KR101591265B1

KR101591265B1 - 퇴행성 신경계 질환 치료제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101591265B1
Application number: KR1020140036552A
Authority: KR
Inventors: 이진아
Original assignee: 한남대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2034-03-28
Also published as: KR20150112415A

Abstract

FUS(fused in sarcoma) 돌연변이의 스트레스 과립(stress granule) 축적을 감소시키는 퇴행성 신경계 질환 치료제를 스크리닝하는 방법으로, (a) 세포에 FUS 돌연변이 단백질을 발현시키는 단계; (b) 상기 세포에 산화 스트레스 유발 물질을 처리하는 단계; (c) 상기 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계; (d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 FUS 양성 스트레스 과립 축적을 감소시키는 물질을 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

Description

퇴행성 신경계 질환 치료제 스크리닝 방법 {A Method for Screening an Agent for Treating a Neuro-Degenerative Disease}

본 발명은 퇴행성 신경계 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 FUS(fused in sarcoma) 돌연변이의 스트레스 과립(stress granule) 축적 및 이와 관련된 자가소화작용의 병리학적 메커니즘을 근거로 하여 퇴행성 신경계 질환을 치료하기 위한 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

루게릭병 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS, 근위축성축삭경화증)은 대뇌 피질(brain cortex), 뇌간(brain stem), 및 척수(spinal cord)에서 상부 및 하부 운동 뉴런의 진행형 손실(progressive loss)을 보이는 파괴적인 퇴행성 신경계 질환으로서(Bento-Abreu et al, (2010) Eur J Neurosci 31(12): 2247-2265), 결국에는 마비 및 사망에 이르게 된다. 대부분의 ALS는 특발성이지만, 약 10%는 유전에 의한 것이다 (Andersen et al, (2011) Nat Rev Neurol 7(11): 603-615).

SOD1 , TARDBP , FUS/TLS, VAPB , OPTN , VCP , UBQLN2 및 C9ORF72을 포함한 몇몇 돌연변이는 ALS와 연관되어 있다고 알려져 있다(Ticozzi et al, (2011) Arch Ital Biol 149(1): 65-82).

FUS(fused in sarcoma, FUS / TLS)는 DNA 수선(repair), 유전자 전사, 및 RNA 스플라이싱(splicing)에 관여하는 DNA/RNA 결합 단백질로서(Dormann et al, (2013) Mol Cell Neurosci .), FUS의 N-말단은 전사 활성과 연관되어 있는 한편, C-말단은 단백질 및 RNA 결합에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, FUS가 전사 인자인 AP2, GCF, Sp1에 대한 인지 사이트를 가지는 것으로 확인된 바 있다.

FUS는 유사분열-후의 뉴런에서, 수상돌기로의 mRNA 이동 조절과, 시냅스 활동에 반응하는 시냅스에서의 국소적 단백질 합성을 위하여 세포질에서 왕복하여 움직이는 것으로 보고된 바 있고(Aoki et al, (2012) Acta Neuropathol 124(3): 383-394; Fujii et al, (2005) Curr Biol 15(6): 587-593), 대뇌 피질에서 FUS의 RNA 타겟을 확인한 결과, 뉴런의 비손상(integrity) 및 시그널링(signaling)에 중요한 mRNA 서열의 스플라이싱을 조절한다는 것이 밝혀졌다(Lagier-Tourenne et al, 2012, Nat Neurosci 15(11): 1488-1497).

FUS 돌연변이는 RNA 결합 유전자의 돌연변이인 대표적인 조기 치매의 일종인 전측두엽성 치매(Frontotemporal Lobar Dementia, FTLD)와 ALS에서 발견된 바 있다.

또한, FUS에서의 몇몇 미스센스(missence) 돌연변이와 넌센스(nonsense) 돌연변이는 ALS, FTLD 및 수전증과 관련되어 있다고 보고된 바 있다(Huey et al, 2012, Neurobiol Aging 33(5): 1016 e1019-1017; Rajput et al, 2013, Eur J Neurol). 이러한 돌연변이의 대부분은 C-말단 도메인에 있는데, 이는 핵 위치화 신호(Nuclear Localization Signal, NLS)의 기능을 하는 것을 보여주고 있다. 그러므로, 이러한 FUS 돌연변이는 FUS가 핵으로 이동하는 것을 막아서 세포질에 비정상적으로 위치하게 하고, 이에 따라 FUS 양성 응집체를 형성하게 된다고 보고된 바 있다(Dormann et al, 2012, EMBO J 31(22): 4258-4275).

또한, 세포질에서의 FUS-양성 세포 함유물은 특발성 ALS 또는 FTLD가 있는 사람의 뇌에서 관찰되었는데, 이는 FUS 양성 세포 함유물이 이러한 질환의 발병에서 어떠한 역할을 할 가능성이 있음을 시사한다(Mori et al, 2012, Neuropathol Appl Neurobiol 38(4): 322-328).

