제, 감미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제, 보존제, 습윤제, 정제 붕해제 또는 캡슐화 물질로서 또한 작용할 수 있는 하나 이상의 물질일 수 있다.

바람직하게는, 조성물은 약 0.5 내지 75 중량% 의 본 발명의 화합물(들) 일 수 있다 (나머지는 적합한 약학 부형제로 이루어짐). 경구 투여를 위해서는, 상기 부형제는 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탤컴, 셀룰로오스, 글루코오스, 젤라틴, 수크로오스, 탄산마그네슘 등을 포함한다.

분말에서, 담체는 세분된 활성 성분을 갖는 혼합물인 세분된 고체이다. 정제에서, 활성 성분은 필요한 결합 능력을 갖는 담체와 적합한 비율로 혼합되며 원하는 형상 및 크기로 압축된다. 분말 및 정제는 바람직하게는 1 내지 약 70% 의 활성 화합물을 함유한다. 적합한 담체는 탄산마그네슘, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당, 락토오스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트래거캔스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 저 용융 왁스, 코코아 버터 등이다. 용어 "제제" 는 담체를 갖거나 갖지 않는 활성 성분이, 이와 함께 담체에 의해 둘러싸진 캡슐을 제공하는, 담체로서 캡슐화 물질을 갖는 활성 화합물의 제형을 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 교갑 및 트로치 (lozenge) 가 포함된다. 정제, 분말, 캡슐, 알약, 교갑 및 트로치는 경구 투여에 적합한 고체 형태로서일 수 있다.

본 발명에 따른 점적 (drops) 은 살균 또는 비-살균 수용성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있고, 활성 성분을 적합한 수용액 (살균제 및/또는 살진균제 및/또는 임의의 다른 적합한 보존제를 임의로 포함하고, 표면 활성제를 임의로 포함함) 에 용해하여 제조될 수 있다. 생성된 용액은 이후 여과로 투명하게 될 수 있고, 적합한 용기로 옮겨져 이후 밀봉되고 오토클레이브에 의해 또는 30 분 동안 98-100℃ 에서 유지시켜 멸균된다. 대안적으로, 용액은 여과에 의해 멸균되고 용기에 무균적으로 옮겨질 수 있다. 점적에 포함시키기에 적합한 살균제 및 살진균제의 예는 페닐수은 니트레이트 또는 아세테이트 (0.002%), 벤즈알코늄 클로라이드 (0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트 (0.01%) 이다. 유성 용액의 제조에 적합한 용매는 글리세롤, 희석된 알코올 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.

사용하기 직전에 경구 투여용 액체 형태 제제로 전환되는 것으로 의도되는 고체 형태 제제가 또한 포함된다. 이러한 액체 형태는 용액, 현탁액 및 유액을 포함한다. 이러한 제제는 활성 성분에 추가적으로 착색제, 풍미, 안정화제, 완충액, 인공 및 천연 감미료, 분산제, 증점제, 가용화제 등을 함유할 수 있다.

경구 투여에 적합한 다른 형태는 유액, 시럽, 엘릭시르, 수용액, 수성 현탁액, 치약, 겔 치분, 추잉검, 또는 사용 직전에 액체 형태 제제로 전환되는 것으로 의도되는 고체 형태 제제를 포함한다. 유액은 프로필렌 글리콜 수용액 중 용액으로 제조될 수 있거나, 레시틴, 소르비탄 모노올레에이트 또는 아카시아와 같은 유화제를 함유할 수 있다. 수용액은 활성 성분을 물에 용해하고 적합한 착색제, 풍미, 안정화제 및 증점제를 첨가하여 제조될 수 있다. 수성 현탁액은 세분된 활성 성분을 점성 물질 예컨대 천연 또는 합성 고무, 수지, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 및 다른 널리 알려진 현탁제와 함께 물에 분산하여 제조될 수 있다. 고체 형태 제제는 용액, 현탁액 및 유액을 포함하며, 활성 성분에 추가적으로 착색제, 풍미, 안정화제, 완충액, 인공 및 천연 감미료, 분산제, 증점제, 가용화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 비경구 투여 (예를 들어 주사, 예를 들어 순간 주사 (bolus injection) 또는 연속 주입에 의한) 용으로 제형화될 수 있으며, 앰플, 사전-충전된 실린지, 소부피 주입에서의 단위 투여 형태, 또는 보존제가 첨가된 다투여 용기로 존재할 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 유액, 예를 들어 수성 폴리에틸렌 글리콜 중 용액과 같은 형태를 취할 수 있다. 유성 또는 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성유 (예를 들어 올리브유), 및 주사 가능 유기 에스테르 (예를 들어 에틸 올레에이트) 를 포함하며, 보존제, 습윤제, 유화제 또는 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 멸균 고체의 무균적 단리, 또는 사용 전 적합한 비히클, 예를 들어 멸균, 무-발열원수로 구성하기 위한 용액으로부터의 동결 건조에 의해 수득된 분말 형태일 수 있다.

비경구 제형에 유용한 오일은 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 오일을 포함한다. 이러한 제형에 유용한 오일의 특이적 예는 땅콩유, 대두유, 참깨유, 면실유, 옥수수유, 올리브유, 석유 및 광물유를 포함한다. 비경구 제형에 사용하기에 적합한 지방산은 올레산, 스테아르산 및 이소스테아르산을 포함한다. 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트는 적합한 지방산 에스테르의 예이다.

비경구 제형에 사용하기에 적합한 비누는 지방 알칼리 금속, 암모늄 및 트리에탄올아민 염을 포함하고, 적합한 세제는 (a) 양이온 세제, 예를 들어 디메틸 디알킬 암모늄 할라이드 및 알킬 피리디늄 할라이드; (b) 음이온 세제, 예를 들어 알킬, 아릴 및 올레핀 술포네이트, 알킬, 올레핀, 에테르 및 모노글리세리드 술페이트 및 술포숙시네이트, (c) 비이온 세제, 예를 들어 지방 아민 산화물, 지방산 알칸올아미드 및 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌 공중합체, (d) 양쪽성 세제, 예를 들어 알킬-.베타.-아미노프로피오네이트 및 2-알킬-이미다졸린 제 4 암모늄 염, 및 (e) 이의 혼합물을 포함한다.

비경구 제형은 전형적으로 용액 중 활성 성분 약 0.5 내지 약 25 중량% 를 함유할 것이다. 보존제 및 완충액이 사용될 수 있다. 주사 부위에서의 자극을 최소화 또는 제거하기 위해, 이러한 조성물은 약 12 내지 약 17 의 친수성-친유성 균형 (HLB) 을 갖는 하나 이상의 비이온 계면활성제를 함유할 수 있다. 이러한 제형 중 계면활성제의 양은 전형적으로 약 5 내지 약 15 중량% 의 범위일 것이다. 적합한 계면활성제는 폴리에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 예컨대 소르비탄 모노올레에이트 및 소수성 염기를 갖는 에틸렌 산화물의 고분자량 부가물 (프로필렌 산화물과 프로필렌 글리콜과의 축합에 의해 형성됨) 을 포함한다. 비경구 제형은 단위-투여 또는 다-투여 밀봉 용기 예컨대 앰플 및 바이알 내에 존재할 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 부형제 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 냉동 건조 (동결 건조) 상태에서 보관될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액이 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 국소적으로 전달될 수 있다. 국소 투여용 부위는 피부 표면 및 또한 질, 직장, 코, 입 및 식도의 점막 조직을 포함한다. 피부 및 점막을 통한 국소 투여용 조성물은 부기 또는 발적과 같은 자극의 징후를 일으키지 않아야 한다.

국소 조성물은 국소 투여에 적합화된 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 따라서, 조성물은 예를 들어 현탁액, 용액, 연고, 로션, 성교 윤활제, 크림, 포말, 분무, 스프레이, 좌약, 임플란트, 흡입제, 정제, 캡슐, 건조 분말, 시럽, 밤 또는 트로치의 형태를 취할 수 있다. 이러한 조성물의 제조 방법은 약학 산업에서 널리 알려져 있다.

본 발명의 화합물은 연고, 크림 또는 로션으로서, 또는 경피 패치로서 상피에 국소 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 연고 및 크림은 예를 들어 적합한 증점제 및/또는 겔화제가 첨가된 수성 또는 유성 베이스로 제형화될 수 있다. 로션은 수성 또는 유성 베이스로 제형화될 수 있으며, 일반적으로 또한 하나 이상의 유화제, 안정화제, 분산제, 현탁제, 증점제 또는 착색제를 함유할 것이다. 입에서의 국소 투여에 적합한 제형은 풍미 베이스 (수크로오스 및 아카시아 또는 트래거캔스) 중 활성제를 포함하는 트로치; 불활성 베이스 예컨대 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로오스 및 아카시아 중 활성 성분을 포함하는 향정 (pastille); 및 적합한 액체 담체 중 활성 성분을 포함하는 구강 세정제를 포함한다.

본 발명에 따른 크림, 연고 또는 페이스트는 외부 적용을 위한 활성 성분의 반-고체 제형이다. 이는 세분되거나 분말화된 형태에 활성 성분을 단독으로, 또는 용액으로, 또는 수성 또는 비-수성 유체 중 현탁액으로, 적합한 기계의 도움으로 지방성 또는 비-지방성 베이스와 혼합하여 제조될 수 있다. 베이스는 경질, 연질 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속 비누와 같은 탄화수소; 점액질; 아몬드유, 옥수수유, 아라키스유, 피마자유 또는 올리브유와 같은 천연 기원유; 프로필렌 글리콜 또는 마크로골과 같은 알코올과 함께, 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산 또는 양모 지방 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 제형은 임의의 적합한 표면 활성제 예컨대 음이온, 양이온 또는 비이온 계면활성제 예컨대 소르비탄 에스테르 또는 이의 폴리옥시에틸렌 유도체를 포함할 수 있다. 현탁제 예컨대 천연 고무, 셀룰로오스 유도체 또는 무기 물질 예컨대 규산질 실리카, 및 기타 성분 예컨대 라놀린이 또한 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 로션은 피부 또는 눈에 대한 적용에 적합한 것들을 포함한다. 눈 로션은 살균제를 임의 함유하는 멸균 수용액을 포함할 수 있으며, 점적의 제조를 위한 것과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 피부에 대한 적용을 위한 로션 또는 도포제는 또한, 알코올 또는 아세톤과 같은 건조를 촉진하고 피부를 냉각시키는 제제 및/또는 글리세롤과 같은 모이스처라이저, 또는 피마자유 또는 아라키스유와 같은 오일을 포함할 수 있다.

경피 전달

본원에서 기재된 약학제-화학 개질제 복합체는 경피적으로 투여될 수 있다. 경피 투여는 전형적으로 약물의 환자의 전신 순환계로의 경피적 통과를 위한 약학제의 전달을 포함한다. 피부 부위는 약물을 경피적으로 투여하기 위한 해부적 부위를 포함하며, 전완, 복부, 흉부, 후부, 둔부, 유양 돌기 부위 등을 포함한다.

경피 전달은 복합체의 공급원을 연장된 기간 동안 환자의 피부에 노출시켜 달성된다. 경피 패치는 약학제-화학 개질제 복합체의 신체로의 제어된 전달을 제공한다는 부가된 이점을 갖는다. [Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987); 및 Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987)] 를 참조한다. 이러한 투약 형태는 약학제-화학 개질제 복합체를 적절한 매질, 예컨대 엘라스토머성 매트릭스 물질 내에 용해, 분산, 또는 다르게는 혼입하여 제조될 수 있다. 흡수 증강제가 피부를 통한 화합물의 흐름을 증가시키는데 또한 사용될 수 있다. 상기 흐름의 속도는 속도-제어 멤브레인을 제공하거나 화합물을 중합체 매트릭스 또는 겔에 분산함으로써 제어될 수 있다.

수동적 경피 약물 전달

다양한 유형의 경피 패치가 본원에서 기재된 방법에 사용될 것이다. 예를 들어, 단순한 점착성 패치는 백킹재 (백킹재) 및 아크릴레이트 점착제로부터 제조될 수 있다. 약학제-화학 개질제 복합제 및 임의의 증강제는 점착성 주조 용액으로 제형화되고 완전히 혼합된다. 용액이 백킹재 상에 직접적으로 주조되고, 주조 용매가 오븐에서 증발되어, 점착성 필름이 남는다. 이형지가 부착되어 시스템이 완결될 수 있다.

대안적으로는, 폴리우레탄 매트릭스 패치를 이용하여 약학제-화학 개질제 복합체를 전달할 수 있다. 이러한 패치의 층은 백킹, 폴리우레탄 약물/증강제 매트릭스, 멤브레인, 점착제 및 이형지를 포함한다. 폴리우레탄 매트릭스는 실온 경화 폴리우레탄 예비중합체를 사용하여 제조된다. 예비중합체에 물, 알코올 및 복합체를 첨가하여, 오직 백킹재만을 직접적으로 주조시킬 수 있는 끈끈하고 견고한 엘라스토머가 형성된다.

본 발명의 추가적인 구현예는 히드로겔 매트릭스 패치를 이용할 것이다. 전형적으로, 히드로겔 매트릭스는 알코올, 물, 약물 및 여러 친수성 중합체를 포함할 것이다. 이러한 히드로겔 매트릭스는 백킹과 점착층 사이에서 경피 패치에 혼입될 수 있다.

