KR101578420B1

KR101578420B1 - 마이크로니들 디바이스 및 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성을 상승시키는 방법

Info

Publication number: KR101578420B1
Application number: KR1020117000147A
Authority: KR
Inventors: 치카테루 노자키; 카즈요시 카미나카; 준이치 마츠다; 타카아키 테라하라; 테츠지 쿠와하라; 세이지 토쿠모토
Original assignee: 히사미쓰 세이야꾸 가부시키가이샤; 잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2009-05-22
Publication date: 2015-12-17
Anticipated expiration: 2029-05-22
Also published as: JPWO2010001671A1; US20110112509A1; WO2010001671A1; CA2729404C; CA2729404A1; KR20110036729A; EP2327419A1; US9028463B2; CN102076357A; EP2327419A4; EP2327419B1

Abstract

인플루엔자 백신의 면역원성을 증강시키는 마이크로니들 디바이스에 의한 면역원성 증강 방법을 제공한다.
본 마이크로니들 디바이스에 의한 면역원성 증강 방법은 A형(H1N1)주, A형(H3N2)주 및 B형주를 유효 성분으로 하는 항원으로 이루어지는 인플루엔자 백신을 코팅한 폴리락트산으로 이루어지는 마이크로니들을 구비한 마이크로니들 디바이스를 피부에 맞닿게 하여 상기 인플루엔자 백신을 경피투여한다. 경피투여후에 마이크로니들 디바이스를 피부에 맞닿게 한 개소에 라우릴알코올을 도포한다.

Description

마이크로니들 디바이스 및 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성을 상승시키는 방법{MICRONEEDLE DEVICE, AND METHOD FOR ENHANCING THE EFFICACY OF INFLUENZA VACCINE BY USING MICRONEEDLE DEVICE}

본 발명은 마이크로니들 디바이스에 의한 면역원성 증강 방법에 관한 것이다.

피부는 최외층의 각질층, 표피, 진피, 및 피하결합조직으로 이루어진다. 통상, 사세포층 및 지질이중층으로 이루어지는 각질층은 많은 물질에 대하여 강력한 배리어 기능을 나타낸다. 진피층에는 랑게르한스 세포라고 불리는 항원제시세포가 존재하고 면역 기능을 담당하고 있다. 랑게르한스 세포는 피부내에 침입한 단백질 항원을 보충하고, 내부에서 분해하며, MHC분자상에 펩티드 단편을 표출한다. MHC-펩티드 복합체는 수입 림프관으로부터 소속 림프절의 피질하층으로 이동하고, T세포와 지상 돌기세포를 통하여 접촉한다. 랑게르한스 세포가 이와 같이 이동함으로써 항원이 피부로부터 림프절내에 존재하는 T_H세포에 전해진다. 랑게르한스 세포는 항원을 T_H세포에 제시하기 위해서 필요한 MHC클래스II분자를 가지고 있다.

이와 같이 피부의 각질층에 의한 강력한 배리어 기능 때문에 진피층으로의 백신은 유효한 것은 알려져 있었지만, 300~2000㎛로 한정된 진피층으로의 주사침에 의한 투여는 기술적인 난점으로부터 정밀도상의 문제가 있었다.

이것을 해결하기 위한 수단으로서, 마이크로니들이 개발되어 있다. 이들은 최외층인 각질층을 천자하는 것을 목적으로 하여, 다양한 사이즈와 형상(높이 수십~수백 마이크로미터정도의 매우 작은 돌기물)이 고안되어 있으며, 특히 비침습적인 백신 투여 방법으로서 기대되고 있다.

또, 마이크로니들을 구비한 디바이스를 이용한 경우의 약제의 적용 방법에 대해서도 다양한 방법이 고안되고 있으며, 약제를 마이크로니들 표면에 코팅하여 투여하는 방법이나, 침에 약제 또는 생체성분을 투과시키기 위한 구멍(중공침)이나 홈을 형성하는 방법, 침 자체에 약제를 혼합하는 방법 등이 제안되고 있다. 이들 마이크로니들 디바이스는 모두 높이 수십~수백 마이크로미터정도의 매우 작은 돌기물(마이크로니들)을 구비한 것이기 때문에, 약제의 적용 방법에 따라서는 약제의 경피흡수성이나 흡수효율도 크게 상이하다고 생각된다.

예를 들어, 마이크로니들을 사용하여 항원(백신)의 경피흡수성을 효율적으로 촉진시키는 방법으로서, 마이크로니들 표면의 일부분에 약제를 코팅하는 방법이 있으며, 예를 들어 비특허문헌 1에 개시되어 있다. 이것은 마이크로니들의 일부분(특히 침부분만)에 항원(백신)을 코팅한 경우, 적용한 항원(백신)의 전부 또는 그 대부분이 체내로 이행하여, 정확한 진피로의 투여 수단으로서 유용한 것을 나타내고 있다.

그런데, 진단약이나 약제와 같은 의약물질을 효율적이고 또한 안전하게 투여하는 것의 중요성이 최근 인식되어 오고 있다. 특히 요즘은 신형 인플루엔자 대책으로서 프리팬더믹 백신(A/H5N1아형)의 개발이 진행되고 있다(비특허문헌 2). 그 접종 방법은 3주간의 간격으로 피하 또는 근육내에 2회 접종할 필요가 있으며, 이러한 종류의 신형 인플루엔자의 대유행을 생각했을 경우, 얼마나 적은 백신으로 얼마나 많은 사람에게 면역을 야기시키는가 라는 백신의 효율적이며 간편한 투여 방법의 개발이 요망된다.

