KR101565886B1

KR101565886B1 - 난소과자극증후군의 진단 방법 및 키트

Info

Publication number: KR101565886B1
Application number: KR1020130152325A
Authority: KR
Inventors: 전상영; 박재일; 장유지; 정성은
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2013-10-23
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2015-11-05
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: KR20150047065A

Abstract

본 발명은 난소과자극증후군의 진단 방법 및 진단 키트를 제공한다. 본 발명에서의 인터루킨-11은 난소과자극증후군에 대한 마커로서의 정확성 및 신뢰도를 갖는 마커이다. 또한, 본 발명은 난소과자극증후군 환자의 난포액에서만 특이적으로 발현이 증가되는 인터루킨-11을 이용하여 생물학적 시료로부터 매우 특이적으로 난소과자극증후군의 조기 진단 및 예후를 판정할 수 있다.

Description

난소과자극증후군의 진단 방법 및 키트{Method and Kit for Diagnosting of Ovarian Hyperstimulation Syndrome}

본 발명은 난소과자극증후군의 진단 방법 및 키트에 관한 것이다.

배란은 성숙 난모세포 및 주위의 체세포에 의해 진행되는 특이한 생물학적 과정으로 난구세포복합체(cumulus cell-oocyte complex, COC)가 수송 및 수정되기 위해 난관 내 난소표면으로부터 방출되는 것을 의미한다(Richards et al., 2008). 배란은 배란 전 고나도트로핀의 급증에 의해 시작되며, 수정가능한 난모세포가 난소 표면 위 난포 내부로부터 노출될 때 완료된다(Bret al., 2002).

배란은 염증 반응과 유사하다(Espey et al., 1980; Hutchinson et al., 2011). 난포는 많은 양의 프로스타글란딘(prostaglandins, PGs)(주로 PGE2)을 생성하고, 조직 염증반응 및 상처 복구가 있는 부위에서 생성되는 것과 비슷하게 히알루로난(hyaluronan, HA)-풍부 매트릭스를 합성하며, 혈관 발달이 증가되어 충혈(hyperemic)된다(Richards et al., 2008). 몇몇 사이토카인들은 난소에서 스테로이드 합성, 프로스타글란딘 생성 및 고나도트로핀 수용체 유도의 측분비(paracrine) 및 자가분비(autocrine) 조절자로서의 생리학적 활성을 갖는다(Adashi et al., 1990; Bret al., 1994). 특히, 사이토카인들은 배란 과정에 연결되어있다(Bret al., 1993).

난소과자극증후군(Ovarian Hyperstimulation Syndrome; OHSS)은 생식샘자극호르몬에 의한 난소과자극 주기를 조절하는 여성에게 유발되는 심각한 합병증으로 잘 알려져 있다. 의원성 조건은 혈관내 부피 감소, 혈농축, 백혈구 증가, 요량 감소증 및 전해질 불균형과 결합된 다낭성 난소확장, 빠른 증체량, 심각한 혈관외액 축적을 포함하는 임상적 및 실험적 징후의 넓은 스펙트럼이 특징이다(Whelan et al., 2000). 배란과 관련된 몇몇의 매개자는 에스트로겐, 히스타민, 사이토카인, 프로스타글란딘 및 레닌-안지오텐신 시스템(renin-angiotensin system)과 같은 OHSS를 유도하는 요소로 제안되었다(Bergh et al., 1992; Morris et al., 1994). VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)는 OHSS 진행의 중요한 원인 인자와 관련된다(Brinsden et al., 1995; Abramov et al., 1997). OHSS의 발생은 외인성 투여 또는 내인성 hCG(human Chorionic gonadotrophin), 또는 드물게 황체형성 호르몬이 주요한 인자인 것으로 보고되었다(Lancet, 1991). OHSS 환자에서 지혈시스템의 변화는 혈전증 위험을 증가시키는데 기여하는 것으로 보고되었고, 소수의 연구에서 심각한 OHSS의 여성에서 지혈 시스템의 변화와 관련된 기작이 조사되었다(Ellis et al., 1998; Dulitzky et al., 2002). 특히, 원형질 조직 인자 및 TFPI의 역할은 아직 규명되지 않았다. 활성화된 인자 Ⅶ(FⅦa)와 결합된 조직 인자는 정상 및 병리학적 조건에서 혈액 응고를 개시하는데 중요한 역할을 한다(Semeraro et al., 1997). 전염증 사이토카인 및 성장인자로 활성화된 단핵백혈구, 내피세포 및 혈관평활근세포에서 조직 인자(Tissue Factor; TF)의 발현이 유도된다(Nemerson et al., 1995).

