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KR101553753B1 - Ｒｈｏａ에 대한 이중 가닥 ｒｎａ 및 그의 용도 - Google Patents

Ｒｈｏａ에 대한 이중 가닥 ｒｎａ 및 그의 용도 Download PDF

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KR101553753B1
KR101553753B1 KR1020137001674A KR20137001674A KR101553753B1 KR 101553753 B1 KR101553753 B1 KR 101553753B1 KR 1020137001674 A KR1020137001674 A KR 1020137001674A KR 20137001674 A KR20137001674 A KR 20137001674A KR 101553753 B1 KR101553753 B1 KR 101553753B1
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하가 칼린스키
이고르 메트
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쿠아크 파마수티칼스 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 RhoA 유전자의 하향-조절(down-regulation)을 위한 화합물, 이를 포함하는 약제학적 조성물, 그의 사용방법 및 킷트(kits)에 관한 것이다. 상기 화합물, 조성물, 방법 및 킷트들은 RhoA 발현이 불리한 결과들을 갖는 질병 또는 상태 및 또는 이들 질병 및 상태들과 연관되는 증후군으로 고통받는 대상체의 치료에서 그리고 신경 보호를 부여하기에 유용하다.

Description

ＲＨＯＡ에 대한 이중 가닥 ＲＮＡ 및 그의 용도{DOUBLE STRANDED RNA COMPOUNDS TO RHOA AND USE THEREOF}
연관된 특허 출원
본 출원은 "RHOA에 대한 siRNA 화합물 및 그의 용도"라는 명칭으로 2010년 6월 24일자로 출원되고 본 출원에 그의 전체로서 그리고 모든 목적들에 대하여 참조로 포함되는 미합중국 가특허출원 제61/358012호의 우선권을 주장한다.
시퀀스 목록(SEQUENCE LISTING)
본 출원은 221-PCT1 ST25 21-June-2011.txt라는 제목의 시퀀스 목록을 포함하며, 2011년 6월 21일자로 생성되고, 크기가 38kb인 상기 ASCII 카피가 그의 전체로서 참조로 포함된다.
본 출원 전체를 통하여 여러 특허 및 간행물이 인용된다. 이들 문헌의 내용은 그 전문들이 본 발명이 속한 분야의 현재 상황을 보다 더 충분히 설명하기 위하여 본 출원에 참조로서 포함된다.
발명의 분야
본 출원은 이중 가닥 뉴클레오티드 화합물, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 Ras 동족 유전자 족, 구성원 A(Ras homolog gene family, member A ; RhoA) 발현의 하향-조절(down-regulation)을 위한 그의 사용방법에 관한 것이다.
본 발명의 양수인에게 양수된 특허협력조약(PCT) 국제특허공개공보 제WO 2008/050329호 및 동 제WO 2009/044392호는 화학적으로 변성된 siRNA 화합물의 제조에 유용한 특정의 RhoA 올리고뉴클레오티드 및 구조적 모티프(structural motifs)를 기술하고 있다.
RhoA의 발현을 하향-조절하기 위한 핵산 분자, 이를 포함하는 조성물 및 킷트(kits) 및 그의 사용방법이 본 출원에 제공된다. 상기 조성물, 방법 및 킷트는 RhoA를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스(mRNA 시퀀스), 예를 들면, 시퀀스 동정 번호(SEQ ID NO):2로 예시화된 인간 RhoA 단백질에 대한 mRNA 코딩 시퀀스(시퀀스 동정 번호: 1)를 결합하는 핵산 분자(예를 들면, 짧은 간섭 핵산(short interfering nucleic acid ; siNA), 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA ; siRNA), 이중-가닥 RNA(double-stranded RNA ; dsRNA), 마이크로-RNA(micro-RNA ; miRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA ; shRNA))의 사용을 포함할 수 있다. 특정의 바람직한 구체예들에 있어서, 본원에서 기술된 상기 조성물, 방법 및 킷트는 RhoA의 발현을 억제한다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 핵산 분자는 RhoA 발현을 하향-조절하는 변성되지 않았거나 또는 화학적으로 변성된 dsRNA 화합물 또는 siRNA 또는 shRNA로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 현재 바람직한 구체예들에 있어서, 억제제는 RhoA 발현을 하향-조절하는 합성의, 화학적으로 변성된 이중 가닥 RNA(dsRNA) 화합물이다. 상기 화학적으로 변성된 핵산 분자 및 조성물은 변성되지 않은 분자에 비하여 증가된 혈청 안정성, 개선된 세포상 업테이크(cellular uptake), 감소된 표적 활성, 감소된 면역원성, 개선된 엔도좀의 방출(endosomal release), 표적 조직 또는 세포로의 개선된 특정의 전달 및 증가된 넉다운(knock down) 활성 중의 적어도 하나를 포함하는 이로운 특성들을 나타낸다.
본 출원에는 질병의 치료 또는 방지를 필요로 하는 대상체에서의 질병 또는 상태의 발생(incidence) 또는 중증도(severity)를 치료 또는 방지하기 위한 방법이 더 기술되며 여기에서 상기 질병 또는 상태 및/또는 연관된 증후군이 중추신경계(central nervous system ; CNS)의 질병, 손상, 상태 또는 병적 측면(pathology) 등과 같은 RhoA 유전자의 발현과 연관되는 것이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 포유동물이다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체이다.
특정의 구체예들에 있어서, RhoA를 표적하는 화학적으로 변성된 dsRNA 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 킷트 및 CNS 상태 또는 병적 측면, 특히 신경병증성 통증(neuropatic pain)(예를 들면, 이질통(allodynia)), 척수 손상(spinal cord injury ; SCI) 및 녹내장(glaucoma)의 치료에서의 이의 사용방법이 본 출원에서 제공된다. 치료되어야 할 다른 상태들에는 RhoA 발현이 신경 생존(neuron survival), 신경 성장(neuronal growth), 신경 재생(neural regeneration) 또는 다른 세포 기능(cellular functions)에 해로운 임의의 상태가 포함된다. 따라서, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 뇌졸증(stroke), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 말초신경병(peripheral neuropathies) 및 급성 및 만성 신경퇴행성 질환(acute and chronic neurodegenerative diseases)들을 포함하나 이들에 제한되지 않는 신경의 재생 또는 신경 또는 신경계의 보호를 요구하는 상태가 본 발명의 상기 화합물로 치료된다.
앞서 언급된 질병, 상태, 손상 및 장애(disorders)를 치료하는 데 유용한 안정하고 활성인 dsRNA 화합물 및 이를 포함하는 조성물은 매우 큰 치료학적 가치가 있다.
하나의 관점에 있어서, (a) 상기 핵산 분자가 센스 가닥(sense strand)와 상보적 안티센스 가닥(complementary antisense strand)을 포함하는 듀플렉스(duplex)이고; (b) 상기 핵산 분자의 각 가닥이 독립적으로 18 내지 49개의 뉴클레오티드의 길이이고; (c)상기 안티센스 가닥의 18 내지 49개의 뉴클레오티드 시퀀스가 포유동물 RhoA를 인코딩하는 mRNA의 연속적인 시퀀스(예를 들면, 시퀀스 동정 번호: 1)에 상보적이고; 그리고 (d) 상기 센스 가닥와 안티센스 가닥이 표 1, 2, 3 또는 4 중의 임의의 것에서 규정된 시퀀스쌍(sequence pairs)을 포함하는 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)가 제공된다.
특정의 구체예들에 있어서, 인간 RhoA를 인코딩하는 mRNA(시퀀스 동정 번호: 1에서 규정된)의 연속적인 시퀀스에 상보적인 상기 안티센스 가닥의 시퀀스는 시퀀스 동정 번호:1의 290-350; 또는 350-414; 또는 414-507; 또는 531-551; 또는 557-627; 또는 634-651; 또는 627-698; 또는 698-757; 또는 919-973; 또는 973-990, 또는 1134-1346; 또는 1346-1369; 또는 1804-1926;의 범위 이내의 뉴클레오티드 시퀀스에 상보적인 시퀀스를 포함한다.
특정의 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥은 표 3에 나타낸 상기 안티센스 시퀀스(시퀀스 동정 번호: 149-162)들 중의 임의의 하나에 대응하는 시퀀스를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 표 2에 나타낸 시퀀스쌍들로부터 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 RHOA_31(시퀀스 동정 번호: 135 및 149), RHOA_33(시퀀스 동정 번호: 136 및 150), RHOA_37(시퀀스 동정 번호: 137 및 151), RHOA_38(시퀀스 동정 번호: 138 및 152), RHOA_43(시퀀스 동정 번호: 139 및 153), RHOA_52(시퀀스 동정 번호: 140 및 154), RHOA_56(시퀀스 동정 번호: 141 및 155), RHOA_57(시퀀스 동정 번호: 142 및 156), RHOA_58(시퀀스 동정 번호: 143 및 157), RHOA_68(시퀀스 동정 번호: 144 및 158), RHOA_69(시퀀스 동정 번호: 145 및 159), RHOA_70(시퀀스 동정 번호: 146 및 160), RHOA_73(시퀀스 동정 번호: 147 및 161) 및 RHOA_76(시퀀스 동정 번호: 148 및 162)에서 규정된 시퀀스쌍들로부터 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_31(시퀀스 동정 번호: 135 및 149)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_33(시퀀스 동정 번호: 136 및 150)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_37(시퀀스 동정 번호: 137 및 151)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_38(시퀀스 동정 번호: 138 및 152)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_43(시퀀스 동정 번호: 139 및 153)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_52(시퀀스 동정 번호: 140 및 154)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_56(시퀀스 동정 번호: 141 및 155)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_57(시퀀스 동정 번호: 142 및 156)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_58(시퀀스 동정 번호: 143 및 157)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_68(시퀀스 동정 번호: 144 및 158)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_69(시퀀스 동정 번호: 145 및 159)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_70(시퀀스 동정 번호: 146 및 160)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_73(시퀀스 동정 번호: 147 및 161)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_76(시퀀스 동정 번호: 148 및 162)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다.
일부 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 RHOA_58(시퀀스 동정 번호: 143 및 157)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 RHOA_70(시퀀스 동정 번호: 146 및 160)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다.
특정의 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥은 표 4(시퀀스 동정 번호: 167-170)에 나타낸 상기 안티센스 시퀀스들 중의 임의의 하나에 대응하는 시퀀스를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 표 4에 나타낸 시퀀스쌍들로부터 선택되고 그리고 RHOA_23(시퀀스 동정 번호: 163 및 167), RHOA_24(시퀀스 동정 번호: 164 및 168), RHOA_26(시퀀스 동정 번호: 165 및 169) 또는 RHOA_29(시퀀스 동정 번호: 166 및 170)에서 규정된 시퀀스쌍들로부터 선택된다.
특정의 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥은 표 2에 나타낸 안티센스 시퀀스들 중의 임의의 하나에 대응하는 시퀀스를 포함한다. 특정의 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 가닥은 표 2에 나타낸 시퀀스쌍들로부터 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 핵산 분자는 RHOA_32(시퀀스 동정 번호: 67 및 101), RHOA_34(시퀀스 동정 번호: 68 및 102), RHOA_35(시퀀스 동정 번호: 69 및 103), RHOA_36(시퀀스 동정 번호: 70 및 104), RHOA_39(시퀀스 동정 번호: 71 및 105), RHOA_40(시퀀스 동정 번호: 72 및 106), RHOA_41(시퀀스 동정 번호: 73 및 107), RHOA_42(시퀀스 동정 번호: 74 및 108), RHOA_44(시퀀스 동정 번호: 75 및 109), RHOA_45(시퀀스 동정 번호: 76 및 110), RHOA_46(시퀀스 동정 번호: 77 및 111), RHOA_47(시퀀스 동정 번호: 78 및 112), RHOA_48(시퀀스 동정 번호: 79 및 113), RHOA_48u(시퀀스 동정 번호: 80 및 114), RHOA_49(시퀀스 동정 번호: 81 및 115), RHOA_50(시퀀스 동정 번호: 82 및 116) RHOA_51(시퀀스 동정 번호: 83 및 117), RHOA_53(시퀀스 동정 번호: 84 및 118), RHOA_54(시퀀스 동정 번호: 85 및 119), RHOA_55(시퀀스 동정 번호: 86 및 120), RHOA_59(시퀀스 동정 번호: 87 및 121), RHOA_60(시퀀스 동정 번호: 88 및 122), RHOA_61(시퀀스 동정 번호: 89 및 123), RHOA_61u(시퀀스 동정 번호: 90 및 124), RHOA_62(시퀀스 동정 번호: 91 및 125), RHOA_63(시퀀스 동정 번호: 92 및 126) RHOA_64(시퀀스 동정 번호: 93 및 127), RHOA_65(시퀀스 동정 번호: 94 및 128), RHOA_66(시퀀스 동정 번호: 95 및 129) RHOA_67(시퀀스 동정 번호: 96 및 130), RHOA_71(시퀀스 동정 번호: 97 및 131), RHOA_72(시퀀스 동정 번호: 98 및 132), RHOA_74(시퀀스 동정 번호: 99 및 133) 및 RHOA_75(시퀀스 동정 번호: 100 및 134)에서 규정된 시퀀스쌍들로부터 선택되는 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_32(시퀀스 동정 번호: 67 및 101)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_34(시퀀스 동정 번호: 68 및 102)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_35(시퀀스 동정 번호: 69 및 103)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_36(시퀀스 동정 번호: 70 및 104)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_39(시퀀스 동정 번호: 71 및 105)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_40(시퀀스 동정 번호: 72 및 106)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_41(시퀀스 동정 번호: 73 및 107)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_42(시퀀스 동정 번호: 74 및 108)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_44(시퀀스 동정 번호: 75 및 109)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_45(시퀀스 동정 번호: 76 및 110)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_46(시퀀스 동정 번호: 77 및 111)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_47(시퀀스 동정 번호: 78 및 112)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_48(시퀀스 동정 번호: 79 및 113), RHOA_48u(시퀀스 동정 번호: 80 및 114), RHOA_49(시퀀스 동정 번호: 81 및 115)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_50(시퀀스 동정 번호: 82 및 116)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_51(시퀀스 동정 번호: 83 및 117)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_53(시퀀스 동정 번호: 84 및 118)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_54(시퀀스 동정 번호: 85 및 119)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_55(시퀀스 동정 번호: 86 및 120)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_59(시퀀스 동정 번호: 87 및 121)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_60(시퀀스 동정 번호: 88 및 122)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_61(시퀀스 동정 번호: 89 및 123)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_61u(시퀀스 동정 번호: 90 및 124)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_62(시퀀스 동정 번호: 91 및 125)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_63(시퀀스 동정 번호: 92 및 126)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_64(시퀀스 동정 번호: 93 및 127)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_65(시퀀스 동정 번호: 94 및 128)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_66(시퀀스 동정 번호: 95 및 129)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_67(시퀀스 동정 번호: 96 및 130)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_71(시퀀스 동정 번호: 97 및 131), RHOA_72(시퀀스 동정 번호: 98 및 132), RHOA_74(시퀀스 동정 번호: 99 및 133)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_75(시퀀스 동정 번호: 100 및 134)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다.
일부 바람직한 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_48(시퀀스 동정 번호: 79 및 113), RHOA_48u(시퀀스 동정 번호: 80 및 114), RHOA_50(시퀀스 동정 번호: 82 및 116), RHOA_61(시퀀스 동정 번호: 89 및 123), RHOA_61u(시퀀스 동정 번호: 90 및 124) 또는 RHOA_75(시퀀스 동정 번호: 100 및 134)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다.
일부 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_48(시퀀스 동정 번호: 79 및 113)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_48u(시퀀스 동정 번호: 80 및 114)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 RHOA_50(시퀀스 동정 번호: 82 및 116)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다.
본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 여러 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 18 내지 49개의 뉴클레오티드의 길이(예를 들면, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개의 뉴클레오티드의 길이); 또는 18 내지 35개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 18 내지 30개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 18 내지 25개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 18 내지 23개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 19 내지 21개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 25 내지 30개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 26 내지 28개의 뉴클레오티드의 길이가 될 수 있다. 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 19개의 뉴클레오티드의 길이이다. 유사하게, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 상기 센스 가닥은 18 내지 49개의 뉴클레오티드의 길이(예를 들면, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개의 뉴클레오티드의 길이); 또는 18 내지 35개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 18 내지 30개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 18 내지 25개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 18 내지 23개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 19 내지 21개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 25 내지 30개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 26 내지 28개의 뉴클레오티드의 길이가 될 수 있다. 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥은 19개의 뉴클레오티드의 길이이다. 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥 각각은 19개의 뉴클레오티드의 길이이다. 본 출원에서 기술되는 바와 같은 상기 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 듀플렉스 영역(duplex region)은 18 내지 49개의 뉴클레오티드의 길이(예를 들면, 약 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개의 뉴클레오티드의 길이), 18 내지 35개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 18 내지 30개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 약 18 내지 25개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 18 내지 25개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 18 내지 23개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 18 내지 21개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 25 내지 30개의 뉴클레오티드의 길이; 또는 25 내지 28개의 뉴클레오티드의 길이가 될 수 있다. 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 여러 구체예들에 있어서, 상기 듀플렉스 영역은 19개의 뉴클레오티드의 길이이다.
특정의 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산(예를 들면, dsRNA 핵산 분자)의 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 별도의 폴리뉴클레오티드 가닥들이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 별도의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 또한 듀플렉스로서 알려진 바와 같이 수소결합을 경유하여, 예를 들면, 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base pairing) 이중 가닥 구조를 형성한다. 일부 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드쌍들은 비-왓슨-크릭 염기쌍(non-Watson-Crick base pairing)을 형성한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥들은 서로 공유적으로 연결되는 2개의 별도의 가닥들이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥들은 센스영역(sense region)과 안티센스영역 둘 다를 갖는 단일 폴리뉴클레오티드 가닥의 일부이며; 일부 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 가닥은 헤어핀 구조를 갖는다.
특정의 구체예들에 있어서, 상기 핵산 분자는 오버행(overhangs)에 대해 대칭인 이중 가닥 핵산(dsRNA) 분자이며, 양 단부들 상에 평활 단부(blunt end)를 갖는다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 핵산 분자는 오버행에 대해 대칭인 dsRNA 분자이며, 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 또는 상기 dsRNA 분자의 양 단부들 상의 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드 오버행의 조합을 갖는다. 특정의 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 핵산 분자는 오버행에 대해 대칭인 dsRNA이며, 상기 분자의 하나의 단부 상에 평활 단부를 그리고 상기 분자의 다른 단부 상에 오버행을 갖는다. 일부 구체예들에 있어서, 비대칭적 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥 상에서 발생하는 듀플렉스의 일측 상에 3'-오버행; 그리고 상기 분자의 타측 상에 평활 단부를 갖는다. 일부 구체예들에 있어서, 비대칭적 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥 상에서 발생하는 듀플렉스의 일측 상에 5'-오버행을; 그리고 상기 분자의 타측 상에 평활 단부를 갖는다. 다른 구체예들에 있어서, 비대칭적 dsNA 분자는 상기 안티센스 가닥 상에서 발생하는 듀플렉스의 일측 상에 3'-오버행을; 그리고 상기 분자의 타측 상에 평활 단부를 갖는다. 일부 구체예들에 있어서, 비대칭적 dsRNA 분자는 상기 안티센스 가닥 상에서 발생하는 듀플렉스의 일측 상에 5'-오버행을; 그리고 상기 분자의 타측 상에 평활 단부를 갖는다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 오버행은 뉴클레오티드 오버행이고, 다른 구체예들에 있어서, 상기 오버행은 비-뉴클레오티드 오버행이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 오버행은 5'-오버행이고; 대안의 구체예들에 있어서, 상기 오버행은 3'-오버행이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 핵산 분자는 일측 단부 상에 루프 구조(loop structure)를 그리고 타측 단부 상에 평활 단부를 갖는, 헤어핀 구조(하나의 폴리뉴클레오티드 상에 상기 센스 가닥와 안티센스 가닥을 갖는)를 갖는다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 핵산 분자는 일측 단부 상에 루프 구조를 그리고 타측 단부 상에 오버행 단부를 갖는 헤어핀 구조를 가지고; 특정의 구체예들에 있어서, 상기 오버행은 3'-오버행이고; 특정의 구체예들에 있어서, 상기 오버행은 5'-오버행이고; 특정의 구체예들에 있어서, 상기 옵버행은 상기 센스 가닥 상에 존재하고; 특정의 구체예들에 있어서, 상기 오버행은 상기 안티센스 가닥 상에 존재한다.
본 출원에서 기술되는 상기 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)는 본 출원에서 기술되는 바와 같은 하나 또는 그 이상의 변형들 또는 변성된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)는 변성된 당(modified sugar)을 갖는 변성된 뉴클레오티드; 변성된 핵염기(nucleobase)를 갖는 변성된 뉴클레오티드; 또는 변성된 인산기(phosphate group)를 갖는 변성된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게, 본 출원에서 제공되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)는 변성된 포스포디에스테르 주쇄(phosphodiester backbone)를 포함하거나 및/또는 변성된 말단 인산기를 포함할 수 있다.
제공된 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)는 변성된 당 성분(sugar moiety), 예를 들면, 2'알콕시 변성 당 성분(2'alkoxy modified sugar moiety)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 일부 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 변성된 당은 2'-0-메틸(2'-0-methyl)을 포함한다.
제공된 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)는, 예를 들면, 본 발명에서 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 변성된 핵염기(들)을 가질 수 있으며, 이는 크산틴(xanthine), 하이포크산틴(hypoxanthine), 2-아미노아데닌(2-aminoadenine), 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체들, 5-할로우라실(5-halouracil) 및 시토신(cytosine), 5-프로피닐우라실(5-propynyl uracil) 및 시토신, 6-아조우라실(6-azo uracil), 시토신 및 티민, 5-우라실(5-uracil, 슈도우라실(pseudouracil)), 4-티오우라실(4-thiouracil), 8-할로(8-halo), 아미노(amino), 티올(thiol), 티오알킬(thioalkyl), 하이드록실 및 다른 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌(7-methylguanine) 및 아시클로뉴클레오티드(acyclonucleotides)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
제공된 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)는, 예를 들면, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 포스포디에스테르 주쇄에 대한 하나 또는 그 이상의 변성들을 가질 수 있다. 일부 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 포스포디에스테르 결합은 상기 포스포디에스테르 결합을 포스프로티오에이트(phosphorothioate), 3'-(또는 5')디옥시-3'-(또는 -5')티오-포스포로티오에이트(3'-(or -5')deoxy-3'-(or -5')thio-phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포로셀레네이트(phosphoroselenate), 3'-(또는 -5')디옥시포스피네이트(3'-(or -5')deoxy phosphinate), 보라노포스페이트(borano phosphate), 3'-(또는 -5')디옥시-3'-(또는 5'-)아미노포스포르아미데이트(3'-(or -5')deoxy-3'-(or 5'-)amino phosphoramidate), 하이드로겐포스포네이트(hydrogen phosphonate), 보라노포스페이트에스테르(borano phosphate ester), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르(phosphotriester)로 치환하는 것에 의하여 변성된다.
여러 구체예들에 있어서, 상기 제공된 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)는 미변성된 안티센스 가닥 및 하나 또는 그 이상의 변성들을 갖는 센스 가닥을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제공된 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)는 미변성된 센스 가닥 및 하나 또는 그 이상의 변성들을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 제공된 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)는 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥 둘 다에서 하나 또는 그 이상의 변성된 뉴클레오티드를 포함한다.
