KR101610985B1 - 암 치료를 위한 세포외 기질 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 세포를 세포외 기질(ECM) 조성물과 접촉시킴으로써 암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 세포를 화학요법제를 포함하는 세포외 기질 조성물과 접촉시킴으로써 암 세포에 화학요법제를 전달하는 방법을 제공한다. 또한, ECM 및 화학요법제를 포함하는 조성물도 제공한다.

Description

암 치료를 위한 세포외 기질 조성물{EXTRACELLULAR MATRIX COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER}

본 발명은 일반적으로 세포외 기질 조성물의 용도에 관한 것이고, 더 구체적으로는 세포 증식을 억제하기 위한 세포외 기질 조성물의 용도에 관한 것이다.

세포외 기질(ECM: extracellular matrix)은 생체내의 포유동물 조직에서 발견되는, 세포를 지지해 주는 세포 주변의 복잡한 구조체이다. ECM은 흔히 결합 조직이라 불린다. ECM은 주로 콜라겐 및 엘라스틴 등의 구조 단백질, 피브릴린, 피브로넥틴, 라미닌 및 프로테오글리칸 등의 분화 단백질을 비롯한 주요한 3가지 부류의 생체분자로 이루어진다.

시험관내에서의 ECM 조성물의 증식 및 다양한 치료 분야 및 의료 분야에 있어서의 그 용도는 당업계에 알려져 있다. 이러한 ECM 조성물의 치료 분야 중 하나로서 주름 및 흉터와 같은 연조직 및 피부 결손의 치료 및 수복을 들 수 있다.

여드름, 수술 반흔 또는 노화와 같은 결손에 의해 발생된 연조직 결손의 수복 또는 증대는 매우 어려운 것으로 판명되었다. 다양한 성공률로 다양한 재료가 연조직 결손을 교정하기 위해 사용되었지만, 완벽하게 안전하고 효과적인 재료는 없었다. 예를 들어, 실리콘은 결절, 재발성 연조직염 및 피부 궤양 등의 장기간의 부작용을 비롯한 다양한 생리학적 문제와 임상적 문제를 일으킨다.

콜라겐 조성물 역시 연조직 증대를 위한 주사 가능한 재료로서 사용되고 있다. 콜라겐은 결합 조직의 주요 단백질이고, 포유동물에 가장 풍부하게 존재하는 단백질로서, 총 단백질 함량의 약 25%를 차지한다. 현재는 28가지 유형의 콜라겐이 문헌에 개시되었다(예를 들어, 상세한 목록에 대해서는 하기 표 1 및 2를 참조). 그러나, 체내 콜라겐 중 90% 이상은 콜라겐 I, II, III 및 IV이다.

재구성된 주사용 소 콜라겐, 가교결합된 콜라겐, 또는 다른 이종성(xenogeneic) 콜라겐과 같은 다양한 콜라겐 재료가 연조직 결손의 치료에 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 콜라겐의 경우 몇 가지 문제점이 있다. 공통된 문제는, 피험체에서의 알레르기 반응을 방지하기 위해 면역원성을 나타낼 가능성이 있는 물질이 제거되도록 임플란트 재료를 제조하는 데 비용이 많이 들고 제조 공정이 복잡하다는 것이다. 게다가, 이러한 콜라겐을 사용한 치료가 장기 지속성이 있다는 것도 입증되지 않았다.

수성 겔 중의 생체적합성 세라믹 입자(미국 특허 제5,204,382호), 열가소성 및/또는 열경화성 물질(미국 특허 제5,278,202호) 및 락트산계 중합체 블렌드(미국 특허 제4,235,312호)와 같은 연조직 수복 또는 증대에 사용될 수 있는 다른 재료도 개시된 바 있다. 추가로, 천연 분비형 ECM 조성물을 사용하는 것도 개시된 바 있다(미국 특허 제6,284,284호). 그러나, 이러한 재료들은 모두 한계가 있는 것으로 드러났다.

따라서, 종래 재료의 부족함을 극복할 수 있는 연조직 수복 및 증대를 위한 새로운 재료가 요구되고 있다. 안전하고, 주사 가능하며, 장기간 지속성이 있고, 생체흡수성이 있는 연조직 수복 및 증대용 재료가 요구되고 있다.

시험관내에서 배양된 ECM 조성물은 또한 손상된 심근 및 관련 조직 등의 손상된 조직을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이 조성물은 임플란트로서, 또는 심장 및 관련 조직 등의 장기에서의 혈관신생을 촉진하기 위한 혈관 보철 또는 스텐트와 같은 이식형 디바이스 상의 생물학적 코팅으로서 유용하다.

관상동맥 질환(CAD: coronary artery disease)으로도 불리는 관상동맥 심장 질환(CHD: coronary heart disease), 허혈성 심장 질환 및 죽상경화성 심장 질환은 심장에 혈액과 산소를 공급하는 작은 혈관의 협착을 특징으로 한다. 관상동맥 심장 질환은 일반적으로 죽상경화증으로 불리는 병태에 의해 유발되는데, 죽상동맥경화증은 지방 물질 및 플라크가 동맥벽에 축적되어 동맥을 협착시킬 때 일어난다. 관상동맥이 협착됨에 따라, 심장으로 전달되는 혈류는 감속되거나 중단되고, 이로써 가슴 통증(안정 협심증), 호흡 곤란, 심장 마비 및 기타 다른 증상이 발생할 수 있다.

관상동맥 심장 질환(CHD)은 미국에서의 남성 및 여성의 주된 사망 원인이다. 미국 심장 학회(American heart Association)에 따르면, 1500만명 이상의 사람들이 몇 가지 유형의 이 병을 앓고 있다고 한다. 관상동맥 심장 질환의 증상과 징후는 이 질환이 진행된 상태에서는 분명하게 나타나지만, 대부분의 관상동맥 심장 질환 환자들은 병이 진행되는 수십년 동안 어떠한 증거도 보이지 않다가 갑작스러운 심장 마비를 겪게 된다. 이 병이 돌연사의 가장 일반적 원인이며, 또한 20세 이상의 남성과 여성의 가장 일반적인 사망 원인이다. 미국 내에서의 현 추세에 따르면, 장래에는 건강한 40대 남성의 1/2과 건강한 40대 여성의 1/3에게서 CHD가 발병하게 될 것이다.

이환된 심장 또는 기타 다른 손상된 심장에서 혈류를 개선시키기 위한 현행 방법은 관상동맥 우회술, 혈관성형술 및 동맥내막절제술 등의 칩습성 수술 기법을 포함한다. 이러한 수술은 본래 수술 중과 수술 후 고유 위험도가 매우 높고, 대개는 심장 허혈의 임시 치료책에 불과하다. 따라서, 현재 이용할 수 있는, CHD 관련 증상의 치료 기법에 대한 성공률을 높이기 위해서는 새로운 치료 옵션이 필요하다.

시험관내에서 배양된 ECM 조성물은 또한 연골 또는 골연골 세포 등의 손상된 세포 또는 조직의 수복 및/또는 재생에 이용될 수 있다. 골연골 조직은 골 또는 연골과 관련되어 있거나 이를 포함하는 임의의 조직이다. 본 발명의 조성물은, 골연골 결손, 예를 들어 퇴행성 결합 조직 질환, 예컨대 류마티스양 질환 및/또는 골관절염뿐만 아니라, 외상에 의한 연골 결손을 갖는 환자의 결손을 치료하는 데 유용하다.

골연골 결손을 수복하고자 하는 현행의 시도는 관절 연골 병변이 회복될 수 있는 가능성을 향상시키고자 하는 시도로 생체적합성 및 생체분해성 하이드로겔 이식편 중의 인간 연골 세포를 이식하는 것을 포함한다. 추가로, 알기네이트 비드, 또는 폴리설페이트화 알기네이트를 포함하는 매트릭스 중에서 연골 세포를 배양하는 기법이 하이알린 유사 연골성 조직을 생성한다고 개시되었다. 그러나, 인간 자가 연골 세포를 이식함으로써 관절 연골의 내연골성 병변을 수복하고자 하는 시도는 제한된 성공만을 거두었다. 따라서, 골연골 결손을 치료하기 위한 현재 이용 가능한 기법의 성공률을 증가시키기 위해서는 새로운 치료 옵션이 필요하다.

시험관내에서 배양된 ECM 조성물은 또한 조작 공학적으로 처리된 조직 임플란트의 생성을 위한 조직 배양 시스템에서 유용하다. 조직 공학 분야는 새로운 생물학적 조직을 생성하거나 손상된 조직을 수복하기 위해 세포 배양 기술을 이용하는 것을 포함한다. 부분적으로는 줄기 세포 기술의 발전에 의해 가속화된 조직 공학 기술은 외상 후 조직 재생 및 치환 또는 퇴행성 질환의 치료에 대한 전망을 밝게 한다. 이는 또한 미용 수술과 관련해서도 이용될 수 있다.

조직 공학 기술은 다양한 세포 유형과 배양 기법을 이용하여 자가 조직 또는 세포 및 이종성 조직 또는 세포 둘 다를 생성하는 데에도 이용될 수 있다. 자가 임플란트를 제작할 때에는, 도너 조직을 수거하여 개별 세포로 분리한 후, 기능성 조직의 원하는 부위에 이식하고자 하는 기재 상에 부착시킨 후 배양한다. 다수의 단리된 세포 유형을 세포 배양 기법을 이용하여 시험관내에서 증식시킬 수 있지만, 부착 의존성 세포(anchorage dependent cell)는 대개 증식을 위한 주형으로서 작용을 할 수 있는 3차원 스캐폴드의 존재를 비롯한 특정 환경을 필요로 한다.

현행 조직 공학 기술은 일반적으로 인공 임플란트를 제공한다. 세포 이식 요법의 성공 여부는 시험관내 조직 배양과 생체내 조직 배양 양자를 위한 적합한 기재의 개발 여부에 달려 있다. 따라서, 천연 재료만을 포함하고 이식에 적합한 세포외 기질을 개발하는 것은 내인성 조직의 더 많은 특징들을 갖게 될 것이다. 따라서, 천연 세포외 기질 재료의 개발이 조직 공학 분야에 있어서의 계속되는 현재의 도전 과제이다.

본 발명은, 부분적으로는, 생체내에서의 암 세포의 성장을 억제할 수 있는 세포외 기질(ECM) 조성물을 발견한 것에 기초한 것이다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명은 암 세포를 본원에 기재된 세포외 기질과 접촉시킴으로써 암 세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 세포 또는 조직을 화학요법제 함유 세포외 기질 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 또는 조직에 화학요법제를 전달하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 ECM 및 화학요법제를 함유하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 면역조절제를 추가로 함유한다.

본 발명의 예시적인 실시형태는 첨부 1에서 추가로 기술되며, 그 전체 내용은 본원에서 참고로 포함한다.

도 1은 CAM 분석에서 ECM 존재 및 부재 하에서의 B16 세포의 종양 중량의 플롯을 도시한다.
도 2는 CAM 분석에서 ECM 존재 및 부재 하에서의 B16 세포의 종양 중량의 플롯을 도시한다.
도 3은 CAM 분석에서 ECM 부재하에, ECM과 혼합 시, 또는 ECM 상에서 증식된 B16 세포의 종양 중량의 플롯을 도시한다.
도 4는 CAM 분석에서 ECM 존재 및 부재, 시스플라틴 존재 또는 부재 하에서의 C6 세포의 종양 중량의 플롯을 도시한다.
도 5는 CAM 분석에서 ECM 존재 및 부재, 시스플라틴 존재 또는 부재 하에서의 C6 세포의 종양 중량의 플롯을 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 ECM 존재 또는 부재 하에 증식된 C6 신경교종 종양의 조직학적 분석 사진을 도시한다.
도 7은 CAM 분석에서 ECM 존재 및 부재 하에 증식된 MDA 435 세포의 종양 중량의 플롯을 도시한다.
도 8은 누드 마우스에서의 미처리 C6 세포의 종양 성장의 사진을 도시한다.
도 9는 누드 마우스에서의 hECM 처리 C6 세포의 종양 성장의 사진을 도시한다.
도 10은 누드 마우스에서의 ECM 및 시스플라틴 처리 C6 세포의 종양 성장의 사진을 도시한다.
도 11은 누드 마우스에서의 시스플라틴 처리 C6 세포의 종양 성장의 사진을 도시한다.
도 12는 ECM 존재 또는 부재 하에, 시스플라틴 존재 또는 부재 하에 누드 마우스에서의 C6 신경교종 종양 성장의 플롯을 도시한다.
도 13a∼d는 처리 안함(도 13a), hECM 처리(도 13b), hECM + 시스플라틴 처리(도 13c) 및 hECM + 시스플라틴 처리(도 13d)의 누드 마우스의 MDA 435 세포의 종양 성장의 사진을 도시한다.
도 14는 ECM 존재 또는 부재, 시스플라틴 존재 또는 부재 하에서의 누드 마우스의 MDA 435 종양 성장의 플롯을 도시한다.
도 15는 설치류에서의 ECM 존재(오른쪽 검체) 및 ECM 부재(왼쪽 검체) 하에서의 B16 세포의 종양 성장 사진을 도시한다.
도 16은 CAM 분석에서 액체 ECM 존재 및 부재 하에서의 B16 세포의 종양 중량의 플롯을 도시한다.
도 17은 CAM 분석에서 액체 ECM 존재 및 부재 하에 증식된 B16 세포의 종양 중량의 용량 반응 곡선을 도시한다.
도 18은 CAM 분석에서 다양한 분자량 분획의 액체 ECM에서 증식된 B16 세포의 종양 중량의 플롯을 도시한다.

본 발명은, 단독으로 또는 화학요법제의 전달을 위한 생물학적 운반체로서 암 세포의 성장 또는 증식의 억제를 위해 세포외 기질 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 조성물 및 방법을 기술하기에 앞서, 기술되는 특정 조성물, 방법 및 실험 조건은 달라질 수 있기 때문에, 본 발명이 그러한 조성물, 방법 및 조건에 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정되기 때문에, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 것이지 한정을 의도한 것이 아님을 이해하여야 한다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용될 때, 단수 형태의 표현은 문맥상 명백히 다른 것을 나타내지 않는 한 복수의 개념을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"이라고 언급한 것은 본원에 기술된 유형의 하나 이상의 방법들 및/또는 단계들을 포함하는 것이며, 이는 본 명세서 등을 읽을 때 당업자에게는 자명할 것이다.

본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명은 암 세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 암 세포를 세포외 기질 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, ECM은 가용성 분획일 수 있으며, 다른 실시형태에서, ECM은 불용성 분획일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, ECM은 가용성 분획과 불용성 분획의 조합일 수 있다.

특정 실시형태에서, 상기 암 세포는 종양으로부터 유래된 것이다. 일부 양태에서, 상기 암은 흑색종, 신경교종 및 선암종으로 구성된 군에서 선택된다. 다른 양태에서, 상기 암은 부신, 방광, 골, 골수, 뇌, 척추, 유방, 자궁경부, 담낭, 신경절, 위장관, 위, 결장, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 타액선, 피부, 췌장, 고환, 흉선, 갑상선 또는 자궁의 암이다. 일 양태에서, 상기 암은 유방암이고, 또 다른 양태에서, 상기 암은 흑색종이다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 화학요법제를 암 세포에 전달하는 방법으로서, 암 세포를 화학요법제 함유 세포외 기질 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

일 양태에서, 상기 접촉은 종양을 절제해 낸 부위의 수술 절제연에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 종양은 임상의가 알고 있는 표준 수술 기법을 이용하여 피험체로부터 제거한다. 본 발명의 ECM 조성물은, ECM이 수술 절제연과 접촉하도록 종양 절개(절제) 시 남겨진 영역에 배치될 수 있다. 특정 실시형태에서, ECM은 종양 변연부 내에 존재하는 암 세포의 성장을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, ECM 조성물은 면역조절제 유무 하에 화학요법제를 추가로 포함할 수 있다. 수술 절제 후 암 치료에 본 발명의 ECM 조성물을 사용하는 것은 종양 부위로 화학요법제 및/또는 면역조절제를 국소 전달 및 서방형 전달할 수 있다는 이점을 갖는다. 추가적인 이익으로는 수술 상처의 치유 개선과 미용적 결과의 개선을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 ECM 및 화학요법제를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 면역조절제를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 세포외 기질 조성물은 적절한 증식 배지 중에서 저산소 조건 하에 2차원 또는 3차원 표면 상에서 세포를 배양함으로써 제조된다. 이 배양 방법에 의하면, 다양한 용도를 갖는 생리학적으로 허용되는 조성물을 얻기 위해 개별적으로 또는 조합하여 이용될 수 있는 가용성 분획과 불용성 분획을 제조할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 세포는 표준 또는 정상 산소 조건 하에 배양될 수 있다.

