KR101579008B1 - ERR-γ 저해제를 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 망막병증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물, 및 망막병증 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

ERR-γ 저해제를 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도{A composition for preventing or treating retinopathy, comprising an ERR-γ inhibitor, and use thereof}

본 발명은 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 망막병증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물, 및 망막병증 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

ERR-γ(estrogen-related receptor gamma)는, NR3B3로 불리는 인간 핵 수용체 단백질로서, ESRRG 유전자에 의해 인코딩된다. ERR-γ는 전사에 있어서 지속적 활성제(constitutive activator)로서 기능한다. ERR-γ는 스테로이드 호르몬 수용체의 핵 호르몬 수용체 패밀리의 일 구성원이며, 아직 생리학적으로 활성인 리간드는 규명되지 않아, 오판(orphan) 수용체로 분류된다. ERR-γ 단백질은 심근에서 지방산 산화 및 미토콘드리아 바이오제네시스(biogenesis)에 연관된 다양한 유전자의 주요 조절자로 알려진 바 있다. 그러나, 망막병증에서의 ERR-γ의 역할은 아직 알려진 바 없으며, ERR-γ의 발현 또는 활성을 조절하는 물질을 안구 투여용 제제에 적용한 바 없었다.

망막(retina)은, 안구의 가장 안쪽을 덮고 있는 신경조직으로 빛에 대한 정보를 전기적 정보로 전환하여 뇌로 전달하는 역할을 수행하는 기관이다. 망막병증(retinopathy)은 눈의 망막에 만성 또는 급성에 의한 손상으로 발병하는 질환으로, 계속 진행중인 염증 및 혈관 리모델링(vascular remodeling)을 수반한다. 또한, 망막병증은 당뇨병 또는 고혈압과 같은 전신 질환의 시각적 발현으로 나타나기도 한다. 이러한 망막병증에는 당뇨망막병증, 고혈압성 망막병증 및 미숙아 망막병증 등이 있다.

그 중 당뇨망막병증은, 당뇨가 있는 환자에서 특유의 망막의 순환장애가 발생하여 발병하는 질환으로, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신증과 함께 당뇨병에서 3대 미세혈관합병증 중 하나이다. 당뇨망막병증의 발생은 당뇨병을 앓은 유병기간과 연관이 있는데 제1형에 해당하는 30세 이전에 진단된 당뇨병의 경우 유병기간이 5년 이하일 때 17%, 15년 이상일 때 98%에서 당뇨망막병증이 발생하고, 이 중 더 악화된 증식당뇨망막병증은 10년 이하일 때는 약 1%, 35년 이상에서는 67%에서 발생한다. 제2형 당뇨병에서는 유병기간 5년 이하에서는 29%, 15년 이상에서는 78%이며, 증식당뇨망막병증은 5년 이하에서는 2%, 15년 이상에서는 16%에서 발생한다고 알려져 있다. 당뇨병 환자의 망막에서는 망막모세혈관 기저막의 비후, 혈관주위 세포의 소실, 미세혈관류의 발생 등 모세혈관에서 혈관의 변화가 나타나며, 시간이 경과함에 따라 광범위한 모세혈관 비관류에 이어 망막신생혈관 역시 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 당뇨망막병증은 당뇨 합병증의 일종이기는 하나, 일단 발병하게 되면 혈당 조절 등으로 그 진행을 막기 어려우며, 망막병증에 특이적인 치료 방법이 요구된다.