인터루킨-11(IL-11)은 골수 기질 세포에서 방출되는 수용성 인자로서 처음 확인되었으며, IL-6 의존적 세포의 증식을 자극하는 능력을 갖는다(Paul et al., 1990). IL-11은 뇌, 척수뉴런, 내장 및 고환을 포함한 여러 기관에서 발현되며 활성을 나타낸다(Du et al., 1997). IL-11은 사이토카인 gp130 패밀리의 하나이다. IL-11은 리간드-특이적 α 체인(IL-11Rα)으로 구성된 헤테로다이머 수용체를 통해 신호전달을 하는 사이토카인이며, 면역 주효 세포(immune effector cells)의 기능 조절을 통해 항염증 사이토카인으로서 작용한다(Trepicchio et al., 1998).

IL-11은 기질세포보다 상피세포를 포함하는 자궁내막 세포의 배양액에서 더 많이 분비되는 것으로 알려져 있다(Cork et al., 2001). 또한, IL-11는 인간 난포액에서 검출되었으나 난소에서의 기능에 대해서는 알려진 바 없다(Branisteanu et al., 1997). 현재까지 배란 동안 IL-11의 기능 연구에 대한 보고는 없었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 난소과자극증후군을 신속하고 정확하게 분자 진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 난소과자극증후군 환자의 난포액에서 인터루킨-11 농도가 현저히 증가된다는 것을 실험적으로 규명하였으며, 이를 근거로 난포액에서의 인터루킨-11 발현 수준 측정이 난소과자극증후군 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 난소과자극증후군의 진단방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 난소과자극증후군 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 체외로 분리된 동물의 난포액에서 인터루킨-11(interleukin-11)의 발현양을 측정하는 단계를 포함하는 난소과자극증후군(ovarian hyperstimulation syndrome)의 진단방법을 제공한다.

본 발명자들은 난소과자극증후군을 신속하고 정확하게 분자 진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였고 그 결과, 난소과자극증후군 환자의 난포액에서 인터루킨-11 농도가 현저히 증가된다는 것을 실험적으로 규명하였으며, 이를 근거로 난포액에서의 인터루킨-11 발현 수준 측정이 난소과자극증후군 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 난포액에서 인터루킨-11의 발현 수준의 증가와 난소과자극증후군과의 상관성에 기초한다. 즉, 난소과자극증후군의 발생 시에 생물학적 시료(특히, 난포액)에서 인터루킨-11은 이의 항상적(constitutive) 발현 수준 이상으로 발현이 증가하는 발현 패턴을 보인다. 본 명세서에서 난소과자극증후군으로 인한 인터루킨-11 발현의 증가는 항상적 발현 수준과 비교하여 이보다 높은 수준으로 발현되는 것을 의미한다.

본 발명에서 난소과자극증후군에 대한 바이오마커로 사용되는 인터루킨-11의 mRNA/DNA 서열(서열목록 제1서열) 및 단백질 서열(서열목록 제2서열)은 GenBank 접근 번호 AY207429에 공지되어 있다.

본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법은 체외로 분리된 인간의 난포액 내 인터루킨-11의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 진단방법을 적용하고자 하는 “대상자(subject)”는 난소과자극증후군을 겪을 것으로 추정되어 난소과자극증후군 여부를 진단하고자 하는 대상자를 의미한다.

본 명세서에서 상기 용어 “난소과자극증후군”은 불임 치료를 목적으로 성선자극호르몬(gonadotrophin)을 사용하여 과배란을 유도할 때 발생하는 의인성(iatrogenic) 합병증을 의미하며, 양측 난소의 크기 증가와 복수(ascites)로 인한 복부 팽만감(abdominal distension)이 특징적이며, 그 외 흉수(hydrothorax), 혈액 농축에 따른 혈전증 (thrombosis), 간기능 장애, 신장기능의 저하, 호흡부전 등을 동반한다.

