KR101595151B1 - Multimer and conformational variant of albumin produced by NO - Google Patents
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Abstract
본 발명은 NO(일산화질소, nitric oxide)를 함유하는 알부민 다량체, NO를 포함하는 알부민 구조변형체, 알부민 단량체 또는 알부민 다량체를 함유하는 NO 전달체, 알부민 단량체 또는 알부민 다량체를 함유하는 산소 전달체, 상기 알부민 구조변형체 또는 알부민 다량체를 함유하는 약물전달체, 일산화질소를 첨가하는 단계를 포함하는 단백질 구조변형체(structural deformer) 또는 다량체(multimer)의 제조방법 및 (a) 단백질 단량체를 포함하는 시료에 일산화질소를 첨가하여 단백질 다량체를 포함하는 시료를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 다량체를 포함하는 시료에 염을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질로부터의 산소 방출을 조절하는 방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 일산화질소를 첨가하여 단백질 다량체화에 의해 산소를 포집하는 단계이며, 상기 (b) 단계는 염의 첨가에 의해 산소를 포함하는 단백질 다량체의 올리고머화 또는 단량체화에 의해 산소를 방출하는 단계인 것인 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an oxygen carrier containing an NO donor containing an albumin oligomer containing NO (nitrogen monoxide, nitric oxide), an albumin structural modification including NO, an albumin monomer or an albumin oligomer, an albumin monomer or an albumin oligomer, A method for producing a structural or deformable protein deformer or multimer comprising the step of adding nitrogen monoxide to a drug delivery system containing the albumin structural modification or albumin multimer, and (a) Adding nitrogen monoxide to produce a sample comprising a protein multimer; And (b) adding a salt to the sample comprising the protein multimer, wherein the step (a) is performed by adding protein to the protein by mass spectrometry Wherein the step (b) is a step of releasing oxygen by oligomerization or monomerization of an oxygen-containing protein multimer by addition of a salt.
Description
본 발명은 NO(일산화질소, nitric oxide)를 함유하는 알부민 다량체, NO를 포함하는 알부민 구조변형체, 알부민 단량체 또는 알부민 다량체를 함유하는 NO 전달체, 알부민 단량체 또는 알부민 다량체를 함유하는 산소 전달체, 상기 알부민 구조변형체 또는 알부민 다량체를 함유하는 약물전달체, 일산화질소를 첨가하는 단계를 포함하는 단백질 구조변형체(structural deformer) 또는 다량체(multimer)의 제조방법 및 (a) 단백질 단량체를 포함하는 시료에 일산화질소를 첨가하여 단백질 다량체를 포함하는 시료를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 다량체를 포함하는 시료에 염을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질로부터의 산소 방출을 조절하는 방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 일산화질소를 첨가하여 단백질 다량체화에 의해 산소를 포집하는 단계이며, 상기 (b) 단계는 염의 첨가에 의해 산소를 포함하는 단백질 다량체의 올리고머화 또는 단량체화에 의해 산소를 방출하는 단계인 것인 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to an oxygen carrier containing an NO donor containing an albumin oligomer containing NO (nitrogen monoxide, nitric oxide), an albumin structural modification including NO, an albumin monomer or an albumin oligomer, an albumin monomer or an albumin oligomer, A method for producing a structural or deformable protein deformer or multimer comprising the step of adding nitrogen monoxide to a drug delivery system containing the albumin structural modification or albumin multimer, and (a) Adding nitrogen monoxide to produce a sample comprising a protein multimer; And (b) adding a salt to the sample comprising the protein multimer, wherein the step (a) is performed by adding protein to the protein by mass spectrometry Wherein the step (b) is a step of releasing oxygen by oligomerization or monomerization of an oxygen-containing protein multimer by addition of a salt.
알부민은 혈액에 매우 많이 존재하는 단백질로, 간에서 생성된다. 구조적으로 인간 혈청 알부민(human serum albumin; HSA)은 585개의 아미노산(66,438 Da)으로 이루어져 있으며, 17개의 이황 가교(disulfide bridge)와 하나의 자유 시스테인(Cys34)으로 구성되어 있다[Dugiaczyk, A. et al., Proc . Natl Acad . Sci . USA, 1998, 79: 71-75]. 또한 알부민은 혈장부피의 유지 및 회복시키는 역할, 물, 칼슘, 나트륨, 칼륨 등의 양이온, 지방산, 호르몬, 빌리루빈(bilirubin), 약물 등 다양한 리간드와 결합하여 혈액의 콜로이드 삼투압을 조절, 전달하는 역할 및 영양 불량시 아미노산 공급원으로서의 역할을 한다[Bar-Or, D. et al ., Eur J. Biochem., 2001, 268: 42-47]. 특히 약물과 알부민의 결합은 약물의 약효 발현에 크게 관여한다. 한편, 순화한 HSA는 예를 들어 외과수술, 출혈성 쇼크 또는 화상 및 신증후군(nephrotic syndromes) 등 알부민 상실 및 알부민 합성 기능 장애에 의한 저알부민혈증의 치료에 사용된다. 알부민은 또한 보다 높은 진핵 세포의 성장에 사용되는 매체의 보충 및 치료용 단백질 배합에 있어서 의약품 첨가제로 사용된다. 혈청 알부민의 또 다른 알려진 기능은 헤모글로빈과 유사하게 산소 분압에 따라 산소와 흡착하고 탈착하여 산소 캐리어로서의 작용이다. 따라서 비상시에 헤모글로빈을 대신하여 투여될 수 있다. 그러나 알부민 단량체는 크기 및 분자량이 작아 혈액을 통한 이동이 빨라 원하는 부위에 머무름이 어렵고, 특히 혈관손상부위에 목적물질을 전달하고자 하는 경우에는 혈관 내에 머무르지 못하고 혈관손상부위를 통해 확산되어 나갈 수 있다는 단점이 있다.Albumin is a very abundant protein in the blood, produced in the liver. Structurally, human serum albumin (HSA) consists of 585 amino acids (66,438 Da), consisting of 17 disulfide bridges and one free cysteine (Cys34) [Dugiaczyk, A. et al ., Proc . Natl Acad . Sci . USA , 1998, 79: 71-75). In addition, albumin plays a role of maintaining and restoring plasma volume, the role of regulating and transporting blood colloid osmotic pressure by binding with various ligands such as water, calcium, sodium, potassium, cation, fatty acid, hormone, bilirubin, And serves as an amino acid source in malnutrition [Bar-Or, D. et al . , Eur J. Biochem ., 2001, 268: 42-47]. In particular, the binding of the drug to albumin is highly involved in the drug efficacy of the drug. On the other hand, purified HSA is used for the treatment of hypoalbuminemia due to, for example, surgical operation, hemorrhagic shock or burn and albumin synthesis dysfunction such as nephrotic syndromes. Albumin is also used as a pharmaceutical additive in supplementing and treating protein formulations for media used for higher eukaryotic cell growth. Another known function of serum albumin is similar to hemoglobin, which adsorbs and desorbs oxygen according to oxygen partial pressure and acts as an oxygen carrier. Therefore, it can be administered instead of hemoglobin in an emergency. However, since albumin monomers are small in size and molecular weight, it is difficult to stay in a desired site due to rapid movement through blood, and in particular, when a target substance is to be delivered to a vascular injury site, the albumin monomer can not stay in the blood vessel, There are disadvantages.
한편 NO는 체내에서 혈관확장과 신호전달기능을 하는 것으로 알려져 있다. 혈중 산소 농도가 떨어지면 혈관 벽의 내피세포는 NO를 생산한다. NO는 주변의 근육세포에 작용하여 근육을 이완시키는 효소를 활성화시켜 혈관을 확장시키는 효과가 있다. 혈관이 확장되면 혈류량이 증가하고 조직에 산소가 원활하게 공급될 수 있다. 이후 NO는 몇 초 지나지 않아 분해된다. Stamler 교수 등은 헌혈 후 저장해 놓은 혈액의 헤모글로빈이 NO 활성을 잃게 되면 산소전달능력이 저하되고 그 때 NO를 첨가하면 헤모글로빈과 결합한 NO 수준이 증가하여 산소전달능력이 향상된다는 것을 보고하였다[James, D. et al ., PNAS, 2007, 104(43): 17058-17062].
On the other hand, NO is known to function in vasodilation and signal transduction in the body. When blood oxygen levels fall, endothelial cells in the blood vessel wall produce NO. NO has the effect of expanding the blood vessels by activating the enzymes that relax the muscle by acting on the surrounding muscle cells. When blood vessels expand, blood flow increases and oxygen can be supplied smoothly to the tissue. The NO disappears after a few seconds. Stamler et al. Reported that hemoglobin stored in blood after blood donation lost its NO activity and decreased oxygen delivery capacity. When NO was added, the level of NO bound to hemoglobin was increased and oxygen delivery capacity was improved [James, D meat al . , PNAS , 2007, 104 (43): 17058-17062].
이에 본 발명자들은 인간혈청알부민 및 계란의 주요 단백질인 오브알부민에 의한 산소전달기전과 NO와의 관계를 예의 연구한 결과, NO에 의해 알부민의 구조가 변형되고 나아가 다량체를 형성하는 현상을 관찰하였으며, 상기 구조변형체 및 다량체가 산소를 포획하여 방출함을 확인하고 이에 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the inventors of the present invention have studied the relationship between the oxygen transport mechanism and NO by human serum albumin and egg albumin, which is the main protein of egg, and found that the structure of albumin was modified by NO to form a multimer, It was confirmed that the structural modification and the multimer capture and release oxygen, and thus the present invention has been completed.
본 발명의 하나의 목적은 NO(일산화질소, nitric oxide)를 함유하는 알부민 다량체를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an albumin oligomer containing NO (nitric oxide).
본 발명의 다른 목적은 NO를 포함하는 알부민 구조변형체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an albumin structural modification including NO.
본 발명의 또 다른 목적은 알부민 단량체 또는 알부민 다량체를 함유하는 NO 전달체를 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide an NO carrier containing an albumin monomer or an albumin oligomer.
본 발명의 또 다른 목적은 알부민 단량체 또는 알부민 다량체를 함유하는 산소 전달체를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide an oxygen carrier containing an albumin monomer or an albumin oligomer.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 알부민 구조변형체 또는 알부민 다량체를 함유하는 약물전달체를 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a drug carrier containing the above-mentioned albumin structural modification or albumin multimer.