이러한 배경 하에 본 발명자들은 망막병증을 효과적으로 치료할 수 있는 치료 표적을 규명하고자 예의 노력한 결과, ERR-γ 단백질이 망막병증에 있어서 효과적인 치료 표적이 됨을 규명하였고, ERR-γ 단백질의 활성을 억제시키는 경우, 망막병증의 치료 효과를 가져올 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 ERR-γ(estrogen-related receptor gamma)의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 망막병증 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 망막병증의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 망막병증이 유발된 분리된 망막 시료에 망막병증 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료에서 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 망막병증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 ERR-γ(estrogen-related receptor gamma)의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "ERR-γ(estrogen-related receptor gamma)"는 NR3B3로 불리는 인간 핵 수용체 단백질이다. ERR-γ는 전사에 있어서 지속적 활성제(constitutive activator)로서 기능하며, 이의 생리학적 리간드가 알려지지 않아 오판(orphan) 수용체로 분류된다. 본 발명에서는, 상기 ERR-γ가 망막병증 동물 모델에서 정상 대조군에 비하여 그 발현이 현저하게 증가되고, 이의 활성을 억제시키는 경우, 망막병증에 대한 치료 효과를 가져올 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 목적상 상기 ERR-γ는 망막병증의 예방 또는 치료를 위한 표적 분자 및 진단을 위한 표적 분자를 의미한다.

본 발명에 따르면, ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질이라면, 이는 본 발명의 조성물에 포함되어 망막병증의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질"은 ERR-γ에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식을 통해 ERR-γ의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나 단백질로 번역 후 분해를 촉진시키는 방식으로 발현을 저해하는 물질, 또는 그 활성을 방해함으로써 ERR-γ 활성을 감소시키는 모든 물질을 포함할 수 있다.

상기 ERR-γ 발현을 저해하는 물질은 ERR-γ를 표적으로 하여 ERR-γ의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한없이 사용 가능하다. 상기 ERR-γ 발현 또는 활성을 저해하는 물질의 예로, 바람직하게는 ERR-γ mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드, ERR-γ 단백질의 활성을 억제하는 항체, 앱타머 또는 화합물 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "올리고 뉴클레오티드"는 수 개 내지 수십 개의 뉴클레오티드가 인산디에스테르 결합(phosphodiester bond)으로 중합되어 형성된 중합체를 의미한다. 상기 ERR-γ mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드로의 예로, 바람직하게는 ERR-γ에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligonucleotides), 앱타머, 또는 siRNA(small interfering RNA) 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미하는 것으로서 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명에서 상기 ERR-γ mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드는 ERR-γ mRNA에 상보적인 서열을 갖는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체로서, 상기 ERR-γ mRNA에 결합하여 상기 ERR-γ mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 등을 방해하거나 또는 ERR-γ mRNA의 그 밖의 다른 모든 생물학적 기능 또는 활성을 저해할 수 있다.

상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 6 내지 100 염기일 수 있고, 보다 바람직하게는 8 내지 60 염기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 당해 기술 분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라 생체 내(in vivo) 에서 합성되거나, 시험관 내(in vitro)에서 합성되어 생체 내로 투여될 수 있다. 생체 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 다중 클로닝 부위 (Multi-cloning site; MCS)의 기원(origin)이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 방법을 들 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 RNA 중합효소 I를 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 ERR-γ mRNA의 발현을 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 ERR-γ의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 ERR-γ mRNA의 발현을 억제하는 앱타머는 ERR-γ의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "siRNA"는 RNA 간섭(interference) 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각을 의미한다. 상기 siRNA는 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용될 수 있다. 이중 가닥의 RNA가 다이서(dicer)에 의해 절단되어 생성될 수 있는 상기 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 해당 mRNA의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 siRNA는 ERR-γ의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다. 상기 siRNA를 제작하는 방법의 비제한적인 예로는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 전사를 이용하여 siRNA를 합성하는 방법, 시험관 내 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 다이서를 이용해 절단하여 제작하는 방법, shRNA 발현 플라스미드 또는 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 또는 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 말한다. 하나의 항체 분자는 두 개의 중사슬(heavy chain) 및 두 개의 경사슬(light chain)로 구성되어 있으며, 이들 각각의 중사슬 및 경사슬은 가변 영역과 고정 영역을 포함한다. 상기 가변 영역은 3개의 상보성 결정 부위 (Complementarity Cetermining Region: CDR) 및 4개의 구조 형성 부위 (Framework Region; FR)를 포함하며, 상기 상보성 결정 부위들에 의해 항체와 항원 사이의 결합 부위가 형성되어 특정 항원에 대한 항체의 결합 특이성이 생성될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 ERR-γ 단백질의 활성을 억제하는 항체라면 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어, 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항체 단편 등을 모두 포함할 수 있다. 또한 키메라성 항체 또는 이종 결합 항체 등과 같이 유전 공학적으로 제작된 항체들도 모두 포함할 수 있다.