본 발명의 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 방법에서 상기 인터루킨-11은 정상 난포액 시료에서의 발현 수준에 비해 난소과자극증후군 난포액 시료에서의 발현 수준이 증가되어 있다. 본 발명의 방법에서 난포액 시료에서의 인터루킨-11의 발현 수준이 이의 항상적 발현수준 보다 증가되어 있으면 난소과자극증후군으로 진단한다.

본 발명의 진단방법은 항원-항체 반응, 마이크로어레이 또는 유전자 증폭 방식으로 실시할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 난소과자극증후군 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 난소과자극증후군을 진단하는데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C₁₄, I₁₂₅, P₃₂ 및 S₃₅)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 인터루킨-11 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed. Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355 (6360):5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727 (1998) 에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 난소암을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 마커의 단백질이 고발현 되어 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 난포액) 보다 강하게 나오는 경우에는 난소과자극증후군으로 진단된다.

본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법은 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 인터루킨-11의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 난소과자극증후군 여부를 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 난포액이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 인터루킨-11의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 난소과자극증후군 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 인터루킨-11의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 정상 난포액)보다 약하게 나오는 경우에는 난소과자극증후군으로 진단된다.

본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법은 유전자 증폭 방식에 의해 실시될 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 인터루킨-11의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 인터루킨-11의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 난포액)에서 본 발명의 인터루킨-11의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 인터루킨-11의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 인터루킨-11의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 인터루킨-11의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 체외로 분리된 동물의 난포액에서 본 발명의 인터루킨-11의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(정상 난포액)보다 낮게 나오는 경우에는 난소과자극증후군으로 진단된다.

따라서 본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법은 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 인터루킨-11의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 인터루킨-11 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 (b) 인터루킨-11 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 난소과자극증후군 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 난소과자극증후군 진단용 키트는 면역분석용 키트, 마이크로어레이 키트 또는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 인터루킨-11 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어“상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적 (perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 발명의 유전자 증폭 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 난소과자극증후군 진단용 키트는 상기 언급된 면역분석법 또는 혼성화법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 난소과자극증후군의 진단 방법 및 진단 키트를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명에서의 인터루킨-11은 난소과자극증후군에 대한 마커로서의 정확성 및 신뢰도를 갖는 마커이다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 난소과자극증후군 환자의 난포액에서만 특이적으로 발현이 증가되는 인터루킨-11을 이용하여 생물학적 시료로부터 매우 특이적으로 난소과자극증후군의 조기 진단 및 예후를 판정할 수 있다.