본 출원에서 제공된 바와 같은 상기 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)는 상기 센스 가닥 및/또는 상기 안티센스 가닥의 5' 단부에 인산기를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 dsRNA 분자는 상기 안티센스 가닥의 5' 말단에 인산기를 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, RhoA의 발현을 하향-조절하는 데 유용한 이중 가닥 핵산 화합물이 제공된다. 본 출원에서 제공된 일부 구체예들에 있어서, 구조(A1)을 갖는 이중 가닥 RNA 화합물이 제공된다:
Figure 112013006138949-pct00001
여기에서 N 및 N' 각각은 미변성되거나 또는 변성될 수 있는 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분(unconventional moiety)이고;
여기에서 (N)x 및 (N')y 각각은 연속적인 N 또는 N' 각각이 공유결합에 의하여 후속의 N 또는 N'에 연결되는 올리고뉴클레오티드이고;
여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드, 1 내지 5개의 연속적인 비-뉴클레오티드 성분 또는 이들의 조합을 포함하고;
여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있으나, 그러나 존재하는 경우, (N')y의 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분(capping moiety)이고;
x 및 y 각각은 독립적으로 18 내지 40의 정수이고;
여기에서 (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 상보적이고; 그리고
여기에서 (N)x는 표 3 또는 표 4에서 규정된 안티센스 시퀀스를 포함한다.
표 3에서 제공된 dsRNA 화합물을 생성하는 데 유용한 상기 센스 시퀀스 및 안티센스 시퀀스는 RHOA_31(시퀀스 동정 번호: 135 및 149), RHOA_33(시퀀스 동정 번호: 136 및 150), RHOA_37(시퀀스 동정 번호: 137 및 151), RHOA_38(시퀀스 동정 번호: 138 및 152), RHOA_43(시퀀스 동정 번호: 139 및 153), RHOA_52(시퀀스 동정 번호: 140 및 154), RHOA_56(시퀀스 동정 번호: 141 및 155), RHOA_57(시퀀스 동정 번호: 142 및 156), RHOA_58(시퀀스 동정 번호: 143 및 157), RHOA_68(시퀀스 동정 번호: 144 및 158), RHOA_69(시퀀스 동정 번호: 145 및 159), RHOA_70(시퀀스 동정 번호: 146 및 160), RHOA_73(시퀀스 동정 번호: 147 및 161) 및 RHOA_76(시퀀스 동정 번호: 148 및 162)이다. 표 4에서 제공된 dsRNA 화합물을 생성하는 데 유용한 상기 센스 시퀀스 및 안티센스 시퀀스는 RHOA_23(시퀀스 동정 번호: 163 및 167), RHOA_24(시퀀스 동정 번호:164 및 168), RHOA_26(시퀀스 동정 번호: 165 및 169) 또는 RHOA_29(시퀀스 동정 번호: 166 및 170)에서 규정된다.
일부 구체예들에 있어서, 연속적인 N 및/또는 N' 각각을 연결하는 상기 공유결합은 포스포디에스테르 결합이다.
일부 구체예들에 있어서, x = y이고 그리고 x 및 y 각각은 19, 20, 21, 22 또는 23이다. 바람직한 구체예들에 있어서, x = y = 19이다.
본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 siRNA, siNA 또는 miRNA이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 RHOA_58(시퀀스 동정 번호: 143 및 157)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 RHOA_70(시퀀스 동정 번호: 146 및 160)에서 규정된 시퀀스쌍을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 DNA 성분 또는 상기 안티센스 가닥(5' 말단)의 포지션 1(position 1)에서 표적에 대한 미스매치(mismatch)를 포함한다. 이러한 듀플렉스 구조가 본 출원에서 기술된다. 하나의 구체예에 따르면, 이하에서 규정되는 구조(A2)를 갖는 이중 가닥 siRNA가 제공된다:
Figure 112013006138949-pct00002
여기에서 N1, N2, N 및 N' 각각은 독립적으로 미변성되거나 또는 변성된 뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;
여기에서 (N)x 및 (N')y 각각은 연속적인 N 또는 N' 각각이 공유결합에 의하여 인접하는 N 또는 N'에 연결되는 올리고뉴클레오티드이고;
여기에서 x 및 y 각각은 독립적으로 17 내지 39 사이의 정수이고;
여기에서 N2는 (N')y에 공유적으로 결합되고;
여기에서 N1은 (N)x에 공유적으로 결합하고 그리고 표적 mRNA(시퀀스 동정 번호: 1)에 미스매치이거나 또는 상기 표적 mRNA에 상보적 DNA 성분이고;
여기에서 N1은 천연의 또는 변성된; 우리딘(uridine), 디옥시리보우리딘(deoxyribouridine), 리보티미딘(ribothymidine), 디옥시리보티미딘(deoxyribothymidine), 아데노신 또는 디옥시아데노신, 어베이직 리보오스 성분(abasic ribose moiety) 및 어베이직 디옥시리보오스 성분(abasic deoxyribose moiety)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분이고;
여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있으나, 그러나 존재하는 경우, N2-(N')y의 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분이고;
여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드, 1 내지 5개의 연속적인 비-뉴클레오티드 성분 또는 이들의 조합이고; 그리고
여기에서 (N')y의 시퀀스가 (N)x의 시퀀스에 상보적이고; 그리고
여기에서 (N)x의 시퀀스가 표 1에서 규정된 안티센스 시퀀스를 포함한다.
여러 구체예들에 있어서, Nl-(N)x의 시퀀스는 표 2에서 규정된 안티센스 시퀀스를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, dsRNA 화합물을 생성하는데 유용한 상기 N2-(N')y 및 Nl-(N)x는 표 2에 제공되고 그리고 RHOA_32(시퀀스 동정 번호: 67 및 101), RHOA_34(시퀀스 동정 번호: 68 및 102), RHOA_35(시퀀스 동정 번호: 69 및 103), RHOA_36(시퀀스 동정 번호: 70 및 104), RHOA_39(시퀀스 동정 번호: 71 및 105), RHOA_40(시퀀스 동정 번호: 72 및 106), RHOA_41(시퀀스 동정 번호: 73 및 107), RHOA_42(시퀀스 동정 번호: 74 및 108), RHOA_44(시퀀스 동정 번호: 75 및 109), RHOA_45(시퀀스 동정 번호: 76 및 110), RHOA_46(시퀀스 동정 번호: 77 및 111), RHOA_47(시퀀스 동정 번호: 78 및 112), RHOA_48(시퀀스 동정 번호: 79 및 113), RHOA_48u(시퀀스 동정 번호: 80 및 114), RHOA_49(시퀀스 동정 번호: 81 및 115), RHOA_50(시퀀스 동정 번호: 82 및 116) RHOA_51(시퀀스 동정 번호: 83 및 117), RHOA_53(시퀀스 동정 번호: 84 및 118), RHOA_54(시퀀스 동정 번호: 85 및 119), RHOA_55(시퀀스 동정 번호: 86 및 120), RHOA_59(시퀀스 동정 번호: 87 및 121), RHOA_60(시퀀스 동정 번호: 88 및 122), RHOA_61(시퀀스 동정 번호: 89 및 123), RHOA_61u(시퀀스 동정 번호: 90 및 124), RHOA_62(시퀀스 동정 번호: 91 및 125), RHOA_63(시퀀스 동정 번호: 92 및 126), RHOA_64(시퀀스 동정 번호: 93 및 127), RHOA_65(시퀀스 동정 번호: 94 및 128), RHOA_66(시퀀스 동정 번호: 95 및 129), RHOA_67(시퀀스 동정 번호: 96 및 130), RHOA_71(시퀀스 동정 번호: 97 및 131), RHOA_72(시퀀스 동정 번호: 98 및 132), RHOA_74(시퀀스 동정 번호: 99 및 133) 및 RHOA_75(시퀀스 동정 번호: 100 및 134)에서 규정된다.
특정의 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 (N)x는 표 1에 나타낸 안티센스 시퀀스들 중의 임의의 하나에 대응하는 시퀀스를 포함한다. 특정의 바람직한 구체예들에 있어서, (N)x 및 (N')y는 표 1에 나타낸 시퀀스쌍들로부터 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술된 핵산 분자는 RHOA_32-1(시퀀스 동정 번호: 3 및 35), RHOA_34-1(시퀀스 동정 번호: 4 및 36), RHOA_35-1(시퀀스 동정 번호: 5 및 37), RHOA_36-1(시퀀스 동정 번호: 6 및 38), RHOA_39-1(시퀀스 동정 번호: 7 및 39), RHOA_40-1(시퀀스 동정 번호: 8 및 40), RHOA_41-1(시퀀스 동정 번호: 9 및 41), RHOA_42-1(시퀀스 동정 번호: 10 및 42), RHOA_44-1(시퀀스 동정 번호: ll 및 43), RHOA_45-1(시퀀스 동정 번호: 12 및 44), RHOA_46-1(시퀀스 동정 번호: 13 및 45), RHOA_47-1(시퀀스 동정 번호: 14 및 46), RHOA_48-1(시퀀스 동정 번호: 15 및 47), RHOA_49-1(시퀀스 동정 번호: 16 및 48), RHOA_50-1(시퀀스 동정 번호: 17 및 49), RHOA_51-1(시퀀스 동정 번호: 18 및 50), RHOA_53-1(시퀀스 동정 번호: 19 및 51), RHOA_54-1(시퀀스 동정 번호: 20 및 52), RHOA_55-1(시퀀스 동정 번호: 21 및 53), RHOA_59-1(시퀀스 동정 번호: 22 및 54), RHOA_60-1(시퀀스 동정 번호: 23 및 55), RHOA_61-1(시퀀스 동정 번호: 24 및 56), RHOA_62-1(시퀀스 동정 번호: 25 및 57), RHOA_63-1(시퀀스 동정 번호: 26 및 58) RHOA_64-1(시퀀스 동정 번호: 27 및 59), RHOA_65-1(시퀀스 동정 번호: 28 및 60), RHOA_66-1(시퀀스 동정 번호: 29 및 61), RHOA_67-1(시퀀스 동정 번호: 30 및 62), RHOA_71-1(시퀀스 동정 번호: 31 및 63), RHOA_72-1(시퀀스 동정 번호: 32 및 64), RHOA_74-1(시퀀스 동정 번호: 33 및 65) 및 RHOA_75-1(시퀀스 동정 번호: 34 및 66)에서 규정된 시퀀스쌍들로부터 선택되는 (N)x 및 (N')y를 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 완전히 상보적이다. 여러 구체예들에 있어서, N2-(N')y의 시퀀스는 Nl-(N)x의 시퀀스에 상보적이다. 일부 구체예들에 있어서, (N)x는 표적 mRNA 내의 약 17 내지 약 39개의 연속적인 뉴클레오티드에 대하여 완전히 상보적이다. 다른 구체예들에 있어서, (N)x는 시퀀스 동정 번호: 1에서 규정된 표적 mRNA 내의 약 17 내지 약 39개의 연속적인 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 안티센스를 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, N1 및 N2는 왓슨-크릭 염기쌍을 형성한다. 다른 구체예들에 있어서, N1 및 N2는 비-왓슨-크릭 염기쌍을 형성한다. 일부 구체예들에 있어서, 염기쌍은 리보뉴클레오티드와 디옥시리보뉴클레오티드 사이에 형성된다.
일부 구체예들에 있어서, x=y=18, x=y=19 또는 x=y=20이다. 바람직한 구체예들에 있어서, x=y=18이다. Nl-(N)x 내의 x=18인 경우, N1은 포지션 1(position 1)을 의미하고 그리고 포지션 2 내지 19들은 (N)18 내에 포함된다. N2-(N')y 내의 y=18인 경우, N2는 포지션 19를 의미하고 그리고 포지션 1 내지 18들은 (N')18 내에 포함된다.
일부 구체예들에 있어서, N1은 (N)x에 공유적으로 결합되고 그리고 상기 표적 mRNA에 대하여 미스매치된다. 여러 구체예들에 있어서, N1은 (N)x에 공유적으로 결합되고 그리고 상기 표적 mRNA에 상보적인 DNA 성분이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 포지션 1 내의 우리딘은 천연의 또는 변성된: 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘, 디옥시우리딘(dU), 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로부터 선택되는 N1으로 치환된다. 여러 구체예들에 있어서, N1은 천연의 또는 변성된: 아데노신, 디옥시아데노신 또는 디옥시우리딘으로부터 선택된다. 예를 들면, 일부 구체예들에 있어서, 포지션 1 내의 시티딘은 아데닌 또는 우리딘으로 대체되거나; 포지션 1 내의 구아노신은 아데닌 또는 우리딘으로 대체되거나; 또는 아데닌이 우리딘으로 대체된다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 포지션 1(N1) 내의 구아노신은 천연의 또는 변성된: 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로 치환된다. 여러 구체예들에 있어서, N1은 천연의 또는 변성된: 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘 또는 디옥시우리딘으로부터 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 포지션 1(N1) 내의 시티딘은 천연의 또는 변성된: 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로 치환된다. 여러 구체예들에 있어서, N1은 천연의 또는 변성된: 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘 또는 디옥시우리딘으로부터 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 포지션 1(N1) 내의 아데노신은 천연의 또는 변성된: 디옥시아데노신, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로 치환된다.
일부 구체예들에 있어서, N1 및 N2는 천연의 또는 변성된: 우리딘 또는 디옥시우리딘과 아데노신 또는 디옥시아데노신 사이에서 염기쌍을 형성한다. 다른 구체예들에 있어서, N1 및 N2는 천연의 또는 변성된: 디옥시우리딘과 아데노신 사이에서 염기쌍을 형성한다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 siRNA, siNA 또는 miRNA이다. 본 출원에서 제공되는 바와 같은 상기 이중 가닥 핵산 분자는 또한 "듀플렉스"로 언급된다.
구조(A2)의 특정의 바람직한 구체예에 있어서 x=y=18이다. 일부 구체예들에 있어서, x=y=18이고, 그리고 (N)x는 표 1 내에 제공되는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, N1은 천연의 우리딘 및 변성된 우리딘으로부터 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, N1은 천연의 우리딘이다. 일부 구체예들에 있어서, Nl-(N)x는 표 2 내에 제공되는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, x=y=19 또는 x=y=20이다. 일부 구체예들에 있어서, x=y=19 또는 x=y=20이고 그리고 (N)x는 표 1 내에 제공되는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, dsRNA 화합물을 생성하는데 유용한 상기 바람직한 센스 시퀀스 및 안티센스 시퀀스는 표 2: RHOA_48(시퀀스 동정 번호: 79 및 113), RHOA_48u(시퀀스 동정 번호: 80 및 114), RHOA_50(시퀀스 동정 번호: 82 및 116), RHOA_61(시퀀스 동정 번호: 89 및 123), RHOA_61u(시퀀스 동정 번호: 90 및 124) 및 RHOA_75(시퀀스 동정 번호: 100 및 134) 내에 규정된 시퀀스쌍들로부터 선택된다.
구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, N1은 2'OMe 당-변성 우리딘(2'OMe sugar-modified uridine) 또는 2'OMe 당-변성 아데노신이다. 구조(A2)의 특정의 구체예들에 있어서, N2는 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드이다.
구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, 각 N은 미변성된 리보뉴클레오티드로 구성된다. 구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, 각 N'는 미변성된 뉴클레오티드로 구성된다. 바람직한 구체예들에 있어서, N 및/또는 N'의 적어도 하나는 화학적으로 변성된 뉴클레오티드 또는 독특한 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 독특한 성분은 미러 뉴클레오티드(mirror nucleotide), 어베이직 리보오스 성분 및 어베이직 디옥시리보오스 성분으로부터 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 독특한 성분은 미러 뉴클레오티드, 바람직하게는 N-DNA 성분이다. 일부 구체예들에 있어서, N 또는 N'의 적어도 하나는 2'OMe 당-변성 리보뉴클레오티드를 포함한다.
구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 완전히 상보적이다. 구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 다른 구체예들에 있어서, (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 대하여 실질적으로 상보적이다.
구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, (N)x는 표적 mRNA 내의 약 17 내지 약 39개의 연속적인 뉴클레오티드에 완전히 상보적인 안티센스 시퀀스를 포함한다. 구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 다른 구체예들에 있어서, (N)x는 표적 mRNA 내의 약 17 내지 약 39개의 연속적인 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 안티센스를 포함한다. 구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, 상기 dsRNA 화합물은, 예를 들면, 평활 단부이고, 여기에서 z", Z 및 Z' 각각은 부재이다. 대안의 구체예에 있어서, z", Z 또는 Z'의 적어도 하나는 존재한다.
여러 구체예들에 있어서, Z 및 Z'는 독립적으로 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 하나 또는 그 이상의 공유적으로 연결된 변성되거나 및 또는 미변성된 뉴클레오티드, 또는 하나 또는 그 이상의 독특한 성분들, 예를 들면, 역전된 어베이직 디옥시리보오스 성분(inverted abasic deoxyribose moiety) 또는 어베이직 리보오스 성분 또는 미러 뉴클레오티드; 하나 또는 그 이상의 비-뉴클레오티드 C3, C4 또는 C5 성분, 아미노-C6 성분 등등을 포함한다. 이루 구체예들에 있어서, Z'는 부재이고 그리고 Z는 존재하고 그리고 하나 또는 그 이상의 비-뉴클레오티드 C3 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, Z는 부재이고 그리고 Z'는 존재하고 그리고 하나 또는 그 이상의 비-뉴클레오티드 C3 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, Z 및 Z' 각각은 독립적으로 하나 또는 그 이상의 비-뉴클레오티드 C3 성분 또는 하나 또는 그 이상의 아미노-C6 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, z"는 존재하고 그리고 미러 뉴클레오티드, 어베이직 성분 및 역전된 어베이직 성분으로부터 선택된다. 구조(A1) 및 구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, Z 및 Z' 각각은 어베이직 성분, 예를 들면, 디옥시리보어베이직 성분(본 출원에서는 "dAb"라고 칭한다) 또는 리보어베이직 성분(본 출원에서는 "rAb"라고 칭한다)을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, Z 및/또는 Z' 각각은 2개의 공유적으로 연결된 어베이직 성분들을 포함하고 그리고, 예를 들면, dAb-dAb 또는 rAb-rAb 또는 dAb-rAb 또는 rAb-dAb이고, 여기에서 각 성분은 인접하는 성분에 공유적으로, 바람직하게는 인산-기반 결합(phospho-based bond)을 경유하여 부착된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 인산-기반 결합은 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포노아세테이트(phosphonoacetate) 또는 포스포디에스테르 결합을 포함한다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 인산-기반 결합은 포스포디에스테르 결합을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, Z 및/또는 Z' 각각은 독립적으로 알킬 성분, 선택적으로 프로판 [(CH2)3] 성분(C3) 또는 프로판올(C30H) 및 프로판디올(propanediol ("C3Pi"))의 인산 유도체(phospho derivative)를 포함하는 그의 유도체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, Z 및/또는 Z' 각각은 2개의 알킬 성분을 포함하고 그리고 일부 실시예들에 있어서는 C3Pi-C30H이다. 상기 안티센스 가닥의 상기 3' 말단 및/또는 상기 센스 가닥의 상기 3' 말단은 인산-기반 결합을 경유하여 C3 성분에 공유적으로 부착되고 그리고 상기 C3 성분은 인산-기반 결합을 경유하여 C3OH에 공유적으로 공액화(conjugated)된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 인산-기반 결합은 포스포로티오에이트, 포스포노아세테이트 또는 포스포디에스테르 결합을 포함한다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 인산-기반 결합은 포스포디에스테르 결합을 포함한다.
구조(A1) 및 구조(A2)의 특정의 구체예들에 있어서, Z는 C3Pi-C30H를 포함한다. 구조(A1) 및 구조(A2)의 특정의 구체예들에 있어서, Z'는 C3Pi 또는 C30H를 포함한다. 구조(A1) 및 구조(A2)의 특정의 구체예들에 있어서, 이중 가닥 핵산 분자는 상기 안티센스 가닥의 상기 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분 및 상기 센스 가닥의 상기 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 또는 C30H 성분을 포함한다.
구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, 각 N은 미변성된 뉴클레오티드로 구성된다. 구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, 각 N'는 미변성된 뉴클레오티드로 구성된다. 바람직한 구체예들에 있어서, N 및/또는 N'의 적어도 하나는 변성된 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이다.
다른 구체예들에 있어서, 구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 화합물은 그의 당 잔기(sugar residue) 내에서 변성된 적어도 하나의 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 화합물은 상기 당 잔기의 2' 포지션에 변성을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 2' 포지션에서의 상기 변성은 아미노, 플루오로, 알콕시 또는 알킬 성분의 존재를 포함한다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 2' 변성은 알콕시 성분을 포함한다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 알콕시 성분은 메톡시 성분(또한 2'-0-메틸; 2'OMe; 2'-OCH3로도 알려짐)이다. 일부 구체예들에 있어서 핵산 화합물은 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥의 어느 하나 또는 둘 다에서 2'OMe 당 변성 교호 리보뉴클레오티드(2'OMe sugar modified alternating ribonucleotides)를 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, 화합물은 상기 안티센스 가닥, (N)x 또는 N1-(N)x에서만 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드를 포함한다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 중간 리보뉴클레오티드; 예를 들면, 19-mer 가닥(19-mer strand) 내의 포지션 10 내에서의 리보뉴클레오티드가 미변성된다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 핵산 화합물은 적어도 5개의 교호 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드 및 미변성된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 부가의 구체예들에 있어서, 구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 화합물은 교호하는 포지션들에서 변성된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 (N)x 또는 N1-(N)x의 5' 및 3' 말단들에서의 각 리보뉴클레오티드는 그들의 당 잔기들 내에서 변성되고, 그리고 (N')y 또는 N2-(N)y의 5' 및 3' 말단들에서의 각 리보뉴클레오티드는 그들의 당 잔기들 내에서 미변성된다. 여러 구체예들에 있어서, 교호하는 포지션들에서의 상기 리보뉴클레오티드들은 상기 당 잔기의 2' 포지션에서 변성된다.
일부 구체예들에서, 상기 핵산 화합물은, 예를 들면, (5'>3') 포지션 1, 3, 5, 7 및 9 또는 포지션 11, 13, 15, 17, 19에서 적어도 5개의 교호하는 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드 및 미변성 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 구조(A1)의 (N)x 또는 구조(A2)의 Nl-(N)x는 포지션 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19에서 2'OMe 변성 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 구조(A1)의 (N)x 또는 구조(A2)의 Nl-(N)x는 포지션 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에서 2'OMe 변성 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 구조(A1)의 (N)x 또는 구조(A2)의 Nl-(N)x는 하나 또는 그 이상의 피리미딘 내에서 2'OMe 변성 리보뉴클레오티드를 포함한다.
구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 상기 안티센스 가닥의 어느 것도 3' 및 5' 말단들에서 포스포릴화되지 않는다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 상기 안티센스 가닥의 어느 하나 또는 둘 다는 3' 말단에서 포스포릴화된다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 상기 안티센스 가닥의 어느 하나 또는 둘 다는 5' 말단들에서 포스포릴화된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 이중 가닥 분자는 하기의 변성들 중 하나 또는 그 이상을 포함한다:
상기 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 포지션 5, 6, 7, 8 또는 9의 적어도 하나 내의 N이 DNA, TNA, 2'5' 뉴클레오티드 또는 미러 뉴클레오티드로부터 선택되고;
상기 센스 가닥의 5' 말단으로부터 포지션 9 또는 10의 적어도 하나 내의 N'가 TNA, 2'5' 뉴클레오티드 및 슈도우리딘(pseudoUridine)으로부터 선택되고; 그리고;
(N')y의 3' 말단 포지션들에서의 4, 5 또는 6개의 연속적인 포지션들 내의 N'가 2'5' 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 하기의 변성들의 조합을 포함한다:
상기 안티센스 가닥은 상기 5' 말단으로부터 포지션 5, 6, 7, 8 또는 9의 적어도 하나 내에 DNA, TNA, 2'5' 뉴클레오티드 또는 미러 뉴클레오티드를 포함하고; 그리고
상기 센스 가닥이 상기 5' 말단으로부터 포지션 9 또는 10 내에 TNA, 2'5' 뉴클레오티드 및 슈도우리딘 중의 적어도 하나를 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 하기의 변성들의 조합을 포함한다:
상기 안티센스 가닥이 상기 5' 말단으로부터 포지션 5, 6, 7, 8 또는 9들 중의 적어도 하나 내에 DNA, 2'5' 뉴클레오티드 또는 미러 뉴클레오티드를 포함하고; 그리고
상기 센스 가닥이 3' 페널티메이트(penultimate ; 끝에서 두번째의) 또는 3' 말단 포지션에서 4, 5 또는 6개의 연속적인 2'5' 뉴클레오티드를 포함한다.
