KR101613612B1

KR101613612B1 - 표적 염기를 검출하기 위한 rna를 함유한 프로브를 제조하기 위한 방법

Info

Publication number: KR101613612B1
Application number: KR1020137002715A
Authority: KR
Inventors: 준코 야마모토; 토무 인덴; 토시하루 오바; 토우루 스즈키; 히로유키 무카이; 키요조 아사다
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2010-07-29
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2031-07-28
Also published as: CN103026362A; JP5711234B2; US20130122503A1; KR20130097147A; JPWO2012014988A1; US9336349B2; WO2012014988A1

Abstract

단순하고 유용한, 표적 염기를 검출하기 위한 RNA를 함유한 프로브를 제공하기 위한 방법; 염기-서열 정보 처리 방법; 염기-서열 정보 처리 장치; 염기-서열 정보 처리 시스템; 및 표적 염기를 검출하는 방법이 개시된다. 개시된 염기-서열 정보 처리 방법은 표적 염기 또는 부분 염기 서열의 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3번째, 4번째, 또는 5번째 염기인 표적 염기에 인접한 염기를 갖는, 7개 내지 14개의 염기들을 포함하고 25 내지 40℃의 Tm 값을 갖는 부분 염기 서열이 발생되는 단계를 포함한다. 개시된 방법은 연구자의 일부에 대한 직관 또는 경험에 기초하지 않고, 표적 염기를 검출하기 위한 RNA를 함유한 프로브를 단순하면서도 효율적으로 제조하게 될 때 유용하다. 상기 방법은 유전 공학의 분야뿐 아니라 의학 연구의 분야에서 상당히 유용하다.

Description

표적 염기를 검출하기 위한 RNA를 함유한 프로브를 제조하기 위한 방법{METHOD FOR MANUFACTURING A PROBE CONTAINING RNA FOR DETECTING A TARGET BASE}

제 1 양상에서, 본 발명은 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 방법, 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치, 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 시스템, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 제조하기 위한 방법 및 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.

제 2 양상에서, 본 발명은 표적 핵산을 검출하는 데에 유용한 RNA-함유 프로브를 설계하기 위한 방법, 설계할 때 사용을 위한 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 방법, 및 컴퓨터가 이러한 뉴클레오티드 서열 처리 방법을 실행하도록 하는 프로그램 및 기록 매체에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 이러한 뉴클레오티드 서열 처리 방법을 실시하기 위한 장치에 관한 것이다.

핵산을 증폭하거나 검출하기 위한 기술은 의학; 약학; 농업, 임학, 및 어업; 및 식품의 분야에서, 예를 들어, 유전공학 및 분자 생물학뿐 아니라, 질병의 진단, 유전자조작식품의 검사 및 미생물, 바이러스 및 병원성 박테리아의 검출에 있어 실험 기구로서 필수적이여 왔다.

생물종에 관계없이, 물질, 효소, 및 유사한 기능을 갖는 다른 것들을 인코딩하는(encode) 유전자들에서 높은 상동(homology)을 공유하는 유전자군이 존재한다는 것이 알려진다. 또한 동일종에 속하는 유기체의 개별 게놈(genome)들은 완전히 동일하지 않고 다형성이라 일컫는 뉴클레오티드 서열에 있어 상이함을 갖는다는 것이 또한 알려진다. 다형성은 1개 내지 수십 개의 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입, 특정 뉴클레오티드 서열의 복제 등을 나타내는 것으로 알려진다. 다른 뉴클레오티드로의 뉴클레오티드의 치환은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP; 여기서 단일 뉴클레오티드 치환으로서 서술될 수 있다)이라 일컫고 질병에 관한 유전자들을 검색하거나, 질병에 대한 감수성을 결정하거나, 약물에 대한 감수성에서 상이함(작용 및 부작용)을 이해하기 위한 인디케이터(indicator)로서 주의를 끌어왔다. 또한 연구는 진행 중인 이러한 치환의 검출을 위한 방법에 대한 것이다.

높은 상동을 공유하는 유전자군으로부터 특정 유전자를 검출하고 SNP를 검출하기 위한 방법은 표적 DNA 및 RNA-함유 프로브(probe)의 잡종화(hybridization)에 의해 형성된 RNA-DNA 잡종(hybrid)이 리보뉴클레아제로의 절단이 가해지는 방법(예를 들어, 특허 문헌 1)을 포함한다. 이런 방법에서, RNA-함유 프로브는 프로브와 표적 DNA 사이의 미스매치(mismatch)가 존재할 때 잡종이 리보뉴클레아제로 절단되지 않도록 설계되고, 이에 의해 하나가 표적 DNA에서 특정 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 치환의 존재 또는 부재를 확인하도록 한다.

유전자 검출을 위한 종래의 프로브들은 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 프로브의 자기 상보성이거나 형성될 잡종의 Tm 값을 인디케이터로서 사용하여, 특정 잡종화가 프로브와 표적 핵산 사이에 이루어지는 이러한 뉴클레오티드 서열을 선택함으로써 설계되어 왔다. 적절한 프로브를 설계하기 위한 다양한 소프트웨어가 또한 제공된다.

하지만, 표적 핵산을 검출하기 위한 상기에 서술된 바와 같은 RNA-함유 프로브는 특정 뉴클레오티드를 포함하거나 포함하지 않거나, 뉴클레오티드 치환이 야기되거나 야기될 것 같은 특정 뉴클레오티드를 포함하는 영역에서만 설계될 수 있고, 이에 따라, 종래의 프로브들이 설계되는 경우와 비교하여, 선택 영역에 있어 제한을 갖는다. 또한, 리보뉴클레아제 H에 대한 프로브에 함유되는 RNA 부분의 감수성은 특정 뉴클레오티드 또는 SNP의 존재/부재에 따라, 크게 변하는 것이 요구된다. 지금까지, 이런 제한들이 실험을 근거하거나 시행착오 하에서 RNA-함유 프로브를 설계할 수 밖에 없도록 연구자들을 강요하여 왔다.

특허문헌 1: 미국 특허 번호 5,660,988호

제 1 양상에서, 본 발명의 목적은 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 제조하기 위한 단순하고 유용한 방법, 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 단순하고 유용한 방법, 장치 및 시스템, 및 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 단순하고 유용한 방법을 제공하는 것이다.

제 2 양상에서, 본 발명의 목적은 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계하기 위한 단순하고 유용한 방법, 및 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 단순하고 유용한 방법, 장치 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자들은 상기에 언급된 문제점들을 해결하기 위하여, 검출될 표적 핵산에서 각 특정 뉴클레오티드 또는 단일 뉴클레오티드 치환을 위한 시행착오를 통해 연구자들에 의해 예전에 설계되어 왔던, 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계하는 연구에 자신들을 바쳐 왔다. 본 발명의 발명자들은 특정 조건들을 충족시키는 서열로서 설계된 RNA-함유 프로브들이 리보뉴클레아제 H와 조합하여 사용될 때 특정 뉴클레오티드 또는 SNP의 효율적인 검출을 가능하게 하는 것으로 발견된다는 결과와, 콤비네이션-바이-콤비네이션(combination by combination) 기반에 대한 조건들의 다수의 조합들을 시험하여 왔고, 이에 의해 본 발명의 완성을 초래한다. 본 발명의 발명자들은 또한 상기에 언급된 RNA-함유 프로브를 설계하기 위한 뉴클레오티드 서열 처리 방법; 컴퓨터가 처리 방법을 실행하도록 하는 프로그램; 뉴클레오티드 서열 처리 장치; 및 추가로 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계하고, 게다가 네트워크를 통해 통신가능한 상태로 뉴클레오티드 서열 처리 장치에 연결된 클라이언트 장치로부터 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보를 단지 입력함으로써, 특정 뉴클레오티드 또는 단일 뉴클레오티드 치환의 효율적인 검출을 가능하게 하는 한 쌍의 프라이머들에 대한 정보를 제공하는 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 시스템을 개발하여 왔다. 이에 의해 발명자들은 본 발명을 완성하여 왔다.

따라서, 요약될 때, 제 1 양상에서, 본 발명은:

[1] 표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열에서의 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 단계;

표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 생성하는단계;

표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 뉴클레오티드 서열에서, 뉴클레오티드 서열에 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계; 및

RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득된 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계를 포함하되,

(d) 부분 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14이고,

(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,

(f) 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드는 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치되는, 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치에 의해 실시되는 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 방법.

[2] 표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열에 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 단계;

출력된 뉴클레오티드 서열 및 생성된 상보적 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계

(여기서, (d) 부분 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14이고,

(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,

(f) 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드는 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치된다); 및

표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열에서, 뉴클레오티드 서열에서의 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치에 의해 실시되는 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 방법.

[3] 표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열로 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 단계;

출력된 뉴클레오티드 서열 및 생성된 상보적 뉴클레오티드 서열에 대하여,

(a) 표적 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대한 결정,

(b) 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대한 결정, 및

(c) 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대한 결정 중 적어도 하나를 결정하여, 퓨린 뉴클레오티드인 하나의 뉴클레오티드가 출력된 뉴클레오티드 서열 및 생성된 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 RNA 위치로서 결정됨으로써, RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 단계;

RNA 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열로부터, RNA 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계

(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,

(f) RNA 위치에서 나타난 하나의 뉴클레오티드는 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치된다); 및

RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열에서, RNA 위치로서 결정된 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치에 의해 실시되는 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 방법.

[4] 표적 뉴클레오티드와 결정된 RNA 위치 사이의 상대적 위치에 기초하여, RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득되는 생성된 부분 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브로서 상위의 부분 뉴클레오티드 서열을 선택하기 위한 우선순위를 결정하는 단계; 및 결정된 우선순위를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 단계를 포함하는, [3]에 따른 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 방법.

[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 방법의 단계들을 포함하는, 컴퓨터에 의해 실시되는 프로그램.

[6] 매체가 [5]에 따른 프로그램을 저장하는 것을 특징으로 하는, 컴퓨터-판독가능한 기록 매체.

[7] 표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열에 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하기 위한 수단;

표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단;

표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 뉴클레오티드 서열에서, 뉴클레오티드 서열에서의 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단; 및

RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득된 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단을 포함하되,

(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,

(f) 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드는 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치되는, 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치.

[8] 표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열에 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하기 위한 수단;

출력된 뉴클레오티드 서열 및 생성된 상보적 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단

(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,

(f) 뉴클레오티드 서열의 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드는 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치된다); 및

표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열에서, 뉴클레오티드 서열에서의 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단을 포함하는, 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치.

[9] 표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열에 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하기 위한 수단;

(c) 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대한 결정 중 적어도 하나를 결정하여, 퓨린 뉴클레오티드인 하나의 뉴클레오티드가 출력된 뉴클레오티드 서열 및 생성된 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 RNA 위치로서 결정됨으로써, RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하기 위한 수단;

RNA 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열로부터, RNA 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단

(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,

RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 RNA 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열에서, RNA 위치로서 결정된 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단을 포함하는, 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치.

[10] RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하기 위한 수단은 표적 뉴클레오티드와 결정된 RNA 위치 사이의 상대적 위치에 기초하여, RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득되는 생성된 부분 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브로서 상위의 부분 뉴클레오티드 서열을 선택하기 위한 우선순위를 결정하는 것; 및 결정된 우선순위를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 것을 포함하는, [9]에 따른 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치.

[11] [7] 내지 [10] 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치, 및 네트워크를 통해 연결되는 클라이언트 장치를 포함하되,

클라이언트 장치는 네트워크를 통해 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치에 입력된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정보를 전송하기 위한 전송 수단을 포함하고,

뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전송된 정보에 기초하여, RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득되는 생성된 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하고 출력하기 위한 수단을 포함하는, 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 시스템.

[12] [1] 내지 [4]에 따른 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 방법에 의해 생성된 RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득된 부분 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열을 갖는 RNA 및 DNA를 함유한 핵산 프라그먼트를 마련하는 단계를 포함하는, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 제조하기 위한 방법.

[13] [12]에 따른 방법에 의해 제조된 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 샘플에서 핵산으로 잡종화시키는 단계; 잡종화 단계 이후에, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브에 리보뉴클레아제 H 처리를 적용시키는 단계; 및 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브가 리보뉴클레아제 H에 의해 절단되었는지 아닌지를 검출하는 단계를 포함하는, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.

또한, 제 2 양상에서, 본 발명은:

[1] (a) 하나의 퓨린 뉴클레오티드가 RNA이고 다른 것들은 DNA들이고,

(b) 검출될 표적 핵산 또는 이의 상보적 스트랜드로부터 파생된 뉴클레오티드 서열은 7개 내지 14개의 뉴클레오티드들을 갖고,

(c) (a)에서 비롯된 RNA 뉴클레오티드는 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에 위치되며,

(d) Tm 값은 25 내지 40℃의 범위에 존재하는: 조건들을 충족시키는 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계를 포함하는, 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계하기 위한 방법;

[2] 단계 (a)에서 RNA 뉴클레오티드는 표적 핵산에서 단일 뉴클레오티드 치환이 야기될 것 같은 뉴클레오티드, 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드, 표적 핵산에서 단일 뉴클레오티드 치환이 야기될 것 같은 뉴클레오티드에 대응하는 상보적 스트랜드에서 뉴클레오티드, 및 상보적 스트랜드에서 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드에 대응하는 뉴클레오티드인, [1]에 따른 설계하기 위한 방법;

[3] [1] 또는 [2]에 따른 방법에 의한, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계하는 단계; 프로브를 합성하는 단계; 합성된 RNA-함유 프로브를 샘플에서 핵산으로 잡종화시키는 단계; 프로브가 리보뉴클레아제 H에 의해 절단되는지 아닌지 시험하도록 리보뉴클레아제 H 처리를 적용시키는 단계를 포함하는, 표적 핵산을 검출하기 위한 방법;

[4] 뉴클레오티드 서열 정보를 획득하는 단계(검출될 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보가 획득된다);

뉴클레오티드를 결정하는 단계(결정은 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에서 하나의 뉴클레오티드, 하나의 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드, 하나의 뉴클레오티드에 대응하는 표적 핵산의 상보적 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드, 및 상보적 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대하여 이루어진다);

뉴클레오티드 정보를 생성하는 단계(퓨린 뉴클레오티드들 중 하나가 RNA로서 설정되고 다른 것들은 DNA들로서 설정된다);

부분 뉴클레오티드 서열을 생성함으로써(검출될 표적 핵산 또는 이의 상보적 스트랜드로부터 파생된 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14이도록 설정된다), 부분 뉴클레오티드 서열에 대한 정보를 생성하는 단계;

뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계(RNA 뉴클레오티드가 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치되는 뉴클레오티드 서열은 부분 뉴클레오티드 서열의 정보에 기초하여 선택된다); 및

특정-뉴클레오티드-함유 서열을 선택하는 단계(특정 뉴클레오티드를 함유하는 서열이 선택되고, 뉴클레오티드 서열 선택 단계에 의해 획득된 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃의 범위에서 존재한다)를 포함하는, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계함에 있어 사용을 위한 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 방법;