도 1은 랫트에서 난소과자극증후군을 유도하는 방법에 대한 모식도이다.
미성숙 랫트에 10 IU PMSG를 연속 4일 동안 투여하고, 그 다음 30 IU hCG를 투여함. 대조군 랫트는 10 IU PMSG를 4일 연속 투여하고, 5일째에 살린을 투여함.
도 2는 고나도트로핀 자극 후 랫트 난소에서 IL-11 유전자 발현을 측정한 결과이다.
A, 랫트 IL-11 cDNA 프로브를 이용하여 노던 블롯팅을 수행하여 난소 총 RNA(20 μg)를 분석함. 28S rRNA의 발현은 내부 표준 대조군으로 사용됨. 결과는 3번의 독립적인 실험에 대하여 나타냄. B, 배란 전 난포로부터 분리한 난포막 세포(TC) 및 과립막 세포(GC)에서 IL-11의 발현 정도를 실시간 PCR 방법으로 측정함. C, IL-11 mRNA의 인 시투 위치를 관찰한 결과임. ³⁵S-표지 랫트 IL-11 cRNA 프로브와 난소 절편을 혼성화함. 난포막 세포에서의 IL-11 발현은 난포 크기와 관계없음을 나타냄. 현미경사진은 명 시야 및 암 시야 조건에서 촬영함(P, 배란 전 난포; G, 성장하는 난포; 화살표, 난포막 세포).
도 3은 인 비보에서 배란-억제 억제제에 의한 hCG-유도 IL-11 발현 조절을 측정한 결과이다.
억제제(RU486, 프로게스테론 수용체 안타고니스; 인도메타신, 사이클로옥시제나제 억제제; NDGA, 리폭시게나제 억제제; GW9662, PPARγ 안타고니스트)는 hCG 투여와 동시에 주사함. 난소 내 IL-11 발현 정도는 실시간 PCR로 측정함. 결과는 2번의 독립적인 실험에 대하여 ‘평균±표준오차’로 나타냄.
도 4는 인 비트로에서 배양한 배란 전 난포에서 LH-자극 IL-11 발현에 대한 신호전달 과정을 규명한 결과이다.
배란 전 난포는 LH가 존재하거나(200 ng/ml) 존재하지 않는 조건(C, 대조군)에서 H-89(10 μM; PKA 억제제), MDL-12,330A (30 μM; PKA 억제제), U73122 (10 μM; PLC 억제제), U0126 (10 μM; MEK 억제제), 스타우로스포린(100 nM; PKC 억제제) 및 LY294002(10 μM; PI3K 억제제)를 포함하는 신호전달 억제제를 처리 또는 처리하지 않으면서 6시간 동안 배양함. 결과는 2번의 독립적인 실험에 대한 값으로 나타냄.
도 5는 난소과자극증후군 랫트에서 IL-11의 난소 발현을 측정한 결과이다.
고용량으로 고나도트로핀을 투여하여 난소과자극증후군을 유도하고, 실시간 PCR 방법으로 발현 정도를 분석함. 난소과자극증후군 유도를 평가하기 위해 VEGF의 발현(A) 정도를 측정함. 결과는 3번의 독립적인 실험에 대하여 ‘평균±표준오차’로 나타냄.
도 6은 과립막 세포에서 IL-11에 의한 유전자 조절을 측정한 결과이다.
PMSG를 48시간 동안 투여한 미성숙 랫트의 난소로부터 수득한 배란 전 난포의 과립막 세포를 무혈청 배지에서 95% O_{2 ,}5% CO_2, 37℃에서 LH가 존재(200 ng/ml) 또는 존재하지 않고(C, 대조군), 재조합 인간 IL-11을 투여(100 ng/ml) 또는 투여하지 않는 조건에서 6시간 동안 배양함
도 7은 배란 전 난포에서 스테로이드 생성에 대한 IL-11의 효과를 측정한 결과이다.
배란 전 난포를 LH(200 ng/ml)가 존재 또는 존재하지 않는 조건(C, 대조군)에서 재조합 인간 IL-11을 농도별로 처리하여 12시간 동안 배양함. 배양 배지의 스테로이드 농도(평균±표준오차)는 RIA로 결정함. 결과는 2번의 독립적인 실험에 대하여 나타냄.
도 8은 인 비트로에서 배양한 배란 전 난포의 난구 확장에 있어서 IL-11이 미치는 영향에 대해 측정한 결과이다.
eCG를 투여한 랫트로부터 수득한 비확장 난구세포복합체를 EGF(100 μg/ml), FSH (100 ng/ml) 또는 IL-11 (100 ng/ml)를 포함하는 배지에서 배양함. 결과는 2번의 독립적인 실험에 대하여 나타냄.
도 9는 체외 수정(in vitro fertilization)을 진행 중인 환자의 난포액(follicular fluid, FF)에서 IL-11 레벨을 ELISA로 측정한 결과이다.
A, 난포액에서 IL-11의 레벨과 나이와의 관계는 선형 회귀 분석으로 확인함. B, 난소를 자극시킨 불임 여성(n = 38)의 난포액에서 IL-11 농도를 측정하고, 불임 인자와 난포액의 IL-11 농도를 플로팅(plotting) 함(C). 괄호안의 숫자는 샘플 수를 의미함. PCOS(다낭성난소증후군, polycystic ovarian syndrome), Tubal(난관이상), Endometriosis(자궁내막증)

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

실험동물

미숙 자성(immature female) Sprague-Dawley(Samtako, 한국) 랫트에 eCG(equine chorionic gonadotropin)(Sigma, 미국) 15 IU를 피하주사 하고 48시간 후에 hCG(human chorionic gonadotropin)(Sigma, 미국) 10 IU를 주사하여 과배란을 유도하였다. 실험동물은 광조건 및 암조건에 각각 14시간 및 10시간 노출하였으며 사료 및 물은 무제한 급이하였다. 모든 실험동물은 국립보건원 실험동물 관리규정에 따라 유지 및 관리하였으며, 전남대학교 동물실험윤리위원회로부터 사용을 승인받았다.

