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KR101601387B1 - c-KIT 항체 및 이의 용도 - Google Patents

c-KIT 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR101601387B1
KR101601387B1 KR1020137029568A KR20137029568A KR101601387B1 KR 101601387 B1 KR101601387 B1 KR 101601387B1 KR 1020137029568 A KR1020137029568 A KR 1020137029568A KR 20137029568 A KR20137029568 A KR 20137029568A KR 101601387 B1 KR101601387 B1 KR 101601387B1
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마이클 아마툴리
브린 (니 브렌난), 로라 앤
케렌 파즈
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임클론 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 인간 c-Kit의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체, 이러한 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 암 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

c-KIT 항체 및 이의 용도 {c-KIT ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 인간 c-Kit의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체, 이러한 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 c-Kit의 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애, 예컨대 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애를 치료하는데 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
c-Kit는 수용체 티로신 키나제(kinase)이고, 예를 들어 줄기 세포 인자 (SCF) 수용체 또는 CD-117로도 공지되어 있다. c-Kit 및 이의 리간드인 SCF는 조혈, 멜라닌생성, 적혈구생성, 정자생성, 발암, 섬유증, 염증, 비만 세포 분화 및 증식, 및 면역학적 프로세스가 포함되는 다양한 생물학적 기능을 매개한다.
글리벡(GLEEVEC)® (이마티닙 메실레이트) 및 수텐트(SUTENT)® (수니티닙 말레이트)는 c-Kit가 포함되는 다중 수용체 티로신 키나제를 억제하는, 승인 및 시판되는 소형 분자 제약 제품이다. 그러나, 종종 종양 세포는 돌연변이에 의해 매개되는 약물 저항성이 있거나 이러한 저항성이 급속하게 발달되기 때문에 일반적으로 이같은 요법들이 이들의 승인된 적응증에서의 제한된 이점을 제공한다는 것이 현재 명확하다.
인간 c-Kit에 대한 항체가 이전에 보고되었다. 그러나, c-Kit 내재화를 억제하거나, 종양 세포에서 c-Kit 효능제 활성, 예를 들어 c-Kit 인산화를 자극하거나, 또는 치료용 항암제로서의 효과적인 사용에 최적인 다른 속성이 없기 때문에, 공지된 c-Kit 항체는 바람직하다고 할 수 없다. 예를 들어, WO 2007/127317에 인간화 c-Kit 항체, 및 주로 비만 세포, 조혈, 멜라닌생성, 및 정자생성에 대한 항체의 효과에 관한 관련 데이터가 개시되어 있다. 명백하게, WO 2007/127317에 기술된 항체는 "MO7e 세포에서 SCF-매개 c-Kit 인산화 및 내재화를 강력하게 억제한다"고 보고되었다.
따라서, 본 발명은 인간 c-Kit의 세포외 도메인 (ECD)을 특이적으로 표적화하는 대안적 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명은 종양 세포에서 c-Kit 효능제 활성, 예를 들어 c-Kit 인산화를 유도하지 않으면서 형질 막-결합 c-Kit의 내재화 및/또는 분해를 유도할 수 있고/있거나 치료용 항암제로서의 효과적인 사용에 유리한 다른 임상 속성 (예를 들어, 개선된 용해도, 시험관내 또는 생체내 안정성, 또는 기타 약동학적 성질)이 있는, 인간 c-Kit의 ECD를 특이적으로 표적화하는 모노클로날 항체를 또한 제공한다. 이같은 항체는 암 치료에서 더욱 효과적일 것으로 예상되며, 유리하게는 돌연변이-매개 약물 저항성의 획득을 지연시키거나 방지하고/하거나 공지된 치료법에 대해 저항성인 암을 치료할 것으로 예상된다. 따라서, 본원에 기술된 c-Kit 항체는 업계의 중대한 요구를 충족시킨다.
본 발명의 한 측면은 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 치료법에 사용하기 위한, HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 암 치료에 사용하기 위한, HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 암 치료를 필요로 하는 인간에게 치료 유효량의, HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 인간에게 치료 유효량의, HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 치료 유효량의 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 다른 치료제는 항암제이다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 c-Kit 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
도 1은 세포를 시험관내에서 항-c-Kit mAb CK6으로 처리하기 전 및 후에 인간 종양 세포주인 Mo7e 및 GIST882의 전체 세포 용해물에서 검출된 전체 c-Kit의 웨스턴 블롯을 도해한다. 항-c-Kit mAb CK6이 시간 의존적인 방식으로 인간 종양 세포에 의해 발현된 c-Kit의 분해를 극적으로 유도하였다.
도 2는 항-c-Kit mAb CK6과 함께 또는 CK6 없이 인간 종양 세포주인 GIST882의 전체 세포 용해물에서 검출된 전체 c-Kit의 웨스턴 블롯을 도해한다. 항-c-Kit mAb CK6이 시간 의존적인 방식으로 GIST882 인간 종양 세포에 의해 발현된 c-Kit의 분해를 유의하게 유도하는 것으로 관찰되지 않는다.
도 3은 항-c-Kit mAb CK6과 함께 또는 CK6 없이 인간 종양 세포주인 Mo7e의 전체 세포 용해물에서 검출된 전체 c-Kit의 웨스턴 블롯을 도해한다. 항-c-Kit mAb CK6이 시간 의존적인 방식으로 Mo7e 인간 종양 세포에 의해 발현된 c-Kit의 분해를 유의하게 유도하는 것으로 관찰되지 않는다.
도 4는 항-c-Kit mAb CK6과 함께 또는 CK6 없이 인간 종양 세포주인 Malm-3M의 전체 세포 용해물에서 검출된 전체 c-Kit의 웨스턴 블롯을 도해한다. 항-c-Kit mAb CK6이 시간 의존적인 방식으로 Malm-3M 인간 종양 세포에 의해 발현된 c-Kit의 분해를 유의하게 유도하는 것으로 관찰되지 않는다.
본 발명은 예를 들어 c-Kit의 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애, 예컨대 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애의 치료에 유용한, 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "항체"라는 용어는 달리 지시되지 않는 한 모노클로날 항체를 지시한다. "모노클로날" 및 이의 약어인 "mAb"는 항체가 생산되는 방법이 아니라 예를 들어 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론이 포함되는 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체를 지칭하도록 의도된다. 항체는, 이러한 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, 무손상 항체 (완전한 또는 전장 Fc 영역을 포함함), 또는 항원-결합 부분을 포함하는 이의 일부분 또는 단편, 예를 들어 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 결합하는 Fab 단편, Fab' 단편, 또는 F(ab')2 단편일 수 있다. 예를 들어, c-Kit의 ECD에 결합할 수 있고 본 발명에 포함되는 항체 단편에는 2가 단편, 예컨대 사슬간 디술피드 결합이 손상되지 않은 (Fab')2, 1가 단편, 예컨대 LCVR-CL 및 HCVR-CH1 도메인으로 이루어지고 중쇄 힌지(hinge) 영역을 보유하지 않는 항체의 단편을 지칭하는 Fab (항원 결합 단편(Fragment, antigen biding)) (예를 들어, 파파인 소화에 의한 것), 중쇄 힌지 영역을 보유하는 Fab, Facb (예를 들어, 플라즈민 소화에 의한 것), F(ab')2, 디술피드 결합이 결여된 Fab', pFc' (예를 들어, 펩신 또는 플라즈민 소화에 의한 것), Fd (예를 들어, 펩신 소화, 부분적인 환원 및 재응집에 의한 것), 및 Fv 또는 scFv (예를 들어, 분자 생물학 기술에 의한 것; 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994] 참조)일 수 있다. 또한 항체 단편은, 예를 들어 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는, 도메인 결실 항체, 선형 항체, 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체, 다가 단일쇄 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody)가 포함되는 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 등을 포함하도록 의도된다. 항원-결합 단편 또는 일부분이 특정되는지 여부와 관계없이, 본원에서 사용된 바와 같은 "항체"라는 용어는 달리 지시되지 않는 한 이같은 단편 또는 일부분, 뿐만 아니라 단일쇄 형태를 포함하는 것으로 이해된다.
경쇄는 1개의 가변 도메인 (본원에서 LCVR로 약칭됨) 및/또는 1개의 불변 도메인 (본원에서 CL로 약칭됨)을 포함할 수 있다. 인간 항체 (면역글로불린)의 경쇄는 카파 (Κ) 경쇄 또는 람다 (λ) 경쇄일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, LCVR이라는 표현은 카파 유형 경쇄 (VΚ) 또는 람다 유형 경쇄 (Vλ)로부터의 가변 영역 양쪽을 포함하도록 의도된다. 중쇄 또한 1개의 가변 도메인 (본원에서 HCVR로 약칭됨) 및/또는 항체 클래스 또는 이소형에 따른 3개 또는 4개의 불변 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4; 본원에서 총괄적으로 CH로 약칭됨)을 포함할 수 있다. 인간 IgG1이 본 발명의 항체에 대한 바람직한 이소형이다.
