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KR101555523B1 - 산화질소 방출성 상처치료 필름 및 이의 제조방법 - Google Patents

산화질소 방출성 상처치료 필름 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR101555523B1
KR101555523B1 KR1020150026410A KR20150026410A KR101555523B1 KR 101555523 B1 KR101555523 B1 KR 101555523B1 KR 1020150026410 A KR1020150026410 A KR 1020150026410A KR 20150026410 A KR20150026410 A KR 20150026410A KR 101555523 B1 KR101555523 B1 KR 101555523B1
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Abstract

본 발명은 산화질소 방출성 상처치료 필름 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 인체에서 자발적으로 형성되는 산화질소 공여체인 s-나이트로글루타치온을 함유한 산화질소 방출성 필름이 인체에 적용할 수 있는 기계적 특성을 가질 뿐 아니라, 서서히 산화질소를 방출하며 상처 감염의 주원인이 되는 병원균을 억제하고 상처를 신속하게 치료할 수 있기 때문에 상기 필름은 상처치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산화질소 방출성 상처치료 필름 및 이의 제조방법{Nitric oxide-releasing films for wound healing and preparation method thereof}
본 발명은 상처 감염의 주원인이 되는 병원균을 억제하며 상처를 신속하게 치료할 수 있는 산화질소 방출성 상처치료 필름 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
우리 몸을 밖에서 감싸고 있는 피부는 일상생활에서 여러 가지 위험한 물리적 손상에 노출되어 있다. 따라서 피부의 기계적 손상, 타박상, 화상 등 우리 주위에서 많은 요인들로 인해 상처가 발생한다. 상처는 사람의 조직이 가지는 해부학적인 연속성이 외부의 작용에 의해 그 본래의 연속성을 상실한 상태를 말한다. 예를 들어 우리의 피부는 표피, 진피, 피하지방으로 이루어져 있는데, 베이거나 넘어지는 등의 외상에 의해서 이러한 표피나 진피, 피하지방 등의 연속성을 상실한 것을 상처라고 한다.
일반적으로 창상, 외상 등과 같은 피부의 상처를 효과적으로 치료하기 위하여 드레싱(Wound dressing)을 사용한다. 상처 치료용 드레싱이 가져야 할 특성으로는 상처와의 접촉면에서 적당한 습기의 유지능력이 필요하고, 상처분비물의 조절능력, 상처에 대한 드레싱의 부착 및 제거의 용이성, 외부의 상처부위간의 공기 및 수증기 관통성, 외부에 대한 상처부위의 단열성, 박테리아의 침입에 대한 저항성, 인체에 대한 무독성, 우수한 기계적 물성 등이 요구된다.
현재 가장 대중화된 상처의 치유 방법으로는 연고를 바르는 것인데, 가장 많이 사용되는 피부 상처 치유 촉진 제품으로는 마데카솔(동국제약), 센티카(삼진제약) 및 티나덱스(종근당) 등이 있다.
한국공개특허 제2002-0066024호
본 발명의 목적은 인체에서 자발적으로 형성되는 산화질소 공여체인 s-나이트로소글루타치온을 함유한 상처치료 필름 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산화질소 공여체를 고분자에 봉입시킨 것을 특징으로 하는 산화질소 방출성 상처치료 필름을 제공한다.
또한 상기 산화질소 공여체는 s-나이트로소글루타치온, 다이아제니윰다이올레이트(diazeniumdiolate), 유기질산염(organic nitrate) 및 철-나이트로실 복합체(iron-nitrosyl complexes)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한 상기 고분자는 키토산, 실리콘, 폴리우레탄 및 칼슘 알지네이트로 이루어진 군에서 선택된 생체적합성 고분자일 수 있다.
또한 상기 필름 100 중량%에 산화질소 공여체를 2.5 내지 30 중량%로 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 고분자를 용매에 용해시키고, pH를 조절한 후, 가소제를 첨가하여 고분자 용액을 준비하는 단계; 상기 고분자 용액에 산화질소 공여체를 첨가하고 교반하여 반응물을 준비하는 단계; 및 상기 반응물을 필름 형태로 주조하고, 암실 제습된 상태에서 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 산화질소 방출성 상처치료 필름의 제조방법을 제공한다.