본 발명의 또 다른 목적은 일산화질소를 첨가하는 단계를 포함하는 단백질 구조변형체(structural deformer) 또는 다량체(multimer)의 제조방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for producing a structural or deformable protein deformer comprising adding nitrogen monoxide.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 단백질 단량체를 포함하는 시료에 일산화질소를 첨가하여 단백질 다량체를 포함하는 시료를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 다량체를 포함하는 시료에 염을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질로부터의 산소 방출을 조절하는 방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 일산화질소를 첨가하여 단백질 다량체화에 의해 산소를 포집하는 단계이며, 상기 (b) 단계는 염의 첨가에 의해 산소를 포함하는 단백질 다량체의 올리고머화 또는 단량체화에 의해 산소를 방출하는 단계인 것인 방법을 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a method for producing a protein-protein complex, comprising: (a) preparing a sample containing a protein multimer by adding nitrogen monoxide to a sample containing a protein monomer; And (b) adding a salt to the sample comprising the protein multimer, wherein the step (a) is performed by adding protein to the protein by mass spectrometry Wherein the step (b) is a step of releasing oxygen by oligomerization or monomerization of an oxygen-containing protein oligomer by addition of a salt.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 NO(일산화질소, nitric oxide)를 함유하는 알부민 다량체를 제공한다.In one aspect to achieve the above object, the present invention provides an albumin oligomer containing NO (nitric oxide).
본 발명의 용어 "알부민"은 세포의 기본 물질을 구성하는 단백질의 하나로,혈액 중에 매우 많이 존재하며, 간에서 생성된다. 자연상태에 존재하는 단순 단백질 중 가장 분자량이 적다. 혈액 중의 혈청 알부민은 혈장부피를 유지하고 회복시키는 기능이 있어서 과다 출혈에 따른 쇼크를 방지하고 수술 및 화상치료 등에 사용된다. 또한 헤모글로빈과 유사한 산소전달 능력을 갖는 것으로 알려져 있다. 인간혈청알부민, 난백알부민, 소혈청알부민 등을 제한없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 인간혈청알부민 또는 난백알부민의 주성분인 오브알부민일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간혈청알부민일 수 있다.The term "albumin " of the present invention is one of the proteins constituting the basic substance of a cell, and exists in the blood very much and is produced in the liver. Among the simple proteins present in the natural state, the molecular weight is the smallest. Serum albumin in blood has a function of maintaining and restoring plasma volume, preventing shock due to excessive bleeding, and being used for surgery and burn treatment. It is also known to have oxygen transfer capability similar to hemoglobin. Human serum albumin, albumin albumin, bovine serum albumin and the like, but may preferably be human serum albumin or ovalbumin, which is a major component of egg white albumin, and more preferably human serum albumin.
본 발명의 용어 "알부민 다량체"는 2개 이상의 알부민 단량체로부터 형성되는 단백질 복합체를 의미하며, 바람직하게는 공유결합이 아닌 알부민 단량체 간의 상호작용에 의해 형성될 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 알부민 다량체는 이량체 또는 그 이상의 다량체를 제한없이 포함하나, 응집체는 포함하지 않으며, 바람직하게 백수십만개, 수십만개 또는 수만개의 알부민 단량체로 구성된 다량체일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 생성된 다량체의 형태를 TEM(transmission electron microscopy)으로 확인한 결과, NO 처리에 의해 생성된 알부민 다량체는 일반적인 단백질 응집체와는 달리 폭 50 내지 200 nm 및 길이 6 내지 10 μm의 섬유형태를 갖는 것을 확인하였다. 단일 알부민 단량체가 약 140×40×40 Å3의 크기를 갖는 것을 고려할 때, 상기 알부민 다량체는 적게는 수만 개 많게는 백수십만개의 알부민 다량체를 포함할 수 있음을 시사하는 것이다(실시예 5 및 도 7).The term "albumin multimer" of the present invention refers to a protein complex formed from two or more albumin monomers, preferably by interaction between albumin monomers that are not covalent bonds. For purposes of the present invention, the albumin multimer may include dimeric or higher multimers, but does not include aggregates, and may preferably be a multimer composed of hundreds of thousands, hundreds of thousands or tens of thousands of albumin monomers. According to a specific embodiment of the present invention, the morphology of the resulting multimer was confirmed by TEM (transmission electron microscopy). As a result, the albumin oligomer produced by the NO treatment had a width of 50 to 200 nm and a length of 6 To 10 [mu] m. Considering that the single albumin monomer has a size of about 140 x 40 x 40 Å 3 , it suggests that the albumin multimer may contain as many as tens of thousands and as many as a few hundreds of thousands of albumin oligomers (Examples 5 and 6) 7).
상기 알부민 다량체는 바람직하게 알부민 1분자 당 0.01 내지 4개, 보다 바람직하게는 0.1 내지 4개의 NO를 함유할 수 있다. 또한, 탄소수 18의 지방산을 추가로 포함할 수 있다. 상기 탄소수 18의 지방산에는 스테아르산(stearic acid; octadecanoic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 리놀렌산(linolenic acid)이 있으며, 바람직하게는 올레산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이외에도 천연알부민에 결합하는 것으로 알려진 탄소수 18의 지방산 이외의 지방산, 호르몬, DHA, EPA 등을 포함할 수 있다. 상기 NO를 포함하는 알부민 다량체를 형성하는 알부민은 인간혈청알부민, 난백알부민, 소혈청알부민 등을 제한없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 인간혈청알부민 또는 난백알부민의 주성분인 오브알부민일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간혈청알부민일 수 있다.
The albumin oligomer may preferably contain 0.01 to 4, more preferably 0.1 to 4 NO per molecule of albumin. Further, it may further include a fatty acid having 18 carbon atoms. The fatty acids having 18 carbon atoms include stearic acid, octadecanoic acid, oleic acid, linoleic acid and linolenic acid, preferably oleic acid, but are not limited thereto. In addition, fatty acids other than fatty acids having 18 carbon atoms known to bind to natural albumin, hormones, DHA, EPA, and the like may be included. The albumin forming the NO-containing albumin oligomer may include, but is not limited to, human serum albumin, albumin albumin, bovine serum albumin and the like, preferably human serum albumin or ovalbumin, which is a major component of albumin albumin, More preferably human serum albumin.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 NO를 포함하는 알부민 구조변형체를 제공한다.In another aspect, the present invention provides an albumin structural modification comprising NO.
본 발명의 용어 "알부민 구조변형체"는 천연형의 알부민으로부터 서열이나 분자량은 변하지 않고 3차원 입체구조만이 변화된 구조적 유도체를 의미한다. The term "albumin structural modification" of the present invention means a structural derivative in which only the three-dimensional structure is changed without changing the sequence or molecular weight from natural albumin.
상기 NO를 포함하는 알부민 구조변형체를 형성하는 알부민은 다량체와 동일하게 인간혈청알부민, 난백알부민, 소혈청알부민 등을 제한없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 인간혈청알부민 또는 난백알부민의 주성분인 오브알부민일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간혈청알부민일 수 있다.The albumin forming the modified albumin structure containing NO may include, without limitation, human serum albumin, albumin albumin, bovine serum albumin and the like as in the case of a multimer, but is preferably a human serum albumin or a major component of albumin albumin Albumin, more preferably human serum albumin.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, NO 처리로 유도된 알부민 단량체의 구조변형체는 알부민의 분자량 및 3차원 구조를 반영하는 천연-PAGE 젤에서는 천연형 알부민 단량체보다 빠르게 이동하여 낮은 분자량을 갖는 것처럼 보이지만, 3차원 구조는 배제하고 분자량에 의해서만 분리되는 SDS-PAGE에서는 동일한 분자량을 갖는 것으로 나타났다. 즉, NO에 의해 유도된 알부민 단량체의 구조변형체는 천연형의 알부민보다 젤 상에서 더 빠르게 이동할 수 있는 보다 컴팩트한 구조를 가지는 것으로 예상할 수 있다.According to a specific embodiment of the present invention, the structural modification of the albumin monomer induced by NO treatment seems to have a lower molecular weight in the natural-PAGE gel that reflects the molecular weight and the three-dimensional structure of albumin than the natural-type albumin monomer, The three-dimensional structure was excluded and showed the same molecular weight in SDS-PAGE separated only by molecular weight. That is, the structural modification of the NO-induced albumin monomer can be expected to have a more compact structure that can move faster on the gel than the natural albumin.
상기 알부민 다량체에 상술한 바와 같이 알부민 구조변형체 또한 알부민 1분자 당 0.01 내지 4개 보다 바람직하게는 0.1 내지 4개의 NO를 함유할 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 과량의 NO를 처리하였을 경우 구조변형체나 다량체가 아닌 응집체를 형성하는 결과를 나타내었다(실시예 3).
As described above, the albumin structural modification may also contain 0.01 to 4, more preferably 0.1 to 4, NO per molecule of albumin. According to the embodiment of the present invention, when an excessive amount of NO is treated, it results in the formation of agglomerates instead of structural modifiers or multimers (Example 3).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 알부민 단량체 또는 알부민 다량체를 함유하는 NO 전달체를 제공한다.In another aspect, the present invention provides an NO carrier containing an albumin monomer or an albumin oligomer.
NO(일산화질소; nitric acid)는 체내에서 혈관확장과 신호전달기능을 갖는 것으로 알려진 물질이다. 특히 혈중 산소 농도가 감소하거나 혈관 손상시 혈관 벽의 내피세포에서 생성되며 주변의 근육세포에 작용하여 근육을 이완시키는 효소를 활성화시킴으로 혈관을 확장시키는 효과를 갖는다. 상기 혈관 벽에서 생성된 NO는 기능을 수행한 후 수 초 내에 분해된다.NO (nitric acid) is a substance known to have vasodilation and signal transduction in the body. In particular, it has the effect of expanding the blood vessels by decreasing oxygen concentration in the blood or forming endothelial cells of the blood vessel wall during vascular injury and activating the enzyme that relaxes muscles by acting on the surrounding muscle cells. NO generated in the blood vessel wall decomposes within seconds after performing the function.
본 발명의 "NO 전달체"는 NO와 결합하여 특정 위치에서 NO를 방출할 수 있는 물질을 의미한다. 바람직하게는 혈류를 타고 이동하여 필요한 위치에서 NO를 방출할 수 있는 물질이다. 따라서 NO 결합체는 첫째로 NO와 가역적으로 결합하여 필요한 위치에서 방출할 수 있고, 둘째로는 혈류를 통해 이동할 수 있으며, 마지막으로 원하는 위치에 선택적으로 타겟팅 할 수 있는 물질인 것이 바람직하다. 알부민은 헤모글로빈과 유사하게 산소분압이 높은 곳에서 산소와 결합하여 혈관을 따라 이동하여 산소분압이 낮은 곳에서 산소를 방출하는 능력을 가진다는 것이 알려져 있다. 또한 본 발명에서는 NO로 유도된 알부민 구조변형체 및 다량체가 천연형 알부민 단량체의 기능은 유지하면서 NO와 비공유결합적 상호작용으로 결합되어있어 가역적인 구조변형에 의해 NO를 재방출할 수 있음을 확인하였다. 따라서 상기 NO를 포함하는 알부민 구조변형체 및 다량체 또는 천연형 알부민은 NO 전달체로 작용할 수 있다. 추가적으로 상기 NO 전달체에 표적세포 특이적으로 결합하는 리간드를 수식하여 조직 선택적 이동능력을 향상시킬 수 있다.