초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 3개의 영역이 LCVR 및 HCVR 각각에서 발견되고, 이는 프레임워크 (본원에서 FR로 약칭됨)로 불리는 덜 가변적인 영역에 의해 지지된다. 카바트(Kabat) 관례에 따라 아미노산이 특정 CDR 영역 또는 도메인에 할당된다 (문헌 [Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)]; [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]). 각각의 HCVR 및 LCVR은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. LCVR 및 HCVR 도메인으로 이루어지는 항체의 일부분이 Fv (가변 단편(Fragment variable))로 지정되고, 항원-결합 부위를 구성한다. 단일쇄 Fv (scFv)는 1개의 폴리펩티드 사슬 상에 LCVR 도메인 및 HCVR 도메인을 함유하는 항체 단편이고, 이때 1개의 도메인의 N 말단과 다른 도메인의 C 말단이 가요성 링커에 의해 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "인간 항체"라는 용어는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역이 있는 항체를 포함한다 ([Kabat, et al., 상기 문헌]에 기술된 바와 같음).
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적 인식을 지칭한다. c-Kit에 대한 본 발명의 항체의 특이성을 친화력 및/또는 결합력을 기초로 결정할 수 있다. 항원과 항체의 해리에 대한 평형 상수 (KD)로 표현되는 친화력은 항원 결정인자와 항체-결합 부위 사이의 결합 강도를 측정한다. 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서, 예컨대 비아코어(BIAcore)® 3000을 사용하여 본원에 개시된 항체의 결합 동역학 및 친화력을 측정할 수 있다. 비아코어® 시스템은 덱스트란 바이오센서 매트릭스 내의 상호작용 분자들의 단백질 농도에서의 변경을 검출하는 SPR의 광학적 성질을 활용한다. 본질적으로 하기 실시예 4에 기술된 바와 같이 SPR 바이오센서에 의해 KD 값이 포함되는 항-c-Kit 모노클로날 항체의 결합 동역학을 결정할 수 있다.
c-Kit의 ECD에 대한 c-Kit 항체의 친화력과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같은 "특이적으로 결합한다"라는 구절은, 달리 지시되지 않는 한, 본질적으로 본원에 기술된 바와 같은 SPR 바이오센서의 사용을 포함하여 업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 결정된 바와 같은, 약 2×10-10 M 미만, 바람직하게는 약 2×10-10 M 내지 약 2×10-12 M의 KD를 의미하도록 의도된다.
본 발명의 한 측면은 HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 LCVR 아미노산 서열이
Figure 112015083241446-pct00001
(서열번호 13의 서열)인 LCVR, 및 HCVR 아미노산 서열이
Figure 112015083241446-pct00002
(서열번호 7의 서열)인 HCVR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 중쇄 아미노산 서열이 서열번호 9의 서열이고 경쇄 아미노산 서열이 서열번호 15의 서열인 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 각각의 중쇄 아미노산 서열이 서열번호 9의 서열이고 각각의 경쇄 아미노산 서열이 서열번호 15의 서열인 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다.
본 발명의 또다른 측면은 HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체가 1) 인간 SCF에 대한 인간 c-Kit 결합의 억제; 2) 인간 c-Kit의 완전 길항; 3) SCF-의존적 신호전달 경로의 억제; 4) 인간 c-Kit의 SCF-비의존적 활성화의 억제; 5) 인간 c-Kit 내재화의 유도; 6) 인간 c-Kit 분해의 유도; 7) 시험관내에서의 종양 세포 성장의 억제; 8) 생체내에서의 종양 세포 성장의 억제; 및 9) 인간 c-Kit의 ECD에 약 2×10-10 M 미만의 KD로 결합하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 성질을 지니는 것인 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 이같은 항체는 1) 내지 9)로부터 선택된 2개 이상의 성질을 보유한다. 더욱 바람직하게는, 이같은 항체는 1) 내지 9)로부터 선택된 3개 이상의 성질을 보유한다. 더욱더 바람직하게는 이같은 항체는 1) 내지 9)로부터 선택된 4개 이상의 성질을 보유한다. 더욱더 바람직하게는, 이같은 항체는 1) 내지 9)로부터 선택된 5개 이상의 성질을 보유한다. 가장 바람직하게는, 이같은 항체는 성질 1) 내지 9)를 보유한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 25℃에서 SPR에 의해 결정된 바와 같이 약 2×10-10 M 미만, 바람직하게는 약 2×10-10 M 내지 약 2×10-12 M, 더욱 바람직하게는 약 100 pM 내지 약 5 pM, 더욱더 바람직하게는 약 100 pM 내지 약 10 pM, 더욱더 바람직하게는 약 75 pM 내지 약 25 pM, 더욱더 바람직하게는 약 75 pM 내지 약 50 pM, 가장 바람직하게는 약 70 pM 내지 약 60 pM의 KD로, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이때 c-Kit의 ECD에 대한 항체의 결합이 c-Kit의 내재화를 유도하는 것인 항체를 제공한다. 바람직하게는, c-Kit 수용체의 ECD에 대한 항체의 결합은 본질적으로 하기 실시예 6에서 기술된 바와 같은 c-Kit 내재화의 시험관내 검정에서 FACS에 의해 결정된 바와 같이 종양 세포를 약 1 ㎍/㎖의 상기 항체로 약 1시간 동안 37℃에서 처리한 후에 종양 세포의 표면 상에 발현된 c-Kit의 50％ 이상의 내재화를 유도한다. 더욱 바람직하게는, c-Kit 수용체의 ECD에 대한 항체의 결합은 본질적으로 하기 실시예 6에서 기술된 바와 같은 c-Kit 내재화의 시험관내 검정에서 FACS에 의해 결정된 바와 같이 종양 세포를 약 1 ㎍/㎖의 상기 항체로 약 6시간 동안 37℃에서 처리한 후에 종양 세포의 표면 상에 발현된 c-Kit의 75％ 이상의 내재화를 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이때 c-Kit의 ECD에 대한 항체의 결합이 종양 세포에 의해 발현된 형질 막-결합 c-Kit의 분해를 유도하는 것인 항체를 제공한다. 바람직하게는, c-Kit의 ECD에 대한 항체의 결합은 본질적으로 하기 실시예 7에서 기술된 바와 같은 c-Kit 분해의 시험관내 검정에 의해 결정된 바와 같이 종양 세포를 약 100 ng/㎖의 상기 항체로 약 12시간 동안 37℃에서 처리한 후에 종양 세포에 의해 발현된 형질 막-결합 c-Kit의 50％ 이상의 분해를 유도한다. 더욱 바람직하게는, c-Kit의 ECD에 대한 항체의 결합은 본질적으로 하기 실시예 7에서 기술된 바와 같은 c-Kit 분해의 시험관내 검정에 의해 결정된 바와 같이 종양 세포를 약 100 ng/㎖의 상기 항체로 약 24시간 동안 37℃에서 처리한 후에 종양 세포에 의해 발현된 형질 막-결합 c-Kit의 75％ 이상의 분해를 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이때 c-Kit의 ECD에 대한 항체의 결합이 시험관내 종양 세포-기반 검정에서 c-Kit 및/또는 MAPK의 SCF-유도 인산화를 억제하는 것인 항체를 제공한다. 바람직하게는, c-Kit 항체는 약 1 nM 미만, 더욱 바람직하게는 약 1 nM 내지 약 1 pM, 더욱더 바람직하게는 약 500 pM 내지 약 5 pM, 더욱더 바람직하게는 약 500 pM 내지 약 10 pM, 더욱더 바람직하게는 약 500 pM 내지 약 100 pM, 더욱더 바람직하게는 약 500 pM 내지 약 250 pM, 가장 바람직하게는 약 300 pM의 IC50으로 시험관내 종양 세포-기반 검정에서 c-Kit 및/또는 MAPK의 SCF-유도 인산화를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이때 c-Kit의 ECD에 대한 항체의 결합이 본질적으로 하기 실시예 11에서 기술된 바와 같이 수행된 생체내 검정에서 종양 세포 성장을 억제하는 것인 항체를 제공한다. 바람직하게는, c-Kit의 ECD에 대한 항체의 결합은 본질적으로 하기 실시예 11에서 기술된 바와 같이 수행된 생체내 검정에서 약 30％ 이상만큼 종양 세포 성장을 억제한다. 더욱 바람직하게는, c-Kit의 ECD에 대한 항체의 결합은 본질적으로 하기 실시예 11에서 기술된 바와 같이 수행된 생체내 검정에서 약 50％ 이상만큼 종양 세포 성장을 억제한다. 더욱더 바람직하게는, c-Kit의 ECD에 대한 항체의 결합은 본질적으로 하기 실시예 11에서 기술된 바와 같이 수행된 생체내 검정에서 약 30％ 이상만큼, 더욱더 바람직하게는 약 60％ 이상만큼 백혈병, 소세포 폐암, 흑색종, 위장관 기질 종양 (GIST), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 신장암, 및/또는 신경모세포종 종양 세포 성장을 억제한다.