또, 현재 일본에 있어서 널리 인플루엔자 백신으로서 사용되고 있는 일본약국방 생물학적제제기준 「인플루엔자HA백신」은 A형(H1N1), A형(H3N2) 및 B형의 3가혼합이며, 용법으로서 1회 또는 약 1~4주간의 간격을 두고 2회 피하 주사로 되어 있다. 이것에도 가끔 면역이 야기되기 어려운 사람이 있는 것이 알려져 있어, 역시 백신의 효율적인 투여가 필요하게 된다.

인플루엔자 백신을 사용한 마이크로니들 제제에 대해서는, 특허문헌 1에 개시되어 있다. 개시된 마이크로니들 제제는 인플루엔자 백신의 투여 방법, 처방을 포함하는데, 마이크로니들에 의한 항원의 투여량과 효과(항체가)의 관계에 대해서, 근육내 주사(IM)나 피하 주사(SC)를 사용한 투여량 이하에서의 검토는 행해지지 않고 있다. 또, 항원의 투여량의 저감이나 효과를 증강시키기 위한 방책은 강구되지 않고 있다.

특허문헌 2에는 인플루엔자 백신을 경구투여, 비강내투여 또는 주사에 의해 투여한 후, 애쥬번트를 피부 표면으로부터 적용하는 경피적 면역 부활 방법이 개시되어 있고, 경구, 골격근내, 피하 등의 투여 방법이 예시되어 있지만, 마이크로니들에 의한 투여는 기재되어 있지 않다.

특허문헌 3에는 치료용 물질의 양을 저감시키고 치료 효과를 달성할 목적에서 중공침을 가진 마이크로니들에 의한 투여가 개시되어 있지만, 면역의 야기에 대한 기재는 없다.

일본 특허 공표 2007-530680호 공보 일본 특허 공표 2004-529906호 공보 일본 특허 공표 2006-506103호 공보

Pharma. Res. 19(1), 63-70(2002) 일본백신학회 뉴스레터, vol. 12(2007. 1. 10)

상기 서술한 바와 같이 인플루엔자 백신을 마이크로니들에 코팅하여 진피로의 정확한 투여를 행함으로써, 효율적이며 간편한 인플루엔자 백신의 투여의 가능성이 있음에도 불구하고, 지금까지 인플루엔자 백신의 마이크로니들에 의한 투여와 주사에 의한 투여에 대한 충분한 비교 검토가 이루어지지 않고 있다.

본 발명의 목적은 인플루엔자 백신의 면역원성을 증강시키는 마이크로니들 디바이스에 의한 면역원성 증강 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자는 이상을 기술배경으로 하여 나날이 검토를 거듭한 결과, A형(H1N1)주, A형(H3N2)주 및 B형주를 유효성분으로 하는 항원으로 이루어지는 인플루엔자 백신을 코팅한 마이크로니들을 사용하여 인플루엔자 백신을 경피투여함으로써, 피하 주사에 비해 효율적으로 인플루엔자 백신의 항체성이 상승하는 것을 알아냈다. 또한 인플루엔자 백신을 코팅한 마이크로니들을 경피투여후, 투여 부위에 라우릴알코올을 도포함으로써, 피하투여에 비해 효율적으로 3가의 모든 아형의 현저한 항체가의 상승을 확인할 수 있었다.

즉, 본 발명에 따른 마이크로니들 디바이스에 의한 면역원성 증강 방법은, A형(H1N1)주, A형(H3N2)주 및 B형주를 유효성분으로 하는 항원으로 이루어지는 인플루엔자 백신을 코팅한 폴리락트산으로 이루어지는 마이크로니들을 구비한 마이크로니들 디바이스를 피부에 맞닿게 하여 상기 인플루엔자 백신을 경피투여하는 것이다. 여기서, 상기 인플루엔자 백신의 경피투여후, 상기 마이크로니들 디바이스를 피부에 맞닿게 한 개소에 애쥬번트 효과를 가지는 라우릴알코올을 도포하는 것으로는 더욱 면역원성이 증강된다. 그 밖에도 피부 침투가 가능한 애쥬번트 활성을 가지는 물질의 도포는 면역원성의 증강 효과를 기대할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로니들 디바이스는, A형(H1N1)주, A형(H3N2)주 및 B형주를 유효성분으로 하는 항원으로 이루어지는 인플루엔자 백신을 코팅한 폴리락트산으로 이루어지는 마이크로니들을 구비한다. 여기서, 상기 코팅은 코팅 담체로서 풀루란을 포함하는 것이 바람직하다. 또, 상기 코팅은 라우릴알코올을 포함할 수 있다.

본 발명에 의하면, A형(H1N1)주, A형(H3N2)주 및 B형주를 유효성분으로 하는 항원으로 이루어지는 인플루엔자 백신을, 주사에 의한 피하투여에 비해, 효율적이며 간편한 조작으로 3가 전부의 아형의 면역원성을 상승시킬 수 있다. 경피적 면역 부활용의 마이크로니들 디바이스를 사용함으로써, 인플루엔자 백신에 의해 유발되는 면역응답을 자극하고, 백신내의 항원의 유효 용량을 줄일 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 마이크로니들 디바이스의 일례를 나타내는 도면이며, (a)는 사시도, (b)는 (a)의 A-B단면도이다.
도 2는 IgG항체가에 대해서 마이크로니들 투여군과 피내투여군과의 비교를 나타내는 도면이다.
도 3은 IgA항체가에 대해서 컨트롤군과 마이크로니들 투여군과의 비교(비강)를 나타내는 도면이다.
도 4는 IgA항체가에 대해서 컨트롤군과 마이크로니들 투여군과의 비교(폐)를 나타내는 도면이다.
도 5는 인플루엔자 백신 투여후의 시간 경과에 있어서의 개별항체가의 측정 결과의 일례를 나타내는 그래프이다.
도 6은 인플루엔자 백신 투여후의 항체가의 추이의 일례를 나타내는 그래프이다.
도 7은 HI항체가의 측정 결과의 일례를 나타내는 그래프이다.