그러나, ALS 환자나 FTLD 환자에게서 발견되는 이들 FUS 돌연변이 단백질의 비정상적인 위치와 응집체 축척과 관련된 메커니즘 연구는 거의 알려진 바 없으며, 이에 근거한 치료법에 대해서도 전무한 실정이다.

또한, 이러한 ALS-유발 돌연변이 단백질이, 퇴행성 뇌질환에서 나타나는 FUS 양성 스트레스 과립(stress granule)과 어떠한 관련성이 있는지, 또는 FUS 양성 스트레스 과립의 축적에 있어서의 자가소화작용의 역할에 대하여는 전혀 알려진 바가 없다.

스트레스 과립(Stress Granule, SG)은 스트레스 조건에서 세포질에 나타나는, 단백질과 RNA의 밀도가 높은 집합체로서, 유해 조건으로부터 RNA를 보호하는 기능을 할 수도 있다고 예측된다. 즉, 밀도가 높은 소구체로 RNA 서열을 축적함으로써 RNA 서열에 코드화된 정보를 보호하는 기능을 할 수도 있을 것이다. 또한, mRNA, RNA 결합 단백질, 및 RNP로 이루어지는 스트레스 과립은 주로 스트레스 조건 하에서 전사 개시로부터 mRNA를 수용하고 보호하지만, 단백질 응집체가 비정상적으로 보유된 스트레스 과립은 세포질 또는 신경돌기에서 몇몇 뉴런 기능에 관여하는 세포내 mRNA 및 RNA 결합 단백질의 격리를 유발할 수 있다.

스트레스 과립은 활발하게 조립되고 분해되는 것으로 보고되어 지고 있고(Li et al, 2013, J Cell Biol 201(3): 361-372), 스트레스 조건 하에서 형성되고 스트레스 중단 후에는 분해되는 동적(動的)인(dynamic) 구조로 보고되고 있다(Li et al, 2013, J Cell Biol 201(3): 361-372).

최근, ALS의 영향을 받은 뇌 영역에서 스트레스 과립 마커인 PABP(Poly(A)-binding protein)와 FUS 양성 세포질 함유물이 비정상적으로 축적되는 것이 확인된 바 있다(Dormann et al, 2012, EMBO J 31(22): 4258-4275). 또한, FUS의 미스센스 돌연변이에 대한 몇몇 세포 수준의 연구에서, 세포질 내 FUS가 스트레스 과립에 위치하여 세포질 영역에 축적된다는 것이 밝혀졌다(Li et al, 2013, J Cell Biol 201(3): 361-372).

또 다른 연구에 의하면 스트레스 과립으로의 FUS/ALS의 조립은 신속하고 가역적이고, FUS는 스트레스 조건에 반응하여 친-생존 과정에 관여된다고 증명되었다(Sama et al, 2013, J Cell Physiol 228(11): 2222-2231). 또한, FUS C-말단 절단(truncation) 돌연변이체 단백질은 스트레스 과립의 조립 또는 분해에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다(Baron et al, 2013, Mol Neurodegener 8(1): 30).

그러나, FUS 돌연변이가 스트레스 과립의 축적과 어떻게 관련되는지 및 그러한 축적이 어떻게 조절되는지에 대하여는 명확하게 규명되지 않았다.

자가소화작용(autophagy)은 리소좀에서 RNA, 단백질, 또는 세포 소기관 등의 세포질 구성 요소를 대규모로 분해하는 경로로서(Lee, 2012, Exp Neurobiol 21(1): 1-8; Nixon, 2013, Nat Med 19(8): 983-997), 단백질과 세포 소기관의 품질 관리(quality control)와도 관련 있다.

자가소화작용 경로는 몇몇 세포질 함유물을 수반하는 퇴행성 신경계 질환과 관련된다고 알려져 있고, 일부 퇴행성 신경계 질환에서는 뉴런에서 세포의 항상성 및 시그널링의 기능 장애를 초래하는, 응집체의 축적 및 손상된 세포 소기관이 나타나는 것으로 알려져 있다. 또한, 산화 스트레스는 ALS 발병과 밀접하게 관련되어 있고, 질병의 진행에 중요하다고 알려져 있다(Barber & Shaw, 2010, Free Radic Biol Med 48(5): 629-641).

한편, 진핵 생물성 스트레스 과립은 이스트에서 자가소화작용에 의해 처리된다고 규명되었다(Buchan et al, 2013, Cell 153(7): 1461-1474).

신규 mTOR(mechanistic target of rapamycin, serine/threonine kinase) 비의존성 자가소화작용 강화제로 알려진 트레할로스(trehalose)는 최근에 운동 뉴런에서 ALS의 진행을 지연시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 자가소화작용 활성화가 SOD 돌연변이와 관련된 ALS를 치료하기 위한 기대되는 전략이 될 수도 있음을 시사하였다(Castillo et al, 2013, Autophagy 9(9): 1308-1320).

그러나, 지금까지 ALS-연관 FUS 양성 스트레스 과립의 축적에 있어서 자가소화작용의 역할에 대하여는 알려진 바가 거의 없다.