또한, 상기 ERR-γ의 활성을 저해하는 물질을 화합물의 형태일 수 있으며, 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

[화학식 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, (Z)-4-(1-{4-[2-(디메틸라미노)에톡시]페닐}-5-히드록시-2-페닐펜트-1-엔일)페놀로 명명된다.

이러한 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질은, 망막병증의 예방 또는 치료를 위하여 본 발명의 조성물에 포함된다.

본 발명에서 용어, "망막병증(retinopathy)"은 눈의 망막에 만성 또는 급성에 의한 손상으로 발병하는 질환이다. 이러한 망막병증은 계속 진행중인 염증 및 혈관 리모델링(vascular remodeling)을 수반할 수 있다. 또한, 망막병증은 당뇨병 또는 고혈압과 같은 전신 질환의 시각적 발현으로 나타나기도 한다. 이러한 망막병증의 종류로는 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 및 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity, ROP) 등이 있다.

여기서, 당뇨망막병증은 전신 질환인 당뇨병에 의한 말초 순환 장애에 따라 장애가 생겨 시력 감소가 발생하는 눈의 합병증을 의미한다. 당뇨망막병증은 초기에는 증상이 없으나, 황반부의 침범이 일어나게 되면서 시력 저하를 나타낸다. 당뇨망막병증은 미세혈관류, 정맥확장, 망막출혈, 망막경색, 황반부종, 신생혈관, 초자체출혈, 견인성 막 등 다양한 병리학적 특징을 수반하여, 이러한 현상이 안저 증상으로 관찰되면 당뇨망막병증으로 진단된다. 당뇨망막병증은 상기와 같은 다양한 증상이 복합적으로 수반되어 발병 또는 진행하는 질환이다.

또한, 미숙아 망막병증은 미숙아, 특히 저체중 출생아에게서 발생할 수 있는 증식성 망막병증이다. 출생 시 망막의 혈관이 완전히 형성되지 않은 미숙아에게 출생 후 혈관형성 과정에 장애가 발생하면 망막의 혈관형성부위와 혈관무형성 부위의 경계에서 비정상적인 섬유혈관증식이 발생하며, 이에 의해 망막이 박리되면서 최종적으로 실명을 초래할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"이란, 본 발명의 조성물을 투여에 의해 망막병증의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 망막병증의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.

본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있으며, 망막병증에 대한 치료제인 점에서 안구 투여 방식으로 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다. 경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물을 정제 또는 캡슐 등과 같은 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스(Saccharose), 솔비톨(Sorbitol), 만니톨(Mannitol), 전분, 아밀로펙틴(Amylopectin), 셀룰로오스(Cellulose) 또는 젤라틴(Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산 칼슘(calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨(sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스(polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있다. 나아가 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물을 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으며, 망막병증에 대한 치료제인 점에서 안구 투여 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 적합한 도포, 분무 또는 투여량은, 상기 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로는 물론, 투여 대상이 되는 개체의 나이, 체중, 성별, 질병 증상의 정도, 섭취하는 음식, 배설 속도 등과 같은 요인들에 의해 다양해 질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 망막병증 동물모델의 경우, 정상 대조군에 비하여 ERR-γ의 발현 수준이 현저하게 증가하는 것을 확인하여(실시예 2), ERR-γ가 망막병증에 있어 치료 표적이 될 수 있음을 확인하였다. 또한, 망막병증 모델에서 본 발명에 따른 ERR-γ 저해제인 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 처리에 의해 VEGF의 발현이 효과적으로 감소됨을 확인함으로써, ERR-γ 저해제가 망막병증의 예방 또는 치료 효과를 가지고 오는 것을 확인하였다(실시예 3 및 4).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 ERR-γ 및 이의 발현 또는 활성을 저해하는 물질에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 상기 건강기능식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