액체 저장소 패치가 또한 본원에서 기재된 방법에 사용될 것이다. 이러한 패치는 불투과성 또는 반투과성, 열 밀봉가능 백킹재, 열 밀봉가능 멤브레인, 아크릴레이트 기재 감압성 피부 점착제 및 실리콘화 이형지를 포함한다. 백킹은 멤브레인에 열 밀봉되어 복합체, 증강제, 겔화제 및 기타 부형제의 용액으로 이후 충전될 수 있는 저장소를 형성한다.

포말 매트릭스 패치는 겔화된 약학제-화학 개질제 용액이 얇은 포말층, 전형적으로 폴리우레탄 내에 가두어진다는 것을 제외하고는, 액체 저장소 시스템에 대한 설계 및 성분에 있어서 유사하다. 이러한 포말층은 패치의 주변에서 열 밀봉된 멤브레인과 백킹 사이에 위치한다.

수동적 전달 시스템에 대해서, 방출 속도는 전형적으로 저장소와 피부 사이에 위치한 멤브레인에 의해, 모놀리스 장치로부터의 확산에 의해, 또는 전달 시스템에서 속도-제어 배리어로서 역할하는 피부 자체에 의해 제어된다. 미국 특허 제 4,816,258 호; 제 4,927,408 호; 제 4,904,475 호; 제 4,588,580 호, 제 4,788,062 호; 등을 참조한다. 약물 전달 속도는 일부분, 멤브레인의 성질에 의존적일 것이다. 예를 들어, 신체 내에서 멤브레인을 통과하는 약물 전달 속도는 일반적으로 진피 배리어를 통과하는 것보다 더 높다. 복합체가 장치로부터 멤브레인으로 전달되는 속도는, 저장소와 피부 사이에 위치하는 속도-제한 멤브레인의 사용에 의해 가장 유리하게 제어된다. 피부가 복합체에 대해 충분히 투과성 (즉, 피부를 통한 흡수가 멤브레인을 통한 이동 속도보다 더 큼) 이라고 가정하여, 멤브레인은 환자에 의해 경험되는 투약 속도를 제어하는 역할을 할 것이다.

적합한 투과성 멤브레인 물질은 투과성의 원하는 정도, 복합체의 성질, 및 장치를 구성하는데 관련되는 기계적 고려 사항을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예시적 투과성 멤브레인 물질은 다양한 천연 및 합성 중합체, 예컨대 폴리디메틸실록산 (실리콘 고무), 에틸렌비닐아세테이트 공중합체 (EVA), 폴리우레탄, 폴리우레탄-폴리에테르 공중합체, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리비닐클로라이드 (PVC), 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 셀룰로오스성 물질, 예를 들어 셀룰로오스 트리아세테이트 및 셀룰로오스 니트레이트/아세테이트, 및 히드로겔, 예를 들어 2-히드록시에틸메타크릴레이트 (HEMA) 를 포함한다.

원하는 장치 특징에 따라, 치료적 생성물의 다른 통상적 성분과 같은 다른 품목이 장치에 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물은 또한 하나 이상의 보존제 또는 제균제, 예를 들어 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 클로로크레솔, 벤즈알코늄 클로라이드 등을 포함할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 또한 항균제, 특히 항생제, 마취제, 진통제 및 항소양제와 같은 다른 활성 성분을 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 좌약으로서 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 지방산 글리세리드 또는 코코아 버터의 혼합물과 같은 저용융 왁스가 최초로 용융되고, 활성 성분이 예를 들어 교반에 의해 균질하게 분산된다. 용융된 균질한 혼합물을 이후 편리한 치수화 몰드에 부어, 냉각시키고 고체화시킨다.

활성 화합물은 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 담체 (예를 들어 PEG 1000 [96%] 및 PEG 4000 [4%]) 에 분산된 본 발명의 화합물 약 0.5% 내지 약 50% 를 포함하는 좌약으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 질 투여를 위해 제형화될 수 있다. 활성 성분에 추가적으로 상기 담체를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포말 또는 스프레이가 적절한 것으로 당업계에 알려져 있다.

본 발명의 화합물은 비강 투여를 위해 제형화될 수 있다. 용액 또는 현탁액은 통상적인 수단, 예를 들어 점적기, 피펫 또는 스프레이에 의해 비강에 직접적으로 적용된다. 제형은 단일 또는 다용량 형태로 제공될 수 있다. 점적기 또는 피펫의 다용량 형태의 경우에서 이는 환자가 용액 또는 현탁액의 적절한, 소정의 부피를 투여함으로써 달성될 수 있다. 스프레이의 경우 이는 예를 들어 계량 미립자화 스프레이 펌프에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 화합물은 특히 호흡기에 대한, 비강내 투여를 포함하는 분무 투여를 위해 제형화될 수 있다. 화합물은 일반적으로, 예를 들어 약 5 마이크론 이하의 작은 입자 크기를 가질 것이다. 이러한 입자 크기는 당업계에 알려진 수단 (예를 들어 마이크로화) 에 의해 수득될 수 있다. 활성 성분은 클로로플루오로카본 (CFC) 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄 또는 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체와 같은 적합한 추진체를 갖는 가압 팩에 제공된다. 분무는 편리하게는 또한 레시틴과 같은 계면활성제를 함유할 수 있다. 약물의 투여량은 계량 밸브에 의해 제어될 수 있다. 대안적으로는, 활성 성분은 건조 분말의 형태, 예를 들어 락토오스, 전분, 전분 유도체 예컨대 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘 (PVP) 과 같은 적합한 분말 베이스에서의 화합물의 분말 믹스의 형태로 제공될 수 있다. 분말 담체는 비강 내에서 겔을 형성할 것이다. 분말 조성물은, 분말이 흡입기에 의해 이로부터 투여될 수 있는, 예를 들어 젤라틴 또는 발포고 팩의, 예를 들어 카트리지 또는 캡슐 내 단위 투여 형태로 존재할 수 있다.

필요한 경우, 제형은 활성 성분의 서방형 또는 방출 제어형 투여용으로 적합화된 장용 코팅으로 제조될 수 있다.

약학 제제는 바람직하게는 단위 투약 형태이다. 이러한 형태에서, 제제는 적절량의 활성 성분을 함유하는 단위 투여량으로 세분된다. 상기 단위 투약 형태는 패키징된 제제, 별개량의 제제를 함유하는 패키지, 예컨대 바이알 또는 앰플 내 패킷된 정제, 캡슐 및 분말일 수 있다. 또한, 단위 투약 형태는 캡슐, 정제, 교갑 또는 트로치 자체일 수 있거나, 이는 패키징된 형태 내 이들 중 임의의 적절한 수일 수 있다.

약학적으로 허용가능한 염

본 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 이들이 제조되는 경우, 또한 본 발명에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 염은 약학적 용도에 대한 이의 적용에서 허용가능한 것일 것이다. 이에 의해, 이는 염이 모체 화합물의 생물학적 활성을 보유할 것이며, 염이 이의 적용 및 질환 치료에서의 용도에 있어서 적당치 않거나 유해한 효과를 갖지 않을 것임을 의미한다.

약학적으로 허용가능한 염은 표준 방법으로 제조된다. 모체 화합물이 염기인 경우, 이는 적합한 용매 중 과량의 유기 또는 무기산으로 처리된다. 모체 화합물이 산인 경우, 이는 적합한 용매 중 무기 또는 유기 염기로 처리된다.

본 발명의 화합물은 알칼리 금속 또는 이의 알칼리 토금속 염의 형태로 공동으로, 동시에, 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께, 특히 바람직하게는 이의 약학 조성물의 형태로, 경구, 직장 또는 비경구 (피하 포함) 경로 여부에 의해 유효량으로 투여될 수 있다.

본 발명적 약학 조성물에 사용하기 위한 약학적으로 허용가능한 산 첨가 염의 예는, 예를 들어 염화수소산, 브롬화수소산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산과 같은 광물산, 및 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산, p-톨루엔술폰산 및 아릴술폰산과 같은 유기산에서 유래한 것들을 포함한다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 본원에서 기재된 바와 같은 약제 조성물의 pH 는 pH 5 내지 pH 9 이다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 본원에서 기재된 바와 같은 약제는 주사에 의한 투여, 좌약, 경구 투여, 설하 정제 또는 스프레이, 피부상 투여 또는 흡입을 위해 제형화된다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 약제는 정맥내, 근육내, 척수내, 복강내, 피하, 순간 또는 연속 투여인 주사에 의한 투여를 위해 제형화된다.

한 구현예에서 본 발명에 따른 약제는 30 분 내지 24 시간의 간격으로 투여된다.

한 구현예에서 본 발명에 따른 약제는 1 내지 6 시간의 간격으로 투여된다.

본 발명에 따른 한 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 약제의 투여 지속은 6 내지 72 시간이다.

본 발명에 따른 한 구현예에서 상기 본원에서 정의된 약제의 투약량은 체중 1 kg 당 10 ㎍ 내지 10 mg 이다.

치료 방법

추가적인 측면에서 본 발명은, 개인에서의 신경계의 질환, 장애 또는 손상의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 상기 본원에서 기재된 방법에 의해 확인되는 하나 이상의 리간드의 용도에 관한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은, 상기 본원에서 기재된 약제의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 병리학적 상태의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 약제는 신경계와 연관되는 질환, 장애 또는 손상의 치료를 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 약제는, 뇌졸중, 외상성 뇌 상해, 척수 상해, 미만성 축삭 상해 및 간질과 같은 상태를 비제한적으로 포함하는, 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에 대한 상해를 포함하는 질환, 장애 또는 손상의 치료를 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 약제는 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에 대한 상해를 포함하는 질환, 장애 또는 손상의 치료를 위한 것이다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 기재된 신경계 장애는 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에서의 뉴런의 변성 및 이의 과정을 포함한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 뉴런의 상기 변성은 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 노인성 치매, 헌팅턴 병, 근위축성 측삭 경화증, 및 다발성 경화증과 연관된 뉴런 상해로 인한 것이다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 신경변성 질환은 파킨슨 병이다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 신경변성 질환은 헌팅턴 병이다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 신경변성 질환은 근위축성 측삭 경화증이다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 개시한 신경계 장애는 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에서의 뉴런의 부전 및/또는 손실을 포함하는 질환, 장애 또는 손상이다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에서의 뉴런의 부전 및/또는 손실을 포함하는 상기 질환, 장애 또는 손상은 당뇨병, 신부전, 알코올 중독, 화학요법, 화학제, 약물 남용, 비타민 결핍 및 감염을 비제한적으로 포함하는 대사 질환, 영양 결핍, 독성 손상, 악성 종양 및/또는 유전적 또는 특발성 상태에 의해 야기된 상태로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 신경계 장애는, 뇌, 뇌간, 척수 및 말초 신경에서의 희돌기아교세포, 성상 세포 및 슈반 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 신경교의 변성 또는 경화증을 포함하는 질환, 장애 또는 손상이다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 신경교의 변성 또는 경화증을 포함하는 상기 질환, 장애 또는 손상은 다발성 경화증, 시신경염, 대뇌 경화증, 감염 후 뇌척수염 및 간질로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 질환 또는 장애는 다발성 경화증, 감각성 실조, 신경변성 척수소뇌성 장애, 유전적 운동실조, 소뇌 위축증 및 알코올 중독이다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 신경계 장애, 질환 또는 손상은 망막, 광수용체 및 연관 신경을 포함하며, 망막, 광수용체 및 연관 신경을 포함하는 상기 신경계 장애, 질환 또는 손상은 망막세포변성, 황반 변성, 녹내장 및 당뇨병성 망막증으로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 신경계 장애, 질환 또는 손상은 음향신경 복합체의 연관된 신경절 및 감각 상피를 포함한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 음향신경 복합체의 연관된 신경절 및 감각 상피를 포함하는 상기 신경계 장애, 질환 또는 손상은 소음성 난청, 난청, 이명, 이염, 내이염, 유전성 및 청각 전정 위축증, 및 메니에르 병으로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 본원에서 기재된 바와 같은 대상은 인간이다.

세포자멸사

세포자멸사는 세포가 회복 가능성이 없도록 손상되고, 바이러스로 감염되거나 기아와 같은 스트레스 상태를 거칠 때 발생할 수 있다. 세포자멸사에 대한 "결정" 은 세포 자체, 주변 조직, 또는 면역계의 일부인 세포로부터 유래할 수 있다. 이러한 경우 세포자멸사는 손상된 세포를 제거하여 손상된 세포가 유기체로부터 추가적인 영양을 고갈시키는 것을 방지하거나, 바이러스 감염이 퍼지는 것을 방지하는 기능을 한다.

소르틸린은 세포내 이입 뿐 아니라 세포내 분류가 가능한 다기능성 타입-1 수용체 (9-11) 이며, 최근 보여진 바와 같이, 이는 또한 p75^NTR-매개 뉴런 세포자멸사의 프로뉴로트로핀-유도의 촉발에 의한 신호전달에 관여한다 (6, 7, 12, 13).

본 발명은 소르틸린의 결합 위치 1, 결합 위치 2 및 결합 위치 3 에 각각 특이적으로 결합하는 리간드의 설계 방법을 제공한다.