본 출원의 발명자들은 FUS 돌연변이 단백질에 의한 ALS 또는 FTLD와 같은 퇴행성 신경계 질환과 관련된 메커니즘을 연구하던 중, FUS 돌연변이의 스트레스 과립에의 축적 저해 및 스트레스 과립으로부터 분해 방해 억제 메커니즘을 통해 퇴행성 신경계 질환, 예를 들어 ALS 또는 FTLD의 치료제를 스크리닝할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 FUS(fused in sarcoma) 돌연변이의 스트레스 과립(stress granule) 축적을 감소시키는 퇴행성 신경계 질환 치료제를 스크리닝하는 방법으로,

(a) 세포에 FUS 돌연변이 단백질을 발현시키는 단계;

(b) 상기 세포에 산화 스트레스 유발 물질을 처리하는 단계;

(c) 상기 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계;

(d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 FUS 양성 스트레스 과립 축적을 감소시키는 물질을 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 퇴행성 신경계 질환 치료제 스크리닝 방법을 통해 FUS 돌연변이의 스트레스 과립에의 축적을 저해하거나 스트레스 과립으로부터 분해 방해를 억제하는 퇴행성 신경계 질환의 치료에 사용될 수 있는 후보 물질군을 스크리닝할 수 있다.

도 1a는 HEK 293T 세포에서 flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C)를 발현시킨 웨스턴 블랏 분석의 결과이다(WT: 야생형, R521C: R521C 돌연변이).
도 1b는 각각 항-flag 항체 또는 항-PABP 항체로 면역염색된 flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C)를 발현하는 뉴런의 이미지로서 FUS 및 PABP의 위치를 보여준다. (SA: 나트륨 아르세나이트 처리, Recovery: 나트륨 아르세나이트 처리의 제거, PABP: 스트레스 과립 마커, DAPI: 핵 위치 확인, 화살표: FUS 양성 스트레스 과립, 기준자(Scale bar): 10 ㎛)
도 1c는 flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C)를 발현하는 뉴런의 이미지로서 각 산화 스트레스 조건(비존재시/존재시/처리 이후)에서 FUS의 위치를 보여준다.
도 1d는 flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C)를 발현하는 뉴런에서 각 산화 스트레스 조건(비존재시/존재시/처리 이후)에서 FUS 양성 스트레스 과립이 있는 뉴런의 퍼센트(%)를 나타내는 막대 그래이다(값은 평균±SEM, 일원분산분석(One way AVOVA) 후 터키의 다중비교 검정(Turkey's multiple comparison test), *** p<0.001, ns: 유의성 없음. n=3).
도 2a는 RFP-LC3와 함께 발현된 flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C)를 발현하는 뉴런의 이미지다.
도 2b는 RFP-LC3 자가포식소체 내 FUS 양성 스트레스 과립이 있는 뉴런의 퍼센트(%)를 나타내는 막대 그래프이다(값은 평균±SEM, 일원분산분석 후 터키의 다중비교 검정, ** p<0.001, n=3).
도 2c는 NH₄Cl (10mM)의 존재시 또는 비존재시에, FUS(WT) 또는 FUS(R521C) 중 어느 하나를 발현하는 HEK 293T 세포 용해액으로부터의, 항-flag 또는 항-LC3를 이용한 웨스턴 블랏 분석의 결과이다.
도 3a는 flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C)를 WT 또는 atg5 ^-/- MEFs에서 형질주입하여 발현시킨 세포에서, FUS 또는 PABP의 세포 내 분포를 보여주는 이미지이다.
도 3b는 flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C)를 WT 또는 atg5 ^-/- MEFs에서 형질주입하여 발현시킨 세포에서 FUS 양성 스트레스 과립이 있는 세포의 퍼센트(%)를 나타내는 막대 그래프이다(값은 3회의 독립적 반복의 평균±SEM, 일원분산분석 후 터키의 다중비교 검정, ** p<0.01, *** p<0.01).
도 3c는 Flag-FUS(WT) 또는 FUS(R521C)를 atg7 siRNA 또는 스크램블(scrambled) siRNA와 함께 배양된 피질 뉴런에 동시-형질주입(co-transfect)한 결과를 나타낸 웨스턴 블랏 분석의 결과이다.
도 3d는 atg7 siRNA 또는 스크램블 siRNA와 함께인 FUS(WT) 또는 FUS(R521C)를 발현하는 뉴런의 이미지로서, FUS 양성 스트레스 과립을 나타낸다(Sc siRNA: 스크램블 siRNA).
도 3e는 atg7 siRNA 또는 스크램블 siRNA와 함께인 FUS(WT) 또는 FUS(R521C)를 발현하는 뉴런에서 FUS 양성 스트레스 과립이 있는 뉴런의 퍼센트(%)를 나타내는 막대 그래프이다(값은 3회의 독립적 반복의 평균±SEM, 일원분산분석 후 터키의 다중비교 검정, *** p < 0.001).
도 4a는 라파마이신과 함께 (또는 없이) FUS(R521C) 및 atg7 siRNA (또는 스크램블 siRNA)를 발현하는 뉴런의 이미지로서, FUS 양성 스트레스 과립을 나타낸다. (Rapa: 라파마이신 처리)
도 4b는 라파마이신과 함께 (또는 없이) FUS(R521C) 및 atg7 siRNA (또는 스크램블 siRNA)를 발현하는 뉴런에서 FUS 양성 스트레스 과립이 있는 뉴런의 퍼센트(%)를 나타내는 막대 그래프이다(값은 3회의 독립적 반복의 평균±SEM, 일원분산분석, 터키의 다중비교 검정, *** p<0.001, ns: 유의성 없음, 화살표: FUS 양성 스트레스 과립).
도 4c는 GFP와 함께 FUS(R521C) 또는 FUS(WT)를 발현하는 뉴런의 대표 이미지로서, 신경돌기 분열을 보여준다(화살표: 신경돌기 분열을 나타냄, 기준자: 20 ㎛).
도 4d는 신경돌기 분열이 있는 뉴런의 퍼센트(%)를 나타내는 막대 그래프이다(값은 4회의 독립적 반복의 평균±SEM, 일원분산분석, 터키의 다중비교 검정, *** p<0.001).