[5] 표적 핵산의 증폭을 위한 프라이머들을 설계하는 단계를 더 포함하되, 설계된 RNA-함유 프로브에 대응하는 영역을 포함하는 표적 핵산의 프라그먼트를 증폭시키기 위한 한 쌍의 프라이머들이 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 설계되는, [4]에 따른 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 방법;

[6] 뉴클레오티드 서열 정보에서 하나의 뉴클레오티드가 단일 뉴클레오티드 치환이 야기될 것 같은 뉴클레오티드인, [4]에 따른 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 방법;

[7] 컴퓨터가 [4] 또는 [5]에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법을 실행하도록 하는 것을 특징으로 하는 프로그램;

[8] 이에 기록되는 [7]에 따른 프로그램을 갖는 컴퓨터-판독가능 기록 매체;

[9] 뉴클레오티드 서열 정보를 획득하기 위한 수단(검출될 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보가 획득된다);

뉴클레오티드를 결정하기 위한 수단(결정은 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에서 하나의 뉴클레오티드, 하나의 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드, 하나의 뉴클레오티드에 대응하는 표적 핵산의 상보적 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드, 및 상보적 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대하여 이루어진다);

뉴클레오티드 정보를 생성하기 위한 수단(퓨린 뉴클레오티드들 중 하나가 RNA로서 설정되고 다른 것들은 DNA들로서 설정된다);

부분 뉴클레오티드 서열을 생성함으로써(검출될 표적 핵산 또는 이의 상보적 스트랜드로부터 파생된 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14이도록 설정된다), 부분 뉴클레오티드 서열에 대한 정보를 생성하기 위한 수단;

뉴클레오티드 서열을 선택하기 위한 수단(부분 뉴클레오티드 서열의 정보에 기초하여, RNA 뉴클레오티드가 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치되는 뉴클레오티드 서열이 선택된다); 및

특정-뉴클레오티드-함유 서열을 선택하기 위한 수단(특정 뉴클레오티드를 함유하는 서열이 선택되고, 뉴클레오티드 서열 선택 단계에 의해 획득된 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃의 범위에서 존재한다)을 포함하는, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계함에 있어 사용을 위한 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 장치;

[10] 표적 핵산의 증폭을 위한 프라이머들을 설계하기 위한 수단을 더 포함하되, 설계된 RNA-함유 프로브에 대응하는 영역을 포함하는 표적 핵산의 프라그먼트를 증폭시키기 위한 한 쌍의 프라이머들이 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 설계되는, [9]에 따른 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 장치;

[11] 뉴클레오티드 서열 정보에서 하나의 뉴클레오티드가 단일 뉴클레오티드 치환이 야기될 것 같은 뉴클레오티드인, [9]에 따른 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 장치; 및

[12] [9] 또는 [10]에 따른 뉴클레오티드 서열 정보 처리 장치 및 네트워크를 통해 뉴클레오티드 서열 정보 처리 장치와 통신가능한 상태로 뉴클레오티드 서열 처리 장치에 연결된 클라이언트 장치를 포함하되,

클라이언트 장치가 뉴클레오티드 서열 처리 장치에 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보를 전송하기 위한 전송 수단, 및 표적 핵산의 증폭을 위한 프라이머들 및 프로브의 정보 또는, 뉴클레오티드 서열 처리 장치로부터 전송된, 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브에 대한 표적 핵산에서 정보를 획득하기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는: 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 시스템에 관한 것이다.

본 발명에 따라, 연구자들은 예전에는 경험 또는 감각을 근거하여 설계하여 왔던, 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 단순하게 설계할 수 있고, 표적 핵산뿐 아니라, 표적 핵산에서 SNP 또는 (여기서 표적 뉴클레오티드라 일컬어질 수 있는) 특정 뉴클레오티드를 효율적으로 검출하는 것이 가능하게 이루어진다. 또한 표적 핵산에서 특정 뉴클레오티드 또는 단일 뉴클레오티드 치환의 효율적인 검출을 가능하게 하는 한 쌍의 프라이머(primer)들에 대한 정보가 제공되고, 이에 따라 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브는 표적 핵산을 검출하는 데 거의 또는 전혀 경험을 갖지 않는 연구자들에 의해 손쉽게 설계될 수 있으며 관심의 표적 핵산에서 SNP 또는 특정 뉴클레오티드를 효율적으로 검출하는 것이 가능하게 이루어진다.

도 1은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 방법의 단계들을 나타내는 흐름도를 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 방법의 단계들의 실시예를 나타내는 흐름도를 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 방법의 단계들의 실시예를 나타내는 흐름도를 도시한다.
도 4는 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 5는 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 6은 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 7은 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 8은 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 9는 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 10은 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 11은 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 12는 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 13은 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 14는 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 15는 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 16은 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 17은 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 18은 각각 본 발명에 따른 방법으로 설계된 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 특이성의 결과의 실시예를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 19는 본 발명에 따른 장치의 블록 다이어그램의 실시예를 도시한다.
도 20은 데이터 메모리(23)의 내부 구조를 도시하는 도면이다.
도 21은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 방법의 흐름도의 실시에를 도시한다.
도 22는 ST3의 흐름도를 도시한다.
도 23은 ST4의 흐름도를 도시한다.
도 24는 ST31의 흐름도를 도시한다.
도 25는 ST32의 흐름도를 도시한다.
도 26은 ST1 내지 ST4에서 입력되거나 생성된 데이터의 형식을 요약하는 테이블을 도시한다.
도 27은 처리 단계 ST2에서 레퍼런스(reference)가 이루어진 테이블을 도시한다.
도 28은 처리 단계들 ST18 내지 ST25에서 생성된 문자열 N을 나타내는 테이블을 도시한다.
도 29는 결정 단계들 ST11 내지 ST17에서 레퍼런스가 이루어진 테이블을 도시한다.
도 30은 처리 단계 ST33에서 레퍼런스가 이루어진 테이블을 도시한다.
도 31은 결정 단계 ST5에서 레퍼런스가 이루어진 테이블을 도시한다.
도 32는 처리 단계 ST10에서 출력된 데이터의 테이블을 도시한다.

본 발명은 하기에서 명확하게 서술될 것이다.

본 발명은 프로브(probe)가 표적 핵산과 잡종화된 이후에 프로브가 리보뉴클레아제 H에 의해 절단되는지 아닌지에 기초하여, 표적 핵산이 검출되는 방법으로 사용되는 RNA-함유 프로브를 제공한다. 본 발명에 따라 설계된 RNA-함유 프로브들의 특징들에 대한, 설명은 실시예로서, 표적 핵산에서의 특정 위치에서 뉴클레오티드(nucleotide) X를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브에 대하여 하기에 주어진다. 여기서, 뉴클레오티드 X는 표적 핵산에서의 어떤 뉴클레오티드, 예를 들어, 단일 뉴클레오티드 치환의 결과로서 정상 뉴클레오티드에 대하여 치환되어 왔던 뉴클레오티드, 또는 보통 발견되지 않으나 다른 뉴클레오티드로 치환될 것 같은 뉴클레오티드일 수 있다. 상기에 서술된 뉴클레오티드 X는 또한 여기서 표적 뉴클레오티드라 일컬어질 수 있다.

본 발명에 따른 RNA-함유 프로브는 표적 핵산에서 상기에 언급된 뉴클레오티드 X를 포함하는 영역 또는 이러한 영역에 상보적인 영역으로 잡종화할 수 있는 서열을 갖는다. 따라서, 프로브는 표적 핵산 또는 이의 상보적 스트랜드(strand)로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 부분이고 (뉴클레오티드 Y라 일컬어진) 표적 핵산의 상보적 스트랜드에서 뉴클레오티드 X에 상보적 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 X를 포함하는 영역으로 잡종화시키는 서열을 갖는다. 이러한 서열의 스트랜드 길이는 특별하게 제한되지 않고 바람직하게는 7 내지 14의 뉴클레오티드들이다. 적어도 하나의 뉴클레오티드 X, 뉴클레오티드 Y, 또는 뉴클레오티드 X와 뉴클레오티드 Y의 각각의 3' 측(side)에 인접한 뉴클레오티드는 퓨린(purine) 뉴클레오티드(아데닌 또는 구아닌)이고, 이에 따라 이런 퓨린 뉴클레오티드들 중 어느 하나가 선택되어, 본 발명에 따른 RNA-함유 프로브가 설계될 때 이런 뉴클레오티드만이 RNA로서 설정되고 다른 것들은 DNA들로서 설정된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 X 및 뉴클레오티드 X의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드들(시토신 또는 티민)인 경우에, 이런 조건은 (RNA로서 뉴클레오티드 Y 또는 뉴클레오티드 Y의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 설정하는) 표적 핵산의 상보적 스트랜드의 서열로부터 RNA-함유 프로브를 설계함으로써 만족시킬 수 있다. DNA 뉴클레오티드를 위한, 용도가 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP뿐 아니라 dUTP, 이노신, 7-DEAZA-GTP, 7-DEAZA-ATP 및 LNA-조작 DNA 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. RNA 뉴클레오티드는 프로브의 3' 말단(end) 또는 5' 말단 중 어느 하나로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에 위치된다. 바람직한 양상에서, RNA 뉴클레오티드는 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단 중 어느 하나로부터 제3 또는 제4의 뉴클레오티드의 위치에 위치된다. 프로브의 Tm 값은 25 내지 40℃, 바람직하게는 25 내지 32℃의 범위에서 존재한다. 여기서, Tm 값은 최근린 방법(nearest-neighbor method)을 이용하여, 추가로 바이오케미스트리(Biochemistry), 36권, 34호, 10581쪽 내지 10594쪽(1997)에서 서술된 방법으로, 50mM의 염 농도 및 500nM의 DNA 농도를 갖는 조건들 하에서 연산된다.

상기에 언급된 조건들을 충족시키는 RNA-함유 프로브들은 상기에 언급된 조건들 중 어느 하나를 충족시키지 않는 것들보다, 프로브가 뉴클레오티드 X를 포함하는 표적 핵산(DNA) 또는 이의 상보적 스트랜드로 잡종화되고 리보뉴클레아제 H와의 처리에 가해질 때 리보뉴클레아제 H로 더 효율적으로 절단된다. 따라서, 상기에 언급된 조건들을 충족시키는 RNA-함유 프로브들은 높은 감수성을 갖는 표적 핵산에서 뉴클레오티드 X의 존재를 검출할 수 있다.

표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계하기 위한 본 발명의 방법에서, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보가 우선 획득된다. 여기서, "표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보"는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 및 뉴클레오티드 서열에서 하나의 뉴클레오티드의 위치로 언급된다. "하나의 뉴클레오티드의 위치"는 검출되도록 요구되는 표적 핵산에서 하나의 뉴클레오티드의 위치로 언급된다. RNA-함유 프로브가 표적 핵산이 높은 정도의 상동(homology)을 나타내는 유전자군으로부터 특정 유전자를 검출하도록 설계될 때, 이런 군의 유전자들의 뉴클레오티드 서열의 상동 분석은 보호된 영역들 또는 상당한 상동 영역들에서, 낮은 정도의 상동을 나타내거나 표적 유전자와 다른 유전자들 사이에서 상이한, 뉴클레오티드를 발견하도록 일반적인 방법으로 실시되고, 이에 의해 이런 뉴클레오티드의 위치는 하나의 뉴클레오티드의 위치로서 설정될 수 있다. RNA-함유 프로브가 SNP를 검출하도록 설계될 때, RNA-함유 프로브는 상기에 언급된 하나의 뉴클레오티드로서 SNP가 야기될 것 같은 게놈 분석 등에 의해 추정되는 뉴클레오티드 또는 공개된 공공 데이터베이스에서 서술된 SNP의 위치에서 뉴클레오티드를 이용함으로써 설계될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 핵산의 서열이라면 특별하게 제한되지 않고 바람직하게는 DNA 서열이다. 게다가, 뉴클레오티드 서열에서 이러한 뉴클레오티드의 위치는 하나 이상의 일 위치에 존재할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드가 하나 이상의 위치에 존재하는 경우에, 하나 이상의 위치의 각각에서의 위치는 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계하기 위한 본 발명의 방법에서 하나의 뉴클레오티드의 위치로서 사용된다. 또한, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보는 어떤 뉴클레오티드 서열 및 뉴클레오티드 서열에서 하나의 뉴클레오티드의 위치, 또는 다양한 개방된 데이터베이스로부터 획득된 뉴클레오티드 서열 및 뉴클레오티드 서열에서 하나의 뉴클레오티드의 위치일 수 있다.

하기에 설정된 조건들을 충족시키는 서열의 세트(set)는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여 생성된다:

(a) 하나의 퓨린 뉴클레오티드는 RNA이고, 다른 것들은 DNA들이다;

(b) 검출될 표적 핵산 또는 이의 상보적 스트랜드로부터 파생된 뉴클레오티드 서열은 7 내지 14 뉴클레오티드들을 갖는다;

(c) (a)에서 개진된 RNA 뉴클레오티드는 3' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치, 또는 대안적으로 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에 위치된다.

(d) Tm 값은 25 내지 40℃의 범위에서 존재한다.

뉴클레오티드의 위치가 하나 이상의 위치에 존재하는 경우에, 서열들의 세트는 하나 이상의 위치에서 뉴클레오티드들의 각각의 위치에 대하여 생성된다.

상기에 서술된 바와 같이 서열의 세트가 생성될 때, 바람직하게는 하기에 설정된 추가 조건들이 적용된다:

(e) 조건 (a)에서, RNA로서 설정된 퓨린 뉴클레오티드부터 5' 측 상의 2개의 뉴클레오티드들까지 범위에 있는(즉, 총 3개의 뉴클레오티드들을 갖는) 서열에 상보적 서열, 또는 5' 측 상의 1개의 뉴클레오티드부터 RNA로서 설정된 퓨린 뉴클레오티드의 3' 측 상의 1개의 뉴클레오티드까지 범위에 있는(즉, 총 3개의 뉴클레오티드들을 갖는) 서열에 상보적 서열이 프로브에 존재한다면, 이어서 이러한 서열은 서열들의 세트로부터 제외된다; 그리고

(f) 넷 이상의 뉴클레오티드들의 상보적 부분을 갖는 역반복 뉴클레오티드 서열(회귀성 서열)을 포함하는 서열은 서열들의 세트로부터 제외된다.

게다가, 서열들의 세트가 생성될 때, 프로브들은 상기에 언급된 조건들, 조건들 (a) 및 (c)가 이어지는 조건들의 세트들 중 어느 하나에서 서술된 바와 같은지에 따라, 하기에 설정된 기준에 따라 정렬되는 것이 바람직할 수 있다. 하기에 서술된 우선순위 1 내지 6에서, 수치값이 낮을수록, 우선순위의 순서가 높다는 것이 의미된다. 하기에 서술된 바와 같은 "목표 핵산에서 하나의 뉴클레오티드"는 표적 뉴클레오티드를 나타내고 또한 이어지는 우선순위에서 "하나의 뉴클레오티드"라 일컬어진다.