본 발명의 조성물은 암 세포의 성장 또는 증식의 억제, 치료제의 전달, 손상된 세포 또는 조직의 수복 및/또는 재생의 촉진, 조직 재생을 촉진하기 위한 패치에서의 사용, 줄기 세포 등의 세포 배양을 위한 조직 배양 시스템에서의 사용, 이식형 디바이스(예를 들어, 인공심박조율기, 스텐트, 스텐트 그래프트, 혈관 보철, 심장 밸브, 션트, 약물 전달 포트 또는 카테터)와 함께 사용되는 표면 코팅에서의 사용, 연질 조직 수복의 촉진, 주름과 같은 피부 표면의 강화 및/또는 개선, 생물학적 유착 방지제로서의 사용 또는 세포 전달 또는 전달 부위에서의 유지를 위한 생물학적 운반체로서의 사용을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다양한 용도를 갖는다.

본 발명은, 부분적으로, 신생혈관형성 전 초기 배아 환경(저산소 상태 및 감소된 중력)을 모의하는 조건 하에 2차원 또는 3차원 표면 상에서 배양된 세포가 배아 단백질의 생성을 비롯한 태아 특성을 갖는 세포외 기질 조성물을 생산한다는 발견에 기초한 것이다. 저산소 상태 하에서의 세포의 배양은 태아 특성 및 성장 인자 발현을 갖는 독특한 ECM을 나타낸다. 종래의 배양 조건 하에서의 ECM의 배양과는 달리, 저산소 조건 하에서 배양된 ECM에서는 5,000종 이상의 유전자가 차등적으로 발현된다. 이로 인해 상이한 특성과 상이한 생물학적 조성을 갖는 배양된 ECM이 얻어진다. 예를 들어, 저산소 조건 하에 생성된 ECM은 III형, IV형 및 V형 콜라겐과 당단백질, 예컨대 피브로넥틴, SPARC, 트롬보스폰딘 및 하이알루론산이 비교적 풍부하다는 점에서 태아 중간엽 조직과 유사하다.

저산소 조건은 또한 상처 치유 및 기관형성을 조절하는 인자, 예컨대 VEGF, FGF-7 및 TGF-β뿐만 아니라, wnts 2b, 4, 7a, 10a 및 11을 비롯한 복수의 Wnt 인자의 발현을 증대시킨다. 배양된 배아 인간 ECM은 또한 효소 활성 증가로 측정되는 바와 같이 시험관내에서의 인간 섬유아세포에서의 대사 활성의 증가를 촉진한다. 또한, 배양된 배아 ECM에 반응하여 세포수 증가가 나타난다.

다양한 실시형태에서, 본 발명은 1종 이상의 배아 단백질을 포함하는 세포외 기질 조성물의 제조 방법 및 그 용도를 포함한다. 특히, 이 조성물은, 저산소 조건 하에, 적절한 증식 배지 중에서 2차원 또는 3차원 표면 상에서 세포를 배양함으로써 생성된다. 상기 조성물은 2차원 또는 3차원 프레임워크 상에서 세포를 배양하여 다층 세포 배양 시스템을 형성하는 것에 의해 유도된다. 본 발명에 따르면, 프레임워크 지지체 상에서 배양된 세포는 다층으로 성장하여 세포 기질을 형성하게 된다. 배양 세포를 저산소 조건 하에 성장시키면, 저산소 배양 조건으로 인해 종래의 배양과 비교하여 차등적인 유전자 발현이 나타난다.

세포외 기질(ECM)은 세포 배양에 의해 생성되는 조직을 실질적으로 포함하는 생체고분자 및 단백질의 조성물이다. 섬유아세포 등의 스트로마 세포는 세포 배양에 적합한 재료 및 표면에 부착된 상태에서 성장되어야 하는 부착 의존성 세포 유형이다. 배양 세포에 의해 생성된 ECM 재료는 3차원 배열로 퇴적되어 조직 유사 구조의 형성을 위한 공간을 제공한다.

3차원 구조를 제공하는 배양 재료를 스캐폴드라 칭한다. ECM의 퇴적을 위한 공간은, 예를 들어, 직물 메쉬 또는 마이크로캐리어로 불리는 구형 비드의 콤팩트한 구조 내에 형성된 간극 공간 내의 개구 형태로 존재한다.

본원에서 사용될 때, "세포외 기질 조성물"은 가용성 분획과 불용성 분획 양자, 또는 이의 임의의 일부분 또는 조합을 포함한다. 불용성 분획은 지지체 또는 스캐폴드 상에 퇴적되는 분비형 세포외 기질 단백질 및 생물학적 성분을 포함한다. 가용성 분획이란, 세포가 배양되고 세포가 활성 물질(들)을 분비하는 배양 배지를 의미하며, 스캐폴드 상에 퇴적되지 않는 단백질 및 생물학적 성분을 포함한다. 상기 두 분획 모두 수집하여 경우에 따라 추가로 처리하여 개별적으로 또는 조합하여 본원에 기재된 다양한 용도에 사용할 수 있다. ECM은 또한 사체 조직으로부터 얻을 수도 있다(미국 특허 제6,284,284호 및 제6,372,494호).

상기 가용성 분획을 최적 농도에 도달하도록 농축하거나 희석할 수 있다. 특정 실시형태에서, 농도는 약 1 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 100 mg/mL, 또는 약 200 mg/mL일 수 있다. 농도는 약 0.1 mg/mL∼약 1,000 mg/mL, 또는 약 1 mg/mL∼200 mg/mL, 또는 약 10 mg/mL∼100 mg/mL일 수 있다.

상기 가용성 분획을, 분획 중 용질 분자의 대부분이 특정 분자량 컷오프를 충족하도록, 분자량에 따라 (예를 들어, 투석, 여과 또는 크로마토그래피에 의해) 추가로 분획화할 수 있다. 컷오프 값은 절대적인 것은 아니지만 특정 분획 중에 포함된 용질 분자의 대부분(예를 들어, 70%, 80%, 90% 또는 95%)이 분자량 컷오프를 충족시킨다는 것을 알 것이다. 따라서, 본원에 제공된 방법의 특정 실시형태에서, ECM 조성물은, 그 안에 포함된 용질 분자의 70% 또는 80% 또는 90%가 5,000 달톤 미만 또는 10,000 달톤 미만, 또는 30,000 달톤 미만, 또는 100,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 가용성 분획을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, ECM은, 그 안에 포함된 용질 분자가 5,000 달톤 초과, 또는 10,000 달톤 초과, 또는 30,000 달톤 초과, 또는 100,000 달톤 초과의 분자량을 갖는 가용성 분획을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, ECM은, 그 안에 포함된 용질 분자가 10,000∼10,000 달톤, 또는 30,000∼100,000 달톤, 또는 10,000∼30,000 달톤의 분자량을 갖는 가용성 분획을 포함할 수 있다.

스트로마 세포 배양에 사용되는 2차원 또는 3차원 지지체 또는 스캐폴드는 (a) 세포가 이것에 부착될 수 있게 하고(또는 세포가 이것에 부착될 수 있도록 변형될 수 있고); (b) 세포가 1층보다 많은 층으로 성장할 수 있게 하는(즉, 3차원 조직을 형성할 수 있게 하는) 임의의 재료 및/또는 형상의 것일 수 있다. 다른 실시형태에서, 실질적으로 2차원인 시트 또는 막을 이용하여 형태적으로 충분히 3차원인 세포를 배양할 수 있다. 생체적합성 재료는 2차원 또는 3차원 구조 또는 스캐폴드로 형성되며, 이때 상기 구조는 세포가 3차원 조직으로 성장하도록 세포의 부착 및 성장을 위한 간극 공간을 갖는다. 일부 실시형태에서, 프레임워크의 개구 및/또는 간극 공간은 세포가 개구 또는 간극 공간을 가로질러 신장할 수 있도록 하는 적절한 크기의 것이다. 세포가 활발하게 성장하여 프레임워크를 가로질러 신장할 수 있도록 유지시켜 주는 것이 본원에 기재된 활성을 담당하는 성장 인자의 레퍼토리 생산을 강화시키는 것으로 생각된다. 개구가 너무 작을 경우, 세포는 빠르게 포화 상태에 도달할 수 있지만, 메쉬를 쉽게 빠져 나오지 못할 수 있다. 이러한 포획된 세포는 증식을 보조하고 장기간의 배양을 유지시하는 데 필요한 적절한 인자의 생산을 접촉에 의해 억제시키고 중단시킬 수 있다. 개구가 너무 클 경우, 세포는 개구를 가로지르는 신장을 할 수 없고, 이로써 증식을 보조하고 장기간의 배양을 유지하는 데 필요한 적절한 인자의 스트로마 세포 내 생산은 감소할 수 있다. 일반적으로, 간극 공간은 약 100 ㎛ 이상, 140 ㎛ 이상, 약 150 ㎛ 이상, 약 180 ㎛ 이상, 약 200 ㎛ 이상, 또는 약 220 ㎛ 이상이다. 본 발명자들은, 본원에서 예시된 바와 같은 메쉬형의 매트릭스를 사용할 경우, 약 100 ㎛∼약 220 ㎛의 개구가 만족할 정도의 효과를 가져온다는 것을 발견하였다. 그러나, 프레임워크의 3차원 구조 및 복잡성에 따라서 다른 크기의 것도 허용될 수 있다. 세포가 신장할 수 있고 장기간 동안 계속하여 복제 및 성장할 수 있도록 하는 임의의 형상 또는 구조가 본 발명의 방법에 따른 세포 인자를 정교하게 하는 기능을 할 수 있다.

일부 양태에서, 3차원 프레임워크는 브레이드, 직조, 편성되거나, 또는 메쉬 또는 패브릭과 같이 프레임워크를 형성하도록 다르게 배열된 중합체 또는 쓰레드로부터 형성된다. 이 재료는 또한 재료의 캐스팅에 의해 또는 발포체, 매트릭스, 또는 스폰지 유사 스캐폴드로의 제작에 의해 형성될 수 있다. 다른 양태에서, 3차원 프레임워크는 중합체 또는 다른 섬유를 함께 압축시켜 간극 공간을 갖는 재료를 형성함으로써 제조된 매팅 섬유 형태이다. 3차원 프레임워크는 세포 배양을 위한 임의의 형태 또는 기하학적 구조를 가질 수 있다. 따라서, 이하에 추가로 기재하는 바와 같은 다른 형태의 프레임워크도 적절한 컨디셔닝된 배지를 생성하는 데 충분할 수 있다.

스캐폴드 또는 프레임워크를 형성하는 데 다종 다양한 재료가 사용될 수 있다. 이러한 재료로는 비중합체 재료와 중합체 재료를 포함한다. 중합체가 사용될 경우, 이 중합체는 임의의 유형의 중합체, 예컨대, 단독중합체, 랜덤 중합체, 공중합체, 블록 중합체, 블록 공중합체(예컨대, 이량체, 삼량체 등), 선형 또는 분지형 중합체 및 가교결합 또는 비가교결합 중합체일 수 있다. 스캐폴드 또는 프레임워크로서 사용하기 위한 재료의 비한정적인 예로는 특히 유리 섬유, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드(예를 들어, 나일론), 폴리에스테르(예를 들어, 데이크론), 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 화합물(예를 들어, 폴리비닐클로라이드; PVC), 폴리카보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; 테플론(TEFLON)), 써마녹스(TPX), 니트로셀룰로스, 다당류(예를 들어, 셀룰로스, 키토산, 아가로스), 폴리펩티드(예를 들어, 실크, 젤라틴, 콜라겐), 폴리글리콜산(PGA) 및 덱스트란을 들 수 있다.

일부 양태에서, 상기 프레임워크는 사용 조건 하에서 시간이 경과함에 따라 분해되는 재료로 제조될 수 있다. 생체분해성이란 또한 생체내에 투여될 때 또는 시험관내 조건 하에서의 화합물 또는 조성물의 흡수성 또는 분해를 의미한다. 생체분해는 직접적 또는 간접적인 생물학적 제제의 작용을 통해 일어날 수 있다. 생체분해성 재료의 비한정적인 예로는 특히 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(즉, PLGA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리카프로락톤, 장선 봉합 재료, 콜라겐(예를, 말 콜라겐 발포체), 폴리락트산 또는 하이알루론산을 들 수 있다. 예를 들어, 이들 재료는 콜라겐 스폰지 또는 콜라겐 겔과 같은 3차원 프레임워크로 직조될 수 있다.

다른 양태에서, 배양물을 장기간 동안 유지하고/하거나 저온 보존하고/하거나 추가적인 구조적 일체성이 필요한 경우, 3차원 프레임워크는 비생체분해성 재료로 이루어져도 좋다. 본원에서 사용될 때, 비생체분해성 재료란 배양 배지 중의 조건 하에 현저히 분해 또는 붕괴되지 않는 재료를 말한다. 예시적인 비분해성 재료로는 비한정적인 예로서 나일론, 데이크론, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 발포 PTFE(ePTFE) 및 셀룰로스를 들 수 있다. 예시적인 비분해성 프레임워크는 평균 공극 크기가 140 ㎛이고 나일론 섬유의 평균 직경이 90 ㎛인 나일론 여과 메쉬인 상표명 니텍스(Nitex)^®(#3-210/36, 뉴욕 소재의 Tetko, Inc.)로서 시판되는 나일론 메쉬를 포함한다.

다른 양태에서, 스캐폴드 또는 프레임워크는 생체분해성 재료와 비생체분해성 재료의 조합이다. 비생체분해성 재료는 배양 과정에서 스캐폴드에 안정성을 제공하는 반면, 생체분해성 재료는 치료 용도에 충분한 세포 인자를 생산하는 세포 네트워크를 생성하기에 충분한 간극 공간이 형성될 수 있도록 한다. 생체분해성 재료는 비생체분해성 재료 상에 코팅될 수 있거나, 메쉬로 직조, 편조 또는 성형될 수 있다. 생체해성 재료와 비생체분해성 재료의 다양한 조합이 이용될 수 있다. 예시적인 조합으로는, 극성 구조체를 얻기 위해서 얇은 생체분해성 중합체 필름인 폴리[D-L-락트-코-글리콜산)으로 코팅된 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)(PET) 직물이 있다.

다양한 양태에서, 스캐폴드 또는 프레임워크 재료는 세포 부착을 향상시키기 위해 세포 접종 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포 접종 전에 나일론 스크린을 0.1 M 아세트산으로 처리하고, 폴리리신, 소 태아 혈청 및/또는 콜라겐 중에서 인큐베이션하여 나일론을 코팅한다. 폴리스티렌은 유사하게 황산을 이용하여 처리할 수 있다. 다른 실시형태에서, 3차원 지지체 프레임워크의 존재 하에서 세포를 성장시키는 것은 세포 부착을 개선하기 위해 단백질(예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴 섬유, 망상 섬유), 당단백질, 글리코스아미노글리칸(예를 들어, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트 등), 피브로넥틴, 및/또는 당중합체(폴리[N-p-비닐벤질-D-락토아미드], PVLA)을 프레임워크에 첨가하거나 이것으로 코팅함으로써 추가로 향상시킬 수 있다. 스캐폴드 또는 프레임워크의 처리는 재료가 세포 부착에 불량한 기재일 경우에 유용하다.