구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, (N)y는 미러 뉴클레오티드, 2'5' 뉴클레오티드 및 TNA로부터 선택되는 적어도 하나의 독특한 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 독특한 성분은 미러 뉴클레오티드이다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 미러 뉴클레오티드는 L-리보뉴클레오티드(L-RNA) 및 L-디옥시리보뉴클레오티드(L-DNA)로부터 선택된다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 미러 뉴클레오티드는 L-DNA이다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥은 포지션 9 또는 10(상기 5' 말단으로부터) 내에 독특한 성분을 포함한다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥은 포지션 9(상기 5' 말단으로부터) 내에 독특한 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥은 19개의 뉴클레오티드의 길이이고 그리고 포지션 15(상기 5' 말단으로부터) 내에 4, 5 또는 6개의 연속적인 독특한 성분들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥은 포지션 15, 16, 17 및 18 내에 4개의 연속적인 2'5' 리보뉴클레오티드들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥은 포지션 15, 16, 17, 18 및 19 내에 5개의 연속적인 2'5' 리보뉴클레오티드들을 포함한다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥은 Z'를 더 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, Z'는 C3OH 성분 또는 C3Pi 성분을 포함한다.
구조(A1) 및/또는 구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, (N)y는 미러 뉴클레오티드 및 2'-5' 뉴클레오티드 간 인산 결합(2'-5' internucleotide phosphate bond)에 의해 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드로부터 선택되는 적어도 하나의 독특한 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 독특한 성분은 미러 뉴클레오티드이다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 미러 뉴클레오티드는 L-리보뉴클레오티드(L-RNA) 및 L-디옥시리보뉴클레오티드(L-DNA)로부터 선택된다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 미러 뉴클레오티드는 L-DNA이다.
구조(A1)의 일부 구체예들에 있어서, (N')y는 적어도 하나의 L-DNA 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, x=y=19이고 그리고 (N')y는 포지션 1 내지 17에서의 미변성된 리보뉴클레오티드 및 3' 페널티메이트 포지션(포지션 18)에서의 하나의 L-DNA로 구성된다. 다른 구체예들에 있어서, x=y=19이고 그리고 (N')y는 포지션 1 내지 16 및 19에서의 미변성된 리보뉴클레오티드 및 3' 페널티메이트 포지션(포지션 17 및 18)에서의 2개의 연속적인 L-DNA로 구성된다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 독특한 성분은 2'-5' 뉴클레오티드 간 인산 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드이다. 여러 구체예들에 따르면, (N')y는 2'-5' 뉴클레오티드 간 인산 결합에 의하여 3' 결합된 3' 말단에서의 2, 3, 4, 5 또는 6개의 연속적인 리보뉴클레오티드들을 포함한다. 하나의 구체예에 있어서, (N')y의 3' 말단에서의 4개의 연속적인 뉴클레오티드들은 3개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합들에 의해 결합된다. 하나의 구체예에 있어서, (N')y의 3' 말단에서의 5개의 연속적인 뉴클레오티드들은 4개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합들에 의해 결합된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 2'-5' 뉴클레오티드들 중의 하나 또는 그 이상이 2'-5' 포스포디에스테르 결합을 형성하고 상기 뉴클레오티드는 3'-O-메틸(3'OMe) 당 변성을 더 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, (N')y의 3' 말단 뉴클레오티드는 3'OMe 당 변성을 포함한다. 특정의 구체예들에 있어서, x=y=19이고 그리고 (N')y는 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 둘 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드들을 포함하고 2'-5' 뉴클레오티드 간 인산 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드를 포함한다. 여러 구체예들에 있어서, 2'-5' 뉴클레오티드 간 인산 결합을 형성하는 상기 뉴클레오티드는 3' 디옥시리보오스 뉴클레오티드 또는 3' 메톡시 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, x=y=19이고 그리고 (N')y는 포지션 15-16, 16-17 및 17-18 사이 또는 포지션 16-17, 17-18 및 18-19 사이에서 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, x=y=19이고 그리고 (N')y는 포지션 16-17 및 17-18 사이 또는 17-18 및 18-19 사이 또는 포지션 15-16 및 17-18 사이에서 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드들을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, (N')y 내의 피리미딘 리보뉴클레오티드(rU, rC)는 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드로 치환된다.
구조(A2)의 일부 구체예들에 있어서, (N)y는 적어도 하나의 L-DNA 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, x=y=18이고 그리고 N2-(N')y는 포지션 1 내지 17 및 19에서의 미변성된 리보뉴클레오티드 및 3' 페널티메이트 포지션(포지션 18)에서의 하나의 L-DNA로 구성된다. 다른 구체예들에 있어서, x=y=18이고 그리고 N2-(N')y는 포지션 1 내지 16 및 19에서의 미변성 리보뉴클레오티드 및 3' 페널티메이트 포지션(포지션 17 및 18)에서의 2개의 연속적인 L-DNA로 구성된다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 독특한 성분은 2'-5' 뉴클레오티드 간 인산 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드이다. 여러 구체예들에 따르면, N2-(N')y는 2'-5' 뉴클레오티드 간 인산 결합에 의하여 결합된 3' 말단에서의 2, 3, 4, 5 또는 6개의 연속적인 리보뉴클레오티드들을 포함한다. 하나의 구체예에 있어서, N2-(N')y의 3' 말단에서의 4개의 연속적인 뉴클레오티드들은 3개의 2'-5' 뉴클레오티드 간 인산 결합에 의하여 결합되고, 여기에서 상기 2'-5' 포스포디에스테르 결합을 형성하는 상기 2'-5' 뉴클레오티드들 중의 하나 또는 그 이상은 3'-0-메틸(3'OMe) 당 변성을 더 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, N2-(N')y의 3' 말단 뉴클레오티드는 2'OMe 당 변성을 포함한다. 특정의 구체예들에 있어서, x=y=18이고 그리고 N2-(N')y는 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서의 둘 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드들을 포함하고 2'-5' 뉴클레오티드 간 인산 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합되는 뉴클레오티드를 포함한다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 2'-5' 뉴클레오티드 간 인산 결합을 형성하는 상기 뉴클레오티드는 3' 디옥시리보오스 뉴클레오티드 또는 3' 메톡시 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, x=y=18이고 그리고 N2-(N')y는 포지션 16-17 및 17-18 사이 또는 포지션 17-18 및 18-19 사이 또는 포지션 15-16 및 17-18 사이에서 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드들을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, (N')y 내의 피리미딘 리보뉴클레오티드(rU, rC)들은 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드들을 포함한다.
구조(A1 및 A2)의 다른 구체예들에 있어서, (N')y는 1 내지 8개의 변성된 리보뉴클레오티드들을 포함하며 여기에서 상기 변성된 리보뉴클레오티드는 디옥시리보오스(DNA) 뉴클레오티드이다. 특정의 구체예들에 있어서, (N')y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개까지의 DNA 성분들을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에는 표 2에서 규정되고 그리고 본 출원에서 RHOA_48(시퀀스 동정 번호: 79 및 113), RHOA_48u(시퀀스 동정 번호: 80 및 114), RHOA_50(시퀀스 동정 번호: 82 및 116), RHOA_61(시퀀스 동정 번호: 89 및 123) 및 RHOA_61u(시퀀스 동정 번호: 90 및 124)로서 동정된 올리고뉴클레오티드쌍들로부터 선택되는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 RNA 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에는 표 2에서 규정되고 그리고 본 출원에서 RHOA_48(시퀀스 동정 번호: 79 및 113), RHOA_48u(시퀀스 동정 번호: 80 및 114), RHOA_50(시퀀스 동정 번호: 82 및 116), RHOA_61(시퀀스 동정 번호: 89 및 123) 및 RHOA_61u(시퀀스 동정 번호: 90 및 124)로서 동정된 올리고뉴클레오티드쌍들로부터 선택되는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 RNA 분자가 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 따르는 모든 포지션(5'>3')들은 5'로부터 3'로 계수된다.
일부 구체예들에 있어서, 이중 가닥 핵산 분자는 본 출원에서 RHOA_48로서 동정된, 시퀀스 동정 번호: l13 내에 규정된 안티센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호:79 내에 규정된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 하기 구조를 가지며:
Figure 112013006138949-pct00003
여기에서 "│"는 리보뉴클레오티드 사이의 염기짝지음(base parining)을 나타내고;
여기에서 A, C, G, U 각각은 독립적으로 미변성되거나 또는 변성된 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;
여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분들 또는 이들의 조합이고; 그리고
여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있으나, 그러나 존재하는 경우, 상기 센스 가닥의 상기 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분이다.
바람직한 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 변성된 리보뉴클레오티드 및 독특한 성분을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)은 (5'>3') 포지션 5, 6, 7 또는 8 중의 하나 또는 그 이상 내에 미러 뉴클레오티드 또는 2'-5' 연결 뉴클레오티드를 그리고 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)은 3' 말단 또는 페널티메이트 포지션들에서 4 또는 5개의 연속적인 2'-5' 연결 뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분, 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드 그리고 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡 성분을 포함한다. 상기 분자는 상기 안티센스 가닥 상에 5' 인산(5' phosphate)을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 오버행; 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 포지션 6에, 포지션 7에 또는 포지션 6 및 7들에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드를 더 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 6, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 또는 C30H 성분; 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48_S1833에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 6, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드, 포지션 6, 7 및 8들 중의 하나 또는 그 이상 내에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 또는 미러 뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 오버행; 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드, 포지션 6에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호:79)이 (5'>3') 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 또는 C30H 성분; 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 어베이직 성분, 역전된 어베이직 성분, C6 아미노 및 미러 뉴클레오티드들로부터 선택되는 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48_S1857에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드, 포지션 6에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드들, 3 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48_S1873에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 6에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드들, 3 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 미러 뉴클레오티드 (L-디옥시리보구아노신-3'-포스페이트)를 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 6, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 1에서 선택적 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드, 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 또는 C30H 성분; 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 어베이직 성분, 역전된 어베이직 성분, C6 아미노 및 미러 뉴클레오티드들로부터 선택되는 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48_S1856에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 6, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 1에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드, 3 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48_S1872에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 6, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 포지션 1에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드 및 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드들, 3 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 미러 뉴클레오티드(L-디옥시리보구아노신-3'-인산)를 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: l13)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들 및 포지션 6 및 7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 1에서 선택적 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드 및 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드들, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 또는 C30H 성분 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 어베이직 성분, 역전된 어베이직 성분 및 미러 뉴클레오티드들로부터 선택되는 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48_S1858에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 6 및 7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 1에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드 및 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드들, 3 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 성분 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48_S1859에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 6에서 미러 뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 1에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드, 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드들, 3 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48_S1860에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 113)이 (5'>3') 포지션 1, 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 8에서 미러 미러 뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 1에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드, 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드들, 3 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 성분 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 79)이 (5'>3') 포지션 1에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드 및 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드들, 3 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 성분 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하고, 그리고 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: l13)이 화합물 RHOA_48_S1884에서 규정된 바와 같이; (5'>3') 포지션 1 내에서의 U의 dT로의 치환, 포지션 1 내에서 상기 디옥시리보티미딘에 공유적으로 부착된 5' 인산, 포지션 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C3OH 성분을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 또는 화합물 RHOA_48_S1885에서 규정된 바와 같이; (5'>3') 포지션 1 내의 우리딘에 공유적으로 부착된 5' 인산, 포지션 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C3OH 성분을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 또는 화합물 RHOA_48_S1886에서 규정된 바와 같이; (5'>3') 포지션 1 내에서의 U의 C3로의 치환, 포지션 1 내에서 상기 C3에 공유적으로 부착된 5' 인산, 포지션 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C3OH 성분을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 또는 화합물 RHOA_48_S1887에서 규정된 바와 같이; (5'>3') 포지션 1 내의 우리딘에 공유적으로 부착된 5' 인산, 포지션 1, 3, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C3OH 성분을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드;들로부터 선택되는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 본 출원에서 RHOA_48u로 동정된, 시퀀스 동정 번호: 114에서 규정된 안티센스 및 시퀀스 동정 번호: 80에서 규정된 센스 가닥을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 하기 구조를 가지며:
Figure 112013006138949-pct00004
여기에서 "│"는 리보뉴클레오티드 사이의 염기짝지음을 나타내고;
여기에서 A, C, G, U 각각은 독립적으로 미변성되거나 또는 변성된 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;
여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분들 또는 이들의 조합이고; 그리고
여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있으나, 그러나 존재하는 경우, 상기 센스 가닥의 상기 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분이다.
바람직한 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 변성된 리보뉴클레오티드 및 독특한 성분들을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 114)은 (5'>3') 포지션 5, 6, 7 또는 8들 중의 하나 또는 그 이상 내에 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, (5'>3') 포지션 5, 6, 7 또는 8들 중의 하나 또는 그 이상 내에 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 오버행을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다. 상기 안티센스 가닥은 5' 말단 인산을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 80)은 (5'>3') 3' 말단 또는 페널티메이트 포지션들에서 4 또는 5개의 연속적인 2'-5' 결합 뉴클레오티드들, 상기 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡 성분을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 80)은 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들을 더 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48u_S1812에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: l14)이 (5'>3') 포지션 3, 6, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 80)이 (5'>3') 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 리보뉴클레오티드들, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 성분; 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48u_S1813에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: l14)이 (5'>3') 포지션 3, 6, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 80)이 (5'>3') 포지션 13 및 16에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 성분; 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 성분을 포함하는 이중나선 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48u_S1870에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 114)이 (5'>3') 포지션 3, 6, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오디드들, 포지션 7에서 2'-5' 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 80)이 (5'>3') 포지션 1에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드, 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 리보뉴클레오티드들, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 성분; 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 미러 뉴클레오티드(L-디옥시리보구아노신-3'-인산)를 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 화합물 RHOA_48u_S1871에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 114)이 (5'>3') 포지션 3, 6, 11, 14, 15, 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 80)이 (5'>3') 포지션 1에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드, 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 2'-5' 리보뉴클레오티드들, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 성분; 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 이중 가닥 핵산 분자는, 본 출원에서 RHOA_50으로 동정된 바와 같은, 시퀀스 동정 번호: 116에서 규정된 안티센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호: 82에서 규정된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 하기의 구조를 가지며:
Figure 112013006138949-pct00005
여기에서 "│"는 리보뉴클레오티드 사이의 염기짝지음을 나타내고;
여기에서 A, C, G, U 각각은 독립적으로 미변성되거나 또는 변성된 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;
여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분들 또는 이들의 조합이고; 그리고
여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있으나, 그러나 존재하는 경우, 상기 센스 가닥의 상기 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분이다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 116)이 (5'>3') 포지션 5, 6, 7 또는 8 중의 어느 하나 또는 그 이상 내에 DNA, 미러 뉴클레오티드 또는 2'-5' 결합 뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분 및 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 116)은 (5'>3') 포지션 5, 6, 7 또는 8 중의 어느 하나 또는 그 이상 내에 교호하는 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 미러 뉴클레오티드 또는 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 포지션 1 내에서의 U(우리딘)의 dU(디옥시우리딘)으로의 치환을 더 포함한다. 상기 안티센스 가닥은 5' 말단 인산을 더 포함할 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 82)은 (5'>3') 포지션 9 또는 10 중의 어느 하나 또는 그 이상 내에 미러 뉴클레오티드 또는 2'-5' 결합 뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드, 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡 성분을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_50_S1796에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: l16)이 (5'>3') 포지션 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 및 19 내에 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7 내에 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분 및 포지션 1 내에 U(우리딘)의 dU(디옥시우리딘)으로의 치환을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 82)이 (5'>3') 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 11, 13 및 18에서 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_50_S1798에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: l16)이 (5'>3') 포지션 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19 내에 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7 내에 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분 및 포지션 1 내에 U(우리딘)의 dU(디옥시우리딘)으로의 치환을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 82)이 (5'>3') 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 18에서 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_50_S1799에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: l16)이 (5'>3') 포지션 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 및 19 내에 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7 내에 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분 및 포지션 1 내에 U(우리딘)의 dU(디옥시우리딘)으로의 치환을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 82)이 (5'>3') 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 18에서 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_50_S1865에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: l16)이 (5'>3') 포지션 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19 내에 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7 내에 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분 및 포지션 1 내에 U(우리딘)의 dU(디옥시우리딘)으로의 치환을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 82)이 (5'>3') 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_50_S1866에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: l16)이 (5'>3') 포지션 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 및 19 내에 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7 내에 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분 및 포지션 1 내에 U(우리딘)의 dU(디옥시우리딘)으로의 치환을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 82)이 (5'>3') 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 17 및 18에서 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 이중 가닥 핵산 분자는 본 출원에서 RHOA 61로 동정된, 시퀀스 동정 번호: 123에서 규정된 안티센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호: 89에서 규정된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 하기 구조를 가지며:
Figure 112013006138949-pct00006
여기에서 "│"는 리보뉴클레오티드 사이의 염기짝지음을 나타내고;
여기에서 A, C, G, U 각각은 독립적으로 미변성되거나 또는 변성된 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;
여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분들 또는 이들의 조합이고; 그리고
여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있으나, 그러나 존재하는 경우, 상기 센스 가닥의 상기 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분이다.
바람직한 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 변성된 리보뉴클레오티드들 및 독특한 성분들을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 123)은 (5'>3') 포지션 5, 6, 7 또는 8 중의 어느 하나 또는 그 이상 내에 DNA, 미러 뉴클레오티드 또는 2'-5' 결합 뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분 및 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 89)은 3' 말단 또는 페널티메이트 포지션에서 4 또는 5개의 연속적인 2'-5' 결합 뉴클레오티드들 또는 3' 말단에 공유적으로 부착된 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥은 포지션 9 및 10 중의 하나 또는 둘 다의 내에 DNA, 미러 뉴클레오티드 또는 2'5' 결합 뉴클레오티드를 더 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 이중 가닥 핵산 분자는 본 출원에서 RHOA_61U로 동정된, 시퀀스 동정 번호: 124에서 규정된 안티센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호: 90에서 규정된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 하기의 구조를 가지며:
Figure 112013006138949-pct00007
여기에서 "│"는 리보뉴클레오티드 사이의 염기짝지음을 나타내고;
여기에서 A, C, G, U 각각은 독립적으로 미변성되거나 또는 변성된 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;
여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분들 또는 이들의 조합이고; 그리고
여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있으나, 그러나 존재하는 경우, 상기 센스 가닥의 상기 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분이다.
바람직한 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 변성된 리보뉴클레오티드들 및 독특한 성분들을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 124)이 (5'>3') 포지션 5, 6, 7 또는 8 중의 하나 또는 그 이상 내에 DNA, 미러 뉴클레오티드 또는 2'-5' 결합 뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분 및 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 90)은 3' 말단 또는 페널티메이트 포지션에서 4 또는 5개의 연속적인 2'-5' 결합 뉴클레오티드들 또는 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥은 포지션 9 및 10 중의 하나 또는 둘 다 내에 DNA, 미러 뉴클레오티드 또는 2'5' 결합 뉴클레오티드를 더 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서는 표 2에서 규정되고 그리고 본 출원에서 RHOA_58(시퀀스 동정 번호: 143 및 157) 및 RHOA_70(시퀀스 동정 번호: 146 및 160)으로 동정된 올리고뉴클레오티드쌍들로부터 선택되는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 RNA 분자가 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 이중 가닥 핵산 분자는 본 출원에서 RHOA 58로 동정된, 시퀀스 동정 번호: 157로 규정된 안티센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호: 143로 규정된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 이중 가닥 핵산 분자는 하기의 구조를 가지며:
Figure 112013006138949-pct00008
여기에서 "│"는 리보뉴클레오티드 사이의 염기짝지음을 나타내고;
여기에서 A, C, G, U 각각은 독립적으로 미변성되거나 또는 변성된 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;
여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분들 또는 이들의 조합이고; 그리고
여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있으나, 그러나 존재하는 경우, 상기 센스 가닥의 상기 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분이다.
바람직한 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 변성된 리보뉴클레오티드들 및 독특한 성분들을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 157)이 (5'>3') 포지션 5, 6, 7 또는 8 중의 하나 또는 그 이상 내에 미러 뉴클레오티드 또는 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 및 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 5' 말단 인산을 더 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 143)은 3' 말단 또는 페널티메이트 포지션에서 4 또는 5개의 연속적인 2'-5' 결합 뉴클레오티드들 또는 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡 성분을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥은 (5'>3') 포지션 9 및 10 중의 하나 또는 둘 다의 내에 DNA, 미러 뉴클레오티드 또는 2'-5' 결합 뉴클레오티드를 더 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_58_S1801에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 157)이 (5'>3') 포지션 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분을 포함하고 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 143)이 (5 '>3') 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 5개의 연속적인 2'-5' 결합 뉴클레오티드들, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_58_S1804에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 157)이 (5'>3') 포지션 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분을 포함하고 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 143)이 (5 '>3') 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에서 5개의 연속적인 2'-5' 결합 뉴클레오티드들, 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_58_S1806에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 1157)이 (5'>3') 포지션 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션7에서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분을 포함하고 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 143)이 (5'>3') 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 11, 13 및 17에서 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_58_S1861에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 157)이 (5'>3') 포지션 4, 8, 11, 13, 15, 17 및 19 내에 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 6 내에 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 143)이 (5'>3') 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 11, 13 및 17에서 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_58_S1862에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 157)이 (5'>3') 포지션 4, 8, 11, 13, 15, 17 및 19 내에 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 6에서 U의 dT로의 치환 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 143)이 (5'>3') 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 11, 13 및 17에서 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_58_S1877에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 157)이 (5'>3') 포지션 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에서 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 7 내에 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분을 포함하고 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 143)이 (5'>3') 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 11,13 및 17에서 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 미러 뉴클레오티드(L-디옥시리보구아노신-3'-인산) 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_58_S1878에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 157)이 (5'>3') 포지션 4, 8, 11, 13, 15, 17 및 19 내에 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 6 내에 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi- C30H 비-뉴클레오티드 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 143)이 (5'>3') 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 11, 13 및 17에서 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 미러 뉴클레오티드 (L-디옥시리보구아노신-3'-인산) 캡 성분을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, RHOA_58_S1879에서 규정된 바와 같이, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 157)이 (5'>3') 포지션 4, 8, 11 , 13, 15, 17 및 19 내에 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드들, 포지션 6 내의 dT 및 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi-C30H 비-뉴클레오티드 성분을 포함하고; 그리고 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 143)이 (5'>3') 3' 말단에 공유적으로 부착된 C3Pi 비-뉴클레오티드 성분, 포지션 11, 13 및 17에서 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 포지션 9에서 2'-5' 결합 뉴클레오티드 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 미러 뉴클레오티드(L-디옥시리보구아노신-3'-인산)을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 이중 가닥 핵산 분자는 본 출원에서 RHOA_70으로 동정된, 시퀀스 동정 번호: 160에서 규정된 안티센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호: 146에서 규정된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 하기의 구조를 가지며:
Figure 112013006138949-pct00009
여기에서 "│"는 리보뉴클레오티드 사이의 염기짝지음을 나타내고;
여기에서 A, C, G, U 각각은 독립적으로 미변성되거나 또는 변성된 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;
여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분들 또는 이들의 조합이고; 그리고
여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있으나, 그러나 존재하는 경우, 상기 센스 가닥의 상기 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분이다.