상기 본원에서 정의된 바와 같은 소르틸린 결합 위치 1 및/또는 결합 위치 2 및/또는 결합 위치 3 에 결합할 수 있어, 이로써 소르틸린, proNGF 와 p75^NTR 사이의 3 성분 복합체의 형성을 방지함으로써 세포자멸사를 저해하는 리간드 분자를 설계하고 제공하는 것은 본 발명의 범주 내에 있다.

따라서 한 구현예에서, 본 발명에 따라 설계된 리간드는 세포자멸사를 저해할 수 있다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 포유류 뉴런 세포를 상기 본원에서 정의된 바와 같은 리간드 분자에 노출시키는 것을 포함하는, 포유류 뉴런 세포에서의 세포자멸사 방지 방법에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 포유류 뉴런 세포를 상기 본원에서 정의된 바와 같은 리간드 분자에 노출시키는 것을 포함하는, 포유류 뉴런 세포의 생존 증강 방법에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 포유류 세포 조성물에 상기 본원에서 정의된 바와 같은 리간드 분자를 투여하는 것을 포함하는, 포유류 세포 조성물의 확장 방법에 관한 것이다.

추가적인 측면에서 본 발명은, 포유류 세포 조성물에 상기 본원에서 정의된 바와 같은 리간드 분자를 투여하는 것을 포함하는, 포유류 세포 조성물의 분화 방법에 관한 것이다.

항체

항체는 특정 표적 분자에 단단히 결합함으로써, 이를 직접적으로 불활성화시키거나 파괴를 위해 이를 표지한다. 항체는 두드러지는 특이성과, 수소 결합, 소수성 및 반 데르 발스 힘 뿐 아니라 이온 반응을 포함하는 많은 화학적 힘의 합에 의해 지시되는 힘으로 이의 표적 (항원) 을 인지한다. 일반적으로, 표적이 화학적으로 보다 복합적일수록, 이는 보다 면역성일 것이다. 항원 결정인자는 짧은 선형 아미노산 스트레치 또는 보다 복잡한, 3 차원 단백질 모듈을 포함할 수 있다.

개념상, 표적 수용체에 대해 지시되는 항체는 2 가지 방법으로 리간드 결합을 저해할 수 있다: 경쟁적 또는 알로스테릭 (allosteric). 경쟁적 저해는 항체의 수용체 상 리간드 결합 위치 또는 그 근처로의 직접적 결합을 포함하며, 그에 의해 이의 수용체로부터 리간드를 대체하거나, 리간드 결합 위치에 대한 리간드의 접근을 입체적으로 저해한다. 알로스테릭 저해는 리간드 결합 에피토프와 별개인 수용체 폴리펩티드 상의 위치로의 항체의 결합을 포함한다. 그러나, 상기 위치에 대한 결합은 수용체의 전체 구조에 있어서의 배좌 변화를 유도하여, 리간드가 이의 유사한 인지 위치에 결합하는 것을 보다 어렵게 하거나 심지어 불가능하게 만든다.

따라서, 본 발명의 한 중요한 측면에서 SEQ ID NO.1 의 결합 위치 1 에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제기된다.

추가적인 구현예에서, 제기된 항체는 SEQ ID NO.1 의 결합 위치 1 에 결합할 수 있는 내인성 또는 외인성 리간드의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 상기 리간드의 SEQ ID NO.1 의 상기 결합 위치 1 로의 결합을 입체적으로 방해한다.

본 발명의 또 다른 측면에서 SEQ ID NO.1 의 결합 위치 2 에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제기된다.

추가적인 구현예에서, 제기된 항체는 SEQ ID NO.1 의 결합 위치 2 에 결합할 수 있는 내인성 또는 외인성 리간드의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 상기 리간드의 SEQ ID NO.1 의 상기 결합 위치 2 로의 결합을 입체적으로 방해한다.

본 발명의 보다 고도로 바람직한 구현예에서 SEQ ID NO.1 의 결합 위치 3 에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제기된다.

추가적인 구현예에서, 제기된 항체는 SEQ ID NO.1 의 결합 위치 3 에 결합할 수 있는 내인성 또는 외인성 리간드의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 상기 리간드의 SEQ ID NO.1 의 상기 결합 위치 3 으로의 결합을 입체적으로 방해한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에 정의된 바와 같은 항체는 SEQ ID NO.1 의 R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 내지 M363, S305, F306, T398 내지 G400, I303-G309, Q349-A356, Y395 및 T402 를 비제한적으로 포함하는 결합 위치 1 의 근처 또는 상기 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 항체는 SEQ ID NO.1 의 R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 내지 M363, S305, F306 및 T398 내지 G400 을 비제한적으로 포함하는 결합 위치 1 의 근처 또는 상기 위치의 하나 이상의 아미노산 산기에 결합한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 항체는 SEQ ID NO.1 의 R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314 및 F350 내지 M363 을 비제한적으로 포함하는 결합 위치 1 의 근처 또는 상기 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 항체는 SEQ ID NO.1 의 L572, L114, V112, R109 내지 S111, S115 내지 G118, T570, G571, W586, W597, T168-I174, L572, A573 및 S584 내지 F588 을 비제한적으로 포함하는 결합 위치 2 의 근처 또는 상기 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 항체는 SEQ ID NO.1 의 L572, L114, V112, R109 내지 S111, S115 내지 G118, T570, G571, W586 및 W597 을 비제한적으로 포함하는 결합 위치 2 의 근처 또는 상기 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 항체는 SEQ ID NO.1 의 L572, L114 및 V112 를 비제한적으로 포함하는 결합 위치 2 의 근처 또는 상기 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 항체는 SEQ ID NO.1 의 D403, S420, D422, N423, S424, I425, E426, T451, Y466, E470, I498, S499 및 V500 을 비제한적으로 포함하는 결합 위치 3 의 근처 또는 상기 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 항체는 SEQ ID NO.1 의 D403, N423, S424, I425, T451, Y466, I498 및 V500 을 비제한적으로 포함하는 결합 위치 3 의 근처 또는 상기 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 정의된 바와 같은 항체는 SEQ ID NO.1 의 T451, Y466, I498 및 V500 을 비제한적으로 포함하는 결합 위치 3 의 근처 또는 상기 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다.

본 발명의 추가적인 구현예에서 상기 본원에서 기재된 바와 같은 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 인간화 항체, 단일 사슬 항체, 재조합 항체로 이루어지는 군에서 선택된다.

추가적인 측면에서 본 발명은 상기 본원에서 기재된 바와 같은 항체, 및 세포독성제 예컨대 화학요법제, 독소, 또는 방사성 동위원소; 특이적 결합 쌍의 일원, 예컨대 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 항원; 검출가능한 생성물을 만들어낼 수 있는 효소로 이루어지는 군에서 선택되는 접합체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.