도 1은 본 발명에 따른 마이크로니들 디바이스의 일례를 나타내는 도면이며, (a)는 사시도, (b)는 (a)의 A-B단면도이다. 도 1(a)에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 마이크로니들 디바이스(인터페이스)(5)는 마이크로니들 기판(8)과, 피부 또는 점막을 천공 가능한 이차원형상으로 배치된 복수의 마이크로니들(6)을 가진다. 마이크로니들 기판(8)은 각 마이크로니들(6)에 대응하여 배치된 복수의 개구부(7)를 구비한다. 본 예에서는, 마이크로니들(6)의 형상은 원뿔형상이지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않고, 사각뿔 등의 다각뿔이어도 되고, 또 다른 형상이어도 된다. 또, 복수의 마이크로니들(6)과 복수의 개구부(7)가 교대로 각각 정사각 격자형상으로 배치되어 있지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않는다. 또한, 마이크로니들(6)과 개구부(7)의 수는 도면에서는 1:1이지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않으며, 개구부(7)를 포함하지 않는 것도 포함한다.

본 예에서는, 마이크로니들(6)의 일부 또는 전체면이 A형(H1N1)주, A형(H3N2)주 및 B형주를 유효성분으로 하는 항원으로 이루어지는 인플루엔자 백신으로 코팅되어 있다. 코팅(1)은 예를 들어 도 1(b)에 나타낸 바와 같이 각 마이크로니들(6)의 표면에 배치된다. 코팅(1)은 마이크로니들(6)의 전체에 배치되어 있지만, 그 일부에 배치할 수도 있다. 필요할 때에 도 1(a)에 나타내는 마이크로니들(6)이 배치된 마이크로니들 기판면을 피부에 맞닿게 하고, 그 반대면으로부터 약물의 용해액을 흘리면, 각 개구부(7)로부터 액체가 흘러나와 각 마이크로니들(6)에 전달되어, 상기 인플루엔자 백신이 경피 흡수된다. 여기서, 개구부(7)는 필수가 아니며, 액체는 개구부(7)를 사용하지 않고 별도의 수단으로 마이크로니들(6)에 공급되어도 된다. 또, 코팅(1)은 외부로부터 액체를 부여하지 않고, 마이크로니들을 피부에 천공했을 때의 체액에 의해 용해시킴으로써, 인플루엔자 백신을 피부내에 방출시킬 수 있다.

마이크로니들 디바이스중의 마이크로니들은 피부 또는 점막에 천자되는 마이크로니들(침)과 이 침부를 지지하는 기판으로 이루어지고, 마이크로니들은 기판에 복수 배열되어 있다. 마이크로니들은 미소구조이며, 마이크로니들의 높이(길이)(h)는 바람직하게는 50㎛~700㎛이며, 보다 바람직하게는 100㎛~600㎛, 더욱 바람직하게는 200㎛~500㎛이다. 여기서, 마이크로니들의 길이를 50㎛ 이상으로 하는 것은 인플루엔자 백신의 경피로부터의 투여를 확실하게 하기 위해서이며, 700㎛ 이하로 하는 것은 마이크로니들의 신경과의 접촉을 회피하여, 통증의 가능성을 확실하게 감소시킬 수 있음과 동시에 출혈의 가능성을 확실하게 회피하기 위해서이다. 또, 그 길이가 700㎛ 이하이면, 피내에 들어가는 인플루엔자 백신의 양을 효율적으로 투여할 수 있다.

여기서, 마이크로니들은 볼록형상 구조물로서 넓은 의미에서의 침형상 또는 침형상을 포함하는 구조물을 의미하고, 원뿔형상 구조의 경우, 통상 그 기저에 있어서의 직경은 50~200㎛정도이다. 또, 마이크로니들은 끝이 날카로운 선단을 가지는 침형상의 것에 한정되는 것은 아니며, 끝이 뾰족하지 않은 형상도 포함하는 것이다. 마이크로니들은 적합하게는 비금속제의 합성 또는 천연의 수지 소재를 사용하여 제작된다. 또, 마이크로니들의 형상은 본 예에서는 원뿔형상이지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않고, 사각뿔 등의 다각뿔이어도 되고, 또 다른 형상이어도 된다.

마이크로니들 기판은 마이크로니들을 지지하기 위한 토대이며, 그 형태는 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 도 1과 같이 관통된 구멍(개구부)을 구비한 기판이어도 되고, 이 경우, 기판의 배면으로부터, 마이크로니들에 코팅한 인플루엔자 백신의 용해액을 흘릴 수 있는 것 외에, 인플루엔자 백신을 개구부 및 마이크로니들을 통하여 흘려서 투여할 수도 있다. 마이크로니들 또는 기판의 재질로서는 실리콘, 이산화규소, 세라믹, 금속(스테인레스, 티탄, 니켈, 몰리브덴, 크롬, 코발트 등) 및 합성 또는 천연의 수지 소재 등을 들 수 있는데, 마이크로니들의 항원성 및 재질의 단가를 고려하면, 폴리락트산, 폴리글리콜리드, 폴리락트산-co-폴리글리콜리드, 풀루란, 카프로노락톤, 폴리우레탄, 폴리 무수물 등의 생분해성 폴리머나, 비분해성 폴리머인 폴리카보네이트, 폴리메타크릴산, 에틸렌비닐아세테이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리옥시메틸렌 등의 합성 또는 천연의 수지 소재가 특히 바람직하다. 또, 다당류인 히알루론산, 풀루란, 덱스트란, 덱스트린 혹은 콘드로이틴황산 등도 적합하다. 특히, 폴리락트산은 생분해성 수지이며, 임플란트 제제로서도 사용 실적이 있는(일본 특허 공표 2002-517300호 공보 또는, Journal of Controlled Release 104(2005) 51-66) 점에서, 강도면, 안전면에서 보아 가장 적합한 마이크로니들 소재의 하나이다.