바람직한 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 변성된 리보뉴클레오티드들 및 독특한 성분들을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 안티센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 160)이 (5'>3') 포지션 5, 6, 7 또는 8 중의 하나 또는 그 이상 내에 DNA, 미러 뉴클레오티드 또는 2'-5' 결합 뉴클레오티드, 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분 및 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자가 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 5' 말단 인산을 더 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥(시퀀스 동정 번호: 146)은 3' 말단 또는 페널티메이트 포지션에서 4 또는 5개의 연속적인 2'-5' 결합 뉴클레오티드들 또는 하나 또는 그 이상의 2'OMe 당 변성 뉴클레오티드들, 3' 말단에 공유적으로 부착된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분 및 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡 성분을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥은 (5'>3') 포지션 9 및 10 중의 하나 또는 둘 다 내에 DNA, 미러 뉴클레오티드 또는 2'5' 결합 뉴클레오티드를 더 포함한다.
제2의 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 이러한 핵산 화합물들; 및 약제학적으로 수용가능한 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 dsRNA는 원래 상태(naked)의 dsRNA로서 투여된다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 화합물은 약물 담체(drug carrier) 내에 캡슐화된다(encapsulated).
제3의 관점에 있어서, 본 발명은 중추신경계(CNS), 말초신경계(PNS), 전정감각계(vestibular sensory sytem), 시각계(visual system) 및/또는 순환계(정맥(vascular), 동맥(arterial)) 내에서의 질병 또는 장애로 고통받는 대상체를 치료하는 데 사용하거나 또는 악성 질병 또는 장애, 예를 들면, 암으로 고통받는 대상체를 치료하는 데 사용되는 본 출원에 따른 화합물에 관한 것이다. 본 출원에서는 중추신경계(CNS) 및/또는 말초신경계(PNS) 내에서의 손상(injury), 질병, 장애 또는 상태에 의해 야기되는 신경퇴화의 억제, 저해 또는 치료를 필요로 하는 개체에 상기 손상, 질병, 장애 또는 상태를 치료하는 데 유효한 양의 구조(A1) 및/또는 구조(A2)에 따른 핵산 화합물을 투여하는 것을 포함하는 중추신경계 및/또는 말초신경계 내에서의 손상, 질병, 장애 또는 상태에 의해 야기되는 신경퇴화를 억제, 저해 또는 치료하기 위한 방법이 제공된다. 신경 손상(neurological injury)로 고통받는 개체에 신경 보호(neuroprotection)를 부여하는 방법이 또한 제공되며, 이는 상기 개체에 구조(A1) 및/또는 구조(A2)에 따른 화합물 또는 그의 약제학적으로 수용가능한 염을 상기 신경 손상과 연관된 신경퇴화를 개선하는 데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.
다른 관점에 있어서, 중추신경계, 말초신경계, 전정감각계, 시각계 및/또는 순환계(정맥, 동맥) 내에서의 질병 또는 장애의 치료를 위한 약물(medicament)의 제조를 위한 본 출원에서 기술되는 핵산 화합물의 용도가 제공된다. 다른 관점에 있어서, 악성 질병 또는 장애, 예를 들면, 암의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 본 출원에서 기술되는 핵산 화합물의 용도가 제공된다. 특정의 구체예들에 있어서, 본 발명은 신경 재생 및 신경 보호, 중추신경계(CNS)의 손상, 척수 손상(SCI), 뇌 손상, 말초신경 손상(PNI), 신경 장애(neurological disorders), 안질환(ocular diseases) 및 전정계(vestibular system)의 장애 및 질병 및 장애들에 연관되는 상태들을 포함하나 이들로 제한되지 않는 질병, 장애, 손상 및 상태들의 치료에서의 화학적으로 변성된 dsRNA 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 조성물 및 이들의 사용방법을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 화합물은 신경퇴화를 완화시킨다. 신경퇴화에는, 예를 들면, 시신경(optic nerve) 및 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell)를 포함하는 망막(retina)의 퇴화를 포함한다. 이는 또한 내이(inner ear)로부터의 뇌로의 소리 및 평형 정보(equilibrium information)를 전달하는 책임이 있는 청신경(auditory nerve ; 또한 전정와우신경(vestibulocochlear nerve) 및 내이신경(acoustic nerve)이라고도 알려짐)의 퇴화를 포함한다. 상기 내이의 모세포(hair cells)는 상기 청신경을 통하여 뇌로 정보를 전달하며, 이는 와우신경(cochlear nerve)과 전정신경(vestibular nerve)으로 이루어지고, 연수(medulla oblongata)로부터 돌출되고 그리고 안면 신경(facial nerve)을 따라 측두골(temporal bone) 내의 속귀길(internal acoustic meatus ; 또는 내이도(internal auditory meatus))을 통하여 두개골 내로 들어간다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 본 출원에서 기술되는 핵산 분자의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 시신경 또는 망막 신경절 세포에서의 신경퇴화를 완화시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 녹내장 또는 비동맥전방허혈성시신경증(Non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy ; NAION)을 앓고 있는 대상체이다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 본 출원에서 기술되는 핵산 분자의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 청신경에서의 신경퇴화를 완화시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 메니에르병(Meniere's disease)을 앓고 있는 대상체이다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 본 출원에서 기술되는 핵산 분자의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 시신경 또는 망막 신경절 세포에 대한 신경 보호를 부여하는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 녹내장 또는 비동맥전방허혈성시신경증을 앓고 있는 대상체이다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 본 출원에서 기술되는 핵산 분자의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 청신경 및 또는 나선 신경절 세포(spiral ganglion cells)에 대한 신경 보호를 부여하는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 메니에르병을 앓고 있는 대상체이다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 본 출원에서 기술되는 핵산 분자의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 신경병증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 자율신경병증(autonomic neuropathy), 암-연관 신경병증(cancer-related neuropathy), 압박성 신경병증(compressive neuropathy), 당뇨병 신경병증(diabetic neuropathy), 약물-유발 신경병증(drug-induced neuropathy), 중독성 신경병증(toxic neuropathy), 화학요법-유발 신경병증(chemotherapy-induced neuropathy), 위장관 신경병증(gastrointestinal neuropathy), 영양-연관 신경병증(nutrition-related neuropathy), 유전성 신경병증(hereditary neuropathy), 면역-매개 신경병증(immune-mediated neuropathy) 및 만성 면역-매개 다발 신경병증(chronic immune -mediated poly neuropathy), 전염성 신경병증(infectious neuropathy) 또는 신경병증성 통증을 앓고 있는 대상체이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 당뇨병 신경병증을 앓고 있는 대상체이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 이질통을 앓고 있는 대상체이다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 본 출원에서 기술되는 핵산 분자의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 비정상적인 및/또는 혼란된 세포 운동성(cell motility), 세포 골격 조절(cytoskeleton regulation) 및/또는 미세소관 조직(microtubule organization)과 연관된 질병 또는 장애로 고통받는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 혈관형성 장애(angiogenic disorder), 관다발계 질병(vascular diseases) 및/또는 동맥 질환(arterial diseases)을 앓고 있는 대상체이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 각막혈관형성(corneal angiogenic) 질병 또는 장애, 망막혈관형성(retinal angiogenic) 질병 또는 장애, 맥락막혈관신생(choroidal angiogenic) 질병 또는 장애 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 안혈관신생(ocular angiogenic) 질병 또는 장애로 고통받는 대상체이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 망막병증(retinopathy), 예를 들면, 당뇨병 망막병증(diabetic retinopathy)으로 고통받는 대상체이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 각막이식거부(corneal graft rejection)의 위험이 있거나 고통받는 각막이식환자(corneal transplant patient)이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 협착재발(restenosis)의 위험이 있거나 고통받는 대상체이다.
이러한 방법들은 이러한 치료를 필요로 하는 포유동물에 RhoA의 발현 또는 활성을 억제하거나 또는 감소시키는, 본 출원에서 기술되는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자들의 예방의학적으로 또는 치료학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 시퀀스 동정 번호: 1에서 규정된 바와 같은 RhoA의 발현을 감소시키거나 또는 억제하는 핵산 분자의 일정한 양을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, RhoA의 발현과 연관되는 질병 또는 장애와 연관되는 질병 또는 장애 또는 증후군들의 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 합성된 예시적인 dsRNA의 표를 제공한다. 상기 분자들의 일부는 서로 다른 농도들에서 시험관 내에서 시험되었으며, %잔류 mRNA가 제공되었다.
도 2는 생쥐(rats)들에서의 시신경 파괴(Optic Nerve Crush) 후의 망막 신경절 세포 재생을 유도하기 위한 상승 투여량(Escalating Doses)의 dsRhoA 화합물의 능력을 측정하기 위한 생체 내 연구에서 dsRhoA 처리 후의 평균 망막 신경절 세포 생존율(Mean RGC survival)을 나타내는 도면이다.
도 3은 생쥐들에서의 시신경 파괴 후의 망막 신경절 세포 재생을 유도하기 위한 상승 투여량의 dsRhoA 화합물의 능력을 측정하기 위한 생체 내 연구에서 dsEGFP와 비교한 망막 신경절 세포 생존율의 증가를 나타내는 도면이다.
도 4는 척수강내 펌프 이식(IT Pump Implantation) 및 가바펜틴 치료(Gabapentin treatment)를 통하여 투여되는 시험 아이템(Test Items)들을 나타내는 도면이다.
도 5는 척수강내 단일 요추 주사(IT Single Lumbar Injection)를 통하여 투여되는 시험 아이템들을 나타내는 도면이다.
RhoA의 발현을 하향-조절하는 화합물, 특히 화학적으로 변성된 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드(dsRNAs) 및 여러 질병 및 의학적 상태들, 특히 중추신경계(CNS)의 질병 및 장애의 치료에서의 이들 신규한 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드들의 용도에 관하여 기술된다. 하나의 관점에 따르면, 본 발명은 미변성된 그리고 변성된 뉴클레오티드 및 또는 독특한 성분을 포함하는 억제성 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다. 상기 화합물에는 당 변성, 염기 변성 및 뉴클레오티드 결합 간 변성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 변성된 뉴클레오티드를 포함하며, 또한 DNA 및 잠금 핵산(LNA ; locked nucleic acid), 에틸렌-가교화 핵산(ENA ; ethylene-bridged nucleic acid), 펩티드 헥산(PNA ; peptide nucleic acid), 아라비노시드(arabinoside), PACE, 미러 뉴클레오티드, 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드 또는 6탄당(6 carbon sugar)을 포함하는 변성된 뉴클레오티드 또는 독특한 성분들을 더 포함할 수 있다.
RhoA는 망막 신경절 세포를 포함하는 중추신경계 신경들 내에서의 운동성, 성장, 분화 및 세포자살 등과 같은 세포 기능들을 조절하는 작은 구아노신트리포스페이트 분해효소 단백질(GTPase protein ; Guanosine Triphosphatase protein)이다. RhoA는 또한 신경 면역 세포(neural immune cells ; 미세아교세포(microglia) 및 마크로파지(macrophages)) 및 성상교세포(astrocytes)에서의 신호화(signalling)에 의하여 이차성 염증 및 반흔성 중추신경계 손상 반응(secondary inflammatory and scarring CNS injury responses)에 관여한다. 치료될 특정의 질병 및 상태에는 척수 손상, 녹내장, 노인황반변성(AMD ; Age related Macular Degeneration), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease) 및 파킨슨씨병(Parkinson's disease)을 포함하여 신경퇴화성 질병들, 루게릭병(ALS ; amyotrophic lateral sclerosis ; 근육위축가쪽경화증), 뇌졸증, 외상성 뇌 손상(TBI) 등이 포함된다.
본 상세한 설명에 따른 siRNA 화합물을 생성하는 데 유용한 바람직한 센스 시퀀스 및 안티센스 시퀀스의 목록이 표 1, 표 2 및 표 3에 제공된다. RhoA를 하향-조절하는 방법, 핵산 분자 및 조성물이 본 출원에서 충분히 기술되며, 상기 임의의 분자 및/또는 조성물이 상기한 임의의 상태로 고통받는 대상체의 치료에서 유리하게 사용될 수 있다.
본 출원에서 제공되는 상기 핵산 화합물은 활성을 증가시키고, 안정성을 증가시키고 및 또는 독성을 최소화시킬 수 있는 구조 및 변성들을 소유하며; 본 출원에서 기술되는 dsRNA 화합물을 생성하는 데 유용한 상기 신규한 변성들은 RhoA 발현을 방지하거나 또는 약화시키는 데 유용한 이중 가닥 RNA에 유리하게 적용될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 구조(A1)을 갖는 이중 가닥 RNA 화합물이 제공된다:
Figure 112013006138949-pct00010
여기에서 N 및 N' 각각은 미변성되거나 또는 변성될 수 있는 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;
여기에서 (N)x 및 (N')y 각각은 연속적인 N 또는 N' 각각이 공유결합에 의하여 후속의 N 또는 N'에 연결되는 올리고뉴클레오티드이고;
여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드, 1 내지 5개의 연속적인 비-뉴클레오티드 성분 또는 이들의 조합을 포함하고;
여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있으나, 그러나 존재하는 경우, (N')y의 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분이고;
x 및 y 각각은 독립적으로 18 내지 40의 정수이고;
여기에서 (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 상보적이고; 그리고
여기에서 (N)x는 표 3 또는 표 4에서 규정된 안티센스 시퀀스를 포함한다.
표 3에서 제공된 dsRNA 화합물을 생성하는 데 유용한 상기 센스 시퀀스 및 안티센스 시퀀스는 RHOA_31(시퀀스 동정 번호: 135 및 149), RHOA_33(시퀀스 동정 번호: 136 및 150), RHOA_37(시퀀스 동정 번호: 137 및 151), RHOA_38(시퀀스 동정 번호: 138 및 152), RHOA_43(시퀀스 동정 번호: 139 및 153), RHOA_52(시퀀스 동정 번호: 140 및 154), RHOA_56(시퀀스 동정 번호: 141 및 155), RHOA_57(시퀀스 동정 번호: 142 및 156), RHOA_58(시퀀스 동정 번호: 143 및 157), RHOA_68(시퀀스 동정 번호: 144 및 158), RHOA_69(시퀀스 동정 번호: 145 및 159), RHOA_70(시퀀스 동정 번호: 146 및 160), RHOA_73(시퀀스 동정 번호: 147 및 161) 및 RHOA_76(시퀀스 동정 번호: 148 및 162)이다. 표 4에서 제공된 dsRNA 화합물을 생성하는 데 유용한 상기 센스 시퀀스 및 안티센스 시퀀스는 RHOA_23(시퀀스 동정 번호: 163 및 167), RHOA_24(시퀀스 동정 번호:164 및 168), RHOA_26(시퀀스 동정 번호: 165 및 169) 또는 RHOA_29(시퀀스 동정 번호: 166 및 170)에서 규정된다.
일부 구체예들에 있어서 각 연속적인 N 및/또는 N'를 결합하는 상기 공유결합은 포스포디에스테르 결합이다.
일부 구체예들에 있어서, x = y이고 그리고 x 및 y 각각은 19, 20, 21, 22 또는 23이다. 바람직한 구체예들에 있어서, x = y = 19이다.
본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, dsRNA 분자)의 일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 siRNA, siNA 또는 miRNA이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 RHOA_58(시퀀스 동정 번호: 143 및 157)에서 규정되는 시퀀스쌍들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 RHOA_70(시퀀스 동정 번호: 146 및 160)에서 규정되는 시퀀스쌍들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 DNA 성분 또는 상기 안티센스 가닥(5' 말단)의 포지션 1에서 표적에 대한 미스매치를 포함한다. 이러한 듀플렉스 구조가 본 출원에서 기술된다. 하나의 구체예에 따르면, 이하에서 규정되는 구조(A2)를 갖는 이중 가닥 siRNA가 제공된다:
Figure 112013006138949-pct00011
여기에서 N1, N2, N 및 N' 각각은 독립적으로 미변성되거나 또는 변성된 뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;
여기에서 (N)x 및 (N')y 각각은 연속적인 N 또는 N' 각각이 공유결합에 의하여 인접하는 N 또는 N'에 연결되는 올리고뉴클레오티드이고;
여기에서 x 및 y 각각은 독립적으로 17 내지 39 사이의 정수이고;
여기에서 N2는 (N')y에 공유적으로 결합되고;
여기에서 N1은 (N)x에 공유적으로 결합하고 그리고 표적 mRNA(시퀀스 동정 번호: 1)에 미스매치이거나 또는 상기 표적 mRNA에 상보적 DNA 성분이고;
여기에서 N1은 천연의 또는 변성된; 우리딘, 디옥시리보우리딘, 리보티미딘, 디옥시리보티미딘, 아데노신 또는 디옥시아데노신, 어베이직 리보오스 성분 및 어베이직 디옥시리보오스 성분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분이고;
여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있으나, 그러나 존재하는 경우, N2-(N')y의 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분이고;
여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드, 1 내지 5개의 연속적인 비-뉴클레오티드 성분 또는 이들의 조합이고; 그리고
여기에서 (N')y의 시퀀스가 (N)x의 시퀀스에 상보적이고; 그리고
여기에서 (N)x의 시퀀스가 표 1에서 규정된 안티센스 시퀀스를 포함한다.
여러 구체예들에 있어서, Nl-(N)x의 시퀀스는 표 2에서 규정된 안티센스 시퀀스를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, dsRNA 화합물을 생성하는데 유용한 상기 N2-(N')y 및 Nl-(N)x는 표 2에 제공되고 그리고 RHOA_32(시퀀스 동정 번호: 67 및 101), RHOA_34(시퀀스 동정 번호: 68 및 102), RHOA_35(시퀀스 동정 번호: 69 및 103), RHOA_36(시퀀스 동정 번호: 70 및 104), RHOA_39(시퀀스 동정 번호: 71 및 105), RHOA_40(시퀀스 동정 번호: 72 및 106), RHOA_41(시퀀스 동정 번호: 73 및 107), RHOA_42(시퀀스 동정 번호: 74 및 108), RHOA_44(시퀀스 동정 번호: 75 및 109), RHOA_45(시퀀스 동정 번호: 76 및 110), RHOA_46(시퀀스 동정 번호: 77 및 111), RHOA_47(시퀀스 동정 번호: 78 및 112), RHOA_48(시퀀스 동정 번호: 79 및 113), RHOA_48u(시퀀스 동정 번호: 80 및 114), RHOA_49(시퀀스 동정 번호: 81 및 115), RHOA_50(시퀀스 동정 번호: 82 및 116) RHOA_51(시퀀스 동정 번호: 83 및 117), RHOA_53(시퀀스 동정 번호: 84 및 118), RHOA_54(시퀀스 동정 번호: 85 및 119), RHOA_55(시퀀스 동정 번호: 86 및 120), RHOA_59(시퀀스 동정 번호: 87 및 121), RHOA_60(시퀀스 동정 번호: 88 및 122), RHOA_61(시퀀스 동정 번호: 89 및 123), RHOA_61u(시퀀스 동정 번호: 90 및 124), RHOA_62(시퀀스 동정 번호: 91 및 125), RHOA_63(시퀀스 동정 번호: 92 및 126), RHOA_64(시퀀스 동정 번호: 93 및 127), RHOA_65(시퀀스 동정 번호: 94 및 128), RHOA_66(시퀀스 동정 번호: 95 및 129), RHOA_67(시퀀스 동정 번호: 96 및 130), RHOA_71(시퀀스 동정 번호: 97 및 131), RHOA_72(시퀀스 동정 번호: 98 및 132), RHOA_74(시퀀스 동정 번호: 99 및 133) 및 RHOA_75(시퀀스 동정 번호: 100 및 134)에서 규정된다.
상기 센스 시퀀스(승객가닥(passenger strand)) 및 안티센스 시퀀스(안내가닥(guide strand))를 활용하는 신규한 dsRNA 화합물이 본 출원에서 규정된다.
정의
편의를 위하여, 본 명세서, 실시예들 및 특허청구범위들에서 사용되는 특정의 용어들이 여기에서 기술된다.
여기서 사용된 것으로, 단수 형태는 내용이 명백하게 다른 것을 언급하지 않는 한 복수형을 포함한다. 본 발명의 관점들 및 구체예들이 마커쉬 군(Markush groups) 또는 다른 대안의 군(grouping of alternatives)으로 기술되는 경우, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 또한 그에 의하여 상기 군의 임의의 개개 구성원(individual member) 또는 종속군(subgroup)의 관점에서 기술된다는 것을 인지할 수 있을 것이다.
"저해제(inhibitor)"는 원하는 생물학적 또는 생리학적 효과를 달성하기에 충분한 정도로 유전자의 발현 또는 이러한 유전자의 산물의 활성을 (부분적으로 또는 완전하게) 하향-조절 또는 감소시킬 수 있는 화합물이다. 본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "저해제"는 dsRNA, siRNA, shRNA, 합성 shRNA; miRNA, 안티센스 RNA 및 DNA 및 리보자임(ribozymes)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 억제제를 의미한다.
"dsRNA 저해제(dsRNA inhibitor)"는 원하는 생물학적 또는 생리학적 효과를 달성하기에 충분한 정도로 유전자의 발현 또는 이러한 유전자의 산물의 활성을 하향-조절 또는 감소시킬 수 있는 화합물이다. 본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "dsRNA 저해제"는 dsRNA, siRNA, shRNA, 합성 shRNA; miRNA 중의 하나 또는 그 이상을 의미한다. 저해는 또한 RNA에 대해 하향-조절 또는 침묵(silencing)으로 언급될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "저해"는 원하는 생물학적 또는 생리학적 효과를 달성하기에 충분한 정도로 유전자의 발현 또는 이러한 유전자의 산물의 활성을 하향-조절 또는 감소시키는 것을 의미한다. 저해는 완전한 것이나 또는 부분적인 것으로 될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, RohAdml "저해" 또는 "하향-조절"은 유전자 발현(전사 또는 번역) 또는 폴리펩티드 활성의 하향-조절 또는 저해를 의미한다. 표적 mRNA 시퀀스의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 mRNA 시퀀스 또는 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 1에서 규정되는 RhoA mRNA에 대하여 적어도 70% 유사성(identity), 보다 바람직하게는 80% 유사성, 심지어 보다 바람직하게는 90% 또는 95% 유사성을 갖는 임의의 상동 시퀀스(homologous sequences)를 의미한다. 따라서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 돌연변이(mutations), 개조(alterations) 또는 변성을 수행한 폴리뉴클레오티드 시퀀스가 본 발명에 포함된다. 용어 "mRNA 폴리뉴클레오티드 시퀀스" 및 "mRNA"는 상호호환가능하게 사용된다. RhoA는 액틴(action) 세포 골격(cytoskeleton)을 조절하는 구아노신트리포스페이트 분해효소 단백질이고 그리고 이는 후속하는 척수 손상으로 상향조절되고 그리고 눈의 섬유주(trabecular meshwork) 내에서 발현되는 것을 밝혀졌다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 상호호환가능하게 사용될 수 있으며, 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 뉴클레오티드 시퀀스를 의미한다. 상기 용어들은 또한 뉴클레오티드 유사체들로 만들어지는 RNA 또는 DNA의 등가물(equivalents), 유사체(analogs) 등을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 출원 전체를 통하여, mRNA 시퀀스는 대응하는 유전자들을 나타내는 것으로 규정된다.
"올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고머"는 약 2 내지 약 50개의 뉴클레오티드드의 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 의미한다. DNA 뉴클레오티드 또는 RNA 뉴클레오티드 각각은 독립적으로 천연 또는 합성의 및 또는 변성되거나 또는 미변성된 것일 수 있다. 변성들에는 상기 올리고뉴클레오티드 내의 당 성분, 염기 성분 및 뉴클레오티드들 간의 결합들에서의 변화들이 포함된다. 본 출원에서 기술되는 상기 화합물들에는 디옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변성된 디옥시리보뉴클레오티드, 변성된 리보뉴클레오티드 및 이들의 조합을 포함하는 분자들이 포함된다.