본 발명의 상기 건강기능식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비제한적인 예로 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 상기 첨가되는 추가 성분의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 음료 또는 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 사용되거나 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가물의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 망막병증 의심 개체 내에 투여하는 단계를 포함하는, 망막병증 치료 방법을 제공한다.

상기 약학적 조성물, 망막병증 및 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 망막병증이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 약학적 조성물의 적합한 1일 총 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

특정 동물에 대한 상기 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 구체적인 약학적 유효량은, 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 해당 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 또는 식이는 물론, 상기 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다.

본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법에서 상기 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며 목적하는 해당 부위에 상기 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 망막병증이 유발된 분리된 망막 시료에 망막병증 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료에서 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 망막병증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 ERR-γ 및 망막병증에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에 따르면, 망막병증에 있어서 ERR-γ 유전자는 치료 표적이 될 수 있으므로, 망막병증 치료 후보 물질을 분리된 망막 시료 또는 망막병증 동물 모델에 처리한 후, 망막 시료에서 이의 발현 또는 활성 변화를 측정함으로써 망막병증 치료제를 스크리닝할 수 있다. 구체적으로, 망막병증인 개체의 경우, 정상 대조군 개체에 비하여 망막에서 ERR-γ의 발현이 증가되어 있으므로, 망막병증인 개체에서 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 감소시킬 수 있는 물질은 망막병증 치료제로 판단될 수 있다.

상기 스크리닝 방법에서 (a) 단계는 망막병증이 유발된 분리된 망막 시료, 구체적으로 망막병증 개체로부터 분리된 망막 시료 또는 망막병증 유발 물질이 처리된 망막 시료에 망막병증 치료 후보 물질을 처리하는 단계이다.

본 발명에서 용어, "시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 망막 세포 또는 조직이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 망막병증 치료 후보 물질과 반응시킬 수 있다.

본 발명에서의 용어 "후보 물질"은 ERR-γ의 발현 또는 활성 수준을 감소시킬 수 있는 물질로, 올리고 뉴클레오티드, 단백질, 화합물 등을 제한없이 포함한다.

상기 스크리닝 방법에서 (b) 단계는 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료에서 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계이다. 이 단계에서 ERR-γ 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 검출은 노던 블롯(Northern blot), 웨스턴 블롯(western blot), 면역조직화학적 염색(immunohistochemical staining), 인 시추 혼성화 방법(in situ hybridization), 역전사효소 중합반응(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 실시간 정량적 RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은, 추가로 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성이 후보 물질이 처리되지 않은 시료에 비해 감소하면 망막병증 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는 조성물은 망막병증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은, 산소유도 망막병증 동물 모델에서, 망막병증의 유도 여부를 확인한 실험이다.
도 2는, 산소유도 망막병증 동물 모델의 망막에서 ERR-γ의 발현을 확인한 것으로, A는 대조군을, B는 산소유도 망막병증 동물 모델에 대한 실험 결과를 나타낸다.
도 3은, hVEGF 프로모터 및 ERR-γ 발현 벡터를 공동-형질감염(co-transfection)한 C2C12 세포에 화학식 1로 표시되는 화합물을 처리한 다음, VEGF 프로모터 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4에서, A는 생후 7일부터 12일까지 고산소 처리한 다음, 생후 12일부터 17일까지 정상산소로 복귀시켜 망막병증을 유도한 산소유도 망막병증 쥐에서 안구를 적출한 후, 망막을 분리하여 mRNA를 추출한 다음, PCR을 진행하여 VEGF mRNA의 발현을 확인하여 수치화한 결과를 나타내는 것이다. 또한, B는 생후 7일부터 12일까지 고산소 처리한 다음, 생후 12일에 정상 산소로 복귀시킨 쥐가 생후 14일이 되었을 때, 화학식 1로 표시되는 화합물을 망막 내 주입하고, 같은 개체의 반대쪽 눈에는 30% PEG(polyethylene glycol)을 주입하여 화학식 1로 표시되는 ERR-γ 저해제의 효과를 VEGF mRNA 측정으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5에서, RGC-5 세포에 데페록사민(Deferoxamine)을 100μM의 농도로 처리하고 ERR-γ 저해제를 도면에 표시된 농도로 동시에 처리한 다음, 12시간 후 mRNA를 추출하여 VEGF 및 액틴(actin)에 대한 PCR을 수행한 결과를 A에 나타내었다. 상기 도 5의 A 결과를 수치화한 결과를 B에 나타내었다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 산소 유도 망막병증 유도