마이크로니들(침)의 밀도는 전형적으로는 침의 횡렬은 1밀리미터(mm)당 약 1 내지 10의 밀도가 제공되도록 횡렬간이 비워져 있다. 일반적으로, 횡렬은 횡렬내의 침의 공간에 대하여 실질적으로 동일한 거리만큼 떨어져 있고, 1cm²당 100~10000개의 침 밀도를 가지며, 바람직하게는 100~5000개, 보다 바람직하게는 200~2000개, 더욱 바람직하게는 400~1000개이다. 100개 이상의 침 밀도가 있으면, 효율적으로 피부를 천공할 수 있고, 10000개를 넘는 침 밀도에서는 마이크로니들에 피부 천공이 가능한 강도를 부여하는 것이 어려워진다.

마이크로니들의 제법으로서는 실리콘 기판을 사용한 웨트 에칭 가공 또는 드라이 에칭 가공, 금속 또는 수지를 사용한 정밀 기계 가공(방전 가공, 레이저 가공, 다이싱 가공, 핫 엠보스 가공, 사출 성형 가공 등), 기계 절삭 가공 등을 들 수 있다. 이들 가공법에 의해, 침부와 지지부는 일체로 성형된다. 침부를 중공으로 하는 방법으로서는 침부를 제작후, 레이저 가공 등으로 2차 가공하는 방법을 들 수 있다.

마이크로니들에 코팅을 행할 때에, 코팅액의 용매 휘발에 의한 약제의 농도 변화 및 물성의 변화를 최소한으로 하기 위해서, 장치의 설치 환경의 온습도를 일정하게 제어할 수도 있다. 용매의 증산을 막기 위해서는, 온도를 내리거나 습도를 올리거나의 어느쪽 또는 그 양쪽을 제어하는 것이 바람직하다. 온도를 제어하지 않는 경우의 실온에서의 습도는 상대습도로서 50~100%RH이며, 바람직하게는 70.0~100%RH이다. 50%RH 이하이면 용매의 증발이 일어나고, 코팅액의 물성의 변화가 일어나는 경우가 있다. 가습 방식에는 목적으로 하는 습도상태를 확보할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 기화식, 증기식, 물 분무식 등이 있다.

인플루엔자 백신은 그 형태에 한정되는 것은 아니며, 시즌성 백신으로부터 팬더믹 백신이면 A형, B형, C형과 각각에 존재하는 아형도 포함할 수 있다. 예를 들어, 일본약국방의 생물학적제제기준 「인플루엔자HA백신」은 A형(H1N1)주, A형(H3N2)주 및 B형주를 유효성분으로 하는 항원으로 이루어지는 인플루엔자 백신이다.

마이크로니들에 코팅하는 코팅액은 인플루엔자 백신 외에, 코팅 담체 및 액체조성물을 포함할 수 있다. 또 본 발명 코팅은 마이크로니들(침)에 코팅액이 고여 고착된 상태가 바람직하고, 그것을 위해 코팅액에 건조 공정을 더하여 고착시키는 경우도 있다.

코팅 담체로서는 인플루엔자 백신과 비교적 상용성(균일하게 섞이는 성질)이 있는 다당류의 담체가 바람직하고, 폴리히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리에틸렌글리콜, 풀루란, 카르멜로스나트륨, 콘드로이틴황산, 히알루론산, 덱스트란, 아라비아고무 등이 바람직하고, 또한 히드록시프로필셀룰로오스, 풀루란, 아라비아고무가 보다 바람직하다. 또, 히드록시프로필셀룰로오스(HPC-SSL(분자량:15,000~30,000), HPC-SL(분자량:30,000~50,000), HPC-L(분자량:55,000~70,000), HPC-M(분자량:110,000~150,000), HPC-H(분자량:250,000~400,000)), 풀루란, 히알루론산이 더욱 바람직하다. 특히, 인플루엔자 백신과의 상용성의 면에서 풀루란이 가장 바람직하다.

코팅액 전체의 코팅 담체의 함량은 1~70중량%이며, 바람직하게는 1~40중량%이며, 특히 바람직하게는 3~25중량%이다. 또, 이 코팅 담체는 액이 흐르는 일이 없도록 어느 정도의 점성이 필요한 경우가 있어, 점도로서 100~100000cps정도 필요하다. 보다 바람직한 점도는 500~60000cps이다. 점도가 이 범위에 있는 것에 의해, 마이크로니들의 재질에 의존하지 않고, 원하는 양의 코팅액을 한번에 도포하는 것이 가능하게 된다. 또, 일반적으로 점도가 높아질수록 코팅액의 양이 늘어나는 경향이 있다.

마이크로니들을 코팅하는데 사용되는 액체조성물은 생체적합성의 담체, 송달되어야 할 인플루엔자 백신, 및 경우에 따라서는 어느 하나의 코팅 보조 물질을 휘발성 액체와 혼합함으로써 조제한다. 휘발성 액체는 물, 디메틸술폭시드, 디메틸포름아미드, 에탄올, 이소프로필알코올 및 그들의 혼합물 등일 수 있다. 이들 중에서 물이 가장 바람직하다. 액체의 코팅액 혹은 현탁액은 전형적으로는 0.1~65중량%의 인플루엔자 백신 농도를 가질 수 있고, 바람직하게는 1~30중량%, 더욱 바람직하게는 3~20중량%이다.