배란 억제제의 주사

hCG 투여 30 분전에 배란-중단 억제제를 피하주사하였다. 1 M 아세트산 및 9% 살린(Saline)에 희석된 DMSO에 프로게스테론 수용체 안타고니스트(RU486, Enzo Life Sciences Inc., 미국)를 용해하여 각 랫트에 1 ㎎/랫트의 농도로 200 ㎕씩 주사하였다. 사이클로옥시제나제(cycloxygenase)의 억제제인 인도메타신(indomethacin, Sigma, 미국)을 인도메타신 10 ㎎당 4 ㎎ Na₂CO₃을 포함하는 탄산나트륨 수용액에 용해하여 1 ㎎/랫트의 농도로 200 ㎕씩 주사하였다. 리폭시게나제(lipoxygenase)의 억제제인 노르디히드로구아이아레트산(Nordihydroguaiaretic acid; NDGA, Sigma, 미국)을 폴리에틸렌 글리콜 400 및 0.9% 살린 1:1(v/v) 혼합물에 용해하여 300 ㎎/㎏으로 200 ㎕씩 주사하였다. PPARγ 안타고니스트(GW9662, Sigma, 미국)를 DMSO(Dimethyl sulfoxide)/살린(1:100)에 용해하여 2 ㎎/㎏의 농도로 100㎕씩 주사하였다.

랫트에서 난소과자극증후군(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)의 유도

난소과자극증후군을 유도하기 위해, 미성숙 랫트(23 일령)을 10 IU PMSG로 연속 4일 동안 피하투여하고 30 IU hCG를 5일째에 투여하였다. 대조군 랫트는 10 IU PMSG로 연속 4일 자극하고 5일째에 살린을 투여하였다(도 1).

환자로부터 황체화과립세포 및 난포액 수득

체외수정을 위해 난소자극된 환자로부터 황체화과립세포을 포함하는 난포액을 흡입하였다. 실험과정은 임상시험심사위원회로부터 승인되었고 환자로부터 과립막세포의 사용에 대한 동의를 얻어 진행되었다. 난소 자극 과정은 공지된 방법을 이용하였다(Koga et al., 2000; Osuga et al., 1999). 각 환자로부터 얻은 난포 흡입물을 200 ×g로 5분 동안 원심분리를 실시하여 수득한 상층액을 -70℃에 보관하였다.

노던 블롯 분석

TRIzol 시약(Molecular Research Center Inc., 미국)을 사용하여 난소의 총 RNA를 추출하였다. 10 또는 20 ㎍의 총 RNA를 포름알데히드를 포함하는 1.2% 아가로즈 젤에 전기영동을 실시하여 분획하고 20×SSC(sodium citrate-sodium chloride)로 캐피러리 블럿팅(capillary blotting)하여 나일론 멤브레인에 트랜스퍼하였다. UV 가교 및 전혼성화(prehybridization) 후, 막을 50% 포르마마이드(formamide), 5×SSC, 1.6×Denhart's 수용액, 1 mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), 250㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA, 500 ㎍/㎖ 효모 tRNA(tansfer RNA) 및 ³²P-표지된 랫트 인터루킨-11 cDNA 프로브를 총 2-4 ×10⁶cpm 포함하는 용액에서 42℃로 항온반응하였다. 혼성화 후, 멤브레인을 65℃에서 1시간동안 0.5×SSC 및 0.1% SDS로 항온반응 한 후에 상온에서 2×SSC 및 0.1% SDS로 각 5분씩 2회 세척하였다. 멤브레인을 -70℃에서 7일 동안 Kodak RX 필름(Eastman Kodak Co., 미국)에 노출시켰다.