또한 상기 산화질소 공여체는 s-나이트로소글루타치온, 다이아제니윰다이올레이트(diazeniumdiolate), 유기질산염(organic nitrate) 및 철-나이트로실 복합체(iron-nitrosyl complexes)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한 상기 고분자는 키토산, 실리콘, 폴리우레탄 및 칼슘 알지네이트로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한 상기 가소제는 폴리에틸린글리콜(polyethylene glycol), 솔비톨(sorbitol), 및 글리세롤(glycerol)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한 고분자 용액을 준비하는 단계에서 0.1 M의 초산 완충용액을 사용하여 pH 4.0 내지 pH 6.0로 조절할 수 있다.
또한 상기 고분자 용액 100 중량부에 대해 산화질소 공여체를 2.5 내지 30 중량부로 첨가할 수 있다.
또한 상기 건조는 25 내지 37 ℃에서 1 내지 2일 동안 건조할 수 있다.
본 발명에 따르면, 인체에서 자발적으로 형성되는 산화질소 공여체인 s-나이트로글루타치온(GSNO)을 함유한 산화질소 방출성 필름이 인체에 적용할 수 있는 기계적 특성을 가질 뿐 아니라, 서서히 산화질소를 방출하며 상처 감염의 주원인이 되는 병원균을 억제하고 상처를 신속하게 치료할 수 있기 때문에 상기 필름은 상처치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 키토산 필름(a)과 GSNO 필름(b)의 표면 형상을 나타낸 주사전자현미경(SEM) 사진이고,
도 2는 GSNO 필름(10), 키토산 필름(B), 키토산(C), GSNO(G) 및 GSNO와 키토산을 혼합한 혼합물(GC)의 열적 특성을 나타낸 것이고,
도 3은 GSNO 필름으로부터 NO 방출 프로파일을 나타낸 것이고,
도 4는 그램양성균과 그램음성균에 대한 NO 방출 필름의 항균 및 항바이오필름 효과를 나타낸 것이고,
도 5는 NO 방출 필름 적용에 따른 기간별 상처의 거시적 변화를 나타낸 것이고,
도 6은 NO 방출 필름 적용에 따른 상처 크기 감소 효과를 나타낸 것이고,
도 7은 NO 방출 필름 적용에 따른 상피화율을 나타낸 것이고,
도 8은 NO 방출 필름 적용에 따른 상처의 조직병리학적 소견을 나타낸 것이다(A~C: 거즈 대조군, D~F: NO 0 mg; G~I: NO 10 mg).
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자는 인체에서 자발적으로 형성되는 산화질소 공여체인 s-나이트로글루타치온(GSNO)을 함유한 산화질소 방출성 필름이 인체에 적용할 수 있는 기계적 특성을 가질 뿐 아니라, 서서히 산화질소를 방출하며 상처 감염의 주원인이 되는 병원균을 억제하고 상처를 신속하게 치료할 수 있음을 밝혀 내어 본 발명을 완성한 것이다.
이에, 본 발명은 산화질소 공여체를 고분자에 봉입시킨 것을 특징으로 하는 산화질소 방출성 상처치료 필름을 제공한다.
상기 산화질소 공여체는 s-나이트로소글루타치온, 다이아제니윰다이올레이트(diazeniumdiolate), 유기질산염(organic nitrate) 및 철-나이트로실 복합체(iron-nitrosyl complexes)로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 특히 인체에서 자발적으로 형성되어 무해면서 필름제조 과정 및 보관과정에서 안정성이 높은 s-나이트로소글루타치온을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
상기 고분자는 키토산, 실리콘, 폴리우레탄 및 칼슘 알지네이트로 이루어진 군에서 선택된 생체적합성 고분자일 수 있지만, 상처 분비물을 흡수하고 상처표면의 보습을 유지하면서 특히 자체적으로 상처 치료 효과를 나타내는 키토산인 것이 보다 바람직하다.
상기 필름 100 중량%에 산화질소 공여체를 2.5 내지 30 중량%로 함유할 수 있다. 산화질소 공여체는 고분자 용액과 혼합되어 건조된 이후에 산화질소(이하 'NO')를 방출하는 물질이고, 산화질소 공여체가 2.5 중량% 미만으로 첨가되는 경우 NO 방출량이 적어서 상처 치유 효과가 떨어지고 지속적으로 NO를 방출할 수 없으며, 30 중량%를 초과하는 경우에는 상처치료 필름의 제조의 전체 효율이 감소되며 기계적 물성 및 안정성이 감소될 수 있다.