도 1: 소르틸린 구조의 개관
A) 터널의 개방면으로부터의 프로펠러 축에서 아래로 조망하는 바와 같은, 2.6 Å 해상도에서의 s소르틸린:NT 의 카툰 일러스트레이션. 개별적 프로펠러 블레이드는 외부 가장자리를 따라 번호 매겨진다. 블레이드 6 에서의 고친화성 NT 결합 위치 (결합 위치 1) 에서의 NT (Pro10-Tyr-Ile-Leu13), 및 블레이드 1 에서의 결합 위치 2 에서의 NT (Leu2-Tyr-Glu-Asn-Lys6) 를 막대로 표시한다. Asn206, Asn450 및 Asn626 에서의 글리코실화의 올리고당 부분을 또한 막대로 표시한다.
B) 수평축을 둘러싼 90°회전에 따른 s소르틸린(a) 의 조망. 프로펠러를 회색으로 표면 표시로서 나타낸다. 블레이드 1 과 10 으로부터 확장되는 소수성 루프는 짙은 회색이다. 10CC 도메인을 카툰 표시로서 나타낸다.
C) (a) 에서 표시한 s소르틸린:NT 복합체의 표면 표시. 프로펠러의 표면은 옅은 회색이고, 10CC 도메인, NT 의 N 및 C-말단 부분은 짙은 회색이고, 소수성 루프는 검은색이다. 적도면에서의 점선을 따른 터널의 면적이 표시된다. 회색선은 d 에서 표시한 횡단면의 위치를 나타낸다.
D) NT 를 갖는 프로펠러의 횡단면을 막대로 표시한다. 동일한 색 도식을 (c) 에서와 같이 사용한다. 상기 조망은 (b) 에서 사용된 조망에 대해 수직축을 둘러싸고 180°회전된 것이다.
점선은 적도면에서의 최대 면적을 나타낸다.
E) 서열 보존 (도 5) 에 의해 채색된 s소르틸린의 표면 표시. 불변 위치를 짙은 회색으로 채색하였다. 글리코실화 뿐 아니라 15 배 과량의 NT 를 갖는 2.6 Å 소르틸린:NT 구조에서 발견된 모든 세 가지 펩티드 절편을 막대로서 표시한다. 좌측: s소르틸린의 평면도 (top view), 즉 C 에서와 동일한 동향. 우측: s소르틸린의 저면도 (bottom view), 즉 평면도의 수직축을 둘러싼 180°회전.
도 2: 리간드 결합의 세부 사항
A) 2.6 Å 구조에서 나타낸 바와 같은 s소르틸린에 대한 NT 의 N-말단 부분의 결합. 원자 유형을 회색의 음영으로 표시한다: 탄소 (s소르틸린) - 옅은 회색, 질소 - 짙은 회색, 산소 - 더 짙은 회색, 및 탄소 (NT) - 가장 짙은 회색. 뉴로텐신 잔기는 와이어 메시로서 나타낸 최종 2.6 Å 2Fo-Fc 전자 밀도 맵의 1 σ 수준으로 덮여진다. 점선은 수소 결합의 위치를 나타낸다.
B) 2.0 Å 구조에서 나타낸 바와 같은 소르틸린에 대한 NT 의 C-말단 부분의 결합. 결합 포켓을 형성하는 s소르틸린의 잔기 및 잔기 Pro10-Tyr-Ile-Leu13 을 막대로 표시한다. 색 코딩은 (a) 에서와 같다. 1 σ 에서 윤곽을 그린 전자 밀도 맵은 2.0 Å 구조의 최종 3Fo-2Fc 맵이다.
C) 프로펠러 결합 위치 2 에서의 프로펩티드의 전자 밀도. 패널 (a) 에서와 같은 s소르틸린의 원자의 동일한 세트를 s소르틸린:프로펩티드의 블레이드 1 의 가닥 1 상에 겹쳐 놓는다.
색 코딩은 패널 (a) 에서와 같다. 최종 3.2 Å 3Fc-2Fo 전자 밀도의 1 σ 표면은 결합된 프로펩티드의 위치를 나타내도록 표시된다.
D) 프로펠러 고친화성 NT 결합 위치에서의 프로펩티드의 전자 밀도. 패널 (b) 에서와 같은 s소르틸린의 원자의 동일한 세트를 s소르틸린:프로펩티드의 블레이드 6 의 가닥 1 상에 겹쳐 놓는다. 최종 3.2 Å 3Fc-2Fo 전자 밀도의 1 σ 표면은 결합된 프로펩티드의 위치를 나타내도록 표시된다.
E) 터널을 가로지르는 프로펩티드 결합. s소르틸린:프로펩티드 구조의 횡단면은 도 1d 에서와 같다. 최종 3.2 Å 3Fc-2Fo 전자 밀도의 1 σ 표면을 표시한다.
도 3: s 소르틸린 결합에 대한 NT 및 유래 펩티드의 효과
뉴로텐신 유래 펩티드의 부재 또는 존재 하에서의 고정된 s소르틸린에 결합하는 리간드의 표면 플라스몬 공명 분석. 매겨진 번호는 개별적 펩티드 내에 포함되는 NT 의 아미노산 (1-13) 을 나타낸다. C-말단 트리펩티드 11-YIL-13 (NT 11-13) 의 존재 하에서의 결합을 나타낸다. A-B) GST 표지된 소르틸린 프로펩티드 (GST-Sort-pro) 의 결합; C) NGF 의 GST-표지된 프로펩티드의 결합; D) RAP 의 결합.
도 4: s 소르틸린 및 s 소르틸린 변이체 수용체의 분비 및 리간드 결합
A) CHO 세포에서의 ³⁵S-생체표지된 s소르틸린의 펄스 추적. 표시된 아미노산 치환을 갖는 수용체, wt 또는 돌연변이체 수용체를 표시된 시간에서 세포 용해물 또는 배지로부터 면역침전시켰다.
B) BDNF 및 소르틸린-프로펩티드의, wt s소르틸린 및 정제된 S283E 돌연변이체에 대한 결합. 수용체는 유사한 농도 (0.06 pM/mm²) 에서 고정되었고, 결합은 SPR 로 분석되었다. 정제된 돌연변이체 수용체의 은 염색을 삽입물로서 나타낸다. C) 여분의 뉴로텐신의 부재 또는 존재 하에서의 NGF-프로도메인의 wt s소르틸린 (상부 패널) 및 S316E 돌연변이체 (하부 패널) 에 대한 결합.
도 5: 소르틸린 서열의 서열 정렬. 매겨진 번호는 프리-프로-소르틸린 번호 (SEQ ID NO.1 에 따른) 에 상응한다. 하기와 같은 NCBI 에서의 중복되지 않는 단백질 데이터베이스에서의 BLAST 검색에 의해 서열을 확인하고:
Bos_taurus: ref|XP_588956.3|;
Canis_familiaris: ref|XP_537041.2|;
Rattus_norvegicus: ref|XP_001076150.1|;
Mus_musculus: ref|NP_064356.2|;
Ornithorhynchus_anatinus: ref|XP_001505243.1;
Tetraodon_nigroviridis: emb|CAG07500.1|;
Danio_rerio: ref|NP_998395.1|,
이후, ClustalW 를 사용하여 s소르틸린 구성물에 대해 정렬하였다. 오직 s소르틸린 구성물에 상응하는 부위만을 His-tag 생략된 C-말단으로 표시한다. Jalview (34) 및 각각의 위치에서의 보존에 따른 회색 음영을 사용하여 정렬 조망을 생성하였다. 서열 아래의 두꺼운 바 (bar) 는 DSSP 에 의해 지정된 바와 같은 2 차 구조의 위치를 표시한다 (34). 상기 선 아래의 블레이드 1 ~ 10 으로 표지된 바는 프로펠러의 개별적 블레이드의 위치를 나타내거나, 10CC 의 2 개 도메인의 면적을 표시한다. 디술피드 연결을, 2 개 시스테인을 연결하거나 디술피드 파트너의 잔기 수로 표지된 얇은 선으로 서열 위에 표시한다. 청색 바는 2 개 소수성 루프의 위치를 나타낸다. 별표는 글리코실화된 아스파라긴 잔기를 나타낸다.
대문자 N 은 뉴로텐신의 C-말단 부분의 결합에 포함되는 잔기를 나타내는 반면, 소문자 n 은 뉴로텐신의 N-말단 부분의 결합에 포함되는 잔기를 나타낸다.
도 6: 발현 및 결정화의 개관
도 7: 2 Å 해상도로의 X-선 회절 패턴
도 8: 세분화 통계 및 라마찬드란 플롯
도 9: 10-블레이드 소르틸린 β-프로펠러가 고유하고, 신규하며 비예측적이라는 것을 입증하는 β-프로펠러 구조의 통계.
도 10: 야생형 (WT) 과 비교하여, PYIL 리간드의 소르틸린 돌연변이체 구조 S316E 및 R325A 에 대한 결합의 개관.
도 11: 소르틸린 프로펩티드의 절편을 포함하는 소르틸린 결정의 최적화.
도 12: 도면은, 뉴로텐신과 착화된 관강내 소르틸린의 2.0 Å 구조에서 나타내는 바와 같은 소르틸린, 및 Pro-Tyr-Ile-Leu 으로서 나타낸 뉴로텐신의 C-말단으로부터의 수소 결합 배열을 나타낸다. 오직 뉴로텐신 류신의 수소 결합만이 불변적인 반면, 뉴로텐신 티로신에 대한 이소류신-353 및 리신-260 의 수소 결합은 가변적이다.
소르틸린과 뉴로텐신 사이의 소수성 상호 작용을 설명하기 위해, 뉴로텐신 탄소 원자의 4.2 Å 내에 탄소 원자를 갖는 소르틸린의 잔기를 이의 상호 작용 파트너 다음에 열거하였다.
도 13: 뉴로텐신 (NT) 의 C-말단과 결합하는 결합 위치 1 의 특이적 상호 작용의 맵핑.
도 14: 인공적 펩티드 NT69L (SEQ ID NO.12) 과 결합하는 결합 위치 1 의 특이적 상호 작용의 맵핑.
도 15: 소르틸린의 2 개 결합 위치에서의 밀도의 개관. 신경 성장 인자의 프로-도메인에 대한 신규한 결합 위치는 위치 3 이다.
도 16: 2.6 Å 에서 나타낸 위치 3 에서의 Fo-Fc 밀도. 결합에 포함되는 소르틸린의 잔기를 막대로서 나타내고 아미노산 유형 및 잔기 수로 표지하였다. 신경 성장 인자의 프로도메인의 펩티드 골격을 전자 밀도로 덮어 표시한다.
도 17: NGF-프로도메인의 절편과의 복합체에서의 s소르틸린의 원자 좌표. 이러한 pdb 파일의 최초 구축된 소르틸린 아미노산 잔기의 번호는, 본 출원의 출원 일자의 것과 같은 Expasy 데이터베이스 엔트리 Q99523 에 따라 번호 매겨진 SEQ ID NO:1 의 C86 에 상응하는 C9 이다.
도 18: 결합 위치 1 의 점유를 야기하는 몰 비율 1:1.5 로 제공된 뉴로텐신과의 복합체에서의 s소르틸린의, 고해상도 (2 Å) 에서의 원자 좌표. 이러한 pdb 파일의 최초 구축된 소르틸린 아미노산 잔기의 번호는, 본 출원의 출원 일자의 것과 같은 Expasy 데이터베이스 엔트리 Q99523 에 따라 번호 매겨진 SEQ ID NO:1 의 G87 에 상응하는 G10 이다.
도 19: 결합 위치 1 (고친화성 위치) 및 결합 위치 2 (저친화성 위치) 모두에서의 점유를 야기하는 몰 비율 1:15 로 제공된 뉴로텐신과의 복합체에서의 s소르틸린의 원자 좌표. 이러한 pdb 파일의 최초 구축된 소르틸린 아미노산 잔기의 번호는, 본 출원의 출원 일자의 것과 같은 Expasy 데이터베이스 엔트리 Q99523 에 따라 번호 매겨진 SEQ ID NO:1 의 G54 에 상응하는 G54 이다.
도 20: 소르틸린의 고유 프로펩티드와의 복합체에서의 결정화된 s소르틸린의 원자 좌표. 프로펩티드는 상기 모델에서 생략된다. 이러한 pdb 파일의 최초 구축된 소르틸린 아미노산 잔기의 번호는, 본 출원의 출원 일자의 것과 같은 Expasy 데이터베이스 엔트리 Q99523 에 따라 번호 매겨진 SEQ ID NO:1 의 D83 에 상응하는 D6 이다.
도 21: 전체 프로펩티드를 포함하도록 합성된 NGF 프로펩티드의 6 개 이코사펩티드의 개관.
도 22: 고정된 s소르틸린에 대한 NGF 프로펩티드 및 이코사펩티드의 결합 친화성의 표면 플라스몬 공명 분석.
도 23: 표면 표시로서 나타낸 s소르틸린-펩티드4 복합체의 개관. Vsp10p-D 의 표면은 옅은 회색이고, 10CC 도메인은 회색이고, NGFpro 로부터의 펩티드4 는 검은색이고, 글리코실화는 원자 유형에 의해 채색된 '공-막대' 표시를 사용하여 나타낸다.
도 24: NGF 프로도메인의 결합 (위치 3). A) NGFpro 로부터의 펩티드-4 를 원자 유형에 의해 채색된 '공-막대' 모델로서 나타낸다. 펩티드 없이 계산되고 2.6 σ 에서 윤곽이 그려진 Fo-Fc 전자 밀도 맵을 펩티드 상에 겹쳐 놓는다. 표면 표시를 사용하여 s소르틸린을 나타낸다. B) 결합된 펩티드4를 헥사-알라닌 절편으로서 모델링하고, s소르틸린의 상호 작용하는 잔기와 함께 '공-막대' 모델로서 나타낸다.
도 25: NGF 프로도메인의 결합 (위치 1/NTS-위치). A) NGFpro 로부터의 펩티드-4 를 원자 유형에 의해 채색된 '공-막대' 모델로서 나타낸다. 나타낸 전자 밀도 맵을 도 24 에서 표시한 바와 같이 계산하고, 펩티드 상에 겹쳐 놓았다. 표면 표시를 사용하여 s소르틸린을 나타낸다. B) 결합된 펩티드4 를 테트라-알라닌 절편으로서 모델링하고, s소르틸린의 상호 작용하는 잔기와 함께 나타낸다.
도 26: Tyr-Ile-Leu (YIL) 로 C-말단 표지된 GST 와 펩티드와의 경쟁. 고정된 s소르틸린에 대한 결합을 표면 플라스몬 공명으로 측정하였다. 측정된 반응 단위와의 100% 상응이 경쟁 펩티드의 부재 하에 100 nM GST-YIL 에 대해 수득되었다. EC50 값은 GST-YIL 결합이 50% 로 감소되는 펩티드의 농도이다. 서열을 펩티드, 및 비-자연적 아미노산을 포함하는 펩티드에 대해 나타내고, 구조를 또한 표시하였다.
서열의 개관
SEQ ID NO.1: 소르틸린
SEQ ID NO.2: SorLA
SEQ ID NO.3: SorCS1
SEQ ID NO.4: SorCS2
SEQ ID NO.5: SorCS3
SEQ ID NO.6: 프리-프로-NGF
SEQ ID NO.7: 프리-프로-BDNF
SEQ ID NO.8: 뉴로트로핀-3
SEQ ID NO.9: 뉴로트로핀-4/5
SEQ ID NO.10: 뉴로텐신 (1-13)
SEQ ID NO.11: PYIL (뉴로텐신의 C-말단)

실시예

실시예 1: 소르틸린의 발현 및 정제

전체 관강내 도메인 (아미노산 1 내지 758) 을 포함하지만 소르틸린의 세포질내 꼬리 또는 트랜스멤브레인 조각은 포함하지 않는, His6 에 C-말단 융합된 가용성 소르틸린 (s소르틸린) 을 이전에 기재한 바와 같이 CHO-K1 세포에서 안정적으로 발현시켰다 (5). CHO-트랜스펙션체를 500 ㎤ NunclonTM 트리플 플라스크 내에서 무혈청 HyQ-CCM5 CHO 배지 (HyClone, Logan, UT) 에서 배양하였다. 단지 사소하게 변형된 이전에 기재된 절차에 따라 셀레노-메티오닌 (SeMet) 을 혼입하였다 (22). 자연적 및 SeMet 치환된 단백질 모두를 이전에 기재된 바와 같이 RAP 친화성 크로마토그래피로 정제하였다 (1). S316E 및 R325A 소르틸린 돌연변이체를 CHO-세포에서 안정적으로 발현시키고, 이후 푸린 (furin) 프로펩티드 절단 위치에서 돌연변이화된 소르틸린에 대해 이전에 기재한 바와 동일한 방법으로 His₆-택 친화성 크로마토그래피에 의해 배지로부터 정제하였다 (5). 뉴로텐신을 Sigma 에서 구매하고, 잔기 37-61 의 소르틸린 프로펩티드 절편 뿐 아니라 다양한 뉴로텐신 절편을 BIOMOL International L.P. (UK) 에서 구매하였다. 모든 펩티드는 95% 초과로 순수하였다. 발현 및 정제는 GST (5) 및 NGF 프로도메인 (6) 에 융합된 소르틸린 프로펩티드에 대해 이전에 기재된 바 있다. 성숙 BDNF (SEQ ID NO.7, 아미노산 잔기 128 내지 246) 를 R&D Systems, Inc. (USA) 에서 구매하였다.

실시예 2: 표면 플라스몬 공명

표면 플라스몬 공명 (SPR) 측정을 20℃ 에서 유지되는 CM5 센서 칩이 장착된 BIAcore 2000 기기 (Biacore Sweden) 에서 수행하였다. 센서 표면을 지나가는 HBS 완충액 (10 mM HEPES pH 7.4, 3.4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 의 연속 흐름을 5 ㎕/분으로 유지하였다. 센서 칩 흐름 셀 1-3 의 카르복실화된 덱스트란 매트릭스를, 물 중 0.2 M N-에틸-N-(3 디메틸아미노프로필)카르보디이미드 및 0.05 M N-히드록시숙시미드 함유 용액을 주사하여 활성화하였다. 소르틸린 용액 (10 mM 나트륨 아세테이트 pH 4.0 중 5 ㎍/㎖, 320 ㎕) 을 이후 흐름 셀 1 및 2 에 15 ㎕/분의 유속으로 주사하였다. 모든 3 개 흐름 셀에서의 남아 있는 결합 위치를 70 ㎕ 의 1 M 에탄올아민 (pH 8.5) 의 주사 (5 ㎕/분) 로 차단하였다. 고정된 소르틸린으로부터의 표면 플라스몬 공명 신호는 49 및 69 fmol/mm2 와 동등한 4419 및 6166 BIAcore 반응 단위 (RU) 를 생성하였다. 5 ㎕/분의 유속으로 모든 흐름 셀을 통해 50 ㎕ 의 분취액을 0.1-8 μM 의 농도로 주사하여, 샘플의 스크리닝을 수행하였다. 다르게 언급하지 않는 한, 샘플을 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.5 mM CaCl2, 1 mM EGTA, 0.005% 계면활성제 P20 에 용해하였다. 샘플 완충액을 또한 실행 완충액 (running buffer) 으로 사용하였다. BIAcore 반응을 상대 반응 단위 (RU), 즉, 고정된 단백질 흐름 셀과 상응하는 대조군 흐름 셀 (단백질이 없이 활성화되고 차단됨) 사이의 반응에 있어서의 차이로 표현하였다. 20 ㎕ 의 10 mM 글리신/HCl pH 4.0, 500 mM NaCl, 20 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20 을 주사하여, 분석의 각각의 사이클 후 센서 칩의 재생을 수행하였다. 무칼슘 조건을 위해, 20 mM EDTA 함유 HBS 를 샘플 뿐 아니라 실행 완충액으로서 사용하였다. BIAevaluation 3.0 소프트웨어를 사용하여 운동 매개변수를 결정하였다. 돌연변이 및 wt s소르틸린에 대해 측정된 반응의 비교를 위해, 이들을 동일한 BIAcore 칩에서 상이한 흐름 셀 내에 고정하고, 유사한 농도의 (GST)Sort-pro, BDNF, NGF-pro 및 NT 가 되게 하였다.