이하, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 출원의 발명자들은 FUS 돌연변이가 과도한 스트레스 과립 축적을 억제함으로써 퇴행성 신경계 질환을 치료할 수 있음을 밝혀냈으며, 이러한 메커니즘이 퇴행성 신경계 질환의 치료제의 스크리닝에 사용될 수 있음을 확인하였다.

(a) 세포에 FUS 돌연변이 단백질을 발현시키는 단계;

(b) 상기 세포에 산화 스트레스 유발 물질을 처리하는 단계;

(c) 상기 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계;

(d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 FUS 양성 스트레스 과립 축적을 감소시키는 물질을 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별하는 단계를 포함한다.

상기 상기 FUS 돌연변이는 FUS(R521C) 돌연변이일 수 있다.

상기 단계 (a)는 세포에서 FUS 돌연변이 단백질을 발현시키는 단계이다. FUS 돌연변이 단백질은 예를 들어, HEK293T 세포 또는 뉴런 세포에 FUS 돌연변이 cDNA 포함 벡터를 형질주입(transfection)시키는 과정을 통해 발현될 수 있다. 상기 FUS 돌연변이는 하기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 제작될 수 있다.

서열번호 1 : 센스-5'-CGCCCAAGCTTATGGCCTCAAACGATTATAC-3'

서열번호 2 : 안티센스-5'-CGCGGATCCTTAATACGGCCTCTCCCTGCAATCCT-3'

상기 단계 (b)는 세포에 산화스트레스 유발 물질을 처리하는 단계이다. 상기 산화스트레스는 예를 들어, 세포 배양 중 나트륨 아르세나이트(sodium arsenite drug)를 첨가하여 유발시킬 수 있다.

상기 단계 (c)는 세포에 시험대상물질을 접촉시키는 단계이다. 시험대상물질을 처리하여 세포 중 발현되는 FUS 돌연변이의 스트레스 과립 축적 감소 여부를 확인할 수 있는 상태라면 특별히 제한되지 않으며, 특정 성장 시점의 배양 신경세포에 시험대상물질을 첨가하고 인큐베이션하는 단계일 수 있다.

상기 단계 (d)는 상기 시험대상물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 FUS 양성 스트레스 과립의 축적을 감소시키는 물질을 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별하는 단계이다. 상기 FUS 양성 스트레스 과립 축적을 감소시키는 것은 FUS 돌연변이가 스트레스 과립에 축적되는 것을 저해하거나, FUS 돌연변이가 FUS 양성 스트레스 과립의 분해를 방해하는 것을 억제하는 것에 의한 것일 수 있다.

상기 FUS 양성 스트레스 과립 축적을 감소시키는 것은 자가소화작용(autophagy)의 활성화에 의한 것일 수 있다.

상기 FUS 양성 스트레스 과립 축적을 감소시키는 것은 신경세포의 비정상적 구조 변화의 감소로써 확인하는 것일 수 있다. 상기 신경세포의 비정상적 구조 변화는 신경돌기의 분열일 수 있다.

상기 FUS 양성 스트레스 과립 축적을 감소시키는 것의 측정은 제한없이 사용될 수 있으나 예를 들어, 면역세포화학법을 수행하여 FUS 양성 스트레스 과립의 개수를 확인하여 정량화함으로써 측정할 수 있다. 이후, 정량화 결과를 시험대상물질을 처리하지 않은 대조군과 비교함으로써 FUS 양성 스트레스 과립 축적의 감소 정도를 측정할 수 있다.

위 측정 방법을 통한 결과 확인 후, 시험대상물질이 시험대상물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 FUS 양성 스트레스 과립의 축적을 감소시키는 경우, 본 발명에 따른 스크리닝 방법에서 목적하는 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별할 수 있다.