일 양태에서, ECM 제조에 메쉬가 사용된다. 메쉬는 약 100 ㎛의 개구와 약 125 ㎛의 두께를 갖는 평직 형태의 직조 나일론 6 재료이다. 배양 상태에서, 섬유아세포인 세포는 하전된 단백질과의 상호작용을 통해 나일론에 부착하게 되고, ECM 단백질을 생산하고 퇴적시키면서 메쉬의 공극 내로 성장하게 된다. 지나치게 크거나 작은 메쉬 개구는 효과적이지 않을 수 있지만, ECM을 생산하고 퇴적시킬 수 있는 능력을 실질적으로 변경하지 않고 시키지 않는다면 메쉬 개구는 상기와 다를 수 있다. 또 다른 양태에서, 세포 성장과 ECM 퇴적에 적합한 기하학적 형태를 제공하는 직물 구성의 다른 직조 재료, 예컨대 폴리올레핀이 ECM 제조에 사용된다.

예를 들어, 원하는 크기로 절단하고, 0.1∼0.5 M 아세트산으로 세척한 후, 고순도 물로 세정한 뒤 스팀 멸균 처리함으로써, 본 발명의 단계 중 임의의 단계에서의 배양을 위한 나일론 메쉬를 제조한다. ECM 제조를 위한 3차원 스캐폴드로서 사용하기 위해, 메쉬를 약 10 cm×10 cm 크기의 사각형으로 만든다. 그러나, 메쉬의 크기는 목적하는 용도에 적합한 임의의 크기일 수 있고, 접종, 세포 성장 및 ECM 생산을 위한 배양 방법 및 최종 형태로의 제조를 비롯한 본 발명의 임의의 방법에 사용될 수 있다.

다른 양태에서, 배양된 3차원 조직을 생성하기 위한 스캐폴드 또는 프레임워크는 마이크로캐리어로 이루어진다. 비드는 미시적이거나 거시적인 것일 수 있고, 조직 내로 침투되거나 특정 기하학적 형태로 압축될 수 있도록 추가로 치수 조정이 될 수 있다. 몇몇 조직 침투 실시형태에서, 세포 배양을 위한 프레임워크는 세포와 함께 3차원 조직을 형성하는 입자를 포함한다. 세포는 입자에 부착되고 서로에 부착됨으로써 3차원 조직을 형성하게 된다. 입자와 세포로 이루어진 복합체 크기는 주사 또는 카테터에 의해 조직 또는 장기 내로 투여되기에 충분한 크기이다.

본원에서 사용될 때의 "마이크로캐리어"란 크기가 나노미터∼마이크로미터 크기를 갖는 입자를 말하는 것으로서, 여기서 입자는 불규칙형, 비구형, 구형, 또는 타원체인 임의의 형상 또는 기하학적 형태를 가질 수 있다. 일반적으로, 비드 또는 마이크로캐리어 상에서의 성장이 2차원 시스템 또는 스캐폴드 또는 프레임워크로서 지칭된다.

본원의 목적에 적합한 마이크로캐리어의 크기는 특정 용도에 적합한 임의의 크기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 3차원 조직에 적합한 마이크로캐리어의 크기는 주사에 의해 투여될 수 있는 크기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 마이크로캐리어의 입자 크기는 약 1 ㎛ 이상, 약 10 ㎛ 이상, 약 25 ㎛ 이상, 약 50 ㎛ 이상, 약 100 ㎛ 이상, 약 200 ㎛ 이상, 약 300 ㎛ 이상, 약 400 ㎛ 이상, 약 500 ㎛ 이상, 약 600 ㎛ 이상, 약 700 ㎛ 이상, 약 800 ㎛ 이상, 약 900 ㎛ 이상, 약 1000 ㎛ 이상의 범위이다.

일부 양태에서, 마이크로캐리어는 생체분해성 재료로 제조된다. 일부 양태에서, 상이한 생체분해성 중합체 층을 2층 이상 포함하는 마이크로캐리어가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 바깥쪽 제1 층은 배양물 중에서 3차원 조직을 형성하는 생체분해성 특성을 갖는 반면, 제1 층과는 상이한 특성을 갖는 생체분해성의 적어도 안쪽의 제2 층은 조직 또는 장기 내로 투여될 때 침식된다.

일부 양태에서, 마이크로캐리어는 다공성 마이크로캐리어이다. 다공성 마이크로캐리어란 분자가 이를 통과하여 마이크로입자 안팎으로 확산될 수 있는 간극을 갖는 마이크로캐리어를 의미한다. 다른 실시형태에서, 마이크로캐리어는 비다공성 마이크로캐리어이다. 비다공성 마이크로입자란 특정 크기를 갖는 분자는 마이크로입자의 안팎으로 확산되지 못하는 마이크로입자를 의미한다.

조성물에 사용하기 적합한 마이크로캐리어는 생체적합성이며 세포에 대한 독성이 적거나 없는 것이다. 적합한 마이크로캐리어는 치료하고자 하는 조직, 치료하고자 하는 손상의 유형, 원하는 치료 기간, 생체내에서의 세포 배양물의 수명 및 3차원 조직을 형성하는 데 소요되는 시간에 따라 선택될 수 있다. 마이크로캐리어는 천연 또는 합성, 하전된(즉, 음이온성 또는 양이온성) 또는 비하전된 것, 생체분해성, 또는 비생체분해성의 다양한 중합체일 수 있다. 중합체는 단독중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 그래프트 공중합체 및 분지형 중합체일 수 있다.

일부 양태에서, 마이크로캐리어는 비생체분해성 마이크로캐리어를 포함한다. 비생체분해성 미세캡슐 및 마이크로캐리어는 폴리설폰, 폴리(아크릴로니트릴-코-비닐 클로라이드), 에틸렌-비닐 아세테이트, 하이드록시에틸메타크릴레이트-메틸-메타크릴레이트 공중합체로 제조된 것을 포함하지만, 이들에 한정되지 않다. 이들은 조직 벌크화 특성을 제공하거나, 마이크로캐리어를 체내에서 제거하는 실시형태에서 유용하다.

일부 양태에서, 마이크로캐리어는 분해성 스캐폴드를 포함한다. 이는 천연 중합체로 제조된 마이크로캐리어를 포함하며, 그 비한정적인 예로는 특히 피브린, 카세인, 혈청 알부민, 콜라겐, 젤라틴, 렉시틴, 키토산, 알기네이트 또는 폴리아미노산, 예컨대 폴리리신을 들 수 있다. 다른 양태에서, 분해성 마이크로캐리어는 합성 중합체로 제조된 것이며, 그 비한정적인 예로는 특히, 폴리락티드(PLA), 폴리글리콜리드(PGA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA), 폴리(카프로락톤), 폴리디옥사논 트리메틸렌 카보네이트, 폴리하이드록시알코네이트(예를 들어, 폴리(하이드록시부티레이트), 폴리(에틸 글루타메이트), 폴리(DTH 이미노카보닐(비스페놀 A 이미노카보네이트), 폴리(오르토 에스테르) 및 폴리시아노아크릴레이트를 들 수 있다.

일부 양태에서, 마이크로캐리어는 하이드로겔을 포함하는데, 하이드로겔은 일반적으로 물이 충전된 친수성 중합체 네트워크이다. 하이드로겔은 중합체 팽윤의 선택적 트리거라는 장점을 갖는다. 중합체 네트워크의 조성에 따라, 마이크로입자의 팽윤은 pH, 이온 강도, 열, 전기, 초음파 및 효소 활성을 비롯한 다양한 자극에 의해 유발될 수 있다. 하이드로겔 조성물에 유용한 중합체의 비한정적인 예로는 특히 폴리(락티드-코-글리콜리드); 폴리(N-이소프로필아크릴아미드); 폴리(메타크릴산-g-폴리에틸렌 글리콜); 폴리아크릴산 및 폴리(옥시프로필렌-코-옥시에틸렌) 글리콜 중합체; 및 천연 화합물, 예컨대 콘드로이탄 설페이트, 키토산, 젤라틴, 피브리노겐, 또는 합성 및 천연 중합체의 혼합물, 예를 들어, 키토산-폴리(에틸렌 옥시드)로부터 형성된 것을 들 수 있다. 중합체는 가역적으로 또는 비가역적으로 가교결합됨으로써 3차원 조직 형성에 적합화될 수 있는 겔을 형성할 수 있게 된다.

본 발명에 따르면, 배양 방법은 스트로마 세포, 예컨대 섬유아세포, 및 특히, 1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 비롯한 다양한 유형의 세포를 증식시키는 데 적용될 수 있다. 다양한 양태에서, 프레임워크 상에 접종되는 세포는 이하에 추가로 기재하는 바와 같이 다른 세포 존재 또는 부재하에 섬유아세포를 포함하는 스트로마 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는, 일반적으로 (1) 뼈; (2) 소성 결합 조직(콜라겐 및 엘라스틴 포함); (3) 인대 및 힘줄을 형성하는 섬유성 결합 조직, (4) 연골; (5) 혈액의 세포외 기질; (6) 지방 세포를 포함하는 지방 조직; 및 (7) 섬유아세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는 결합 조직으로부터 유래된 스트로마 세포이다.

스트로마 세포는, (경우에 따라) 생검에 의해 또는 부검 시 얻을 수 있는, 다양한 조직 또는 장기, 예컨대 피부, 심장, 혈관, 골수, 골격근, 간, 췌장, 뇌, 포피로부터 유래된 것일 수 있다. 일 양태에서, 태아 섬유아세포는 신생아 포피와 같은 포피로부터 다량 얻을 수 있다.

일부 양태에서, 세포는 태아, 신생아, 성체 유래의 섬유아세포 또는 그 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 스트로마 세포는 다종 다양한 세포 및/또는 조직의 성장을 보조할 수 있는 태아 섬유아세포를 포함한다. 본원에서 사용될 때, 태아 섬유아세포는 태아 공급원으로부터 유래된 섬유아세포를 의미한다. 본원에서 사용될 때, 신생아 섬유아세포란 신생아 공급원으로부터 유래된 섬유아세포를 의미한다. 적절한 조건 하에서 섬유아세포는 다른 세포, 예컨대 골 세포, 지방 세포 및 평활근 세포 및 중배엽 기원의 기타 다른 세포를 발생시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 섬유아세포는, 피부로부터 유래된 섬유아세포인 진피 섬유아세포를 포함한다. 정상 인간 진피 섬유아세포는 신생아 포피로부터 단리될 수 있다. 이들 세포는 일반적으로 1차 배양 종료시에 냉동 보존된다.

다른 양태에서, 3차원 조직은 줄기 세포 또는 전구 세포를 단독으로 또는 본원에서 언급된 임의의 세포 유형과의 조합으로 사용함으로써 제조될 수 있다. 줄기 세포 및 전구 세포의 예로는 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 뉴런 줄기 세포, 표피 줄기 세포 및 간엽 줄기 세포를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

일부 실시형태에서, "특이적인" 3차원 조직은 특정 장기, 즉, 피부, 심장으로부터 유래된 세포, 및/또는 본원에 기재된 방법에 따라 배양 증식시킨 세포 및/또는 조직을 추후에 받게 되는 특정 개체로부터 유래된 세포를 스캐폴드에 접종하는 것에 의해 제조된다.

생체내에서의 특정 용도를 위해서는, 환자 자신의 조직으로부터 스트로마 세포를 얻는 것이 바람직할 수 있다. 스트로마 지지체 프레임워크의 존재 하에서의 세포 증식은 단백질, 예를 들어 콜라겐, 라미닌, 탄성 섬유, 망상 섬유, 당단백질; 글리코스아미노글리칸, 예를 들어 헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트 등; 세포 기질, 및/또는 기타 다른 재료를 프레임워크에 첨가하거나, 이것으로 프레임워크 지지체를 코팅함으로써 추가로 향상시킬 수 있다.

따라서, 본원에 기재된 2차원 또는 3차원 배양 시스템이 다양한 세포 유형 및 조직의 증식에 적합하기 때문에, 배양하고자 하는 조직 및 원하는 콜라겐 유형에 따라, 프레임워크에 접종하기 위한 적절한 스트로마 세포를 선택할 수 있다.

본 발명의 방법 및 용도는 본원에서 언급된 상이한 세포 유형, 예컨대 조직 특이적 세포, 또는 상이한 유형의 스트로마 세포와 함께 이용하기에 적합하지만, 본 발명에 사용하기 위한 세포의 유래는 또한 종 특이적일 수 있다. 따라서, 종 특이적인 ECM 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 세포는 인간 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 인간 섬유아세포일 수 있다. 또한, 세포는 또 다른 종의 동물로부터 유래된 세포, 예컨대, 말과(말), 개과(개), 또는 고양이과(고양이) 세포이다. 추가로, 다른 종 또는 관련 계통(예를 들어, 동종이계, 동계 및 이종 발생성)에 사용하기 위한 ECM 조성물을 제조하기 위해 하나의 종 또는 종 계통으로부터 유래된 세포가 사용될 수 있다. 다중 종 ECM 조성물을 제조하기 위해 다양한 종으로부터 유래된 세포가 병용될 수 있다는 것도 이해되어야 한다.

따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 인간이 아닌 동물을 포함하는 용도에도 적합하다. 본원에서 사용될 때, "수의학"이란 동물, 특히, 가축의 의학적 또는 외과적 치료에 관한 또는 그와 관련된 의학을 의미하는 것이다. 일반적인 수의학적 동물로는 포유동물, 양서류, 조류, 파충류 및 어류를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전형적인 동물로는 개, 고양이, 말, 토끼, 영장류, 설치류 및 가축, 예컨대 소, 말, 염소, 양 및 돼지를 포함할 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 추가적인 세포가 스트로마 세포를 포함하는 배양물 중에 존재할 수 있다. 이러한 추가적인 세포는 많은 유익한 효과를 가질 수 있는데, 그 중에서도 특히, 배양 상태에서의 장기간의 증식을 지지한다는 점, 성장 인자의 합성을 증대시킨다는 점 및 세포가 스캐폴드에 부착되는 것을 촉진한다는 점을 비롯한 효과를 가질 수 있다. 추가적인 세포 유형으로는 평활근 세포, 심장근 세포, 내피 세포, 골격근 세포, 내피 세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵구 및 지방세포를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 세포는 섬유아세포와 함께, 또는 일부 양태에서는 섬유아세포 부재 하에, 프레임워크 상에 접종될 수 있다. 이들 스트로마 세포는 비한정적인 예로서 피부, 심장, 혈관, 골수, 골격근, 간, 췌장 및 뇌를 포함하는 적절한 조직 또는 장기로부터 유래될 수 있다. 다른 양태에서, 섬유아세포를 제외한, 1종 이상의 기타 다른 세포 유형을 스캐폴드 상에 접종한다. 추가의 다른 양태에서, 스캐폴드에 섬유아세포인 세포만을 접종한다.

섬유아세포는 섬유아세포의 공급원으로서의 역할을 할 수 있는 적절한 기관 또는 조직을 분해시킴으로써 쉽게 단리될 수 있다. 예를 들어, 조직 또는 기관을 기계적으로 분해시키고/시키거나, 이웃 세포 간의 결합을 약화시키는 분해 효소 및/또는 킬레이트제로 처리함으로써, 현저한 세포 파괴 없이 조직을 개별 세포의 현탁액으로 분산시킬 수 있다. 효소에 의한 분해는, 조직을 잘게 썰고, 이 잘게 썬 조직을 다수의 분해 효소 중 어느 하나 또는 그 조합으로 처리함으로써 실시할 수 있다. 이러한 효소로는 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 엘라스타제, 하이알루로니다제, DNA 분해효소, 프로나제 및/또는 디스파제 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 기계적 파괴는, 그라인더, 블렌더, 체, 균질기, 압력 셀, 또는 인소네이터(insonator) 등을 이용하는 방법(여기에 한정되지 않음)을 비롯하여 다수의 방법에 의해 수행할 수 있다. 일 양태에서, 절제된 포피 조직을 일반적으로 콜라게나제 및/또는 트립시나제 같은 분해 효소를 사용하여 처리함으로써 세포를 캡슐화 구조체로부터 해리시킬 수 있다.