실시간 PCR 분석

제조사의 지시에 따라 TRIzol 시약(Molecular Research Center, 미국)을 사용하여 다양한 조건 하에서 총 RNA를 추출하였다. 분석에 사용된 특정 프라이머는 표 1에 기재하였다. PCR은 변성단계 95℃에서 1분, 어닐링단계 62℃에서 30초 및 신장단계 72℃에서 30초의 조건으로 실시하였다. 모든 데이터는 β-액틴 발현값으로 보정하였다. 실시간 PCR 분석은 QuantiTect SYBR GreenER PCR Kit(Qiagen) 및 Roter-Gene 6000 실시간 PCR 시스템을 이용하여 수행하였다.

인 시투 혼성화(In situ hybridization) 분석

랫트 난소는 4% 파라포름알데하이드를 포함하는 PBS에 4℃에서 6시간동안 고정시킨 후, 0.5 M 수크로오스를 포함하는 PBS에 하룻밤 동안 담갔다. 동결 절편(14 μm 두께)을 폴리-L-라이신(Sigma)이 코팅된 현미경 슬라이드에 마운팅하고, 4% 파라포름알데하이드를 포함하는 PBS에 고정시킨 다음, 분석할 때 까지 -70℃에 보관하였다. 혼성화 과정은 종래에 알려진 방법과 기본적으로 동일하였다. 요약하면, 절편에 0.2 M HCL, 2× SSC, 프로나아제 E(0.125 mg/mL), 4% 파라포름알데하이드 및 무수 아세트산을 포함하는 트리에탄올아민을 단계적으로 전처리하였다. 혼성화는 52-55℃ 조건에서 ³⁵S-표지된 랫트 인터루킨 11 cRNA 프로브(108 cpm/mL), 50% 포름아마이드, 0.3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1× Denhardt’s 용액, 10% 덱스트란 황산, 1 mg/mL 캐리어 트랜스퍼 RNA 및 10 mM 디티오트레이톨을 포함하는 혼합물을 이용하여 하룻밤 동안 실시하였다. 혼성화 반응 후, 37℃에서 리보누클레아제 A(25 mg/mL)를 30분간 처리하고 및 0.1× SSC를 처리하는 엄격한 조건하에서 슬라이드를 세척하였다. 슬라이드를 NTB-2 에멀젼(Eastman Kodak)에 살짝 담근 후, 2주 후 현상할 때까지 4℃에 보관하였다. 슬라이드는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 다음, 명(bright) 및 암 시야 조명을 갖는 광학현미경으로 관찰하였다.

배란 전 과립막세포의 배양

미숙 랫트에 eCG를 주사하고 48시간 후에 배란 전 난포로부터 과립막세포(granulosa cell)를 수득하였다. 배란 전 난포를 쉽게 확인하기 위해 난소를 홑겹(one layer)으로 편평하게 한 다음, 배란 전 과립막세포를 해부현미경 하에서 23-게이지 바늘을 이용하여 난포천자법(follicular puncture method)을 실시하였다. 튜브(Falcon, 미국) 당 1 × 10⁶ 세포를 분주하고, 항생제 및 0.1% BSA를 추가적으로 포함하는 DMEM/Ham’s F-12 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 및 가습조건에서 배양하였다.

방사면역분석법(Radioimmunoassay, RIA)

배란 전 난포를 배양한 다음, 추가적인 정제과정 없이 배양액의 스테로이드 호르몬 농도를 바로 측정하였다. 배양 배지의 프로게스테론 농도는 공지된 RIA 방법으로 결정하였고(Lee et al., 1999), 결과값은 난포 당 ng으로 표시하였다.

난구세포복합체(Cumulus oocyte complex, COC) 분리 및 배양

인 비트로에서 난구세포복합체를 확장(expansion) 시키기 위해, eCG-처리한 미성숙 랫트의 비확장(nonexpanded) 난구세포복합체(~10)를 5% 우태아혈청을 포함하는 난구세포복합체 배지(MEM, 25 mM HEPES, 0.25 mM 소듐 피루브산, 3 mM L-글루타민, 3 mg/ml BSA, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신) 50 μl가 담겨있는 Nunclon 4-웰 플레이트(Sigma)의 각 웰에 분주하였다. 하룻밤 동안 배양한 다음 현미경으로 관찰하여 확장 정도를 평가하였다.

ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 분석

인터루킨-11 농도의 측정은 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트(R&D Systems, 미국)를 사용하여 수행하였다. 모든 실험 과정은 제조사의 매뉴얼에 따라 실시하였다. 측정하기 전에 인간 난포액 샘플을 샘플 완충액으로 적절히 희석하였다.

통계 분석

결과는 적어도 3번의 독립적인 실험에 대하여 ‘평균±표준오차’로 나타내었다. 군 간의 유의한 차이는 그래프패드 프리즘 소프트웨어(미국)를 적용한 뉴먼-컬스(Neuman-Keuls) 시험법에 적용 후 ANOVA로 분석하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의성을 갖는다.

실험결과

난소에서 IL-11 유전자 발현 조절

난소에서 IL-11 유전자 발현 조절에 대해 알아보기 위해, 고나도트로핀 처리 후 시간대별로 난소로부터 수득한 총 RNA에 대해 노던 블롯팅 분석을 실시하였다. 도 2A에서 보는 바와 같이, PMSG-투여 랫트에 hCG를 주사한 결과, 6시간 이내에 IL-11 발현이 증가되었다. 처리 후 6시간에는 IL-11 mRNA 레벨이 대조군 레벨까지 감소되었다.

세포 타입별 IL-11 mRNA 레벨을 측정하기 위해, 분리한 난소 세포를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다(도 2B). 부분적으로 배란 전 난포의 난포막 세포에서 IL-11 mRNA 레벨이 높았으나 과립막 세포에서는 높지 않았다. IL-11 수용체는 과립막 세포 및 난포막 세포에서 발현되었다(도 2B). 세포 타입별 IL-11 mNRA 발현을 특징짓기 위해 랫트 IL-11에 대한 안티센스 및 센스 cRNA 프로브를 이용하여 인 시투 혼성화 분석을 실시하였다(도 2C). PMSG/hCG-자극 미성숙 랫트 난소에서 IL-11 전사체는 배란 전 난포의 난포막에서 높은 레벨을 나타냈다.

IL-11 발현 조절을 조사하기 위해, 배란-억제 억제제를 hCG 투여 시에 주사하였다(도 3). RU486(프로게스테론 수용체 안타고니스트), 인도메타신(사이클로옥시제나제의 억제제), NDGA(리폭시게나제의 억제제) 또는 GW9662(PPARγ 안타고니스트)의 처리는 IL-11 발현에 영향을 미치지 않았다.

신호전달 과정을 규명하기 위해, 배란 전 난포를 무혈청 조건에서 6시간 동안 배양하였다. H-89(10 μM; PKA 억제제), MDL-12,330A(30 μM; PKA 억제제), U73122(10 μM; PLC 억제제), U0126(10 μM; MEK 억제제), 스타우로스포린(100 nM; PKC 억제제) 또는 LY294002(10 μM; PI3K 억제제)의 처리는 LH-자극 IL-11 발현에 영향을 미치지 않았다(도 4). 흥미롭게도 MEK의 억제제인 U0126은 IL-11의 발현을 억제하였다. 이러한 결과는 배란 전 난포에서 LH-유도 IL-11 발현이 MEK 과정을 통해 매개된다는 것을 의미한다.

랫트 난소에서 IL-11의 발현은 난소과자극증후군(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)을 유도한다.

OHSS 랫트에서 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 발현이 증가된다는 것을 실험동물 모델에서 확인하였다(도 5A)(Get al., 2003). IL-11 발현은 OHSS 랫트에서 변화되지 않았다(도 5B). OHSS를 유도한 랫트 동물모델에서는 IL-11 발현과 OHSS와의 상관성을 확인할 수 없었으나, 하기 실험결과와 같이 불임여성 난포액에서의 IL-11 농도는 OHSS 환자와 유의적인 상관성을 나타낸다(도 9).