생후 7일 된 C57BL/6 마우스를 어미 쥐와 같이 75% 고산소(hyperoxia)에 총 5일간 노출시켰다(생후 7일-11일). 생후 12일에 고산소 챔버에서 꺼내어 다시 정상 산소(21% 산소)에 노출시켜 신생혈관 형성을 유도하였다. 5일 뒤인 생후 17일에 최대 혈관신생을 확인하였다. 대조군의 경우 같은 기간 동안 정상 산소에서 유지하였다.

고산소에 노출시킨 생후 12일과 17일 마우스의 안구를 각각 적출하여 4% 파라포름알데히드(PFA)에 4 ℃의 온도에서 고정시켰다. 1시간 고정 후, 각막과 공막, 렌즈, 유리체 등을 제거하고 망막만을 분리해내었다. 분리한 망막을 1% PFA에 1시간 고정시킨 후, 0.1% Tween 20을 이용하여 투과성(permeabilization)으로 만들었다. 그 다음, 1% BSA와 0.1% Triton X-100을 녹인 PBS에 망막을 넣어서 블롯킹을 하고, 햄스터 항-마우스 CD31 단일클론항체(Millipore, no. MA1398z), 다클론 래빗 항-신경교 섬유질 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein) 항체(DakoCytomation, no. Z0334)를 넣어 반응시켰다(4 ℃, 밤새). 다음날, 알렉사 플루오르 488-컨쥬게이션된 항-햄스터 항체(Jackson ImmunoResearch, no. 127-545-160), 알렉사 플루오르 568-컨쥬게이션된 항-래빗 항체(Life Technologies, no. A11011)를 반응시키고, 망막의 가장 자리를 잘라 마운팅하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, A는 생후 12일 마우스의 망막에서 산소유도 망막병증의 유도를 확인한 결과로서, 망막 중앙(central retina) 중심에 비관류 지역(nonperfusion area)가 존재함을 나타낸다. 도 1에서, B는 생후 17일 마우스의 망막에서 산소유도 망막병증의 유도를 확인한 결과로서, 혈관신생이 유도되어 산소유도 망막병증이 유도되었음을 나타내었다.