다른 기존에 알려진 제제 보조 물질은 그들이 코팅의 필요한 용해성 및 점도의 특징 그리고 건조된 코팅의 성상 및 물성에 유해한 영향을 끼치지 않는 한, 코팅에 첨가해도 된다.

마이크로니들의 코팅의 두께는 50㎛ 미만이며, 바람직하게는 25㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 1~10㎛이다. 일반적으로, 코팅의 두께는 건조후에 마이크로니들의 표면에 걸쳐 측정되는 평균의 두께이다. 코팅의 두께는 일반적으로 코팅 담체의 복수의 피막을 적용함으로써 증대시키는 것, 즉, 코팅 담체 고착후에 코팅 공정을 반복함으로써 증대시킬 수 있다.

마이크로니들의 높이(길이)(h)는 상기 서술한 바와 같이, 바람직하게는 50㎛~700㎛이다. 마이크로니들의 코팅의 높이(H)는 마이크로니들의 높이(h)에 의해 변동하는데, 0㎛~700㎛의 범위로 할 수 있고, 통상 10㎛~700㎛의 범위내이며, 바람직하게는 30㎛~500㎛정도이다.

본 발명의 마이크로니들 디바이스를 사용하여 인플루엔자 백신에 의한 면역의 야기를 보다 완전한 것으로 하기 위해서, 예를 들어, 애쥬번트 효과가 있는 지방족 알코올류를 본 발명 마이크로니들 디바이스에 의해 투여한 부위에 도포할 수 있다. 이와 같은 지방족 알코올류에 있어서는, 직쇄 또는 분기상의 지방족 알코올류가 바람직하다. 이와 같은 지방족 알코올류에 있어서, 탄소수 및 분자량에 특별히 한정은 없지만, 피부투과성을 고려하면 탄소수 8~20인 것이 보다 바람직하다. 또, 이러한 지방족 알코올류는 포화 또는 불포화의 어느 쪽이어도 된다.

이들 지방족 알코올류 중에는 경피흡수에 있어서의 흡수 촉진제로서 이용되는 것도 많은데, 본 발명에 있어서의 지방족 알코올류는 WO2007/015441을 참조하면 흡수 촉진 작용에 더하여, 애쥬번트 효과를 기대할 수 있다.

그러한 지방족 알코올류는 예를 들어 옥틸도데칸올, 라우릴알코올, 올레일알코올, 이소스테아릴알코올, 데칸올 등인데, 그 중에서도 라우릴알코올, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴알코올이 특히 바람직하고, 라우릴알코올이 가장 바람직하다.

백신에 혼합시키는 경우에는, 본 발명의 지방족 알코올류는 0.1~99중량%에서 바람직하게 배합되고, 5~90중량%로 배합되는 것이 보다 바람직하며, 특히 10~80중량%이면 더욱 바람직하다. 가장 바람직한 조성중에 있어서의 지방족 알코올류의 함량은 15~75중량%이다.

또, 뒤에서 도포하는 경우에 있어서는, 당연히 지방족 알코올류 그 자체를 도포할 수 있지만, 기존에 알려진 제제 보조 물질을 포함시킬 수도 있고, 그 조성은 0.1~99중량%에서 바람직하게 배합되고, 5~90중량%로 배합되는 것이 보다 바람직하며, 특히 10~80중량%이면 더욱 바람직하다. 가장 바람직한 조성중에 있어서의 지방족 알코올류의 함량은 15~75중량%이다.

본 발명의 마이크로니들 디바이스의 투여 시간은 4분~600분정도로 생각되는데, 컴플라이언스 향상을 위해서는, 가능한 한 짧은 쪽이 바람직하다.

마이크로니들 디바이스에 코팅된 인플루엔자 백신의 대부분의 투여가 종료된 시점이 최적의 투여 시간이며, 코팅의 조성이나 애쥬번트, 또한 마이크로니들의 형상에 따라서도 변화된다고 생각된다.

마이크로니들 디바이스의 바람직한 투여 시간은 4분~180분이다. 4분 미만에서는 용해에 시간이 걸리기 때문에 인플루엔자 백신의 투여가 불충분하게 되는 경우가 있고, 180분을 넘는 경우는 컴플라이언스상 바람직하지 않다. 또, 이 투여 시간은 보다 바람직하게는 4분~60분이며, 가장 바람직하게는 4분~10분이다.

본 발명의 마이크로니들 디바이스는 피부내에서의 면역응답을 자극하고, 혈청중 IgG항체가를 상승시킨다. 그리고, 또한 애쥬번트를 첨가하지 않고 IgA항체가도 상승시키는 것이 가능하게 된다. 특히 IgA항체가는 폐, 비점막 등의 국소에 있어서 상승한다.

[실시예]

(실험예 1)

이하와 같이 조정한 A형(H1N1)주, A형(H3N2)주 및 B형주를 유효성분으로 하는 항원을 포함하는 인플루엔자HA백신을 BIOMAX-10K(밀리포어사제)를 사용하고, 원심분리에 의해 농축하여, 고분자 폴리머(풀루란)과 혼합한 후, 가습기로 상대습도 90~100%RH를 유지하면서, 폴리락트산제 마이크로니들(높이 약300㎛, 밀도 841개/cm², 사각뿔형상)에 코팅했다. 코팅 함량은 각 항원 0.3㎍/patch로 하고, 4주령의 ddY 마우스(암컷)에게 마취하에서 복부 제모후, 코팅 마이크로니들을 피부에 2시간 천자 투여했다. 일부 투여후에 애쥬번트액(라우릴알코올)을 투여 부위에 적하한 후, 마찬가지로 2시간 천자 투여했다. 피하투여군은 배부 피하에 1㎍/50μL/head를 투여했다. 1주일후에 동 조건에서 부스트하고, 그 1주일후에 채혈후 3가의 항체가를 측정했다. 마찬가지로, 상기 백신을 상기 마이크로니들에 대한 코팅량의 3배분을 주사에 의해 피하투여하여 항체가를 측정했다. 표 1에 그 결과를 나타낸다.