과립막 세포에서 IL-11에 의해 조절되는 유전자

LH 또는 IL-11 처리 후, 배란에 관여하는 유전자의 발현을 측정하였다. 신호 전달 분자 가운데, Alcam의 발현은 IL-11에 의해 증가되었다(도 6). 흥미롭게도, 전사인자 Runx1 또한 IL-11 처리에 의해 상향조절(up-regulation)되었다.

스테로이드 생산 및 난구 확장에 있어서 IL-11의 효과

배양 배지를 이용하여 스테로이드 생산에 미치는 IL-11의 영향을 측정하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, 프로게스테론 생산은 현저한 수준은 아니지만 배란 전 난포를 12시간 배양하는 동안 IL-11에 의해 조금 증가되었다. 에스트로겐 생산은 IL-11에 의해 변화되지 않았다. LH 처리는 프로게스테론 및 에스트로겐 생산을 자극시켰다.

난구 확장에 미치는 IL-11의 영향을 측정한 결과, EGF 또는 FSH에 의해 난구 확장이 유도되었으나, IL-11 처리에 의해서는 미미한 수준으로 난구 확장이 유도되었다(도 8).

체외 수정을 진행 중인 환자의 난포액에서 IL-11의 레벨

38명의 환자로부터 흡입하여 수득한 난포액을 포함하는 거시적으로 깨끗한 난모세포 총 38개에서 IL-11의 레벨을 ELISA를 통해 측정하였다. 환자 나이에 따른 IL-11 레벨의 연관성은 나타나지 않았으며(도 9A), IL-11 레벨은 임신한 여성과 임신하지 않은 여성 간에 큰 차이가 없었다(도 9B).

또한, 불임원인인자와 IL-11 농도의 상관성을 조사하였다(도 9C). 대조군으로 사용한 불임인자(male factor)는 과배란 유도 후 정자 직접주입법 (ICSI)을 통하여 IVF를 거친 환자로써 난소과자극증후군(OHSS) 환자의 난포액에서의 IL-11 농도와 통계학적 유의성을 지닌 차이점을 보였다. OHSS 환자의 난포액에서 IL-11 농도는 불임 인자를 갖는 환자보다 2배 가량 높았으며, 이는 IL-11을 OHSS를 유발하는 원인인자 중의 하나로 볼 수 있으며 OHSS의 바이오마커로 사용할 수 있다는 가능성을 시사한다. 다낭성난소증후군(PCOS, polycystic ovarian syndrome), 난관이상(tubal) 및 자궁내막증(endometriosis) 환자의 IL-11 농도는 male factor 환자와 차이점을 보이지 않았다.

논의

본 발명에 따르면, 배란을 유도하는 황체형성호르몬(luteinizing hormone)을 랫트에 투여한 결과 IL-11 발현이 배란기 난포의 난포막 세포에서 현저히 증가하였다. 이러한 결과를 바탕으로 IL-11이 배란을 조절하는 기능을 수행한다고 판단 할 수 있다. 그러나 IL-11은 스테로이드호르몬 생산과는 무관하였으며 난구 확장에도 영향을 미치지 못하였다. 흥미롭게도, 체외수정(IVF, in vitro fertilization)을 거치는 여성불임환자 중 난소과자극증후군의 난포액에서 IL-11 농도가 현저하게 높았으며, 이는 IL-11의 농도를 불임여성의 난포액에서 측정함으로써 난소과자극증후군을 진단할 수 있는 바이오마커로 사용할 수 있음을 시사한다.

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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interleukin 11 amino acid <400> 2 Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro 1 5 10 15 Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser 20 25 30 Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe 50 55 60 Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met 65 70 75 80 Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg 85 90 95 Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg 100 105 110 Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr 115 120 125 Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met 130 135 140 Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro 145 150 155 160 Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala 165 170 175 Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu 180 185 190 Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu 195

Claims

난소과자극증후군(ovarian hyperstimulation syndrome)에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 체외로 분리된 인간의 난포액에서 인터루킨-11(interleukin-11)의 양을 측정하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 인터루킨-11은 정상 난포액에서의 수준에 비해 난소과자극증후군 난포액에서 수준이 증가되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 인터루킨-11 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 (b) 인터루킨-11 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 난소과자극증후군 진단용 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 키트.