1. 표적 핵산에서 하나의 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드이고 하나의 뉴클레오티드의 3' 측 및 5' 측의 각각에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인 경우에:

우선순위 1:

(a) 하나의 뉴클레오티드는 RNA이고 다른 것들은 DNA들이다; 그리고

(c) (a)에서 비롯된 RNA 뉴클레오티드는 3' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에 위치된다.

우선순위 2:

(a) 하나의 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드는 RNA이고 다른 것들은 DNA들이다; 그리고

우선순위 3:

(c) (a)에서 비롯된 RNA 뉴클레오티드는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에 위치된다.

우선순위 4:

2. 표적 핵산에서 하나의 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드이고, 하나의 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드이며, 하나의 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드인 경우에:

우선순위 1:

우선순위 2:

우선순위 3:

(a) 하나의 뉴클레오티드에 대응하는 상보적 스트랜드(안티센스(antisense) 스트랜드)에서 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드는 RNA이고 다른 것들은 DNA들이다; 그리고

우선순위 4:

우선순위 5:

우선순위 6:

(a) 하나의 뉴클레오티드에 대응하는 안티센스 스트랜드에서 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드는 RNA이고 다른 것들은 DNA들이다; 그리고

3. 표적 핵산에서 하나의 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드이고, 하나의 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드이며, 하나의 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인 경우에:

우선순위 1:

우선순위 2:

4. 표적 핵산에서 하나의 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드이고, 하나의 뉴클레오티드의 3' 측 및 5' 측의 각각에 인접한 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드인 경우에:

우선순위 1:

우선순위 2:

우선순위 3:

우선순위 4:

5. 표적 핵산에서 하나의 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드이고, 하나의 뉴클레오티드의 3' 측 및 5' 측의 각각에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인 경우에:

우선순위 1:

(a) 하나의 뉴클레오티드에 대응하는 안티센스 스트랜드에서 뉴클레오티드는 RNA이고 다른 것들은 DNA들이다; 그리고

우선순위 2:

우선순위 3:

우선순위 4:

6. 표적 핵산에서 하나의 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드이고, 하나의 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드이며, 하나의 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드인 경우에:

우선순위 1:

우선순위 2:

우선순위 3:

우선순위 4:

우선순위 5:

우선순위 6:

7. 표적 핵산에서 하나의 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드이고, 하나의 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드이며, 하나의 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인 경우에:

우선순위 1:

우선순위 2:

8. 표적 핵산에서 하나의 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드이고, 하나의 뉴클레오티드의 3' 측 및 5' 측의 각각에 인접한 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드인 경우에:

우선순위 1:

우선순위 2:

우선순위 3:

우선순위 4:

또한 상기에 서술된 바와 같은 설계 방법에 의해 획득된 RNA-함유 프로브가 표적 핵산을 검출하는 데에 사용되는 방법이 본 출원에 포함된다. 예를 들어, 상기에 언급된 방법에 의해 설계된 높은 우선순위를 갖는 RNA-함유 프로브 서열은 알려진 방법에 의해 합성된다. 합성된 RNA-함유 프로브는 샘플에서 핵산으로 잡종화가 가해질 수 있고, 이어서 리보뉴클레아제로의 처리가 이어져 프로브가 리보뉴클레아제로 절단되는지 아닌지를 검사하며, 이에 의해 샘플에서 핵산을 검출할 수 있다. 프로브가 절단되었는지 아닌지를 검사하기 위한 절차는 특별하게 제한되지 않고, 핵산 분석을 위한 알려진 절차가 사용될 수 있다. 예를 들어, 전기영동법 또는 고성능 액체크로마토그래피 방법이 스트랜드 길이에 있어 변화로부터 프로브의 절단을 검출하는 데에 사용될 수 있다. 특히 바람직한 양상은, 예를 들어, RNA-함유 프로브가 2개의 물질, 형광 물질 및 형광 물질에 의해 방출된 형광을 소광하는(quenching) 작용을 갖는 물질로 표식된(labeled) 것을 포함하되, 이런 물질들은 프로브 내의 RNA 뉴클레오티드의 각 측에서 적절한 거리로 위치된다. 이러한 RNA-함유 프로브는 프로브가 온전한 조건들에서 형광을 거의 방출하지 않을 것이나, 프로브가 절단되고 형광물질과 소광 물질 사이의 거리가 커질 때 형광을 생성시킬 것이다. 이러한 RNA-함유 프로브를 설계하는 것은 반응 하에서 반응 용액으로부터 방출된 형광을 관찰함으로써 표적 핵산을 검출하는 것을 가능하게 한다. 다양한 형광 물질 및 소광 물질은 알려지고 이들 중 많은 것들이 이미 상업적으로 이용가능하다. 본 발명에서, 본 발명에 의해 설계된 RNA-함유 프로브를 이용한 표적 핵산의 검출은 특정 뉴클레오티드의 검출 또는 특정 뉴클레오티드가 존재하는지 아닌지의 검출, 특히 야기되어 왔던 단일 뉴클레오티드 치환의 결과로서 표적 핵산에서 생성하는 뉴클레오티드의 존재의 검출, 또는 일반적으로 발견되지만 야기되어 왔던 단일 뉴클레오티드 치환의 경우에 다른 뉴클레오티드로 치환되어 왔던 뉴클레오티드의 부재의 검출을 위한 방법으로서 실시될 수 있다.

본 발명에 따른 (또한 뉴클레오티드 서열 처리 방법이라 일컫는) 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 방법은 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계하기 위한 상기에 언급된 방법에 기초하여, 우선 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보를 획득하는 단계(S1), 획득된 뉴클레오티드 서열 정보를 확인하는 단계(S2) 및 RNA-함유 프로브를 설계하는 단계(S3)를 포함한다(도 1). 이러한 프로브를 설계하는 단계(S3)는 상기에 언급된 조건 (a) 내지 (d)를 순차적으로 처리하는 단계를 포함한다. 또한, 바람직하게는 상기에 언급된 조건 (e) 및 (f)를 처리하는 단계가 포함된다.

더 상세하게 서술될 것인 바와 같이, RNA-함유 프로브를 설계하는 단계는:

결정이 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 뉴클레오티드 서열 정보에서 하나의 뉴클레오티드, 하나의 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 서열 정보에서 하나의 뉴클레오티드에 대응하는 상보적 스트랜드에서 뉴클레오티드, 및 상보적 스트랜드에서 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대하여 이루어지는, 뉴클레오티드를 결정하는 단계;

퓨린 뉴클레오티드들 중 하나가 RNA로서 설정되고 다른 것들이 DNA들로서 설정되는, 뉴클레오티드 정보를 생성하는 단계;

검출될 표적 핵산 또는 이의 상보적 스트랜드로부터 파생된 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14로 설정되고, 이에 의해 부분 뉴클레오티드 서열에 대한 정보를 생성시키는, 부분 뉴클레오티드 서열을 생성시키는 단계;

부분 뉴클레오티드 서열에 대한 정보에 기초하여, RNA 뉴클레오티드가 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치되는 뉴클레오티드 서열이 선택되는, 뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계;

특정 뉴클레오티드를 포함하는 서열이 선택되고, 뉴클레오티드 서열 선택 단계에 의해 획득된 뉴클레오티드 서열의 Tm 값이 25 내지 40 ℃의 범위에서 존재하는, 특정-뉴클레오티드-함유 서열을 선택하는 단계로 이루어진다.

표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보를 획득하는 단계는 획득된 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 공개된 공공 데이터베이스로부터 더 상세한 정보를 획득하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 또한, 획득된 뉴클레오티드 서열 정보를 확인하는 단계는 획득된 뉴클레오티드 서열 정보를 공개된 공공 데이터베이스로부터 획득된 정보와 비교하고 확인하는 추가 단계를 포함할 수 있다.

게다가, 본 발명에 의해 설계된 RNA-함유 프로브가 잡종화시키는 표적 핵산에서 영역을 증폭시킬 수 있는 한 쌍의 프라이머(primer)들을 설계하는 단계(S4)(도 2 또는 도 3)가 추가될 수 있다. 또한, 각 프로브들을 위하여 설계된 한 쌍의 프라이머들 및 상기에 언급된 단계들에서 제공된 RNA-함유 프로브들의 세트의 목록을 작성하는 단계(S5)가 또한 추가될 수 있다. 이러한 한 쌍의 프라이머들을 설계하는 단계에서 프라이머 쌍을 설계하기 위한 방법은 특별하게 제한되지 않고, 알려진 방법들이 표적 핵산에서 RNA-함유 프로브 서열이 잡종화시키는 영역이 증폭될 수 있는 이러한 한 쌍의 프라이머들을 설계하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 한 쌍의 프라이머들은 핵산의 증폭을 위한 알려진 방법들, 예컨대 PCR, ICAN, 및 LAMP 방법으로 사용될 수 있는 어떤 하나일 수 있다. 이에 따라 설계된 프라이머들을 이용하여 샘플에서 표적 핵산으로부터 파생된 DNA 프라그먼트(fragment)의 증폭 및 표적 핵산을 검출하기 위한 본 발명의 방법이 조합될 수 있어, 관심의 유전자에서 단일 뉴클레오티드 치환 또는 특정 뉴클레오티드의 존재 또는 부재가 작은 양의 샘플에서 높은 감수성으로 검출될 수 있다.

본 발명에서, RNA-함유 프로브는 또한 핵산의 증폭을 위한 알려진 방법에서 사용가능한 손쉽게 설계되어 왔던 한 쌍의 프라이머들로 증폭되는 DNA 서열에서 설계될 수 있다. 이런 경우에, 증폭되는 DNA 서열에서 하나의 뉴클레오티드는 본 발명에서 "하나의 뉴클레오티드"로서 설정될 수 있고, 이에 의해 본 발명에 따른 방법에 의한 RNA-함유 프로브를 설계하여, 프로브는 높은 감수성으로 증폭된 서열을 검출하는 데에 사용될 수 있다.

컴퓨터가 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법을 실행하도록 하는 프로그램들은 상기에 서술된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 처리 방법의 단계드를 실시할 수 있는 어떤 것들일 수 있고, 예를 들어, 루비, 펄, 파이썬, C, C++, 자바® 등으로 작성된 것들을 포함할 수 있다.

이에 기록된 프로그램을 갖는 컴퓨터 판독가능한 기록 매체는 예를 들어, 광학 디스크들 예컨대 컴팩트 디스크(CD), 디지털 다기능 디스크(DVD), 블루레이 디스크(BL) 등, 플래시 메모리, 하드 디스크 및 다른 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 컴퓨터에 의해 판독가능한 어떤 매체가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 (또한 뉴클레오티드 서열 처리 장치라 일컫는) 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 장치는 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계하기 위한 상기에 언급된 방법에 기초하여, 검출될 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보를 우선 획득하기 위한 수단, 획득된 뉴클레오티드 서열 정보를 확인하기 위한 수단, 및 RNA-함유 프로브를 설계하기 위한 수단을 포함한다. 이러한 프로브를 설계하기 위한 수단은 상기에 언급된 조건 (a) 내지 (d)를 순차적으로 처리하기 위한 수단을 포함한다. 또한, 바람직하게는 상기에 언급된 조건 (e) 및 (f)를 처리하기 위한 수단이 포함된다.

더 상세하게 서술될 것인 바와 같이, RNA-함유 프로브를 설계하는 수단은:

결정이 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보에서 하나의 뉴클레오티드, 하나의 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드, 하나의 뉴클레오티드에 대응하는 표적 핵산의 상보적 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드, 및 상보적 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대하여 이루어지는, 뉴클레오티드를 결정하기 위한 수단;

퓨린 뉴클레오티드들 중 하나가 RNA로서 설정되고 다른 것들이 DNA들로서 설정되는, 뉴클레오티드 정보를 생성하기 위한 수단;

검출될 표적 핵산 또는 이의 상보적 스트랜드로부터 파생된 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14로 설정되고, 이에 의해 부분 뉴클레오티드 서열에 대한 정보를 생성시키는, 부분 뉴클레오티드 서열을 생성시키기 위한 수단;

RNA 뉴클레오티드가 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치되는 뉴클레오티드 서열이 부분 뉴클레오티드 서열에 대한 정보에 기초하여 선택되는, 뉴클레오티드 서열을 선택하기 위한 수단;

특정 뉴클레오티드를 포함하는 서열이 선택되고, 뉴클레오티드 서열 선택 단계에 의해 획득된 뉴클레오티드 서열의 Tm 값이 25 내지 40 ℃의 범위에서 존재하는, 특정-뉴클레오티드-함유 서열을 선택하기 위한 수단으로 이루어진다.

표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보를 획득하기 위한 수단은 획득된 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 공개된 공공 데이터베이스로부터 더 상세한 정보를 획득하기 위한 추가 수단을 포함할 수 있다. 또한, 획득된 뉴클레오티드 서열 정보를 확인하기 위한 수단은 획득된 뉴클레오티드 서열 정보를 공개된 공공 데이터베이스로부터 획득된 정보와 비교하고 확인하기 위한 추가 수단을 포함할 수 있다. 게다가, 상기에 언급된 수단은 비표적 핵산에 대한 설계된 RNA-함유 프로브의 잡종화의 가능성을 평가하기 위한 추가 수단을 포함할 수 있다.

게다가, 본 발명에 의해 설계된 RNA-함유 프로브가 잡종화시키는 표적 핵산에서 영역을 증폭시킬 수 있는 한 쌍의 프라이머들을 설계하기 위한 수단이 추가될 수 있다. 또한, 각 프로브들을 위하여 설계된 한 쌍의 프라이머들 및 상기에 언급된 수단에 제공된 RNA-함유 프로브들의 세트의 목록을 작성하기 위한 수단이 또한 추가될 수 있다. 여기서, 이러한 프라이머들은 핵산의 증폭을 위한 알려진 방법, 예컨대 PCR, ICAN, 및 LAMP 방법으로 사용될 수 있는 어떤 하나일 수 있다. 이에 따라 설계된 프라이머들을 이용하여 샘플에서 표적 핵산으로부터 파생된 DNA 프라그먼트의 증폭 및 표적 핵산을 검출하기 위한 본 발명의 방법이 조합될 수 있어, 관심의 유전자에서 단일 뉴클레오티드 치환 또는 특정 뉴클레오티드의 존재 또는 부재가 작은 양의 샘플에서 높은 감수성으로 검출될 수 있다.