한 측면에서, 본 발명은 증가된 리간드 의존적 또는 리간드 비의존적 c-Kit 활성과 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 인간에게 유효량의, HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 증가된 리간드 의존적 또는 리간드 비의존적 c-Kit 활성과 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 장애는 암이다.
"장애" 또는 "질환"은 본 발명의 항체 또는 방법으로의 치료가 이로울 임의의 병태이다. 이는 인간을 당해 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 병태를 포함하여 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체로 치료될 장애에는 악성 및 양성 종양; 백혈병, 소세포 폐암, 흑색종, GIST, 유잉 육종, 신장암 및 신경모세포종이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 암종, 백혈병, 모세포종 및 육종이 포함된다. 바람직하게는, 본 발명의 항체로 치료될 장애에는 c-Kit 의존적 악성 및 양성 종양; c-Kit 의존적 백혈병, 소세포 폐암, 흑색종, GIST, 유잉 육종, 신장암 및 신경모세포종이 포함되지만 이에 한정되지 않는, cKit 의존적 암종, 백혈병, 모세포종 및 육종이 포함된다.
본 발명의 또다른 측면은 암 치료를 필요로 하는 인간에게 유효량의 본 발명의 c-Kit 항체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 암은 백혈병, 소세포 폐암, 흑색종, GIST, 유잉 육종, 신장암, 및 신경모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 인간에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 암은 c-Kit 의존적이다.
한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 c-Kit 항체를 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 치료법에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 c-Kit 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 임의의 c-Kit 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 백혈병, 소세포 폐암, 흑색종, GIST, 유잉 육종, 신장암, 및 신경모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 임의의 c-Kit 항체를 제공한다. 바람직하게는, 암은 c-Kit 의존적이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본원에 기술된 c-Kit 항체의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 암은 c-Kit 의존적이다.
한 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본원에 기술된 c-Kit 항체를 유효량의 또다른 치료제 (예컨대 항-혈관신생 작용제, 또다른 항체, 화학요법제, 세포독성제, 면역억제제, 시토카인, 세포독성 방사선요법, 코르티코스테로이드, 또는 항구토제)와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 다양한 신생물성 또는 비-신생물성 병태를 치료하기 위해 본원에 기술된 c-Kit 항체가 하나 이상의 상이한 항암 및/또는 항-혈관신생 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 c-Kit 항체가 하나 이상의 다른 치료제, 예컨대 또다른 항암제로의 요법을 시작하기 전에, 이러한 요법 동안에, 이러한 요법과 실질적으로 동시에, 또는 이러한 요법을 시작한 후에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 다른 항암제 중 하나 이상은 이마티닙, 수니티닙, 시타라빈 (araC), 다카르바진 (DTIC), 시스플라틴, 및 에토포시드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 측면은 상기 언급된 임의의 c-Kit 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 상기 언급된 임의의 c-Kit 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이때 항체의 결합이 c-Kit 내재화를 유도하고/하거나 c-Kit의 분해 및/또는 c-Kit 및/또는 MAPK의 인산화 감소를 유도하는 것인 항체에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이때 항체의 결합이 시험관내에서 종양 세포 성장을 억제하고/하거나 생체내에서 종양 세포 성장을 감소시키는 것인 항체에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 HCVR 및 LCVR을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 ECD에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이때 항체의 결합이 c-Kit의 내재화 및/또는 분해를 유도하고/하거나 c-Kit 및/또는 MAPK의 인산화를 감소시키고/시키거나, 시험관내에서 종양 세포 성장을 억제하고/하거나, 생체내에서 종양 세포 성장을 감소시키는 것인 항체에 관한 것이다.
벡터의 형질전환 및 본 발명의 항체의 발현을 위한 바람직한 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 NS0 세포 (비-분비형 (0) 마우스 골수종 세포), 293, SP20 및 CHO 세포, 및 림프계 기원의 기타 세포주, 예컨대 림프종, 골수종 또는 하이브리도마 세포이다. 기타 진핵생물 숙주, 예컨대 효모를 별법으로 사용할 수 있다.
c-Kit 항체와 관련하여 "단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 결정된 바와 같이 95 중량％ 초과의 항체, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과로, (2) 스피닝(spinning) 컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 본 발명의 c-Kit 항체와 관련된 "단리된"이라는 용어는 재조합 세포 내의 원위치 항체를 포함할 수 있는데, 이는 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 황산암모늄 또는 황산나트륨에 의한 침전에 이어지는 식염수에 대한 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 친화력 또는 면역친화력 크로마토그래피 (단백질-A 친화력 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되지 않음), 뿐만 아니라 겔 여과 또는 구역 전기영동이 포함되는, 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 본 발명의 c-Kit 항체를 단리 또는 정제할 수 있다.
추가로, 본 발명은 제어 서열, 예컨대 발현 서열, 프로모터 및/또는 인핸서 서열에 작동가능하게 연결된 앞서 기술된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 박테리아와 같은 원핵생물 시스템 및 효모 및 표유동물 세포 배양 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는 진핵생물 시스템에서의 항체 폴리펩티드의 효율적인 합성을 위한 다양한 발현 벡터가 개발되었다. 본 발명의 벡터는 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열의 절편을 포함할 수 있다.
본 발명은 앞서 기술된 재조합 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포를 또한 제공한다. 하이브리도마 이외의 세포주에서 본 발명의 항체가 발현될 수 있다. 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 적절한 포유동물 숙주 세포의 형질전환에 사용할 수 있다.
특히 선호되는 세포주는 높은 수준의 발현, 관심 단백질의 구성적인 발현, 및 숙주 단백질로부터의 최소 오염을 기초로 선택된다. 발현용 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주가 업계에 주지되어 있고, COS-7 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 및 림프계 기원의 세포주, 예컨대 림프종, 골수종, 또는 하이브리도마 세포가 포함되는 다수의 기타 세포주와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 다수의 불멸화 세포주가 이에 포함된다.
본 발명은 인간에게 유효량의 본원에 기술된 c-Kit 항체를 투여하는 것에 의해 인간에서 종양 성장 및/또는 암을 치료하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명에 따라 치료될 적절한 병태는 인간 c-Kit를 발현하는 세포를 수반한다. 어떠한 특정 메커니즘에도 속박되기를 원치 않으면서, 본 발명의 방법은 예를 들어 신생물 성장이 c-Kit 의존적인 것들이 포함되는 암 세포의 성장의 치료를 제공한다.
본 발명의 문맥에서, "치료" 또는 "치료하다"는 질환 또는 장애와 연관된 기저 병태 또는 원치 않는 생리학적 변화의 진행을 억제하거나, 느리게 하거나, 줄이거나 역전시키는 것, 병태의 임상 증상을 호전시키는 것, 또는 병태의 임상 증상의 출현을 방지하는 것이 포함되는 치료적 처치를 지칭한다. 이로운 또는 원하는 임상 결과는 검출가능한지 또는 검출가능하지 않은지와 관계없이, 증상의 완화, 질환 또는 장애 정도의 축소, 질환 또는 장애의 안정화 (즉, 질환 또는 장애가 악화되지 않음), 질환 또는 장애의 진행의 지연 또는 감속, 질환 또는 장애의 호전 또는 경감, 및 질환 또는 장애의 진정 (부분적이든 또는 전체적이든)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우의 예상 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 이들은 이미 질환에 걸린 이들이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 치료 유효량의 본 발명의 항체가 이를 필요로 하는 인간에게 투여된다. 추가로, 본 발명의 제약 조성물은 치료 유효량의 본 발명의 c-Kit 항체를 포함할 수 있다. "치료 유효량" 또는 "유효 용량"은 원하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 기간에서 이를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 항체의 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유발하는 항체 또는 항체 일부분의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 기타 요인에는 투여, 표적 부위, 환자 (환자가 인간인지 또는 동물인지와 관계없음)의 생리학적 상태, 투여되는 기타 약물, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지 여부가 포함된다. 치료 유효량은 항체 또는 항체 일부분의 임의의 독성이거나 해로운 효과보다 치료적으로 이로운 효과가 더 큰 양일 수도 있다. 본원에 기술된 c-Kit 항체는 인간에게의 투여에 특히 유용하지만, 치료 목적으로 다른 포유동물에게도 투여될 수 있다.
최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료 또는 예방 반응)을 제공하도록 투여량 체계를 조정할 수 있다. 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 당업자에게 공지된 일상적인 방법을 사용하여 치료 투여량을 적정할 수 있다. 투약 일정은 전형적으로 단일 볼루스 투여 또는 연속 주입 내지 하루에 여러 번 (예를 들어, 4-6시간 마다) 투여하는 것 범위이거나, 또는 치료 중인 의사 및 환자의 병태에 의해 지시되는 바와 같을 것이다. 투약하는 양 및 빈도는 환자를 치료 중인 의사에 의해 결정될 것이다. 그러나, 본 발명이 임의의 특정 용량에 한정되지 않는다는 것을 주지하여야 한다.