"리보뉴클레오티드"는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 의미하며, 이는 천연 또는 합성의 및 또는 변성되거나 또는 미변성된 것일 수 있다. 변성들에는 상기 올리고리보뉴클레오티드 내의 당 성분, 염기 성분 및 리보뉴클레오티드들 간의 결합에서의 변화들이 포함된다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리보뉴클레오티드"는 천연 및 합성의, 미변성되고 그리고 변성된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 변성들에는 상기 올리고리보뉴클레오티드 내의 당 성분, 염기 성분 및/또는 리보뉴클레오티드들 간의 결합에서의 변화들이 포함된다.
일부 구체예들에 따르면, 미변성되고 그리고 변성된 뉴클레오티드 및 또는 독특한 성분을 포함하는 저해성 올리고뉴클레오티드 화합물(inhibitory oligonucleotide compounds)이 제공된다. 상기 화합물은 당 변성, 염기 변성 및 뉴클레오티드 간 결합 변성들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 변성된 뉴클레오티드를 포함하며, DNA 및 잠금 핵산, 에틸렌-가교화 핵산, 펩티드 헥산, 아라비노시드, PACE, 미러 뉴클레오티드 등과 같은 변성된 뉴클레오티드 또는 6탄당을 갖는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드의 모든 유사체들 또는 이들에 대한 변성들은 상기 유사체들 또는 변성들이 상기 뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드의 기능에 실질적으로 역으로 영향을 주지 않는 한 본 출원에서 기술되는 상기 변성들과 함께 사용될 수 있다. 수용가능한 변성들에는 당 성분의 변성들, 염기 성분의 변성들, 뉴클레오티드 간 결합에서의 변성들 및 이들의 조합들이 포함된다.
하나의 구체예에 있어서, 상기 화합물은 적어도 하나의 리보뉴클레오티드의 당 성분에 대한 2' 변성("2' 당 변성")을 포함한다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 화합물은 선택적으로 교호하는 포지션들에서 2'0-알킬(2'0-alkyl) 또는 2'-플루오로(2'-fluoro) 또는 2'0-알릴(2'0-allyl) 또는 임의의 다른 2' 변성들을 포함한다. 다른 안정화 변성들(stabilizing modifications)이 또한 가능하다(예를 들면, 말단 변성들). 일부 구체예들에 있어서, 바람직한 2'0-알킬은 2'0-메틸(메톡시, 2'OMe) 당 변성이다. 당 변성에는 상기 당 잔기의 상기 2' 성분에 대한 변성이 포함되며, 다른 무엇들 보다도, 유럽특허 제EP 0 586 520 Bl호 또는 동 제EP 0 618 925 Bl호에서 기술된 바와 같은 아미노, 플루오로, 알콕시, 예를 들면, 메톡시, 알킬, 아미노, 플루오로, 클로로, 브로모, CN, CF, 이미다졸(imidazole), 카르복실레이트(carboxylate), 티오에이트, 탄소수 1 내지 10의 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴(alkaryl) 또는 아랄킬(aralkyl), OCF3, OCN, 0-알킬, S-알킬, 또는 N-알킬; 0-알케닐, S 알케닐, 또는 N-알케닐; SOCH3; S02CH3; 0N02; N02, N3; 헤테로사이클로알킬(heterozycloalkyl); 헤테로사이클로알카릴(heterozycloalkaryl); 아미노알킬아미노(aminoalkylamino); 폴리알킬아미노(polyalkylamino) 또는 치환된 실릴(substituted silyl)들이 포함된다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 골격(backbone)이 변성되고 그리고 포스페이트-D-리보오스 엔터티(phosphate-D-ribose entities)를 포함하나, 그러나 또한 티오포스페이트-D-리보오스 엔터티(thiophosphate-D-ribose entities), 트리에스테르(triester), 티오에이트, 2'-5' 가교화 골격(2'-5' bridged backbone ; 또한 5'-2'로서 언급될 수도 있음), PACE 등을 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비-짝지음 뉴클레오티드 유사체(non-pairing nucleotide analog)"는 6개의 아미노 아데노신(amino adenosine ; 네뷸라린(Nebularine)), 4-메틸-인돌(4-Me-indole), 3-니트로피롤(3-nitropyrrole), 5-니트로인돌(5-nitroindole), Ds, Pa, N3-Me riboU, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-Me-dT, Nl-Me-dG, Nl-Me-dA, N3-ethyl-dC, N3-Me dC를 포함하나 이들에 제한되지 않는 비-염기쌍 성분을 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 의미한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 비-염기쌍 뉴클레오티드 유사체는 리보뉴클레오티드이다. 다른 구체예들에 있어서, 이는 디옥시리보뉴클레오티드이다.
다른 변성들에는 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 부분에 대한 말단 변성들이 포함되며 또한 캡핑 성분으로 알려져 있다. 이러한 말단 변성들은 뉴클레오티드, 변성된 뉴클레오티드, 지질(lipid), 펩티드 및 당으로부터 선택된다.
"알킬 성분 또는 그의 유도체"는 성분 그 자체로서 또는 알코올, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포노아세테이트를 포함하는 관능기를 더 포함하는 직쇄(straight) 또는 분지된(branched) 탄소 성분을 의미하며 또한 아민, 카르복실산, 에스테르, 아미드 알데히드를 포함한다. "탄화수소 성분(Hydrocarbon moiety)" 및 "알킬 성분"은 상호호환적으로 사용된다.
"말단 관능기(terminal functional group)"는 할로겐, 알코올, 아민, 카르복실(carboxylic), 에스테르, 아미드, 알데히드, 케톤, 에테르기를 포함한다.
"뉴클레오티드"는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 의미하고, 이는 천연 또는 합성일 수 있고 그리고 변성되거나 또는 미변성될 수 있다. 변성들에는 당 성분, 염기 성분 및/또는 뉴클레오티드 간 결합들에 대한 변화 및 치환들이 포함된다.
변성된 리보뉴클레오티드에는 디옥시리보뉴클레오티드 및 변성된 디옥시리보뉴클레오티드가 포함된다. 변성된 디옥시리보뉴클레오티드에는, 예를 들면, 5' 말단 포지션(포지션 번호 1) 내의 뉴클레오티드로서 유용할 수 있는 5'OMe DNA(5-메틸-디옥시리보구아노신-3'-인산); PACE(디옥시리보아데닌 3' 포스포노아세테이트, 디옥시리보시티딘 3' 포스포노아세테이트, 디옥시리보구아노신 3' 포스포노아세테이트, 디옥시리보티미딘 3' 포스포노아세테이트)가 포함된다. 본 출원에는 생체 내 RhoA의 발현을 저해하기 위한 방법 및 조성물이 별도로 제공된다. 대체로, 상기 방법은 RhoA로부터 전사되는 mRNA를 표적으로 하는 올리고리보뉴클레오티드, 특히 이중 가닥 RNA(즉, dsRNA)들 또는 세포 내에서 dsRNA를 생성할 수 있는 핵산 물질을 예를 들면 RNA 간섭 메카니즘(RNA interference mechanism)에 의하여 RhoA의 발현을 하향-조절하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 특히, 상기 대상 방법은 질병, 장애 또는 손상의 치료를 위한 RhoA의 발현을 하향-조절하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 핵산 분자 또는 RhoA의 저해제는 여러 병적 측면을 치료하기 위한 약물로서 사용된다. 본 발명에 따르면, 상기 핵산 분자 또는 RhoA의 저해제는 중추신경계, 말초신경계, 전정감각계, 시각계 및/또는 순환계(정맥, 동맥) 내에서의 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약물로서 사용된다.
dsRNA 들 및 RNA 간섭( dsRNAs and RNA interference )
RNA 간섭(RNAi)은 이중-가닥(ds) RNA-의존성 유전자-특이적 전사후 침묵(RNA-dependent gene-specific posttranscriptional silencing)을 포함하는 현상이다. 이러한 현상을 연구하고 포유동물 세포를 실험적으로 조작하기 위한 초기 시도는 긴 dsRNA 분자(long dsRNA molecules)에 반응하여 활성화된, 활성의, 비-특이적 항생 방어 메카니즘(active, non-specific antiviral defense mechanism)에 의하여 좌절되었다(문헌 Gil et al, Apoptosis, 2000. 5: 107-114 참조). 이후, 21개의 뉴클레오티드 RNA의 합성 듀플렉스가 유전적 항생 방어 메카니즘을 자극함이 없이 포유동물 세포 내에서 유전자 특이적 RNAi를 조절(mediate)할 수 있다는 것이 밝혀졌다(문헌 Elbashir et al. Nature 2001, 411 :494-498 및 Caplen et al. PNAS 2001, 98:9742-9747 참조). 그 결과, 짧은 이중-가닥 RNA들인 작은 간섭 RNA(siRNAs)들이 유전자 발현을 억제하고 그리고 유전자 기능을 이해하는 데 폭 넓게 사용되어 왔다.
RNA 간섭(RNAi)은 작은 간섭 RNA(siRNAs)(문헌 Fire et al, Nature 1998, 391 :806 참조), 마이크로 RNAs(miRNAs)(문헌 Ambros V. Nature 2004, 431 :350-355; 및 Barrel DP. Cell. 2004 116(2):281-97 참조)에 의하여 조절된다. 대응하는 과정은 통상 식물에서 관찰되는 경우 특이적 전사후 유전자 침묵으로 그리고 곰팡이(fungi)에서 관찰되는 경우 퀄링(quelling)으로 언급된다.
siRNA 화합물은 내인성(endogenous) 또는 외인성(exogenous) 유전자/mRNA의 발현을 하향-조절 또는 침묵(즉, 완전히 또는 부분적으로 저해)시키는 이중-가닥 RNA이다. RNA 간섭은 특정의 dsRNA종이 특정의 단백질 복합체로 들어가서 여기에서 이들이 계속해서 상보적 세포상 RNA들을 표적하고 그리고 특이적으로 이들을 분해하는 능력에 기초하고 있다. 따라서, 상기 RNA 간섭 반응은 통상 RNA-유발 침묵화 복합체(RISC ; RNA-induced silencing complex)라고 언급되는 엔도뉴클레아제 복합체(endonuclease complex)를 특징으로 하며, 이는 상기 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 시퀀스를 갖는 단일-가닥 RNA의 개열(cleavage)을 조절한다. 표적 RNA의 개열은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 대하여 상보적인 영역(region)의 중간에서 일어날 수 있다(문헌 Elbashir, et al, Genes Dev., 2001, 15: 188 참조). 보다 상세하게 설명하면, III형 리보핵산 분해효소(type III RNAses)들에 의하여 긴 dsRNA들이 짧은(17 내지 29bp) dsRNA 단편(또한 짧은 저해성 RNA들 또는 "siRNAs"라고 언급됨)으로 소화된다(DICER, DROSHA, 등, (문헌 Bernstein et al, Nature, 2001, 409:363-6 및 Lee et al, Nature, 2003, 425:415-9 참조). 상기 RISC 단백질 복합체는 이들 단편들 및 상보적 mRNA를 인식한다. 전과정은 표적 mRNA의 엔도뉴클레아제 개열에 의해 종료된다(문헌 McManus and Sharp, Nature Rev Genet, 2002, 3:737-47; Paddison and Hannon, Curr Opin Mol Ther. 2003, 5(3): 217-24 참조). (이들 용어들 및 제안된 메카니즘들에 대한 추가의 정보를 위해서는, 예를 들면, 문헌 Bernstein, et al, RNA. 2001, 7(11): 1509-21 ; Nishikura, Cell. 2001, 107(4):415-8 및 국제특허공개공보 제WO 01/36646호를 참조하시오).
siRNA가 포유동물 및 인간 둘 다에서 생체 내에서 효과적일 수 있다는 것이 연구에 의해 밝혀졌다. 특히, 비트코와 그의 동료들(Bitko et al.)은 경비적으로(intranasally; 코를 통하여) 투입되는 경우, 호흡기 세포융합 바이러스 뉴클레오캡시드 N 유전자(respiratory syncytial virus(RSV) nucleocapsid N gene)에 대향하는 특정의 siRNAs가 생쥐들의 치료에서 효과적이라는 것이 밝혀졌다(문헌 Nat. Med. 2005, l l(l):50-55 참조). siRNA들의 치료적 적용(therapeutic applications)들의 리뷰를 위하여는, 예를 들면, 문헌 Barik (Mol. Med 2005, 83: 764-773) 및 Chakraborty (Current Drug Targets 2007 8(3):469-82)를 참조하시오. 게다가, 노인황반변성(AMD)를 치료하기 위하여 vEGFR1 수용기(VEGFR1 receptor)를 표적하는 짧은 siRNA들에 대한 임상적 연구들이 인간 환자들에서 수행되었다(문헌 Kaiser, Am J Ophthalmol. 2006 142(4):660-8 참조). 치료제(therapeutic agents)로서의 siRNA의 사용에 대한 추가 정보는 문헌 Durcan, 2008. Mol. Pharma. 5(4):559-566; Kim and Rossi, 2008. BioTechniques 44:613-616; Grimm and Kay, 2007, JCI, 117(12):3633-41에서 찾을 수 있을 것이다.
화학적 합성
본 발명의 상기 화합물은 리보핵산(ribonucleic)(또는 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic)) 올리고뉴클레오티드의 합성에 대하여 당해 기술분야에서 잘 알려진 임의의 방법들에 의하여 합성될 수 있다. 이러한 합성은 다른 무엇들 보다도 문헌 Beaucage and Iyer, Tetrahedron 1992; 48:2223-2311; Beaucage and Iyer, Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194 및 Caruthers, et. al, Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313에 기술되어 있고; 티오에이트의 합성은 다른 무엇들 보다도 Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 1985; 54: 367-402에 기술되어 있고, RNA 분자의 합성은 Sproat, in Humana Press 2005 edited by Herdewijn P.; Kap. 2: 17-31에 기술되어 있고 그리고 개개 다운스트림(downstream) 과정은 다른 무엇들 보다도 Pingoud et. al, in IRL Press 1989 edited by Oliver R.W.A.; Kap. 7: 183-208에 기술되어 있다.
다른 합성 절차들은 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들면, 상기 절차들은 문헌 Usman et al, 1987, J. Am. Chem. Soc, 109, 7845; Scaringe et al, 1990, NAR., 18, 5433; Wincott et al, 1995, NAR. 23, 2677-2684; 및 Wincott et al, 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59에 기술된 바와 같고, 이들 절차들은 5'-말단에 디메톡시트리틸(dimethoxytrityl), 그리고 3'-말단에 포스포르아미다이트(phosphoramidites) 등과 같은 통상의 핵산 보호 및 짝지음기들을 사용할 수 있다. 상기 변성된(예를 들면, 2'-0-메틸화) 뉴클레오티드 및 미변성된 뉴클레오티드는 원하는 바 대로 포함된다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드들은 개별적으로 합성되고 그리고, 예를 들면, 연결(ligation)에 의하여(문헌 Moore et al, 1992, Science 256, 9923; Draper et al., 국제특허공개공보 제WO 93/23569호; Shabarova et al., 1991, NAR 19, 4247; Bellon et al, 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al, 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204 참조) 또는 합성 및/또는 탈보호(deprotection)에 후속하는 교잡(hybridization)에 의하여 후합성적으로(post-synthetically) 서로 연결될 수 있다.
상용적으로 획득가능한 기계(그 중에서도 어플라이드 바이오시스템즈사(Applied Biosystems)로부터 획득가능한)가 사용될 수 있으며; 상기 올리고뉴클레오티드들은 본 출원에서 기술되는 시퀀스들에 따라 제조될 수 있다. 화학적으로 합성된 단편들의 오버랩핑쌍(overlapping pairs)들은 당해 기술분야에서 잘 알려진 방법들을 사용하여 연결될 수 있다(예를 들면, 미합중국 특허(U.S. Pat.) 제6,121,426호를 참조하시오). 상기 가닥들은 개별적으로 합성되고 그리고 계속해서 튜브(tube) 내에서 서로에 대하여 어닐링(annealed)된다. 계속해서, 상기 이중-가닥 siRNA들이 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)에 의하여 어닐링되지 않은(예를 들면, 이들 중 어느 하나의 과량으로 인하여) 단일-가닥 올리고뉴클레오티드들로부터 분리된다. 본 발명의 상기 siRNA들 또는 siRNA 단편들에 관하여는, 둘 또는 그 이상의 이러한 시퀀스들이 합성되고 그리고 서로 연결되어 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 화합물들은, 예를 들면, 미합중국 공개특허 제US 2004/0019001 (McSwiggen)호에서 기술된 바와 같이 또한 일렬로 연결되는 합성 방법론(tandem synthesis methodology)을 통하여 합성될 수 있으며, 여기에서 두 siRNA 가닥들이 개열가능한 링커(cleavable linker)에 의하여 분리된 단일의 인접하는 올리뉴클레오티드 단편 또는 가닥으로서 합성되고 이는 후속적으로 개열되어 교잡되고 그리고 siRNA 듀플렉스의 정제를 허용하는 별도의 siRNA 단편들 또는 가닥들을 제공한다. 상기 링커는 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커가 될 수 있다.
본 발명은 또한 본 출원에서 언급된 임의의 질병들 및 상태들의 치료를 위한 둘 또는 그 이상의 siRNA 분자들을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하여 그에 의하여 상기 두 분자들이 동등하거나 또는 달리 이로운 활성을 생성하는 양으로 상기 약제학적 조성물 내에서 물리적으로 서로 혼합되거나, 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합되거나 또는 2 내지 100개, 바람직하게는 2 내지 50개 또는 2 내지 30개의 뉴클레오티드의 범위의 길이의 핵산 링커(nucleic acid linker)에 의하여 서로 연결될 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 상기 siRNA 분자들은 본 출원에서 기술되는 바와 같은 이중-가닥 핵산 구조로 구성되며, 여기에서 상기 2개의 siRNA 시퀀스들은 표 1, 2, 3 또는 4에서 규정되는 핵산들로부터 선택된다. 따라서, 상기 siRNA 분자들은 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합되거나 또는 링커에 의하여 연결되어 일렬로 연결되는 siRNA 화합물을 형성할 수 있다. 2개의 siRNA 시퀀스들을 포함하는 이러한 일렬로 연결되는 siRNA 화합물들은 전형적으로 38 내지 150개의 뉴클레오티드의 길이, 보다 바람직하게는 38 또는 40 내지 60개의 뉴클레오티드의 길이 및 2개 이상의 siRNA 시퀀스들이 상기 일렬로 연결되는 분자 내에 포함되는 경우 보다 긴 길이가 된다. 둘 또는 그 이상의 shRNA들을 인코딩하는 일렬로 연결되는 분자와 마찬가지로, 세포내 가공(internal cellular processing)을 경유하여 생성되는 siRNA, 예를 들면, dsRNA들을 인코딩하는 둘 또는 그 이상의 보다 긴 시퀀스들로 구성되는 보다 긴 길이의 일렬로 연결되는 화합물이 또한 고려된다. 이러한 일렬로 연결되는 분자들은 또한 상기 상술의 일부로서 고려된다. 본 출원에서 기술되는 둘(일렬로 연결되는) 또는 그 이상(RNAistar") dsRNA 시퀀스들이 고려된다. 이러한 "일렬로 연결되거나" 또는 "성상(star)의" 분자들의 예들이 본 출원의 양수인에게 양도되고 그리고 그의 전체가 참조로 본 출원에 포함되는 국제특허공개공보 제WO 2007/091269호에서 제공된다.
RhoA를 표적하는 상기 dsRNA 분자들은 약제학적 조성물 내에서의 주활성성분(main active component)가 되거나, 또는 둘 또는 그 이상의 dsRNA들(또는 둘 또는 그 이상의 dsRNA들을 인코딩하거나 또는 내인적으로 생성하는 분자들, 분자들의 혼합물이거나 또는 둘 또는 그 이상의 dsRNA들을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 일렬로 연결되는 분자들임)을 포함하는 약제학적 조성물의 하나의 활성성분이 될 수 있으며, 상기 약제학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 부가의 유전자를 표적하는 하나 또는 그 이상의 부가의 dsRNA 분자로 구성된다. 상기 부가의 유전자(들)의 동시적 저해(simultaneous inhibition)는 본 출원에서 기술되는 상기 질병들의 치료를 위한 부가의 또는 상승작용적 효과(synergistic effect)를 가질 것이다.
부가적으로, 본 출원에서 기술되는 상기 dsRNA 또는 이러한 dsRNA를 포함하거나 또는 인코딩하는 임의의 핵산 분자는 본 출원에서 기술되는 상기 질병들의 치료를 위한 강화된 표적화를 달성하기 위하여 상기 표적 세포들에 대하여 발현되는 세포 표면 내면화 분자들(cell surface internalizable molecules)에 대한 항체들(압타머 분자(aptamer molecules)들을 포함하여)에 연결되거나 또는 결합(공유적으로 또는 비-공유적으로)될 수 있다. 예를 들면, 항-Fas 항체(바람직하게는 중화 항체(neutralizing antibody))가 임의의 dsRNA와 결합될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 리간드/항체 같이 작용할 수 있는 압타머가 임의의 dsRNA와 결합(공유적으로 또는 비-공유적으로)할 수 있다.
본 발명의 상기 핵산 화합물들은 직접적으로 또는 바이러스 벡터(viral vector)나 비-바이러스 벡터와 함께 전달될 수 있다. 직접적으로 전달되는 경우, 상기 시퀀스들은 대체로 뉴클레아제 저항성(nuclease resistant)이 부여된다. 달리, 상기 시퀀스들은 발현카셋트(expression cassettes) 내에 포함되거나 또는 본 출원에서 이하에서 논의되는 바와 같이 세포 내에서 상기 시퀀스가 발현되도록 구성될 수 있다. 대체로 상기 구성은 적절한 조절시퀀스(regulatory sequence) 또는 프로모터(promoter)를 포함하여 상기 시퀀스가 표적화된 세포 내에서 발현되도록 하는 것을 허용한다. 본 발명의 상기 화합물들의 전달을 위하여 선택적으로 사용되는 벡터들은 상용적으로 획득가능하고, 그리고 당해 기술분야에서 공지된 방법들에 의하여 본 발명의 상기 화합물들의 전달을 목적으로 변성될 수 있다.
화학적 변성
유사체 또는 변성들이 실질적으로 상기 뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드의 기능에 영향을 주지 않는 한, 뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드의 모든 유사체들 또는 변성들이 본 발명에 대하여 사용될 수 있다. 상기 뉴클레오티드들은 천연적으로 발생하거나 또는 합성의 변성된 염기들로부터 선택될 수 있다. 천연적으로 발생하는 염기들에는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실이 포함된다. 뉴클레오티드들의 변성된 염기들에는 이노신(inosine), 크산틴(xanthine), 하이포크산틴(hypoxanthine), 2-아미노아데닌(2-aminoadenine), 6-메탈, 2-프로필 및 다른 알킬아데닌, 5-할로우라실(5-halo uracil), 5-할로시토신(5-halo cytosine), 6-아자시토신(6-aza cytosine) 및 6-아자티민(6-aza thymine), 슈도우라실(pseudo uracil), 4-티우라실(4-thiuracil), 8-할로아데닌(8-halo adenine), 8-아미노아데닌(8-aminoadenine), 8-티올아데닌(8-thiol adenine), 8-티오알킬아데닌(8-thiolalkyl adenines), 8-히드록실아데닌(8-hydroxyl adenine) 및 다른 8-치환 아데닌, 8-할로구아닌(8-halo guanines), 8-아미노구아닌(8-amino guanine), 8-티올구아닌(8-thiol guanine), 8-티오알킬구아닌(8-thioalkyl guanines), 8-히드록실구아닌(8-hydroxyl guanine) 및 다른 치환된 구아닌, 다른 아자(aza) 및 디아자(deaza) 아데닌, 다른 아자 및 디아자 구아닌, 5-트리플루오로메틸우라실(5-trifluoromethyl uracil) 및 5-트리플루오로시토신(5-trifluoro cytosine)이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 올리고머 내의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 이노신으로 치환된다.