또한, 본 발명은 용매증발법에 의한 산화질소 방출성 상처치료 필름의 제조방법을 제공한다. 보다 상세하게는, 상기 제조방법은 고분자를 용매에 용해시키고, pH를 조절한 후, 가소제를 첨가하여 고분자 용액을 준비하는 단계; 상기 고분자 용액에 산화질소 공여체를 첨가하고 교반하여 반응물을 준비하는 단계; 및 상기 반응물을 필름 형태로 주조하고, 암실 제습된 상태에서 건조시키는 단계를 포함한다.
일 실시예에 따르면, 상기 제조방법은 키토산과 같은 고분자를 용매에 용해시키고, 산성화제로 pH를 조절한 후, 글리세롤을 첨가하여 고분자 용액을 준비하는 단계; 상기 고분자 용액에 s-나이트로소글루타치온(이하 'GSNO')과 같은 산화질소 공여체를 첨가하고 교반하여 반응물을 준비하는 단계; 상기 반응물을 필름 형태로 주조하고, 암실 제습된 상태에서 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 고분자 용액을 준비하는 단계에서 초산 완충용액 0.1 M의 초산 완충용액을 사용하여 pH 4.0 내지 pH 6.0로 조절할 수 있다.
상기 고분자 용액을 약산으로 유지하여 산화질소 공여체를 혼합하는 경우 GSNO가 균질하게 고분자 용액에 혼합될 수 있으며, GSNO의 안정성에 영향을 미치지 않는다.
상기 가소제는 폴리에틸린글리콜(polyethylene glycol), 솔비톨(sorbitol), 및 글리세롤(glycerol)으로 이루어진 군에서 선택할 수 있으며, 상기 글리세롤은 상처치료 필름의 가용성을 증가시켜 기계적 물성을 증대할 수 있다.
상기 고분자 용액 100 중량부에 대하여 산화질소 공여체를 2.5 내지 30 중량부로 첨가하여 10분 내지 60분, 바람직하게는 20분 동안 교반할 수 있다. 만약, 상기 함량범위를 초과하여 산화질소 공여체를 첨가하면 상분리가 일어나 외관상의 문제 및 기계적 물성 저하와 같은 문제가 야기될 수 있다.
상기 건조는 25 내지 37℃에서 1 내지 2일 동안 건조할 수 있다. 만약, 상기 온도범위를 벗어나 건조하면 필름 투명도와 GSNO의 안정성에 문제가 야기될 수 있다.
특히, 주조된 필름을 건조할 때 암실, 제습 조건 하에서 건조하면 47%의 높은 산화질소 공여체의 로딩 효율을 나타내는 반면, 제습하지 않은 조건 하에서 건조하면 20% 이하의 산화질소 공여체의 로딩 효율을 나타내는 문제가 야기될 수 있다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> GSNO 합성
GSNO는 알려진 방법(Tetrahedron Lett, 1985; 26: 2013-6)에 따라 합성하였다. 즉, 환원성 L-글루타치온(Sigma Adlrich, MO, USA) 1.005 g을 4℃에서 2M HCl(Daejung)에 용해시켜 최종 농도가 0.625 mM인 용액을 제조하였다. 상기 용액에 질산나트륨(Sigma Adlrich, MO, USA) 220.6 mg을 첨가하고 30분 동안 아이스배스 상에서 교반하였다. 40 분 이후에 이렇게 얻어진 용액을 찬 80% 아세톤으로 침전시키고 20분 동안 교반하였다. 상기 교반된 용액을 4℃, 20,000g에서 30분 동안 원심분리 하였다. 얻어진 침전을 같은 조건으로 찬 100% 아세톤 20 mL를 첨가하여 원심분리하였다. 다시 얻어진 침전을 같은 조건으로 100% 디메틸에테르 20 mL를 첨가하여 원심분리하였다. 이렇게 얻어진 분홍색 파우더 GSNO를 24시간 동안 동결건조하여 -20℃에 보관하고, 이후 실험에 사용하였다.
<실시예 2> NO-방출 필름 제조
NO 방출 필름은 용매증발법을 이용하여 제조하였다. 즉, 키토산을 아세톤 완충액(100 mM)에 용해시키고, 초산을 이용하여 상기 용액의 pH를 4.4로 조정하였다. 상기 키토산 용액에 최종 농도 1%(w/w)가 되도록 글리세롤을 첨가하였다. 상기 용액에 10 mg의 GSNO를 첨가하고 20분 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 페트리디쉬에서 주조하고, 암실에서 제습기를 구비한 건조기에서 37℃, 2일 동안 건조시켰다. 이렇게 제조된 필름(이하 'CS/NO 필름')을 7℃, 진공 하에서 보관하며 사용할 때까지 암실에서 보관하였다. 이때, GSNO가 함유되지 않은 블랭크 필름을 대조군으로 제조하였다.