"NO carrier" of the present invention means a substance capable of releasing NO at a specific position in combination with NO. It is preferably a material that can move along the blood stream and release NO at the required location. Therefore, it is preferable that the NO conjugate is reversibly bound to NO first and released at a necessary position, secondly, it can move through the bloodstream, and finally, it can be selectively targeted to a desired position. It is known that albumin, like hemoglobin, binds oxygen at high oxygen partial pressures and moves along the blood vessels to have the ability to release oxygen at low oxygen partial pressures. In the present invention, it was also confirmed that the structural modification and the multimer of the albumin structure induced by NO were linked to NO by non-covalent interaction while maintaining the functions of the natural albumin monomer, thereby releasing NO by reversible structural modification . Thus, the albumin structural modification including the NO and multimer or natural type albumin can act as an NO carrier. In addition, a ligand that binds specifically to a target cell can be modified to enhance the tissue selective migration capability of the NO carrier.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 알부민 단량체 또는 알부민 다량체를 함유하는 산소 전달체를 제공한다.In another aspect, the present invention provides an oxygen carrier containing an albumin monomer or an albumin oligomer.
상기 본 발명의 알부민 단량체 또는 알부민 다량체가 산소 전달체로 작용하는 원리는 상기 NO 전달체와 동일하다. 상기 NO 전달체와 산소 전달체로 작용할 수 있는 알부민 단량체는 천연형의 단량체까지 포함한다.The principle that the albumin monomer or albumin oligomer of the present invention acts as an oxygen carrier is the same as the NO carrier. The albumin monomer capable of acting as an NO donor and an oxygen carrier includes natural type monomers.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, NO를 처리하여 제조한 알부민 다량체는 추가적인 NO 기체 주입시 또는 고농도의 염용액 처리시 산소기체를 방출하는 것을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 알부민 다량체가 산소기체를 함유하고 있음을 시사하는 것으로, NO 기체 주입시에는 NO 기체에 의한 치환에 의해, 고농도의 염용액 처리시에는 다량체가 저분자화하면서 함유하고 있던 산소기체를 방출함을 확인하였다(실시예 4 및 6). 다시 말하면, 본 발명에 따른 알부민 다량체는 산소기체를 치환할 수 있는 다른 기체가 제공되거나 주위의 염농도에 따라서 산소기체를 방출할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 알부민 다량체가 환경에 따라 함유하고 있는 산소기체를 방출할 수 있는 산소전달체로 작용할 수 있음을 시사한다.
According to a specific embodiment of the present invention, it was confirmed that the albumin multimer prepared by treating NO emits oxygen gas when the NO gas is injected or when the salt solution is treated at a high concentration. This suggests that the albumin multimer according to the present invention contains oxygen gas. When the NO gas is injected, by the substitution with the NO gas, the oxygen gas contained in the high molecular weight salt solution, (Examples 4 and 6). In other words, the albumin multimer according to the present invention may be provided with other gases capable of displacing oxygen gas or may release oxygen gas according to the surrounding salt concentration. This suggests that the albumin multimer according to the present invention can act as an oxygen carrier capable of releasing oxygen gas contained according to the environment.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 알부민 구조변형체 또는 알부민 다량체를 함유하는 약물전달체를 제공한다.As another embodiment, the present invention provides An albumin structural modification or an albumin oligomer.
알부민의 공지된 또 다른 기능은 약물전달체로서의 기능이다. 상기 언급된 바와 같이 본 발명의 알부민 구조변형체 및 알부민 다량체는 알부민과 동일한 생체내 기능을 가지면서 선택적 이동능력이 향상된 단백질 복합체이다. 따라서, 상기 알부민 구조변형체 및 알부민 다량체는 약물전달체로 사용될 수 있다. 또한 표적세포에 특이적으로 결합하는 리간드를 추가적으로 수식하여 조직 선택적 이동성을 높일 수 있다.
Another known function of albumin is its function as a drug delivery vehicle. As mentioned above, the albumin structural modifications and albumin oligomers of the present invention are protein complexes having the same in vivo functions as albumin and having an improved selective migration ability. Thus, the albumin structural modifications and albumin oligomers may be used as drug delivery vehicles. In addition, a ligand that specifically binds to a target cell can be further modified to increase tissue selective mobility.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 단백질 단량체를 포함하는 시료에 일산화질소를 첨가하는 단계를 포함하는 단백질 다량체(multimer) 또는 구조변형체(structural deformer)의 제조방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for producing a protein multimer or a structural deformer comprising the step of adding nitrogen monoxide to a sample containing a protein monomer.
바람직하게 상기 일산화질소는 최종농도가 1 μM 내지 600 μM이 되도록 첨가하여 제조할 수 있다. 보다 바람직하게 최종농도가 1 μM 내지 40 μM, 보다 더 바람직하게는 1 μM 내지 20 μM이 되도록 처리할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니며, NO를 고농도로 처리하였을 때 단백질이 응집체를 형성할 수 있으며, 이때 NO의 농도는 단백질의 종류에 따라 다름을 고려하여 다량체가 형성되는 것이 확인되는 한 낮은 농도로 처리하는 것이 바람직하다.Preferably, the nitric oxide can be prepared by adding to a final concentration of 1 [mu] M to 600 [mu] M. More preferably, the final concentration can be adjusted to be 1 [mu] M to 40 [mu] M, more preferably 1 [mu] M to 20 [mu] M. However, the present invention is not limited thereto. When NO is treated at a high concentration, the protein may form an aggregate. In this case, the concentration of NO depends on the kind of the protein, .
상기 일산화질소의 첨가는 완충액에 불활성 가스를 주입하여 산소를 제거한 후 NO 가스를 주입하여 제조한 NO 용액을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게 상기 완충액은 PBS(phosphate buffered saline)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 불활성 가스는 아르곤 또는 헬륨 가스일 수 있으며, 바람직하게는 아르곤 가스일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 알부민에 NO를 처리하기 위하여 NO 용액을 제조하여 사용하였으며, 상기 NO 용액은 완충액에 불활성 가스를 주입하여 산소를 제거한 후 NO 가스를 주입하여 NO 원액으로 제조하고 원하는 농도로 희석하여 사용하였다.The addition of the nitrogen monoxide can be achieved by adding an NO solution prepared by injecting an inert gas into the buffer solution to remove oxygen and injecting NO gas. Preferably, the buffer solution may be PBS (phosphate buffered saline), but is not limited thereto. The inert gas may be argon or helium gas, and preferably argon gas. According to a specific embodiment of the present invention, an NO solution is prepared and used for treating NO with albumin. The NO solution is prepared by injecting an inert gas into the buffer solution to remove oxygen, injecting NO gas, Concentration.
바람직하게는 상기 완충액으로는 0.1 M PBS를, 불활성 가스로는 아르곤 가스를 사용할 수 있다. 아르곤 가스 및 NO 가스는 용액에 직접 버블링하여 주입할 수 있고, NO 주입시간은 30분으로 하여 1.9 mM 농도의 NO 원액을 제조할 수 있다. 알부민 구조변형체 및 다량체를 제조하기 위하여 상기 NO 용액을 알부민 용액에 제시된 농도대로 혼합하였다. 상기한 방법으로 제조한 NO 용액을 1200 μM과 1400 μM 이상의 농도로 동일한 부피의 오브알부민과 인간혈청알부민에 처리하였을 때, 즉 최종혼합물에서 NO의 농도가 600 μM과 700 μM이 되도록 처리하였을 때, 상기 단백질들의 응집이 관찰됨을 확인하였다. 응집이 아닌 다량체를 형성하기에 바람직한 NO의 농도는 오브알부민과 인간혈청알부민에 대해 각각 300 μM과 1200 μM이나 다량체를 형성하되 응집체를 형성하지 않는 한 이에 제한되지 않는다(실시예 3).Preferably, 0.1 M PBS is used as the buffer solution, and argon gas is used as the inert gas. The argon gas and the NO gas can be injected directly into the solution and the NO injection time can be 30 minutes to prepare a 1.9 mM concentration of the NO liquid. To prepare albumin structural modifications and oligomers, the NO solution was mixed with the albumin solution at the concentrations indicated. When the NO solution prepared above was treated with the same volume of ovalbumin and human serum albumin at concentrations of 1200 μM and 1400 μM or more, that is, when the final concentration of NO was 600 μM and 700 μM, It was confirmed that aggregation of the proteins was observed. The preferred concentration of NO to form non-aggregated multimers is not limited to 300 μM and 1200 μM for ovalbumin and human serum albumin, respectively, except that aggregates are formed (Example 3).
한편, 상기 NO를 처리하여 제조한 단백질 다량체는 염화나트륨 첨가에 의해 올리고머화 또는 단량체화될 수 있다.On the other hand, the protein oligomer prepared by treating NO can be oligomerized or monomers by adding sodium chloride.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, TEM으로 얻은 분자수준의 이미지로부터, NO 처리에 의해 형성된 섬유모양의 알부민 다량체가 500 mM의 NaCl로 처리하였을 때 저분자량의 올리고머 또는 단량체로 분해되는 것을 확인하였다(도 7).According to a specific embodiment of the present invention, it was confirmed from the molecular-level images obtained by TEM that the fibrous albumin oligomer formed by the NO treatment was decomposed into low molecular weight oligomers or monomers when treated with 500 mM of NaCl ( 7).
또한, 본 발명에 따른 단백질은 탄소수 18의 지방산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함할 수 있다. 자연상태의 혈액 중에는 탄소수 18의 지방산이 존재하며, 상기 지방산은 인간혈청알부민 등의 혈액단백질과 결합하고 있ㄴ는 것으로 알려져 있다. 이외에도 천연알부민에 결합하는 것으로 알려진 탄소수 18의 지방산 이외의 지방산, 호르몬, DHA, EPA 등을 포함할 수 있다.In addition, the protein according to the present invention may further comprise a fatty acid having 18 carbon atoms or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It is known that there is a fatty acid of carbon number 18 in the natural blood and that the fatty acid binds to blood proteins such as human serum albumin. In addition, fatty acids other than fatty acids having 18 carbon atoms known to bind to natural albumin, hormones, DHA, EPA, and the like may be included.