게다가, 폴리뉴클레오티드의 유사체가 제조될 수 있으며, 여기에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 구조가 근본적으로 변경되고 그리고 치료제(therapeutic reagents) 또는 실험약(experimental reagents)로서 더 적절하다. 뉴클레오티드 유사체의 예는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid ; PNA)이며, 여기에서 DNA(또는 RNA 내의 디옥시리보오스(또는 리보오스) 인산 골격이 펩티드에서 발견되는 것과 유사한 폴리아미드 골격으로 치환된다. PNA 유사체들은 효소 분해(enzymatic degradation)에 대하여 저항성이고 그리고 생체 내 및 시험관 내에서 연장된 안정성을 갖는 것으로 나타났다. 올리고뉴클레오티드들로 만들어질 수 있는 다른 변성들에는 폴리머 골격(polymer backbones), 환상 골격(cyclic backbones), 비환식 골격(acyclic backbones), 티오포스페이트-D-리보오스 골격(thiophosphate-D-ribose backbones), 트리에스테르 골격(triester backbones), 티오에이트 골격(thioate backbones), 2'-5' 가교화 골격(2'-5' bridged backbone), 인공 핵산(artificial nucleic acids), 모르폴리노 핵산(morpholino nucleic acids), 잠금 핵산(LNA), 글리콜 핵산(glycol nucleic acid ; GNA), 트레오스 핵산(threose nucleic acid ; TNA), 아라비노시드 및 미러 뉴클레오시드(예를 들면, 베타-D-디옥시뉴클레오시드(beta-D-deoxynucleoside) 대신으로 베타-L-디옥시뉴클레오시드(beta-L-deoxynucleoside) instead of beta-D-deoxynucleoside))가 포함된다. LNA 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA 화합물의 예들은 문헌 Elmen et al, (NAR 2005, 33(l):439-447)에 기술되어 있다.
본 발명의 상기 핵산 화합물은 하나 또는 그 이상의 역전된 뉴클레오티드, 예를 들면, 역전된 티미딘 또는 역전된 아데닌을 사용하여 합성될 수 있다(예를 들면, 문헌 Takei, et al, 2002, JBC 277(26):23800-06을 참조하시오).
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "독특한 성분"은 어베이직 리보오스 성분, 어베이직 디옥시리보오스 성분, 디옥시리보뉴클레오티드, 변성된 디옥시리보뉴클레오티드, 미러 뉴클레오티드, 비-염기쌍 뉴클레오티드 유사체(a non-base pairing nucleotide analog) 및 2'-5' 뉴클레오티드 간 인산 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드; C3, C4, C5 및 C6 성분들; LNA를 포함하는 가교화된 핵산 및 에틸렌가교화 핵산(ethylene bridged nucleic acids)을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "캡핑 성분"은 어베이직 리보오스 성분, 어베이직 디옥시리보오스 성분, 2'O 알킬 변성을 포함하는 변성 어베이직 리보오스 및 어베이직 디옥시리보오스 성분; 역전된 어베이직 리보오스 및 어베이직 디옥시리보오스 성분들 및 이들의 변성들; C6-이미노-Pi(C6-imino-Pi); L-DNA 및 L-RNA를 포함하는 미러 뉴클레오티드; 5'OMe 뉴클레오티드; 및 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 유사체들; 1-(β-D-에리쓰로푸라노실)뉴클레오티드(1-(β-D-erythrofuranosyl)nucleotide); 4'-티오 뉴클레오티드, 카르복실 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬인산(5'-amino-alkyl phosphate); 1,3-디아미노-2-프로필인산(l,3-diamino-2-propyl phosphate), 3-아미노프로필인산(3-aminopropyl phosphate); 6-아미노헥실인산(6-aminohexyl phosphate); 12-아미노도데실인산(12-aminododecyl phosphate); 히드록시프로필인산(hydroxypropyl phosphate); 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오티드(1,5-anhydrohexitol nucleotide); 알파-뉴클레오티드(alpha-nucleotide); 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드(threo-pentofuranosyl nucleotide); 비환식 3',4'-세코 뉴클레오티드(acyclic 3',4'-seco nucleotide); 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드(3,4-dihydroxybutyl nucleotide); 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드(3,5-dihydroxypentyl nucleotide), 5'-5'-역전 어베이직 성분(5'-5'-inverted abasic moiety); 1,4-부탄디올인산(1,4-butanediol phosphate); 5'-아미노; 및 가교화 또는 비가교화 메틸인산 및 5'-머캅토 성분(5'-mercapto moieties)을 포함한다.
어베이직 디옥시리보오스 성분은, 예를 들면, 어베이직 디옥시리보오스-3'-인산(abasic deoxyribose-3'-phosphate); 1,2-디디옥시-D-리보푸라노스-3-인산(1,2-dideoxy-D-ribofuranose-3-phosphate); 1,4-안하이드로-2-디옥시-D-리비톨-3-인산(1,4-anhydro-2-deoxy-D-ribitol-3-phosphate)을 포함한다. 역전된 어베이직 디옥시리보오스 성분은 역전된 디옥시리보어베이직(inverted deoxyriboabasic); 3',5' 역전된 디옥시리보어베이직 5'-인산(3',5' inverted deoxyriboabasic 5'-phosphate)을 포함한다.
"미러" 뉴클레오티드는 천연적으로 발생하거나 또는 통상적으로 사용되는 뉴클레오티드에 대하여 역전된 키랄성(reversed chirality)을 갖는 뉴클레오티드, 즉 천연적으로 발생하는 (D-뉴클레오티드)의 거울상(L-뉴클레오티드)이다. 상기 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드가 될 수 있으며, 적어도 하나의 당, 염기 및 또는 골격 변성을 더 포함할 수 있다. 미합중국 특허 제6,602,858호는 적어도 하나의 L-뉴클레오티드 치환을 포함하는 핵산 촉매(nucleic acid catalysts)를 기술하고 있다. 미러 뉴클레오티드는, 예를 들면, L-DNA(L-디옥시리보아데노신-3'-인산(미러 dA); L-디옥시리보시티딘-3'-인산(미러 dC); L-디옥시리보구아노신-3'-인산(미러 dG); L-디옥시리보티미딘-3'-인산(거울상 dT)) 및 L-RNA(L-리보아데노신-3'-인산(미러 rA); L-리보시티딘-3'-인산(미러 rC); L-리보구아노신-3'-인산(미러 rG); L-리보우라실-3'-인산(미러 dU)을 포함한다.
구조(A1) 또는 구조(A2)의 여러 구체예들에 있어서, Z 및 Z'는 부재이다. 다른 구체예들에 있어서, Z 또는 Z'는 존재한다. 일부 구체예들에 있어서, Z 및/또는 Z'는 독립적으로 C2, C3, C4, C5 또는 C6 알킬 성분, 선택적으로 C3 [프로판, -(CH2)3-] 성분 또는 프로판올(C3-OH/C30H), 프로판디올 및 프로판디올의 포스포디에스테르 유도체("C3Pi")을 포함하는 그의 유도체를 포함한다. 바람직한 구체예들에 있어서, Z 및/또는 Z' 각각은 2개의 탄화수소 성분을 포함하며, 일부 실시예들에 있어서는 C3Pi-C30H 또는 C3Pi-C3Pi이다. 각 C3는 공유결합, 바람직하게는 인산-기반 결합을 경유하여 인접하는 C3에 공유적으로 공액화(conjugated)된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 인산-기반 결합은 포스포로티오에이트, 포스포노아세테이트 또는 포스포디에스테르 결합이다.
구조(A1)의 특정의 구체예들에 있어서, x=y=19이고 그리고 Z는 적어도 하나의 C3 알킬 오버행을 포함한다. 구조(A2)의 특정의 구체예들에 있어서, x=y=18이고 그리고 Z는 적어도 하나의 C3 알킬 오버행을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 C3-C3 오버행은 공유 결합, 바람직하게는 포스포디에스테르 결합을 경유하여 (N)x 또는 (N')y의 3' 말단에 공유적으로 부착된다. 일부 구체예들에 있어서, 제1의 C3와 제2의 C3 사이의 결합은 포스포디에스테르 결합이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C3Pi이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C3Ps이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C30H(OH는 히드록시)이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C30H이다.
여러 구체예들에 있어서, 상기 알킬 성분은 말단 히드록실기, 말단 아미노기 또는 말단 인산기를 포함하는 C3 알킬, C4 알킬, C5 알킬 또는 C6 알킬 성분을 포함하는 알킬 유도체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 알킬 성분은 C3 알킬 또는 C3 알킬 유도체 성분이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 C3 알킬 성분은 프로판올, 프로필인산(propylphosphate), 프로필포스포로티오에이트(propylphosphorothioate) 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 C3 알킬 성분은 포스포디에스테르 결합을 경유하여 (N')y의 3' 말단 및/또는 (N)x의 3' 말단에 공유적으로 결합된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 알킬 성분은 프로판올, 프로필인산 또는 프로필포스포로티오에이트를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, Z 및 Z' 각각은 독립적으로 프로판올, 프로필인산 프로필포스포로티오에이트, 이들의 조합 또는 이들의 멀티플(multiples), 특히 2 또는 3개의 공유적으로 결합된 프로판올, 프로필인산, 프로필포스포로티오에이트 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, Z 및 Z' 각각은 프로필인산, 프로필포스포로티오에이트, 프로필포스포-프로판올(propyl phospho-propanol); 프로필포스포-프로필포스포로티오에이트(propyl phospho-propyl phosphorothioate); 프로필포스포-프로필인산(propylphospho-propyl phosphate); (프로필인산)3((propyl phosphate)3), (프로필인산)2-프로판올((propyl phosphate)2-propanol), (프로필인산)2-프로필포스포로티오에이트((propyl phosphate)2-propyl phosphorothioate)으로부터 독립적으로 선택된다. 임의의 프로판 또는 프로판올 공액화 성분이 Z 또는 Z' 내에 포함될 수 있다.
예시적인 3' 말단 비-뉴클레오티드 성분들의 구조들은 다음과 같다:
Figure 112013006138949-pct00012
지침(Indications)
본 출원에서 기술된 상기 분자들 및 조성물들은 중추신경계, 말초신경계, 전정감각계, 시각계 및/또는 순환계(정맥, 동맥)의 질병 또는 장애와 마찬가지로 세포 운동성, 세포 골격 조절 및 미세소관 조직과 연관된 질병 또는 장애 및 본 출원에서 기술되는 다른 질병 및 상태들의 치료에 유용하다.
중추신경계 장애 및 손상
여러 관점들 및 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법들과 함께 세포 또는 조직 내에서의 RhoA의 수준에 연관되거나 또는 반응할 수 있는 중추신경계(CNS)의 질병, 장애 및 손상 등과 같은 RhoA 유전자와 연관되는 질병, 장애 및 손상을 치료하고, 특히 상기 중추신경계의 질병 또는 손상으로 고통받거나 또는 그에 영향을 받거나 또는 그에 감수성인 대상체를 치료하는 데 유용하다.
신경 재생 및 신경 보호에 연관된 상태
본 출원에서 기술되는 상기 dsRhoA 화합물은 2차 손상으로부터 척수 신경세포(spinal cord neurons)의 보호 및 기능의 회복을 야기하는 축삭(신경) 재생의 촉진에 사용될 수 있다.
축삭 재생(axon regenration)이 이로울 수 있다는 많은 징후들이 있다. 축삭 손실은 다발성 경화증, 뇌졸증, 외상성 뇌 손상, 말초신경병 및 만성 신경퇴행성 질환 등과 같은 장애들에서 신경 증상(neurological symptoms)에 기여한다.
중추신경계( CNS )의 손상
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 중추신경계(CNS)의 손상을 치료하고, 특히 외상성 및 비-외상성 척수 손상 및 두개골(skull)의 골절 또는 관통(즉, 자동차 사고, 낙상, 총상)에 의해 야기되는 뇌 손상(예를 들면, 외상성 뇌 손상(TBI)), 질병 과정(disease process)(즉, 신경독소(neurotoxins), 감염, 종양, 대사 이상(metabolic abnormalities) 등) 또는 두부(head)의 급격한 가속 또는 감속의 경우(즉, 흔든 아이 증후군(Shaken Baby Syndrome), 폭발), 둔상(blunt trauma), 뇌진탕(concussions) 및 뇌진탕 증후군(concussion syndrome) 등과 같은 폐쇄성 뇌손상(closed head injury)을 포함하나, 이들에 제한되지 않는 중추신경계의 손상으로 고통받거나 또는 그에 영향을 받거나 또는 그에 감수성인 대상체를 치료하는 데 유용하다.
게다가, 두부 또는 척주(spine)에의 타격의 결과와 같은 중추신경계에 대한 기계적인 손상에 의하여 허혈 반응(ischemic episode)이 야기될 수 있다. 외상에는 두부, 경부(neck) 또는 척주의 임의의 위치 또는 이들에 종속하는 위치에 대한 이물체(foreign object)의 외상성 접촉에 의해 야기될 수 있는 찰상(abrasion), 절상(incision), 타박상(contusion), 관통상(puncture), 압박(compression) 등과 같은 조직 공격(tissue insult)이 포함될 수 있다. 유체의 부적절한 축적(예를 들면, 정상 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 또는 안구내액(vitreous humor fluid) 생산의 차단(blockade) 또는 기능이상(dysfunction), 전환(turnover) 또는 용적 제어, 또는 경막하(subdural) 또는 두개내(intracranial) 혈종(hematoma) 또는 부종(edema))에 의한 중추신경계 조직의 수축(constriction) 또는 압박에 의하여 외상성 손상의 다른 형태들이 야기될 수 있다. 유사하게, 전이성 또는 원발성 종양 등과 같은 이상조직의 덩어리의 존재에 의하여 외상성 수축 또는 압박이 야기될 수 있다.
척수 손상( SCI )
미국의 국립 척수손상 통계센터(National Spinal Cord Injury Statistical Center ; NSCISC)에서 작성한 2009년 4월 이래의 척수장애인 통계(Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance)에 따르면 미국에서만 매년 10,000 내지 12,000명의 척수 환자(SCI)가 발생하고 25만명 이상의 미국인이 현재 척수 환자와 함께 생활하는 것으로 추산되고 있다. 척수 손상으로 고통받는 사람들 중, 절반 이상(57.5%)이 사고 시에 고용되어 있었다고 보고되었다. 척수 손상 환자들의 요양 관리 비용(cost of managing the care)은 연간 4조 달러($4 billion/year)에 달하고 있으나, 2008년 12월 기준 연간 평균 64,443 달러에 달하는 임금(wages), 복리후생비(fringe benefits) 및 생산성에서의 손실 등과 같은 어떠한 간접 비용도 포함되지 않은 것이다.
현재 SCI에 대한 효과적인 치료법은 존재하지 않으며, 또한 미국의 국립급성척수손상연구(National Acute Spinal Cord Injury Studies ; NASCIS) I, II 및 III 이래로, 손상 후 8시간 이내에 24시간 동안 공급되는 고용량의 스테로이트 메틸프레드니솔론(methylprednisolone ; MP)가 현재 치료의 기준이다. 그러나, 그 효과는 작고 논란이 많으며, 캐나다 등과 같은 많은 국가들에서는 MP는 치료의 기준이 되고 있지 않으며, 현재는 단지 선택치료(treatment option)로 분류되고 있다(문헌 Hugenholtz, 2003 참조). 최근 척수 손상 후 초기 외과수술(척수감압수술(spinal decompression surgery))이 밝은 결과를 나타내고 있다는 것을 보여주는 연구들이 있었다. 급성 척수 손상의 외과수술 치료 연구(Surgical Treatment of Acute Spinal Cord Injury Study ; STASCIS)에 따르면, 초기 손상 1일 이내에 감압 수술을 받은 사람 중의 24%가 미국척수손상협회(American Spinal Injury Association ; ASIA) 척도로 측정하였을 때 뚜렷한 개선을 나타내었으나, 그러나 이들 결과들에 대하여 확고한 결정을 내리기에는 여전히 너무 이르다. 오늘날, 척수 손상을 다루는(dealing) 임상 시험 목록이 거의 250여개에 달하고 있으나, 그러나 이들의 거의 대부분은 재활치료(rehabilitation)를 다루고 있다. 따라서, 새로운 치료법에 대한 요구가 존재하고 있으며, 이는 모델계(model systems)들에서의 신규한 치료법의 개발 및 이들의 임상으로의 전개를 필요로 한다.
하나의 구체예에 있어서 중추신경계에 대한 손상은 척수 손상(SCI) 또는 척수병증(myelopathy)이다. 척수 손상 또는 척수병증은 감각 및/또는 운동성의 손실을 야기하는 척수의 장애(disturbance)이다. 척수 손상의 두 가지 통상적인 형태들은 외상 및 질병에 기인한다. 외상성 손상은 자동차 사고, 낙상, 총상, 그 중에서도 다이빙 사고(diving accidents)에 기인할 수 있으며, 또한 척수에 영향을 줄 수 있는 질병에는 소아마비(polio), 이분척추(spina bifida), 종양, 루게릭병(ALS), 다발성 경화증(MS), 척수공동증(syringomyelia), 횡단성 척수염(transverse myelitis) 및 프리드라이히 운동실조증(Friedreich's ataxia)이 포함된다.
여러 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은
척수 손상에 의하여 야기되는 손상, 특히 자동차 사고, 낙상, 스포츠 손상, 산업 재해, 총상에 의해 야기되는 척수 외상, 척주 약화(류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 또는 골다공증(osteoporosis)으로부터 야기되는) 또는 정상적인 노화 과정으로 인하여 척수를 보호하는 척주관(spinal canal)이 너무 좁아지는 경우(척추관 협착증(spinal stenosis))에 의하여 야기되는 척수 외상, 척수가 당겨지거나 측방으로 가압되거나 또는 압박되는 경우에 발생하는 직접적인 손상, 척수 내 또는 척수 외(그러나 척주관 내)에서의 출혈, 액체 저류(fluid accumulation) 및 팽윤에 후속하는 척수에 대한 손상을 치료하거나 또는 예방하기 위하여 사용된다.
따라서 본 발명은 척수 손상을 치료하는 데 유효한 양으로 대상체의 중추신경계 내에서의 RhoA 발현을 하향-조절하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 척수 손상의 치료 방법을 또한 제공한다.
뇌 손상
하나의 구체예에 있어서, 상기 중추신경계에 대한 손상은 뇌 손상이다. 외상 및 뇌졸증 등과 같은 뇌 손상은 서구사회에서의 사망(mortality) 및 장애(disability)의 중요한 원인 중의 하나이다. 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury ; TBI)은 현대 사회에서의 병원 입원(hospital admission) 및 장애의 가장 심각한 원인들 중의 하나이다. 임상실험(clinical experience)에서는 TBI를 손상 직후 일어나는 일차 손상(primary damage) 및 손상 후 수 일간 동안 일어나는 이차 손상(secondary damage)으로 분류할 것을 제안하고 있다. TBI의 현행 치료법은 수술(surgical)이거나 또는 달리 주로 대증요법(symptomatic)이다.
따라서 본 발명은 뇌 손상을 치료하는 데 유효한 양으로 대상체의 중추신경계 내에서의 RhoA 발현을 하향-조절하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 뇌 손상의 치료 방법을 제공한다.
말초신경 손상( PNI )
말초신경 손상들은 운동 기능(motor function), 감각 기능(sensory function) 또는 둘 다의 손실의 결과를 가져올 수 있다. 말초신경 손상들은 외상(예를 들면, 둔상 또는 관통상, 외상) 또는 급성 압박의 결과로 일어날 수 있다. 신연-연관 손상(stretch-related injuries)들이 가장 흔한 형태이다. 칼날에 의해 형성되는 것과 같은 열상(lacerations)들이 또한 흔하다. 북아메리카에서는, 외상 환자의 약 2 내지 3%가 주요 신경 손상을 갖는 것으로 여겨지고 있다. 후향적 연구에 따르면, 의료 지원을 구하는 모집단(population)의 약 1.4%, 55세 이하의 83% 그리고 남성의 50%가 사지 외상(limb trauma)의 사고인 것으로 연구되었다. 상지(upper-limb) 또는 하지(lower-limb)의 90일 이내의 신경 손상의 총 사고가 동일 모집단에서 1.64%이었다. 말초신경 손상은 탈수초(demyelination) 또는 축삭변성(axonal degeneration)을 야기할 수 있다. 임상적으로, 탈수초 및 축삭변성 둘 다는 손상된 신경의 감각 및/또는 운동 기능의 두절(disruption)을 야기한다. 기능의 회복은 재수초화(remyelination)와 함께 그리고 축삭 재생 및 감각 수용기 및 근단판(muscle end plates)들 또는 둘 다의 재-신경분포(re-innervation)와 함께 일어난다. 회복의 패턴은 혼성되고 그리고 불완전하다. 4도(4th degree) 내지 6도 손상들은 수술을 요한다. 신경 손상 수술에 대한 지침들은 하기와 같다:
폐쇄성 신경 손상(closed nerve injury): 손상 후 3개월에서 임상적으로나 전기진단적 연구 둘 다에서 회복의 증거가 없다.
개방성 신경 손상(open nerve injury ; 즉, 열상): 가능한 한 빠른 외과적 진단(surgical exploration)이 추천된다. 감각의 손실 또는 운동 약화가 보고된 모든 열상들은 외과적으로 진단되어야 한다.
압좌 신경 손상(crush nerve injury): 3개월 후, 전기적으로 또는 임상적으로 재-신경분포의 증거 없이, 수복(repair) 또는 이식(graft)을 수반하는 외과적 재건술(surgical reconstruction)이 표시되었다.
수술 전후 신경 손상(Perioperative nerve damage). 신경 손상은 심지어 수술 동안 및 수술의 결과로서도 야기될 수 있다. 수술 전후 신경 손상은 상대적으로 희귀하나 환자에게는 치명적이다. 5000건의 사례 중 1건의 빈도로 영구 손상이 발생하는 것으로 여겨진다. 신경 손상은 (희귀하게) 슬관절 치환술(knee replacement) 등과 같은 대외과수술(major orthopedic surgery)에 대하여 발생할 수 있다. 슬관절 치환술에서 손상된 가장 흔한 신경은 다리를 안면쪽으로 들어올리는 신경(비골 신경(the peroneal nerve))이다. 이러한 일이 발생할 공산은 수 백분의 1이다. 현재 미국 내에서는 덜 흔하게는 발목(ankle), 팔꿈치(elbow), 어깨 및 손가락의 전슬관절 치환술과 함께, 가장 흔하게는 엉덩이와 무릎(hip and knee)을 포함하여 매년 550,000건 이상의 관절 치환술(joint replacement procedures)이 있다. 연간 193,000건 이상의 인공 고관절 치환술(artificial hip replacement surgeries)이 수행된다. 2030년대에 미국 내에서 3,480,000(3.48 million)건의 고관절 및 슬관절 치환술(hip and knee replacement procedures)로 추산된다는 문헌 73rd Annual Meeting of the American Academy of Orthopaedic Surgeons (AAOS)에서 제공된 바와 같이, 다음 25년간에는 그 수요가 극적으로 증가할 것으로 예기된다.
전정계의 질병 및 장애
여러 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 RhoA의 발현이 해로운 전정계에 영향을 주는 장애 및 질병, 예를 들면, 메니에르병을 치료하는 데 유용하다. 인간을 포함하여 대부분의 포유동물에서 상기 전정감각계는 균형에, 그리고 공간적 방위(spatial orientation) 및 안정성의 감각에 기여한다. 와우각(cochlea)과 함께 이는 내이의 미로를 구성한다. 상기 전정계는 회전운동을 표시하는 반원형의 구계(canal system); 및 선형 가속을 표시하는 이석(otoliths);의 두 구성요소들을 포함한다.