특히, 증발 촉진을 위하여 암실, 제습 조건 하에서 필름을 건조하였는데, 이렇게 암실, 제습 조건 하에서 필름을 건조할 경우 47%의 산화질소 공여체의 로딩 효율을 갖는 불그스름하고 투명하면서 균질한 필름을 얻을 수 있는 반면, 제습 조건 없이 건조오븐에서 건조하는 경우 20% 이하의 로딩 효율을 나타내었다.
한편in vivo 상처 치유 효과와 비교하기 위해 키토산이 아닌 다른 고분자를 담체로 하는 폴리비닐알콜(poly vinyl alcohol; PVA, Sigma Adlrich, MO, USA)을 고분자로 사용하고 열을 가하여 1%(w/w) PVA 용액을 제조하고, 상기 CS/NO 필름과 동일한 과정으로 필름을 제조하였다(이하 'PVA/NO 필름').
<실시예 3> NO-방출 필름의 특성 분석
1. 필름 두께
실시예 2에서 제조된 필름의 두께는 디지털 외측 마이크로미터(Bluebird Multinational Co.)를 이용하여 5개의 다른 위치(중심 및 4개의 코너)에서 측정하였다. 다섯 위치의 평균값을 필름의 두께로 사용하였다.
그 결과, 블랭크 필름과 NO 방출 필름의 중심 및 4개 코너 각각의 평균 두께는 61.2 ± 4.5 μm 및 64.6 ± 8.6 μm로 나타나 GSNO의 첨가에 의해 필름의 두께가 변화하지 않았다는 것을 확인하였다.
2. 주사전자현미경(SEM) 분석
실시예 2에서 제조된 CS/NO 필름의 표면 형상은 SEM(FE-SEM, S4800, Hitachi, Japan)을 이용하여 조사하였다. 1.5 x 1.5 cm2 크기의 샘플을 양면 탄소 테이프 상에 올리고, 진공 하에서 2분 동안 백금으로 코팅하였다. 이렇게 준비된 샘플을 1~5 kV의 가속 전압에서 FE-SEM 하에서 관찰하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 블랭크 필름은 균질하고 완만한 표면 형상을 나타내며, GSNO의 삽입에 의해 필름의 표면 형상에 변화가 없었다.
3. 열 특성
순수 GSNO, 블랭크 필름 및 CS/NO 필름의 열 특성은 시차주사 열량측정법(DSC; N-650, SCINCO, Korea)을 이용하여 측정하였다. 각 샘플은 동적 질소 분위기 하 30℃에서 200℃까지 온도를 변화시켜 5℃/min의 속도로 완전히 밀봉된 알루미늄 팬에서 가열되었다.
도 2에 도시된 바와 같이, GSNO는 195℃에서 강한 흡열 피크를 나타내었고, 키토산은 GSNO와 비교하여 약한 흡열 피크를 나타내었다. 그러나, GSNO의 흡열 피크는 CS/NO 필름에서는 관찰되지 않아 GSNO가 필름에 완전히 용해되어 분자적으로 사라진 것을 확인할 수 있었다. 두 필름의 폭넓은 흡열 피크는 140℃ 이하에서 관찰되었고, 이러한 피크는 습기 증발에 기인한 것이다.
4. 기계적 특성
실시예 2에서 제조된 CS/NO 필름의 기계적 특성을 분석하기 위하여, 인장시험기(Instron 3345, Instron, Norwood, MA)를 이용하여 인장강도(TS)와 파단 연신율을 평가하였다. 먼저, 준비된 필름을 특정 도그본 형상(길이 80 mm, 너비 30 mm)으로 잘랐다. 모든 시험은 10 mm/min의 신장율에서 수행하였고, 필름의 두께는 시험 바로 직전 캘리퍼를 이용하여 측정하였다. 파단 연신율(E%)은 샘플의 최초 길이(30 mm)와 파단시 연신 길이 간의 차이로부터 산출하였다.