상기 단백질의 비제한적인 예는 알부민(albumins), 글로불린(globulins), 피브리노겐(fibrinogen), 조절단백질(regulatory proteins) 또는 응고인자(clotting factors) 등의 혈액단백질(blood proteins)일 수 있다. 보다 바람직하게 상기 단백질은 오브알부민 또는 인간혈청알부민일 수 있다.
Non-limiting examples of such proteins may be blood proteins such as albumin, globulins, fibrinogen, regulatory proteins or clotting factors. More preferably, the protein may be ovalbumin or human serum albumin.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 단백질 단량체를 포함하는 시료에 일산화질소를 첨가하여 단백질 다량체를 포함하는 시료를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 다량체를 포함하는 시료에 염을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질로부터의 산소 방출을 조절하는 방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 일산화질소를 첨가하여 단백질 다량체화에 의해 산소를 포집하는 단계이며, 상기 (b) 단계는 염의 첨가에 의해 산소를 포함하는 단백질 다량체의 올리고머화 또는 단량체화에 의해 산소를 방출하는 단계인 것인 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a protein, comprising: (a) preparing a sample containing a protein multimer by adding nitrogen monoxide to a sample containing a protein monomer; And (b) adding a salt to the sample comprising the protein multimer, wherein the step (a) is performed by adding protein to the protein by mass spectrometry Wherein the step (b) is a step of releasing oxygen by oligomerization or monomerization of an oxygen-containing protein oligomer by addition of a salt.
상기 단백질의 비제한적인 예는 알부민(albumins), 글로불린(globulins), 피브리노겐(fibrinogen), 조절단백질(regulatory proteins) 또는 응고인자(clotting factors) 등의 혈액단백질(blood proteins)일 수 있다. 보다 바람직하게 상기 단백질은 오브알부민 또는 인간혈청알부민일 수 있다.Non-limiting examples of such proteins may be blood proteins such as albumin, globulins, fibrinogen, regulatory proteins or clotting factors. More preferably, the protein may be ovalbumin or human serum albumin.
상기 염의 비제한적인 예는 염화나트륨, 염화마그네슘, 염화암모늄, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 질산나트륨, 황산마그네슘 등일 수 있다. 바람직하게 상기 염은 염화나트륨일 수 있다.Non-limiting examples of such salts include sodium chloride, magnesium chloride, ammonium chloride, potassium chloride, sodium acetate, sodium carbonate, sodium nitrate, magnesium sulfate, and the like. Preferably, the salt may be sodium chloride.
본 발명에 따른 구체적인 실시예에 의하면, PBS 또는 알부민 단량체 용액에 NaCl을 첨가하여 용액의 이온세기가 증가할 경우 용액 중의 산소포화도가 감소하여 이온세기 증가에 따라 산소분압이 감소하는 것으로 나타났으나, 본 발명에 따른 알부민 다량체 용액의 경우 상기한 바와 같이 용액자체의 산소포화도는 이온세기에 비례하여 감소함에도 불구하고 용액 내의 산소분압이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 알부민 다량체가 산소분자를 함유하고 있다가, 이온세기가 증가함에 따라 저분자화 되면서 이들 산소분자를 방출하여 발생하는 현상으로 해석될 수 있다. 또한 알부민 다량체를 제조하기 위한 일산화질소의 처리농도 및 알부민 다량체의 저분자화를 위한 NaCl 농도에 대해 각기 다른 산소분압 변화 양상을 보이는 것을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 단백질로부터의 산소 방출을 조절하는 방법은 단백질 다량체화를 위해 첨가하는 일산화질소의 농도 및/또는 제조된 단백질 다량체의 저분자량화를 위해 첨가되는 염화나트륨의 농도에 의해 달성될 수 있다.
According to the specific example of the present invention, when the ionic strength of the solution is increased by adding NaCl to the PBS or albumin monomer solution, the oxygen saturation in the solution decreases, and the oxygen partial pressure decreases with the increase of the ionic strength. As described above, in the case of the albumin multimer solution according to the present invention, the oxygen saturation of the solution itself was decreased in proportion to the ionic strength, but the oxygen partial pressure in the solution was increased. This can be interpreted as a phenomenon in which the albumin macromolecule contains oxygen molecules and is released by releasing these oxygen molecules as the ionic strength increases. In addition, it was confirmed that the treatment of the nitrogen monoxide for producing the albumin oligomer and the NaCl concentration for the low molecular weight of the albumin oligomer showed different oxygen partial pressure changes, so that the oxygen release from the protein according to the present invention was controlled The method can be accomplished by the concentration of nitric oxide added for protein mass multiplication and / or the concentration of sodium chloride added for the lower molecular weight of the prepared protein multimer.
혈장 및 계란의 주요 단백질인 알부민에 NO(일산화질소, nitric oxide)를 처리하여 제조된 알부민 단량체 구조변형체 또는 알부민 다량체는 산소전달체 및 약물전달체로서 기존의 알부민의 기능은 유지하면서 혈액 중 이동속도는 낮아지고 선택성은 높아져서 보다 개선된 전달체로 작용할 수 있으며, 목적세포에 특이적인 리간드를 추가로 표지하여 선택성이 보다 더 향상된 전달체로 이용할 수 있다.
The albumin monomer modification or albumin oligomer prepared by treating NO (nitric oxide) with albumin, which is a main protein of plasma and egg, is an oxygen carrier and a drug delivery system, and maintains the function of existing albumin, The selectivity can be lowered and can act as a more improved transporter, and a ligand specific to the target cell can be additionally labeled so that the transporter can be used as a further improved selectivity.
도 1은 NO에 의한 20% 오브알부민의 구조적 변화를 나타낸 도이다. 20% 오브알부민 용액을 제조하였고, NO 용액과 혼합하여 밤새도록 반응시켰다. 오브알부민은 8% Bis-Tris 젤로 분리하였다. (a)는 CBB로 염색한 오브알부민을 천연(native)-PAGE로 (b)는 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 레인 1; 분자량 마커, 레인 2; 오브알부민 대조군, 레인 3; 1 μM NO 용액으로 처리한 오브알부민, 레인 4; 10 μM NO 용액으로 처리한 오브알부민, 레인 5; 100 μM NO 용액으로 처리한 오브알부민, 레인 6; 300 μM NO 용액으로 처리한 오브알부민.
도 2는 인간혈청알부민의 다량체화에 대한 NO의 영향을 나타낸 도이다. SK 케미칼의 20% 알부민 용액을 NO 용액과 혼합하여 밤새도록 반응시켰다. 단백질은 8% Bis-Tris 젤로 분리하였다. (a) 및 (b)는 CBB(coomassie brilliant blue)로 염색한 결과이고, (c) 및 (d)는 니트로셀룰로스 막에 이동시켜 항-인간혈청알부민을 처리한 후 이차 HRP 결합 항체를 처리하여 웨스턴 블롯으로 검출한 결과이다. (a) 및 (c)는 천연(native)-PAGE로 (b) 및 (d)는 SDS-PAGE로 인간혈청알부민 단백질을 분석한 결과이다. 레인 1; 분자량 마커, 레인 2; 인간혈청알부민 대조군, 레인 3; 300 μM NO 용액으로 처리한 인간혈청알부민, 레인 4; 600 μM NO 용액으로 처리한 인간혈청알부민, 레인 5; 1200 μM NO 용액으로 처리한 인간혈청알부민.
도 3은 인간혈청알부민의 단량체에 대한 NO의 영향을 나타낸 도이다. SK 케미칼의 20% 알부민 용액을 NO 용액과 혼합하여 밤새도록 반응시켰다. 단백질은 8% Bis-Tris 젤로 분리하였다. (a)는 천연-PAGE로, (b)는 SDS-PAGE로 인간혈청알부민을 분석하여 CBB로 염색한 결과이다. 레인 1; 분자량 마커, 레인 2; 인간혈청알부민, 10 μg, 대조군, 레인 3; 600 μM NO 용액으로 처리한 인간혈청알부민, 10 μg, 레인 5; 인간혈청알부민, 1 μg, 대조군, 레인 6; 600 μM NO 용액으로 처리한 인간혈청알부민, 1 μg.
도 4는 NO/O2 듀얼 마이크로센서 구조를 나타낸 도이다. 듀얼 마이크로센서에서 NO 및 O2 기체는 PTFE 기체 투과성 막 통과 후 WE1 및 WE2의 표면에서 전류측정에 의해 검출하였다.
도 5는 5% 오브알부민에서 산소측정 결과를 나타낸 도이다. 5% 오브알부민 용액은 0.1 mol/L PBS로 제조하였고, 동일한 부피의 PBS 및 600 μM NO 용액과 혼합하여 밤새도록 반응시켰다. 듀얼 센서에서 NO 및 O2 기체는 PTFE 기체 투과성 막 통과 후 WE1 및 WE2의 표면에서 전류측정에 의해 검출하였다. (a)는 오브알부민 용액 대조군, (b)는 NO 처리 오브알부민 용액에 대한 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 인간혈청알부민에서 산소측정 결과를 나타낸 도이다. 시료는 PBS 완충액에 녹이고 동일한 부피의 600 μM NO 용액과 혼합하여 밤새도록 반응시켰다. 듀얼 센서에서 NO 및 O2 기체는 PTFE 기체 투과성 막 통과 후 WE1 및 WE2의 표면에서 전류측정에 의해 검출하였다. (a)는 인간혈청알부민 대조군, (b)는 NO 처리 인간혈청알부민에 대한 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 NO 처리에 의해 생성된 다량체화된 상태 및 고농도의 NaCl 처리에 의해 단량체화된 상태의 인간혈청알부민을 나타내는 TEM 사진이다. 1 내지 37.5 μM NO 용액으로 처리하여 알부민의 다량체화를 유도할 수 있으며, 상기 알부민 다량체는 500 mM NaCl로 처리시 단량체로 완전히 분해될 수 있음을 나타낸다.
도 8은 대조군의 염처리에 따른 용액의 산소분압 변화를 나타낸 도이다. (a)는 음성대조군으로써 NO를 처리하지 않은 PBS에 NaCl을 가하면서 용액의 산소분압을 측정한 결과이다. (b)는 NO를 처리하지 않은 1 중량%로 희석한 알부민 주사제 즉, 혈장유래 알부민 용액의 NaCl 처리에 따른 산소분압 변화를 나타낸 도이다.
도 9는 NO를 처리한 인간혈청알부민 용액의 염처리에 따른 산소분압 변화를 나타낸 도이다. 1 중량%로 희석한 알부민 주사제 즉, 혈장유래 알부민 용액을 (a) 18.5 μM 및 (b) 37.5 μM 농도의 NO 용액으로 처리한 후 NaCl을 가하여 염농도를 높이면서 용액의 산소분압을 측정한 결과이다.