본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 장치는 독립적인 방식으로 전체적인 처리를 수행하는 장치, 또는 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 시스템일 수 있되, 정보는 뉴클레오티드 서열 처리 장치와, 네트워크를 통해 뉴클레오티드 서열 처리 장치와 통신할 수 있는 상태로 뉴클레오티드 서열 처리 장치에 연결되는 클라이언트 장치 사이에서 통신된다. 전자에서, 예를 들어, 본 발명에 따른 프로그램은 프로그램을 실행할 수 있는 상태로 컴퓨터의 하드 디스크에 기록되거나 설치될 수 있고, 이에 의해 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 장치로서 컴퓨터를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프로그램은 프로그램을 실행할 수 있는 상태로, 외부 매체 예컨대, 광학 디스크 또는 플래시 메모리에 기록되거나 설치될 수 있으며, 외부 매체는 컴퓨터에 연결되고, 이에 의해 컴퓨터의 하드 디스크에 프로그램을 기록하거나 설치하지 않고, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리를 수행할 수 있는 장치를 구성할 수 있다. 후자에서, 예를 들어, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 장치에 클라이언트 장치를 통해 전송될 수 있고 뉴클레오티드 서열 처리 장치에 의해 획득된, 프라이머 쌍들을 설계하기 위한 정보 및 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브에 대한 정보는, PC 통신 또는 네트워크 예컨대 인트라넷 또는 인터넷을 경유한 클라이언트 장치를 통해 수신될 수 있다. 대안적으로, 이런 정보는 클라이언트 장치에 의한 요청에 따라, 선택되고 수신될 수 있다. 장치가 어디에 위치되는지 등에 관계없이, 이런 시스템은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 장치를 사용하는 것을 허용할 것이고, 이에 따라 유용할 수 있다. 게다가, 클라이언트 장치를 통해 손쉽게 이용가능한 뉴클레오티드 서열 처리 장치를 만들기 위하여, 시스템은 정보가 웹 스크린(web screen)을 통해 전송되고 수신될 수 있도록 구성된다는 것이 명백하다.

리보뉴클레아제 H 및 본 발명에 따라 설계된 RNA-함유 프로브는 단일 반응에서 표적 핵산의 증폭 및 검출을 수행하는 것을 가능하게 하면서, 핵산의 증폭을 위한 반응 용액에 첨가될 수 있다. 본 발명에 따라 설계된 RNA-함유 프로브는 PCR에 의한 표적 핵산의 프라그먼트를 증폭시키기 위한 반응 및 내열성 리보뉴클레아제 H로 프로브를 절단하기 위한 반응이 동시에 실시되는 검출 시스템에 특히 적절하다. 신호, 예를 들어, 형광이 상기에 서술된 바와 같은 프로브의 절단으로 생성되도록 표식된 RNA-함유 프로브는 이런 양상에서 적절하고, 신호 검출 시스템으로 장착된 핵산 증폭 장치와 조합하여 단일 뉴클레오티드 치환 또는 표적 핵산의 신속한 검출을 위한 시스템을 구성하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명에 따라, RNA-함유 프로브는 표적 핵산 또는 표적 핵산에서 SNP를 검출하는 데에 유용하게 제조될 수 있고, 프로브와 조합될 수 있는 표적 핵산의 프라그먼트를 증폭시키기 위한 한 쌍의 프라이머들이 또한 제공된다. 상기에 서술된 바와 같은 RNA-함유 프로브 및 프라이머들은 양호한 감수성으로 표적 핵산 또는 SNP를 검출하기 위한 키트들 또는 시약의 성분일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 표적 핵산 또는 단일 뉴클레오티드 치환의 검출을 위한 감지 시스템이 또한 제공된다.

본 발명의 특정 구체예들이 도 19 내지 도 32에 기초하여 서술될 것이다.

도 19는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 장치(10)를 도시한다. 뉴클레오티드 서열 처리 장치(10)는:

(a) 뉴클레오티드 서열 처리 장치(10)의 처리 및 조작을 연산하고 제어하기 위한 컴퓨터의 CPU(central processing unit; 중앙처리장치)(20);

(b) 기본 컴퓨터 프로그램, 예컨대 조작 프로그램, 및 프로그램들을 실행하는 데에 필요한 데이터를 저장하기 위한 ROM(read-only memory; 읽기용 메모리);

(c) CPU(20)의 워킹 메모리(working memory)로서 작용하고 일시적으로 화상 처리에 필요한 데이터 및 파라미터들을 저장하기 위한 RAM(random-access memory; 임의 추출 메모리);

(d) 도 20에 도시된 다양한 종류의 데이터를 저장하기 위하여, 예를 들어, 하드 디스크 메모리로서 구성된 데이터 메모리(23);

(e) CD-ROM 드라이브 장치(45)로 입력된 도 21 내지 도 25에 도시된 공정들을 위한 프로그램들을 저장하기 위하여, 예를 들어, 하드 디스크 메모리로서, 구성된 프로그램 메모리(24);

(f) 유전자 데이터베이스 데이터가 인터넷(50)을 통해 유전자 데이터베이스 서버에 전송되고 유전자 데이터베이스 서버로부터 수신되도록 하기 위하여, 통신 터미널 장치(46)에 연결된 통신 인터페이스(36);

(g) 키보드(41)를 통해 입력된 데이터 및 지시 명령을 수신하고, 인터페이스 처리, 예컨대 규정된 신호 변환을 수행하며, 이들을 CPU(20)에 이송시키기 위하여, 주어진 데이터 및 지시 명령이 입력되는 키보드(41)에 연결되는 키보드 인터페이스(31);

(h) 마우스(42)를 통해 입력된 데이터 및 지시 명령을 수신하고, 인터페이스 처리, 예컨대 규정된 신호 변환을 수행하며, 이들을 CPU(20)에 이송시키기 위하여, 지시 명령이 CRT 디스플레이(43)에 입력되는 마우스(42)에 연결되는 키보드 인터페이스(32);

(i) 디스플레이될 화상 데이터를 CRT 디스플레이(43)를 위한 화상 신호로 변환하고 화상 신호를 CRT 디스플레이(43) 상에 출력하고 디스플레이하기 위하여, 스크린들을 설정하고 지시하는, CPU(20) 및 다른 것들에 의해 처리된 출력 데이터를 디스플레이하는 CRT 디스플레이(43)에 연결되는 디스플레이 인터페이스(33);

(j) 인쇄될 인쇄 데이터 등의 규정된 신호 변환을 수행하고 데이터를 인쇄하기 위한 프린터(44)에 데이터를 출력하기 위하여, CPU(20) 및 다른 것들에 의해 처리된 출력 데이터가 인쇄되는 프린터(44)에 연결된 프린터 인터페이스(34);

(k) 규정된 신호 변환을 수행하고 판독 화상-처리 프로그램 등의 프로그램 데이터를 프로그램 메모리(24)에 이송시키기 위하여, 이에 기록된 프로그램들을 갖는 CD-ROM(45a)으로부터 상기에 언급된 공정을 위한 프로그램들의 프로그램 데이터를 판독하는 CD-ROM 드라이브 장치(45)에 연결된 드라이브 장치 인터페이스(35)를 포함하되;

이런 회로들(20 내지 24, 31 내지 36)은 버스(bus)(30)를 통해 연결된다.

도 20은 도 19에 도시된 데이터 메모리(23)의 내부 구조를 나타내는 블록 다이어그램을 도시한다. 도 20에 도시된 바와 같이, 데이터 메모리(23)는:

(1) 상보적 뉴클레오티드 서열을 생성시키는 데에 사용되는 레퍼런스 테이블(71);

(2) RNA 위치를 결정하는 데에 사용되는 레퍼런스 테이블(72);

(3) 퓨린 뉴클레오티드를 결정하는 데에 사용되는 레퍼런스 테이블(73);

(4) 우선순위를 결정하는 데에 사용되는 레퍼런스 테이블들(74 내지 76);

(5) 25℃≤ Tm 값 ≤ 40℃인지 아닌지에 대하여 결정하는 데에 사용되는 레퍼런스 테이블(77); 및

(6) 프라이머 서열 및 부분 뉴클레오티드 서열에 대한 출력 정보의 레퍼런스 테이블(78)을 저장한다.

테이블들(71 내지 78)은 도 27 내지 도 32에 도시된다.

도 19에 도시된 장치는 도 21에 도시된 흐름도에 나타난 처리 단계들을 수행한다. 도 21에서 ST1는 표적 뉴클레오티드를 서술하는 정보 및 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 입력하는 처리 단계이다. 입력될 문자열(string)은 문자열 K(숫자 x, 문자열 J, 기호 i)이다(도 26에 도시된 테이블(70)을 참조). 문자열 J는 A, T, G, 또는 C 중 어느 문자로 구성된 일차원 문자열이다. 문자열 J는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 대응한다. 문자열 J의 좌측은 뉴클레오티드 서열의 5' 측을 나타내고 우측은 뉴클레오티드 서열의 3' 측을 나타낸다. 숫자 x는 자연수이다. 숫자 x는 표적 뉴클레오티드를 나타낸다. 문자열 J의 좌측 말단으로부터 x번째 위치에 위치된 문자는 표적 뉴클레오티드를 나타낸다. 기호 i는 문자열 K가 입력되어 왔던 뉴클레오티드 서열이라는 것을 나타낸다. 기호 i는 문자열 K에 의해 표시된 뉴클레오티드 서열을 ST2에서 생성되는 뉴클레오티드 서열과 비교하기 위한 것이다.

ST2는 표적 핵산의 상보적 뉴클레오티드 서열을 생성시키는 처리 단계이다. ST2는 문자열 M(숫자 x, 문자열 L, 기호 c)을 생성한다(도 26에 도시된 테이블(70) 참조). 숫자 x는 문자열 K에서의 숫자 x와 동일하다. 문자열 L은 도 27에서 테이블(71)에 기초하여, 문자열 J로부터 생성된다. 문자열 L을 구성하는 문자들의 각각은 좌측부터 우측까지 문자열 J을 판독하고 좌측부터 우측까지 판독된 문자열 J를 재배열함으로써 획득된 문자열을 구성하는 문자들의 각각으로 도 27에서의 테이블(71)에서 나타난 상관관계를 갖는다. 기호 c는 문자열 L이 상보적 뉴클레오티드 서열인 것을 나타낸다.

ST3는 우선순위의 순서 및 RNA 위치를 결정하는 처리 단계이다. ST3는 도 22에 도시된 흐름도에 따라 수행된다. 도 22에 도시된 흐름도는 결정하기 위한 처리 단계들 ST11 내지 ST17 및 정보를 생성시키기 위한 처리 단계들 ST18 내지 ST25로 구성된다.

결정하기 위한 처리 단계들 ST11 내지 ST17은 도 29에서 테이블(73)에 따라 수행된다. ST11에서, 예(Yes)의 결정은 문자열 J의 좌측부터 x번째 위치에서 문자가 A 또는 G일 때 이루어진다. 한편, 문자열 J에서 동일한 위치에서 문자가 T 또는 C일 때 아니오(No)의 결정이 이루어진다. ST12 및 ST13에서, 유사한 결정이 문자열 J의 좌측부터 (x+1)번째 위치에서의 문자에 대하여 이루어진다. ST14 내지 ST17에서, 유사한 결정이 문자열 J의 좌측부터 (x-1)번째 위치에서의 문자에 대하여 이루어진다.

처리 단계들 ST18 내지 ST25은 ST11 내지 ST17에서의 결정의 결과에 따라, 수행된다. 처리 단계들 ST18 내지 ST25에서, 3개의 문자들로 이루어진 문자열 N(기호 i 또는 c, 숫자 y, 기호 z)이 생성된다(도 26에 도시된 테이블(70)). 특히, 도 28에서의 테이블(72)에 나타난 문자열 N은, 각각, ST18 내지 ST25에서 처리 h1 내지 처리 h8에 따라, 생성된다.

문자열 N에서 좌측부터 1번째 문자인, 기호 i 또는 c는, RNA 위치가 위치되는 뉴클레오티드 서열을 나타내는 기호이다. 기호 i는 RNA 위치가 ST1에서 입력되어 왔던 뉴클레오티드 서열에 위치되는 것을 나타낸다. 기호 c는 RNA 위치가 ST2에서 입력되어 왔던 뉴클레오티드 서열에 위치되는 것을 나타낸다.

문자열 N에서 좌측부터 2번째 문자인, 숫자 y는 숫자 x 또는 (x+1)이고 RNA 위치를 식별하기 위한 숫자이다. 숫자 y는 좌측 말단으로부터 y번째 위치가 RNA 위치인 것을 나타낸다.

문자열 N에서 좌측부터 3번째 문자인, 기호 z는 α, β 및 γ로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 기호 z는 우선순위의 순서를 나타내기 위한 문자이다. 문자 α는 우선순위의 가장 높은 순서를 나타내고, 내림차순으로 β 및 γ가 이어진다. 생성된 문자열 N은 데이터 메모리(23)에서 일시적으로 저장된다.

ST4는 말단으로부터 3 내지 5 뉴클레오티드들 사이의 위치가 RNA 위치인 7 내지 14개의 뉴클레오티드들을 갖는 부분 뉴클레오티드 서열을 서술하는 정보를 생성시키기 위한 처리 단계이다. 처리는 도 23에 도시된 흐름도에 따라 실시된다.

도 23에 도시된 흐름도는 처리 단계들 ST31, ST32 및 ST33로 이루어진다.

처리 단계 ST31은 5' 말단으로부터 3 내지 5 뉴클레오티드들 사이의 위치가 RNA 위치인 부분 뉴클레오티드 서열을 서술하는 정보를 생성시키기 위한 처리 단계이다. 처리 단계 ST31은 도 24에 도시된 흐름도에 따라 수행된다.

도 24에 도시된 흐름도에서 ST41는 문자열 K, 문자열 M 및 문자열 N을 판독하는 처리 단계이다.

ST42, ST43, ST45, ST46, ST47 및 ST48에서, 프로브 5'-터미널(terminal) 위치, 프로브 크기 및 RNA 위치 각각은 자연수이다. RNA 위치는 문자열 N에서 숫자 y에 의해 나타낸다. 프로브 5'-터미널 위치는 숫자 a로서 정의되고, 프로브 크기는 숫자 b로서 정의된다.

ST44는 문자열 P(문자열 O, 숫자 y, 기호 z, 기호 ST31)를 생성시키는 처리 단계이다. ST44에서 생성시키는 공정에서, 레퍼런스는 우선 ST42에서 레퍼런스된 숫자 y가 파생된 문자열 N에서 좌측부터 1번째 문자로 이루어진다. 1번째 문자가 기호 i일 때, 문자열 J에서 좌측 말단으fh부터 a번째 문자부터 (a+b-1)번째 문자까지 범위에 있는 문자들이 판독된다. 좌측부터 우측까지 판독 문자들의 문자열을 재배열함으로써 생성된 문자열은 문자열 O이다. 문자열 N에서 좌측부터 1번째 문자가 기호 c일 때, 문자열 J 대신에 문자열 L이 사용된다는 점을 제외하고는, 유사한 방법으로 처리가 실시된다. 문자열 P에서 숫자 y 및 기호 z가 레퍼런스가 이루어져 왔던 문자열 N에서 숫자 y 및 기호 z와 동일하다. 문자열 P에서 기호 ST31는 추후에 실시되는 ST33에서 우선순위의 순서를 생성시키는 처리 단계의 목적을 위한 것이다. 생성된 문자열 P는 데이터 메모리(23)에 일시적으로 저장된다.