(인플루엔자 바이러스HA항원의 조정)

유정란(수정란)을 부란기내에서 약11일간, 38~39℃로 보온하고, 배의 발생을 확인한 후, 난각에 주사침이 통과할 정도의 구멍을 뚫고, 그곳으로부터 장뇨액에 백신 제조주인 인플루엔자 바이러스(A/Hiroshima(H3N2), A/New Caledonia(H1N1) 및 B/Malaysia)를 직접 주입하고, 그 구멍을 막고, 다시 부란기에 되돌려, 32~36℃에서 3일정도 보온했다. 그 후, 바이러스 접종란을 냉장고에 하룻밤 넣고, 난각을 잘라내어, 장뇨액을 무균적으로 채취했다. 채취액중의 혈액 등의 혼입물을 제거한 후, 조날 원심기를 사용한 자당밀도구배원심법에 의해 바이러스 입자를 정제 농축했다. 이 인플루엔자 바이러스 부유액을 에틸 처리하고, 그 후에 포르말린을 첨가했다.

이상과 같이 조정한 3주의 인플루엔자HA항원량을 생물학적제제기준(후생노동성)의 인플루엔자HA백신에 기재된 역가시험법중, 일원방사면역확산시험법에 따라 측정하고, 이것을 혼합, 희석하여 인플루엔자HA백신으로 했다.

(HI항체가의 측정)

마우스 혈청중의 HI항체가의 측정은 3주의 HA항원(A형(H1N1)주, A형(H3N2)주 및 B형주)마다 이하에 나타내는 방법으로 행했다.

우선, 마우스 혈청 100μL의 전처리에 의해 비특이적 적혈구 저해 활성 및 적혈구 자연 응집소를 제거했다. 다음에 전처리후의 10배 희석 마우스 혈청을 마이크로 플레이트상에서, PBS를 사용하여 10배 내지 640배까지 2배 계단 희석(25μL/well)하고, 이것에 미리 4배의 적혈구 응집 활성으로 조정해 둔 HA항원액(인플루엔자HI시약 「세이켄」, 덴카세이켄 가부시키가이샤)을 등량(25μL/well) 첨가했다. 이것을 믹서로 잘 진탕한 후, 실온에서 1시간 정치하고, 0.5% 닭 혈구부유액을 50μL씩 각 well에 첨가했다. 실온에서 1시간 정치한 후, 적혈구 응집 저해를 일으킨 최고 희석 배율을 측정하여 HI항체가로 했다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명 마이크로니들 디바이스를 사용함으로써 투여 항원량이 1/3로 피하투여와 거의 동등한 효과를 나타내는 것이 판명되었다. 이것으로부터 본 발명 마이크로니들 디바이스 투여에 의해, 주사에 의한 피하투여에 비해, 약3배의 효율적인 HI항체가의 상승이 확인되었다.

또한, 라우릴알코올을 애쥬번트로서 병용함으로써 A형의 HI항체가가 상승함과 아울러, 지금까지 HI항체가가 상승하기 어려웠던 B형(일본약국방 생물학적제제 인플루엔자HA백신 참조)에도 현저한 효과를 나타내는 것이 판명되었다.

(실험예 2)

이하와 같이 조정한 A형(H1N1)주를 유효성분으로 하는 항원을 포함하는 인플루엔자HA백신을 BIOMAX-10K(밀리포어사제)를 사용하고, 원심분리에 의해 농축하여, 고분자 폴리머(풀루란)와 혼합한 후, 상대습도 90~100%RH의 조건하에서, 상기 혼합액을 폴리락트산제 마이크로니들(높이 약300㎛, 밀도 841개/cm², 사각뿔형상)에, 함량 0.3㎍/patch로 코팅했다.

10주령의 ddY 마우스(암컷)를 마취하에서 복부 제모후, 상기한 마이크로니들을 마이크로니들 투여군으로서 피부에 2시간 천자 투여했다. 1주간후, 또한 1주간후의 합계 2회로 동일조건에서 부스트하고, 또한 2주간후에 채혈 및 비강과 폐세정을 행했다.

한편, 피내투여군으로서 인플루엔자HA백신/PBS를 배부 피하에 3㎍/50μL/head를 투여하고, 1주간후, 또한 1주간후의 합계 2회로 동일조건에서 부스트하고, 또한 2주간후에 채혈했다.

상기에서 얻어진 혈청으로부터 하기 방법에 의해 IgG항체가를 측정하고, 비강 및 폐세정의 세정액으로부터, 하기 방법에 의해 IgA항체가를 측정했다(n=4).

(실험예 3)

미사용분의 마이크로니들로부터, 항원을 추출하고, 단백을 정량하고, HA환산에 의해 산출한 결과, 투여 1회째:2.5㎍, 2회째:1.5㎍, 3회째:3.9㎍이었기 때문에, 동등량의 항원을 피하투여군에 투여했다.

동물에 대한 투여는 마우스(ddY/암컷/4W)의 복부를 투여 전날에 제모하고, 투여 당일 넴뷰탈 마취하에서 천자 부위를 알코올솜으로 소독하고, 마이크로니들을 5초간 손가락으로 눌러, 5 혹은 120분간 테이프를 감아 마이크로니들을 고정했다. <군 구성 : (1)피하투여(4마리), (2)마이크로니들 5분간 투여(5마리), (3)마이크로니들 120분간 투여(5마리)>

투여 스케줄은 초회 투여의 2, 4주간후의 합계 3회 투여하고, 채혈은 2, 4, 5주간(2w, 4w, 5w)후에 행했다. 채혈후, ELISA로 인플루엔자 항원 특이적 항체가(IgG)를 측정했다. 또, 5주간(5w)후의 혈청에 있어서는 HI항체가를 측정했다.