도 10은 NO를 처리한 재조합인간혈청알부민 용액의 염처리에 따른 산소분압 변화를 나타낸 도이다. 1 중량% 재조합인간혈청알부민 용액을 (a) 18.5 μM 및 (b) 37.5 μM 농도의 NO 용액으로 처리한 후 NaCl을 가하여 염농도를 높이면서 용액의 산소분압을 측정한 결과이다.Fig. 1 shows the structural change of 20% ovalbumin by NO. Fig. 20% ovalbumin solution was prepared and mixed with NO solution and reacted overnight. The ovalbumin was separated into 8% Bis-Tris gel. (a) is the result of analysis of CBB-stained ovalbumin by native-PAGE and (b) by SDS-PAGE.
Figure 2 shows the effect of NO on the mass multiplication of human serum albumin. A 20% albumin solution of SK Chemicals was mixed with the NO solution and allowed to react overnight. The protein was separated into 8% Bis-Tris gel. (a) and (b) show the result of staining with CBB (coomassie brilliant blue), (c) and (d) show the results of treatment with anti-human serum albumin after transferring to a nitrocellulose membrane, Western blot. (a) and (c) are the native-PAGE, and (b) and (d) are the results of analysis of human serum albumin protein by SDS-PAGE.
Fig. 3 shows the effect of NO on monomers of human serum albumin. Fig. A 20% albumin solution of SK Chemicals was mixed with the NO solution and allowed to react overnight. The protein was separated into 8% Bis-Tris gel. (a) is a natural-PAGE, and (b) is a result of analyzing human serum albumin by SDS-PAGE and staining with CBB.
4 shows a NO / O 2 dual microsensor structure. In a dual microsensor NO and O 2 gas was detected by the current measured at the surface WE1 and WE2 after passing through the gas-permeable PTFE membrane.
FIG. 5 is a graph showing an oxygen measurement result in 5% of albumin. FIG. The 5% ovalbumin solution was prepared with 0.1 mol / L PBS and mixed with the same volume of PBS and 600 μM NO solution overnight. In a dual sensor NO and O 2 gas was detected by the current measured at the surface WE1 and WE2 after passing through the gas-permeable PTFE membrane. (a) is a control group of the ovalbumin solution, and (b) is a graph showing the measurement results of the NO-treated ovalbumin solution.
6 is a graph showing the results of oxygen measurement in human serum albumin. Samples were dissolved in PBS buffer and mixed overnight with an equal volume of 600 μM NO solution. In a dual sensor NO and O 2 gas was detected by the current measured at the surface WE1 and WE2 after passing through the gas-permeable PTFE membrane. (a) is a human serum albumin control group, and (b) is a graph showing measurement results of NO-treated human serum albumin.
FIG. 7 is a TEM photograph showing human serum albumin in a state of being mass-produced by the NO treatment and in a monomerized state by high-concentration NaCl treatment. 1 to 37.5 [mu] M NO solution to induce the mass multiplication of albumin, indicating that the albumin oligomer can be completely degraded into monomers upon treatment with 500 mM NaCl.
8 is a graph showing the change in oxygen partial pressure of the solution according to the salt treatment of the control group. (a) is the result of measuring the oxygen partial pressure of the solution while adding NaCl to the PBS not treated with NO as the negative control group. (b) is a diagram showing the change in oxygen partial pressure according to the NaCl treatment of the albumin injected solution diluted to 1 wt%, that is, the plasma-derived albumin solution without the NO treatment.
9 is a graph showing the change in oxygen partial pressure according to a salt treatment of a human serum albumin solution treated with NO. (A) 18.5 μM and (b) 37.5 μM NO solution diluted to 1% by weight, ie plasma-derived albumin solution, and then the NaCl concentration was increased to increase the salt concentration .
10 is a graph showing changes in oxygen partial pressure according to a salt treatment of a NO-treated recombinant human serum albumin solution. (A) 18.5 μM and (b) 37.5 μM NO solution after 1% by weight of recombinant human serum albumin solution, and then increasing the salt concentration by adding NaCl to measure the oxygen partial pressure of the solution.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1: 시약 및 재료 1: Reagents and materials
오브알부민(ovalbumin)은 시그마로부터, 오브알부민 항체는 Santa Cruz biotechnology로부터 구입하였다. 인간혈청알부민(human serum albumin; HSA) 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA)로부터, Coomassie Brilliant Blue R250은 Amresco로부터, 의약품 등급의 인간혈청알부민은 SK 케미칼로부터 구입하여 사용하였다.
The ovalbumin was purchased from Sigma, and the albumin antibody was purchased from Santa Cruz biotechnology. Human serum albumin (HSA) antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, MA), Coomassie Brilliant Blue R250 from Amresco, and drug grade human serum albumin from SK Chemicals.
실시예Example 2: 2: NONO (일산화질소, (Nitrogen monoxide, nitricnitric oxideoxide ) 원액 용액의 준비) Preparation of stock solution
NO 원액 용액(stock solution)은 0.1 M PBS에 아르곤 가스를 주입하여 산소를 제거한 후 NO 가스를 30분간 버블링시켰다. 상기 방법으로 제조된 NO 원액 용액의 농도는 1.9 mM이며(Ahmmed et al. 2001; Friedemann et al. 1996), NO 원액 용액은 사용할 때마다 새로 준비하였다.
The NO stock solution was purged with argon gas in 0.1 M PBS and bubbled with NO gas for 30 minutes. The concentration of the NO stock solution prepared by the above method was 1.9 mM (Ahmmed et al . 2001; Friedemann et al . 1996), the NO stock solution was prepared fresh each time it was used.
실시예Example 3: 1D 3: 1D 폴리아크릴아미드Polyacrylamide 젤 전기영동(1- Gel electrophoresis (1- dimemsionaldimemsional polyacrylamide폴리acrylamide gel come electrophoresis전공기 ; 1D-; 1D- PAGEPAGE ))
NO에 의한 단백질의 구조변화를 확인하기 위하여 1D-PAGE를 이용하였다. 구체적으로 본 발명에서는 SDS(sodium dodecylsulfate)-PAGE 및 천연(native)-PAGE를 이용하였다. SDS-PAGE는 아미노산 측쇄끼리의 결합(이황결합 등)을 절단하여 단일사슬 형태로 만든 후 음이온성 계면활성제인 SDS를 처리하여 단백질의 전하를 균일하게 한 후 전압을 걸어 전하차에 의해 단백질을 분리하는 것이다. 반면, 천연-PAGE는 아미노산 측쇄의 결합을 유지하며, SDS도 처리하지 않으므로 단백질 고유의 상태를 볼 수 확인할 수 있다. 시그마로부터 구입한 오브알부민은 0.1 M PBS에 녹여 준비하였다. 동일한 양의 단백질을 SDS 또는 천연 시료 완충액과 섞었고, SDS 시료는 97℃에서 3 내지 5분간 가열하였다. 이후 8% Bis-Tis 젤을 이용하여 80 내지 120 V에서 전기영동하였다. 상기 전기영동한 1D-PAGE 젤은 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue; CBB) 염색, 웨스턴 블롯 및 당단백질 염색을 각각 수행하여 확인하였다. 구체적인 실험방법은 하기와 같다.
1D-PAGE was used to confirm structural changes of proteins due to NO. Specifically, SDS (sodium dodecylsulfate) -PAGE and native-PAGE were used in the present invention. SDS-PAGE was performed by cutting the bonds between amino acid side chains (disulfide bonds, etc.) into a single-chain form, treating SDS as an anionic surfactant to uniformize the charge of the protein, . On the other hand, the natural-PAGE maintains the binding of the amino acid side chains, and since the SDS is not also processed, the native state of the protein can be confirmed. The ovalbumin purchased from Sigma was dissolved in 0.1 M PBS and prepared. The same amount of protein was mixed with SDS or natural sample buffer, and the SDS sample was heated at 97 ° C for 3 to 5 minutes. Then, electrophoresis was performed at 80 to 120 V using 8% Bis-Tis gel. The electrophoretic 1D-PAGE gel was confirmed by performing coomassie brilliant blue (CBB) staining, Western blotting and glycoprotein staining, respectively. Specific experimental methods are as follows.
첫째, CBB 염색은 Coomassie Brilliant Blue R-250 시약을 이용하는 염색방법으로 50 ng 이상의 단백질을 검출할 수 있다. Coomassie Brilliant Blue R-250 시약이 단백질의 아르기닌(arginine; Arg), 라이신(lysine; Lys) 또는 방향족 고리를 갖는 아미노산 잔기인 타이로신(tyrosine; Tyr), 트립토판(tryptophan; Try), 페닐알라닌(phenylalanine; Phe) 등과 결합하여 붉은 색이 푸르게 변하는 성질을 이용한다. 쿠마시는 6개의 페닐그룹과 2개의 황산기를 통해서 단백질과 소수성 상호작용 및 반데르발스 상호작용(van der Waals interaction)을 통해 결합한다. 이를 위하여 1D-PAGE 후 젤을 쿠마시 블루 R-250으로 30분간 염색하였다. 증류수로 세척한 후 메탄올과 아세트산이 섞인 탈염색 용액에서 바탕이 제거될 때까지 탈염색시켰다. 그 다음, LAS-3000(FUJIFILM)을 이용하여 염색된 단백질을 확인하였다.
First, CBB staining can detect more than 50 ng protein by staining method using Coomassie Brilliant Blue R-250 reagent. The Coomassie Brilliant Blue R-250 reagent is an enzyme that binds to the amino acid residues tyrosine (Tyr), tryptophan (Try), phenylalanine (Phe), and the amino acid residues of arginine (Arg), lysine ) And the like, and the red color changes in a blue color. Coumarin binds through proteins with hydrophobic and van der Waals interactions through six phenyl groups and two sulfate groups. After the 1D-PAGE, the gel was stained with Coomassie blue R-250 for 30 minutes. After washing with distilled water, de-staining was performed in a de-staining solution containing methanol and acetic acid until the substrate was removed. Then, the stained protein was identified using LAS-3000 (FUJIFILM).
두번째, 웨스턴 블롯은 여러 단백질을 전기영동으로 분리하고 분리된 단백질 밴드를 니트로셀룰로스 또는 나일론 막에 옮긴 후 단백질이 옮겨진 막에서 항원-항체 반응을 이용하여 특정 항체에 대한 항원을 찾아내는 방법이다. 이를 위하여 1D-PAGE 후 젤을 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 이동이 끝나면 선홍색(ponceau) 염색으로 제대로 이동되었는지 확인하였고, 세척 완충액으로 씻은 후 5% 무지방 우유에 희석한 오브알부민 항체 또는 인간혈청알부민을 넣고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 세척 완충액으로 10분간 3회 세척 후, 증가된 화학발광 용액을 막에 처리한 후 하이퍼필름에 감광시켜 단백질을 확인하였다.