섬유아세포의 단리는, 예를 들어 하기와 같이 수행할 수 있다: 새로운 조직 샘플을 철저히 세척하고 행크스 평형 염 용액(HBSS: Hanks' balanced salt solution) 중에서 잘께 썰어 혈청을 제거한다. 잘게 썬 조직을 새로 제조한 트립신 등의 분해 효소의 용액 중에서 1∼12시간 동안 인큐베이션한다. 이러한 인큐베이션 후, 해리된 세포를 현탁시키고 원심분리에 의해 펠릿을 만들어 배양 접시에 플레이팅한다. 모든 섬유아세포는 다른 세포보다 먼저 부착되기 때문에, 적절한 스트로마 세포를 선택적으로 단리하여 증식시킬 수 있다. 그 후, 단리된 섬유아세포를 포화 상태까지 증식시키고, 포화된 배양물로부터 채취하여 3차원 프레임워크 상에 접종할 수 있다(문헌[Naughton et al., 1987, J. Med. 18(3&4):219-250] 참조). 3차원 프레임워크에 고농도의 스트로마 세포, 예를 들어, 약 10⁶∼5×10⁷개의 세포/ml로 스트로마 세포를 접종하게 되면 단기간 내에 3차원 기질 지지체가 확립되게 된다.

조직을 개별 세포 현탁액으로 만들고 나면, 이 현탁액을 부분집단으로 분획화할 수 있으며, 이로부터 섬유아세포 및/또는 기타 다른 스트로마 세포 및/또는 구성요소가 얻을 수 있다. 이는 또한 특정 세포 유형의 클로닝 및 선별, 원치않는 세포의 선택적 파괴(음성 선별), 혼합 집단에서의 차등적인 세포 응집성에 기초한 분리, 냉동-해동법, 혼합 집단에서의 세포의 차등적인 부착 특성, 여과, 통상적인 원심분리 및 띠원심분리, 원심 세정 분리(역류 원심분리), 단위 중력 분리, 향류 분배, 전기영동 및 형광 활성화 세포 분류를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 표준 세포 분리 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 클론 선별 및 세포 분리 기법에 관한 리뷰를 위해서는 문헌[Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11 and 12, pp. 137-168]을 참조할 수 있다.

일 양태에서, 단리된 섬유아세포를 증식시켜 세포 은행을 구축할 수 있다. 세포 은행은, 다양한 양으로 다양한 시점에 배양 뱃치를 개시할 수 있고, 오염원 및 특이적인 세포 특징에 대해 세포를 우선적으로 테스트할 수 있도록 구축할 수 있다. 그 후, 세포 은행으로부터 얻은 섬유아세포를, 스캐폴드 시딩에 적절한 수준으로 세포수가 증가되도록 증식시킨다. 세포 및 세포 접촉 재료의 환경에의 노출을 포함하는 작업은 외래 물질 또는 바람직하지 않은 미생물의 오염 가능성을 줄이기 위해 무균 절차로 수행한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 세포를 단리한 후, 마스터 세포 은행을 구축하는 데 적합한 양이 되도록 세포를 몇 차례 계대배양할 수 있다. 그 후, 세포 은행을 회수하여 적절한 용기에 채워 넣고, 극저온 조건 하에 보존할 수 있다. 냉동 바이알에 담긴 마스터 세포 은행의 세포를 해동시켜, 추가적인 계대배양(일반적으로 2회 이상)을 통해 증식시킬 수 있다. 그 후, 이 세포를 극저온에서 보존되는 상용(working) 세포 은행을 제조하는 데 사용할 수 있다.

세포 증식 단계는, 메쉬 또는 마이크로캐리어와 같은 3차원 스캐폴드 또는 지지체에 접종하기 위해 세포수를 추가로 늘리기 위해, 상용 세포 은행 단계의 세포 바이알을 사용한다. 매회의 계대는, 세포를 성장 표면에 접종하고 인큐베이션하고 세포에 영양을 공급하고 회수하는 일련의 계대배양 단계이다.

세포 은행 및 세포 증식을 위한 배양은 배양 플라스크, 롤러 보틀 또는 마이크로캐리어와 같은 배용 용기에 접종함으로써 수행할 수 있다. 섬유아세포와 같은 스트로마 세포는 의도된 세포 표면에 부착하여 증식 배지 존재 하에 증식한다. 배양 플라스크, 롤러 보틀 또는 마이크로캐리어와 같은 배양 용기는 특별히 세포 배양에 알맞게 구성되며, 통상적으로 의도된 용도에 적격인 다양한 플라스틱 재료로 제조된다. 마이크로캐리어는 일반적으로 미시적 또는 거시적인 비드이며, 일반적으로 다양한 플라스틱 재료로 제조된다. 그러나, 이것은 기타 다른 물질, 예컨대 유리 또는 고체/반고체의 생물계 물질, 예컨대 상기에 언급된 것과 같은 콜라겐 또는 기타 다른 물질, 예컨대 덱스트란, 변형 당 복합체로부터 제조될 수 있다.

배양 과정에서, 영양분의 적절한 이용성을 유지하고, 배양물의 억제성 생성물을 제거하기 위해, 세포 성장 과정 동안 사용이 끝난 배지를 새로운 배지로 주기적으로 교환한다. 배양 플라스크 및 롤러 보틀은 세포가 증식할 수 있는 표면을 제공하며, 통상적으로 부착 의존성 세포의 배양에 사용된다.

일 양태에서, 인큐베이션은 37℃로 가열된 챔버에서 수행된다. 배지와 챔버 환경 사이에 소통이 필요한 배양 토폴로지는, pH 조절을 보조하기 위해, 5% CO₂ v/v를 챔버 기체 공간 중의 공기와 함께 이용한다. 대안으로, 배양 온도 및 pH를 유지하도록 장비가 갖추어진 용기를 세포 증식과 ECM 제조 공정 둘 다에 사용할 수 있다. 온도가 35℃ 미만 또는 38℃ 초과이거나, CO₂ 농도가 3% 미만 또는 12% 초과인 것은 부적절할 수 있다.

세포를 부착 표면으로부터 수거하는 것은, 증식 배지를 제거하고, 세포를 완충된 염 용액으로 세정하여 효소 경쟁 단백질을 감소시키고, 해리 효소를 가한 다음, 세포 탈착 후에 효소를 중화시킴으로써 수행할 수 있다. 수거된 세포 현탁액을 수집하고, 수거한 액을 원심분리에 의해 분리한다. 계대배양한 수거물로부터 얻은 세포 현탁액을 샘플링하여 회수된 세포량과 다른 세포 속성을 평가할 수 있으며, 그 후, 이것을 새로운 배지와 합하여 접종물로서 사용한다. 허용 가능한 ECM 특징을 얻는 것과 관련하여, 세포 은행 및 스캐폴드 접종물을 제조하는 데 사용되는 계대수가 중요하다.

적절한 2차원 또는 3차원 스캐폴드를 제조한 후, 조제된 스트로마 세포를 시딩함으로써 접종을 한다. 침강 등의 다양한 방법으로 스캐폴드 접종을 행할 수 있다. 호기성 조건 하에서의 ECM 배양을 위해 제조된 메쉬는 저산소 상태 배양을 위한 메쉬와 동일한 방식으로 제조되는데, 단, 저산소 조건을 형성하기 위해 혐기성 챔버가 사용되지 않는 것을 예외로 한다.

예를 들어, 호기성 조건 및 저산소 조건의 양쪽 조건 하에서의 ECM 배양을 위해 제조된 양쪽 메쉬의 경우, 제조 및 멸균된 메쉬를 150 mm(직경)×15 mm(깊이)의 멸균 페트리 접시에 놓고, 약 10조각의 두께로 적층시킨다. 그 후, 메쉬 적층체를 침강에 의해 접종한다. 접종물에 대해 적절한 세포 농도가 되도록 세포를 새로운 배지에 첨가한다. 접종물을 메쉬 적층체에 첨가하며, 이때 세포는 인큐베이션 조건 하에 나일론 섬유 위로 침강하여 부착된 채로 유지된다. 적절한 시간이 경과한 후, 개별적으로 시딩된 메쉬 시트를 무균 상태에서 적층체로부터 분리하여, 약 50 ml의 증식 배지를 함유하는 별개의 150 mm×15 mm 페트리 접시에 개별적으로 첨가할 수 있다.

접종된 배양물의 인큐베이션은 저산소 조건 하에 수행하는데, 이렇게 하면 일반 배양 조건 하에 제조된 ECM과 비교하여 독특한 특성을 갖는 ECM 및 주변 배지가 생산된다는 것이 밝혀졌다. 본원에서 사용될 때, 저산소 조건은 주변 공기의 산소 농도(약 15%∼20%의 산소)와 비교하여 산소 농도가 더 낮은 것을 특징으로 한다. 일 양태에서, 저산소 조건은 산소 농도가 약 10% 미만인 것을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 저산소 조건은 산소 농도가 약 1%∼10%, 1%∼9%, 1%∼8%, 1%∼7%, 1%∼6%, 1%∼5%, 1%∼4%, 1%∼3%, 또는 1%∼2%인 것을 특징으로 한다. 특정 양태에서, 시스템은 배양 용기 내의 산소를 약 1∼3%로 유지한다. 저산소 조건은 주변 기체 농도를 조절할 수 있게 하는 배양 장치, 예를 들어, 혐기성 챔버를 이용함으로써 형성하고 유지할 수 있다.

세포 배양물의 인큐베이션은 일반적으로 증식 및 시딩을 위해 15∼20% 산소 및 5% CO₂를 포함하는 정상 대기 중에서 수행되며, 그 후 저산소 배양물을, 배양 배지 내에 저산소 환경이 형성되도록 95% 질소/5% CO₂로 퍼지한 기밀 챔버로 분할해 넣는다.

예를 들어, 저산소 조건 하에서의 ECM 생산을 위해 배양되는 메쉬를 갖는 페트리 접시를 처음 2∼3주 동안에는 37℃ 및 95% 대기/5% CO₂ 중에서 인큐베이션하여 증식시킨다. 대기와 유사한 조건 하의 배양 기간 후, 혐기성 배양을 위해 디자인된, 약 95% 질소 및 5% CO₂의 기체 혼합물로 퍼지된 챔버 중에서 메쉬를 갖는 페트리 접시를 인큐베이션한다. 배양 기간 동안 사용된 증식 배지를 대기 산소 수준의 새로운 배지로 교체하고, 배지를 교체한 후 메쉬가 충전된 페트리 접시를 혐기성 챔버에 놓고, 이 챔버를 95% 질소/5% CO₂로 퍼지한 뒤 37℃에서 인큐베이션한다. 배양된 메쉬가 원하는 크기에 도달하거나 원하는 생물학적 성분을 함유하게 되면 배양된 메쉬를 수거한다.

인큐베이션 기간 동안, 스트로마 세포는 3차원 프레임워크를 따라 선형으로 성장하여 이를 둘러싼 후 프레임워크의 개구로 증식하기 시작한다. 증식하는 세포는 무수히 많은 성장 인자, 조절 인자 및 단백질을 생산하게 되는데, 그 중 일부는 주변 배지로 분비되고, 나머지는 지지체 상에 퇴적되어 세포외 기질을 구성하게 되며, 이에 대해서는 이하에서 더욱 상세히 설명한다. 성장 인자 및 조절 인자를 배양물에 첨가할 수는 있지만, 이는 필수적인 것은 아니다. 스트로마 세포를 배양하면 불용성 분획과 가용성 분획이 둘 다 생성된다. 세포는 세포외 단백질이 충분히 퇴적될 수 있도록 적절한 정도까지 성장시킨다.

3차원 조직을 배양하는 동안, 증식 세포는 프레임워크로부터 박리되어 배양 용기 벽에 부착되어 여기에서 계속 증식하여 포화 상태의 단일층을 형성할 수 있다. 세포 성장에 영향을 줄 수 있는 이러한 현상을 최소화하기 위해, 세포 배양물에 영양분을 공급하는 동안 또는 세포 배양물을 새로운 배양 용기로 이전함으로써 박리된 세포를 제거할 수 있다. 포화 상태의 단일층을 제거하거나 배양된 조직을 새 용기의 새로운 배지로 이전하는 것은 배양물의 증식 활성을 유지시키거나 회복시킨다. 일부 양태에서, 배양 세포 단일층의 포화도가 25%를 초과하는 배양 용기에서 제거 또는 이전을 수행할 수 있다. 대안으로, 일부 실시형태에서는, 박리된 세포가 고착되지 못하도록 교반하고, 다른 한편으로는, 새로운 배지를 계내로 연속하여 주입한다. 일부 양태에서, 2종류 이상의 세포를, 동시에, 또는 하나를 먼저 배양한 다음 두번째 것을 배양하는 방식으로 함께 배양할 수 있다(예를 들어, 섬유아세포 및 평활근 세포 또는 내피 세포).

스캐폴드에 접종한 후, 세포가 3차원 조직으로 성장하는 것을 지지하는 적절한 영양 배지 및 인큐베이션 조건 하에 세포 배양물을 인큐베이션한다. 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagles Medium), RPMI 1640, 피셔(Fisher's), 이스코브(Iscove's) 및 맥코이(McCoy's) 등의 다수의 상업적으로 입수 가능한 배지가 세포 배양물의 성장을 지지하는 데 적합할 수 있다. 배지에 추가적인 염, 탄소 공급원, 아미노산, 혈청 및 혈청 성분, 비타민, 미네랄, 환원제, 완충제, 지질, 뉴클레오시드, 항생제, 부착 인자 및 성장 인자를 보충할 수 있다. 다양한 유형의 증식 배지의 조제는 당업자가 이용할 수 있는 각종 참고 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrates for Serum Free Animal Cell Cultures, Alan R. Liss, New York (1984)]; [Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester, England (1996)]; [Culture of Animal Cell, A Manual of Basic Techniques, 4 th Ed., Wiley-Liss (2000)] 참조).

호기성 조건이든 저산소 조건이든 간에 본 발명의 임의의 배양 단계에 이용되는 증식 또는 배양 배지는 혈청을 포함해도 좋고 무혈청이어도 좋다. 일 양태에서, 배지는 4.5 g/L 글루코스, 알라닐-L-글루타민, Eq 2 mM을 포함하고 명목상 10% 소 태아 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지이다. 또 다른 양태에서, 배지는 무혈청 배지이고, 0.5% 혈청 알부민, 2 ㎍/ml 헤파린, 1 ㎍/ml 재조합 염기성 FGF, 1 ㎍/ml 대두 트립신 저해제, 1× ITS 보충제(인슐린-트랜스페린-셀레늄, Sigma 카탈로그 번호 13146), 1:1000으로 희석된 지방산 보충제(Sigma 카탈로그 번호 7050) 및 1:1,000으로 희석된 콜레스테롤이 보충되고, 글루타맥스(Glutamax)^®와 함께 4.5 g/L 글루코스 베이스의 배지를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지이다. 추가로, 저산소 배양과 호기성 배양 둘 다에 동일한 배지가 사용될 수 있다. 일 양태에서, 시딩 및 처음 1주간의 증식 후에, 증식 배지를 혈청 베이스의 배지로부터 무혈청 배지로 교체한다.

인큐베이션 조건은 저산소 성장 조건을 유지하는 데 적절한 pH, 온도 및 기체(예를 들어, O₂, CO₂ 등) 조건이다. 일부 실시형태에서, 증식 활성을 최대화하고 분획의 원하는 활성을 촉진하는 인자를 생성하기 위해, 세포 배양물을 인큐베이션 기간 동안 배지 중에 현탁시킬 수 있다. 또한, 사용이 끝난 배지를 제거하고 박리된 세포를 줄이고 새로운 영양 공급원을 첨가하기 위해 배양물에 주기적으로 "영양 공급"을 할 수 있다. 인큐베이션 기간 동안, 배양된 세포는 3차원 스캐폴드의 필라멘트를 따라 선형으로 증식하여 이를 둘러싼 후 스캐폴드의 개구 내로 증식해 들어가기 시작한다.