도 23에 도시된 흐름도에서 처리 단계 ST32는 3' 말단으로부터 3 내지 5 뉴클레오티드들 사이의 위치가 RNA 위치인 부분 뉴클레오티드 서열을 서술하는 정보를 생성시키기 위한 처리 단계이다. 처리 단계 ST32는 도 25에 도시된 흐름도에 따라 수행된다. 도 25에 도시된 흐름도는 3'-터미널 위치를 나타내는 숫자가 사용된다는 점을 제외하고는, 도 24에 도시된 흐름도와 유사하다. 처리 단계 ST32는 처리 단계 ST31과 유사한 방법으로 문자열 Q(문자열 O, 숫자 y, 기호 z, 기호 ST32)를 생성시킨다(도 26에 도시된 테이블(70)을 참조). 문자열 Q에서 기호 ST32는 추후에 실시되는 ST33에서 우선순위의 순서에 대하여 정보를 생성시키기 위한 것이다.

도 23에 도시된 흐름도에서 처리 단계 ST33은 부분 뉴클레오티드 서열을 위한 우선순위의 순서에 대한 정보를 생성시키는 처리 단계이다. 우선, 데이터 메모리(23)에 일시적으로 저장되는 문자열 P(문자열 O, 숫자 y, 기호 z, 기호 ST31), 및 문자열 Q(문자열 O, 숫자 y, 기호 z, 기호 ST32)가 ST31 및 ST32에 의해 판독된다. 판독되어 왔던 문자열 Q 및 문자열 P에서 기호 ST32 또는 기호 ST31 및 기호 z에 기초하여, 기호 r은 도 30에서 테이블들(74 내지 76)에 따라 결정된다. 따라서, 도 30에서의 테이블들(74 내지 76)에 나타난 숫자들(1 내지 6)의 어느 숫자는 기호 z가 α, β, 또는 γ중 어느 하나인지 및 기호가 ST31 또는 ST32인지에 기초하여, 기호 r로서 생성된다. 기호 r은 생성되어 왔던 부분 뉴클레오티드 서열을 위한 우선순위의 순서를 나타내는 기호이다. 기호 r은 자연수 1 내지 6 중 어느 하나이다. 여기서, 1은 우선순위의 순서에서 가장 높은 것을 의미하고, 우선순위의 내림차순으로 2, 3, 4, 5 및 6이 이어진다. 기호 r 및 판독된 문자열 P 및 문자열 Q는 문자열 R(문자열 O, 숫자 y, 기호 r)을 생성시키는 데에 사용된다(도 26에 도시된 테이블(70)을 참조). 생성된 문자열 R은 데이터 메모리(23)에 일시적으로 저장된다.

ST5는 Tm 값에 기초하여 결정하는 처리 단계이다. 데이터 메모리(23)에 일시적으로 저장되는 모든 문자열 R들에 대하여, 각 Tm 값이 연산된다. 여기서, Tm 값은 최근린 방법(nearest-neighbor method)을 이용하고, 추가로 바이오케미스트리(Biochemistry), 36권, 34호, 10581쪽 내지 10594쪽(1997)에서 연산된 방법으로, 50mM의 염 농도 및 500nM의 DNA 농도를 갖는 조건들 하에서 연산된다. 연산된 Tm 값을 이용하여, 결정이 도 31에서 테이블(77)에 기초하여 이루어진다. 만약 아니오의 결정이 이루어져 왔다면, 이어서 데이터 메모리(23)에 일시적으로 저장되는, 대응하는 문자열 R이 삭제된다.

ST6는 동일한 서열이 ST4에 의해 생성되어 왔던 문자열에 포함될 때, 이런 문자열 O를 포함하는 문자열 R이 데이터 메모리(23)로부터 삭제되는 처리 단계이다. 문자열 O에서 좌측부터 (y-2)번째 위치부터 y번째 위치까지 범위에 있는 문자열 및 문자열 O에서 좌측부터 (y-1)번째 위치부터 (y+1)번째 위치까지 범위에 있는 문자열이 판독되며, 검색이 이런 판독된 문자열들이 문자열 O에 포함되는지 아닌지에 대하여 이루어진다. 만약 이런 문자열들이 문자열 O에 포함된다면, 이런 문자열 O를 포함하는 문자열 R은 데이터 메모리(23)로부터 삭제된다.

ST7은 문자열 O가 4개 이상의 문자들의 역반복 뉴클레오티드 서열(회귀성 서열)을 포함할 때, 이런 문자열 O를 포함하는 문자열 R이 데이터 메모리(23)로부터 삭제되는 처리 단계이다. 포함되는 회귀성 서열의 결정이 하기의 방법으로 이루어진다: 우선, 프로브의 서열은 seq로서 정의되고, 프로브의 스트랜드 길이는 n으로서 정의된다. 뉴클레오티드는 5' 말단부터 3' 말단까지, 0, 1, 2, ..., (n-1)로서 번호가 붙는다. 이런 정의 하에서, 하기에 서술된 바와 같은 방법이 수행된다. 따라서, 부분 서열의 시작 위치(i)는 0번째 위치부터 {(n-1) - (최소 표적 크기 × 2 - 1)}번째 위치까지 변하고, 이에 의해 부분 서열의 크기가 최소 표적 크기인 4bp부터, 가장 근접한 정수로 반올림된, (n-1)/2까지의 범위에 있는 부분 서열의 각 상보적 서열을 생성시킨다. 만약 생성된 상보적 서열이 부분 서열 시작 위치(i)부터 (i+ 부분 서열 크기)번째 위치까지 범위에 있는 서열과 동일하다면, 이어서 회귀성인 결정이 이루어진다. 프로그램으로서 이런 방법을 표현하는 실시예는 다음과 같다.

만약 회귀성인 결정이 상기에 언급된 결정에 의해 이루어진다면, 이런 문자열 O을 포함하는 문자열 R은 데이터 메모리(23)로부터 삭제된다.

ST8은 부분 뉴클레오티드 서열을 추출하는 처리 단계이다. 상기에 언급된 처리를 통한 삭제 없이 데이터 메모리(23)에 저장된 모든 문자열 R들은 데이터 메모리(23)로부터 판독된다. 판독된 문자열 R들 중에서, 우선순위의 순서를 나타내는 기호 r에서 가장 작은 숫자를 갖는 하나 이상의 문자열 R들이 추출된다.

ST9는 프라이머 서열을 설계하는 처리 단계이다. 프라이머들은 ST8에서 선택된 프로브의 서열과 호환가능하게 생성된다. 한 쌍의 이러한 프라이머들을 설계하는 단계에서 프라이머 쌍을 설계하기 위한 방법은 특별하게 제한되지 않고, 알려진 방법들이 표적 핵산에서 RNA-함유 프로브 서열이 잡종화시키는 영역이 증폭될 수 있는 이러한 한 쌍의 프라이머들을 설계하는 데에 사용될 수 있다.

ST10은 출력하는 처리 단계이다. 처리 단계 ST10에서, 도 32에 도시된 테이블(78)에서 정보는 ST8에서 추출된 문자열 R에 기초하여, CRT 디스플레이(43)에 출력된다. 좌측 말단으로부터 y번째 문자가 괄호() 안에 포함되는 문자열 O가 출력된다. 여기서, 괄호()는 괄호() 안의 문자의 위치가 RNA를 나타내는 것을 나타낸다.

본 발명에 포함되는 다른 양상들은 도 21에 도시된 흐름도에 기초하여 서술될 것이다.

ST1에서, 문자열 K는 도 19에 도시된 키보드(41) 또는 마우스(42)를 이용하여 입력될 수 있다. 또한 문자열 K는 인터넷(60)을 통해 유전자 데이터베이스 서버 유닛(60)으로부터 획득된 것을 입력함으로써 입력될 수 있다. 추가로 ST1에서, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 서술하는 정보가 입력될 수 있다. 따라서, ST2에 의해 생성될 문자열 M은 ST1에 입력될 수 있다. 이런 경우에, ST2는 생략된다.

우선순위의 순서를 나타내는 기호 z에 대한, ST3에서 생성된 문자열 N에서, 생성된 것이 생략될 수 있다. ST4에서, 우선순위를 생성시키기 위한 도 23에 도시된 처리 단계 ST33은 생략될 수 있다. 처리 단계들 ST6 및 ST7은 또한 생략될 수 있다.

프라이머들을 설계하기 위한 처리 단계 ST9은 또한 생략될 수 있다. 이런 경우에, 프로브 서열 또는 서열들만이 출력된다.

처리 단계들 ST5 내지 ST7은 이런 순서로 실시되지 않을 수 있다. 이런 처리 단계들의 순서는 필요한 대로 변경될 수 있다. 처리 단계들 ST5 내지 ST7 중 하나 이상은 ST4와 동시에 실시될 수 있다. 처리 단계들 ST5 내지 ST7에서, 데이터 메모리(23)에 저장되어 왔던 문자열 R들의 일부를 삭제하는 대신에, 무효 플래그(invalid flag)를 이용한 방법이 채택될 수 있다. 이런 경우에, ST8에서 추출 방법은 이에 따라 채택되어 왔던 방법으로 변경된다.

처리 단계 ST9가 처리 단계 ST8 이후에 실시될 수 있으면서, ST9는 가끔 처리 단계들 ST3 내지 ST7 중 어느 하나 이후에 실시된다.

상기의 구체예들에 기초하여 명확하게 서술되어 왔던 바와 같이, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 방법이 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3 내지 5 뉴클레오티드들 사이의 위치가 RNA 위치인 7개 내지 14개의 뉴클레오티드들을 갖는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성시키는 처리 단계 및 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값이 25 내지 40℃의 범위에서 존재하는지 아닌지에 대하여 결정하는 처리 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

더 바람직한 구체예들에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 표적 핵산에서 표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드, 및 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대하여 결정하는 처리 단계를 포함한다.

게다가, 더 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은:

표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드;

표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드;

표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드; 및

표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드의 위치를 RNA 위치로서 결정하는 처리 단계를 포함한다. 훨씬 더 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 결정의 처리 단계가 RNA 위치로서 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대하여 상기의 언급된 결정의 결과에 기초하여 실시하도록 수행된다.

훨씬 더 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법에서 표적 뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드 치환이 야기될 것 같은 뉴클레오티드이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 RNA 위치에 기초한 우선순위들에 따라 선택하는 단계를 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, RNA 위치에 기초한 우선순위들은: 높은 우선순위부터 낮은 우선순위로,

표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드;

표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드; 및

표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드에 적용된다. 게다가, 더 바람직한 구체예에서, RNA 위치에 기초한 우선순위들은: 높은 우선순위부터 낮은 우선순위로,

표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드;

표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드에 적용된다.

바람직한 구체예들에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 각 말단과 RNA 위치 사이의 상대적 위치에 기초한 우선순위들에 따라 선택하는 단계를 포함한다. 더 바람직한 구체예들에서, 각 말단과 RNA 위치 사이의 상대적인 위치에 기초한 우선순위들은, 높은 우선순위부터 낮은 우선순위로, 3' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이에 존재하는 RNA 위치, 및 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이에 존재하는 RNA 위치에 적용된다.

바람직한 구체예들에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 RNA 위치를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열이 뉴클레오티드 서열에 존재하는지 아닌지에 대하여 결정하는 처리 단계를 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 존재 또는 부재에 대하여 결정하는 것이 가해지는 서열은 5' 측 상에서 RNA 위치부터 2개의 뉴클레오티드들까지의 범위에 있는 서열에 상보적인 서열, 또는 RNA 위치의 5' 측 상의 하나의 뉴클레오티드부터 RNA 위치의 3' 측 상의 하나의 뉴클레오티드까지의 범위에 있는 서열에 상보적인 서열이다.

바람직한 구체예들에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 회귀성 서열이 뉴클레오티드 서열에 존재하는지 아닌지에 대하여 결정하는 처리 단계를 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 결정될 회귀성 서열은 4개 이상의 뉴클레오티드들을 갖는다.

바람직한 구체예들에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 생성된 프로브들의 부분 뉴클레오티드 서열에 대한 정보에 기초하여, 프라이머들의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 처리 단계를 포함한다.

상기에 서술된 바와 같은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 본 발명을 실행하기 위한 하드웨어 및 프로그램을 이용하여 실시될 수 있다. 여기서 본 발명의 방법을 실행하기 위한 프로그램은 컴퓨터-판독가능 기록 매체에 기록되어 왔던 것일 수 있다. 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 또한 상기에 서술된 바와 같이 뉴클레오티드 서열 처리 방법을 수행하기 위한 처리 장치를 이용하여 실시될 수 있다. 바람직한 구체예들에서, 본 발명에 따른 처리 장치는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법을 실시하기 위한 수단을 갖고, 레퍼런스가 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법을 실시하는 데에 있어 이루어지는 테이블들이 데이터 메모리에 저장된다. 하지만, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 이런 방법을 이용한 것으로 제한되지 않고, 또한 예를 들어, 수동 작용에 의해 뉴클레오티드 서열을 처리하는 단계를 포함한다.

상기에 서술된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 처리 방법은 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 시스템으로 실시될 수 있되, 시스템은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법을 실행하기 위한 뉴클레오티드 서열 처리 장치; 및 네트워크를 통해 뉴클레오티드 서열 처리 장치와 통신가능한 상태로 뉴클레오티드 서열 처리 장치에 연결되는 클라이언트 장치를 포함한다. 바람직한 구체예들에서, 클라이언트 장치는 뉴클레오티드 서열 처리 장치에 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 정보를 전송하기 위한 수단 및 뉴클레오티드 서열 처리 장치로부터 전송된, 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브에 대한 표적 핵산에서 정보를 획득하기 위한 수단을 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 클라이언트 장치는 뉴클레오티드 서열 처리 장치로부터 전송된, 표적 핵산의 증폭을 위한 프라이머들에 대한 정보 및 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브에 대한 표적 핵산에서 정보를 획득하기 위한 수단을 포함한다.

상이한 양상에서, 본 발명은 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 방법을 제공하고, 방법은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법을 포함한다.

상이한 양상에서, 본 발명은 또한 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법을 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 프로브를 제조하기 위한 방법은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 처리 방법에 의해 결정된 것과 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 및 DNA를 함유한 핵산 프라그먼트를 마련하는 단계를 포함한다.

상이한 양상에서, 본 발명은 또한 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 수단을 제공하고, 방법은 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 이용하는 단계를 포함하되, 프로브는 본 발명에 따른 제조 방법에 의해 생성된다. 더 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법은 샘플에서 핵산에 대한 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 잡종화시키는 단계(여기서, 프로브는 본 발명에 따른 제조 방법에 의해 제조된다); 프로브에 리보뉴클레아제 H로 처리를 적용시키는 단계; 및 프로브가 리보뉴클레아제 H에 의해 절단되었는지 아닌지를 검출하는 단계를 포함한다.