실시예 2: 산소유도망막병증 모델과 대조군에서의 ERR-γ 발현 비교

생후 17일된 쥐의 안구를 적출하여 4% PFA에 넣어 4℃에서 밤새 고정시키고, 파라핀 블록에 조직을 포매하여 4 ㎛ 두께로 절편을 잘랐다. 에피토프 회수 용액(IHC World, IW 1100)을 사용하여 항원 회수를 하였고, 3% H₂O₂로 내재적 퍼옥시다제를 블록킹하였다. IHC 과정은 울트라 비젼 LP 검출 시스템 HRP 폴리머 키트(Thermo Scientific, TL-060-HL)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 단일클론 항-인간 ERR-γ 항체(PPMX, no. H6812)는 1:200으로 희석하였고, 4 ℃에서 밤새 반응시켰다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 정상 산소에 둔 대조군(생후 17일)에 대한 결과(A)와 비교하였을 때, 망막병증 모델에서 ERR-γ의 발현이 증가한 결과를 나타내었다(B). 상기와 같은 결과는 ERR-γ 단백질이 망막병증의 진단 및 치료에 있어 효과적인 표적이 될 수 있음을 나타내는 결과이다.

실시예 3: ERR-γ 저해제의 VEGF 프로모터 활성 억제 효과 확인

C2C12 세포를 실험 전 날 플레이트에 분주하여 자라게 하였다. 다음 날 hVEGF 프로모터와 ERR-γ, β-갈락토시다제(galactosidase) 발현 벡터를 TransIT®-LT1(Mirus, MIR 2305)와 반응시켜 형질감염(transfection)을 위한 소포(Liposome)를 형성하게 하였다. 일정 시간 반응 후, 발현 벡터 소포체를 C2C12 세포에 넣어주고 하루 동안 배양하였다. 다음 날 ERR-γ 저해제를 농도별로 처리하고 다시 하루 동안 배양하였다. 형질감염 48시간 후에 세포를 용해 (lysis) 시켜 프로모터 활성도를 측정하였다. 프로모터 활성도는 루시퍼라아제(Luciferase) 활성도를 측정하여 확인하고, 형질감염 효율의 확인은 β-갈락토시다제(galactosidase)의 활성도를 측정하여 한다. 프로모터의 활성도를 β- 갈락토시다제의 활성도로 보정하여 대조군 대비 실험 조건의 배수로 나타내었다.

여기서 사용한 ERR-γ 저해제는 화학식 1로 표시되는 화합물 단일 종류로 ERR-γ 특이적 저해제이고, 첨단의료복합단지에서 합성 의뢰하여 사용하였다.

그 결과를 도3에 나타내었다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, ERR-γ의 발현 증가에 따라 증가된 VEGF 프로모터의 활성이 본 발명에 따른 ERR-γ 저해제의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하는 결과를 나타내었다.

실시예 4: 망막병증 모델에서 ERR-γ 저해제의 VEGF 발현 억제 효과 확인

(1) 산소유도망막병증 동물 모델에서 ERR-γ 저해제의 VEGF 발현 억제 효과 확인

생후 7일 된 C57BL/6 마우스를 어미 쥐와 같이 75% 고산소(hyperoxia)에 총 5일간 노출시켰다(생후 7일-11일). 생후 12일에 고산소 챔버에서 꺼내어 다시 정상 산소(21% 산소)에 노출시켜 신생혈관 형성을 유도하였다. 정상 대조군의 경우 같은 기간 동안 정상 산소에서 유지하였다. 고산소에 노출시킨 생후 17일 마우스 및 정상 대조군의 안구를 각각 적출하여 각막과 공막, 렌즈, 유리체 등을 제거하고 망막만을 분리해내었다. 분리한 망막을 QIAzol Lysis 용액(QIAZEN, 79306)을 이용하여 mRNA를 추출하고, cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific, K1622)를 이용해 cDNA를 합성하였다. VEGF 프라이머는 정방향(forward) 5'-TTACTGCTGTACCTCCACC-3' (서열번호 1)/ 역방향(reverse) 5'-ACAGGACGGCTTGAAGATG-3' (서열번호 2)를 사용하여 1) 95 ℃ 10 min - 2) 95 ℃ 30s - 3) 57 ℃ 30s - 4) 72 ℃ 30s - 5) 72℃ 5min의 조건(2번에서 4번까지는 총 28번 반복)으로 PCR을 진행하였다. PCR 결과는 Image J 소프트웨어를 사용하여 수치화 하고, VEGF의 결과를 액틴(Actin) 결과로 보정하여 정상군 대비 산소유도 망막병증의 차이를 비교하였다.