저해 효과의 측정

트리펩티드 Tyr-Ile-Leu (YIL) 에 의한 (GST)Sort-pro, BDNF, NGF-pro 및 NT 결합의 저해를, 증가하는 농도의 YIL 을 각각의 샘플에 첨가하여 측정하였다. 이후 저해 효과의 측정은 90% 감소된 결합이 관찰되는 YIL 의 농도로서 주어졌다.

실시예 3: 형광 측정

1 nm 씩 증가시켜 280 nm 내지 500 nm 에서의 측정으로, 20℃ 에서 SFM-25, Kontron Instruments 에서 모든 고유 형광 측정을 수행하였다. 모두 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl 완충액에서, 5μM NT 와 함께 0.55μM s소르틸린, 5μM NT, 및 0.55μM s소르틸린에서 데이터를 수집하였다. NT 를 0.1 M 저장 용액에서 0.55 μM s소르틸린 용액으로 첨가 (무시해도 좋을 만큼 희석됨) 하여 NT 를 갖는 s소르틸린을 제조하였다.

실시예 4: 대사적 표지

이전에 상세히 기재된 바와 같이 배지 1 ㎖ 당 200 mCi 의 L-[³⁵S]시스테인 및 L-[³⁵S]메티오닌을 사용하여, 10 mg/㎖ BFA 의 존재 하에 대사적 표지를 수행하였다 (5). BFA 의 부재 하에 추적을 수행하고, 주어진 시간 지점에서 수용체를 배지 및 상응하는 용해된 세포로부터 면역침전시켰다. 침전된 단백질을 환원 PAGE 로 분석하고, 디페닐옥사졸-플루오로그래피 겔을 -70℃ 에서 노출시켰다.

실시예 5: 결정화, 동결방지 및 HA 유도체화

정제된 단백질을 50 mM Tris-HCl pH 7.9 및 150 mM NaCl 을 함유하는 완충액으로 투석하고, Centricon (Millipore Corp.) 또는 Vivaspin (Sartorius Ltd.) 농축기를 사용하여 브래드포드 (Bradford) 검정에 의해 측정된 바와 같이 4.5-5.5 mg/㎖ 로 농축하였다. 뉴로텐신 (s소르틸린:NT 비율 1:1.5 또는 1:15) 또는 프로펩티드 (s소르틸린:프로펩티드 비율 1:4) 와의 혼합을, 결정화 실험이 준비되기 전에 수행하였다. 결정화 점적을, 2 ㎕ 단백질 용액, 및 말론산에 의해 pH 6-7.5 로 조정된, 18-21% w/v PEG 6000, Tris-Hepes pH 7.2-7.8 (40-93 mM Tris 및 100 mM Hepes) 또는 100 mM Tris-HCl pH 7.9, 3-6% 글리세롤, 및 600 mM NaCl 또는 250-400 mM C₃H₂Na₂O₄ (나트륨 말로네이트) 를 함유하는 저장소 용액 2 ㎕ 를 사용하여 20℃ 에서 준비하였다. 3.2 Å 로 회절하는 셀레노-메티오닌 (Se-Met) 표지 s소르틸린:NT 결정을 동일한 조건에서 수득하였다. 데이터 수집을 위한 결정을 탈수하고, 저장소의 글리세롤 농도를 12-15% 로 증가시켜 동결방지하였다. 밤새 평형화한 후 결정을 액체 질소에서 순간 동결하였다. 결정은 약 3.3-3.0 Å 로 정상적으로 회절되었으나, 저장소 염으로서 약간 과량의 NT 및 NaCl 로 증대된 결정에 대해서는, 상당히 양호하게 회절되고 (약 2.5-2.0 Å) 단위 셀 매개변수에서의 변화를 나타내는 결정을 드물게 수득하였다 (표 1). Hg 및 Pt 유도체의 제조를 위해, 수은 살리실레이트 및 시스-Pt(NH₃)₂Cl₂ 의 분말을 결정이 형성된 점적에 직접 첨가하였다. Hg 유도체에 대한 수침 시간은 1 개월이었고, Pt 유도체에 대한 수침 시간은 1 일이었다. 물에 용해된 1 mM Ta6Br12 1 ㎕ 를 탈수 결정의 점적에 수침 시간 2 일 동안 첨가하여 Ta 유도체를 제조하였고, 이후 이는 가시적으로 녹색으로 변화하였다. 유도체화된 결정 중 어느 것도 후-수침 (backsoaked) 되지 않았다.

실시예 6: 데이터 수집 및 프로세싱

싱크로트론 MAX-lab (Lund, Sweden), SLS (Zurich, Switzerland) 및 DESY/EMBL (Hamburg, Germany) 에서 데이터 수집을 수행하였고, XDS (23) 를 사용하여 프로세싱하였다 (표 1 참조). Hg, Pt 및 Ta 유도체에 대한 데이터를 각각의 요소의 흡수 끝머리 부근에서 수집하였고, SeMet 표지 결정에 대한 데이터 세트를 형광 스캔에 의해 측정된 바와 같이 Se 피크 파장 (0.97853 Å) 에서 직접 수집하였다. 뉴로텐신 결정과의 복합체에서의 s소르틸린 (sSort:NT) 에 대한 데이터 세트를 과다량의 NT 로 측정하여, 회절 이방성 서버 (Diffraction Anisotropy Server) 를 사용하여 이방성 효과에 대해 보정하였다 (24).

데이터 수집 및 프로세싱 통계

	Se - sSort - NT (약간 과량, 1:1.5)	sSort - NT (약간 과량, 1:1.5)	sSort - NT (약간 과량, 1:1.5)	sSort - NT (약간 과량, 1:1.5)	sSort - NT69L
HA 수침		시스-Pt(NH₃)₂Cl₂	수은 살리실레이트	Ta₆Br₁₂	자연적
빔라인	I911-3, MAXlab	I911-5, MAXlab	X12, DESY	PX1, SLS	PX1, SLS
데이터 통계
파장 (Å)	0.97853	0.90718	0.9050	1.2548	1.2970
해상도 한계 (Å)	3.8 (4.1-3.8)	4.0 (4.3-4.0)	6.0 (6.6-6.0)	5.0 (5.3-5.0)	2.8 (2.9-2.8)
공간군	C2	C2	C2	C2	C2
단위-셀 a	162.3 Å	162.7 Å	162.6 Å	162.5 Å	161.3 Å
b	79.8 Å	78.5 Å	75.9 Å	76.8 Å	78.4 Å
c	112.1 Å	111.2 Å	110.7 Å	111.1 Å	112.0 Å
β	126.67°	126.75°	127.75°	127.07°	126.92°
고유 반사	21311	18332	5103	9159	27362
Rsym(I)	5.2 (11.7)	6.8 (15.8)	2.6(5.7)	2.4(3.1)	4.5 (31.1)
완전성	95.2 (96.6)	97.7 (98.2)	96.7 (97.3)	98(99.2)	96.3(93.5)
I/시그마	17.4 (10.5)	16.5 (8.0)	40.3 (22.8)	28.5(23.7)	25.5(6.1)
위상화 (phasing) 통계
위상화에 대한 고해상도 절삭값 (Å)	3.8	4.0	6.0	5.0	3.8
위치	13 Se	4 Pt	2 Hg	1 Ta-다발
위상력 (Phasing Power)
Iso_acen	0.262	0.614	0.415	0.325
Iso_cen	0.276	0.674	0.390	0.315
Ano_acen	1.705	0.621	0.981	0.363
Rcullis
Iso_acen	0.993	0.908	0.980	0.964
Iso_cen	0.946	0.825	0.873	0.898
Ano_acen	0.645	0.640	0.571	0.638
Fom 비중심적 (Acentric)					0.45
중심적 (Centric)					0.18

실시예 7: 위상화 ( Phasing ) 및 모델 구축

발명자들은 ShelxD 를 사용하여 s소르틸린에 존재하는 14 개 메티오닌 중 13 개 Se 위치를 발견하였다 (25). CNS 를 사용하여 계산된 SeMet SAD 위상을 Pt, Hg 및 Ta 유도체에서의 중원자 위치를 확인하는데 사용하였다. 뉴로텐신 유사체에 대해 착화된 s소르틸린의 이질동상 2.8 Å 고유 데이터세트와 함께 모든 4 개 유도체를 SHARP 에서의 MIRAS 위상화에 대한 입력물로서 사용하였다 (27). 부분적 Cα 추적이 RESOLVE 로 만들어져(28), 이를 O 에서의 수동 재구축에 의해 확장하고 보정하였다 (29). 이러한 부분적 모델을, 이후 MOLREP 의 사용에 의해 (30) 약간 과량의 NT 로 증대된 s소르틸린:NT 결정에서 수집된 2.0 Å 고유 데이터세트로의 분자적 대체에 사용하였다. CNS 에서의 세분화 사이클 및 O 에서의 수동 재구축에 의해 완전한 모델을 생성하였다. 과다량의 NT 로 증대된 sSort:NT 결정에서 수집된 데이터, 및 sSort:프로펩티드 절편에서 수집된 데이터의 위상화를, MOLREP 에 대한 입력물로서, 2.0 Å 구조에 대한 미완결 모델 (NT 불포함) 을 사용하는 분자적 대체에 의해 수행하였다. 이후, O 에서의 모델 구축 및 CNS 를 사용하는 세분화의 후속적 사이클에 의해 모델을 완성하였다. 최종 세분화를 위해, 발명자들은 2.0 Å sSort:NT 구조에 대해 TLS B-인자 보정을 사용하는 REFMAC (31), 2.6 Å sSort:NT 구조에 대해 TLS B-인자 보정을 사용하는 PHENIX(32) 세분화, 및 3.2 Å sSort:프로펩티드 구조에 대해 CNS 를 이용하였다 (표 2).

데이터 수집, 프로세싱, 모델 구축 및 세분화 통계

	sSort - NT (약간 과량, 1:1.5)	sSort - NT (과다량, 1:15)	sSort -프로펩티드 (절편 4-28, 1:4)
빔라인	PX1, SLS	I911-5, MAX-lab	I911-5, MAX-lab
데이터 통계
파장 (Å)	0.95008	0.90736	0.90736
해상도 한계 (Å)	2.0 (2.1-2.0)	2.64(2.74-2.64)	3.15 (3.3-3.15)
공간군	C2	C2	C2
단위-셀 a	145.8 Å	162.1 Å	162.1 Å
b	74.5 Å	78.7 Å	78.1 Å
c	108.3 Å	111.1 Å	111.7 Å
β	131.87°	126.61°	127.20°
Rsym(I)	7.3(44.0)	4.9(59.9)	7.4(50.4)
완전성	96.9 (98.8)	98.0(98.0)	99.0 (99.5)
I/시그마	11.59 (4.32)	19.9(2.9)	14.53 (2.59)
세분화 통계
반사 (작업/시험)	53737/2862	30813/953	18418/938
R-인자	0.204	0.169	0.230
Rfree	0.229	0.225	0.295
모델에서의 원자 수
s소르틸린 및 NT	5.213	5293	5.194
탄수화물	67	94	122
물	307	213	0
PEG 및 글리세롤	16	13	0
평균 B-인자 (Å)
s소르틸린	30.4	70.5	99.7
결합 위치 1 에서의 NT	57.1	68.3	...
결합 위치 2 에서의 NT	...	103.2	...
인공 결합 위치에서의 NT	...	126.7	...
글리코실화	49.2	98.0	138.0
용매 (물, PEG, 글리세롤)	46.9	60.7	...
기하학
Rmsd 결합-길이	0.021 Å	0.008 Å	0.0076 Å
Rmsd 결합 각	1.832°	1.204°	1.389°
Phi-Psi 분포
최고 선호	87.0%	81.9%	70.7 %
추가적으로 허용	12.0%	16.5 %	27.0 %
관대히 허용	0.9%	1.2%	2.1 %
불허	0.2%	0.3 %	0.2 %

실시예 8: 프로-뉴로트로핀 결합 위치 (결합 위치 3) 의 확인

s 소르틸린 정제

SEQ ID NO.1 (아미노산 78 내지 755) 을 포함하는, His₆ 에 C-말단 융합된 가용성 소르틸린 (s소르틸린) 을 이전에 기재된 바와 같이 CHO-K1 세포에서 안정적으로 발현시켰다 (5). CHO-트랜스펙션체를 500 ㎤ NunclonTM 트리플 플라스크 내에서 무혈청 HyQ-CCM5 CHO 배지 (HyClone, Logan, UT) 에서 배양하였다. 이전에 기재된 바와 같이 CNBr-활성화된 세파로오스 비즈 (GE health care) 상에 고정된 수용체 결합 단백질로의 친화성 크로마토그래피에 의해 s소르틸린을 정제하였다 (1).