약 15∼20%의 정상 대기 산소 농도 하에서의 인큐베이션과 비교하여 저산소 조건 하에 인큐베이션하는 동안, 수천 종의 유전자가 차등적으로 발현된다. 이러한 조성물 중에서 몇 종의 유전자, 그 중에서도 특히 특정 라미닌 종, 콜라겐 종 및 Wnt 인자가 상향 조절되거나 하향 조절되는 것으로 확인되었다. 다양한 양태에서, 3차원 세포외 기질은, 일반 조건 하에서의 증식과 비교하여 저산소 조건 하에서의 증식으로 인해 세포에 의해 생산되는 일련의 세포 생성물 또는 특징적인 핑거프린트로 정의될 수 있다. 본원에 구체적으로 예시된 세포외 기질 조성물에서, 3차원 조직 및 주변 배지는 다양한 인자의 발현 및/또는 분비를 특징으로 한다.

본원에 기재된 3차원 조직 및 조성물은 스캐폴드 또는 프레임워크 상에 존재하는 세포외 기질을 갖는다. 일부 양태에서, 세포외 기질은 저산소 조건 하에서의 성장 및 지지체 상에서 성장한 세포 선별로 인하여 다양한 라미닌 및 콜라겐 유형을 포함한다. 적절한 콜라겐 유형을 가공하는 섬유아세포를 선별하고 특이적인 라민 및 콜라겐 종의 발현이 상향 조절 또는 하향 조절되는 저산소 조건 하에서 세포를 성장시킴으로써, 퇴적된 세포외 기질(ECM) 단백질의 비율을 조정하거나 향상시킬 수 있다.

일부 양태에서, 섬유아세포의 선별은, 특정 콜라겐 유형을 정의하는 적절한 이소타입 또는 서브클래스의 단일클론 항체를 사용함으로써 수행할 수 있다. 다른 양태에서, 자기 비드와 같은 고체 기재를 사용하여 항체가 결합되어 있는 세포를 선별하거나 제거할 수 있다. 이러한 항체의 조합물을 사용하여 원하는 콜라겐 유형을 발현하는 섬유아세포를 (양성적으로 또는 음성적으로) 선별해 낼 수 있다. 대안으로, 프레임워크에 접종하는 데 사용되는 스트로마는 원하는 콜라겐 유형을 합성하는 세포의 혼합물일 수 있다. 예시적인 콜라겐 유형의 분포 및 기원을 하기 표 1에 제시한다.

[표 1]

ECM 조성물 중에 존재할 수 있는 추가적 유형의 콜라겐을 하기 표 2에 제시한다.

[표 2a]

[표 2b]

상기에 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 ECM 조성물은 다양한 콜라겐을 포함한다. 실시예 1의 표 3에 나타낸 바와 같이, 여러 종의 콜라겐의 발현이 저산소 조건 하에 배양된 ECM 조성물 중에서 상향 조절되는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서, 1종 이상의 배아 단백질을 포함하는 ECM 조성물은 약 15∼20% 산소의 산소 조건에서 제조된 것과 비교하여 상향 조절된 콜라겐 종을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상향 조절된 콜라겐 종은 V형 알파 1; IX형 알파 1; IX형 알파 2; VI형 알파 2; VIII형 알파 1; IV형 알파 5; VII형 알파 1; XVIII형 알파 1; 및 XII형 알파 1이다.

본원에 기재된 ECM 조성물은, 각종 콜라겐 이외에도 각종 라미닌을 포함한다. 라미닌은 꼬인 코일 도메인을 통해 서로 연결되어 있는 알파쇄, 베타쇄 및 감마 쇄로 이루어진 당단백질 이종삼량체 패밀리이다. 현재까지, 5개의 알파 라미닌쇄, 4개의 베타 라미닌쇄 및 3개의 감마 라미닌 쇄가 서로 조합하여 15종의 상이한 동형체를 형성하는 것으로 확인되었다. 이 구조 내에서, 다른 라미닌 및 기저판 분자, 및 막 결합형 수용체에 대해 결합 활성을 갖는 도메인을 확인할 수 있다. 도메인 VI, IVb 및 IVa는 구형 구조를 형성하고, 도메인 V, IIIb 및 IIIa(이는 시스테인이 풍부한 EGF 유사 요소를 포함한다)는 막대형 구조를 형성한다. 상기 3종의 쇄의 도메인 I 및 II가 삼중 가닥의 꼬인 코일 구조(긴 아암) 형성에 관여한다.

라미닌 쇄는 공통된 독특한 기능을 가지고 있으며, 특이적인 시간적(발생학적) 및 공간적(조직 부위 특이적) 패턴으로 발현된다. 라미닌 알파쇄는, 조직 특이적인 분포 패턴을 보이고 주요 세포 상호작용 부위를 포함하기 때문에, 이종삼량체에서 기능적으로 중요한 부분인 것으로 간주된다. 혈관 내피는, 발생 단계, 혈관 유형 및 내피의 활성화 상태에 따라 발현을 달리하는 2개의 라미닌 동형체를 발현하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 본 발명의 일 양태에서, 1종 이상의 배아 단백질을 포함하는 ECM 조성물은 산소 농도 약 15∼20%의 산소 조건에서 제조된 것과 비교하여 상향 조절 또는 하향 조절된 다양한 라미닌 종을 포함한다.

라미닌 8은 알파-4 라미닌쇄, 베타-1 라미닌쇄 및 감마-1 라미닌쇄로 이루어진다. 라미닌 알파-4 쇄는 성인에서도 발생 중에도 널리 분포되어 있다. 성인에서는 심근 섬유, 골격근 섬유 및 평활근 섬유를 둘러싸는 기저막과 폐의 폐포 중격에서 확인할 수 있다. 이는 또한 모세관 및 대혈관 양자의 내피 기저막, 및 말초 신경의 신경주위 기저막뿐만 아니라, 골수의 작은 세동맥, 대동맥 및 동모양 혈관 사이 공간에도 존재하는 것으로도 알려져 있다. 라미닌 8은 혈소판에 의해 발현되어 그에 부착되며, 3T3-L1 지방세포에서 합성되는 혈관 내피의 주요 라미닌 동형체로서, 이것의 합성 수준은 세포의 지방 전환 시에 증가하는 것으로 나타났다. 라미닌 8은 일반적으로 간엽 세포 계통에서 발현되어 결합 조직에서 미소혈관을 유도하는 라미닌 동형체인 것으로 생각된다. 라미닌 8은 또한 마우스 골수 1차 세포 배양물, 세동맥벽, 및 동모양 혈관 사이 공간(여기에서, 라미닌 8은 발생 중인 골수에서의 주요 라미닌 동형체임)에서 확인되었다. 라미닌 8은 성체 골수에서 조혈 세포에 인접해 위치하기 때문에, 알파-4 쇄를 포함하는 라미닌 동형체가 조혈 세포 발생과 생물학적으로 관련이 있는 상호작용을 가질 것으로 생각된다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, ECM은 상향 조절된 라미닌 종, 예컨대 라미닌 8을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 3차원 조직에 의해 생산된 라미닌은 적어도 라미닌 8을 포함하며, 이 라미닌 8이 조성물 중에 존재하는 라미닌 단백질의 특징 또는 표식을 정의한다.

본원에 기재된 ECM 조성물은 다양한 Wnt 인자를 포함한다. Wnt 패밀리 인자는 수많은 세포내 경로와 세포-세포 상호작용 과정에서 중요한 역할을 하는 신호전달 분자이다. Wnt 신호전달은 종양발생, 배아의 조기 중배엽 패턴 형성, 뇌 및 신장의 형태발생, 유선 증식의 조절 및 알츠하이머병에 연루되어 있다. 실시예 1의 표 4에 나타낸 바와 같이, 몇몇 Wnt 단백질 종의 발현이 저산소 상태에서 배양된 ECM 조성물 중에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서, 1종 이상의 배아 단백질을 포함하는 ECM 조성물은 산소 농도 약 15∼20%의 산소 조건에서 생산된 것과 비교하여 상향 조절된 Wnt 종을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상향 조절된 Wnt 종은 wnt 7a 및 wnt 11이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 3차원 조직에 의해 생산되는 Wnt 인자는 적어도 wnt 7a 및 wnt 11을 포함하며, 이들 Wnt 인자가 조성물 중에 존재하는 Wnt 단백질의 특징 또는 표식을 정의한다.

본 명세서 전반에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 ECM 조성물은 가용성 분획과 불용성 분획을 둘 다 또는 이들의 임의의 일부분을 포함한다. 본 발명의 조성물은 상기 분획 중 어느 하나 또는 둘 다와 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 개개의 성분들을 분획으로부터 단리하여 개별적으로 사용하거나 다른 단리물 또는 공지된 조성물과 함께 사용할 수 있다.

따라서, 다양한 양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 세포외 기질 조성물은 바로 사용하거나 다양한 방식으로 가공(프로세싱)할 수 있으며, 그 방법은 불용성 분획과 가용성 분획 둘 다에 적용될 수 있다. 인자를 보존 및/또는 농축하기 위해 무세포 상청액 및 배지를 포함하는 가용성 분획을 동결건조시킬 수 있다. 필요에 따라 활성 보존을 위해 다양한 생체적합성 방부제, 동결방지제 및 안정화제를 사용할 수 있다. 생체적합성 제제의 예로는 특히 글리세롤, 디메틸 설폭시드 및 트레할로스를 들 수 있다. 동결건조물은 또한 1종 이상의 부형제, 예컨대 완충제, 증량제 및 등장성 조절제를 포함할 수 있다. 이하에 추가로 기재하는 것과 같이, 냉동 건조된 배지는 적절한 용액 또는 약학적 희석제를 첨가함으로써 재구성할 수 있다.

다른 양태에서, 가용성 분획을 투석한다. 투석은 다공성 막을 통한 선택적 확산에 기초하여 샘플 성분을 분리해 내는 가장 보편적으로 이용되는 기법 중 하나이다. 용질의 90%가 막에 잔류하게 만드는 분자량을 특징으로 하는 막의 분자량 컷오프(MWCO: molecular-weight cutoff)를 공극 크기가 결정한다. 특정 양태에서, 원하는 컷오프에 따라 임의의 공극 크기를 갖는 막이 고려된다. 전형적인 컷오프는 5,000 달톤, 10,000 달톤, 30,000 달톤 및 100,000 달톤이지만, 모든 크기가 고려된다.

일부 양태에서, 활성 성분(예를 들어, 성장 인자)을 배지 중에 침전시킴으로써 가용성 분획을 프로세싱할 수 있다. 침전은 황산암모늄을 사용하는 염석, 또는 친수성 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)의 사용과 같은 다양한 방법을 이용할 수 있다.

다른 양태에서, 가용성 분획에 대해 다양한 선택적 필터를 사용하는 여과를 수행할 수 있다. 여과에 의해 가용성 분획을 프로세싱하는 것은 분획 중에 존재하는 인자를 농축시키는 데 유용하고, 또한, 가용성 분획 중에서 사용되는 소분자 및 용질을 제거하는 데에도 유용하다. 특정 분자량에 대해 선택성을 갖는 필터로는 <5,000 달톤, <10,000 달톤 및 <15,000 달톤인 것을 포함한다. 기타 다른 필터도 사용될 있고, 프로세싱된 배지로 본원에 기재된 바와 같이 치료 활성에 대해서 분석할 수 있다. 예시적인 필터 및 농축기 시스템으로는 특히 중공사막 필터, 필터 디스크 및 필터 프로브(예를 들어, Amicon Stirred Ultrafiltration Cell 참조)에 기초한 것을 포함한다.

추가의 다른 양태에서, 배지 중의 염, 불순물을 제거하거나 다양한 성분들을 분획화하기 위해 가용성 분획에 대해 크로마토그래피를 수행한다. 분자체, 이온 교환, 역상 및 친화성 크로마토그래피 기법과 같은 다양한 크로마토그래피 기법을 이용할 수 있다. 생물학적 활성을 크게 손실하지 않으면서 컨디셔닝된 배지를 프로세싱하기 위해서는, 마일드한 크로마토그래피 배지를 사용할 수 있다. 비한정적인 예로서 특히, 덱스트란, 아가로스, 폴리아크릴아미드에 기초한 분리용 배지(예를 들어, 세파덱스(Sephadex), 세파로스(Sepharose) 및 세파크릴(Sephacryl)과 같은 다양한 상표명으로 시판됨)를 들 수 있다.

또 다른 양태에서, 컨디셔닝된 배지는 리포좀으로서 조제된다. 활성 인자의 전달과 활성 인자의 수명 연장을 리포좀의 루멘 내로 성장 인자를 도입하거나 봉입할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 리포좀은 다양한 유형으로 분류될 수 있다: 다층막 소포체(MLV: multilamellar vesicle), 안정형 다층막 소포체(SPLV: stable plurilamellar vesicle), 소형 단층막 소포체(SUV: small unilamellar vesicle) 또는 대형 단층막 소포체(LUV: large unilamellar vesicle). 리포좀은, 포스파티딜 에테르 및 에스테르, 예컨대 포스포티딜세린, 포스포티딜콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 디미리스토일포스파티딜콜린; 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤; 세레브로시드; 스핑고미엘린; 글리세로지질; 및 기타 다른 지질을 비롯하여 합성 또는 천연의 다양한 지질 화합물로부터 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,833, 948호 참조).

가용성 분획은 추가적인 첨가제 없이 바로 사용될 수도 있고 약학적으로 허용되는 부형제, 비이클 또는 담체와 함께 약학 조성물로서 제조될 수도 있다. "약학 조성물"이란 가용성 분획 및/또는 불용성 분획과 1종 이상의 약학적으로 허용되는 비이클, 담체 또는 부형제로 이루어진 형태를 의미한다. 피내, 피하, 또는 근육내 투여를 위한 조성물은 수성 또는 유성 비이클 중 세포외 기질 조성물의 멸균 현탁액, 용액 또는 에멀션으로 조제될 수 있다. 조성물은 또한 현탁화제, 안정화제 또는 분산제와 같은 제제화제를 함유할 수 있다. 주사용 제제는 방부제를 포함하거나 포함하지 않으면서, 다회 투여 용기 중의 앰플인 단위 제형으로 제공될 수 있다. 대안으로, 조성물은, 멸균 발열원 무함유 물, 식염수, 완충액, 또는 덱스트로스 용액을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 적절한 비이클을 사용하여 재구성할 수 있는 분말 형태로 제공될 수 있다.

다른 양태에서, 3차원 조직은 해동시켜 사용하는 동결보존된 제제이다. 약학적으로 허용되는 동결보존제로는 특히 글리세롤, 당류, 폴리올, 메틸셀룰로스, 및 디메틸 설폭시드를 들 수 있다. 당류 물질로는 단당류, 이당류 및 기타 다른 올리고당을 포함하며, 최대로 동결 농축된 용액의 유리 전이 온도(Tg)는 적어도 -60℃, -50℃, -40℃, -30℃, -20℃, -10℃, 또는 0℃이다. 동결보존에 사용하기 위한 당류의 예로 트레할로스가 있다.

일부 양태에서, 사용 전에 3차원 조직을 처리하여 세포를 사멸시킨다. 일부 양태에서, 투여를 위해 스캐플드 상에 퇴적된 세포외 기질을 수집하여 프로세싱할 수 있다(본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제5,830,708호 및 제6,280,284호 참조).

다른 실시형태에서, 3차원 조직을 농축시키고 투여를 위해 약학적으로 허용되는 배지로 세척할 수 있다. 원심분리 또는 여과와 같은, 조성물을 농축시키기 위한 다양한 기법이 당업계에서 이용 가능하다. 그 예로 덱스트란 침강 및 분별 원심분리를 들 수 있다. 3차원 조직의 조제는 또한 현탁액의 이온 강도를 등장성 상태로(즉, 약 0.1∼0.2), 그리고 생리학적 pH(즉, pH 6.8∼7.5)로 조절하는 것을 포함할 수 있다. 제제는 또한 세포 현탁액의 투여 또는 안정성에 도움이 되도록 활택제 또는 기타 다른 부형제를 함유할 수 있다. 그 예로는 특히 당류(예를 들어, 말토스) 및 유기 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 및 하이알루론산을 들 수 있다. 다양한 제제의 제조에 대한 추가적인 상세한 설명은 본원에서 참고로 포함하는 미국 특허 공개 제2002/0038152호에 기재되어 있다.