그 결과를 도 4A에 나타내었다. 도 4A에 나타나있듯, 산소유도망막병증 모델에서는 정상군에 비하여 VEGF mRNA 발현이 증가한 결과를 나타내었다.

또한, 상기 생후 12일에 정상산소로 복귀시킨 마우스의 생후 14일 시점에 ERR-γ 저해제인 (Z)-4-(1-{4-[2-(디메틸라미노)에톡시]페닐}-5-히드록시-2-페닐펜트-1-엔일)페놀 1mM의 농도로 망막 내 주입하였다. 같은 개체의 반대쪽 눈에는 30% PEG를 망막 내 주입하여, 본 발명에 따른 ERR-γ 저해제의 효과를 서로 비교하였다. 생후 17일에 상기 기술한 방법으로 망막을 수득하고, PCR을 진행하였다.

그 결과를 도 4B에 나타내었다. 도 4B에 나타나있듯, 산소유도 망막병증 마우스에서 30% PEG를 처리한 대조군에 비하여 본 발명에 따른 ERR-γ 저해제를 처리한 군에서 VEGF mRNA가 현저히 감소하는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 ERR-γ 저해제 처리를 통하여 망막병증의 치료 효과를 나타낼 수 있음을 시사하는 것이다.

(2) 데페록사민 유도 망막병증 모델에서 ERR-γ 저해제의 VEGF 발현 억제 효과 확인

데페록사민을 망막신경절세포(retinal ganglion cell, RGC)인 RGC-5 세포(Rat RGC)에 처리하여 망막병증 상태를 유도하였다. 또한, ERR-γ 저해제인 (Z)-4-(1-{4-[2-(디메틸라미노)에톡시]페닐}-5-히드록시-2-페닐펜트-1-엔일)페놀을 5μM 또는 10μM의 농도로 데페록사민 처리와 동시에 처리하고, 12시간 동안 배양하였다. 그 후 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, VEGF 프라이머 정방향 5'- ATCATGCGGATCAAACCTCACCA-3' (서열번호 3)/ 역방향 5'- GAGCACTTT GGGTCCGGAGG-3' (서열번호 4)를 사용하여 상기 기술된 방법과 동일하게 PCR을 진행하였다. PCR 결과는 Image J 소프트웨어를 사용하여 수치화 하고, VEGF의 결과를 Actin 결과로 보정하여 나타내었다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 ERR-γ 저해제의 처리에 의해 데페록사민 처리에 의해 증가된 VEGF의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 ERR-γ 저해제가 망막병증의 치료를 가지고 올 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A composition for preventing or treating retinopathy, comprising an ERR-gamma inhibitor, and use thereof <130> PA130521-KR-P1 <150> KR 10-2013-0114012 <151> 2013-09-25 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VEGF <400> 1 ttactgctgt acctccacc 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VEGF <400> 2 acaggacggc ttgaagatg 19 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VEGF <400> 3 atcatgcgga tcaaacctca cca 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VEGF <400> 4 gagcactttg ggtccggagg 20

Claims (7)

1. ERR-γ(estrogen-related receptor gamma)의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질은 ERR-γ mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, 항체, 또는 화합물인 것인 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 ERR-γ의 활성을 저해하는 물질은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것인 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 안구 투여용인 것인 조성물.
   
5. ERR-γ의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물.
   
6. (a) 망막병증이 유발된 분리된 망막 시료에 망막병증 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및
   (b) 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료에서 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 망막병증 치료제의 스크리닝 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 ERR-γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준; 또는 이의 활성이 후보 물질이 처리되지 않은 시료에 비해 감소하면 망막병증 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.

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