NGFpro 정제

BL21 (DE3) star RIPL 세포를, N-말단 히스티딘 택 (His₆), 담배 식각 바이러스 (tobacco etch virus) 프로테아제 (TEV) 위치, 및 신경 성장 인자의 프로펩티드 (NGFpro) 의 개방 판독 프레임을 포함하는 pET-30 Ek/LIC 벡터로 형질전환하였다. 유도 전, 1 mM IPTG 로 밤새 (O/N) 20℃ 에서 OD_600nm 0.8 로 세포를 성장시켰다. 세포를 다음과 같은 용해 완충액에 재현탁하였다: 50 mM TrisHCl pH=8.0, 1 M KCl, 10 mM 이미다졸, 5 mM BME, 5 mM PMSF, 2 mg/㎖ DNase I 및 1 개의 프로테아제 저해제 정제 (Complete, Roche). 세포를 고압 균질화기 (HPH) 상에서 분쇄하고, 용해물을 184.000xg 에서 원심분리하여 투명하게 하였다. Ni²⁺-컬럼 (HisTrap 1 ㎖ FF, GE) 을 완충액 A (50 mM TrisHCl pH=8.0, 200 mM KCl 및 5 mM BME) 로 평형화시켰다. 투명해진 용해물을 로딩하고, NGFpro 를 완충액 B (50 mM TrisHCl pH=8.0, 200 mM KCl, 500 mM 이미다졸 및 5 mM BME) 와 함께 40 컬럼 부피 (CV) 이미다졸 (10 mM 내지 500 mM) 구배로 용리하였다. 첫 번째 Ni²⁺컬럼으로부터의 NGFpro 함유 분획을 모으고, 완충액을 TEV 혼화가능 완충액 C (50 mM TrisHCl pH=8.0, 200 mM KCl, 5 mM BME, 0.5 mM EDTA) 로 교환하였다. TEV 소화를 RT O/N 에서 수행하였다. His₆ 택을 Ni² ⁺컬럼 (HisTrap 1 ㎖ FF, GE) 에서 40 컬럼 부피 (CV) 이미다졸 (0 mM 내지 250 mM) 구배로 제거하였다. 두 번째 Ni² ⁺컬럼으로부터의 NGFpro 를 10 kDa 절삭 멤브레인을 갖는 Vivaspin 6 컬럼을 사용하여 농축하였다. 완충액 D (50 mM TrisHCl pH=7.6 및 150 mM NaCl) 에서, 0.4 ㎖/분의 유속으로 Superdex 75 10/300 GL 컬럼 (GE) 에서 분취형 겔여과를 수행하였다.

NGF 프로펩티드의 펩티드 제조

도 21 에서 입증한 바와 같이, 신경 성장 인자의 프로펩티드의 이코사펩티드 (20 aa) 를 Caslo Laboratory Aps (www.caslo.com) 에서 고체상 화학에 의해 합성하였다. 펩티드를 C-말단에서 아미드화하고 전체 NGFpro 를 3 aa 오버랩으로 커버하였다. 펩티드 (95% 초과의 순도) 를 완충액 E (10 mM HEPES pH=7.0 및 50 mM NaCl) 에 용해하였다.

표면 플라스몬 공명 분석

모든 측정을 20℃ 에서 유지된 BIAcore 3000 기기 (Biacore Sweden) 에서 수행하였다. 완충액 F (10 mM HEPES pH=7.4, 150 mM (NH₄)₂SO₄, 1.5 mM CaCl₂, 1.5 mM EGTA 및 0.005% Tween-20) 의 연속 흐름이 5 ㎕/분으로 CM5 칩 센서 표면을 지나가게 하였다. 고정된 s소르틸린에 대한 펩티드 및 NGFpro 의 친화성을 측정하였다. NGFpro 에 대한 해리 상수 (K_d) 는 약 10 nM 이었고, 펩티드-4 에 대한 해리 상수 (K_d) 는 약 5 μM 이었다. s소르틸린에 결합하기 위해 NGFpro 와 경쟁하는 펩티드의 능력을 또한 시험하였다. 결과를 도 22 에 나타내었다.

리간드를 갖는 s 소르틸린의 결정화

정제된 s소르틸린을 완충액 G (50 mM Tris-HCl pH 8.0 및 150 mM NaCl) 로 투석하고, Vivaspin (Sartorius Ltd.) 농축기에서 브래드포드 검정에서 측정된 바와 같이 4.5-5.5 mg/㎖ 로 농축하였다. s소르틸린 및 NGFpro 를 몰 비율 1:2 로 혼합하고, 얼음에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 복합체를 싯팅 드롭 (sitting drop) 을 사용하는 증기 확산 실험에서 결정화하였다. 결정화 점적을 1 ㎕ 복합체 용액, 및 20-28% 폴리 에틸렌 글리콜 (PEG) 5000 모노메틸 에테르, 100 mM TrisHCl pH = 7.5 및 200 mM Li₂SO₄ 를 포함하는 저장소 용액 1 ㎕ 를 사용하여 20℃ 에서 준비하였다. s소르틸린 및 펩티드-4 를 1:5 내지 1:28 범위의 다양한 몰 비율로 혼합하고 얼음에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 복합체를 싯팅 드롭을 사용하는 증기 확산 실험에서 결정화하였다.

결정화 점적을 1 ㎕ 복합체 용액, 및 20-28% PEG 6000, 100 mM TrisHCl pH = 7.5 및 200-600 mM Li₂SO₄ 를 포함하는 저장소 용액 1 ㎕ 를 사용하여 20℃ 에서 준비하였다.

액체 질소에서 순간 동결되기 전에, 수크로오스 또는 글리세롤을 저장소에 첨가함으로써 (20% v/v 이하) 결정을 탈수하였다.

데이터 수집 및 프로세싱

s소르틸린:NGFpro 복합체의 X-선 회절 데이터를 ESRF Grenoble (France) 에서 스테이션 ID29 에서 수집하고, s소르틸린:펩티드-4 복합체 결정의 회절 데이터를 Max-lab Lund (Sweden) 에서 스테이션 I911-3 에서 싱크로트론 방사를 사용하여 동결 조건에서 수집하였다. 데이터를 지표화하고 XDS 로 프로세싱하였다 (23). NGFpro 또는 펩티드-4 와의 복합체에서의 s소르틸린의 결정은 비대칭 단위에서 한 s소르틸린 분자를 갖는 정방 공간군 P4₁2₁2 에 속하는 이질동상형이었다 (표 3). 위상기를 사용하여 분자 대체에 의해 구조를 측정하였다 (36). 그의 모든 리간드의 스트리핑된 s소르틸린 및 뉴로텐신의 구조를 위상화를 위한 초기 모델로서 사용하였다. 생성된 모델을 Phenix 에서의 모델 바이어스 및 세분화를 감소시키기 위해 어닐링 (annealing) 시뮬레이션하였다 (32). 차분 푸리에 맵 (Difference fourier map) F_obs-F_calc 를 사용하여 NGFpro 의 결합된 부분 뿐 아니라 s소르틸린의 글리코실화 및 루프의 배좌 변화를 위치시켰다.

	s 소르틸린 : NGFpro (1:2)	s 소르틸린 :펩티드-4 (1:17)
빔라인	ID29, ESRF	Max-lab, I911-2
데이터 통계
파장 (Å)	1.07253	1.0737
해상도 (Å)	30.0-4.1 (4.3-4.1)	25.0-3.2 (3.4-3.2)
공간군	P4₁2₁2	P4₁2₁2
단위-셀 (Å) a, b	159.97	159.37
c	106.55	108.72
R_merge (I)	17.9 (73.8)	9.4 (69.9)
완전성	99.5 (99.6)	99.4 (99.9)
I/시그마	9.4 (2.2)	17.35 (2.29)

실시예 9: 도킹 및 인 실리코 ( in silico ) 스크리닝

2 개의 격자를, H-결합 최적화 (Optimize H-bonds) 의 광역 샘플링 (Exhaustive Sampling) 으로, Maestro version 8.0 을 사용하여, 1 개의 격자는 0.3 Å 내로 구조를 최소화하고 다른 1 개는 각각 활용가능한, 소르틸린-리간드 복합체의 세분된 구조의 최소화 없이 계산하였다. Ser352 의 -OH 의 수소, 및 Ile353 의 NH 의 수소를 가능한 제약으로서 구체화하였다.

바운딩 박스 (bounding box) 를 표준 값 면적을 갖는 잔기 325, 260 및 352 의 센트로이드로서 정의하였다.

리간드를 Maestro 에서 Tyr-Ile-Leu 로부터 1 개 잔기 치환된 트리펩티드로서 구축하여, 60 개의 자연적 펩티드를 야기하였다. 리간드는, OPLS_2005 역장 및 10000 으로 설정된 최대 반복으로 Macro-Model 에서 에너지 최소화되었다.

XP 스코어링 함수를 사용하여 생성된 모든 격자 내로 도킹을 수행하였다. 리간드로부터의 수소 결합이 초기에 구체화된 2 개 수소 중 1 개로 형성되도록 제약을 적용하였다. 도킹 포즈의 수동 검사 및 G-스코어 모두를 기초로 한 생화학적 분석 및 합성을 위해 펩티드를 선택하였다. 추가적으로, 합성을 위해 선택된 것들과 매우 유사한, 일관적으로 불충분한 스코어링/도킹 리간드를 또한 음성 대조군으로서 합성하였다.

도킹에 사용된 구조로부터의 도킹 격자의 생성

워크플로우 (Workflows) 메뉴로 가서 단백질 제조 마법사 (Protein Preparation Wizard) 를 선택한다.

해당 구조를 들여온 후 (Import), 고정 구조 (Fix Structure) 에서 디폴트 설정으로 두거나, 결합 위치에 구조적 워터스 (structural waters) 가 없는 경우 딜리트 워터스 (Delete Waters) 를 0.1A 로 바꾸고, 셋업을 누른다. 임의의 구조적 워터스가 제거되지 않았는지 워크스페이스를 확인한다. 임의의 비-구조적 워터스를 수동으로 제거한다.

다음으로, 광역 샘플링에 대한 라디오 버튼을 켜고 H-결합 최적화 (Optimize H-bonds) 를 클릭한다.

결합 포켓에 리간드를 갖지 않는 경우에는, 이후 최소화... (Minimize...) 버튼을 무시한다. 결합 포켓에 리간드를 갖는 경우, 2 개의 격자 (디폴트 설정으로 최소화... 를 실행하는 1 개와, 최소화하지 않거나 수소만을 최소화하는 다른 1 개) 를 만들어야 한다.

어플리케이션 (Applications) 메뉴로 가서 이동 (Glide) 을 선택한 후, 수용체 격자 생성 (Receptor Grid Generation) 을 선택한다.

결합 포켓에 리간드가 있는 경우, 이는 격자 생성에서 제거되어야 하며, 이는 수용체 탭이 활성인 동안 워크스페이스에서 이를 클릭하여 수행된다. 이미 황색이 아니라면, "리간드 확인 선택 (Pick to identify ligand)" 을 클릭한다. 바운딩 박스에서 리간드 세트를 선택하고 이제 격자를 생성할 수 있으나, 도킹하기를 원하는 리간드가 원래의 것보다 많이 큰 경우 탭 위치 (tab Site) 로 가서 "길이로의 리간드 도킹 <= (Dock ligands with length <=)" 을 클릭하고 슬라이더를 조정한다. 원래 구조에 리간드가 없는 경우, "선택된 잔기의 센트로이드 (Centroid of selected residues)" 를 클릭하고 워크스페이스에서 결합 위치를 둘러싼 잔기를 클릭해야한다.

소르틸린을 Arg248 (/325/292) 위치에서의 펩티드로 실행하는 경우, 제약 탭 (Constraints tab) 으로 가서 Ser275 (/352/319) 의 히드록실의 수소, 및 Ile276 (/353/320) 의 극성 수소를 선택한다.

이제 시작 (Start) 을 클릭한다.

리간드의 생성 및 에너지 최소화

구축 패널 (Build Panel) 버튼을 클릭하여 구축 패널을 연다.

프로젝트 테이블의 모든 엔트리를 해제한다. 블랭크 워크스페이스에서, 구축 패널을 사용하여 리간드를 구축한다. 올바른 전하를 갖는지 확인하고 (LigPrep 이 올바른 전하를 지정하고 호변이성체에 대한 추가적 리간드 및 다전하 상태를 생성할 뿐 아니라 에너지를 최소화할 것이다), 수소 첨가 (Add Hydrogens) 를 더블 클릭한다. 워크스페이스로부터 엔트리 생성 (Generate Entry From Workspace) 버튼을 누르고 리간드의 명칭을 정한다.

다음 리간드가 첫 번째 것과 유사하다면, 프로젝트 테이블로 가서 사본 (duplicate) 을 만든 후 이의 명칭을 다시 정한다. 첫 번째 리간드를 구축한 바와 같이 새 엔트리를 편집한다. 매우 다르다면, 프로젝트 테이블에 있는 모든 것을 단순히 해제하고 첫 번째에 대해 한 바와 같이 실행한다. 리간드의 SMILES 를 갖는 경우, 이를 OpenBabel 로 mol2 포맷으로 전환하고 이를 프로젝트 테이블로 가져오는 (import) 것이 더 빨라진다. .pdbs 는 결합 순서를 인지하기 위해 Maestro 에 대해 특수화된 수소를 가져야 하며, .sdfs 는 키랄성 정보를 포함하지 않는다.