Second, the Western blot is a method of separating several proteins by electrophoresis, transferring the separated protein bands to a nitrocellulose or nylon membrane, and then detecting an antigen for a specific antibody by using an antigen-antibody reaction in the membrane on which the protein is transferred. For this purpose, the gel was transferred to the nitrocellulose membrane after 1D-PAGE. After the transfer, it was confirmed that it was transferred to ponceau stain. After washing with washing buffer, it was reacted overnight at 4 ° C with orbital albumin antibody or human serum albumin diluted in 5% nonfat milk. After washing three times for 10 minutes with washing buffer, the increased chemiluminescence solution was treated on the membrane and exposed to hyperfilm to confirm the protein.
3.1. 3.1. NONO 농도에 따른 Depending on concentration 오브알부민의Of albumin 구조변화 Structural change
구입한 오브알부민에 1, 10, 100 및 300 μM의 NO 용액을 처리한 후 1D-PAGE로 변화를 확인하였다(도 1). 그 결과, NO 농도가 증가할수록 오브알부민 단량체의 밴드는 아래로 떨어지고, 폴리머가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, NO를 1200 μM 이상 과량으로 처리시에는 응집이 관찰되었다. 이로부터 NO는 1 내지 600 μM, 특히 300 μM의 농도로 처리했을 때 안정적으로 반응하며 다량체를 생성하고 또한 오브알부민 단량체의 구조에도 영향을 주는 것을 확인하였다.
The purchased ovalbumin was treated with 1, 10, 100 and 300 μM NO solution, and the change was confirmed by 1D-PAGE (FIG. 1). As a result, it was confirmed that as the NO concentration was increased, the band of the ovalbumin monomer fell down and the polymer was increased. However, aggregation was observed when NO was treated at over 1200 μM. From this, it was confirmed that NO reacts stably when treated at a concentration of 1 to 600 μM, particularly 300 μM, to produce a multimer and also to the structure of the ovalbumin monomer.
3.2. 3.2. NONO 농도에 따른 인간혈청알부민의 구조변화 Structural changes of human serum albumin by concentration
20% 인간혈청알부민에 300, 600 및 1200 μM 농도의 NO 용액을 처리한 후 1D-PAGE로 변화를 확인하였다(도 2). 그 결과, 처리한 NO의 농도가 증가할수록 인간혈청알부민 단량체의 밴드가 아래로 떨어지고 다량체가 증가하는 것을 CBB 염색 및 HSA-항체에 대한 웨스턴 블롯으로부터 확인할 수 있었다. 인간혈청알부민은 상기 3.1.에서 보인 오브알부민보다 높은 농도인 1400 μM 이상의 NO로 처리시 응집현상이 관찰되었다. 따라서, 오브알부민과 인간혈청알부민의 NO에 대한 반응민감성에 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 인간혈청알부민에 1200 μM의 NO를 처리시 천연젤에서 단백질의 양이 증가한 것처럼 보였으나, 희석하여 다시 분리한 결과 분자량 감소로 인한 것임을 확인할 수 있었다(도 3). 이로부터 의약품 등급의 인간혈청알부민은 300 내지 1200 μM의 NO 처리시 특히 1200 μM로 처리시 젤로 확인할 수 있는 안정적인 반응을 보이며 단량체의 구조변화에도 영향을 주는 것을 알 수 있었다.
20% human serum albumin was treated with 300, 600 and 1200 μM NO solution, and the change was confirmed by 1D-PAGE (FIG. 2). As a result, it was confirmed that the band of human serum albumin monomer fell down and the amount of oligomer increased as the concentration of treated NO increased, from CBB staining and Western blotting for HSA-antibody. When human serum albumin was treated with NO at a concentration higher than 1400 μM, which is higher than the level of ovalbumin shown in 3.1, aggregation was observed. Therefore, it was confirmed that there is a difference in the sensitivity of the reaction between ovalbumin and human serum albumin to NO. Treatment of human serum albumin with 1200 μM of NO seemed to increase the amount of protein in the natural gel, but it was confirmed by dilution that the molecular weight was reduced (FIG. 3). From this, it can be seen that the pharmaceutical grade human serum albumin shows a stable reaction which can be confirmed with gel at 300 to 1200 μM NO treatment, especially at 1200 μM, and it also affects the structural change of the monomer.
상기와 같은 결과는 NO가 알부민, 특히 오브알부민 또는 인간혈청알부민의 3차원 구조변화를 수반할 수 있음을 시사하는 결과이다.
These results suggest that NO may be involved in the three-dimensional structure change of albumin, especially ovalbumin or human serum albumin.
실시예Example 4: 4: NONO // OO 22 듀얼Dual 마이크로센서 및 이를 이용한 단백질에 포획된 산소 측정 Microsensor and the measurement of oxygen captured by protein using it
NO/O2 듀얼 마이크로센서는 시료 중의 NO와 O2 기체의 농도를 동시에 실시간으로 측정할 수 있는 기기이다. 이것은 유리를 씌운 두 개의 백금 작업 전극과 은/염화은 기준 전극으로 구성되어 있다(도 4). 상기 전극들은 기체 투과성 막으로 싸여 있어서 다른 방해 이온 종들을 제외한 오직 기체분자만 선택적으로 막을 통과할 수 있다. 통과한 기체분자 중 작업 전극의 +0.75V에서는 NO가 산화되고 -0.4V에서는 O2가 환원된다. 상기 산화, 환원 전류는 각각 NO와 O2의 양에 비례하여 측정된다. 기지의 NO, O2 농도에서 산화/환원 전류를 측정하는 보정(calibration)을 거쳐 시료 중 미지 농도의 NO, O2를 정량할 수 있다.The NO / O 2 dual microsensor is a device that can simultaneously measure NO and O 2 gas concentrations in a sample in real time. It consists of two platinum working electrodes coated with glass and a silver / silver chloride reference electrode (Figure 4). The electrodes are enclosed in a gas-permeable membrane so that only gaseous molecules, except for other interfering ionic species, can selectively pass through the membrane. Of the gas molecules passed, NO is oxidized at + 0.75 V of working electrode and O 2 is reduced at -0.4 V. The oxidation and reduction currents are measured in proportion to the amounts of NO and O 2 , respectively. After the correction (calibration) for measuring the oxidation / reduction current from NO, O 2 concentration of the base can be determined to NO, O 2 of a sample of unknown concentration.
상기 NO/O2 듀얼 마이크로센서를 이용하여 오브알부민 및 인간혈청알부민의 포획된 산소를 측정하였다. 0.1 M PBS에 녹여 준비한 5% 오브알부민 및 5% 인간혈청알부민 시료에 각각 600 μM NO 용액을 동일한 부피로 가하여 4℃에서 12시간 반응시킨 후 NO 기체를 주입하며 전류 변화를 측정하였다.
The captured oxygen of ovalbumin and human serum albumin was measured using the NO / O 2 dual microsensor. 600 μM NO solution was added to 5% ovalbumin and 5% human serum albumin samples dissolved in 0.1 M PBS, respectively, and reacted at 4 ° C for 12 hours. NO gas was injected and current changes were measured.
4.1. 4.1. 오브알부민에서의Of albumin 산소 측정 Oxygen measurement
오브알부민의 산소를 측정하기 위하여 NO/O2 듀얼 마이크로센서를 이용하였다(도 5). 도 5에 나타낸 바와 같이, 동일한 부피의 600 μM NO 용액으로 처리한 5% 오브알부민의 산소 바탕 수준이 대조 용액의 것과 비교하였을 때, 산소함량이 감소하였음을 확인할 수 있었고, NO 기체 주입시 산소가 방출되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 오브알부민은 감소한 산소 바탕 수준만큼 산소를 포획할 수 있으며, NO에 의해 상기 포획한 산소를 방출시킴을 알 수 있었다.
A NO / O 2 dual microsensor was used to measure the oxygen of ovalbumin (Figure 5). As shown in FIG. 5, when the oxygen level of the 5% ovalbumin treated with the same volume of the 600 μM NO solution was compared with that of the control solution, it was confirmed that the oxygen content was decreased. And it was confirmed that it was released. That is, it can be seen that ovalbumin can capture oxygen by a reduced oxygen background level and release the trapped oxygen by NO.
4.2. 인간혈청알부민에서의 산소 측정4.2. Measurement of oxygen in human serum albumin
인간혈청알부민에서 산소함량을 측정하기 위하여 NO/O2 듀얼 마이크로센서를 이용하였다(도 6). 상기 의약품 등급 인간혈청알부민은 인간 혈액으로부터 분리하여 제조한 것이다. 상기 인간혈청알부민에 동일한 부피의 600 μM NO 용액을 처리하고 산소 바탕 수준을 측정하였다. 상기 오브알부민과 유사하게 대조 용액에 비해 산소 바탕 수준이 감소하였고, NO 기체를 주입하자 산소가 방출되었다(도 6). 이로부터 의약품 등급의 인간혈청알부민 또한 감소한 산소 바탕 수준만큼 산소를 포획할 있으며, NO에 의해 포획한 산소를 방출할 수 있음을 확인하였다.
An NO / O 2 dual microsensor was used to measure oxygen content in human serum albumin (Figure 6). The pharmaceutical grade human serum albumin is prepared by separating from human blood. The human serum albumin was treated with an equal volume of 600 [mu] M NO solution and the oxygen background level was measured. Similar to the above-mentioned albumin, the oxygen background level was reduced compared with the control solution, and oxygen was released upon injection of NO gas (FIG. 6). From this, it has been confirmed that the drug-grade human serum albumin also captures oxygen as much as the reduced oxygen level and can release oxygen trapped by NO.
실시예Example 5: 5: NONO 처리에 의한 알부민의 다량체화 및 ≪ RTI ID = 0.0 > mass < / RTI > NaClNaCl 처리에 의한 알부민 다량체의 저분자 Small molecule of albumin multimer by treatment 화anger
상기 실시예 3에서 언급된 바와 같이 NO 처리시 알부민은 NO 농도에 따라 다량체화(multimerization)가 진행되지만 일정농도 이상의 고농도로 처리한 경우에는 응집(aggregation)이 수반됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 알부민 다량체는 응집에 의해 형성되는 응집체와는 다른 특성을 가짐을 확인하고자 하였다. 상기 응집은 일반적으로 단백질은 열이나 산처리에 의해 복수의 분자가 비가역적으로 형성되는 무정형의 단백질 복합체를 의미하는 것일 수 있으므로, TEM을 이용하여 단분자 수준에서 관찰하여 생성되는 다량체가 일정한 형태를 가지며, 가역적으로 단량체화될 수 있음을 확인하였다.As described in Example 3, albumin was multimerized according to NO concentration during NO treatment, but aggregation was accompanied by treatment at a high concentration above a certain concentration. Therefore, it was confirmed that the albumin oligomer according to the present invention has different characteristics from the aggregates formed by aggregation. In general, the aggregation may be an amorphous protein complex in which a plurality of molecules are irreversibly formed by heat or acid treatment. Therefore, it is preferable that the multimers produced by observing at the monomolecular level using a TEM have a certain shape And can be reversibly monomerized.