도 5는 인플루엔자 백신 투여후의 시간 경과에 있어서의 개별항체가의 측정 결과의 일례를 나타내는 그래프이다. 도 6은 인플루엔자 백신 투여후의 항체가의 추이의 일례를 나타내는 그래프이다. 도 5 및 도 6에 나타내는 바와 같이, 마우스에 대한 5 및 120분간 마이크로니들(MN) 천자 투여후의 IgG항체가에 큰 차는 없었다. 또한, 피하투여(s.c.)와 거의 동등한 효과였다. 또, 표 2에 나타내는 바와 같이, 마우스에 대한 5 및 120분간 마이크로니들(MN) 천자 투여후의 HI항체가에 있어서도 거의 동등하며, 피하투여(s.c.)군과 비교하여 동일 수준인 점에서, 5분간의 천자 투여로 충분한 HI항체가를 기대할 수 있다고 생각된다.

(IgG항체가의 측정)

채혈한 혈액으로부터 혈청을 분리하고, 비동화(56℃, 30분간 처리)한 것을 검체로서 사용한다. 코팅 버퍼에 의해 0.2㎍/mL로 희석한 바이러스 항원을 100μL/well로 well에 첨가하고, 4℃, 하룻밤 정치했다. 고상화한 플레이트를 세정 버퍼 300μL/well로 3회 세정하고, 블로킹 버퍼를 300μL/well 첨가하여, 37℃, 15분 반응했다. 그 후, 세정 버퍼 300μL/well로 3회 세정하고, 희석 버퍼에서 100배 희석하고, 2배 계열로 단계 희석한 검체를 각 100μL/well 첨가하여, 37℃, 1시간 반응시켰다.

다음에, 세정 버퍼 300μL/well로 3회 세정하고, 희석한 HRP표식 항마우스 IgG항체 100μL/well을 첨가하여, 37℃, 1시간 반응시켰다. 버퍼 300μL/well로 3회 세정하고, ABTS Peroxidase Substrate 용액을 100μL/well 첨가하고, 암소에서 실온, 30분간 반응후, Peroxidase Stop Solition을 100μL/well 첨가하여 반응을 정지하고, 405nm의 흡광도를 측정했다.

코팅 버퍼;0.05M탄산 버퍼(pH9.5)

세정 버퍼;0.05% Tween20 함유 PBS(PBS-T)

블로킹 버퍼;1% BSA 함유 PBS

희석 버퍼;1% BSA 함유 PBS-T

(IgA항체가의 측정)

비강 및 폐 세정액을 검체로 한다. 코팅 버퍼에 의해 0.1㎍/mL로 희석한 바이러스 항원을 100μL/well로 well에 첨가하고, 4℃, 하룻밤 정치했다. 고상화한 플레이트를 세정 버퍼 300μL/well로 3회 세정하고, 블로킹 버퍼를 300μL/well 첨가하여, 37℃, 15분 반응했다. 그 후, 세정 버퍼 300μL/well로 3회 세정하고, 희석 버퍼에서 2배 희석하고, 검체를 각 100μL/well 첨가하여, 37℃, 1시간 반응시켰다.

다음에, 세정 버퍼 300μL/well로 3회 세정하고, 희석한 HRP표식 항마우스 IgA항체 100μL/well을 첨가하여, 37℃, 1시간 반응시켰다. 버퍼 300μL/well로 3회 세정하고, ABTS Peroxidase Substrate 용액을 100μL/well 첨가하고, 암소에서 실온, 30분간 반응후, Peroxidase Stop Solition을 100μL/well 첨가하여 반응을 정지하고, 405nm의 흡광도를 측정했다.

코팅 버퍼;0.05M 탄산 버퍼(pH9.5)

세정 버퍼;0.05% Tween20 함유 PBS(PBS-T)

블로킹 버퍼;1% BSA 함유 PBS

희석 버퍼;1% BSA 함유 PBS-T

IgG항체가에 대해서는, 마이크로니들 투여군과 피내투여군과의 비교를 도 2에 나타낸다. 또, IgA항체가에 대해서는, 항원투여를 행하지 않는 군을 컨트롤군으로 하고, 그것과 마이크로니들 투여군과의 비교를 도 3(비강), 도 4(폐)에 각각 나타낸다.

(실험예 4)

이하와 같이 조정한 A형(H1N1)주를 유효성분으로 하는 항원을 포함하는 인플루엔자HA백신을 BIOMAX-10K(밀리포어사제)를 사용하고, 원심분리에 의해 농축하여, 고분자 폴리머(풀루란)와 혼합한 후, 상대습도 90~100%RH의 조건하에서, 상기 혼합액을 폴리락트산제 마이크로니들(높이 약300㎛, 밀도 841개/cm², 사각뿔형상)에, 함량 0.3㎍/patch 혹은 3㎍/patch로 코팅했다.

4주령의 ddY 마우스(암컷)에게 마취하에서 복부 제모후, 코팅 마이크로니들을 피부에 2시간 천자 투여했다. 대조로 동일 용량(0.3 혹은 3㎍HA/head)으로 피하투여 및 피내투여했다. 3주간후에 동일 조건에서 부스트하고, 그 2주간후에 채혈하여, HI항체가를 측정했다.