에너지 최소화에 대한 2 가지 옵션이 존재한다: LigPrep 또는 MacroModel.

a) 어플리케이션 메뉴로 가서 MacroModel 을 선택한 후, 다중 최소화 (Multiple Minimization) 를 선택한다.

프로젝트 테이블에서 모든 리간드를 선택하고 드롭-다운 메뉴를 프로젝트 테이블 (Project Table) (엔트리 선택된) 로 설정한다. 포텐셜 (Potential) 탭에서 역장 (Force field): OPLS_2005 (디폴트여야 함) 를 선택한다. 미니 (Mini) 하에서 방법 (Method): PRCG (디폴트) 및 최대 반복: 10000 을 선택한다. 파일에 리간드를 저장했으며 이를 그로부터 직접 사용하기를 원하는 경우, 멀트 (Mult) 탭 하의 파일 (file) 을 특수화하고 시작한다.

b) 어플리케이션 메뉴로 가서 LigPrep 를 선택한다.

프로젝트 테이블에서 모든 리간드를 선택하거나 모든 리간드를 갖는 파일을 선택하고 이에 따라 드롭-다운 메뉴를 설정한다. 표적 pH 를 7.4 및 +/- 2 미만으로 설정하기를 원할 수 있다. 키랄성을 유지하고 시작한다. 최소화 후 리간드가 올바른지를 확인하고, 특히 키랄 중심이 에난티오머 모두에 존재할 것인지 (원래 리간드에서 명료하게 정의되지 않은 경우) 를 검사하는 것을 기억한다. 히스티딘의 모든 상태를 자동으로 생성하기 때문에, LigPrep 이 MacroModel 에 대해 바람직하다.

도킹

어플리케이션 메뉴로 가서 이동 (Glide) 을 선택한 후, 리간드 도킹 (Ligand Docking) 을 선택한다.

수용체 격자 (Receptop grid) 파일을 선택한다. 정확도 (Precision) 를 XP 로 설정한다. 유연성있게 도킹하고 고리 뒤집기 (ring-flip) 가 일어나도록 한다. 고급 설정 (advanced settings) 에서 접합체 단계의 최대 수를 5000 으로 설정한다. 리간드 탭으로 가서 에너지 최소화 단계에서 생성된 파일을 선택하거나, 단순히 프로젝트 테이블에서 이를 선택하고 선택된 엔트리를 작동시킨다. 출력 (Output) 탭에서 리간드 당 최대 5 포즈 적음 (Write out at most 5 poses per ligand) 을 설정한다. 매우 많은 리간드를 갖는 경우, 도킹 실행 당 리간드를 조정한다.

소르틸린을 Arg248 (/325/292) 위치에서의 펩티드로 실행하는 경우, 제약 (Constraints) 탭으로 가서 그룹 1 (Group 1) 에서 2 개의 h-결합 제약을 추가하고 Must match: At least: 1 로 설정한다. 둘 중 하나에 대한 수소 결합을 포함하는 포즈만이 포함될 것이다. Maestro 보고서가, 자연적인 것으로 보이지 않으며 구조 내에서 관찰된 바 없는 (만약 관찰된 바 없다면 제약 없이 도킹하도록 접근을 보정함) 펩티드를 많이 포함시키기 때문에, 이를 추가한다.

모든 이용가능한 구조에 대해 단계 1 과 3 을 반복한다. 단계 2 로부터의 최소화된 리간드를 재사용한다.

결과의 평가

어플리케이션 메뉴로 가서 이동 (Glide), 이후 포즈뷰어 (Poseviewer) 를 선택한다.

최고 스코어 리간드의 도킹을 수동으로 비교하고, 다른 구조에서의 동일한 리간드를 비교하고, 타당한 것으로 보이는 것들 뿐 아니라 음성 대조군에 대해 스코어/도킹이 불충분한 매우 관련된 화합물을 합성한다.

실시예 10: 저해제의 검증 방법

유기 화학에서의 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행된 확인된 리간드의 합성 후에, 리간드 후보물이 길항적 특성을 갖는지, 즉 상기 리간드가 소르틸린의 결합 위치 1, 2 또는 3 중 임의의 것에 대한 내인성 리간드의 결합을 방지할 수 있는지를 검증하는 것이 중요하다.

실시예 2 에서 기재된 바와 같이 고정된 s소르틸린에 대한 표면 플라스몬 공명 측정에 의해, 제안된 리간드를 저해 효과에 대해 시험하였다.

제안된 리간드를 방사성표지하고 절편 자가조직방사선 (slice autoradiography) 에 사용하였다. 현상된 영상을 방사성표지된 단클론 소르틸린 항체를 이용하는 절편 자가조직방사선과 비교하였다. 단클론 항체와 공존하는 (co-localize) 이들 리간드를, 소르틸린 녹-아웃 (knock-out) 마우스의 절편을 사용하여 절편 자가조직방사선에서 다시 시험하였다.

소르틸린을 만족스럽게 영상으로 만드는 리간드를 마우스에 주사하고 뇌 균질물을 방사능에 대해 시험하거나, 비표지된 리간드를 PET 또는 SPECT 에 적합한 방사성동위원소로 표지하고 마우스 또는 돼지에 주사하고 이들의 뇌를 생체내 영상화하였다.

내인성 안정성 실험을 뇌 균질물에 대해 수행하였다.

화합물을 투과하는 비-혈액-뇌 배리어는 비-CNS 영상화 및 소르틸린에서의 이러한 결합 위치의 저해에 적합하고, BBB 투과 화합물은 소르틸린의 생체내 수준 및 분포를 검사하는 뇌 스캔에 적합하였다.