메니에르병
또한 특발성 내림프수종(idiopathic endolymphatic hydrops ; ELH)으로도 알려진, 메니에르병은 현기증(vertigo)과 이명(tinnitus)을 야기하고, 종국적으로는 청각 상실(hearing loss)을 야기하는 신경 손상의 결과를 가져오는 내이의 장애이다. 메니에르병의 정확한 원인은 알려지지 않았으나, 그러나 내림프액(endolymph)의 축적으로 인한 막성 미로(membranous labyrinth)의 왜곡(distortion)이 내재하는 메카니즘인 것으로 여겨지고 있다. 내림프액은 일차적으로는 달팽이관 내의 혈관조(stria vascularis)에 의하여 그리고 또한 전정미로(vestibular labyrinth) 내의 편평 반월상체(planum semilunatum) 및 암세포(暗細胞 ; dark cells)들에 의해 생산된다(문헌 Sajjadi H, Paparella MM. Meniere's disease. Lancet. 372(9636):406-14 참조). 전정수도관(vestibular aqueduct)을 통한 내림프액 공간(endolymphatic fluid space)으로부터 내림프낭(endolymphatic sac)으로의 내림프액의 흐름이 폐쇄되고, 내림프수종(endolymphatic hydrops)이 일어나게 된다. 메니에르병은 대상체의 귀들 중의 어느 하나 또는 둘 다에 영향을 줄 수 있다. 메니에르병과 연관된 주요 병적 상태(primary morbidity)는 현기증과 퇴행성 청각 상실(progressive hearing loss)을 약화시키는 속성이다. 현행 치료법은 신경 퇴행(neuronal degeneration) 및 연관된 청각 상실의 진행을 방지하는 데 성공적이지 못하였다. 전정와우신경(vestibulocochlear nerve)을 포함하는 내이의 뉴런(neurons)들을 손상으로부터 보호하거나 또는 전정와우신경의 재생을 유도하고 그에 의하여 메니에르병 환자에서의 청각 상실을 완화 또는 방지하는 치료요법이 크게 요구되고 있다. 본 출원에서 제공되는 상기 핵산, 조성물, 방법 및 킷트는 메니에르병의 위험이 있거나 그로부터 고통받는 대상체를 치료하는 데 유용하다.
신경 장애
여러 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 신경 장애들을 치료하는 데 유용하다.
여러 구체예들에 있어서, 상기 신경 장애는 이에 제한되지 않는 뇌졸증, 뇌졸증-유사 상황(예를 들면, 뇌부전(cerebral failure), 신부전(renal failure), 심부전(cardiac failure)), 신경세포사, 뇌전증(epilepsy), 파킨슨씨병 증상 원인(Parkinsonism), 글루텐 운동실조증(Gluten Ataxia), 뇌빈혈(cerebral ischemia) 및 뇌혈관손상(cerebrovascular accident)들로부터 선택된다.
뇌전증 ( Epilepsy )
하나의 구체예에 있어서, 상기 신경 장애는 뇌전증이다. 뇌전증은 뇌의 정상 기능에서의 문제들로 표시되는 장애군이다. 이들 문제들은 정신적인 문제들 및 감각들에 대한 문제점들과 마찬가지로 발작(seizures), 이상신체운동(unusual body movements) 또는 의식 상실 또는 의식에서의 변화를 일으킬 수 있다.
따라서 본 발명은 뇌전증을 치료하는 데 유효한 양으로 대상체의 중추신경계 내에서의 RhoA 발현을 하향-조절하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 뇌전증의 치료 방법을 제공한다.
뇌졸증
다른 구체예에 있어서, 상기 신경 장애는 뇌졸증이다. 뇌졸증은 뇌에의 공격을 야기하는 혈액 공급 중단의 결과로 일어나는 급성 신경 손상이다. 대부분의 뇌혈관 질병들은 병소의 신경학적결손(focal neurological deficit)의 돌발적인 발병(onset)으로서 존재한다. 상기 결손은 고정되어 잔류할 수 있거나 또는 개선되거나 또는 점진적으로 악화되어 대개는 허혈성 병소(ischemic focus)의 코어에서의 비가역적인 신경 손상을 야기하는 반면에, 경색주변(penumbra)에서의 신경 장애는 치료가능하거나 및/또는 가역적일 수 있다. 장기간의 허혈은 직접적인 조직 괴사의 결과를 가져온다. 뇌부종(cerebral edema)이 후속되고 그리고 후속하는 2 내지 4일에 걸쳐 진행한다. 경색(infarction)의 영역이 큰 경우, 부종은 그에 수반되는 결과들 모두를 갖는 상당한 질량 효과를 야기할 수 있다.
신경 조직에 대한 손상은 심각한 장애 및 사망을 야기할 수 있다. 손상의 정도는 일차적으로는 손상된 조식의 위치 및 정도에 의해 영향을 받는다. 급성 공격에 대응하여 활성화되는 내재성 연쇄반응(endogenous cascades)이 기능적 측면(functional outcome)에서 중요한 역할을 한다. 상기 손상을 최소화하거나, 제한하거나 및/또는 역행시키기 위한 노력이 임상적 결과들을 완화시키는 데 큰 잠재성을 갖는다.
따라서 본 발명은 뇌혈관 상태를 치료하는 데 유효한 양으로 대상체의 중추신경계 내에서의 RhoA 발현을 하향-조절하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 뇌혈관 상태의 치료 방법을 또한 제공한다.
파킨슨씨병 증상 원인
하나의 구체예에 있어서, 상기 신경 장애는 운동완만(bradykinesia), 근육 강직(muscle rigidity); 진전(tremor); 및 자세 불안정(postural instability)으로 특징지워지는 손상된 운동 제어(motor control)를 특징으로 하는 장애들의 군인 파킨슨씨병 증상 원인이다. 파킨슨 질환은 일반적으로 일차성 파킨슨씨병 증상 원인, 이차성 파킨슨씨병 증상 원인 및 유전성 형태들로 구분된다. 이들 상태들은 기저핵(basal ganglia) 내의 도파민 작동성의 또는 밀접학 연관된 운동 통합 신경 경로의 기능이상과 연관된다.
따라서 본 발명은 파킨슨씨병 증상 원인을 치료하는 데 유효한 양으로 대상체의 중추신경계 내에서의 RhoA 발현을 하향-조절하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 파킨슨씨병 증상 원인의 치료 방법을 또한 제공한다.
신경퇴행성 질환
신경퇴행성 질환은 중추신경계의 세포(대뇌 및/또는 척수 및/또는 눈)들이 손실된 상태이다. 상기 중추신경계 세포들은 쉽게 대량으로 재생되지 않으며, 따라서 과도한 손상은 대단히 파괴적일 수 있다. 신경퇴행성 질환은 뉴런 또는 그들의 수초(myelin sheath)의 손상으로 야기되며, 이는 시간의 경과에 따라 기능이상 및 장애(disabilities)를 야기한다. 비록 이들이 상호 배타적이지는 않음에도 불구하고, 이들은 대체로 표현형 효과(phenotypic effects)에 따라 2개의 군, 즉 운동실조증 등과 같이 운동에 영향을 주는 상태; 및 기억에 영향을 주고 치매(dementia)와 연관되는 상태;로 구분된다. 치매는 영양 기능(vegetative functions)이 손상되지 않은 반면에 기억, 학습, 이해, 문제 해결 및 추상적 사고(abstract thinking) 등과 같은 지적 기능들의 상실로 표현된다. 신경퇴행성 질환의 비-제한적인 예들로는 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 근육위축가쪽경화증(ALS, 또한 루게릭병으로도 알려짐), 헌팅턴씨병(Huntington's disease), 루이바디성치매(Lewy body dementia) 및 파킨슨씨병들이 있다.
다른 형태의 신경퇴행성 질환에는 단백질의 구조적 변성체(misfolded proteins) 또는 프리온(prions)에 의해 야기되는 질환들이 포함된다. 인간에서의 프리온 질환의 비-제한적인 예들로는 크로이펠츠-야곱병(Creutzfeldt-Jakob disease ; CJD) 및 변종 광우병(variant CJD ; Mad Cow Disease)들이 있다.
안신경퇴행성 질환의 비-제한적인 예들에는 황반변성으로 피해를 입은 대상체에서의 망막에서의 광수용체(photoreceptor) 손실, 당뇨병 망막병증, 망막색소변성증(retinitis pigmentosa), 녹내장 및 유사 질환들이 포함된다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 신경퇴행성 질환 및 상태를 치료하는 데 유용하다.
본 발명의 상기 약제학적 조성물은 파킨슨씨병, 근육위축가쪽경화증(ALS), 프리온 질병 치매(Prion disease dementia), 알쯔하이머병, 루이바디성치매, 피크병(Pick's disease), 혈관확장성 운동실조증(Ataxia-telangiectasia ; AT), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia ; FTD), 전두측두엽 대엽성 퇴화(Frontotemporal lobar degeneration ; FTLD), 헌팅턴씨병, 인간면역결핍바이러스-연관 치매(HIV-associated dementia), 뇌졸증 후 치매(post-stroke dementia) 또는 임의의 다른 질병-유발 치매; 및 안신경퇴행성 질환들을 포함하나, 이들에 제한되지 않는 신경퇴행성 장애(neurodegenerative disorders)들로 고통받거나 그에 의해 영향을 받거나 또는 그에 감수성인 대상체를 치료하는 데 특히 유용하다.
알쯔하이머병(AD)
하나의 구체예에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알쯔하이머병(AD)이다. 알쯔하이머병은 기억 및 언어 등과 같은 인식 기능(cognitive function)의 손실을 야기하는 대뇌의 여러 영역들에서의 신경 세포들의 기능의 손실 및 사멸에 의해 특징지워지는 진행성, 신경퇴행성 질환이다.
따라서 본 발명은 알쯔하이머병을 치료하는 데 유효한 양으로 대상체의 중추신경계 내에서의 RhoA 발현을 하향-조절하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 알쯔하이머병의 치료 방법을 또한 제공한다.
근육위축가쪽경화증(ALS)
하나의 구체예에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 근육위축가쪽경화증(ALS)이다. 근육위축가쪽경화증은 수의근 운동(voluntary muscle movement)을 제어하는 운동 신경들의 퇴화에 의해 야기되는 진행성, 대개는 치명적인 신경퇴행성 질환이다. 상기 장애는 상위 및 하위운동신경이 퇴화되어 근육에 신호를 전달하는 것을 중단함에 따라 전신을 통한 근육 약화 및 위축(atrophy)을 야기한다. 탈신경(denervation)으로 인하여 기능이 불능으로 되고, 근육들이 점진적으로 약화되고, 근육부분수축(fasciculation ; 경련(twitches))이 전개되고, 그리고 종국적으로는 탈신경으로 인하여 위축된다. 근육위축가쪽경화증으로 고통받는 대상체는 궁극적으로는 모든 수의운동(voluntary movement)을 개시하고 그리고 제어하는 능력을 상실하고; 방광 및 내장 괄약근(sphincters)들 및 눈 운동을 담당하는 근육들은 (항상은 아니지만) 대개는 여분이 있다.
따라서 본 발명은 근육위축가쪽경화증을 치료하는 데 유효한 양으로 대상체의 중추신경계 내에서의 RhoA 발현을 하향-조절하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 근육위축가쪽경화증의 치료 방법을 또한 제공한다. 특정의 구체예들에 있어서, RhoA의 하향-조절은 중추신경계에 대하여 신경보호특성을 부여한다.
파킨슨씨병( PD )
하나의 구체예에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 파킨슨씨병(PD)이다. 파킨슨씨병은 근육 진전, 근육 강직, 감소된 운동성, 구부정한 자세, 느린 수의운동 및 가면을 쓴 것 같은 표정(mask-like facial expression)으로 표시되는 진행성 장애이다.
따라서 본 발명은 파킨슨씨병을 치료하는 데 유효한 양으로 대상체의 중추신경계 내에서의 RhoA 발현을 하향-조절하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 파킨슨씨병의 치료 방법을 또한 제공한다.
혈관확장성 운동실조증( AT )
하나의 구체예에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 혈관확장성 운동실조증(AT)이다. 혈관확장성 운동실조증은 희귀하고, 신경퇴행성인, 유전되는 질병이며, 이는 신체의 많은 부분들에 영향을 주고 그리고 심각한 장애를 야기한다. 운동실조증은 형편없는 통제(poor coordination)을 의미하고, 모세혈관확장증(telangiectasia)은 작은, 확장된 혈관들을 의미하며, 이들 둘 다는 이 질병의 특징들이다. 혈관확장성 운동실조증은 소뇌(cerebellum ; 신체의 운동 통제 제어 센터)에 영향을 주고 그리고 또한 이 사례들의 약 70%에서 면역체계를 약화시켜 호흡기 장애 및 증가된 암의 위험을 야기한다.
따라서 본 발명은 혈관확장성 운동실조증을 치료하는 데 유효한 양으로 대상체의 중추신경계 내에서의 RhoA 발현을 하향-조절하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 혈관확장성 운동실조증의 치료 방법을 또한 제공한다.
뇌졸증 후 치매( PSD )
하나의 구체예에 있어서, 상기 장애는 뇌졸증 후 치매(PSD)이다. 인구의 약 25%가 뇌졸증 후 치매를 가지며, 많은 다른 인구들에서 후속의 5 내지 10년에 걸쳐 치매로 발전한다. 게다가, 많은 사람들은 고급의 대뇌 기능들(기획력 및 정보 처리의 속도 등과 같은)의 보다 미세한 장애(impairments)들을 경험하고, 그리고 후속적으로 발전하는 치매의 매우 높은 위험에 처하게 된다. 이러한 과정에서의 대뇌의 심부(deep parts)에서의 매우 작은 뇌졸증은 뇌졸증 후 치매에 특이적인 대뇌 위축의 확인된 패턴을 야기하는 정에서 필수적인 것으로 여겨진다.
따라서 본 발명은 뇌졸증 후 치매를 치료하는 데 유효한 양으로 대상체의 중추신경계 내에서의 RhoA 발현을 하향-조절하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 뇌졸증 후 치매의 치료 방법을 또한 제공한다.
안신경퇴행성 질환들
하나의 구체예에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 황반 변성으로 피해를 입은 대상체에서의 망막에서의 망막 신경절 세포(RGC) 및/또는 광수용체 세포의 손실, 당뇨병 망막병증, 망막색소변성증, 녹내장 및 다른 안질환(ocular diseases)들을 포함하나, 이들에 제한되지 않는 안신경퇴행성 질환이다.
따라서 본 발명은 안신경퇴행성 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 대상체의 중추신경계 내에서의 RhoA 발현을 하향-조절하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 안신경퇴행성 질환의 치료 방법을 또한 제공한다.
신경보호
다른 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 신경보호를 제공하거나 및/또는 뇌보호(cerebroprotection)를 제공하거나 및/또는 중추신경계의 질병, 장애 또는 손상에서의 급성 또는 만성 신경 손상을 완화시키는 것에 관련된다.
뇌혈관 장애( Cerebrovascular Disorders )
하나의 구체예에 있아사. 상기 신경 장애는 뇌혈관 장애이며, 뇌혈관 손상은 허혈성 또는 출혈성 두개내 혈관 손상으로 인한 신경 기능의 갑작스러운, 비경련성의 손실이다. 일반적으로, 뇌혈관 손상은 뇌 내의 해부학적 위치, 혈관 분포, 병인(etiology), 감염된 개체의 연령 및 출혈성 대 비출혈성 속성에 따라 분류된다(추가의 정보에 대해서는 문헌 Adams et al, Principles of Neurology, 6th ed, pp 777-810 참조).
뇌혈관 질환은 주로 인생의 중년 및 말년에서 발생한다. 이들은 미국 내에서 상당한 신경 장애와 마찬가지로 매년 대략 200,000명의 사망을 야기한다. 뇌졸증의 발생 정도는 연령에 따라 증가하며 모집단의 급속히 성장하는 부류인 많은 노인 인구들에 영향을 준다. 이들 질환들은 허혈성-경색(ischemia-infarction) 또는 두개내 출혈 중 어는 하나를 야기한다.
눈의 허혈성 상태
허혈성시신경병증(Ischemic optic neuropathy ; ION)에는 시신경에 허혈을 발생시키는 다양한 장애들이 포함된다. 정의상, 허혈성시신경병증은 시신경유두부종(disc edema)가 급성으로 존재하는 경우 전측으로 정의되며, 안구(globe)에 가장 근접한 시신경의 부분의 협착을 암시한다. 허혈성시신경병증은 상기 안구 너머 수 센티미터(㎝)에 놓이는 후측이 될 수 있다. 허혈성시신경병증은 대개는 60세 이상의 노령 인구에서만 일어난다. 대부분의 사례들은 비동맥형(nonarteritic)이고 그리고 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 당뇨병 또는 시신경관류(optic nerve perfusion) 상의 고혈압의 영향에 기인한다. 측두동맥염(temporal arteritis)은 사례들의 약 5%를 야기한다(동맥형 허헐셩시신경병증(arteritic ION)).
증후군 및 징후들은 시신경유두(optic nerve head)의 팽창 및 종종 출혈을 수반하는 갑작스럽고, 부분적이거나 또는 전체적인 시각 상실이다. 시야결손(visual field defect)은 수평 경계(horizontal demarcation)로 또는 중앙 또는 중앙황반부(천연의 맹점(natural blind spot)의 주변)의 암점(scotomata)으로서 시야의 절반의 상실로 나타날 수 있다. 시신경유두의 창백(pallor)에 후속하여 시력 감소가 일어난다.
전방 허혈성 시신경병증( Anterior Ischemic Optic Neuropathy )
비동맥형 전방 허혈성 시신경병증(NAION)은 전방 허혈성 시신경병증(AION)의 두 가지 주요 형태들 중의 하나이며, 시신경에로의 불충분한 혈액 공급의 상태가 시신경을 손상시켜 시력의 상실을 야기한다. 비동맥형 전방 허혈성 시신경병증은 환자의 특정의 심혈관계 위험 인자들과 복잡한 시신경유두의 조합으로부터 야기된다. 반면에 전방 허혈성 시신경병증의 다른 주요 형태인 동맥형 전방 허혈성 시신경병증(Arteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy ; AAION)은 비동맥형 전방 허혈성 시신경병증을 얻는 사람들보다 약간 더 나이 든 사람들에서 발생하는, 덜 일반적으로 발생하는 중간-크기의 혈관의 염증 상태이다.
비록 상기 상태를 야기하는 메카니즘이 완전히 이해되지는 않고 있으나, 신경-안과 전문의(neuro-ophthalmologists)들은 대체로 2가지 문제점들의 집합점에 그 책임이 있다는 것에 동의하고 있다. 대부분의 사람들에 있어서, 그를 통하여 시신경들이 관통하는 눈벽 내의 공동의 직경은 상기 시신경의 직경 보다 20 내지 30% 더 크다. 비동맥형 전방 허혈성 시신경병증으로 발전하는 경향을 갖는 사람들에서의 상기 두 가지 문제점들 중의 하나는 이 20 내지 30%의 차이를 오류로 갖지 않는다는 것이다. 상기 두 번째의 문제점에는 상기 시신경의 전방부에 위치하는 상기 시신경유두에로의 빈약한 혈액 공급 또는 허혈을 야기하는 심혈관 위험 인자가 포함된다. 그 결과로서 상기 시신경유두가 팽윤하고, 그리고 이를 위한 공간이 없기 때문에, 그 결과의 상기 시신경의 압축은 보다 허혈이 되는 경향이 있다.
이들 심혈관 위험 인자들 중 가장 흔한 것들에는 당뇨병, 고혈압 및 고콜레스테롤 수준이다. 이들 위험 인자들이 발달하는 잠재성에서 역할하는 유전적 요인들이 존재한다. 다른 유전적 요인들이 또한 비동맥형 전방 허혈성 시신경병증으로 발달하는 잠재성에서 역할할 수 있다는 증거가 또한 존재한다.
여러 관점들 및 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물들은 단독으로 또는 다른 치료법들과 조합하여 비동맥형 전방 허혈성 시신경병증을 치료하는 데 유용하다.
녹내장
녹내장은 전세계에서 실명을 야기하는 주요 원인들 중의 하나이다. 전세계에서 대략 6680만명(66.8 million people)이 녹내장에 걸리며, 매년 적어도 12,000명의 미국인들이 이 질환으로 실명된다(문헌 Kahn and Milton, Am J Epidemiol. 1980, 111(6):769-76 참조). 녹내장은 모든 실명의 사례들의 11% 이상으로 추산되는, 미국에서 실명의 두 번째로 가장 흔한 원인이다.
녹내장은 상승된 안내압(intraocular pressure ;IOP)으로 인한 시신경유두 내의 축삭들의 퇴화, 면역계의 간섭 및 영양 인자들의 전달의 결여로 특징지워진다. 원발성 개방우각 녹내장(primary open-angle glaucoma ;POAG)으로 알려진 녹내장의 가장 흔한 형태들 중의 하나는 섬유주(TM) 내에서의 수성 방수액 유출(aqueous humor outflow)의 저항의 증가로 야기되며, 안내압 상승과 종국적으로는 시신경 손상을 야기한다.
현재 녹내장을 표적으로 하는 많은 약물들이 존재하고, 점안액(eye drops) 또는 연고를 통하여 투여되나, 그러나, 이들 모두는 단지 안내압을 낮추는 데 집중하고 있으며, 신경망막(neural retina)에 대한 손상을 방지하는 것에는 접근하지 못하고 있다. 일부 획득가능한 약물들은 알파-2-아드레날린 수용체 길항제(alpha-2-adrenergic receptor agonists)의 사례에서와 같이 오히려 증가된 심박수, 증가된 혈압, 두통, 시각 흐림(blurry vision), 피로, 구강 건조(dry mouth) 및 눈 안 또는 눈 주변의 홍조(redness) 등과 같은 심각한 부작용들을 갖는다. 이들 부작용들 중의 다수가 상기 약물에 대한 전신적 노출에서 뿐만 아니라 또한 알파-아드레날린 수용체 소분자 길항제들의 낮은 특이성에서 유래한다. 본 출원의 양수인은 녹내장에 대한 신규한 다면적인 치료법으로서 인간 RhoA mRNA 및 단백질을 저해하는 것을 목적으로 한다.