상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 ECM 조성물은 ECM 조성물의 예상 용도 및 적절한 전달 또는 투여 방법에 따라 여러 방식으로 프로세싱될 수 있다. 예를 들어, 이 조성물은 3차원 스캐폴드 또는 임플란트로서 전달될 수도 있고, 상기에 기재된 바와 같이 주사용으로 제제화될 수도 있다. "투여" 또는 "투여하는"이라는 용어는 치료가 필요한 피험체에게 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물을 제공하는 행위를 포함하는 것으로 정의된다. 본원에서 사용될 때, "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"이라는 어구는 소화관내 투여 및 국소 투여 이외의 투여 방식으로서, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 비한정적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피밑, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 본원에서 사용될 때, "전신 투여," "전신 투여되는," "말초 투여," 및 "말초 투여되는"이라는 어구는 화합물, 약물 또는 기타 다른 물질이 피험체의 전신에 유입됨으로써 대사 및 기타 다른 유사 과정을 거칠 수 있게 하는, 중추 신경계 내로 직접 투여하는 것 이외의 화합물, 약물 또는 기타 다른 물질 투여 방법을 의미하며, 예를 들어, 피하 투여가 있다.

본원에서 사용될 때, "피험체"라는 용어는 해당 방법의 실시 대상이 되는 임의의 개체 또는 환자를 지칭한다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이 피험체는 일반적으로 인간이지만 동물일 수도 있다. 따라서, 포유동물, 예컨대 설치류(마우스, 랫트, 햄스터 및 기니 피그), 고양이, 개, 토끼, 가축(소, 말, 염소, 양, 돼지 등 포함) 및 영장류(원숭이, 침팬지, 오랑우탄 및 고릴라 포함)을 비롯한 다른 동물도 피험체의 정의에 포함된다.

본 발명의 세포외 기질 조성물은 손상된 세포 또는 조직의 수복 및/또는 재생 촉진, 조직 재생 촉진을 위한 패치에서의 용도, 줄기 세포 등의 세포 배양용 조직 배양 시스템에서의 용도, 이식형 디바이스(예를 들어, 인공심박조율기, 스텐트, 스텐트 그래프트, 혈관 보철, 심장 판막, 션트, 약물 전달 포트 또는 카테터)와 관련하여 사용되는 표면 코팅에서의 용도, 주름과 같은 피부 표면의 연조직 수복, 강화 및/또는 개선 촉진, 생물학적 유착 방지제 또는 세포 전달 또는 전달 부위에서의 유지를 위한 생물학적 운반체로서의 용도를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다양한 용도를 갖는다.

추가로, 본원의 임의의 방법에 기재된 바와 같은 세포 배양으로부터 유래된 ECM 조성물은, 본 발명의 임의의 다른 용도 또는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조직 배양 시스템을 사용하는 세포 배양에 의해 생성된 ECM 조성물은, 예를 들어, 세포의 수복 및/또는 재생, 조직 재생 촉진을 위한 패치에서의 용도, 줄기 세포 등의 세포 배양용 조직 배양 시스템에서의 용도, 이식형 디바이스(예를 들어, 인공심박조율기, 스텐트, 스텐트 그래프트, 혈관 보철, 심장 판막, 션트, 약물 전달 포트 또는 카테터)와 관련하여 사용되는 표면 코팅에서의 용도, 주름 등의 피부 표면의 연조직 수복, 강화 및/또는 개선 촉진, 생물학적 유착 방지제 또는 세포 전달 또는 전달 부위에서의 유지를 위한 생물학적 운반체로서의 용도에 사용될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 본 발명은 세포 또는 조직을 수복 및/또는 재생시키는 방법 및 연조직 수복을 촉진하는 방법을 포함한다. 일 실시형태는 수복 또는 재생시키고자 하는 세포를 본 발명의 세포외 기질 조성물과 접촉시켜 세포를 수복 및/또는 재생시키는 방법을 포함한다. 본 발명은 골연골 세포를 비롯한 각종 세포의 수복 및/또는 재생에 이용될 수 있다.

일 양태에서, 본 발명의 방법은 골연골 결손의 수복을 고려한다. 본원에서 사용될 때, "골연골 세포"는 연골발생 또는 골발생 계통에 속하거나 환경 신호에 따라서 연골발생 또는 골발생 계통으로 분화될 수 있는 세포를 말한다. 이러한 잠재력은 공지된 기법에 의해서 시험관내 또는 생체내에서 테스트할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명의 ECM 조성물은 연골발생 세포, 예를 들어, 연골을 생산할 수 있는 세포 또는 그 자체가 연골을 생산하는 세포로 분화되는 세포(연골 세포 및 그 자체가 연골 세포로 분화되는 세포(예를 들어, 연골 세포 전구 세포 포함)를 수복 및/또는 재생시키는 데 사용된다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 결합 조직을 수복 및/또는 재생시키는 데 유용하다. 본원에서 사용될 때, "결합 조직"이란 포유동물의 체내에 있는 많은 구조 조직 중 임의의 것을 지칭하며, 뼈, 연골, 인대, 힘줄, 반달 연골, 진피, 상피, 근육, 지방 조직, 관절낭을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 ECM 조성물은 가동 관절, 예컨대 무릎, 발목, 팔꿈치, 엉덩이, 손목, 손가락 또는 발가락 관절, 또는 턱관절의 골연골 결손을 치료하는 데 사용될 수 있다. 그러한 골연골 결손은 외상성 손상(예를 들어, 운동 상해 또는 과도한 마모) 또는 골관절염 등의 질환에 기인한 것일 수 있다. 특정 측면은 골관절염 연골의 표재성 병변의 치료 또는 예방에 있어서의 본 발명의 기질의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 노화 또는 출산으로 인한 골연골 결손의 치료 또는 예방에 있어서의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 있어서의 골연골 결손은 또한 미용 수술(예를 들어, 코, 귀)과 같은 수술(이에 한정되지 않음)과 관련하여 연골 및/또는 뼈의 수복이 필요한 상태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 이와 같은 결손은 연골 또는 골 형성이 중단되었거나 유전적 결함으로 인해 연골 또는 뼈가 손상되었거나 존재하지 않는 체내 어느 부위에서나 일어날 수 있다.

상기에서 언급한 바와 같이, 특정 세포의 성장을 유도하거나 자극하는 성장 인자 또는 기타 다른 생물학적 물질이 본 발명의 ECM 조성물에 포함될 수 있다. 성장 인자의 유형은 세포 유형 및 조성물의 의도된 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 골연골 세포의 경우, 추가적인 생물학적 물질, 예컨대 세포 성장 인자(예를 들어, TGF-β), 연골발생을 자극하는 물질(예를 들어, 연골 형성을 자극하는 BMP, 예컨대 BMP-2, BMP-12 및 BMP-13), 스트로마 세포가 스캐폴드로 이동하는 것을 자극하는 인자, 기질 퇴적을 자극하는 인자, 소염제(예를 들어, 비스테로이드성 소염제), 면역억제제(예를 들어, 사이클로스포린)가 포함될 수 있다. 기타 다른 성장 인자, 예컨대 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 내피 성장 인자(EGF: epidermal growth factor), 인간 내피 세포 성장 인자(ECGF: human endothelial cell growth factor), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 연골 유래 형태발생 단백질(CDMP: cartilage derived morphogenetic protein), 기타 다른 골 형성 단백질, 예컨대 OP-1, OP-2, BMP3, BMP4, BMP9, BMP11, BMP14, DPP, Vg-1, 6OA, 및 Vgr-1, 콜라겐, 탄성 섬유, 망상 섬유, 당단백질 또는 글리코스아미노글리칸, 예로서, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라틴 설페이트 등과 같은 기타 다른 단백질도 포함될 수 있다. 예를 들어, 아스코르베이트와 함께 TGF-β와 같은 성장 인자를 사용하는 것은 연골 세포 분화를 유발하고 연골 세포에 의한 연골 형성을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 하이알루론산은 연골 세포 및 다른 스트로마 세포가 부착하기 좋은 우수한 기재로서, 이것은 스캐폴드의 일부로서 도입되거나 스캐폴드 상에 코팅될 수 있다.

추가로, 특정 세포의 성장 및/또는 활성에 영향을 주는 다른 인자도 사용될 수 있다. 예를 들어, 연골 세포의 경우, 본원에서 참고로 포함하는 미국 특허 출원 제2002/0122790호에 기재된 바와 같이, 비대 상태로 연골 세포를 유지하기 위해 연골 세포에 의한 연골 생산을 자극하는 콘드로이티나제와 같은 인자를 기질에 첨가할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법은, 본원에서 참고로 포함하는 국제 특허 공개공보 WO 2005/054446에 기재된 바와 같이, 폴리설페이트화 알기네이트 또는 다른 폴리설페이트화 다당류, 예컨대 폴리설페이트화 사이클로덱스트린 및/또는 폴리설페이트화 인슐린, 또는 결합 조직 세포의 ECM의 생산을 자극할 수 있는 기타 다른 성분을 함유시키는 것을 포함한다.

본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생체내 또는 시험관내에서 수복 및/또는 재생시키고자 하는 세포 또는 조직을 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, ECM 조성물을 (예를 들어, 본 발명의 ECM 조직, 패치 또는 코팅된 디바이스를 통해) 피험체 내로 주사 또는 이식할 수 있다. 또 다른 양태에서, 수복 및/또는 재생시키고자 하는 조직 또는 세포를 피험체로부터 채취하여 시험관내에서 배양한 후, 공지된 수술 기법을 이용하여 피험체에 이식하거나 투여할 수 있다.

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 ECM 조성물을 다양한 방식으로 프로세싱할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 조직 배양 시스템을 포함한다. 다양한 양태에서, 상기 배양 시스템은 본원에 기재된 ECM 조성물로 이루어진다. 본 발명의 ECM 조성물은 다양한 방식으로 조직 배양 시스템 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 스캐폴드 재료를 함침함으로써 코팅으로서, 또는 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제로서 혼입될 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 배양 시스템은 성장 인자 또는 배아 단백질 등의 본원에 기재된 세포외 기질 조성물 중 어느 것이 함침된 3차원 지지체 재료를 포함할 수 있다.

본원에 기재된 세포외 조성물은 다양한 세포 유형의 증식을 위한 지지체 또는 3차원 지지체로서의 역할을 할 수 있다. 세포 배양이 가능한 임의의 세포 유형이 고려된다. 일 양태에서, 배양 시스템을 사용하여 줄기 세포의 증식을 지지할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 또는 뉴런 줄기 세포이다.

조직 배양 시스템은 이식 가능한 조직과 같은 추가적인 ECM 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조직 배양 시스템을 사용한 세포의 배양은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조직 배양 시스템을 사용하여 피험체에 주사하거나 이식하기 위한 ECM 조성물을 제조할 수 있다. 조직 배양 시스템에 의해 제조된 ECM 조성물은 본원에 기재된 임의의 방법으로 프로세싱하여 사용할 수 있다.

본 발명의 ECM 조성물은 세포 전달을 위한 생물학적 운반체로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, ECM 조성물은 가용성 분획 및/또는 불용성 분획 둘 다를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 세포외 기질 조성물을 포함하는, 세포 전달 또는 전달 부위에서의 유지를 위한 생물학적 운반체를 기술한다. 세포 및 3차원 조직 조성물을 포함하는 본 발명의 ECM 조성물을 사용하여, 생체내에서 세포의 성장을 촉진하고/하거나 지지할 수 있다. 상기 운반체는, 상기에 기재된 바와 같이, 줄기 세포 등의 세포를 손상된 심장 근육으로 주사하는 것을 보조하거나, 힘줄 및 인대 수복을 위한 것과 같은 임의의 적절한 용도에 사용될 수 있다.

적절한 세포 조성물(예를 들어, 본 발명의 단리된 ECM 세포 및/또는 추가적인 생물학적 물질)은 ECM 조성물이 이식 또는 투여되기 전, 후 또는 중에 투여될 수 있다. 예를 들어, 배양 시스템 또는 생물학적 전달 비이클을 피험체 내로 이식하기 전에 세포를 투여, 결합 및/또는 삽입 부위에 시딩할 수 있다. 대안으로, 그 후에 적절한 세포 조성물을 (예를 들어, 그 부위 내로 주사하여) 투여할 수 있다. 세포는 그 안에서 조직 재생 및/또는 세포 수복을 유도하도록 작용한다. 세포를 결손 부위로 투여할 있는 임의의 수단에 의해, 예를 들어, 주사에 의해 세포를 시딩할 수 있다. 주사기 또는 관절경과 같이 세포의 생존성을 유지시켜 주는 임의의 수단을 이용하여 세포를 주사할 수 있다.

세포외 기질 조성물은, 이 조성물을 투여하여 심장 및 관련 조직에서 내피 세포 증식 및 혈관 신생을 촉진하는 것에 의해 기관 및 조직에서의 혈관 형성을 촉진하는 것으로 알려진 바 있다. 따라서, 추가의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 피험체에 디바이스를 이식하는 것과 관련하여 사용되는, 본원에 기재된 세포외 기질 조성물을 포함하는 표면 코팅을 포함한다. 상기 코팅은 인공심박조율기, 스텐트, 스텐트 그래프트, 혈관 보철, 심장 판막, 션트, 약물 전달 포트 또는 카테터와 같이, 피험체로의 이식 또는 침투에 사용되는 임의의 디바이스에 적용될 수 있다. 특정 측면에서, 코팅은 상처 치유를 조절하기 위해, 염증을 조절하기 위해, 섬유 피막 형성을 조절하기 위해, 조직 내성장을 조절하기 위해, 또는 세포 내성장을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 심장, 장, 경색 또는 허혈 조직 등의 손상된 조직을 치료하는 것을 포함한다. 이러한 용도에 고려되는 세포외 조성물의 제조에 관해 기술한 실시예가 이하에 제시된다. 정상 산소 조건 하에서 배양된 세포외 기질 조성물의 제조 및 용도에 관해서는 본원에서 참고로 포함하는 미국 특허 출원 제2004/0219134호에 기재되어 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 세포외 기질 조성물을 포함하는 조직 재생 패치를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 피험체의 주름 부위에 본원에 기재된 세포외 기질 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 피험체의 피부 표면을 개선시키는 방법을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 피험체의 주름 부위에 본원에 기재된 세포외 기질 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 피험체의 연조직 수복 또는 증대를 위한 방법을 포함한다. 세포의 수복 및/또는 재생, 피부 표면 개선 및 연조직 수복을 위한 정상 산소 배양 조건 하에서 생성된 세포외 기질 조성물의 사용 및 그 제조에 대해서는 미국 특허 제5,830,708호, 미국 특허 제6,284,284호, 미국 특허 출원 제2002/0019339호 및 미국 특허 출원 제2002/0038152에 기재되어 있으며, 이들 특허 문헌은 본원에서 참고로 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 세포외 조성물을 포함하는 생물학적 유착 방지제를 포함한다. 이 제제는 그러한 용도에서 장 또는 혈관 문합 형성 후 사용되는 유착 방지용 패치로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 조성물 또는 활성 화합물은 일반적으로 치료되는 특정 질환을 치료 또는 예방하는 데 유효한 양으로 사용될 수 있다. 이 조성물은 치료적 이익을 얻기 위해 치료 목적으로 또는 예방적 이익을 얻기 위해 예방 목적으로 투여될 수 있다. 치료적 이익이란 치료 대상의 근본적 병태 또는 질병을 근절시키거나 호전시키는 것을 의미한다. 치료적 이익은 또한 실제로 개선이 일어나는지 여부에 관계없이, 질환의 진행을 중단시키거나 늦추는 것을 포함한다.