표 1과 같이, 파단 연신율은 NO의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다. 블랭크 필름은 최초 길이에 비해 134.4 ± 11.5%까지 연신되었지만, NO 방출 필름은 단지 129.9 ± 18.1% 정도 기록되었다. 그러나, GSNO 첨가는 인장강도와 영률을 감소시켰다.
인장강도(MPa) 파단 연신율(%) 영률(MPa)
블랭크 7.87 ± 1.02 134.4 ± 11.5 7.18 ± 0.53
NO 10 mg 6.53 ± 0.70 129.9 ± 18.1 5.48 ± 0.31
5. NO 방출 분석
CS/NO 필름 50 mg에 대응하는 정사각형 모형으로 자른 후, 37℃에서 10 mL의 인산완충액(PBS, pH 7.4) 중에 담구었다. 필름으로부터 방출된 NO는 Griess 시약을 이용하여 분석하였다. 정해진 시간 간격으로 100 ㎕의 PBS를 취하고 신선한 PBS로 대체하였다. 적절한 희석 후, Griess 시약을 1:1의 비율로 희석 PBS와 반응시켜 얻어진 반응용액 100 ㎕를 96 웰플레이트에 가한 후 암실 실온에서 30분 동안 보관하였다. 540 nm에서 마이크로플레이트 리더를 이용하여 아질산염의 양을 측정하였다.
도 3과 같이, NO 방출 필름으로부터 NO가 1차 지수함수 그래프로 나타났다.
NO는 초기 1시간까지는 느리게 방출하는 패턴을 보여주었고 이 후 1차 반응식에 따라 방출하였다. 초기의 느린 방출은 필름이 수화하는데 따른 필요 시간에 기인한 것이다. NO가 방출되기 위해 CS/NO 필름이 팽창하여야 하므로, NO가 최초로 방출되기까지 지연시간이 예상되었고, CS/NO 필름은 상처 치료 기간 동안 충분한 NO의 방출해야 하는 것을 감안할 때 각기 다른 함량의 GSNO가 포함된 CS/NO 필름 중에서 20 중량%의 GSNO를 함유하는 CS/NO 필름이 48시간동안 지속적으로 가장 많은 양의 NO를 방출하는 것을 확인하였다.
6. 항균 및 항바이오필름 효과 검토
도 4는 그램양성균과 그램음성균에 대한 NO 방출 필름의 항균 및 항바이오필름 효과를 나타낸 것이다.
본 실험을 위하여 녹농균 P. aeruginosa PAO1(wild type prototroph, Peerson et al., 1997), 황색포도구균 S. aureus 균주 RN4220(Kreiswirth et al., 1983), 또는 메티실린 내성 황색포도구균(Methicillin-resistant Staphylococcus)을 이용하였다. 황색포도구균은 3 mL의 LB 브로스에서 격렬한 진탕을 하면서 밤새도록 성장시켰다. 이러한 세포들을 12웰 플레이트의 커버글래스 상에 접종하고 37℃에서 2 ㎕ 항생제를 함유한 LB 브로스 배지 2 mL에서 배양하였다. 그후, 블랭크 필름과 CS/NO 필름을 1.3cm x 1.3cm의 크기로 잘라 각 웰에 첨가하였다. 정해진 시간 간격으로 커버글래스를 멸균수로 가볍게 세정하여 부착되지 않은 황색포도구균을 제거한 후, 형광현미경으로 관찰하였다. 녹농균의 경우에는 25 ㎕ 항생제를 함유한 최소배지 2 mL와 플라스미드 유도제를 커버글래스를 포함한 12웰 플레이트 상에 분주하였다. 40 ㎕ 녹농균을 각 웰의 커버글래스 상에 접종한 후, 필름을 각 웰에 첨가하였다. 정해진 시간 간격으로 커버글래스를 멸균수로 가볍게 세정하여 부착되지 않은 녹농균을 제거한 후, 형광현미경으로 관찰하였다.
녹농균에서는 8시간 경과 후 GSNO가 봉입된 CS/NO 필름에서 키토산 필름에 비해 바이오필름이 적게 나타났으며, 24시간 경과 후에는 CS/NO 필름 표면 상 바이오필름이 키토산 필름보다 훨씬 적게 나타났다.
그리고, 황색포도구균에서도 24시간 경과 후 CS/NO 필름이 키토산 필름에 비해 주목할 만큼 박테리아 수를 감소시킴을 확인하였다.