본 발명의 항-c-Kit 항체는 시타라빈 (즉, araC), 다카르바진 (DTIC), 시스플라틴, 또는 에토포시드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 항신생물제와 조합되어 투여될 수 있다.
본 발명에서, 임의의 적절한 방법 또는 경로를 사용하여 본 발명의 c-Kit 항체를 투여할 수 있고, 임의로는 항신생물제 및/또는 다른 수용체의 길항제와 공동-투여할 수 있다. 본 발명의 조합 요법에서, 또다른 작용제로의 요법을 시작하기 전에, 이러한 요법 동안에, 이러한 요법과 실질적으로 동시에, 또는 이러한 요법을 시작한 후에 c-Kit 항체를 투여할 수 있다.
본 발명의 c-Kit 항체는, 치료적 처치의 목적으로 사용되는 경우에, 바람직하게는 제약 조성물로서 제제화된다. 이같은 제약 조성물 및 이의 제조 방법이 업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005)] 참조.
실시예 1: 인간 c- Kit 에 대한 인간 모노클로날 항체
항-인간 c-Kit mAb인 CK6의 CDR의 아미노산 서열이 표 1에서 제시된다.
Figure 112015083241446-pct00041
CK6 mAb HCVR, LCVR, 중쇄 (HC), 및 경쇄 (LC)의 아미노산 서열, 및 이를 코딩하는 cDNA 서열을 나타내는 서열 번호가 하기 표 2에서 제공된다.
Figure 112015083241446-pct00042
실시예 2: 인간 IgG1 항-인간 c- Kit 모노클로날 항체의 발현 및 정제
항-c-Kit mAb의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA 서열을 업계에 공지된 절차에 따라 발현 벡터 내로의 클로닝을 위해 PCR에 의해 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA (예를 들어, 서열번호 8의 서열)을 벡터 pEE6.1 (론자 바이올로직스 피엘씨(Lonza Biologics plc), 영국 버크셔 슬라우) 내의 인간 면역글로불린 중쇄 감마1 불변 영역을 코딩하는 cDNA 서열에 인-프레임(in-frame)으로 융합시킬 수 있다. 전체 인간 경쇄를 코딩하는 cDNA (예를 들어, 서열번호 16의 서열)를 벡터 pEE12.1 (론자 바이올로직스 피엘씨, 영국 버크셔 슬라우) 내로 직접적으로 클로닝할 수 있다. 조작된 면역글로불린 발현 벡터들을 NS0 골수종 세포 내에 전기천공에 의해 안정적으로 형질감염시킬 수 있고, 형질전환체를 글루타민 신테타제(synthetase) 선별 배지에서 배양할 수 있다. 안정한 클론을 항-인간 c-Kit 특이적 결합 ELISA에 의해 항체 발현에 대해 스크리닝할 수 있다. 양성 클론을 스피너(spinner) 플라스크 또는 생물반응기에서 항체 생산을 위해 무혈청 배지 배양으로 배양할 수 있다. 전장 IgG1 항체를 단백질 친화력 크로마토그래피 (포로스 A(Poros A), 캘리포니아주 포스터 시티의 퍼셉티브 바이오시스템즈 인코포레이티드(PerSeptive Biosystems Inc.))에 의해 정제할 수 있었고, 중성 완충 식염수 용액 내로 용출시킬 수 있다.
별법으로, 항-인간 c-Kit mAb의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA 서열들 (예를 들어, 각각 서열번호 8 및 14의 서열)을 클로닝하여, GS (글루타민 신테타제) 발현 벡터 내의 인간 면역글로불린 중쇄 감마1 불변 영역을 코딩하는 cDNA 서열에 인-프레임으로 융합시킬 수 있다. 조작된 면역글로불린 발현 벡터들을 CHO 세포 내에 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 안정한 클론을 인간 c-Kit에 특이적으로 결합하는 항체의 발현에 대해 확인할 수 있다. 양성 클론을 생물반응기에서 항체 생산을 위해 무혈청 배지 배양으로 확장시킬 수 있다. 전장 IgG1 항체를 단백질 A 친화력 크로마토그래피로 정제할 수 있고, 중성 완충 식염수 용액 내로 용출시킬 수 있다.
실시예 3: 항-인간 c- Kit 모노클로날 항체 CK6 의 시험관내 결합 및 차단 활성
정제된 항-c-Kit mAb의 시험관내 c-Kit 결합 및 차단 활성을 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)과 같은 업계에 공지된 면역학적 정량 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 간략하게, 96-웰 마이크로티터 플레이트를 100 ㎕/웰의 1 ㎍/㎖ 재조합 인간 c-Kit (rh-c-Kit) 단백질 (R&D 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미니애폴리스)로 실온 (20 - 25℃)에서 1시간 동안 코팅하였다. 세정 후, 웰을 3％ PBS/밀크로 차단하였다. 그 후, 전형적으로는 1.5 ㎍/㎖ 또는 100 nM에서 시작되는 정제된 항-c-Kit mAb의 여러 희석물을 rh-c-Kit가 코팅된 웰에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 여러 번 세정한 후 (3-5회), 항-인간 IgG-HRP 접합 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 펜실베니아주 웨스트 그로브)의 1:1000 희석물을 1시간 동안 실온에서 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 세정하고, HRP 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 청색이 발색될 때까지 인큐베이션하였다. 정지 용액을 첨가하고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모노클로날 항체 CK6을 상기 기술된 바와 같이 ELISA에서 rh-c-Kit 단백질에 결합하는 것에 대해 테스트하였다. 결과는 CK6이 rh-c-Kit에 약 3×10-11 M의 EC50 값으로 결합한다는 것을 가리킨다.
정제된 mAb를 c-Kit와 이의 리간드의 결합을 차단하는 능력에 대해 또한 테스트할 수 있다. 간략하게, 96-웰 마이크로티터 플레이트를 100 ㎕/웰의 1 ㎍/㎖ c-Kit 리간드 줄기 세포 인자 (SCF) (R&D 시스템즈)로 실온에서 1시간 동안 코팅하였다. 세정 후, 웰을 3％ PBS/밀크로 차단하였다. mAb의 여러 희석물 (전형적으로는 15 ㎍/㎖ 또는 1.0 μM에서 시작됨)을 먼저 rh-c-Kit (R&D 시스템즈)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, SCF가 코팅된 웰에 첨가하여 실온에서 2시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 여러 번 세정한 후 (3-5회), 항-인간 IgG-HRP 접합 항체의 1:1000 희석물을 1시간 동안 실온에서 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 0.2％ 트윈(Tween)-PBS로 세정하고, HRP 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 청색이 발색될 때까지 인큐베이션하였다. 정지 용액을 첨가하고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
모노클로날 항체 CK6을 상기 검정에서 c-Kit와 이의 리간드의 결합을 차단하는 능력에 대해 테스트하였다. 결과는 CK6이 c-Kit-리간드 상호작용을 약 4×10-11 M의 IC50 값으로 차단한다는 것을 가리킨다.
실시예 4: 항-c- Kit 모노클로날 항체 CK6 의 결합 동역학
rh-c-kit에 대한 항-c-Kit 모노클로날 항체의 결합 동역학을 업계에 공지된 방법에 따라 SPR 바이오센서, 예컨대 비아코어® 3000 또는 비아코어® T100 (GE 헬스케어(GE Health Care), 뉴저지주 피스카타웨이)에 의해 결정할 수 있다. 본질적으로, 항-cKit 모노클로날 항체를 결합 친화력 측정 동안 비아코어® T100 및 러닝(running) 완충제로서의 HBS-EP (0.01 M HEPES-pH 7.4, 0.15 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005％ (v/v) 계면활성제 P20)를 사용하여 SPR로 평가할 수 있다. 25℃에서 측정한다. 약 120 반응 단위 (RU)의 rh-c-kit (pH 5.0)를 표준 아민 커플링 절차를 사용하여 CM5 칩 상에 고정시킬 수 있다. mAb를 고정된 rh-c-kit에 약 30 ㎕/분의 유량으로 180초 동안 주입한 후, HBS-EP를 사용하여 900초 동안 해리시켰다. 항-c-Kit 모노클로날 항체의 농도는 2배 희석의 구배일 수 있고, 이때 구배 당 농도는 3개 이상이고, 실험 당 구배는 3개이다. 해리 후, rh-c-kit 표면의 재생을 2회의 30 ㎕/분의 50 mM HCl의 30초 주입으로 달성할 수 있다. 비아코어® T100 평가 소프트웨어를 사용하여 속도 상수를 결정할 수 있다. 속도 상수 K오 프( off )/K온( on )의 비로부터 친화력 상수 KD를 계산할 수 있다. 상호작용의 "K온, M-1s-1" 및 "K오프, s-1" 속도를 사용하여 항체/수용체 상호작용의 친화력 (KD, M) 을 결정할 수 있다.