구체적으로, 음성염색(negative staining)을 위해 0.5% 인간혈청알부민을 20 mM Tris-HCl 및 37.5 μM NO(또는 PBS와 1 μM NO)를 포함하는 용액으로 10배 희석하였다. 높은 이온세기에서 분자상태를 가시화하기 위하여 단백질 원액을 상기 희석 완충액과 혼합한 후 500 mM NaCl을 첨가하였다. 대기 중에서 3분간 글로우 방전시킨(glow-discharged) 탄소코팅 그리드(carbon-coated grid) 상에 각 시료를 5 μl씩 가하고, 상기 그리드를 즉시 1% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 음성염색하였다. 120kV에서 작동하는 Technai G2 Spirit Twin TEM(FEI, USA)에서 그리드를 확인하고 4K×4K UltraScan 4000 CCD 카메라(Gatan, USA)로 이미지를 기록하였다.Specifically, 0.5% human serum albumin was diluted 10-fold with a solution containing 20 mM Tris-HCl and 37.5 [mu] M NO (or PBS and 1 [mu] M NO) for negative staining. To visualize the molecular state at high ionic strength, the protein stock solution was mixed with the dilution buffer and then 500 mM NaCl was added. 5 μl of each sample was added to a glow-discharged carbon-coated grid for 3 minutes in the atmosphere, and the grid was immediately negatively stained with 1% uranyl acetate. Grids were identified on a Technai G2 Spirit Twin TEM (FEI, USA) operating at 120 kV and images were recorded on a 4K x 4K UltraScan 4000 CCD camera (Gatan, USA).
그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 즉, 알부민에 NO 용액을 처리하여 제조한 알부민 다량체는 일반적인 단백질의 응집에 의해 생성되는 응집체와 달리 길다란 섬유모양을 갖는 것을 확인하였으며, 그 크기는 폭이 50 내지 200 nm, 길이가 약 6 내지 10 μm였다. 한편, 상기 섬유모양의 알부민 다량체는 고농도 예컨대 500 mM 농도의 NaCl을 처리하였을 때 저분자량의 올리고머(oligomer) 또는 단량체(monomer)로 분해되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에 의해 용액환경을 조절함으로써 알부민 다량체를 생성하거나 생성된 다량체를 단량체로 분해시키는 것이 가능함을 확인하였다.The results are shown in Fig. As shown in FIG. 7, it was confirmed that the albumin oligomer prepared by treating the albumin with the solution according to the present invention had a long fibrous shape, unlike the aggregates produced by aggregation of general proteins, The width was 50 to 200 nm and the length was about 6 to 10 mu m. On the other hand, it was confirmed that the fibrous albumin oligomer was decomposed into oligomers or monomers having a low molecular weight when treated with NaCl at a high concentration of 500 mM, for example. Therefore, it has been confirmed that by controlling the solution environment by the method according to the present invention, it is possible to generate albumin oligomers or decompose the resulting oligomers into monomers.
이어서, 830 nm 파장에서 작동하며 온도조절기를 구비한 Viscotech 802 DLS(Viscotech, U.K.)와 256-채널 멀티 타우 상관기(256-channel multi tau correlator)를 이용하여 20℃에서 동적광산란(Dynamic Light Scattering) 측정을 수행하였다. NO를 처리한 단백질(알부민:NO의 결합비=10:1)을 포함하는 PBS 용액을 100, 200, 225, 250, 300, 400 또는 500 mM NaCl 및 50 mM Tris을 포함하는 pH 7.0의 용액으로 추가적으로 희석하였다. 상기 제조한 각각의 시료를 20 ml씩 마이크로셀에 주입하였다. 입자의 이동확산계수(translation diffusion coefficient)는 제조업자로부터 제공되는 Omnisize 3.0 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. 용매의 굴절률 또는 점도 변화는 고려하지 않았다. 굴절률 및 점도값은 PBS에 대한 값을 사용하였다.Next, dynamic light scattering measurement at 20 ° C was performed using a Viscotech 802 DLS (Viscotech, UK) operating at 830 nm wavelength and equipped with a temperature controller and a 256-channel multi-tau correlator Respectively. A PBS solution containing NO-treated protein (binding ratio of albumin: NO = 10: 1) was dissolved in a solution of pH 7.0 containing 100, 200, 225, 250, 300, 400 or 500 mM NaCl and 50 mM Tris Further diluted. Each of the samples prepared above was injected into the microcells in an amount of 20 ml each. The translation diffusion coefficient of the particles was calculated using the Omnisize 3.0 software provided by the manufacturer. The refractive index or viscosity change of the solvent was not considered. Refractive index and viscosity values were used for PBS.
상기 동적광산란 실험은 NO 처리에 의해 형성된 섬유모양의 알부민 다량체이 저분자량을 갖는 올리고머 또는 단량체로 분해되는 경향을 이해하기 위하여 수행하였다. 10 μM 알부민을 1 μM NO(pH 7.0)과 반응시킨 혼합물의 경우, 100 내지 200 mM NaCl 용액을 처리하였을 때, 약 10%의 고분자량을 갖는 다량체가 용액 내에 존재함을 확인하였다. 이들의 저분자량화 경향을 연구하기 위하여 이온세기를 점차적으로 증가시키면서 측정을 계속하였다. 그 결과 200 mM NaCl 용액에서 저분자화가 진행되며 250 mM 이상으로 이온 세기가 높아지면 고분자량의 다량체들이 저분자량을 갖는 올리고머 또는 단량체로 분해됨을 확인하였다. 특히 225 내지 250 mM 농도의 NaCl로 처리시 저분자량화가 가속화되며 250 mM을 초과하는 농도에서는 완전히 분해됨을 확인하였다.
The dynamic light scattering experiments were carried out in order to understand the tendency of oligomer or monomer having fiber-like albumin macromolecular cholesteric molecular weight to be decomposed by NO treatment. In the case of a mixture of 10 μM albumin reacted with 1 μM NO (pH 7.0), it was confirmed that when a 100 to 200 mM NaCl solution was treated, a multimer having a high molecular weight of about 10% was present in the solution. In order to investigate their tendency to lower molecular weight, the measurement was continued while gradually increasing the ionic strength. As a result, it was confirmed that low molecular weight in 200 mM NaCl solution proceeded, and when the ionic strength was increased to 250 mM or more, high molecular weight oligomers were decomposed into oligomers or monomers having low molecular weight. Especially, treatment with NaCl at 225-250 mM accelerated the low molecular weight and completely decomposed at the concentration exceeding 250 mM.
상기 결과는 본 발명에 따른 알부민 다량체는 일반적인 단백질 응집체와는 달리 섬유모양의 일정한 형태를 가지며, 염농도를 조절하여 가역적으로 저분자화할 수 있는 물질임을 시사한다. 또한 상기 알부민 다량체는 처리하는 NO 농도 및/또는 NaCl 농도를 조절함으로써 다량체화 및/또는 저분자화 정도를 조절할 수 있음을 확인하였다.
The above results suggest that the albumin multimer according to the present invention has a uniform fiber shape unlike general protein aggregates and can be reversibly low molecular weight by controlling the salt concentration. In addition, it was confirmed that the albumin oligomer can control the degree of multimerization and / or low molecular weight by controlling the concentration of NO and / or NaCl to be treated.
실시예Example 6: 알부민 6: albumin 다량체의Multimeric 산소포집능Oxygen capture ability
본 발명의 제조방법에 따라 NO 처리에 의해 생성된 알부민 다량체의 특성변화를 확인하고 산소전달체로서의 활용가능성을 확인하기 위하여 상기 알부민 다량체의 산소포집능을 확인하였다.In order to confirm the change of the characteristics of the albumin oligomer produced by the NO treatment according to the production method of the present invention, the oxygen uptake ability of the albumin oligomer was confirmed in order to confirm the possibility of utilization as an oxygen carrier.
시료로는 인간혈청알부민 주사제(SK)를 0.3 M PBS(pH 7.4)를 이용하여 1 중량% 농도로 희석한 알부민 용액을 사용하였다. 상기 1 중량% 인간혈청알부민 용액과 상기 용액에 18.5 μM 또는 37.5 μM 농도로 처리하여 제조한 알부민 다량체 용액에 NaCl을 첨가하여 저분자화 시키면서 방출되는 산소의 양을 측정하였다. 상기 산소량의 측정은 실험실에서 자체 제작한 클락타입(Clark-type) 전류측정용 센서를 이용하여 수행하였으며, 실험에 앞서 산소가 제거된 PBS 용액에 산소로 포화된 PBS 용액을 첨가하면서 증가하는 산소량을 측정하여 보정곡선을 얻고 상기 보정곡선을 이용하여 인간혈청알부민 시료에 대해 측정된 전류값을 용존산소분압으로 환산하였다.As a sample, an albumin solution in which human serum albumin injected (SK) was diluted to 1 wt% concentration with 0.3 M PBS (pH 7.4) was used. The amount of oxygen released by the addition of NaCl to the oligosaccharide albumin solution prepared by treating the above 1 wt% human serum albumin solution and the solution at a concentration of 18.5 μM or 37.5 μM was measured. The measurement of the amount of oxygen was performed using a Clark-type current measuring sensor manufactured by a laboratory. Before the experiment, oxygen was added to the PBS solution, To obtain a calibration curve, and the current value measured for the human serum albumin sample was converted into the dissolved oxygen partial pressure using the calibration curve.