실시예들

본 발명은 실시예들을 이용하여 하기에서 더 명확하게 서술될 것이나, 어떻게든지 하기의 실시예들의 범위로만 제한되도록 의도되지 않는다.

실시예 1

검사는 표적 핵산를 검출하기 위한 프로브에서 RNA 뉴클레오티드 및 검출되도록 요구되었던 표적 핵산에서 하나의 뉴클레오티드의 위치에서 상이함으로 인해 반응의 특이성에서 상이함으로 이루어졌다. 우선, 표적 핵산으로서, 서열 목록에서 SEQ ID NO:1에서 기술된 서열은 templet 1로서 사용되었다. 이어서, templet 1로 잡종화하는 프로브들 즉, templet 1을 검출하기 위한 프로브들로서, 하기의 프로브들이 하기에 서술된 실험에서 설정되었고 사용되었다:

5' 말단으로부터 7번째 뉴클레오티드(즉, 3' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드)가 (하기에서 probe central이라 불릴 수 있는; SEQ ID NO:2) RNA였던 프로브;

5' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드(즉, 3' 말단으로부터 9번째 뉴클레오티드)가 (하기에서 probe 5'-4mer라 불릴 수 있는; SEQ ID NO:3) RNA였던 프로브;

5' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드(즉, 3' 말단으로부터 10번째 뉴클레오티드)가 (하기에서 probe 5'-3mer라 불릴 수 있는; SEQ ID NO:4) RNA였던 프로브;

3' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드(즉, 5' 말단으로부터 9번째 뉴클레오티드)가 (하기에서 probe 3'-4mer라 불릴 수 있는; SEQ ID NO:5) RNA였던 프로브; 및

3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드(즉, 5' 말단으로부터 10번째 뉴클레오티드)가 (하기에서 probe 3'-3mer라 불릴 수 있는; SEQ ID NO:6) RNA였던 프로브.

(1) 프로브들에서 RNA 뉴클레오티드의 위치에서 상이함으로 인한 특이성에 있어 상이함의 검사:

templet 1에서 검출되도록 요구되었던 하나의 뉴클레오티드는 5' 말단으로부터 10번째 뉴클레오티드에서 설정되었다. 이런 10번째 뉴클레오티드에 대응하는 각 프로브들에서 뉴클레오티드는 RNA로서 설정되었다. 프로브들에서 RNA의 위치에서 상이함으로 인한 특이성에서 상이함을 검사하기 위하여, 표 1에 도시된 바와 같이 templet 1의 뉴클레오티드 서열에서 3개의 뉴클레오티드들의 서열들(nnn) 및 각 프로브들의 뉴클레오티드 서열에서 3개의 뉴클레오티드들의 서열들(mrm)이 설정되었고, templet 1 및 RNA-함유 프로브들은 모두 합성되었다. 합성된 프로브들의 각각은 5' 말단에서 Eclipse로 표식되었고 3' 말단에서 FAM으로 표식되었다. 표에서 서열을 위하여, 괄호()는 괄호() 안의 뉴클레오티드가 RNA인 것을 나타낸다.

표 1

이어서, (타카라 바이오 주식회사에 의해 제조된) CyCleave PCR® Core Kit에서 폴리메라아제를 제외한 시약이 각 반응에 대하여 1μM templet 1, 0.3μM 각 프로브, 및 0.004U Tli RNase H Ⅱ를 이용한 (타카라 바이오 주식회사에 의해 제조된) Thermal Cycler Dice® Real Time System으로 순환 프로브 반응을 실시하는 데에 사용되었다. 반응 조건은 30초, 55℃의 40 사이클; 30초, 55℃였다. 형광값의 측정을 위하여, 반응 시작에서 형광값 및 최대 형광값이 측정되었다. 또한 형광값이 최대에 이를 때까지 사이클의 수가 또한 계수되었다. 결과는 표 2에 도시된다. 표에서 서열에 대하여, 괄호()는 괄호() 안의 뉴클레오티드가 RNA인 것을 나타낸다. 표에서 수치값들은 형광값 백분율(%)로서 연산된 값들이고, 이는 수식 [(최대 형광값 - 반응시작에서 형광값) / 최대 형광값에서 사이클의 수]를 이용하여 미스매칭된(mismatched) RNA-함유 프로브에 대하여 연산되되, templet 1과 완전히 일치하는 프로브들의 각각이 사용되었을 때 수식의 값은 100%로 설정된다. 영 아래의 형광값 백분율은 0%로서 표현된다. 또한, 완전히 일치하는 RNA-함유 프로브들에서, 형광에서 변화가 관찰되지 않았고 이에 따라 연산이 가능하지 않았을 경우에, 형광값 백분율은 "-"으로서 표현된다.

표 2

표 2에 도시된 바와 같이, 심지어 서열들(nnn, mrm)이 상보적이지 않았을 경우에, probe central이 사용되었을 때 상대적으로 높은 형광값 백분율(%)이 측정되었던 반면에, 서열들(nnn, mrm)이 상보적이지 않았을 경우에, probe 5'-4mer, probe 5'-3mer, probe 3'-4mer 및 probe 3'-3mer이 사용되었을 때 상대적으로 낮은 형광값 퍼센트(%)가 측정되었다. 이런 결과들로부터, 관심의 뉴클레오티드가 중앙, 또는 5' 말단으로부터 7번째 뉴클레오티드, 또는 프로브의 3' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드보다 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드 및 4번째 뉴클레오티드에서 프로브에 RNA의 위치를 설정함으로써 더 높은 특이성 및 효율성으로 검출될 수 있었다는 것이 판명되었다.

(2) 뉴클레오티드에 대응하는 프로브에서 RNA와 검출되도록 요구되었던 뉴클레오티드의 위치들 사이에서 상이함으로 인한 특이성에서 상이함의 검사:

RNA가 표적 핵산에서 검출되도록 요구되었던 하나의 뉴클레오티드에 대응하는 프로브들에서 뉴클레오티드의 위치와 다른 위치들에서 설정되었던 경우에 특이성을 검사하기 위하여, 하기에 서술된 실험이 실시되었다. 우선, templet 1에서 검출되도록 요구되었던 하나의 뉴클레오티드는 5' 말단으로부터 11번째 뉴클레오티드에서 설정되었다. 표 3에 도시된 바와 같이 templet 1의 뉴클레오티드 서열에서 3개의 뉴클레오티드들의 서열들(nnn) 및 각 프로브들의 뉴클레오티드 서열에서 3개의 뉴클레오티드의 서열들(mrm)이 설정되어 이런 11번째 뉴클레오티드에 대응하는 각 프로브들에서 뉴클레오티드의 3' 말단에 인접한 뉴클레오티드는 RNA로서 설정되었고 templet 1 및 RNA-함유 프로브들은 모두 합성되었다. 합성된 프로브들의 각각은 5' 말단에서 Eclipse로 표식되었고 3' 말단에서 FAM으로 표식되었다. 표에서 서열에 대하여, 괄호()는 괄호() 안의 뉴클레오티드가 RNA인 것을 나타낸다.

표 3

이어서, 순환 프로브 반응은 실시예 1-(1)에서의 것과 유사한 조건들 하에서 수행되었다. 결과들은 표 4에 도시된다. 표에서 서열에 대하여, 괄호() 안의 뉴클레오티드가 RNA를 나타낸다. 표에서 수치값은 표 2에서의 것과 유사한 연산 방법을 이용하여 연산된 형광값 백분율을 나타낸다.

표 4

templet 1에서 검출되도록 요구되었던 하나의 뉴클레오티드는 5' 말단으로부터 9번째 뉴클레오티드에서 설정되었다. 표 5에 도시된 바와 같이 templet 1의 뉴클레오티드 서열에서 3개의 뉴클레오티드들의 서열들(nnn) 및 각 프로브들의 뉴클레오티드 서열에서 3개의 뉴클레오티드의 서열들(mrm)이 설정되어 이런 9번째 뉴클레오티드에 대응하는 각 프로브들에서 뉴클레오티드의 5' 말단에 인접한 뉴클레오티드는 RNA로서 설정되었고, templet 1 및 RNA-함유 프로브들은 모두 합성되었다. 합성된 프로브들의 각각은 5' 말단에서 Eclipse로 표식되었고 3' 말단에서 FAM으로 표식되었다. 표에서 서열에 대하여, 괄호()는 괄호() 안의 뉴클레오티드가 RNA인 것을 나타낸다.

표 5

이어서, 순환 프로브 반응은 실시예 1-(1)에서의 것과 유사한 조건들 하에서 수행되었다. 결과들은 표 6에 도시된다. 표에서 서열에 대하여, 괄호()는 괄호() 안의 뉴클레오티드가 RNA인 것을 나타낸다. 표에서 수치값은 표 2에서의 것과 유사한 연산 방법을 이용하여 연산된 형광값 백분율을 나타낸다.

표 6

표 4와 표 6에 도시된 결과들로부터, 검출되도록 요구되었던 하나의 뉴클레오티드에 대응하는 프로브들에서 각 뉴클레오티드가 RNA로서 설정되었던 경우에서와 같이, 관심의 뉴클레오티드는 표적 핵산에서 검출되도록 요구되었던 하나의 뉴클레오티드에 대응하는 프로브들에서 각 뉴클레오티드의 3' 말단에 인접한 뉴클레오티드가 RNA로서 설정되었던 경우에 또한 특이하고 효율적으로 검출될 수 있었다는 것이 판명되었다. 반면에, 5' 측에 인접한 뉴클레오티드가 RNA로서 설정되었던 경우가 감소된 특이성을 야기하였다는 것이 판명되었다.

실시예2

검사는 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브들의 Tm 값에서 상이함으로 인한 반응의 특이성으로 이루어졌다. 우선, NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov/)에 등록된 SNP들, rs5443, rs1654416, 및 rs1799821에 대하여, 25 내지 32℃ 또는 35내지 40℃ 중 어느 하나의 Tm 값을 갖고 SNP들 중 하나를 함유한 각 프로브가 설계되었다. rs5443의 경우에, 게놈 서열의 양성(센스) 스트랜드로 설계되었고 게놈 서열에서 SNP 위치에 대응하는 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드들이 프로브의 5' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드 및 4번째 뉴클레오티드에 위치된 RNA로서 설정되었으며, 게놈 서열의 안티센스 스트랜드로 설계되었고 게놈 서열의 상보적 스트랜드 상의 SNP 위치에 대응하는 뉴클레오티드들이 프로브의 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드에 위치된 RNA로서 설정되었던, 프로브들이 설계되었다(SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8). rs1654416의 경우에, 게놈 서열의 안티센스 스트랜드로 설계되었고 게놈 서열의 상보적 스트랜드 상의 SNP 위치에 대응하는 뉴클레오티드들이 프로브의 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드에 위치된 RNA로서 설정되었던 프로브들이 설계되었다(SEQ ID NO:9 내지 SEQ ID NO:12). rs1799821의 경우에, 게놈 서열의 센스 스트랜드로 설계되었고 게놈 서열에서 SNP 위치에 대응하는 뉴클레오티드들이 프로브의 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드(SEQ ID NO:14 및 SEQ ID NO:15) 및 5' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드(SEQ ID NO:13)에 위치된 RNA로서 설정되었던 프로브들이 설계되었다. 이런 합성에서 RNA-함유 프로브들의 형광 표식의 형식 및 설계된 프로브들의 Tm 값 및 서열이 표 7에 도시된다. 표에서 서열에 대하여, 괄호()는 괄호() 안의 뉴클레오티드가 RNA인 것을 나타낸다.

표 7

상기에 언급된 RNA-함유 프로브들에 대하여, 프라이머 쌍들은 Cycleave PCR들이 실시될 수 있도록 설계되었다. rs5443으로부터 설계된 RNA-함유 프로브들의 rs5443 C probe 및 rs5443 T probe에 대하여, 한 쌍의 프라이머들, rs5443 F primer 및 rs5443 R primer(SEQ ID NO:16 및 SEQ ID NO:17)가 설계되었다. rs5443 C probe 2 및 rs5443 T probe 2에 대하여, 한 쌍의 프라이머들, rs5443 F2 primer 및 rs5443 R2 primer(SEQ ID NO:18 및 SEQ ID NO:19)가 설계되었다. rs1654416으로부터 설계된 RNA-함유 프로브들에 대하여, rs1654416 F primer 및 rs1654416 R primer(SEQ ID NO:20 및 SEQ ID NO:21)가 설계되었다. rs1799821로부터 설계된 RNA-함유 프로브들에 대하여, 한 쌍의 프라이머들, rs1799821 F primer 및 rs1799821 R primer(SEQ ID NO:22 및 SEQ ID NO:23)가 설계되었다.

상기에 언급된 RNA-함유 프로브들 및 프라이머들은 각각 합성되었고, Cycleave PCR들은 키트의 지시에 따라 (타카라 바이오 주식회사에 의해 제조된) Cycleave PCR® Core Kit를 이용하여 (타카라 바이오 주식회사에 의해 제조된) Thermal Cycler Dice® Real Time System으로 수행되었다. 템플릿 DNA는 하기에 서술된 바와 같이 마련되었고 10⁵ 카피(copy)에 대응하는 양이 각 반응에 대하여 사용되었다. 우선, 프로브들의 각각의 DNA 서열을 포함하는 프라이머 증폭 영역으로 각각 이루어진 서열들이 각각 인공적으로 마련되었다. 이어서, 마련된, 인공적으로 합성된 서열들의 각각은 일반적인 방법으로 (타카라 바이오 주식회사에 의해 제조된) 플라스미드 벡터 T-Vector pMD19(Simple)의 Eco RV T-Cloning 사이트에 삽입되었고 삽입된 벡터는 템플릿 DNA로서 사용되었다. 반응은 표 8에 나열된 RNA-함유 프로브들 및 프라이머 쌍들의 조합으로 실시되었고 FAM 및 ROX 신호들은 (타카라 바이오 주식회사에 의해 제조된) Thermal Cycler Dice® Real Time System의 지시에 따라 검출되었다. 표에서, 반응 1, 반응 3 및 반응 5는 25 내지 32℃의 범위에서 Tm 값을 갖도록 설계된 RNA-함유 프로브를 나타내고, 반응 2, 반응 4 및 반응 6은 35 내지 40℃의 범위에서 Tm 값을 갖도록 설계된 RNA-함유 프로브를 나타낸다.