모노클로날 항체 CK6을 인간 c-Kit 단백질에 대한 이의 결합 동역학에 대해 테스트하였다. 25℃에서 측정치를 수득하였다. mAb CK6에 대한 KD, K온, 및 K오프 속도가 표 3에서 제시된다.
Figure 112013101472676-pct00005
실시예 5: 항-인간 c- Kit 모노클로날 항체 CK6 의 종 특이성
항-인간 c-Kit mAb의 종 결합 특이성을 ELISA에서 인간, 시노몰구스(cynomolgus), 및 마우스 c-Kit 단백질에 대한 항체의 반응성을 측정함으로써 결정할 수 있다. 간략하게, 96-웰 마이크로티터 플레이트를 100 ㎕/웰의 1 ㎍/㎖ 재조합 인간 c-Kit 단백질 (rh-c-Kit) 또는 재조합 마우스 c-Kit (rm-c-Kit; Gln26-Thr519) (시판됨 (R&D 시스템즈)), 또는 시노몰구스 c-Kit (cyno-c-Kit; 재조합에 의해 제조된 Met1-His549)로 실온에서 1시간 동안 코팅하였다. 세정 후, 웰을 3％ PBS/밀크로 차단하였다. 그 후, 인간 항-인간-c-Kit mAb의 단계 희석물을 c-Kit가 코팅된 웰에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 여러 번 세정 후, 결합된 인간 항체를 검출하기 위해 항-인간 IgG-HRP 접합 항체의 1:1000 희석물을 1시간 동안 실온에서 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 세정하고, HRP 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 청색이 발색될 때까지 인큐베이션하였다. 정지 용액을 첨가하고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 CK6이 rh-c-Kit, 시노몰구스 c-Kit에 결합하지만 (5.7×10-11 M의 EC50), rm-c-Kit에는 유의하게 결합하지 않는다는 것을 나타낸다 (표 4).
Figure 112013101472676-pct00006
Figure 112013101472676-pct00007
유동 세포측정법 분석을 기초로 인간 Mo7e 및 마우스 P815 세포의 표면 상에 발현된 형질 막-결합 c-Kit에 결합하는 것에 대해 c-Kit mAb의 종 특이성을 추가로 테스트할 수 있다 (예를 들어, WO2004/007735 참조). 간략하게, 전체적인 살아 있는 인간 Mo7e 및 마우스 P815 세포를 밤새 혈청 고갈시키고, 저온 차단 완충제 (PBS 내 5％ FBS)에서 3회 세정한 후, 100 ㎕의 차단 완충제에 재현탁시켰다. 항-c-Kit 항체를 1.0 ㎍/㎖로 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 2차 형광-접합 항체 (잭슨 이뮤노리서치)를 1.0 ㎍/㎖로 첨가하여, 유동 세포측정법 분석을 통해 세포 표면에 결합된 인간 항체를 검출하였다. 결과는 세포 기반 검정에서 CK6이 인간 종양 세포 (즉, Mo7e)에 의해 발현된 형질 막-결합 인간 c-Kit에 결합하지만, 마우스 종양 세포 (즉, p815)에 의해 발현된 형질 막-결합 마우스 (p815) c-Kit에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
Figure 112013101472676-pct00008
단리된 시노몰구스 골수 세포의 표면 상에 발현된 형질 막-결합 c-Kit에 mAb가 결합하는 것을 측정함으로써 c-Kit mAb의 종 특이성을 추가로 테스트할 수 있다. 간략하게, DPBS 현탁액 내의 골수를 히스토파크(Histopaque) 1077 밀도 구배 상에 층상화시켜 혈액 성분을 분리하였다. 원심분리 후, 백혈구를 계면으로부터 수확하고, ACK 용해 완충제에서 신속하게 헹궈서, 모든 잔류 적혈구를 제거하였다. 그 후, 단리된 백혈구를 CK6에 이어서 피코에리트린-접합 항-인간 IgG 2차 항체로 표지하고, FACS 분석에 적용하였다.
Figure 112013101472676-pct00009
CK6 mAb를 사용한 c-Kit 발현에 대한 시노몰구스 골수 세포의 FACS 분석은 CK6이 골수 세포의 세포 표면 상에 발현된 형질 막-결합 시노몰구스 c-Kit에 결합한다는 것을 가리킨다.
실시예 6: 시험관내 c- Kit 내재화 검정
시험관내 세포 기반 검정을 사용하여 인간 c-Kit 발현 세포에 대해 지시된 c-Kit mAb의 중화 활성을 측정할 수 있다. c-Kit mAb-유도 내재화를 기초로 할 수 있는 이같은 검정은 하기에 간략하게 기술된 바와 같은 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 이용할 수 있다.
1×106개의 세포/㎖ 농도의 혈청-고갈된 c-Kit 발현 Mo7e 세포를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 항-c-Kit 항체를 1 ㎍/㎖의 농도로 세포에 첨가하고, 4℃ 및 37℃에서 상이한 시간 간격으로 인큐베이션하였다. 세포를 200 ㎕ 차단 완충제 (PBS 내의 5％ 소 태아 혈청)에서 3회 세정하여, 모든 미결합 항체를 제거하였다. 세포를 100 ㎕의 차단 완충제에 재현탁시켰다. 피코에리트린-접합 항-인간 IgG-Fc-감마 항체 (잭슨 이뮤노리서치)를 첨가하여 결합된 항체의 존재를 검출하였고, 음성 대조군으로서 이전의 항체 노출이 없는 세포에 첨가하였다. 이러한 시점부터 가능한 경우 세포를 암실에서 유지시켰다. 세포를 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 이전과 같이 세정하였다. 그 후, 세포 샘플을 형광-표지 세포를 검출하는 다색 검출 검정 시스템 (예를 들어, 구아바 이지사이트 시스템(Guava easyCyte System) (밀리포어(Millipore), 매사추세츠주 빌레리카))에 러닝시켰다.
세포 표면 상의 평균 형광 강도는 c-Kit 항체로의 처리 후에 세포 표면 상에 잔존하는 c-Kit 분자의 양을 반영한다. 대표적인 실험으로부터의 데이터는 세포를 항-c-Kit mAb CK6과 함께 37℃에서 1시간, 6시간 및 24시간 동안 인큐베이션한 후의 세포 표면 c-Kit의 시간 의존적 감소를 나타낸다 (표 8 참조). 세포를 4℃에서 CK6과 함께 인큐베이션하는 것은 c-Kit 함량에서의 유의하지 않은 변화를 초래하였다 (음성 대조군). 이러한 데이터는 항-c-Kit mAb CK6이 시험관내에서 c-Kit를 발현하는 세포에서 c-Kit의 내재화를 극적으로 유도한다는 것을 나타낸다.