참고문헌

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Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Leu Pro 35 40 45 Arg Trp Ser Gly Pro Ile Gly Val Ser Trp Gly Leu Arg Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Gly Gly Ala Phe Pro Arg Gly Gly Arg Trp Arg Arg Ser Ala Pro 65 70 75 80 Gly Glu Asp Glu Glu Cys Gly Arg Val Arg Asp Phe Val Ala Lys Leu 85 90 95 Ala Asn Asn Thr His Gln His Val Phe Asp Asp Leu Arg Gly Ser Val 100 105 110 Ser Leu Ser Trp Val Gly Asp Ser Thr Gly Val Ile Leu Val Leu Thr 115 120 125 Thr Phe His Val Pro Leu Val Ile Met Thr Phe Gly Gln Ser Lys Leu 130 135 140 Tyr Arg Ser Glu Asp Tyr Gly Lys Asn Phe Lys Asp Ile Thr Asp Leu 145 150 155 160 Ile Asn Asn Thr Phe Ile Arg Thr Glu Phe Gly Met Ala Ile Gly Pro 165 170 175 Glu Asn Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Ala Glu Val Ser Gly Gly Ser 180 185 190 Arg Gly Gly Arg Ile Phe Arg Ser Ser Asp Phe Ala Lys Asn Phe Val 195 200 205 Gln Thr Asp Leu Pro Phe His Pro Leu Thr Gln Met Met Tyr Ser Pro 210 215 220 Gln Asn Ser Asp Tyr Leu Leu Ala Leu Ser Thr Glu Asn Gly Leu Trp 225 230 235 240 Val Ser Lys Asn Phe Gly Gly Lys Trp Glu Glu Ile His Lys Ala Val 245 250 255 Cys Leu Ala Lys Trp Gly Ser Asp Asn Thr Ile Phe Phe Thr Thr Tyr 260 265 270 Ala Asn Gly Ser Cys Lys Ala Asp Leu Gly Ala Leu Glu Leu Trp Arg 275 280 285 Thr Ser Asp Leu Gly Lys Ser Phe Lys Thr Ile Gly Val Lys Ile Tyr 290 295 300 Ser Phe Gly Leu Gly Gly Arg Phe Leu Phe Ala Ser Val Met Ala Asp 305 310 315 320 Lys Asp Thr Thr Arg Arg Ile His Val Ser Thr Asp Gln Gly Asp Thr 325 330 335 Trp Ser Met Ala Gln Leu Pro Ser Val Gly Gln Glu Gln Phe Tyr Ser 340 345 350 Ile Leu Ala Ala Asn Asp Asp Met Val Phe Met His Val Asp Glu Pro 355 360 365 Gly Asp Thr Gly Phe Gly Thr Ile Phe Thr Ser Asp Asp Arg Gly Ile 370 375 380 Val Tyr Ser Lys Ser Leu Asp Arg His Leu Tyr Thr Thr Thr Gly Gly 385 390 395 400 Glu Thr Asp Phe Thr Asn Val Thr Ser Leu Arg Gly Val Tyr Ile Thr 405 410 415 Ser Val Leu Ser Glu Asp Asn Ser Ile Gln Thr Met Ile Thr Phe Asp 420 425 430 Gln Gly Gly Arg Trp Thr His Leu Arg Lys Pro Glu Asn Ser Glu Cys 435 440 445 Asp Ala Thr Ala Lys Asn Lys Asn Glu Cys 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa = N-methyl-Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> NT69L <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa = L-neo-Trp <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa = tert-Leu <400> 12 Xaa Lys Pro Xaa Xaa Leu 1 5 <210> 13 <211> 357 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(357) <223> RAP <400> 13 Met Ala Pro Arg Arg Val Arg Ser Phe Leu Arg Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Gly Pro Trp Pro Ala Ala Ser His Gly 20 25 30 Gly Lys Tyr Ser Arg Glu Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Glu Ser Gly Glu Glu Phe Arg Met Glu Lys Leu Asn Gln Leu Trp Glu 50 55 60 Lys Ala Gln Arg Leu His Leu Pro Pro Val Arg Leu Ala Glu Leu His 65 70 75 80 Ala Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Asp Glu Leu Ala Trp Lys Lys Leu 85 90 95 Lys Leu Asp Gly Leu Asp Glu Asp Gly Glu Lys Glu Ala Arg Leu Ile 100 105 110 Arg Asn Leu Asn Val Ile Leu Ala Lys Tyr Gly Leu 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Gly Phe Gly 275 280 285 Thr Ile Phe Thr Ser Asp Asp Arg Gly Ile Val Tyr Ser Lys Ser Leu 290 295 300 Asp Arg His Leu Tyr Thr Thr Thr Gly Gly Glu Thr Asp Phe Thr Asn 305 310 315 320 Val Thr Ser Leu Arg Gly Val Tyr Ile Thr Ser Val Leu Ser Glu Asp 325 330 335 Asn Ser Ile Gln Thr Met Ile Thr Phe Asp Gln Gly Gly Arg Trp Thr 340 345 350 His Leu Arg Lys Pro Glu Asn Ser Glu Cys Asp Ala Thr Ala Lys Asn 355 360 365 Lys Asn Glu Cys Ser Leu His Ile His Ala Ser Tyr Ser Ile Ser Gln 370 375 380 Lys Leu Asn Val Pro Met Ala Pro Leu Ser Glu Pro Asn Ala Val Gly 385 390 395 400 Ile Val Ile Ala His Gly Ser Val Gly Asp Ala Ile Ser Val Met Val 405 410 415 Pro Asp Val Tyr Ile Ser Asp Asp Gly Gly Tyr Ser Trp Thr Lys Met 420 425 430 Leu Glu Gly Pro His Tyr Tyr Thr Ile Leu Asp Ser Gly Gly Ile Ile 435 440 445 Val Ala Ile Glu His Ser Ser Arg Pro Ile Asn Val Ile Lys Phe Ser 450 455 460 Thr Asp Glu Gly Gln Cys Trp Gln Thr Tyr Thr Phe Thr Arg Asp Pro 465 470 475 480 Ile Tyr Phe Thr Gly Leu Ala Ser Glu Pro Gly Ala Arg Ser Met Asn 485 490 495 Ile Ser Ile Trp Gly Phe Thr Glu Ser Phe Leu Thr Ser Gln Trp Val 500 505 510 Ser Tyr Thr Ile Asp Phe Lys Asp Ile Leu Glu Arg Asn Cys Glu Glu 515 520 525 Lys Asp Tyr Thr Ile Trp Leu Ala His Ser Thr Asp Pro Glu Asp Tyr 530 535 540 Glu Asp Gly Cys Ile Leu Gly Tyr Lys Glu Gln Phe Leu Arg Leu Arg 545 550 555 560 Lys Ser Ser Val Cys Gln Asn Gly Arg Asp Tyr Val Val Thr Lys Gln 565 570 575 Pro Ser Ile Cys Leu Cys Ser Leu Glu Asp Phe Leu Cys Asp Phe Gly 580 585 590 Tyr Tyr Arg Pro Glu Asn Asp Ser Lys Cys Val Glu Gln Pro Glu Leu 595 600 605 Lys Gly His Asp Leu Glu Phe Cys Leu Tyr Gly Arg Glu Glu His Leu 610 615 620 Thr Thr Asn Gly Tyr Arg Lys Ile Pro Gly Asp Lys Cys Gln Gly Gly 625 630 635 640 Val Asn Pro Val Arg Glu Val Lys Asp Leu Lys Lys Lys Cys Thr Ser 645 650 655 Asn Phe Leu Ser Pro 660 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Neurotensin Fragment <400> 38 Glu Asn Lys Pro Arg 1 5 <210> 39 <211> 667 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> sSortilin fragment (amino acid residues 83-749 of SEQ ID NO:1) <400> 39 Asp Glu Glu Cys Gly Arg Val Arg Asp Phe Val Ala Lys Leu Ala Asn 1 5 10 15 Asn Thr His Gln His Val Phe Asp Asp Leu Arg Gly Ser Val Ser Leu 20 25 30 Ser Trp Val Gly Asp Ser Thr Gly Val Ile Leu Val Leu Thr Thr Phe 35 40 45 His Val Pro Leu Val Ile Met Thr Phe Gly Gln Ser Lys Leu Tyr Arg 50 55 60 Ser Glu Asp Tyr Gly Lys Asn Phe Lys Asp Ile Thr Asp Leu Ile Asn 65 70 75 80 Asn Thr Phe Ile Arg Thr Glu Phe Gly Met Ala Ile Gly Pro Glu Asn 85 90 95 Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Ala Glu Val Ser Gly Gly Ser Arg Gly 100 105 110 Gly Arg Ile Phe Arg Ser Ser Asp Phe Ala Lys Asn Phe Val Gln Thr 115 120 125 Asp Leu Pro Phe His Pro Leu Thr Gln Met Met Tyr Ser Pro Gln Asn 130 135 140 Ser Asp Tyr Leu Leu Ala Leu Ser Thr Glu Asn Gly Leu Trp Val Ser 145 150 155 160 Lys Asn Phe Gly Gly Lys Trp Glu Glu Ile His Lys Ala Val Cys Leu 165 170 175 Ala Lys Trp Gly Ser Asp Asn Thr Ile Phe Phe Thr Thr Tyr Ala Asn 180 185 190 Gly Ser Cys Lys Ala Asp Leu Gly Ala Leu Glu Leu Trp Arg Thr Ser 195 200 205 Asp Leu Gly Lys Ser Phe Lys Thr Ile Gly Val Lys Ile Tyr Ser Phe 210 215 220 Gly Leu Gly Gly Arg Phe Leu Phe Ala Ser Val Met Ala Asp Lys Asp 225 230 235 240 Thr Thr Arg Arg Ile His Val Ser Thr Asp Gln Gly Asp Thr Trp Ser 245 250 255 Met Ala Gln Leu Pro Ser Val Gly Gln Glu Gln Phe Tyr Ser Ile Leu 260 265 270 Ala Ala Asn Asp Asp Met Val Phe Met His Val Asp Glu Pro Gly Asp 275 280 285 Thr Gly Phe Gly Thr Ile Phe Thr Ser Asp Asp Arg Gly Ile Val Tyr 290 295 300 Ser Lys Ser Leu Asp Arg His Leu Tyr Thr Thr Thr Gly Gly Glu Thr 305 310 315 320 Asp Phe Thr Asn Val Thr Ser Leu Arg Gly Val Tyr Ile Thr Ser Val 325 330 335 Leu Ser Glu Asp Asn Ser Ile Gln Thr Met Ile Thr Phe Asp Gln Gly 340 345 350 Gly Arg Trp Thr His Leu Arg Lys Pro Glu Asn Ser Glu Cys Asp Ala 355 360 365 Thr Ala Lys Asn Lys Asn Glu Cys Ser Leu His Ile His Ala Ser Tyr 370 375 380 Ser Ile Ser Gln Lys Leu Asn Val Pro Met Ala Pro Leu Ser Glu Pro 385 390 395 400 Asn Ala Val Gly Ile Val Ile Ala His Gly Ser Val Gly Asp Ala Ile 405 410 415 Ser Val Met Val Pro Asp Val Tyr Ile Ser Asp Asp Gly Gly Tyr Ser 420 425 430 Trp Thr Lys Met Leu Glu Gly Pro His Tyr Tyr Thr Ile Leu Asp Ser 435 440 445 Gly Gly Ile Ile Val Ala Ile Glu His Ser Ser Arg Pro Ile Asn Val 450 455 460 Ile Lys Phe Ser Thr Asp Glu Gly Gln Cys Trp Gln Thr Tyr Thr Phe 465 470 475 480 Thr Arg Asp Pro Ile Tyr Phe Thr Gly Leu Ala Ser Glu Pro Gly Ala 485 490 495 Arg Ser Met Asn Ile Ser Ile Trp Gly Phe Thr Glu Ser Phe Leu Thr 500 505 510 Ser Gln Trp Val Ser Tyr Thr Ile Asp Phe Lys Asp Ile Leu Glu Arg 515 520 525 Asn Cys Glu Glu Lys Asp Tyr Thr Ile Trp Leu Ala His Ser Thr Asp 530 535 540 Pro Glu Asp Tyr Glu Asp Gly Cys Ile Leu Gly Tyr Lys Glu Gln Phe 545 550 555 560 Leu Arg Leu Arg Lys Ser Ser Val Cys Gln Asn Gly Arg Asp Tyr Val 565 570 575 Val Thr Lys Gln Pro Ser Ile Cys Leu Cys Ser Leu Glu Asp Phe Leu 580 585 590 Cys Asp Phe Gly Tyr Tyr Arg Pro Glu Asn Asp Ser Lys Cys Val Glu 595 600 605 Gln Pro Glu Leu Lys Gly His Asp Leu Glu Phe Cys Leu Tyr Gly Arg 610 615 620 Glu Glu His Leu Thr Thr Asn Gly Tyr Arg Lys Ile Pro Gly Asp Lys 625 630 635 640 Cys Gln Gly Gly Val Asn Pro Val Arg Glu Val Lys Asp Leu Lys Lys 645 650 655 Lys Cys Thr Ser Asn Phe Leu Ser Pro Glu Lys 660 665 <210> 40 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> NGF pro domain (amino acid residues 19 to 121 of SEQ ID NO 6) <400> 40 Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro Gln 1 5 10 15 Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg 20 25 30 Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln 35 40 45 Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu 50 55 60 Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala 65 70 75 80 Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn 85 90 95 Arg Thr His Arg Ser Lys Arg 100 <210> 41 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> NT propeptide (amino acid residues 17-140 of SEQ ID NO:8) <400> 41 Gln Gly Asn Asn Met Asp Gln Arg Ser Leu Pro Glu Asp Ser Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Ile Ile Lys Leu Ile Gln Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Leu 20 25 30 Ser Lys Gln Met Val Asp Val Lys Glu Asn Tyr Gln Ser Thr Leu Pro 35 40 45 Lys Ala Glu Ala Pro Arg Glu Pro Glu Arg Gly Gly Pro Ala Lys Ser 50 55 60 Ala Phe Gln Pro Val Ile Ala Met Asp Thr Glu Leu Leu Arg Gln Gln 65 70 75 80 Arg Arg Tyr Asn Ser Pro Arg Val Leu Leu Ser Asp Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Glu Pro Pro Pro Leu Tyr Leu Met Glu Asp Tyr Val Gly Ser Pro Val 100 105 110 Val Ala Asn Arg Thr Ser Arg Arg Lys Arg Tyr Ala 115 120 <210> 42 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> NGF pro-domain (amino acid residues 19-121 of SEQ ID NO 6) <400> 42 Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro Gln 1 5 10 15 Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg 20 25 30 Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln 35 40 45 Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu 50 55 60 Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala 65 70 75 80 Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn 85 90 95 Arg Thr His Arg Ser Lys Arg 100 <210> 43 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> pro BDNF (amino acid residues 19-246 of SEQ ID NO 7) <400> 43 Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys 20 25 30 Ala Gly Ser Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val Ile 35 40 45 Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu Asn 50 55 60 Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser Gln 65 70 75 80 Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys Asn 85 90 95 Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser Asp 100 105 110 Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp 115 120 125 Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys Gln 145 150 155 160 Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly 165 170 175 Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr 180 185 190 Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly 195 200 205 Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile 210 215 220 Lys Arg Gly Arg 225 <210> 44 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> BDNF pro domain (amino acid residues 19-127 of SEQ ID NO:7) <400> 44 Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys 20 25 30 Ala Gly Ser Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val Ile 35 40 45 Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu Asn 50 55 60 Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser Gln 65 70 75 80 Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys Asn 85 90 95 Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg 100 105 <210> 45 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Pro NT3 (amino acid residues 17-257 of SEQ ID NO:8) <400> 45 Gln Gly Asn Asn Met Asp Gln Arg Ser Leu Pro Glu Asp Ser Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Ile Ile Lys Leu Ile Gln Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Leu 20 25 30 Ser Lys Gln Met Val Asp Val Lys Glu Asn Tyr Gln Ser Thr Leu Pro 35 40 45 Lys Ala Glu Ala Pro Arg Glu Pro Glu Arg Gly Gly Pro Ala Lys Ser 50 55 60 Ala Phe Gln Pro Val Ile Ala Met Asp Thr Glu Leu Leu Arg Gln Gln 65 70 75 80 Arg Arg Tyr Asn Ser Pro Arg Val Leu Leu Ser Asp Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Glu Pro Pro Pro Leu Tyr Leu Met Glu Asp Tyr Val Gly Ser Pro Val 100 105 110 Val Ala Asn Arg Thr Ser Arg Arg Lys Arg Tyr Ala Glu His Lys Ser 115 120 125 His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr 130 135 140 Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gln Val Thr Val Leu 145 150 155 160 Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu 165 170 175 Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile 180 185 190 Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys Thr Ser Gln Thr Tyr Val 195 200 205 Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly Trp Arg Trp Ile 210 215 220 Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg 225 230 235 240 Thr <210> 46 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> NT3 pro domain (amino acid residues 17-140 of SEQ ID NO:8) <400> 46 Gln Gly Asn Asn Met Asp Gln Arg Ser Leu Pro Glu Asp Ser Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Ile Ile Lys Leu Ile Gln Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Leu 20 25 30 Ser Lys Gln Met Val Asp Val Lys Glu Asn Tyr Gln Ser Thr Leu Pro 35 40 45 Lys Ala Glu Ala Pro Arg Glu Pro Glu Arg Gly Gly Pro Ala Lys Ser 50 55 60 Ala Phe Gln Pro Val Ile Ala Met Asp Thr Glu Leu Leu Arg Gln Gln 65 70 75 80 Arg Arg Tyr Asn Ser Pro Arg Val Leu Leu Ser Asp Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Glu Pro Pro Pro Leu Tyr Leu Met Glu Asp Tyr Val Gly Ser Pro Val 100 105 110 Val Ala Asn Arg Thr Ser Arg Arg Lys Arg Tyr Ala 115 120 <210> 47 <211> 186 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> proNT 4/5 (amino acid residues 25-210 of SEQ ID NO 9) <400> 47 Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp 1 5 10 15 Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro 20 25 30 Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly 35 40 45 Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala 50 55 60 Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala Val Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val 65 70 75 80 Thr Asp Arg Arg Thr Ala Val Asp Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val 85 90 95 Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe 100 105 110 Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly 115 120 125 Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser 130 135 140 Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala 145 150 155 160 Gln Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val 165 170 175 Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Ala 180 185 <210> 48 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> NT4/5 pro domain (amino acid residues 25-80 of SEQ ID NO 9) <400> 48 Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp 1 5 10 15 Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro 20 25 30 Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly 35 40 45 Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg 50 55 <210> 49 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Sortilin propeptide (amino acid residues 34-77 of SEQ ID NO:1) <400> 49 Gln Asp Arg Leu Asp Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Leu Pro Arg 1 5 10 15 Trp Ser Gly Pro Ile Gly Val Ser Trp Gly Leu Arg Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Gly Gly Ala Phe Pro Arg Gly Gly Arg Trp Arg Arg 35 40 <210> 50 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Sortilin propeptide fragment (amino acid residues 37-61 of SEQ ID NO:1) <400> 50 Leu Asp Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Leu Pro Arg Trp Ser Gly 1 5 10 15 Pro Ile Gly Val Ser Trp Gly Leu Arg 20 25 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Peptide-4 <400> 51 Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu Arg Ser Pro 1 5 10 15 Arg Val Leu Phe 20 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 52 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10

Claims

SEQ ID NO.:33 의 아미노산 서열로 이루어지는 소르틸린과 리간드와의 복합체의 결정으로서, 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 결정:
(a) 상기 소르틸린과 리간드: NGF 프로 도메인 (SEQ ID NO.:40) 의 정방 결정으로서,
단위 셀 치수 a=b=159.97 Å, c=106.55 Å, α=β=γ=90°를 갖는 공간군 P4₁2₁2 에 속하는 결정,
(b) 상기 소르틸린과 리간드: 펩티드-4 (SEQ ID NO.:51) 의 정방 결정으로서,
단위 셀 치수 a=b=159.37 Å, c=108.72 Å, α=β=γ=90°를 갖는 공간군 P4₁2₁2 에 속하는 결정,
(c) 상기 소르틸린과 리간드: 뉴로텐신 (SEQ ID NO.:10) 의 단사정계 결정으로서,
단위 셀 치수 a=145.8 Å, b=74.5 Å, c=108.3 Å, α=γ=90°, β=131.87°를 갖는 공간군 C2 에 속하는 결정,
(d) 상기 소르틸린과 리간드: 뉴로텐신 (SEQ ID NO.:10) 의 단사정계 결정으로서,
단위 셀 치수 a=162.1 Å, b=78.7 Å, c=111.1 Å, α=γ=90°, β=126.61°를 갖는 공간군 C2 에 속하는 결정, 및
(e) 상기 소르틸린과 리간드: sSort-프로펩티드 (SEQ ID NO.:49) 의 단사정계 결정으로서,
단위 셀 치수 a=162.1 Å, b=78.1 Å, c=111.7 Å, α=γ=90°, β=127.20°를 갖는 공간군 C2 에 속하는 결정.
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