도 7은 HI항체가의 측정 결과의 일례를 나타내는 그래프이다. 마이크로니들(MN)을 사용함으로써 0.3 및 3㎍HA/head군 모두 피하투여(SC)와 동등 혹은 그 이상의 항체가를 나타내는 것을 알 수 있었다. 3㎍HA/head군에 있어서는, 피내투여(IC)와 동일 정도의 항체가를 나타냈다. 피하투여의 3㎍HA/head에서는 모두 방어 반응을 나타내기에 충분한 항체가를 나타낸다. 한편, 0.3㎍HA/head에서는 1예, 다소 낮은 HI항체가(20)의 것이 관찰되었다.

본 발명은 이하의 것을 포함한다.

(1) 기판에 이차원형상으로 배치된 피부를 천공 가능한 폴리락트산으로 이루어지는 복수의 마이크로니들을 구비하고, 이 마이크로니들에, A형주 및 B형주로 이루어지는 인플루엔자 바이러스 항원이 코팅된 마이크로니들 디바이스.

(2) 상기 마이크로니들이 원뿔형 또는 각뿔형인, 상기 (1)에 기재된 마이크로니들 디바이스.

(3) 상기 코팅이 코팅 담체로서 풀루란을 포함하는, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 마이크로니들 디바이스.

(4) 상기 코팅이 실온에서의 상대습도 70.0~100%RH에서 행해지는, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 마이크로니들 디바이스.

(5) 상기 코팅이 애쥬번트 활성을 가지는 물질을 포함하는, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 마이크로니들 디바이스.

(6) 상기 애쥬번트 활성을 가지는 물질이 라우릴알코올인, 상기 (5)에 기재된 마이크로니들 디바이스.

(7) 상기 마이크로니들 디바이스의 기판이 인플루엔자 바이러스 항원액 또는 인플루엔자 바이러스 항원 용해액을 전달 가능한 복수의 개구부를 가지는 것인, 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 마이크로니들 디바이스.

(8) 상기 마이크로니들의 높이가 200~500㎛인, 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 마이크로니들 디바이스.

(9) 상기 마이크로니들이 400~1000개/cm²의 밀도로 배치되는, 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 마이크로니들 디바이스.

(10) 기판에 이차원형상으로 배치된 피부를 천공 가능한 폴리락트산으로 이루어지는 복수의 마이크로니들에, A형주 및 B형주로 이루어지는 인플루엔자 바이러스 항원을 코팅하여 이루어지는 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성(奏功性)을 상승시키는 방법.

(11) 상기 마이크로니들 디바이스의 투여 시간이 4분~180분의 사이인 상기 (10)에 기재된 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성을 상승시키는 방법.

(12) 상기 마이크로니들이 원뿔형 또는 각뿔형인, 상기 (10) 또는 (11)에 기재된 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성을 상승시키는 방법.

(13) 상기 코팅이 코팅 담체로서 풀루란을 포함하는, 상기 (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성을 상승시키는 방법.

(14) 상기 코팅이 실온에서의 상대습도 70.0~100%RH에서 행해지는, 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성을 상승시키는 방법.

(15) 상기 코팅이 애쥬번트 활성을 가지는 물질을 포함하는, 상기 (10) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성을 상승시키는 방법.

(16) 상기 애쥬번트 활성을 가지는 물질이 라우릴알코올인, 상기 (15)에 기재된 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성을 상승시키는 방법.

(17) 상기 마이크로니들 디바이스의 기판이 인플루엔자 바이러스 항원액 또는 인플루엔자 바이러스 항원 용해액을 전달 가능한 복수의 개구부를 가지는 것인, 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성을 상승시키는 방법.

(18) 상기 마이크로니들의 높이가 200~500㎛인, 상기 (10) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성을 상승시키는 방법.

(19) 상기 마이크로니들이 400~1000개/cm²의 밀도로 배치되는, 상기 (10) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 마이크로니들 디바이스에 의한 인플루엔자 백신의 주공성을 상승시키는 방법.

(산업상 이용가능성)

본 발명은 마이크로니들 디바이스를 사용함으로써, 효율적이며, 게다가 간편한 조작으로 A형(H1N1)주, A형(H3N2)주 및 B형주를 유효성분으로 하는 항원으로 이루어지는 인플루엔자 백신의 3가 전부의 아형의 항원성을 상승시키는 것을 가능하게 하는 것이며, 산업상의 이용가능성이 있다.

1…코팅
5…마이크로니들 디바이스
6…마이크로니들
7…개구부
8…마이크로니들 기판

Claims

기판에 이차원형상으로 배치된 피부를 천공 가능한 폴리락트산으로 이루어지는 복수의 마이크로니들을 구비하고, 이 마이크로니들에, A형주 및 B형주로 이루어지는 인플루엔자 바이러스 항원이 실온에서의 상대습도 70.0~100%RH에서 코팅된 것을 특징으로 하는 마이크로니들 디바이스.
제 1 항에 있어서, 상기 마이크로니들이 원뿔형 또는 각뿔형인 것을 특징으로 하는 마이크로니들 디바이스.
제 1 항에 있어서, 상기 코팅이 코팅 담체로서 풀루란을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로니들 디바이스.
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제 1 항에 있어서, 상기 코팅이 애쥬번트 활성을 가지는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로니들 디바이스.
제 5 항에 있어서, 상기 애쥬번트 활성을 가지는 물질이 라우릴알코올인 것을 특징으로 하는 마이크로니들 디바이스.
제 1 항에 있어서, 상기 마이크로니들 디바이스의 기판이 인플루엔자 바이러스 항원액 또는 인플루엔자 바이러스 항원 용해액을 전달 가능한 복수의 개구부를 가지는 것인 것을 특징으로 하는 마이크로니들 디바이스.
제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로니들의 높이가 200~500㎛인 것을 특징으로 하는 마이크로니들 디바이스.
제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로니들이 400~1000개/cm²의 밀도로 배치되는 것을 특징으로 하는 마이크로니들 디바이스.
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