Figure 112013101472676-pct00010
실시예 7: 시험관내 c- Kit 분해 검정
시험관내 세포 기반 검정을 사용하여, 종양 세포를 c-Kit mAb로 37℃에서 처리한 후에 세포 용해물에서 확인되는 c-Kit의 총량에 의해 측정되는 바와 같은 c-Kit의 분해를 유도하는 c-Kit mAb의 능력을 측정할 수 있다. 간략하게, c-Kit를 발현하는 인간 세포주 (예를 들어, Mo7e 및 GIST882)를 6-웰 접시에 3 ㎖의 무혈청 배지 내의 3×106개의 세포/㎖의 밀도로 플레이팅하였다. CK6 항체 (100 ng/㎖)를 웰에 첨가하고, 37℃에서 48시간, 24시간 및 12시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 웰 1개는 대조군으로서 미처리로 남겨두었다. 처리 기간 직후, 세포를 저온 PBS에서 세정하고, 100 ㎕ 용해 완충제 (50 mM 헤페스(Hepes) pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaPPi, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1％ 트리톤(Triton) X-100, 프로테아제(protease) 억제제 칵테일)에서 용해시켰다. 얼음 상에서 10분 인큐베이션한 후, 세포를 12,000g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 환원 조건 하에 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 블롯을 항-인간 c-Kit 항체 (캘리포니아주 칼스배드의 인비트로젠(Invitrogen); 카탈로그 #34-8800)로 프로빙(probing)하여, 다양한 시간 동안 CK6과 함께 인큐베이션하기 전 및 후의 세포 내의 모든 c-Kit의 양을 검출하였다. 결과는 c-Kit mAb CK6과의 12시간 인큐베이션 후 미처리 세포와 비교하여 c-Kit의 유의한 분해를 나타낸다 (표 9). c-Kit의 CK6-유도 분해는 시간-의존적 방식으로 증가하였다. 과학 문헌에서의 이전의 보고로부터 예상된 바와 같이, 종양 세포를 SCF (100 ng/㎖)로 12시간, 24시간 및 48시간 동안 37℃에서 처리한 후에는 c-Kit 분해가 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
Figure 112013101472676-pct00011
실시예 7a: 시험관내 c- Kit 분해 검정
c-Kit를 발현하는 인간 세포주 (예를 들어, GIST882, Mo7e, 및 Malm-3M)를 6-웰 접시에 10％ 혈청을 사용하는 1개의 Mo7e 검정을 제외하고는 모두 3 ㎖의 무혈청 배지 내의 3×106개의 세포/㎖의 밀도로 플레이팅하였다. 다양한 농도의 CK6 항체 또는 SCF를 웰에 첨가하고, 37℃에서 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 웰 1개는 대조군으로서 미처리로 남겨두었다. 처리 기간 직후, 세포를 저온 PBS에서 세정하고, 100 ㎕ 용해 완충제 (50 mM 헤페스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaPPi, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1％ 트리톤 X-100, 프로테아제 억제제 칵테일)에서 용해시켰다. 얼음 상에서 10분 인큐베이션한 후, 세포를 12,000g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 환원 조건 하에 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 블롯을 항-인간 c-Kit 항체 (캘리포니아주 칼스배드의 인비트로젠; 카탈로그 #34-8800, 또는 매사추세츠주 댄버스의 셀 시그널링 테크놀러지(Cell Signaling Technology); 카탈로그#3308)로 프로빙하여, CK6 또는 SCF과 함께 인큐베이션하기 전 및 후의 세포 내의 모든 c-Kit의 양을 검출하였다. 결과는 c-Kit mAb CK6과의 인큐베이션 후 미처리 세포와 비교하여 c-Kit의 유의한 분해가 없음을 나타낸다. 0％ 혈청을 사용했을 때 Mo7e 종양 세포를 SCF (1 ㎍/㎖ 및 100 ng/㎖)로 24시간 동안 37℃에서 처리한 후에 c-Kit 분해가 관찰되었다. 10％ 혈청을 사용했을 때는 SCF 유도 분해가 명백하지 않았다. (GIST882의 복사본 = 1, Mo7e = 3, 및 Malm-3M = 1). 등가 단백질 로딩(loading)을 입증하기 위해, 블롯을 항-GAPDH 항체 (캘리포니아주 칼스배드의 앰비온(Ambion); 카탈로그#AM4300)로 다시 프로빙하였다.
실시예 8: c- Kit -의존적 인간 암 세포주의 확인
대부분의 성체 조직에 걸쳐 c-Kit 발현이 결여되기 때문에, 종양 내에서의 c-Kit 발현 검출은 일반적으로 c-Kit-의존적 세포 성장을 시사한다. 인간 암-유래 세포주를 유동 세포측정법 분석에 이어서 c-Kit 관련 세포-기반 인산화 및 생존능 검정을 사용하여 c-Kit 발현에 대해 테스트할 수 있다.
간략하게, 유동 세포측정법 분석을 통한 c-Kit 발현에 대해, 1.0×106개의 전체적인 살아 있는 세포를 밤새 혈청 고갈시키고, 차단 완충제 (PBS 내 5％ 소 태아 혈청)에서 3회 세정한 후, 100 ㎕의 차단 완충제에 재현탁시켰다. 항-c-Kit 항체 또는 대조군 항체를 1.0 ㎍/㎖로 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 이전과 같이 세정하여 모든 과량의 항체 또는 미결합 항체를 제거하였다. 세포를 다시 100 ㎕의 차단 완충제에 재현탁시킨 후, 형광-표지 2차 항체와 함께 인큐베이션하여, 세포에 결합된 1차 항체를 검출하였다. 형광-표지 항체를 첨가한 후, 세포를 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 암실에서 유지시켰다. 세포를 이전과 같이 세정하여 모든 미결합 항체를 제거하고, 100 ㎕ 차단 완충제에 재현탁시켰다. 그 후, 관련되지 않은 항체 대조군 샘플을 포함할 수 있는 세포 샘플을 형광-표지 세포를 검출하는 다색 검출 검정 시스템 (예를 들어, 구아바 이지사이트 시스템 (밀리포어, 매사추세츠주 빌레리카))에 러닝시켰다. 세포 표면 상의 평균 형광 강도는 관련되지 않은 항체 대조군과 비교하여 세포 표면 상의 c-Kit 분자의 양을 반영한다.
웨스턴 블롯을 통한 c-Kit 발현에 대해, 3.0×106개의 세포를 밤새 혈청 고갈시킨 후, 저온 PBS에서 세정하였다. 세포를 100 ㎕ 빙냉 용해 완충제 (50 mM 헤페스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaPPi, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1％ 트리톤 X-100, 프로테아제 억제제 칵테일)에서 10분 동안 얼음 상에서 용해시켰다. 4℃에서 15분 동안 12,000 rpm에서 원심분리하여 세포 잔해물을 펠릿화시켰다. 상청액을 수집하고, 환원 조건 하에 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 블롯을 항-인간 c-Kit 항체 (R&D 시스템즈) 및 적합한 HRP-표지 2차 항체로 프로빙하여, 세포 내에 존재하는 c-Kit의 양을 검출하였다.
c-Kit 리간드 SCF (페프로테크(Peprotech), 뉴저지주)로의 자극으로 처리한 후 또는 이러한 자극 없이 상기 기술된 바와 같이 세포를 용해시킴으로써 c-Kit 상태를 결정할 수 있다. 세포 용해물을 인산화된 c-Kit에 대해 특이적인 항체 프로브를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 자극되지 않은 세포 및 자극된 세포 양쪽 모두에 대한 블롯 내에 밴드가 존재하는 것은 c-Kit에서의 활성화 돌연변이가 있어 이의 리간드의 부재 하에서도 c-Kit가 인산화되거나 또는 세포주가 루프 과발현으로 자신의 리간드를 생산하고 있음을 가리킨다. 리간드의 존재 하에서만 인산화되는 세포주는 야생형 (WT) 과발현이다.
Figure 112013101472676-pct00012
본질적으로 이러한 실시예에서 기술된 바와 같이 수행된 분석을 기초로, 백혈병, 흑색종, SCLC, 유잉 육종 및 GIST로부터 유래된 15개의 세포주가 c-Kit-의존적인 것으로 결정되었다 (표 10 참조). 각각의 세포주에 대한 c-Kit 상태를 문헌 검색 및 서열 분석에 의해 확증하였다.
실시예 9: 시험관내 c- Kit 및 MAP 키나제 인산화 검정
SCF와 c-Kit의 상호작용은 c-Kit 이량체화를 유도하여, 세포질 도메인의 티로신 잔기의 자가인산화를 초래한다. c-Kit 하류에서, 포스파티딜이노시톨-3-키나제, Src 패밀리 구성원, JAK/STAT 경로 및 Ras-Raf-MAP 키나제 (MAPK) 케스케이드가 포함되는 다중 신호 전달 성분들이 활성화된다.
SCF에 반응한 c-Kit 및 MAPK 인산화를 억제하는 항-인간 c-Kit mAb의 능력을 하기의 절차에 따라 시험관내 세포-기반 검정에서 결정할 수 있다. 간략하게, 상기 실시예 8에서 기술된 바와 같이, c-Kit-의존적 세포주들을 밤새 혈청 고갈시켰다. 그 후, 이들을 항-c-Kit mAb의 여러 희석물 (전형적으로는 100 nM 내지 0.1 nM 범위)과 함께 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 5 ng/㎖ SCF (R&D 시스템즈 또는 페프로테크)로 15분 동안 37℃에서 자극하였다. 그 후, 세포를 즉각적으로 저온 PBS에서 세정하고, 세포 단백질을 추출하기 위해 100 ㎕의 빙냉 용해 완충제 (50 mM 헤페스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaPPi, 50 mM NaF, 1mM Na3VO4, 1％ 트리톤 X-100, 프로테아제 억제제 칵테일)에서 10분 동안 얼음 상에서 용해시켰다. 4℃에서 15분 동안 12,000 rpm에서 원심분리하여 세포 잔해물을 펠릿화하였다. 상청액을 수집하고, 환원 조건 하에 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 블롯을 포스포-특이적 항-인간 c-Kit 또는 MAPK 항체 및 적합한 HRP-표지 2차 항체로 프로빙하여, 본 발명가들의 실험 조건 하의 c-Kit 및 MAP 키나제의 인산화 수준을 검출하였다.
모노클로날 항체 CK6을 Mo7e 백혈병 세포에서 SCF에 반응한 c-Kit 및 MAPK 인산화를 억제하는 능력에 대해 테스트하였다. 인산화 억제 검정에서의 mAb CK6의 IC50은 300 pM인 것으로 결정되었다. 이러한 결과들은 항-c-Kit mAb CK6이 c-Kit 활성화 및 이의 하류 신호전달을 효과적으로 차단할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 10: 시험관내 종양 세포 성장 억제 검정
본 발명의 c-Kit 모노클로날 항체에 의한 종양 세포 성장의 억제를 다수의 시판되는 세포 생존능 검정 키트 중 어느 하나를 사용하여 시험관내 검정에서 시험할 수 있다. 더욱 구체적으로, 종양 세포 성장을 억제하는 CK6의 능력을 시판되는 세포 생존능 키트 (예를 들어, 셀타이터-글로® 발광 세포 생존능 검정(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay), 미국 위스콘신주 매디슨의 프로메가(Promega))를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 테스트하였다.