상기 퇴행성 신경계 질환은 신경세포의 손상으로 인하여 유발되는 것을 특징으로 하며, 신경세포 손상으로 인하여 유발되는 퇴행성 신경계 질환으로는 예를 들어, 루게릭병 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS, 근위축성축삭경화증), 전측두엽성 치매(Frontotemporal Lobar Dementia, FTLD) 또는 수전증이 포함될 수 있다.

상기 메커니즘을 통해 스크리닝된 물질은 자가소화작용의 활성화를 통해 퇴행성 신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물 제조에 사용될 수 있다.

실시예

이하 실시예를 들어 더욱 설명하나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실험 방법 및 조건]

1. cDNA 플라스미드 제작

FUS(WT) 인간 cDNA는 Addgene (Cambridge, MA, USA)으로부터 입수하였다. 동물세포에서의 발현을 위해, R521C cDNA는 돌연변이를 포함하는 하기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 제작하였다.

서열번호 1 : 센스-5'-CGCCCAAGCTTATGGCCTCAAACGATTATAC-3'

서열번호 2 : 안티센스-5'-CGCGGATCCTTAATACGGCCTCTCCCTGCAATCCT-3'

이후, FUS(WT) 또는 FUS(R521C)의 각 cDNA를 3Xflag CMV7.1 벡터(Sigma, St Louis, MO USA)의 BamHI/HindIII 사이트에 서브클로닝하였다.

2. 세포 배양, 형질주입, 및 면역세포화학

ICR 마우스(DAEIL, Korea)의 피질 뉴런 세포를 문헌(Lee, J. A., A. Beigneux, S. T. Ahmad, S. G. Young, and F. B. Gao. 2007. Curr Biol 17:1561-7.; Lee, J. A., and F. B. Gao. 2009. J Neurosci 29:8506-11.)에 기재된 방법에 따라 배양하였다.

배양 후 3일 또는 5일(3 or 5 days in vitro(DIV))된 피질 뉴런 세포에 각각의 cDNA 플라스미드 300-500 ng을 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA USA)를 이용하여 형질주입하였다.

자가소화작용의 억제를 위하여, 배양 후 3일된(DIV3) 배양 피질 뉴런으로 atg7 siRNA를 형질주입하였다(Ban et al, 2013, Mol Cell Biol 33(19): 3907-3919). 형질주입 후 48 시간 후에 배양 배지에 나트륨 아르세나이트 (Sigma, St. Louis, MO, USA, 0.5mM) 또는 라파마이신 (Sigma, St. Louis, MO, USA, 10nM)을 첨가하였다.

면역세포화학을 위하여, 뉴런, atg5 넉아웃(knockout) (atg5-/-) MEFs(mouse embryonic fibroblasts), 또는 야생형(WT) MEFs(Kuma et al, 2004)를 0.1% 트리톤 X 100(Triton X 100)에 5분간 투과화(permeabilization)시킨 다음, 3% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)으로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 이후, 세포를 항-flag 항체(Sigma, St. Louis, MO, USA, 1:100), 항-PABP 항체(abCAM, USA, 1:100), 및 항-ATG7 항체(Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, USA, 1:1000)와 함께 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 항-래빗 이차 항체(Jackson Labs, Bar Harbor, ME, USA)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

3. 웨스턴 블랏팅

문헌(Ban et al, 2013, Mol Cell Biol 33(19): 3907-3919)에 기재된 바와 같이 용해 완충액에서 전 세포 용해액을 제조하였다. 세포 용해액(50 ㎍ 단백질)을 항-LC3 항체(Novus Biologicals, Littleton, CO, USA, 1:5000), 항-PABP PABP(abCAM, Cambridge, MA, USA, 1:100), 항-GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, Millipore, Billerica, MA, USA, 1:10,000) 및 HRP 컨쥬게이션된 항-래빗 또는 항-마우스 이차 항체(1:10,000-20,000)를 이용한 웨스턴 블랏에 의해 분석했다.

[ 실시예 1] FUS ( R521C ) 돌연변이가 산화 스트레스 하에서 FUS 돌연변이의 스트레스 과립에의 축적에 미치는 영향 평가

(1) FUS 단백질의 발현 및 안정성 확인

fus 유전자의 특정 돌연변이가 ALS와 관련된 신경퇴화를 유발하는 기전을 조사하기 위하여, ALS에서 확인된 fus 유전자 돌연변이 중에서 가장 빈번한 점 변이 중 하나인 R521C 미스센스 돌연변이(Dormann & Haass, 2013, Mol Cell Neurosci)를 선택하였다.

이들의 발현 및 단백질 안정성을 확인하기 위하여, HEK 293T 세포에서 flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C)를 발현시켰다. 세포를 24시간 동안 형질주입(transfection)시킨 후에, 시클로헥사미드(cycloheximide, CHX)로 처리하여 새로운 단백질 합성을 억제시켰다(Colombo et al, 1965, Biochem Biophys Res Commun 18: 389-395). CHX 처리 후 0, 12, 24, 및 48 시간에 세포 용해액을 얻어 항-flag 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 야생형(WT) 단백질은 감소된 반면에 FUS(R521C) 단백질 수준은 48시간에도 유지되어, FUS(R521C) 단백질이 FUS(WT)보다 단백질 분해에 더 잘 견디는 것으로 나타났다.