7. in vivo 상처 치유 효과 검토
NO 방출 필름의 in vivo 상처 치유 효과를 검토하기 위하여, 250 ~ 280g의 수컷 SD 랫트를 동물모델로 사용하였다. 랫트의 등에 상처를 만들기 전에 먼저 졸레틸 50®(틸레타민/졸라제팜)와 롬펀®(자일라진 염산염)을 5:2의 부피비로 이용하여 동물을 마취시켰다. 랫트 등의 털을 전기면도기로 제거한 후, 피부의 등을 절개하여 전층 상처(1.5cm × 1.5cm)를 만들었다. 각 상처에 녹농균 P. aeruginosa(3.2 × 1088888 cells/mL 용액 50 μL를 떨어뜨리고 감염성 상처를 만들기 위해 24시간 동안 방치하였다.
각 상처에 메디폼®(먼디파마, 대조군), 실시예 2에서 제조한 PVA/NO 필름 또는 CS/NO 필름을 적용하였다. 각각의 물질들을 적용한 후 탄성 부착테이프(Micropore, 3M Consumer Health Care, St Paul, MN, USA)를 이용하여 고정시켰다. 상처 병변 상에 처리된 모든 드레싱은 적절한 시간에 새로운 것으로 교체하였다.
모든 랫트는 분리된 케이지에 보관되었고, 디지털 카메라를 이용하여 매 3일마다 각 병변의 디지털 이미지를 모았다. 상처를 낸 이후에 4, 7, 10, 13, 16일에 얻어진 이미지를 이용하여 상처의 거시적 변화를 관찰하였다. 상처 크기 감소와 상피화율은 하기 수학식을 근거로 산출되었다.
상피화율(%) = Et / (Wt + W0) x 100
Et: 시간 t당 상피화된 영역
Wt: 시간 t당 상처 영역
W0: 최초 상처 영역
도 5는 수술 후 일시 변화에 따른 거시적 관찰결과를 나타낸 것으로서, 수술 4일째 CS/NO 필름을 제외한 나머지 필름에서 매우 심한 염증이 관찰된 반면, CS/NO 필름은 매우 빠르게 상처가 봉합되는 것을 확인하였다.
도 6은 NO 방출 필름 적용에 따른 상처 크기 감소 효과를 나타낸 것이며, CS/NO 필름은 메디폼에 비해 현저하게 빠른 상처 치유 효과를 나타내어 10일 경과 후 상처가 거의 아물어지는 것을 확인하였다. 또 다른 NO 방출 필름인 PVA/NO 필름은 메디폼보다 빠른 치유 효과를 보였지만 CS/NO 필름에 비해서는 느린 치유 효과를 나타내었다.
그리고, 도 7은 상피화율을 나타낸 것으로서, 수술 4일째 CS/NO 필름 적용 상처가 메디폼 대조군에 비해 더 빠른 속도로 상피화를 나타내었으며, 특히 CS/NO 방출 필름을 적용한 상처가 가장 신속한 속도로 상피화를 나타내어, 수술 7일째에서 10일째 후 CS/NO 방출 필름을 적용한 상처는 메디폼 대조군 적용 상처에 비해 보다 높은 속도로 상피화를 나타내었다.
따라서 NO 방출 필름이 더 우수한 상처 치유 능력을 나타내었으며, 키토산을기질로 사용한 CS/NO 필름이 PVA를 기질로 사용한 PVA/NO 필름보다 더 우수한 치유 효과를 나타내었다. 상기 결과는 키토산이 NO를 봉입하고 다시 안정적으로 방출하는 능력이 우수하고 또한 키토산 자체의 항균작용과 상처치유작용이 동반 상승작용을 이끈 것으로 보인다.
8. 조직병리적 소견 검토
1) 조직병리적 절차
진피 및 피하조직을 포함한 피부의 전층 상처 조직을 모았고, 육아조직에 근거한 상처 샘플에 대한 하나 또는 두 개의 부위, 가능하면 중심 영역을 잘라내었다. 이렇게 잘라낸 피부를 10% 중성완충 포르말린으로 고정시켰다. 파라핀 포매 후, 3~4 ㎛ 단편을 준비하였다. 각 단편은 광학현미경 조사를 위해 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하거나, 콜라겐 섬유를 위해 Masson's trichrome으로 염색하였다. 이 후, 각 피부를 광학현미경(E400, Nikon, Japan) 하에서 조직병리적으로 관찰하였다.