조성물의 투여량은, 예를 들어, 조성물의 유형, 치료 대상의 특정 적응증, 투여 방식, 원하는 이익이 예방적 이익인지 또는 치료적 이익인지, 치료 대상 적응증의 중증도 및 환자의 나이와 체중 및 투약 형태의 유효성을 비롯한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 유효 투여량을 결정하는 것은 충분히 당업자의 능력 내에 있다.

초기 투여량은 초기에 시험관내 분석으로부터 예측할 수 있다. 또한, 초기 투여량은 동물 모델과 같은 생체내 데이터로부터 예측할 수 있다. 모발 성장을 증진하는 조성물의 효능을 테스트하는 데 유용한 동물 모델로는 특히 설치류, 영장류 및 기타 다른 포유동물을 포함한다. 당업자는 시험관내 데이터 및 동물 데이터로부터 외삽법을 통한 추정에 의해 인간 투여에 적합한 투여량을 결정할 수 있다.

투여량은 특히 컨디셔닝된 배지의 활성, 투여 방식, 치료 대상 병태 및 상기에 언급한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 투여량과 투여 간격은 치료적 또는 예방적 효과를 유지하는 데 충분한 수준을 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 ECM을 항염증제, 항히스타민, 화학요법제, 면역조절제, 치료용 항체 또는 단백질 키나제 억제제와 함께 치료가 필요한 조직, 세포 또는 피험체에 투여하는 것을 포함한다. 한정을 의도한 것은 아니지만, 화학요법제는 대사길항물질, 예컨대 메토트렉세이트, DNA 가교결합제, 예컨대 시스플라틴/카보플라틴; 알킬화제, 예컨대 칸부실; 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대 닥티노마이신; 미세소관 억제제, 예컨대 탁솔(파클리탁솔) 등을 포함한다. 다른 화학요법제로는, 예를 들어 빈카 알칼로이드, 미토마이신 타입 항생제, 블레오마이신 타입 항생제, 항엽산제, 콜히친, 데메콜린, 에토포시드, 탁산, 안트라사이클린 항생제, 독소루비신, 다우노루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 4-디메톡시-다우노마이신, 11-데옥시다우노루비신, 13-데옥시다우노루비신, 아드리아마이신-14-벤조에이트, 아드리아마이신-14-옥타노에이트, 아드리아마이신-14-나프탈렌아세테이트, 암사크린, 카무스틴, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 에토포시드, 로바스타틴, 멜팔란, 토페테칸, 옥살리플라틴, 클로람부실, 메토트렉세이트, 로무스틴, 티오구아닌, 아스파라기나제, 빈블라스틴, 빈데신, 타목시펜 또는 메클로르에타민을 포함한다. 한정을 의도한 것은 아니지만, 치료용 항체는 HER2 단백질에 대한 항체, 예컨대 트라스투주맵(trastuzumab); 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 대한 항체, 예컨대 내피세포 성장 인자를 표적으로 하는 베바시주맵(bevacizumab) 및 표피세포 성장 인자를 표적으로 하는 OSI-774; 인테그린 수용체를 표적으로 하는 항체, 예컨대 Vitaxin(MEDI-522로도 알려짐) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 항암제 부류로는 1) 알칼로이드, 예를 들어 미세소관 억제제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 빈데신 등), 미세소관 안정화제(예를 들어, 파클리탁셀[탁솔] 및 도세탁셀, 탁소테레 등), 및 염색질 기능 억제제, 예를 들어 토포이소머라제 억제제, 예컨대 에피포도필로톡신(예를 들어, 에토포시드[VP-16] 및 테니포시드[VM-26] 등), 및 토포이소머라제 I을 표적으로 하는 억제제(예를 들어, 캄포테신 및 이시리노테칸[CPT-11] 등); 2) 공유결합성 DNA 결합제[알킬화제], 예를 들어, 질소 머스터드(예를 들어, 메클로르에타민, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 이포스파미드 및 부설판[마일레란] 등), 니트로소우레아(예를 들어, 카무스틴, 로무스틴 및 세무스틴 등) 및 기타 알킬화제(예를 들어, 다카바빈, 하이드록시메틸멜라민, 티오테파 및 미토사이신 등); 3) 비공유결합성 DNA 결합제[항종양 항생제], 예를 들어 핵산 결합제(예를 들어, 닥티노마이신[액티노마이신 D] 등), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신[다우노마이신 및 세루비딘], 독소루비신[아드리아마이신] 및 이다루비신[이다마이신] 등), 안트라세네디온(예를 들어, 안트라사이클린 유사체, 예컨대 [미톡산트론] 등), 블레오마이신(블레녹산) 등 및 플리카마이신(미트라마이신) 등; 4) 대사길항물질, 예를 들어 항엽산제(예를 들어, 메토트렉세이트, 폴렉스 및 멕세이트 등), 퓨린 대사길항물질(예를 들어, 6-머캅토퓨린[6-MP, 퓨리네톨], 6-티오구아닌[6-TG], 아자티오프린, 아시클로버, 강시클로버, 클로로데옥시아데노신, 2-클로로데옥시아데노신[CdA] 및 2'-데옥시코포르마이신[페노스타틴] 등), 피리미딘 길항제(예를 들어, 플루오로피리미딘[예를 들어, 5-플루오로우라실(아드루실), 5-플루오로데옥시우리딘(FdUrd)(플록스우리딘)] 등) 및 사이토신 아라비노시드(예를 들어, 사이토사[ara-C] 및 플루다라빈 등); 5) 효소, 예를 들어 L-아스파라기나제; 6) 호르몬, 예를 들어 글루코코티코이드, 예컨대 항에스트로겐(예를 들어, 타목시펜 등), 비스테로이드성 항안드로겐(예를 들어, 플루타마이드 등) 및 아로마타제 억제제(예를 들어, 아나스트로졸[아리미덱스] 등); 7) 백금 화합물(예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴 등); 8) 항암제, 독소 및/또는 방사성 핵종 등에 접합된 단일클론 항체; 9) 생물학적 반응 조절제(예를 들어, 인터페론[예를 들어, IFN-알파 등] 및 인터루킨[예를 들어, IL-2 등] 등); 10) 입양 면역요법; 11) 조혈 성장 인자; 12) 종양 세포 분화를 유도하는 제제(예를 들어, 올트랜스 레티노산 등); 13) 유전자 치료 기법; 14) 안티센스 치료 기법; 15) 종양 백신; 16) 종양 전이에 대한 치료법(예를 들어, 바티미스타트 등); 및 17) 신생혈관형성 억제제를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물 및 방법은, 상기에 언급된 병리학적 상태의 치료에 일반적으로 적용되는, 본원에 언급된 다른 치료 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 다른 치료제의 예로는 사이클로스포린(예를 들어, 사이클로스포린 A), CTLA4-Ig, 항체, 예컨대 ICAM-3, 항IL-2 수용체(항Tac), 항CD45RB, 항CD2, 항CD3(OKT-3), 항CD4, 항CD80, 항CD86, CD40과 gp39 사이의 상호작용을 차단하는 제제, 예컨대 CD40 및/또는 gp39(즉, CD154)에 특이적인 항체, CD40 및 gp39(CD40Ig 및 CD8 gp39)으로부터 작제된 융합 단백질, 억제제, 예컨대 핵 전좌 억제제, NF-카파 B 기능의 억제제, 예컨대 데옥시스퍼구알린(DSG), 콜레스테롤 생합성 억제제, 예컨대 HMG CoA 리덕타제 억제제(로바스타틴 및 심바스타틴), 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 예컨대 이부프로펜 및 사이클로옥시게나제 억제제, 예컨대 로페콕시브, 스테로이드, 예컨대 프레드니손 또는 덱사메타손, 금 화합물, 항증식제, 예컨대 메토트렉세이트, FK506(타크롤리무스, 프로그라프), 마이코페놀레이트 모페틸, 세포독성제, 예컨대 아자티오프린 및 사이클로포스파미드, TNF-a 억제제, 테니답, 항TNF 항체 또는 가용성 TNF 수용체 및 라파마이신(시롤리무스 또는 라파뮨) 또는 이들의 유도체를 포함한다.

사이토카인, 면역조절제 및 항체 등의 단백질 치료제를 비롯한 다른 제제들도 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 투여될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "사이토카인"이란 용어는 케모카인, 인터루킨, 림포카인, 모노카인, 콜로니 자극 인자 및 수용체 관련 단백질 및 이들의 기능성 단편을 포함한다. 본원에서 사용될 때, "기능성 단편"이란 용어는 규정된 기능 분석을 통해 확인되는 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 말한다.

사이토카인은 내피세포 단핵구 활성화 폴리펩티드 II(EMAP-II), 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF), 과립구-CSF(G-CSF), 대식세포-CSF(M-CSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 및 IL-13, 인터페론 등을 포함하며, 이들은 세포 또는 세포 메커니즘에서 특정 생물학적 변경, 형태적 변경, 표현형 변경과 관련되어 있다.

다른 치료제가 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 이용될 경우, 이들은 예를 들어 내과의사 처방전(Physician Desk Reference; PDR)에 기재된 양으로 또는 당업자가 다른 방식으로 결정한 양으로 사용될 수 있다.

상기에 언급된 용도에 고려되는 세포외 기질 조성물의 제조에 관한 실시예를 이하에 기재한다. 하기 실시예는 본 발명의 실시형태를 추가로 설명하기 위해 제공된 것이며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 이 실시예는 이용될 수 있는 전형적인 것에 해당하지만, 당업자에게 알려져 있는 다른 절차, 방법 또는 기법을 대안적으로 이용할 수 있다.

실시예 1

저산소 조건 하에서 증식된 ECM 조성물 중에서의 유전자의 차등적인 발현

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 조직 배양 플라스크에서 표준 단일층으로서 배양하고, 자연적으로 퇴적된 태아 유사 ECM 내에서의 3차원 섬유아세포 배양물과 비교하였다. 이 배양물을 본원에 개시된 바와 같이 증식시켰다. 유전자의 차등적인 발현을 평가하기 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 Agilent Whole human Genome Oligo Microarrays^®를 사용하여 전체 유전자 발현(40,000개 미만의 유전자를 포함함)에 대한 전체 RNA 샘플을 완성하였다.

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 상태에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 콜라겐 및 ECM 유전자 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 다양한 콜라겐 및 ECM 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 3에 명백히 제시되어 있다.

[표 3]

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 상태에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 Wnt 경로 유전자의 유전자 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 다양한 Wnt 경로 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 4에 명백히 제시되어 있다.

[표 4a]

[도 4b]

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 상태에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 골 형성 단백질(BMP: bone morphogenetic protein) 경로 유전자의 유전자 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 다양한 BMP 경로 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 5에 명백히 제시되어 있다.

[표 5]

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 상태에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 추가적인 유전자의 발현을 조절하는 것으로 확인되었다다. 추가적인 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 6에 명백히 제시되어 있다.

[표 6a]

[표 6b]

실시예 2

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 사용한 저산소 상태 하에서의 ECM 생산

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 사용한 저산소 상태 하에서의 ECM 배양에 관한 2가지 실시예를 제공한다.

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 조직 배양 플라스크에서 10% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민이 보충된 90% DMEM(10% FBS/DMEM)의 존재 하에 증식시켰다. 세포를 0.05% 트립신/EDTA를 사용하여 3대까지 계대배양하고, 그 시점에 세포를 배지 1 ml당 0.04 mg의 건조 비드의 사이토덱스-1(Cytodex-1) 덱스트란 비드(100∼120 ml가 충전된 125 ml의 스피너 플라스크 중 5e⁶ 세포/10 mg 비드), 또는 나일론 메쉬(25e⁶ 세포/6×100 ㎠ 나일론)에 시딩하였다. 모든 배양물은 증식 및 시딩을 위해 표준 대기 및 5% CO₂ 중에서 유지하였고, 그 후저산소 배양물을 배양 배지 내에 저산소 환경이 형성될 수 있도록 95% 질소/5% CO₂로 퍼지된 밀폐 챔버로 분할해 넣었다. 이 시스템은 배양 용기 내 산소 농도를 약 1∼5%로 유지한다. 시딩을 위해 나일론 또는 비드를 덮는 데 필요한 최소 부피로 세포를 잘 혼합해 넣고, 그 후, 약 30분이 지나 1회 혼합한 후, 함습 37℃ 인큐베이터에서 밤새 방치하였다. 세포가 증식하여 ECM을 퇴적시키기 시작하는 동안 2∼3일마다 50∼70% 배지를 교환해 주면서 2∼4주 동안 10% FBS/DMEM을 배양물에 공급하였다. 추가로 4∼6주 동안, FBS 대신, 철 보충제, 및 20 ㎍/ml 아스코르브산을 함유하는 10% 송아지 혈청을 배양물에 공급하였다. 스피너 플라스크를 처음에는 15∼25 rpm으로 약 2∼4주 동안 혼합하였으며, 그 후 45 rpm으로 증가시켜 이후로는 이 속도를 유지하였다. 비드 배양물은 4주 후에 폭 및 직경이 약 0.5∼1.0 cm인 ECM 함유의 거대 무정형 구조체를 형성하였으며, 따라서 기체 확산과 높은 대사 요구량으로 상기 배양물은 저산소 상태가 되었다.

또 다른 실시예에서는, 1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 단일층 플라스크에서 증식시킨 후, 시험관내 ECM 발생을 지지하도록 나일론 메쉬 스캐폴드 상에서 배양하였다. 고글루코스, 2 mM L-글루타민 및 10%(v/v) 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 중에서 섬유아세포를 증식시켰다. 또한, 배양물에 20 ㎍/ml 아스코르브산을 보충하였다. 주변 산소(대략 16∼20%의 산소) 중에서 3주 후, 한쌍의 ECM 함유 배양물을 95% 질소/5% 이산화탄소(카탈로그 번호 MC-101, 캘리포니아주 델 마 소재의 Billups-Rothenberg, Inc.)로 광범위하게 플러싱한 밀폐 챔버의 저산소 배양 조건(1∼5%의 산소)으로 전환하였다. 배양 배지로부터 대기 산소를 확실하게 고갈시키기 위해, 2∼3시간 후, 배지가 약 1∼3%의 산소를 포함하도록 공기를 바꾸었다. 두 세트의 ECM 함유 배양물 모두 추가의 4주 동안 매주 2회씩 영양분을 공급하면서 배양하고, 그 후 RNA 단리를 위해 배양물을 조제하였다. 제조사의 설명서에 따라 상업적으로 입수 가능한 키트(카탈로그 번호 Z3100, Promega, Inc.)를 사용하여 전체 세포 RNA를 단리하였다. 정제된 RNA 샘플을 -80℃에 보관해 두었다가, Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays^®를 이용하는 유전자 발현의 마이크로어레이 분석을 위해 프로세싱하였다.

Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays^®를 이용하여 결과를 분석한 바, 저산소 배양물로부터 제조된 프로브와 비교하여 주변 산소로부터 제조된 프로브로부터 차등적으로 발현된 전사체 약 5,500종이 검출되었다. 이 중 대략 절반(2,500종)은 저산소에 의해 2.0배 넘게 증가하였고, 대략 절반(2,500종)은 저산소에 의해 2.0배 넘게 감소하였다. 이는 저산소가 시험관내 유전자 발현에 현저한 변화를 유발한다는 것을 시사한다. 특히 중요한 것은, ECM 단백질, 특히 다수의 콜라겐 유전자에 대한 전사체는 상향 조절된 반면, 다수의 기질 분해 효소 유전자는 하향 조절되었다는 점이다.