(2) FUS 단백질의 세포내 발현 위치 조사

유사분열-후의 뉴런(post-mitotic neuron)에서 FUS(R521C)의 세포내 위치를 조사하기 위하여, flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C)를 배양된 래트 피질 뉴런에서 배양 후 5일(DIV5, in vitro days)에 발현시켰다. 그 실험 결과를 도 1b에 나타내었다.

도 1b에,나타난 바와 같이, FUS(WT) 대부분은 형질주입 후 24-48 시간에 핵에 위치하였다. FUS(R521C)도 주로 핵에 위치하였으나, 일부는 세포질에도 위치하였다(도 1b). 그러나, FUS(R521C) 양성 스트레스 과립은 배양된 뉴런에서 거의 검출되지 않았다.

이는 FUS 양성 스트레스 과립의 형성은 노화 중 산화 스트레스와 같은 환경적인 인자에 의해 시작되는 것일 수도 있다는 것을 보여준다(도 1b 및 도 1c).

(3) 산화 스트레스가 FUS ( R521C ) 단백질의 세포내 위치에 미치는 영향 조사

또한, 배양된 뉴런에서 산화 스트레스가 ALS-연관 R521C의 세포내 위치에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위하여, FUS(WT) 또는 FUS(R521C) 발현 뉴런을 문헌(Bosco et al, 2010, Hum Mol Genet 19(21): 4160-4175)에 기재된 바에 따라, 산화 스트레스와 스트레스 과립의 형성을 유도하는 나트륨 아르세나이트(sodium arsenite) (0.5 mM, 1 hr)를 형질주입 후 24시간에 배양 배지에 첨가하였다. 나트륨 아르세나이트와 1시간 인큐베이션 후에, 산화 스트레스로부터 회복을 위하여 뉴런을 나트륨 아르세나이트가 없는 새로운 배지에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 뉴런에서 단백질 발현을 확인한 결과를 도 1b 및 도 1c에 나타냈다.

도 1b에 나타난 바와 같이, FUS(WT)는 산화 스트레스(Bentmann et al, 2012, J Biol Chem 287(27): 23079-23094)에 반응하여 스트레스 과립 마커인 PABP(Poly(A)-binding protein) 양성 스트레스 과립에 위치하였다.

또한, 도 1d에 나타난 바와 같이, 스트레스 과립으로의 FUS의 결합은 FUS(WT) 발현 뉴런에 비하여 FUS(R521C) 발현 뉴런에서 상승하였고, 이는 R521C 돌연변이가 산화 스트레스 노출시에 FUS 양성 스트레스 과립의 형성을 상승시킨다는 것을 나타냈다.

(4) R521C 돌연변이가 FUS 양성 스트레스 과립의 조립 역학에 미치는 영향 조사

본 발명자들은 R521C 돌연변이가 FUS 양성 스트레스 과립의 조립 역학을 조절하는지 여부를 조사하였다. 도 1c 및 도 1d에 나타난 바와 같이, FUS(WT) 양성 스트레스 과립은 나트륨 아르세나이트 제거 후 20분에 상당히 감소되었고, 이는 FUS가 스트레스 과립으로부터 분해됨을 나타내는 것이다(도 1d). 그러나, FUS(R521C) 양성 스트레스 과립은 산화 스트레스 제거 후 20분에도 여전히 남아 있었고, 이는 R521C 돌연변이는 산화 스트레스에 의해 유도된 스트레스 과립으로부터 FUS의 분해를 방해한다는 것을 나타내는 것이다(도 1b, 도 1c, 및 도 1d). FUS 돌연변이는 스트레스 조건 하에서 과립으로의 FUS의 결합을 상승시킬 뿐만 아니라, 스트레스 이후에는 FUS가 스트레스 과립으로부터 신속하게 분리되는 것을 방해하는 것으로 나타났다. 그러므로, 노화 중 스트레스에 반응하는 스트레스 과립의 정상적인 역학의 장애 및 FUS 양성 스트레스 과립의 과도한 축적은 ALS 진행의 원인이 될 수도 있을 것이다.

결과적으로, ALS-연관 FUS(R521C) 돌연변이는 산화 스트레스시에 스트레스 과립으로의 FUS의 결합을 강화하고 산화 스트레스로부터 회복하는 동안 그들의 역학을 방해하는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 2] 자가소화작용과 FUS -양성 스트레스 과립의 축적과의 관련성 조사

본 발명자들은 자가소화작용이 FUS 돌연변이(R521C)를 수반한 ALS의 재현된 세포 모델에서 FUS-양성 스트레스 과립의 축적과 관련있는지 알아보기 위하여 하기 실험을 실시하였다.