표 8

각 반응들의 결과들은 도 4 내지 도 9에 도시된다. 이런 도면들에서, 상측 패널은 FAM 신호의 검출을 도시하고, 하측 패널은 ROX 신호의 검출을 도시한다. 각 패널들의 수직축은 FAM 및 ROX로부터 형광값을 나타내고, 수평축은 사이클의 수를 나타낸다. 실선들은 야생형 템플릿에 대한 결과를 도시하고, 점선들은 돌이변이형 템플릿에 대한 결과를 도시한다. rs5443의 검출의 결과들을 도시하는, 도 4와 도 5에서, 선들 "야생형"은 게놈 서열에서의 SNP 위치에 뉴클레오티드가 C일 때 결과를 나타내고, 선들 "돌연변이형"은 게놈 서열에서의 SNP 위치에 뉴클레오티드가 T일 때 결과를 나타낸다. rs1654416의 검출의 결과들을 도시하는, 도 6과 도 7에서, 선들 "야생형"은 게놈 서열에서의 SNP 위치에 뉴클레오티드가 T일 때 결과를 나타내고, 선들 "돌연변이형"은 게놈 서열에서의 SNP 위치에 뉴클레오티드가 C일 때 결과를 나타낸다. rs1799821의 검출의 결과들을 도시하는, 도 8과 도 9에서, 선들 "야생형"은 게놈 서열에서의 SNP 위치에 뉴클레오티드가 G일 때 결과를 나타내고, 선들 "돌연변이형"은 게놈 서열에서의 SNP 위치에 뉴클레오티드가 A일 때 결과를 나타낸다.

이런 결과들은 rs5443 SNP의 검출에 대하여, 25 내지 32℃의 Tm 값을 갖도록 설계된 RNA-함유 프로브들 사이에 야생형 SNP를 검출하기 위한 rs5443 C probe는, 야생형 SNP의 검출만을 초래하였다는 것을 입증한다(도 4에서 FAM, 상측 패널). 돌연변이형 SNP를 검출하기 위한 rs5443 T probe는, 돌연변이형 SNP의 특정 검출만을 초래하였다(도 4에서 ROX, 하측 패널). 35 내지 40℃의 Tm 값을 갖도록 설계된 RNA-함유 프로브들 사이에 야생형 SNP를 검출하기 위한 rs5443 C probe 2는, 야생형 SNP의 검출 및 추가적으로 약한 신호를 갖는 돌연변이형 SNP의 검출을 초래하였다(도 5에서 FAM, 상측 패널). 돌연변이형 SNP를 검출하기 위한 rs5443 T probe 2는, 돌연변이형 SNP의 검출 및 추가적으로 약한 신호를 갖는 야생형 SNP의 검출을 초래하였다(도 5에서 ROX, 하측 패널). 유사한 결과들이 rs1654416에 대하여 설계된 RNA-함유 프로브들로 획득되었다(도 6과 도7). rs1799821에 대하여 설계된 RNA-함유 프로브들 모두를 갖는, 프로브들의 각각은 야생형 SNP 또는 돌연변이형 SNP 중 어느 하나의 특정 검출을 초래하였다(도 8과 도9). 도 4 내지 도 9에 도시된 결과들로부터, 25 내지 40℃의 범위에서 Tm 값을 갖는 RNA-함유 프로브를 설계하는 것은 SNP들의 특정 검출을 허용하였다는 것이 판명되었다.

실시예 3

추가 검사는 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브들의 Tm 값으로 인한 반응의 특이성으로 이루어졌고, 검사는 반응에 첨가된 RNase H의 양으로 인한 특이성으로 이루어졌다. 우선, 각각 실시예 2에서 서술된 SNP들(rs5443, rs1654416, 및 rs1799821) 중 하나를 포함하였고 40℃ 이상의 Tm 값을 가졌던 프로브들이 설계되었다. rs5443의 경우에, 게놈 서열의 안티센스 스트랜드로 설계되었고 게놈 서열에서 상보적 스트랜드 상의 SNP 위치에 대응하는 뉴클레오티드들이 프로브의 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드 및 4번째 뉴클레오티드(SEQ ID NO:24 및 SEQ ID NO:25)에 위치된 RNA로서 설정되었던 프로브들이 설계되었다. rs1654416의 경우에, 게놈 서열의 안티센스 스트랜드로 설계되었고 게놈 서열의 상보적 스트랜드 상의 SNP 위치에 대응하는 뉴클레오티드들이 프로브의 5' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드(SEQ ID NO:27) 및 3' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드(SEQ ID NO:26)에 위치된 RNA로서 설정되었던 프로브들이 설계되었다. rs1799821의 경우에, 게놈 서열의 안티센스 스트랜드로 설계되었고 게놈 서열의 상보적 스트랜드 상의 SNP 위치에 대응하는 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드들이 프로브의 3' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드(SEQ ID NO:29) 및 5' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드(SEQ ID NO:28)에 위치된 RNA로서 설정되었된 프로브들이 설계되었다. 이런 합성에서 RNA-함유 프로브들의 형광 표식의 형식 및 설계된 프로브들의 Tm 값 및 서열이 표 9에 도시된다. 표에서 서열에 대하여, 괄호() 안의 뉴클레오티드는 RNA를 나타낸다.

표 9

상기에 언급된 RNA-함유 프로브들에 대하여, 프라이머 쌍들은 Cycleave PCR이 실시될 수 있도록 설계되었다. rs5443으로부터 설계된 프로브에 대하여, 한 쌍의 프라이머들, 5443 F3 primer 및 rs5443 R3 primer(SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:31)가 설계되었다. rs1654416으로부터 설계된 RNA-함유 프로브들에 대하여, 한 쌍의 프라이머들, rs1654416 F3 primer 및 rs1654416 R3 primer(SEQ ID NO:32 및 SEQ ID NO:33)가 설계되었다. rs1799821로부터 설계된 RNA-함유 프로브들에 대하여, 한 쌍의 프라이머들, rs1799821 F3 primer 및 rs1799821 R3 primer(SEQ ID NO:34 및 SEQ ID NO:35)가 설계되었다.

상기에 언급된 RNA-함유 프로브들 및 프라이머들은 각각 합성되었고, Cycleave PCR들은 실시예 2에서와 같이 수행되었다. 이런 반응에서, 키트로 공급된 Tli RNase H Ⅱ는 키트로 공급된 버퍼(buffer)를 이용하여 마련되어서, 반응에 첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양은 각 프로브들에 대하여 사용되었던, 100 U(보통 첨가되었던 양), 10 U 및 5 U였다.

rs5443의 결과들은 (첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양이 100 U이었을 때) 도 10, (첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양이 10 U이었을 때) 도 11 및 (첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양이 5 U이었을 때) 도 12에 도시된다. rs1654416의 결과들은 (첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양이 100 U이었을 때) 도 13, (첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양이 10 U이었을 때) 도 14 및 (첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양이 5 U이었을 때) 도 15에 도시된다. rs1799821의 결과들은 (첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양이 100 U이었을 때) 도 16, (첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양이 10 U이었을 때) 도 17 및 (첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양이 5 U이었을 때) 도 18에 도시된다. 이런 도면들에서, 상측 패널은 FAM 신호의 검출을 도시하고, 하측 패널은 ROX 신호의 검출을 도시한다. 각 패널들의 수직축은 FAM 및 ROX로부터 형광값을 나타내고, 수평축은 사이클의 수를 나타낸다. 실선들은 야생형 템플릿에 대한 결과를 도시하고, 점선들은 돌이변이형 템플릿에 대한 결과를 도시한다.

이런 결과들은 첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 보통 양(100U)에서, 40℃ 이상의 Tm 값을 갖도록 설계되었던 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브들 중 어떤 것에 대하여, 특정하게 야생형만을 검출하기 위한 각 FAM-표식된 프로브들이 또한 돌연변이형의 검출을 초래하였다는 것을 입증한다. 또한, 특정하게 돌연변이형만을 검출하기 위한 각 ROX-표식된 프로브들이 또한 야생형의 검출을 초래하였다. 따라서, 40℃ 이상의 Tm 값을 갖도록 설계되었던 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브들이 특정 검출을 할 수 없었다는 것이 판명되었다.

40℃ 이상의 Tm 값을 갖도록 설계되었던 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브들을 이용하여, 첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양으로 인한 감수성의 검사의 결과들로부터, rs1799821 G probe 3로 첨가된 Tli RNase H Ⅱ의 양을 5U로 감소시킴으로써 특이성을 향상시키는 것이 발견되었된 반면에, 다른 것들로 특이성이 어느 정도까지 향상되는 경향이 있었다는 것이 판명되었으나, 증폭 곡선들은 덜 가파른 형상을 나타내었고 Ct 값은 지연되었으며, 이에 따라 이런 프로브들은 감소된 반응성을 가졌다. 이로부터, 40℃ 이상의 Tm 값을 갖도록 설계되었던 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브들이 사용되었을 때, 대부분의 프로브들은 특정 검출을 가능하지 않게 한다는 것이 입증되었다.

본 발명에 따라, 연구자들의 경험 또는 감각에 기초하지 않고, 표적 핵산의단순하고 효율적인 검출을 가능하게 하는 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브를 설계하기 위한 방법이 제공된다. 또한, 표적 핵산을 검출하기 위한 RNA-함유 프로브가 심지어 기술분야에서 경험을 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않는 연구자들에 의해 손쉽게 설계되는 것을 가능하게 하고, 이에 따라 유전 공학의 분야뿐 아니라 의학 연구의 분야에서 상당히 유용한, 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 장치 및 방법이 제공된다.

ST1: 표적 뉴클레오티드를 서술하는 정보 및 표적 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 입력하는 처리 단계
ST2: 표적 핵산의 상보적 뉴클레오티드 서열을 생성시키는 처리 단계
ST3: 우선순위의 순서 및 RNA 위치를 결정하는 처리 단계
ST4: 부분 뉴클레오티드 서열을 서술하는 정보를 생성시키는 처리 단계
ST5: Tm 값에 기초하여 결정하는 처리 단계
ST6: 데이터 메모리(23)로부터 문자열 R을 삭제하는 처리 단계
ST7: 데이터 메모리(23)로부터 문자열 R을 삭제하는 처리 단계
ST8: 부분 뉴클레오티드 서열을 추출하는 처리 단계
ST9: 프라이머 서열을 설계하는 처리 단계
ST10: 출력하는 처리 단계
ST11 내지 ST17: 결정하는 처리 단계
ST18 내지 ST25: 정보를 생성시키는 처리 단계
ST31: 부분 뉴클레오티드 서열을 서술하는 정보를 생성시키는 처리 단계
ST32: 부분 뉴클레오티드 서열을 서술하는 정보를 생성시키는 처리 단계
ST33: 부분 뉴클레오티드 서열들에 대한 우선순위의 순서에 대한 정보를 생성시키는 처리 단계
ST41: 문자열 K, M 및 N을 판독하는 처리 단계
ST44: 문자열 P(문자열 O, 숫자 Y, 기호 z, 기호 ST31)을 생성시키는 처리 단계
10: 뉴클레오티드 서열을 처리하기 위한 장치
20: CPU
21: ROM
22: RAM
23:데이터 메모리
24: 프로그램 메모리
41: 키보드
42: 마우스
43: CRT 디스플레이
45: CD-ROM 드라이브 장치
45a: CD-ROM
50: 인터넷
60: 유전자 데이터베이스 서버 유닛
70: ST1 내지 ST4에서 생성되거나 입력된 데이터의 형식을 요약하는 테이블
71: 상보적 뉴클레오티드 서열을 생성하는 데에 있어 레퍼런스 테이블
72: RNA 위치를 결정하는 데에 있어 레퍼런스 테이블
73: 퓨린 뉴클레오티드를 결정하는 데에 있어 레퍼런스 테이블
74: 우선순위의 순서를 결정하는 데에 있어 레퍼런스 테이블
75: 우선순위의 순서를 결정하는 데에 있어 레퍼런스 테이블
76: 우선순위의 순서를 결정하는 데에 있어 레퍼런스 테이블
77: 25℃≤ Tm 값 ≤ 40℃인지 아닌지에 대한 결정하는 데에 있어 레퍼런스 테이블
78: 부분 뉴클레오티드 서열 및 프라이머 서열에 대한 출력 정보의 테이블
SEQ ID NO:1; 표적 핵산 templet 1.
SEQ ID NO:2; templet 1을 검출하는 키메라 올리고뉴클레오티드 probe central. 5' 말단으로부터 7번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:3; templet 1을 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 probe 5'-4mer. 5' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:4; templet 1을 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 probe 5'-3mer. 5' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:5; templet 1을 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 probe 3'-4mer. 3' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:6; templet 1을 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 probe 3'-3mer. 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:7; rs5443의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs5443 C probe2. 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:8; rs5443의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs5443 T probe. 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:9; rs1654416의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs1654416 C probe. 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:10; rs1654416의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs1654416 T probe. 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:11; rs1654416의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs1654416 C probe2. 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:12; rs1654416의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs1654416 T probe2. 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:13; rs1799821의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs1799821 A probe. 5' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:14; rs1799821의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs1799821 A probe2. 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:15; rs1799821의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs1799821 G probe2. 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:16; rs5443 C probe 또는 rs5443 T probe를 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs5443 F primer.
SEQ ID NO:17; rs5443 C probe 또는 rs5443 T probe를 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs5443 R primer.
SEQ ID NO:18; rs5443 C probe2 또는 rs5443 T probe2를 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs5443 F2 primer.
SEQ ID NO:19; rs5443 C probe2 또는 rs5443 T probe2를 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs5443 R2 primer.
SEQ ID NO:20; rs1654416 C probe, rs1654416 T probe, rs1654416 C probe2 또는 rs1654416 T probe2를 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs1654416 F primer.
SEQ ID NO:21; rs1654416 C probe, rs1654416 T probe, rs1654416 C probe2 또는 rs1654416 T probe2를 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs1654416 R primer.
SEQ ID NO:22; rs1799821 A probe, rs1799821 G probe, rs1799821 A probe2 또는 rs1799821 G probe2를 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs1799821 F primer.
SEQ ID NO:23; rs1799821 A probe, rs1799821 G probe, rs1799821 A probe2 또는 rs1799821 G probe2를 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs1799821 R primer.
SEQ ID NO:24; rs5443의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs5443 C probe3. 3' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:25; rs5443의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs5443 T probe3. 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:26; rs1654416의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs1654416 C probe3. 3' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:27; rs1654416의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs1654416 T probe3. 5' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:28; rs1799821의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs1799821 A probe3. 5' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:29; rs1799821의 SNP를 검출하는 키메라 올리고뉴클레이티드 rs1799821 G probe3. 3' 말단으로부터 4번째 뉴클레오티드가 RNA이다.
SEQ ID NO:30; rs5443 C probe3 또는 rs5443 T probe3을 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs5443 F3 primer.
SEQ ID NO:31; rs5443 C probe3 또는 rs5443 T probe3을 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs5443 R3 primer.
SEQ ID NO:32; rs1654416 C probe3 또는 rs1654416 T probe3을 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs1654416 F3 primer.
SEQ ID NO:33; rs1654416 C probe3 또는 rs1654416 T probe3을 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs1654416 R3 primer.
SEQ ID NO:34; rs1799821 A probe3 또는 rs1799821 G probe3을 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs1799821 F3 primer.
SEQ ID NO:35; rs1799821 A probe3 또는 rs1799821 G probe3을 포함하는 DNA 영역을 증폭시키는 rs1799821 R3 primer.

SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> METHOD FOR PRODUCING RNA-CONTAINING PROBE FOR DETECTING A TARGET NUCLEOTIDE <130> 670340 <150> JP 2010-169927 <151> 2010-07-29 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target nucleic acid template 1 <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 aatatccgnn nggcattgaa gca 23 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide probe central to detect the template 1. The 7th base from 5' end is RNA. <400> 2 atgccmrmcg ga 12 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide probe 5'-4mer to detect the template 1. The 4th base from 5' end is RNA. <400> 3 ccmrmcggat at 12 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide probe 5'-3mer to detect the template 1. The 3rd base from 5' end is RNA. <400> 4 cmrmcggata tt 12 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide probe 3'-4mer to detect the template 1. The 4th base from 3' end is RNA. <400> 5 acatgccmrm cg 12 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide probe 3'-3mer to detect the template 1. The 3rd base from 3' end is RNA. <400> 6 tacatgccmr mc 12 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs5443 C probe2 to detect the SNP of rs5443. The 3rd base from the 3' end is RNA. <400> 7 aggccacgga 10 <210> 8 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs5443 T probe to detect the SNP of rs5443. The 3rd base from the 3' end is RNA. <400> 8 aaggccacag a 11 <210> 9 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs1654416 C probe to detect the SNP of rs1654416. The 3rd base from the 3' end is RNA. <400> 9 tcacaaacga a 11 <210> 10 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs1654416 T probe to detect the SNP of rs1654416. The 3rd base from the 3' end is RNA. <400> 10 ttcacaaaca aa 12 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs1654416 C probe2 to detect the SNP of rs1654416. The 3rd base from the 3' end is RNA. <400> 11 attcacaaac gaa 13 <210> 12 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs1654416 T probe2 to detect the SNP of rs1654416. The 3rd base from the 3' end is RNA. <400> 12 cattcacaaa caaa 14 <210> 13 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs1799821 A probe to detect the SNP of rs1799821. The 3rd base from the 5' end is RNA. <400> 13 ccatccactt t 11 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs1799821 A probe2 to detect the SNP of rs1799821. The 3rd base from the 3' end is RNA. <400> 14 tctactgcca tc 12 <210> 15 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs1799821 G probe2 to detect the SNP of rs1799821. The 3rd base from the 3' end is RNA. <400> 15 ctactgccgt c 11 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs5443 F primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe or rs5443 T probe. <400> 16 tgccgcttgt ttgacc 16 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs5443 R primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe or rs5443 T probe. <400> 17 agttgaagtc gtcgtagcc 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs5443 F2 primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe2 or rs5443 T probe2. <400> 18 ctcccacgag agcatcatc 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs5443 R2 primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe2 or rs5443 T probe2. <400> 19 ttacccacac gctcagactt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> s1654416 F primer to amplify the DNA region including rs1654416 C probe, rs1654416 T probe, rs1654416 C probe2 or rs1654416 T probe2. <400> 20 gcatgaaatg cctggttact 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1654416 R primer to amplify the DNA region including rs1654416 C probe, rs1654416 T probe, rs1654416 C probe2 or rs1654416 T probe2. <400> 21 gggtttcagg gagcctagat 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1799821 F primer to amplify the DNA region including rs1799821 A probe, rs1799821 G probe, rs1799821 A probe2 or rs1799821 G probe2. <400> 22 ccattaagga ccttgtccac t 21 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1799821 R primer to amplify the DNA region including rs1799821 A probe, rs1799821 G probe, rs1799821 A probe2 or rs1799821 G probe2. <400> 23 atctgagcac tgccacacc 19 <210> 24 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs5443 C probe3 to detect the SNP of rs5443. The 4th base from the 3' end is RNA. <400> 24 aaggccacgg ac 12 <210> 25 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs5443 T probe3 to detect the SNP of rs5443. The 3rd base from the 3' end is RNA. <400> 25 gagaaggcca caga 14 <210> 26 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs1654416 C probe3 to detect the SNP of rs1654416. The 4th base from the 3' end is RNA. <400> 26 cattcacaaa cgaag 15 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs1654416 T probe3 to detect the SNP of rs1654416. The 4th base from the 5' end is RNA. <400> 27 aacaaagtct tcaca 15 <210> 28 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs1799821 A probe3 to detect the SNP of rs1799821. The 3rd base from the 5' end is RNA. <400> 28 atggcagtag agcc 14 <210> 29 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric oligonucleotide rs1799821 G probe3 to detect the SNP of rs1799821. The 4th base from the 3' end is RNA. <400> 29 aaagtggacg gca 13 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs5443 F3 primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe3 or rs5443 T probe3. <400> 30 ctcccacgag agcatcatc 19 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs5443 R3 primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe3 or rs5443 T probe3. <400> 31 cttcatggag tcccagacat t 21 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> s1654416 F3 primer to amplify the DNA region including rs1654416 C probe3 or rs1654416 T probe3. <400> 32 agcatgaaat gcctggtta 19 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1654416 R3 primer to amplify the DNA region including rs1654416 C probe3 or rs1654416 T probe3. <400> 33 gggaatggag atatctagag g 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1799821 F3 primer to amplify the DNA region including rs1799821 A probe3 or rs1799821 G probe3. <400> 34 tggactcggc agtgttctgt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1799821 R3 primer to amplify the DNA region including rs1799821 A probe3 or rs1799821 G probe3. <400> 35 tagctggctg gctctgtgga 20

Claims

뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치에 의해 실시되고, 프로브가 표적 핵산과 잡종화된 후에 리보뉴클레아제 H에 의해 절단되는지 아닌지에 기초하여 표적 핵산을 검출하는 방법에서 사용되는 RNA 및 DNA-함유 프로브를 생성하기 위한 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 방법에 있어서, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브는 하나의 RNA를 가지고,
표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열에 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 단계;
표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계;
표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 뉴클레오티드 서열에서, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계; 및
RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득된 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브에 상응하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계를 포함하되,
(d) 부분 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14이고,
(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,
(f) 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드는 상기 부분 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치되는 것을 특징으로 하는 방법.
뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치에 의해 실시되고, 프로브가 표적 핵산과 잡종화된 후에 리보뉴클레아제 H에 의해 절단되는지 아닌지에 기초하여 표적 핵산을 검출하는 방법에서 사용된 RNA 및 DNA-함유 프로브를 생성하기 위한 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 방법에 있어서, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브는 하나의 RNA를 가지고,
표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열에 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 단계;
표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 생성하는단계;
출력된 뉴클레오티드 서열 및 생성된 상보적 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계
(여기서, (d) 부분 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14이고,
(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,
(f) 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드는 상기 부분 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치된다); 및
표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열에서, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브에 상응하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치에 의해 실시되고, 프로브가 표적 핵산과 잡종화된 후에 리보뉴클레아제 H에 의해 절단되는지 아닌지에 기초하여 표적 핵산을 검출하는 방법에서 사용된 RNA 및 DNA-함유 프로브를 생성하기 위한 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 방법에 있어서, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브는 하나의 RNA를 가지고,
표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열에 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 단계;
표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 생성하는단계;
출력된 뉴클레오티드 서열 및 생성된 상보적 뉴클레오티드 서열에 대하여,
(a) 표적 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대한 결정,
(b) 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대한 결정, 및
(c) 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대한 결정 중 적어도 하나를 결정하여, 퓨린 뉴클레오티드인 하나의 뉴클레오티드가 출력된 뉴클레오티드 서열 및 생성된 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 RNA 위치로서 결정됨으로써, RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 단계;
RNA 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열로부터, RNA 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계
(여기서, (d) 부분 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14이고,
(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,
(f) RNA 위치에서 나타난 하나의 뉴클레오티드는 상기 부분 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치된다); 및
RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열에서, RNA 위치로서 결정된 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브에 상응하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서,
RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 단계는,
표적 뉴클레오티드와 결정된 RNA 위치 사이의 상대적 위치에 기초하여, 이후의 단계에서 RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득되는 생성된 부분 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브에 상응하는 상기 부분 뉴클레오티드 서열을 선택하기 위한 우선순위를 결정하는 단계를 포함하고;
상기 우선순위는 상기 RNA 위치를, 높은 우선순위로부터 낮은 우선순위인 아래의 뉴클레오티드들:
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드;
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드;
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드;
에 적용하여 결정되는 방법.
삭제
컴퓨터-판독가능한 기록매체에 있어서,
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하는 방법의 단계를 포함하는 컴퓨터에 의해 실시되는 프로그램을 저장하는 것을 특징으로 하는 컴퓨터-판독가능한 기록 매체.
프로브가 표적 핵산과 잡종화된 후에 리보뉴클레아제 H에 의해 절단되는지 아닌지에 기초하여 표적 핵산을 검출하는 방법에서 사용된 RNA 및 DNA-함유 프로브를 생성하기 위한 정보 처리 방법을 사용하는 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치에 있어서, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브는 하나의 RNA를 가지고,
표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열에 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하기 위한 수단;
표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단;
표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 뉴클레오티드 서열에서, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단; 및
RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득된 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브에 상응하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단을 포함하되,
(d) 부분 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14이고,
(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,
(f) 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드는 상기 부분 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치되는 것을 특징으로 하는 장치.
프로브가 표적 핵산과 잡종화된 후에 리보뉴클레아제 H에 의해 절단되는지 아닌지에 기초하여 표적 핵산을 검출하는 방법에서 사용된 RNA 및 DNA-함유 프로브를 생성하기 위한 정보 처리 방법을 사용하는 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치에 있어서, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브는 하나의 RNA를 가지고,
표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열에 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하기 위한 수단;
표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단;
출력된 뉴클레오티드 서열 및 생성된 상보적 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단
(여기서, (d) 부분 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14이고,
(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,
(f) 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드는 상기 부분 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치된다); 및
표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 각각 인접한 뉴클레오티드들의 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열에서, 뉴클레오티드 서열에서 표적 뉴클레오티드 또는 표적 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브에 상응하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
프로브가 표적 핵산과 잡종화된 후에 리보뉴클레아제 H에 의해 절단되는지 아닌지에 기초하여 표적 핵산을 검출하는 방법에서 사용된 RNA 및 DNA-함유 프로브를 생성하기 위한 정보 처리 방법을 사용하는 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치에 있어서, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브는 하나의 RNA를 가지고,
표적 뉴클레오티드, 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 입력될 뉴클레오티드 서열에 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 입력함으로써, 표적 뉴클레오티드의 입력된 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하기 위한 수단;
표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적 뉴클레오티드의 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단;
출력된 뉴클레오티드 서열 및 생성된 상보적 뉴클레오티드 서열에 대하여,
(a) 표적 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대한 결정,
(b) 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대한 결정, 및
(c) 표적 뉴클레오티드의 5' 측에 인접한 뉴클레오티드가 퓨린 뉴클레오티드인지 아닌지에 대한 결정 중 적어도 하나를 결정하여, 퓨린 뉴클레오티드인 하나의 뉴클레오티드가 출력된 뉴클레오티드 서열 및 생성된 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 RNA 위치로서 결정됨으로써, RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하기 위한 수단;
RNA 위치 정보를 포함하는 출력될 뉴클레오티드 서열로부터, RNA 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단
(여기서, (d) 부분 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드들의 수는 7 내지 14이고,
(e) 부분 뉴클레오티드 서열의 Tm 값은 25 내지 40℃이며,
(f) RNA 위치에서 나타난 하나의 뉴클레오티드는 상기 부분 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 3과 5 뉴클레오티드들 사이의 위치에서 위치된다); 및
RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 RNA 위치 정보를 포함하는 부분 뉴클레오티드 서열에서, RNA 위치로서 결정된 뉴클레오티드를 RNA로 변환함으로써 획득된, 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브에 상응하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 9 항에 있어서,
RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하기 위한 수단은 표적 뉴클레오티드와 결정된 RNA 위치 사이의 상대적 위치에 기초하여, 이후의 단계에서 RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득되는 생성된 부분 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브에 상응하는 상기 부분 뉴클레오티드 서열을 선택하기 위한 우선순위를 결정하는 것을 포함하고;
상기 우선순위는 상기 RNA 위치를, 높은 우선순위로부터 낮은 우선순위인 아래의 뉴클레오티드들:
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드;
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드;
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드;
에 적용하여 결정되는 장치.
뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 시스템에 있어서,
제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치, 및 네트워크를 통해 연결되는 클라이언트 장치를 포함하되,
클라이언트 장치는 네트워크를 통해 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치에, 입력된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정보를 전송하기 위한 전송 수단을 포함하고,
뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 장치는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전송된 정보에 기초하여, RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득되는 생성된 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하고 출력하기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA 및 DNA-함유 프로브를 제조하기 위한 방법에 있어서,
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 따른 뉴클레오티드 서열 정보를 처리하기 위한 방법에 의해 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브에 상응하는 부분 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계, 및 상기 부분 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열을 갖는 DNA 및 RNA를 함유한 핵산 프라그먼트를 마련하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법에 있어서,
제 12 항에 따른 방법에 의해 제조된 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA 및 DNA-함유 프로브를 샘플에서 핵산으로 잡종화시키는 단계;
잡종화 단계 이후에, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA 및 DNA-함유 프로브에 리보뉴클레아제 H 처리를 적용시키는 단계; 및
표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA 및 DNA-함유 프로브가 리보뉴클레아제 H에 의해 절단되었는지 아닌지를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서,
RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하는 단계는,
표적 뉴클레오티드와 결정된 RNA 위치 사이의 상대적 위치에 기초하여, 이후의 단계에서 RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득되는 생성된 부분 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 상기 RNA 및 DNA-함유 프로브에 상응하는 상기 부분 뉴클레오티드 서열을 선택하기 위한 우선순위를 결정하는 단계를 포함하고;
상기 우선순위는 상기 RNA 위치를, 높은 우선순위로부터 낮은 우선순위인 아래의 뉴클레오티드들:
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드;
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드;
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드;
에 적용하여 결정되는 방법.
제 9 항에 있어서,
RNA 위치 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 출력하기 위한 수단은 표적 뉴클레오티드와 결정된 RNA 위치 사이의 상대적 위치에 기초하여, 이후의 단계에서 RNA 뉴클레오티드 변환에 의해 획득되는 생성된 부분 뉴클레오티드 서열로부터, 표적 뉴클레오티드를 검출하기 위한 RNA 및 DNA-함유 프로브에 상응하는 상기 부분 뉴클레오티드 서열을 선택하기 위한 우선순위를 결정하는 것을 포함하고;
상기 우선순위는 상기 RNA 위치를, 높은 우선순위로부터 낮은 우선순위인 아래의 뉴클레오티드들:
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드;
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드;
표적 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 내의 표적 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 3' 측에 인접한 뉴클레오티드;
에 적용하여 결정되는 장치.