실시예 3

치료 용도를 위한 조직 공학적으로 처리된 인간 배아 세포외 기질

배아 세포외 기질(ECM)은 흉터 형성 또는 유착을 유발하지 않고 신속한 세포 증식과 치유에 도움이 되는 환경을 형성한다. 신생혈관형성 전의 초기 배아 환경을 모의하는 조건(저산소 상태 및 감소된 중력) 하에 인간 신생아 섬유아세포가 3차원으로 증식시키면 태아의 특성을 갖는 ECM 조성물이 생성될 것이라고 가정하였다. 유전자 칩 어레이 분석에 의하면, 종래의 조직 배양 조건과 비교하여 저산소 상태 하에서 5,000종이 넘는 유전자가 차등적으로 발현되는 것으로 나타났다. 생성된 ECM은 콜라겐 III형, IV형 및 V형, 및 당단백질, 예컨대 피브로넥틴, SPARC, 트롬보스폰딘 및 하이알루론산이 비교적 풍부하다는 점에서 태아 중간엽 조직과 유사하였다. 또한 ECM은, 주요 성장 인자를 갖는 재생성 줄기 세포 집단을 지지하는 추정 영역에서 성장 인자에 결합하여 이를 제시하는 데 있어서 중요한 조절 기능을 하기 때문에, 본 발명자들은 배양 상태에서 태아 유사 ECM이 발생하는 동안 저산소 상태가 성장 인자 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 저산소 상태는 또한 상처 치유 및 기관형성을 조절하는 인자, 예컨대 VEGF, FGF-7 및 TGF-β와, Wnt 2b, 4, 7a, 10a 및 11을 비롯한 다수의 wnt의 발현을 증진시킬 수 있다. MTT 분석법을 이용할 때 효소 활성의 증가로 측정되는 바와 같이, 배아 인간 ECM은 또한 시험관내 인간 섬유아세포의 대사 활성의 증가를 촉진하였다. 또한, 본 발명자들은 인간 ECM에 대한 반응으로 세포수가 증가한 것을 검출하였다. 이러한 인간 ECM은 흉터 형성 또는 유착의 발생없이 새 조직의 증식 및 치유가 필요한 다양한 치료 용도에 있어서 생물학적 표면 코팅으로서, 또 조직 필러 치료에 사용될 수 있다.

실시예 4

재생 의학 용도를 위한 천연적으로 가용성인 WNT 활성의 제공

피부 또는 혈액과 같은 성체 조직을 재생시킬 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포는 이러한 재생을 실현하기 위해 어느 정도까지는 배아 발생을 반복한다. 증가하고 있는 많은 연구를 통해, 배아발생 중에 활성을 띠는, 줄기 세포 다능성 및 계통 특이적 분화의 주요 조절인자가 특정 환경 하에서는 성체에서도 재발현된다는 것이 밝혀졌다. 분비된 형태발생 성장 인자 및 발생 인자의 WNT 패밀리는 잠재적으로 가치있는 연구 도구가 되고 결국 임상에서의 치료 수단이 될 수 있는 성장 인자 중 하나이다. 그러나, 현재까지 상업적 규모로는 Wnt가 표준 재조합 발현 및 정제 기법에 대하여 적합하지 않은 것으로 입증되었고, WNT 베이스의 제품을 임상적으로 개발할 수 있는 대규모 WNT 단백질 생산에 관한 보고도 없었다. 배양액 중의 다양한 스캐폴드 상의 신생아 인간 진피 섬유아세포를 사용하여 태아 유사 ECM을 배양 증식시킴으로써 3차원 조직 등가물을 생성할 수 있는 기법이 개발되었다. 이 과정에서, 상기 배양물이, ECM 생산에 사용되는 무혈청 컨디셔닝 배지 중에 함유되어 있는 생물학적 활성 WNT의 상업적 규모의 공급원을 제공할 수 있다는 것이 발견되었다. 여기에서, 본 발명자들은 상기 WNT 생성물 후보물질에 대한 데이터를 제공한다.

세포의 유전자 발현 분석은, 적어도 3종의 WNT 유전자(wnt 5a, wnt 7a, 및 wnt 11)가 발현되었고, wnt 신호전달과 관련이 있는 소수의 유전자도 발현되었다는 것을 입증하였다; 그러나, 그 기능은 완전히 이해되고 있지 않다. 유전자 발현 데이터를 wnt 신호전달(1차 인간 표피 각질세포에서 β-카테닌의 핵 전좌)에 대한 시험관내 생물학적 분석으로 확장시켜, 혈액 줄기 세포에 대한 wnt 활성을 평가하였다. 두 분석 모두를 통해 정규(canonical) wnt 활성과 일치하는 활성이 입증되었다. 또한, 이들 배양물로부터 얻은 컨디셔닝된 배지는, 마우스의 피부 내로 주사되었을 때 모낭 줄기 세포가 성장기에 진입할 수 있도록 유도하여 모발 성장이 이루어질 수 있도록 하는 wnt 활성을 보였다. 이는 규정 배지 및 무혈청 조건 배지 중의 안정화된 WNT 활성은 정제를 필요로 하지 않는다는 것을 시사한다. 이러한 생성물을 모낭 재생용으로, 또 다양한 인간 줄기 세포의 배양을 위한 유용한 연구 수단으로서 사용할 수 있다.

실시예 5

저산소 상태 하의 섬유아세포는 독특한 ECM 생산과 성장 인자 발현을 나타낸다

인간 신생아 진피 섬유아세포는 시험관내에서 배양될 때 ECM을 생산하는데, 이는 진피와 매우 유사하고, 상처 치유와 같은 재생 의학 분야에서 손상된 진피를 대체할 수 있다. 상처 치유 과정은 또한 배아 환경을 모의함으로써 배아 발생을 반복하기 때문에, 본 발명자들은 생산된 ECM이 조직 재생 용도를 위한 증대된 ECM을 제공할 것이라고 가정하였다. 따라서, 신생혈관형성 전의 초기 배아에 존재하는 저산소 상태를 모의하기 위해, 인간 신생아 섬유아세포 유래의 ECM을 저산소 상태의 배양 조건으로 증식시켰다. 이 목적은 배양 상태에서의 조직 발생 중에 저산소 조건을 사용함으로써 태아 특성을 갖는 ECM을 생성하는 것이었다.

이러한 저산소 배양 상태에서 생산된 ECM은 콜라겐 III형 및 V형, 및 당단백질, 예컨대 피브로넥틴, SPARC, 트롬보스폰딘 및 하이알루론산이 비교적 풍부하다는 점에서 태아 중간엽 조직과 유사하였다. 또한, ECM은, 주요 성장 인자를 갖는 재생성 줄기 세포 집단을 지지하는 추정 영역에서 성장 인자에 결합하고 이를 제시하는 데 있어서 중요한 조절 기능을 하기 때문에, 본 발명자들은 배양 상태에서의 태아 유사 ECM의 발생 중에 저산소 상태가 성장 인자 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 저산소 상태는 또한 상처 치유 및 기관형성을 조절하는 인자, 예컨대 VEGF, FGF-7 및 TGF-β의 발현을 증대시킬 수 있는 것으로 확인되었다.

MTT 분석법을 이용할 때 효소 활성의 증가로 측정되는 바와 같이, 인간 ECM은 또한 시험관내 인간 섬유아세포의 대사 활성 증가를 촉진하였다. 또한, 인간 ECM에 대한 반응으로 세포수가 증가한 것도 검출되었다. 이러한 결과는 배아 세포 배양에서 코팅/스캐폴드로서, 또 다양한 치료 용도 또는 의료용 디바이스에서 생물학적 표면 코팅/필러로서의 상기 인간 ECM의 용도를 뒷받침한다.

실시예 6

골수종, 신경교종 및 유방암에서의 세포외 기질 조성물

시스플라틴 존재 또는 부재 하, ECM 존재 또는 부재 하에서의 B16(흑색종 세포주), C6(신경교종 세포주) 및 MDA 435(유방암 세포주) 세포의 종양 성장을 수정된 계란의 장뇨막 분석(CAM)으로 조사하였다. 요약하면, 계란의 생존성을 촛불에 비추어 확인하였다. 계란의 적도판에서 껍질과 장뇨막 사이에 기포가 형성되도록 공기 주머니를 이동시켰다. CAM으로의 접근로를 확보하기 위해 껍질에 창을 만들었다. CAM에 다음과 같이 세포를 첨가하였다: B16 세포, 계란당 5백만개; C6 세포, 계란당 5백만개; 및 MD435 세포, 계란당 5백만개. ECM 처리 계란의 경우, ECM(약 100 ㎍/처리) 및 세포를 동시에 계란에 첨가하였다. 시스플라틴으로 처리된 계란의 경우, 시스플라틴(1 mg/mL의 시스플라틴 용액 250 ㎕)을 다음날 국소적으로 첨가하였다. 계란을 10일 동안 인큐베이션하였고, 그 후 종양을 절제하여 칭량하였다.

종양 질량은 ECM 존재 하에 유의적으로 감소하였다. 도 1 및 2는 B16 세포에 의해 생성된 종양의 중량이 ECM 부재에 비해 ECM 존재 하에 감소하였음을 보여준다. 종양의 중량은 또한 ECM과 혼합하거나 ECM 상에서 배양한 경우에도 감소되었다(도 3). 도 4 및 5는 C6 세포에 의해 생성된 종양의 중량이 미처리에 비해 ECM 존재 하에 감소되었음을 보여준다. 또한, ECM+시스플라틴 존재 하에 종양 중량이 추가로 감소되었다. 도 7은 MDA 435 유방암 세포에 의해 생성된 종양의 중량이 미처리에 비해 ECM 존재 하에 감소되었으며 ECM+시스플라틴 존재 하에 추가로 감소되었음을 보여준다.

또 다른 CAM 분석에서는, B16 세포를 바이오뉴시스(BioNeusis)(10 mg/ml) 100 ㎕와 함께 계란(계란당 2∼3백만개 세포)에 주사하였다. 바이오뉴시스는 ECM을 생성하는 데 사용되는 바이오리액터에서 섬유아세포에 의해 컨디셔닝된 배지로서 액체 형태에서만 ECM과 매우 유사하다. 도 16은 CAM 분석에서의 종양 증식이 미처리에 비해 바이오뉴시스 존재 하에 감소되었음을 보여준다. 추가 연구에서, B16 세포를 액체 ECM의 농도를 증가시키면서 배양하였으며, 이때 모든 ECM 농도에서 증식이 감소되었다(도 17). 또 다른 연구에서는, B16 세포를, CAM 분석에서의 비분획화 액체 ECM 중에서 증식시킨 B16 세포와 비교하여 다양한 분자량 분획의 액체 ECM 중에서 증식시켰다. 100,000 달톤 초과를 제외하고 모든 분자량 분획이 비분획화 ECM과 비교하여 종양 질량 감소율(%)에 있어서의 증가를 보였다(도 8).

ECM 존재 또는 부재 하 및 시스플라틴 존재 및 부재 하에서의 B16 세포, C6 세포 또는 MDA435 세포의 종양 증식을 누드 마우스에서 조사하였다. 세포, ECM 및 시스플라틴을 누드 마우스의 아랫쪽 둔부에 동시에 피하 주사하였다. 사진 촬영, 길이 및 폭 측정, 마지막으로 중량 측정을 통해 종양 증식을 경시적으로 추적하였다. 도 8 및 9는, 주사 후 14일째의, ECM 존재 하(도 9) 및 부재 하(도 8)에서의 누드 마우스에서의 C6 세포로부터의 종양 증식을 보여준다. 도 10 및 11은, 주사 후 14일째의, ECM+시스플라틴 존재 하(도 10) 및 ECM 없이 시스플라틴 존재 하(도 11)에서의 누드 마우스에서의 C6 세포로부터의 종양 증식을 보여준다. ECM 존재 하에서 증식시킨 세포는, 촉진할 수 있는 종양을 형성한 대조군(미처리)과 비교하여 종양 증식을 보이지 않거나 감소된 증식을 보였다. 도 12는, ECM으로 처리된 마우스는 미처리 대조군과 비교하여 감소된 종양 증식을 나타내었으며, ECM 존재 또는 부재 하에 시스플라틴으로 처리된 마우스는 종양 증식을 나타내지 않았음을 보여주는 18일 동안의 종양 증식 플롯을 도시한다. 유사한 연구에서, ECM 존재 하에 증식시킨 MDA435 세포(도 13b), ECM 및 시스플라틴 존재 하에 증식시킨 MDA435 세포(도 13c) 또는 시스플라틴 단독 존재 하에 증식시킨 MDA435 세포(도 13d)는 촉진할 수 있는 종양을 형성한 미처리 대조군(도 13a)과 비교해서 종양 증식의 감소 또는 부재를 나타내었다. 도 14는 25일 동안의 종양 증식 플롯을 도시하며, 여기에서는 ECM으로 처리된 마우스가 미처리 대조군과 비교해서 감소된 종양 증식을 나타내었다. ECM 존재 또는 부재 하에 시스플라틴으로 처리된 마우스는 종양 질량이 0까지 감소됨을 나타내었다. 도 15는 ECM 존재(오른쪽) 또는 ECM 부재(왼쪽) 하에 누드 마우스에서 증식시킨 B16 세포의 결과를 보여주며, 여기에서는 종양 증식이 ECM 존재 하에 억제되었다.

상기 실시예 및 첨부 1(그 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨)과 관련하여 본 발명을 기술하였지만, 그 변경 및 수정이 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함된다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 특허청구범위에 의해서만 한정된다.

Claims (28)

1. 저산소 세포외 기질을 생산하기 위해 1-5% 산소의 저산소 조건하에서 마이크로캐리어 비드 상에 인간 섬유아 세포를 배양하고 저산소 세포외 기질을 회수함으로써 제조되는, 암 세포 성장 또는 증식 억제용 세포외 기질(ECM) 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 암 세포가 종양으로부터 유래되는 것인 세포외 기질 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 암 세포가 흑색종, 신경교종 및 선암종으로 구성된 군에서 선택되는 암으로부터 유래되는 것인 세포외 기질 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 세포외 기질 조성물이 2차원 또는 3차원 표면 상에서 세포를 배양하는 것으로부터 얻어지는 것인 세포외 기질 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 세포가 성체, 태아, 신생아 또는 배아 조직으로부터 유래되는 것인 세포외 기질 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 가용성 분획인 세포외 기질 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 불용성 분획인 세포외 기질 조성물.
10. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 가용성 분획과 불용성 분획의 조합인 세포외 기질 조성물.
11. 제8항에 있어서, 상기 가용성 분획이 분자량 30,000 달톤 미만의 분자를 포함하는 분자량 분획을 포함하는 것인 세포외 기질 조성물.
12. 제1항에 있어서, 상기 세포외 기질 조성물이 화학요법제를 포함하는 것인 세포외 기질 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 화학요법제가 시스플라틴인 세포외 기질 조성물.
14. 삭제
15. 저산소 인간 세포외 기질을 생산하기 위해 1-5% 산소의 저산소 조건하에서 마이크로캐리어 비드 상에 인간 섬유아 세포를 배양하고 저산소 세포외 기질을 회수함으로써 제조되는 암 치료용 세포외 기질(ECM) 조성물로서, 상기 세포외 기질 조성물은 화학요법제를 추가로 포함하고 있는 것인 암 치료용 세포외 기질(ECM) 조성물.
16. 삭제
17. 제15항에 있어서, 상기 세포외 기질 조성물이 2차원 또는 3차원 표면 상에서 세포를 배양하는 것으로부터 얻어지는 것인 세포외 기질 조성물.
18. 제17항에 있어서, 상기 세포가 성체, 태아, 신생아 또는 배아 조직으로부터 유래되는 것인 세포외 기질 조성물.
19. 삭제
20. 삭제
21. 제15항에 있어서, 상기 조성물이 가용성 분획인 세포외 기질 조성물.
22. 제15항에 있어서, 상기 조성물이 불용성 분획인 세포외 기질 조성물.
23. 제15항에 있어서, 상기 조성물이 가용성 분획과 불용성 분획의 조합인 세포외 기질 조성물.
24. 제21항에 있어서, 가용성 분획이 분자량 30,000 달톤 미만의 분자를 포함하는 분자량 분획을 포함하는 것인 세포외 기질 조성물.
25. 제15항에 있어서, 상기 화학요법제가 시스플라틴인 세포외 기질 조성물.
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