먼저, 배양된 피질 뉴런으로 flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C)를 자가포식소체 마커인 RFP-LC3와 함께 동시 형질주입하여 발현시켰다(Ban et al, 2013, Mol Cell Biol 33(19): 3907-3919). 그러나, 산화 스트레스 하에서도 FUS(WT) 또는 FUS(R521C) 발현 뉴런에서 눈에 띄는 RFP-LC3양성 자가포식소체를 관찰할 수 없었다(데이터 미기재).

다음으로, FUS(WT) 또는 FUS(R521C)를 발현하는 뉴런을 자가소화작용의 억제제로 알려진, 리소좀-영양 시약인 염화암모늄(NH₄Cl) (10mM)의 존재 하에 산화 스트레스 (0.5 mM, 나트륨 아르세나이트 처리, 1 hr)에 노출시켜, 염화암모늄의 존재 하에서 RFP-LC3 양성 자가포식소체를 조사하였다. 그 결과, FUS 양성 스트레스 과립은 산화 스트레스시에 리소좀성 분해의 억제 하에서 RFP-LC3 양성 자가포식소체에 함께 위치하였고(도 2a 및 도 2b), 이러한 결과로써 FUS 양성 스트레스 과립이 리소좀성 분해의 억제 하에서 자가포식소체에 축적된다는 것을 확인할 수 있었다.

FUS(R521C)가 RFP-LC3 양성 자가포식소체에 어떻게 축적되는지 밝히기 위하여, NH₄Cl의 존재 또는 비존재 하에 LC3 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석을 수행하여, flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C) 발현 세포에서 자가소화작용의 변화를 조사하였다.

도 2c에 나타난 바와 같이, LC3-II는 NH₄Cl의 존재시에 축적되었고, 이로써 자가소화작용 경로가 FUS(WT 및 R521C) 발현 세포에서 활발하다는 것을 알 수 있었다.

결과적으로, 몇몇 퇴행성 신경계 질환은 자가소화작용 분해의 기능 장애와 관련되지만, FUS 양성 스트레스 과립은 자가소화작용 경로를 손상시키는 것으로 보이지는 않음을 알 수 있었다.

[ 실시예 3] 자가소화작용-결핍이 FUS 양성 스트레스 과립의 축적에 미치는 영향 조사

FUS(R521C) 양성 스트레스 과립의 과도한 축적에서 자가소화작용의 역할을 추가로 조사하기 위하여, flag-FUS(WT) 또는 flag-FUS(R521C)을 WT MEFs 또는 자가소화작용이 결핍된 atg5 ^-/- MEFs에 형질주입하였다. FUS-양성 스트레스 과립은 WT MEFs에서는 거의 검출되지 않은 반면에, atg5 ^-/- MEFs의 상당 부분에 축적되었다(도 3a 및 도 3b). 또한, FUS(WT) 양성 스트레스 과립보다 더 많은 FUS(R521C) 양성 스트레스 과립이 atg5 ^-/- MEFs에 축적되었고, 이는 FUS(WT)보다 FUS(R521C) 양성 스트레스 과립의 축적이 자가소화작용의 결핍에 더 민감하다는 것을 확인할 수 있었다(도 3a 및도 3b).

또한, FUS-양성 스트레스 과립의 조립 과정이 자가소화작용 경로에 의하여 조절되는지를 추가로 확인하기 위하여, 유사분열-후의 뉴런에서 자가소화작용의 필수 구성 요소인 atg7(Komatsu et al, 2007, Proc Natl Acad Sci U S A 104(36): 14489-14494)의 발현을 넉다운(knock down)시켜 스트레스 과립의 조립을 조사하였다. 구체적으로, 배양된 피질 뉴런에 Flag-FUS(WT) 또는 Flag-FUS(R521C)를 스크램블 siRNA (scrambled siRNA) 또는 atg7 siRNA의 어느 하나와 함께 동시 형질주입하였다. 형질주입 후 48시간 후에, 뉴런을 나트륨 아르세나이트(0.5 mM, 1hr)로 처리하였다. Flag-FUS(WT) 또는 Flag-FUS(R521C)가 atg7 siRNA 또는 스크램블 siRNA와 함께 뉴런에서 발현된 결과는 도 3c에 나타나 있다.

도 3d 및 도 3e에 나타난 바와 같이, 대조 뉴런(스크램블 siRNA)에 비교할 때 더 많은 FUS(WT) 양성 또는 FUS(R521C) 양성 스트레스 과립이 자가소화작용 결핍 뉴런에 축적되었고, 이러한 결과로써 자가소화작용이 FUS 양성 스트레스 과립의 조절에 관여한다는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 4] 자가소화작용의 활성화가 FUS ( R521C ) 발현 뉴런에 미치는 영향 조사

(1) 자가소화작용의 활성화가 FUS 양성 스트레스 과립의 형성에 미치는 영향

FUS(R521C) 양성 스트레스 과립의 감소에서 자가소화작용의 직접적 역할을 조사하기 위하여, mTOR(mechanistic target of rapamycin, serine/threonine kinase)의 억제제인 라파마이신을 사용하여 FUS(R521C) 발현 뉴런에서 자가소화작용을 활성화시켰다(Liang, 2010, Cell Death Differ 17(12): 1807-1815).