음성대조군으로는 PBS 용액에 NaCl 농도가 50, 150, 300 및 500 mM이 되도록 NaCl 용액을 첨가하면서 측정한 용존산소분압을 이용하였다. 그 결과를 도 8(a)에 나타내었다. 도면상의 수직으로 표시된 화살표는 NaCl을 첨가한 시점을 나타내며, 좌로부터 각각 50, 150, 300 및 500 mM로 NaCl 농도를 계단식으로 증가시켰다. 용액에서 NaCl의 농도가 증가함에 따라 산소의 용해도가 감소하면서 용액 중의 산소분압이 감소하는 것을 확인하였다. 도 8(b)에는 NO를 처리하지 않은 1 중량% 인간혈청알부민 용액에 상기한 바와 동일하게 NaCl을 처리하면서 측정한 산소분압을 나타내었다. 상기 음성대조군에서와 마찬가지로 NaCl의 농도가 증가함에 따라 용존산소분압이 감소함을 확인하였다(ΔpO2=-5.77 mmHg).As a negative control, the dissolved oxygen partial pressure was measured by adding NaCl solution to the PBS solution so that the NaCl concentration was 50, 150, 300 and 500 mM. The results are shown in Fig. 8 (a). Vertical arrows in the figure indicate the time point when NaCl was added, and the NaCl concentration was increased stepwise from the left to 50, 150, 300, and 500 mM, respectively. It was confirmed that as the concentration of NaCl increases, the oxygen partial pressure in the solution decreases while the solubility of oxygen decreases. Fig. 8 (b) shows the oxygen partial pressures measured while treating NaCl in the same manner as described above with 1 wt% human serum albumin solution not treated with NO. As in the negative control group, it was confirmed that the dissolved oxygen partial pressure decreased with increasing NaCl concentration (ΔpO 2 = -5.77 mmHg).
한편, 1 중량% 인간혈청알부민 용액에 NO 용액을 각각 18.5 μM 또는 37.5 μM 농도로 처리하여 제조한 인간혈청알부민 다량체 용액에 상기한 바와 동일하게 NaCl을 처리하여 염농도를 증가시키면서 용존산소분압을 측정하였으며, 그 결과를 각각 도 9(a) 및 9(b)에 나타내었다. 도 9(a) 및 (b) 모두에서 상기 PBS 및 NO를 처리하지 않은 인간혈청알부민 용액에서와는 달리 NaCl의 농도가 증가할수록 산소용해도가 감소함에도 불구하고 측정되는 용존산소분압이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 18.5 μM NO로 처리한 경우(도 9(a); ΔpO2=+4.1 mmHg)보다 37.5 μM NO로 처리한 경우(도 9(b); ΔpO2=+11.9 mmHg) 즉, 다량체화 정도가 높을수록 산소분압 증가도가 높은 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 인간혈청알부민 다량체는 단량체(도 8(b); ΔpO2=-5.77 mmHg)에 비해 높은 산소포집능을 가지고 주변 염농도에 따라 저분자화하면서 보유한 산소를 효율적으로 방출하므로 산소전달체로 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.Meanwhile, the human serum albumin oligomer solution prepared by treating the 1% by weight human serum albumin solution with the NO solution at a concentration of 18.5 μM or 37.5 μM, respectively, was treated with NaCl in the same manner as above to measure the dissolved oxygen partial pressure The results are shown in Figs. 9 (a) and 9 (b), respectively. 9 (a) and 9 (b), the dissolved oxygen partial pressure was increased as the concentration of NaCl was increased in spite of the decrease in oxygen solubility, unlike the case of PBS and human serum albumin without NO treatment. (Fig. 9 (b); ΔpO 2 = + 11.9 mmHg) compared with the case of treatment with 18.5 μM NO (FIG. 9 (a); ΔpO 2 = + 4.1 mmHg) The higher the oxygen partial pressure increase was. Accordingly, the human serum albumin oligomer according to the present invention has a higher oxygen capture ability than the monomer (Fig. 8 (b); ΔpO 2 = -5.77 mmHg) and efficiently releases the retained oxygen while reducing the molecular weight according to the surrounding salt concentration. It can be used effectively as a carrier.
또한 상기 혈장유래의 천연상태의 인간혈청알부민뿐만 아니라, 재조합 인간혈청알부민도 동일한 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 1 중량%의 재조합 인간혈청알부민 용액을 시료로 이용하여 상기한 바와 동일한 방법으로 실험하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 이에 따라, 재조합 인간혈청알부민 역시 NO를 처리하지 않은 경우에는 NaCl의 농도가 증가함에 따라 산소분압이 감소하는 반면, 18.5 μM(도 10(a); ΔpO2=+26.8 mmHg) 또는 37.5 μM(도 10(b); ΔpO2=+26.2 mmHg) 농도의 NO로 처리한 경우 혈장유래 인간혈청알부민에서와 동일하게 NaCl의 농도가 증가함에 따라 산소분압이 증가하는 것으로 나타났다. 상기 모든 실험은 2회 반복하여 수행하였으며, 이를 평균하여 하기 표 1에 요약하였다.In addition, in order to confirm whether the recombinant human serum albumin as well as the human serum albumin in the natural state derived from the plasma showed the same effect, 1% by weight of recombinant human serum albumin solution was used as a sample, The results are shown in Fig. Thus, the recombinant human serum albumin also showed a decrease in oxygen partial pressure as the concentration of NaCl was increased in the absence of NO, while that of 18.5 μM (FIG. 10 (a); ΔpO 2 = + 26.8 mmHg) or 37.5 μM 10 (b); ΔpO 2 = + 26.2 mmHg), the oxygen partial pressure was increased as the concentration of NaCl increased, as in plasma-derived human serum albumin. All the experiments were repeated twice, and the results were averaged and summarized in Table 1 below.
상기 실시예 4 및 실시예 6에 나타난 결과를 종합하면, 본 발명에 따른 알부민 다량체는 산소를 함유하고 있으며, 주위환경변화에 따라 이를 방출할 수 있으므로, 산소전달체로 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다. 구체적으로, NO 기체를 추가로 주입하는 경우 상기 NO 분자가 알부민 다량체에 함유된 산소분자를 치환하여 산소분자를 방출할 수 있으며, 고농도의 염용액을 처리하여 알부민 다량체를 저분자화함으로써 상기 다량체가 함유하고 있던 산소분자를 방출할 수 있음을 확인하였다.
The results of Examples 4 and 6 suggest that the albumin oligomer according to the present invention contains oxygen and can be used as an oxygen carrier since it can release it according to changes in the surrounding environment do. Specifically, when NO gas is further injected, the NO molecule can displace oxygen molecules contained in the albumin multimer to release oxygen molecules. By treating the salt solution with a high concentration to lower molecular weight of the albumin oligomer, It was confirmed that oxygen molecules contained in the sieve could be released.
Claims (27)
Wherein the albumin is a human serum albumin or an albumin, and the oligomer of the albumin is selected from the group consisting of non-covalent interactions between albumin monomers due to binding of nitrogen monoxide to albumin monomers, Is in the form of a derivatized protein complex.
상기 알부민의 다량체는 알부민 1분자 당 0.01 내지 4 개의 NO를 함유하는 것인 다량체.
The method according to claim 1,
Wherein the oligomer of albumin contains 0.01 to 4 NO per molecule of albumin.
상기 알부민은 탄소수 18의 지방산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 결합된 것인 다량체.
The method according to claim 1,
Wherein the albumin is a fatty acid having a carbon number of 18 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
상기 알부민은 오브알부민인 것인 다량체.
The method according to claim 1,
Wherein the albumin is ovalbumin.
A NO (nitric oxide) carrier comprising a multimer of the albumin of claim 1.
상기 알부민은 표적세포에 특이적으로 결합하는 리간드가 추가로 결합된 것인 NO 전달체.
10. The method of claim 9,
Wherein the albumin is further conjugated with a ligand that specifically binds to the target cell.
An oxygen carrier comprising the oligomer of albumin of claim 1.
상기 알부민은 표적세포에 특이적으로 결합하는 리간드가 추가로 결합된 것인 산소 전달체.
14. The method of claim 13,
Wherein the albumin is further conjugated with a ligand that specifically binds to the target cell.
A drug delivery system containing the oligomer of albumin according to any one of claims 1 to 4.
상기 약물전달체는 표적세포에 특이적으로 결합하는 리간드가 추가로 결합된 것인 약물전달체.
18. The method of claim 17,
Wherein the drug delivery vehicle is further conjugated with a ligand that specifically binds to the target cell.
A method for producing a human serum albumin or an albumin multimer comprising the step of adding nitric oxide (NO) to a sample containing a human serum albumin monomer or an albumin monomer.
상기 일산화질소는 최종농도가 1 μM 내지 600 μM이 되도록 첨가되는 것인제조방법.
20. The method of claim 19,
Wherein the nitrogen monoxide is added to a final concentration of 1 [mu] M to 600 [mu] M.
상기 일산화질소의 첨가는 완충액에 불활성 가스를 주입하여 산소를 제거한 후 일산화질소 가스를 주입하여 제조한 일산화질소 용액을 첨가하여 수행되는 것인 제조방법.
20. The method of claim 19,
Wherein the addition of the nitrogen monoxide is carried out by adding a nitrogen monoxide solution prepared by injecting an inert gas into the buffer to remove oxygen and injecting nitrogen monoxide gas.
상기 다량체는 염화나트륨 첨가에 의해 올리고머화 또는 단량체화될 수 있는 것인 제조방법.
20. The method of claim 19,
Wherein the oligomer can be oligomerized or monomers by addition of sodium chloride.
상기 인간혈청알부민 단량체 또는 오브알부민 단량체는 탄소수 18의 지방산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 결합된 것인 제조방법.
20. The method of claim 19,
Wherein the human serum albumin monomer or the albumin monomer is conjugated with a fatty acid having a carbon number of 18 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
(b) 상기 다량체를 포함하는 시료에 염을 첨가하는 단계를 포함하는, 인간혈청알부민 또는 오브알부민으로부터의 산소 방출을 조절하는 방법에 있어서,
상기 (a) 단계는 일산화질소를 첨가하여 인간혈청알부민 또는 오브알부민 다량체화에 의해 산소를 포집하는 단계이며, 상기 (b) 단계는 염의 첨가에 의해 산소를 포함하는 다량체의 올리고머화 또는 단량체화에 의해 산소를 방출하는 단계인 것인 방법.
(a) preparing a sample containing human serum albumin or an albumin dimer by adding nitric oxide (NO) to a sample containing human serum albumin or an albumin monomer; And
(b) adding a salt to a sample comprising said multimer, wherein said method comprises the steps of:
Wherein the step (a) comprises collecting oxygen by mass spectrometry of human serum albumin or ovalbumin by adding nitrogen monoxide, and the step (b) is a step of oligomerizing or monomerizing an oxygen-containing oligomer by addition of a salt Gt; oxygen, < / RTI >
상기 염은 염화나트륨, 염화마그네슘, 염화암모늄, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 질산나트륨 및 황산마그네슘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
27. The method of claim 26,
Wherein the salt is selected from the group consisting of sodium chloride, magnesium chloride, ammonium chloride, potassium chloride, sodium acetate, sodium carbonate, sodium nitrate, and magnesium sulfate.
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20150724 Patent event code: PE09021S01D |
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