2) 조직형태 계측
보다 상세한 조직병리적 변화를 확인하기 위하여, 가로로 자른 각각의 피부 샘플에서 자동 디지털 이미지 분석기를 구비한 컴퓨터(iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Quebec, Canada)를 이용하여 벗겨진 상피 영역(mm), 육아조직의 미소혈관 수(필드의 혈관수/mm2), 육아조직에서 침윤 염증세포의 수(필드의 %/mm2) 및 육아조직 면적(mm2/가로로 자른 상처의 중심영역)을 측정하였다. 각 실험군 중 8군데 상처에 대해 조직병리학 전문가에게 블라인드 테스트를 실시하여 분석하였다. 또한, 재상피화율은 종전 알려진 방법(Biol Pharm Bull 2007 Dec;30(12): 2406-2411)을 변화시켜 산출하였다.
재상피화율(%)=[상처의 총길이(10mm)-벗겨진 상피영역(mm)]/상처 총길이 X 100
3) 결과
도 8 및 표 2에서 조직병리적 소견을 나타내었으며, 조직병리적, 조직형태 계측적으로 필름 적용 실험군에서 유의적으로 벗겨진 상피조직이 감소하며, 필름 적용 실험군에서 재상피화율이 유의적으로 증가하였다. 특히, NO 방출 필름 적용 실험군에서 블랭크 필름이나 거즈를 적용한 경우보다 유의적으로 재빠르게 상처 치유 효과를 나타내었으며, 육아조직의 신속한 재구축, 더 낮은 염증세포 침윤과 더 낮은 혈관신생을 나타내었다. 또한, NO 방출 필름 적용 실험군에서 유의적으로 재빠르게 콜라겐 섬유 재생을 촉진함을 확인하였다.
조직형태계측 거즈 대조군 블랭크 필름 CS/NO 필름
벗겨진 상피 영역 (mm) 2.93 ± 0.68 1.44 ± 0.22 0.61 ± 0.1ce
재상피화율 (%) 70.66 ± 6.79 85.58 ± 2.19 93.91 ± 0.98ce
미소혈관수 154.24 ± 28.36 66.38 ±16.15a 30.25 ±11.72ab
침윤염증세포수 441.13 ±122.71 139.00 ±21.53c 79.75 ±14.27ce
콜라겐생성조직 34.32 ±8.88 49.55 ±7.19a 62.34 ±6.41ab
육아조직면적(mm2) 6.39 ±1.58 4.25 ±0.55c 2.46 ±0.46ce
상기 값은 8마리 S.D 렛트 상처의 평균으로 나타낸 것이다.
a p < 0.01 LSD 테스트에 의한 거즈 대조군과 비교
b p < 0.01 LSD 테스트에 의한 NO 0 mg과의 비교
c p < 0.01 및 d p<0.05 MW 테스트에 의한 거즈 대조군과 비교
e p < 0.01 MW 테스트에 의한 NO 0 mg과 비교
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (11)

  1. s-나이트로소글루타치온을 키토산에 봉입시킨 것을 특징으로 하는 산화질소 방출성 상처치료 필름.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 필름 100 중량%에 s-나이트로소글루타치온을 2.5 내지 30 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 산화질소 방출성 상처치료 필름.
  5. 키토산을 초산 완충용액에 용해시키고, pH를 조절한 후, 글리세롤을 첨가하여 키토산 용액을 준비하는 단계;
    상기 키토산 용액에 s-나이트로소글루타치온을 첨가하고 교반하여 반응물을 준비하는 단계; 및
    상기 반응물을 필름 형태로 주조하고, 암실 제습된 상태에서 건조시키는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 산화질소 방출성 상처치료 필름의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 청구항 5에 있어서, 키토산 용액을 준비하는 단계에서 0.1 M의 초산 완충용액을 사용하여 pH 4.0 내지 pH 6.0으로 조절하는 것을 특징으로 하는 산화질소 방출성 상처치료 필름의 제조방법.
  10. 청구항 5에 있어서, 상기 키토산 용액 100 중량부에 대해 s-나이트로소글루타치온을 2.5 내지 30 중량부로 첨가하는 것을 특징으로 하는 산화질소 방출성 상처치료 필름의 제조방법.
  11. 청구항 5에 있어서, 상기 건조는 25 내지 37 ℃에서 1 내지 2일 동안 건조하는 것을 특징으로 하는 산화질소 방출성 상처치료 필름의 제조방법.
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