구체적으로, Flag-FUS(R521C)를 atg7 siRNA 또는 스크램블 siRNA (Sc siRNA) 중 어느 하나와 함께 배양된 피질 뉴런으로 형질주입하였다. 형질주입 후 48시간 후에, 뉴런을 라파마이신(10 nM)의 존재 또는 비존재 하에 나트륨 아르세나이트 (0.5 m M)에 노출시켰다. 뉴런을 고정하고 나서 항-flag 또는 항-PABP 항체로 면역염색하였다.

도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, 라파마이신 처리는 FUS(R521C) 양성 스트레스 과립의 축적을 감소시켰다.

라파마이신은 자가소화작용을 포함하여, 단백질 합성 또는 세포 시그널링에 관여하는 일부 세포 내 경로에 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, 라파마이신에 의한 자가소화작용의 특이적 활성화가 스트레스 과립의 감소에 영향을 미치는지 추가로 확인하기 위하여, atg7 siRNA를 R521C 발현 뉴런에 형질주입함으로써 자가소화작용을 억제하였고, 라파마이신이 여전히 스트레스 과립의 수를 감소시킬 수 있는지 시험하였다.

이 또한 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, FUS(R521C) 발현 뉴런이 atg7 siRNA로 형질주입된 상태에서 라파마이신으로 처리하면, 산화 스트레스시에 FUS(R521C) 양성 스트레스 과립의 수가 감소되지 않았다. 이러한 결과로써 라파마이신에 의한 자가소화작용의 특이적 활성화는 스트레스 과립 수의 감소로 이어진다는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 자가소화작용의 활성화가 신경세포에 미치는 영향 조사

본 발명자들은, FUS(R521C)가 FUS(WT)에 비하여 유사분열-후의 뉴런에서 산화 스트레스에 반응하여 신경퇴화를 유발하는지와 자가소화작용 활성화에 의하여 스트레스 과립을 감소시키면 FUS(R521C) 돌연변이에 의해 유발된 신경퇴화로부터 벗어날 수 있는지 여부를 조사하였다.

구체적으로, Flag-FUS(R521C) 또는 Flag-FUS(WT)를 배양된 피질 뉴런으로 GFP(green fluorescent protein)와 함께 형질주입하였다. 형질주입 후 48시간 후에, 뉴런을 1시간 동안의 라파마이신 (10 nM)의 존재 또는 비존재 하에 나트륨 아르세나이트 (0.5 m M)와 함께 산화 스트레스에 노출시킨 후에 새로운 배지로 세척하였다. 세척 후 24시간에, 뉴런의 형태를 GFP로 시각화하였다.

도 4c 및 도 4d에 나타난 바와 같이, FUS(WT) 발현 뉴런에서는 신경돌기 분열이 거의 보이지 않은 반면에, FUS(R521C) 발현 뉴런에서는 현저한 신경돌기 분열 현상을 보였다.

또한, 라파마이신 처리에 의해 자가소화작용이 활성화되면, FUS(R521C) 발현 뉴런에서 산화 스트레스에 노출됨으로써 유도된 신경돌기 분열이 상당히 감소되는 것도 확인할 수 있었다.

종합하면, 이러한 결과는로써 자가소화작용은 FUS-양성 스트레스 과립의 과도한 축적을 저하시키고, FUS 병리학과 관련된 신경돌기 퇴화를 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Hannam University Institute for Industry-Academia Cooperation <120> A Method for Screening an Agent for Treating a Neuro-Degenerative Disease <130> P140240 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgcccaagct tatggcctca aacgattata c 31 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cgcggatcct taatacggcc tctccctgca atcct 35

Claims

FUS(fused in sarcoma)(R521C) 돌연변이의 스트레스 과립(stress granule) 축적을 감소시키는 퇴행성 신경계 질환 치료제를 스크리닝하는 방법으로,
(a) 세포에 FUS 돌연변이 단백질을 발현시키는 단계;
(b) 상기 세포에 산화 스트레스 유발 물질을 처리하는 단계;
(c) 상기 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계;
(d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 자가소화작용(autophagy)의 활성화에 의한 FUS 양성 스트레스 과립 축적의 감소 및 신경세포의 비정상적 구조 변화의 감소를 나타내는 물질을 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 FUS(R521C) 돌연변이는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 제작되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 FUS 양성 스트레스 과립 축적을 감소시키는 것은 FUS 돌연변이가 스트레스 과립에 축적되는 것을 저해하거나, FUS 돌연변이가 FUS 양성 스트레스 과립의 분해를 방해하는 것을 억제하는 것에 의한 것인 방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 퇴행성 신경계 질환은 루게릭병 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS, 근위축성축삭경화증), 전측두엽성 치매(Frontotemporal Lobar Dementia, FTLD) 또는 수전증인 것인 방법.