셀타이터-글로® 발광 세포 생존능 검정 키트를 사용하여 결정된 바와 같이 항-c-Kit 모노클로날 항체 CK6은 약 300 pM의 IC50으로 Mo7e 세포의 세포 생존능을 억제하는 것으로 결정되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 11: 생체내 종양 세포 성장 억제 검정
본질적으로 업계에 공지되어 있고 업계에서 광범위하게 사용되는 관련된 생체내 이종이식 모델에서 본 발명의 항-c-Kit 항체의 항-종양 효능을 추가로 시험할 수 있다.
간략하게 기술하면, c-Kit-의존적 인간 암 세포주를 배양하여 확장시킨 후, 무흉선 누드 마우스 (찰스 리버(Charles River), 매사추세츠주 윌밍턴)의 뒤쪽 옆구리 내로 마우스 당 2백만-1천만 개의 세포로 피하 주사하였다. 항-c-Kit mAb를 PBS, pH 7.2에서 희석하고, 정맥내 주사에 의해 4 또는 40 ㎎/㎏으로 투여하였다. 종양 크기가 약 180-360 ㎣에 도달했을 때, 마우스를 무작위화하고, 대조군 (예를 들어, 10 ㎕/g의 USP 식염수) 및 처리군 (예를 들어, 4 또는 40 ㎎/㎏의 mAb CK6)으로 나누었다. 또한, 처리군은 적합한 화학요법 약물 또는 승인된 RTK 억제제 (단독이거나 또는 본 발명의 항체와 조합됨)를 포함할 수 있었다. 항체 및 식염수 대조군을 주당 3회로 4주 동안 투여하였다. 종양 세포 성장의 억제를 처리 과정 동안 주당 2회의 종양 부피의 3차원 캘리퍼 측정으로 결정하였다. 하기와 같이 종양 부피를 결정할 수 있었다:
종양 부피 (㎣) = (종양 길이)(종양 폭2)(π/6),
[식 중, 종양 길이는 피부 표면에 대해 평행인 종양의 최대 치수이고, 폭은 피부 표면에 대해 평행인, 길이에 대해 수직인 최대 측정치이다]. 독성의 일반적인 측정으로서 처리 과정 동안 체중을 또한 자주 측정할 수 있었다. T/C％, 및 P 값을
T/C％ = [(처리 부피/초기 부피)/(대조군 부피/최초 부피)]*100
인 RM ANOVA에 의해 계산하였고, P 값은 식염수와 비교하여 계산하였다.
CK6을 처리로 사용한 다양한 c-Kit 관련 이종이식 모델로부터의 데이터가 표 11-14에서 제시된다.
Figure 112013101472676-pct00013
Figure 112013101472676-pct00014
Figure 112013101472676-pct00015
Figure 112013101472676-pct00016
이러한 데이터들을 항-c-Kit mAb CK6이 다양한 c-Kit 관련 이종이식 모델에서 종양 세포 성장을 극적으로 억제한다는 것을 입증한다. CK6으로의 처리는 표준 항암제, 예컨대 시타라빈 (araC) 및 다카르바진 (DTIC), 뿐만 아니라 에토포시드와 조합된 시스플라틴과 비교하여 더 강한 항-종양 활성을 입증하였다. 또한, CK6과 DTIC 또는 AraC의 조합물은 단독요법과 비교하여 더 강한 항-종양 활성을 입증하였다. 유사하게, CK6과 시스플라틴 및 에토포시드의 조합물은 시스플라틴 및 에토포시드 조합물 단독과 비교하여 더 강한 항-종양 활성을 입증하였다.
아미노산 및 뉴클레오티드 서열
> CK6-CDRH1 아미노산 서열 (서열번호 1의 서열)
Figure 112013101472676-pct00017
> CK6-CDRH2 아미노산 서열 (서열번호 2의 서열)
Figure 112013101472676-pct00018
> CK6-CDRH3 아미노산 서열 (서열번호 3의 서열)
Figure 112013101472676-pct00019
> CK6-CDRL1 아미노산 서열 (서열번호 4의 서열)
Figure 112013101472676-pct00020
> CK6-CDRL2 아미노산 서열 (서열번호 5의 서열)
Figure 112013101472676-pct00021
> CK6-CDRL3 아미노산 서열 (서열번호 6의 서열)
Figure 112013101472676-pct00022
> CK6-HCVR 아미노산 서열 (서열번호 7의 서열)
Figure 112013101472676-pct00023
> CK6-HCVR cDNA 서열 (서열번호 8의 서열)
Figure 112013101472676-pct00024
> CK6-HC 아미노산 서열 (서열번호 9의 서열)
Figure 112013101472676-pct00025
> CK6-HC cDNA 서열 (서열번호 10의 서열)
Figure 112013101472676-pct00026
> 분비 신호 서열이 있는 완전한 CK6-HC aa 서열 (서열번호 11의 서열)
Figure 112013101472676-pct00027
> 완전한 CK6-HC cDNA 서열 (서열번호 12의 서열)
Figure 112013101472676-pct00028
> CK6-LCVR 아미노산 서열 (서열번호 13의 서열)
Figure 112013101472676-pct00029
> CK6-LCVR cDNA 서열 (서열번호 14의 서열)
Figure 112013101472676-pct00030
> CK6-LC 아미노산 서열 (서열번호 15의 서열)
Figure 112013101472676-pct00031
> CK6-LC cDNA 서열 (서열번호 16의 서열)
Figure 112013101472676-pct00032
> 분비 신호 서열이 있는 완전한 CK6-LC aa 서열 (서열번호 17의 서열)
Figure 112013101472676-pct00033
> 완전한 CK6-LC cDNA 서열 (서열번호 18의 서열)
Figure 112013101472676-pct00034
> 신호 펩티드가 있는 인간 c-Kit 세포외 도메인 (ECD) (서열번호 19의 서열)
Figure 112013101472676-pct00035
> 신호 펩티드가 없는 인간 c-Kit 세포외 도메인 (ECD) (서열번호 20의 서열)
Figure 112013101472676-pct00036
SEQUENCE LISTING <110> Imclone, LLC <120> c-KIT ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> X18895 <150> 61/485255 <151> 2011-05-12 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 His Gly Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Glu Gly Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 123 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Ala Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Gly Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Glu Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 369 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 8 caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagcg gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata caggtttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccggca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacatggg 300 cgtggatata atggctacga gggtgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttca 369 <210> 9 <211> 453 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Ala Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Gly Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Glu Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 10 <211> 1359 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 10 caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagcg gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata caggtttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccggca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacatggg 300 cgtggatata atggctacga gggtgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttcag ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840 ttcaactggt atgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca agactggctg 960 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080 cgggaggaga tgaccaagaa ccaagtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctatt ccaagctcac cgtggacaag 1260 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggcaaa 1359 <210> 11 <211> 472 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 11 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Ala Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Gly Lys Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Glu Gly Ala 115 120 125 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 185 190 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 210 215 220 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 225 230 235 240 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245 250 255 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 370 375 380 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 430 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 435 440 445 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 12 <211> 1419 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 12 atgggatggt catgtatcat cctttttctg gtagcaactg caactggagt acattcacag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagcggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag gtttaccagc tactggatcg gctgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc tatcctggtg actctgatac cagatacagc 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccggcaagt ccatcagcac cgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag acatgggcgt 360 ggatataatg gctacgaggg tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 420 tcttcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtatg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccaaga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gaggagatga ccaagaacca agtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctattcca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggcaaatga 1419 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 13 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 14 <211> 273 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 14 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag ttt 273 <210> 15 <211> 214 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 15 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 16 <211> 645 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 16 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 17 <211> 233 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 17 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile 35 40 45 Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser 100 105 110 Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 18 <211> 702 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 18 atgggatggt catgtatcat cctttttctg gtagcaactg caactggagt acattcagcc 60 atccagttga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 120 acttgccggg caagtcaggg cattagcagt gctttagcct ggtatcagca gaaaccaggg 180 aaagctccta agctcctgat ctatgatgcc tccagtttgg aaagtggggt cccatcaagg 240 ttcagcggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gcagcctgaa 300 gattttgcaa cttattactg tcaacagttt aatagttacc ctctcacttt cggcggaggg 360 accaaggtgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702 <210> 19 <211> 520 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 19 Met Arg Gly Ala Arg Gly Ala Trp Asp Phe Leu Cys Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Arg Val Gln Thr Gly Ser Ser Gln Pro Ser Val Ser Pro Gly 20 25 30 Glu Pro Ser Pro Pro Ser Ile His Pro Gly Lys Ser Asp Leu Ile Val 35 40 45 Arg Val Gly Asp Glu Ile Arg Leu Leu Cys Thr Asp Pro Gly Phe Val 50 55 60 Lys Trp Thr Phe Glu Ile Leu Asp Glu Thr Asn Glu Asn Lys Gln Asn 65 70 75 80 Glu Trp Ile Thr Glu Lys Ala Glu Ala Thr Asn Thr Gly Lys Tyr Thr 85 90 95 Cys Thr Asn Lys His Gly Leu Ser Asn Ser Ile Tyr Val Phe Val Arg 100 105 110 Asp Pro Ala Lys Leu Phe Leu Val Asp Arg Ser Leu Tyr Gly Lys Glu 115 120 125 Asp Asn Asp Thr Leu Val Arg Cys Pro Leu Thr Asp Pro Glu Val Thr 130 135 140 Asn Tyr Ser Leu Lys Gly Cys Gln Gly Lys Pro Leu Pro Lys Asp Leu 145 150 155 160 Arg Phe Ile Pro Asp Pro Lys Ala Gly Ile Met Ile Lys Ser Val Lys 165 170 175 Arg Ala Tyr His Arg Leu Cys Leu His Cys Ser Val Asp Gln Glu Gly 180 185 190 Lys Ser Val Leu Ser Glu Lys Phe Ile Leu Lys Val Arg Pro Ala Phe 195 200 205 Lys Ala Val Pro Val Val Ser Val Ser Lys Ala Ser Tyr Leu Leu Arg 210 215 220 Glu Gly Glu Glu Phe Thr Val Thr Cys Thr Ile Lys Asp Val Ser Ser 225 230 235 240 Ser Val Tyr Ser Thr Trp Lys Arg Glu Asn Ser Gln Thr Lys Leu Gln 245 250 255 Glu Lys Tyr Asn Ser Trp His His Gly Asp Phe Asn Tyr Glu Arg Gln 260 265 270 Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Ala Arg Val Asn Asp Ser Gly Val Phe 275 280 285 Met Cys Tyr Ala Asn Asn Thr Phe Gly Ser Ala Asn Val Thr Thr Thr 290 295 300 Leu Glu Val Val Asp Lys Gly Phe Ile Asn Ile Phe Pro Met Ile Asn 305 310 315 320 Thr Thr Val Phe Val Asn Asp Gly Glu Asn Val Asp Leu Ile Val Glu 325 330 335 Tyr Glu Ala Phe Pro Lys Pro Glu His Gln Gln Trp Ile Tyr Met Asn 340 345 350 Arg Thr Phe Thr Asp Lys Trp Glu Asp Tyr Pro Lys Ser Glu Asn Glu 355 360 365 Ser Asn Ile Arg Tyr Val Ser Glu Leu His Leu Thr Arg Leu Lys Gly 370 375 380 Thr Glu Gly Gly Thr Tyr Thr Phe Leu Val Ser Asn Ser Asp Val Asn 385 390 395 400 Ala Ala Ile Ala Phe Asn Val Tyr Val Asn Thr Lys Pro Glu Ile Leu 405 410 415 Thr Tyr Asp Arg Leu Val Asn Gly Met Leu Gln Cys Val Ala Ala Gly 420 425 430 Phe Pro Glu Pro Thr Ile Asp Trp Tyr Phe Cys Pro Gly Thr Glu Gln 435 440 445 Arg Cys Ser Ala Ser Val Leu Pro Val Asp Val Gln Thr Leu Asn Ser 450 455 460 Ser Gly Pro Pro Phe Gly Lys Leu Val Val Gln Ser Ser Ile Asp Ser 465 470 475 480 Ser Ala Phe Lys His Asn Gly Thr Val Glu Cys Lys Ala Tyr Asn Asp 485 490 495 Val Gly Lys Thr Ser Ala Tyr Phe Asn Phe Ala Phe Lys Gly Asn Asn 500 505 510 Lys Glu Gln Ile His Pro His Thr 515 520 <210> 20 <211> 495 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 20 Gln Pro Ser Val Ser Pro Gly Glu Pro Ser Pro Pro Ser Ile His Pro 1 5 10 15 Gly Lys Ser Asp Leu Ile Val Arg Val Gly Asp Glu Ile Arg Leu Leu 20 25 30 Cys Thr Asp Pro Gly Phe Val Lys Trp Thr Phe Glu Ile Leu Asp Glu 35 40 45 Thr Asn Glu Asn Lys Gln Asn Glu Trp Ile Thr Glu Lys Ala Glu Ala 50 55 60 Thr Asn Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Thr Asn Lys His Gly Leu Ser Asn 65 70 75 80 Ser Ile Tyr Val Phe Val Arg Asp Pro Ala Lys Leu Phe Leu Val Asp 85 90 95 Arg Ser Leu Tyr Gly Lys Glu Asp Asn Asp Thr Leu Val Arg Cys Pro 100 105 110 Leu Thr Asp Pro Glu Val Thr Asn Tyr Ser Leu Lys Gly Cys Gln Gly 115 120 125 Lys Pro Leu Pro Lys Asp Leu Arg Phe Ile Pro Asp Pro Lys Ala Gly 130 135 140 Ile Met Ile Lys Ser Val Lys Arg Ala Tyr His Arg Leu Cys Leu His 145 150 155 160 Cys Ser Val Asp Gln Glu Gly Lys Ser Val Leu Ser Glu Lys Phe Ile 165 170 175 Leu Lys Val Arg Pro Ala Phe Lys Ala Val Pro Val Val Ser Val Ser 180 185 190 Lys Ala Ser Tyr Leu Leu Arg Glu Gly Glu Glu Phe Thr Val Thr Cys 195 200 205 Thr Ile Lys Asp Val Ser Ser Ser Val Tyr Ser Thr Trp Lys Arg Glu 210 215 220 Asn Ser Gln Thr Lys Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Ser Trp His His Gly 225 230 235 240 Asp Phe Asn Tyr Glu Arg Gln Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Ala Arg 245 250 255 Val Asn Asp Ser Gly Val Phe Met Cys Tyr Ala Asn Asn Thr Phe Gly 260 265 270 Ser Ala Asn Val Thr Thr Thr Leu Glu Val Val Asp Lys Gly Phe Ile 275 280 285 Asn Ile Phe Pro Met Ile Asn Thr Thr Val Phe Val Asn Asp Gly Glu 290 295 300 Asn Val Asp Leu Ile Val Glu Tyr Glu Ala Phe Pro Lys Pro Glu His 305 310 315 320 Gln Gln Trp Ile Tyr Met Asn Arg Thr Phe Thr Asp Lys Trp Glu Asp 325 330 335 Tyr Pro Lys Ser Glu Asn Glu Ser Asn Ile Arg Tyr Val Ser Glu Leu 340 345 350 His Leu Thr Arg Leu Lys Gly Thr Glu Gly Gly Thr Tyr Thr Phe Leu 355 360 365 Val Ser Asn Ser Asp Val Asn Ala Ala Ile Ala Phe Asn Val Tyr Val 370 375 380 Asn Thr Lys Pro Glu Ile Leu Thr Tyr Asp Arg Leu Val Asn Gly Met 385 390 395 400 Leu Gln Cys Val Ala Ala Gly Phe Pro Glu Pro Thr Ile Asp Trp Tyr 405 410 415 Phe Cys Pro Gly Thr Glu Gln Arg Cys Ser Ala Ser Val Leu Pro Val 420 425 430 Asp Val Gln Thr Leu Asn Ser Ser Gly Pro Pro Phe Gly Lys Leu Val 435 440 445 Val Gln Ser Ser Ile Asp Ser Ser Ala Phe Lys His Asn Gly Thr Val 450 455 460 Glu Cys Lys Ala Tyr Asn Asp Val Gly Lys Thr Ser Ala Tyr Phe Asn 465 470 475 480 Phe Ala Phe Lys Gly Asn Asn Lys Glu Gln Ile His Pro His Thr 485 490 495

Claims (13)

  1. 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하며, 여기서 HCVR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, CDRH1은 SYWIG (서열번호 1의 서열)이고, CDRH2는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열번호 2의 서열)이고, CDRH3은 HGRGYNGYEGAFDI (서열번호 3의 서열)이고, CDRL1은 RASQGISSALA (서열번호 4의 서열)이고, CDRL2는 DASSLES (서열번호 5의 서열)이고, CDRL3은 CQQFNSYPLT (서열번호 6의 서열)인, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 인간 c-Kit의 세포외 도메인 (ECD)에 특이적으로 결합하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, LCVR 아미노산 서열이 서열번호 13의 서열이고, HCVR 아미노산 서열이 서열번호 7의 서열인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기서 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 9의 서열이고, 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 15의 서열인 항체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하며, 여기서 각각의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 9의 서열이고, 각각의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 15의 서열인 항체.
  5. 제1항 또는 제2항의 항체의 항원-결합 단편.
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