원발성 개방우각 녹내장에 있어서, 약화된 수성 방수액 배수(aqueous humour drainage)의 결과로서 상승된 안내압(IOP)이 발달하고, 그리고 이는 시신경증, 후속하는 진행성 망막 신경절 세포(RGC) 축삭 퇴화 및 망막 신경절 세포 세포자살과 연관된다. 녹내장에 대한 현행 치료법은 안내압을 낮추는 것에 집중되어 있다. 그러나, 상승된 안내압을 수반하지 않는 형태의 녹내장이 존재하며; 시각 상실은 실제로 시신경 및 망막 신경절 세포에 대한 손상에 의해 야기된다. 현재, 녹내장 환자에서의 신경보호 및/또는 신경재생에 접근하는 임상적 시도 중에 있는 극히 적은 수의 약물들이 존재한다. 미국 식품의약국(FDA)-승인된 신경보호 약물인 나멘다(Namenda ; 메만틴(memantine))이 최근 녹내장에 대한 3기 임상시험을 완료하였으나, 위약(placebo)와 비교할 때 녹내장 환자에서 효력을 갖지 않는다는 것으로 나타나서 실망스러운 결과를 나타내었다. RhoA는 망막 신경절 세포를 포함하여 중추신경계 신경들에서 운동성, 성장, 분화 및 세포자살 등과 같은 세포 기능들을 제어하는 작은 구아노신트리포스페이트 분해효소 단백질이다. RhoA는 또한 신경 면역 세포(미세아교세포(microglia) 및 마크로파지(macrophages))들 및 성상교세포들 내에서의 신호화(signalling)에 의한 이차성 염증 및 반흔성 중추신경계 손상 반응에 관여한다. 시신경 압박 손상(Optic nerve crush injury ; ONC injury)은 축색절단된 망막 신경절 세포(axotomised RGC) 내에서 RhoA를 활성화시키고, 이는 세포자살 및 축삭 재생의 저해를 신호한다. 대조적으로, siRhoA 및 C3 트랜스퍼라아제 세포외 효소(C3 transferase exoenzyme)을 포함하여 RhoA 길항제들로 손상된 망막 신경절 세포의 치료는 명백하게도 망막 신경절 세포 생존 및 신경영양물질-구동 축삭 재생(neurotrophin-driven axon regeneration)을 향상시킨다. RhoA 활성화가 또한 증가된 안내압을 야기하는 세포 수축 및 세포외 기질(extracellular matrix) 생성을 조절하는 것에 의하여 수성 방수액 유출에 대한 눈의 섬유주의 저항성을 조절하는 것에 관여하는 것으로 밝혀졌다(문헌 Zhang et al, Am J Physiol Cell Physiol, 259:1057. 2008 참조). 이론에 구속됨이 없이, 녹내장성 눈(glaucomatous eye)에서의 RhoA 신호화의 차단이 다중의 효과들; 즉 (A) 수성 방수액 배수의 항상성의 교정; (B) 망막 신경절 세포 세포자살적 신호화의 차단; 및 (C) 망막 신경절 세포 축삭 재생의 향상에 의하여 치료적 효력(therapeutic benefit)이 될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 제공되는 상기 dsRNA 분자, 조성물, 방법 및 킷트들은 녹내장의 위험이 있거나 또는 그로부터 고통받는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 이론에 구속됨이 없이, 본 출원에서 제공되는 치료학적 dsRhoA 분자는 다중의 메카니즘들에 의하여 녹내장을 치료하여 망막 신경절 세포들(RGCs)의 신경보호, 강화된 망막 신경절 세포 축삭 재생 및 낮아진 안내압(IOP)으로 이끈다.
신경병증
자율신경병증( Autonomic Neuropathy )
자율신경병증은 혈압, 심박수, 장 및 방광 비우기 및 소화 등과 같은 매일의 신체 기능을 관리하는 신경들에 손상이 있는 경우에 발생하는 증후군들의 군이다.
자율신경계(autonomic nervous system)는 심장, 위장관(GI tract) 및 비뇨기계(urinary system)를 보조하는 신경들로 이루어진다. 자율신경병증(Autonomic neuropathy)은 이들 기관계들 중의 임의의 것에 영향을 줄 수 있다. 당뇨병에서 가장 일반적으로 인식된 자율신경의 기능이상은 기립성 저혈압(orthostatic hypotension) 또는 환자가 일어날 때의 불편한 느낌(uncomfortable sensation)이다. 당뇨병 자율신경병증의 경우에서는 혈액이 뇌로 연속적으로 그리고 충분히 흘러가도록 심장과 동맥이 심박수 및 혈관 상태(vascular tone)를 적절하게 조정하지 못하는 것에 기인한다. 이 증후군은 대개는 부비강 호흡 변화(sinus respiratory variation), 즉 일반적으로 정상 호흡에서 발견되는 일반적인 심박수 변화의 상실을 수반한다. 이들 두 발견들이 존재하는 경우, 심장 자율신경병증이 존재한다.
위장관 징후들에는 지연된 위 비우기(gastric emptying), 위마비(gastroparesis), 구역질(nausea), 복부팽창(bloating) 및 설사가 포함된다. 많은 당뇨병환자들이 당뇨병에 대한 경구 약물을 섭취하기 때문에, 이들 약물들의 흡수는 지연된 위 비우기에 의해 크게 영향을 받는다. 경구 당뇨약을 식사 전에 섭취하고 그리고 수 시간 동안에 또는 때로는 수일 내에 흡수되지 않는 경우, 이미 혈당이 정상이거나 또는 혈당이 낮아진 때에 저혈당(hypoglycemia)을 야기할 수 있다. 소장의 느린 운동은 세균 과증식을 야기하여 고혈당증의 존재에 의해 악화될 수 있다. 이는 복부팽창, 가스 및 설사를 야기한다.
비뇨기 증후군들에는 빈뇨(urinary frequency), 급뇨(urgency), 요실금(incontinence) 및 요정체(retention)들이 포함된다. 다시, 당뇨(sweet urine)의 정체로 인하여, 요로 감염이 빈번하다. 요정체는 방광 게실(bladder diverticula), 결석, 역류성신증(reflux nephropathy)을 야기할 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 제공되는 상기 핵산, 조성물, 방법 및 킷트들은 자율신경병증의 위험에 있거나 또는 그로부터 고통받는 대상체를 치료한느 데 유용하다.
뇌신경병증( Cranial neuropathy )
뇌신경이 영향을 받는 경우, 제3 동안신경(oculomotor (3rd)) 신경병증이 가장 흔하다. 상기 동안신경은 외측직근(lateral rectus) 및 상두사근(superior oblique muscles)을 제외한 눈을 움직이는 모든 근육들을 제어한다. 이는 또한 동공을 축소시키고 눈꺼풀을 개방하는 역할을 한다. 당뇨병 제3 신경 마비(diabetic third nerve palsy)의 발병은 대개는 돌발적이고, 이마 및 안와 통증으로 시작하여 복시(diplopia)로 이어진다. 동공 크기를 제어하는 근육들을 제외한, 제3 신경에 의하여 자극된 동안근육들 모두가 영향을 받을 수 있다. 눈의 외측직근을 제어하는 제6 신경인 외전신경(abducens nerve)(눈을 외측으로 움직임)이 또한 흔하게 영향을 받으나, 그러나 활차신경(trochlear nerve)인 제4 신경(눈을 아래로 움직이는 상두사근을 제어함)이 연루되는 것은 일반적이지 않다. 흉곽 또는 요추 척수신경의 단발신경병증(mononeuropathies)이 발생할 수 있고, 그리고 심근경색증(myocardial infarction), 담낭염(cholecystitis) 또는 충수염(appendicitis)을 모방하는 통증 증후군을 야기한다. 당뇨병은 수근관증후군(carpal tunnel syndrome) 등과 같은 포착 신경병증(entrapment neuropathies)의 높은 발병율을 갖는다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 제공되는 핵산, 조성물, 방법 및 킷트들은 뇌신경병증의 위험에 있거나 또는 그로부터 고통받는 대상체를 치료한느 데 유용하다.
암-연관 신경병증( Cancer - Related Neuropathies )
말초신경병증(peripheral neuropathies)은 가장 흔한 암의 신경계의 부작용(neurologic complication)이다. 암환자에서의 말초신경계 기능이상의 감별 진단(differential diagnosis)은 광범위하고 그리고 암에 의한 직접적인 신경 압박 또는 침입; 암치료의 신경독성; 영양 결핍; 대사성 교란(metabolic derangements); 및 부종양성질환(paraneoplastic disorders)들이 포함된다. 말초신경병증을 앓고 있으나 밝혀진 암 진단이 없는 환자에 있어서, 상기 신경병증이 앞서 진단 미확정의 신생물(neoplasm)의 간접 효과인 가능성을 고려하는 것이 중요하다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 제공되는 상기 dsRNA 분자, 조성물, 방법 및 킷트들은 암-연관 신경병증의 위험에 있거나 또는 그로부터 고통받는 대상체를 치료하는 데 유용하다.
압박성 신경병증
포착 신경병증: 용어 포착 신경병증은 신경이 섬유성 또는 섬유-골성 관(fibrous or fibro-osseous tunnel) 내에서 기계적으로 수축되거나 또는 섬유상 밴드(fibrous band)에 의해 변형되는 특정의 위치에서 일어나는 단리된 말초신경 손상을 의미한다. 일부 경우들에 있어서, 상기 신경은 만성적 직접적 압박에 의하여 손상되고, 그리고 다른 경우들에 있어서, 경사 또는 신장력(angulation or stretching forces)이 상기 신경에 기계적인 손상을 야기한다. 섬유-골성 관 내에서의 신경 압박의 흔한 예들에는 수근관증후군 및 척골관(cubital tunnel)에서의 자신경병증(ulnar neuropathy)들이 있다. 경사 및 신장 손상은 주관절(elbow joint)의 심한 변형(gross deformity ; "만기자신경마비(tardy ulnar palsy)") 및 신경성흉부출구증후군(neurogenic thoracic outlet syndrome)과 연간되는 자신경병증에 대한 신경 손상의 중요한 메카니즘이다. 외력에 의한 반복 압박(recurrent compression)은 또한 팔꿈치 및 손 안의 자신경의 심부가지 병변(deep branch lesions)에서의 자신경병증 등과 같은 병소 신경 손상(focal nerve injuries)을 야기할 수 있다. 비록 이들 후자의 신경병증이 "포착 신경병증"의 엄격한 정의를 만족시키는 것은 아니지만, 이들은 종종 논의의 화제로 고려된다. 이들 단리된 신경병증들 전부의 병리학적 특징에는 병소 탈수초 및 왈러축삭변성(wallerian axonal degeneration)의 변화하는 조합이 포함된다.
여러 관점들 및 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 압박성 신경병증 및/또는 포착 신경병증을 치료하는 데 유용하다.
당뇨병 신경병증
당뇨병 신경병증은 당뇨병의 흔한 합병증이며, 여기에서 신경은 고혈당수준(고혈당증)의 결과로서 손상된다. 당뇨병 신경병증은 제1형 및 제2형 당뇨병 둘 다에서 일어날 수 있다.
당뇨병을 앓는 사람은 흔하게 신경 조직에 대하여 일시적 또는 영구적 손상으로 발전된다. 신경 손상은 감소된 혈류(blood flow) 및 높은 혈당 수준에 의하여 야기되며, 혈당 수준이 잘 조절되지 않을 경우 보다 더 발전할 것이다. 평균적으로, 증후군은 당뇨병 진단 이후 10 내지 20년 후에 시작된다. 당뇨병을 앓는 사람의 대략 50%가 종국적으로 신경 손상으로 발전할 것이다. 말초신경손상은 두개골 내의 신경(뇌신경) 또는 척추 및 그들의 가지들로부터의 신경들에 영향을 줄 수 있다. 이러한 형태의 신경 손상(신경병증)은 단계별로 발전하는 경향이 있다. 자율신경병증은 심근(heart muscle) 및 평활근을 포함하여 생명 기능을 조절하는 신경들에 영향을 준다.
당뇨병 신경병증에서의 미세혈관 질환
혈관 및 신경 질환은 밀접하게 연관되어 서로 얽혀있다. 혈관은 정상 신경 기능에 의존하고 그리고 신경은 적절한 혈류에 의존한다. 미세혈관에서의 첫 번째의 병리학적 변화는 혈관수축(vasoconstriction)이다. 질병이 진행됨에 따라, 신경 기능이상은 모세혈관 기저막 후막화(capillary basement membrane thickening) 및 내피 과형성(endothelial hyperplasia) 등과 같은 혈관 비정상의 발전과 밀접하게 연관되며, 이들은 감소된 산소 분압 및 저산소증(hypoxia)에 기여한다. 신경 허혈(neuronal ischemia)은 당뇨병 신경병증의 잘-정립된 특성이다. 혈관확장제(vasodilator agents ; 예를 들면, 안지오텐신-전환-효소 억제제(angiotensin-converting-enzyme inhibitors), 알파 1-길항제(alpha 1 -antagonists))가 대응하는 신경 전도 속도에서의 개선과 함께 신경 혈류에서 실질적인 증가를 야기할 수 있다. 따라서, 미세혈관 기능이상은 당뇨병의 초기에서 발생하고, 신경 기능이상의 진전과 병행하며, 당뇨병 신경병증에서 관찰되는 구조적, 기능적 및 임상적 변화들의 중증도를 뒷받침하는 데 충분할 수 있다. 감각운동 신경병증(sensorimotor neuropathy)인 말초 신경병증(다리)은 당뇨병에서의 다리 궤양의 병리기전(phathogenesis)에서의 명백한 구성요소이다.
신경 전도도 연구에 의하면 당뇨병 진단 시에서 환자들의 10 내지 18%에서 신경병증이 이미 존재하여 질병의 초기 단계에서 그리고 보다 가벼운 혈당 조절장애(glycemic dysregulation)와 함께 말초신경 손상이 일어난다는 것을 암시하고 있다. 신경병증이 당뇨병의 초기 임상 징후라는 개념이 40년 전부터 제안되었으며, 대부분의 연구는 내당능장애(IGT)와 신경병증 사이의 관계를 보고하고 있다. 내당능장애 및 연관된 신경병증을 갖는 대부분의 환자는 현저한 신경병증적 통증(neuropathic pain)을 수반하는 대칭적 원의 감각 다발신경병증(symmetric, distal sensory polyneuropathy)을 갖는다. 내당능장애 신경병증(IGT neuropathy ; 문헌 Microvascular complications of impaired glucose tolerance - Perspectives in Diabetes, J. Robinson Singleton, in Diabetes December 1, 2003 참조)은 초기 당뇨병 신경병증과 표현형적으로 유사하고, 이는 통증을 포함하는 감각 증후군 및 자율신경 기능이상을 야기한다. 초기 당뇨병 신경병증을 앓는 669명의 환자들의 조사에서, 감각 증후군은 60% 이상, 발기부전은 거의 40% 그리고 다른 자율신경 관련 증상은 33%에서 존재하나, 그러나 운동 관련 증상의 증거는 단지 12%에서만 존재하였다. 이들 임상적인 발견들은 통증, 온도 및 자율신경 신호를 운반하는 작은 무수신경섬유들의 현저한 초기 관련을 암시한다. 피부 생검으로부터의 표피 내 무수신경섬유의 직접적인 정량은 내당능장애 및 초기 당뇨병과 연관된 신경병증을 앓는 환자에서의 유사한 섬유 손실 및 변형된 형태를 나타낸다.
자율신경 기능이상, 특히 발기부전 및 변형된 심장 미주신경 반응(cardiac vagal response)은 당뇨병에서의 신경병증적 손상의 흔한 초기 특징들이다. 내당능장애 환자들에 대한 연구는 만연한 미주신경 자율신경기능장애(vagal dysautonoinia)를 암시하였으며; 별도의 연구에서 또한 나이를 맞춘 정상혈당 대조 대상체에 비하여 내당능장애 환자의 더 많은 분율에서 운동 후 비정상적인 심박수 회복, 심호흡에 대한 둔화된 R-R간격 변동성(R-R interval variability) 및 감소된 날숨 대 들숨의 비율(미주신경 자율신경기능장애의 모든 측정치)을 제안하고 있다.
당뇨병에서의 신경 손상은 운동, 감각 및 자율신경 섬유에 영향을 미친다. 운동 신경병증은 근육 약화, 위축 및 불완전 마비(paresis)를 야기한다. 감각 신경병증은 통증, 압력 및 열의 보호 감각의 상실을 야기한다. 통증의 부재는 궤양, 미인지된 외상 및 샤르코 신경성관절병증(Charcot neuroarthropathy)을 포함하여 무감각하 발에서 많은 문제들을 야기한다. 환자는 상처가 진전된 후까지도 치료를 구하지 않을 수 있다. 감각 및 운동 기능이상의 조합은 환자가 발에 비정상적인 스트레스를 가하여 외상을 야기할 수 있으며, 이는 감염으로 야기될 수 있다. 자율신경 교감신경병증은 혈관확장 및 발한 감소를 야기할 수 있으며, 이는 특히 미세혈관 흐름(microvascular flow)에서의 기능 변경과 마찬가지로 피부 손상을 일으키기 쉬운 따뜻하고 과도하게 건조한 발이 되도록 한다. 자율신경 기능이상(및 피부 구조의 탈신경화)은 또한 피부 온전성(skin integrity)의 상실을 야기하며, 이는 미생물 침입에 대한 이상적인 장소를 제공한다. 신경병증 발은 자발적으로 궤양을 일으키지는 않으며; 오히려 신경병증에 수반되는 외상의 일부 형태의 조합이다.
미세혈관 기능이상은 당뇨병 초기에 발생하며, 신경 기능이상의 진전과 병행하며, 당뇨병 신경병증에서의 구조적, 기능적 및 임상적 변화의 중증도를 뒷받침하기에 충분할 수 있다.
여러 관점들 및 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 당뇨병 신경병증을 치료하는 데 유용하다.
약물-유발 및 중독성 신경병증
관례적인 임상 실례에서 마주치는 대부분의 중독성 신경병증은 의원성 약제학적 중독(iatrogenic pharmaceutical intoxications)으로 인한 것이며; 대형 제약회사들과 마찬가지로 유행성의 직업적 노출은 흔치 않다. 중독성 신경병증의 대부분, 그리고 불행히도 가장 어려운 사례들은 소규모의, 종종 기회적인, 직업적인 노출 또는 고의적이고 그리고 살인적인 섭취로 인한 개별적인 중독들이다.
의원성 다발신경병증(idiopathic polyneuropathy)은 말초 신경병증 사례들의 상당한 부분을 구성한다. 게다가, 신경병증의 다수의 동정가능한 사례들은 단지 대증요법 외에는 획득가능한 예방적인 또는 치유력이 있는 개입할 수 없다. 따라서, 독성 또는 약물 유발 신경병증의 검출이 삶의 질에 영향을 주는 중요한 진단이 될 수 있다. 약물-유발 신경병증은 흔하지는 않으나(하나의 외래환자 신경과 배경 내에서 사례들 중의 2 내지 4%) 1, 그러나 개입이 뚜렷한 개선 또는 증후군 해결을 야기할 수 있기 때문에 인지하는 것이 중요하다.
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화학요법-유발 신경병증
암-연관 신경병증과 마찬가지로 약물-유발 또는 중독성 신경병증으로 또한 고려될 수 있는 화학요법-유발 신경병증은 특정의 암 치료를 위하여 화학요법에서 사용된 화학약품이 말초신경들을 손상시키거나 또는 파괴시키는 경우에 발생한다.
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위장관 및 영양-연관 신경병증
위장관계에 연관된 신경병증은 가장 흔하게는 영양 결핍의 결과로 인지된다. 이러한 결핍은 영양실조(예를 들면, 알코올 중독) 또는 물리적인 변형(예를 들면, 외과적 절제/우회)의 결과로서의 감소된 흡수표면 또는 장벽 침입(intestinal wall infiltration ; 예를 들면, 크론씨병)에 기인할 수 있다. 면역-매개 메카니즘이 이제는 다체계적 징후(예를 들면, 만성소화장애증(celiac disease), 염증성 장 질환)를 갖는 것으로 인지되는 일부 위장관 상태들에서 신경병증의 발달에서 중요한 역할을 하는 것으로 의심된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 제공되는 상기 dsRNA 분자, 조성물, 방법 및 킷트들이 위장관 신경병증의 위험이 있거나 또는 그로부터 고통받는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 제공되는 상기 dsRNA 분자, 조성물, 방법 및 킷트들이 영양-관련 신경병증의 위험이 있거나 또는 그로부터 고통받는 대상체를 치료하는 데 유용하다.
유전성 신경병증
샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth Disease)
샤르코-마리-투스병(CMT)은 1800년대 후반에 이들을 기술한 3인의 조사자들을 위하여 명명된 유전되는 말초 신경병증을 의미한다. 샤르코-마리-투스병이 대략 2500명 중의 1명으로 영향을 주기 때문에, 이들은 가장 흔한 유전되는 신경 질환이다. 비록 X염색체에 연쇄된 것이 우성이지만, 샤르코-마리-투스병 환자들의 대부분이 상염색체성우성유전(autosomal dominant inheritance)을 가지며, 또한 상염색체성열성형태(autosomal recessive forms) 또한 존재한다. 심지어 우성적으로 유전되는 장애들이 주어진 환자에서 새로운 돌연변이로서 시작할 수 있기 때문에, 산발적으로 보이는 사례들이 또한 발생할 수 있다. 비록 3분의 1 이하가 일차성 축상 또는 신경 장애들로 나타남에도 불구하고 사례들의 대부분은 탈수초화이다. 대부분의 환자들은 원위부 약화(distal weakness), 감각 상실, 족변형(foot deformities ; 족부 요족(pes caus) 및 망치발가락(hammer toes)) 및 반사 부재(absent reflexes)로 특징지워지는 "전형적인" 샤르코-마리-투스 표현형을 갖는다. 그러나, 다른 환자들은 거의 어떠한 질병의 증후군들로도 발전하지 않는 반면에, 일부 환자들은 유아기에서 심각한 장애로 발전한다(데제린-소타스병(Dejerine Sottas Disease) 또는 선천성 저수초형성(congenital hypomyelination)).
여러 관점들 및 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 유전성 신경병증을 치료하는 데 유용하다. 여러 관점들 및 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 샤르코-마리-투스병을 치료하는 데 유용하다.
면역-매개 신경병증 및 만성 면역-매개 다발신경병증
자가면역 메카니즘은 면역요법을 잘 받아들이는 여러 만성 신경병증성 증후군에 연관된다. 총괄하여, 이들 신경병증들은 상대적으로 흔하다; 문헌 Barohn et al (1998) 및 Verghese et al (2001) 참조. 그러나, 실제로는, 일반적으로 받아들여지는 임상적인 진단 기준 또는 신뢰할 만한 혈청학적 검사의 획득가능성의 결여로 인하여, 많은 자가면역 신경병증들이 진단이 어렵다. 따라서, 자가면역 신경병증을 앓는 많은 환자들이 대신 "의원성 신경병증"을 갖는 것으로 진단되고, 그리고 이들 질환의 진전에도 불구하고 치료되지 않는 상태로 방치된다.
만성 자가면역 신경병증들은 말초신경에 대한 면역-매개 손상으로 나타나는 증후군의 다양한 군이다. 이들 많은 장애들에 대하여는, 확정적인 진단 시험법이 없으며, 단지 조절된 치료적 시도들이 전형 없거나 또는 단지 일부만 있을 뿐이다. 따라서, 진단이 오류가 될 수 있으며, 환자는 치료되지 않은 상태로 방치된다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 면역-매개 신경병증을 치료하는 데 유용하다. 여러 관점들 및 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 만성 면역-매개 다발신경병증을 치료하는 데 유용하다.
감염성 신경병증(Infectious Neuropathies)
감염성 신경병증의 비-제한적인 예들에는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염 연관 신경병증; 라임 신경병증(Lyme neuropathy); 한센병(leprosy) 연관 신경병증; 대상포진 신경병증(Herpes zoster neuropathy ; 대상포진(shingles) 및 포진후신경통(post-herpetic neuralgia)); C형 간염 신경병증(Hepatitis C neuropathy); 단순포진 신경염(Herpes simplex neuritis); 디프테리아 신경염(Diphtheric neuritis); 및 샤가스병(Chagas' disease)들이 포함된다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 감염성 신경병증을 치료하는 데 유용하다. 여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염과 연관된 신경병증을 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 감염성 신경병증을 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 라임 신경병증을 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 한센병 연관 신경병증을 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 대상포진 신경병증을 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 C형 간염 신경병증을 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 단순포진 신경염을 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 디프테리아 신경염을 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 샤가스병을 치료하는 데 유용하다.
신경병증성 통증( NP )
국제통증연구학회(International Association for the Study of Pain ; IASP)는 신경병증성 통증을 "말초신경계 또는 중추신경계의 질병 또는 손상 및 신경계의 기능이상의 결과로 생기는 통증"으로 정의한다.
통증은 종종 혼합된 침해감수성 및 신경병증성 형태들, 예를 들면, 신경근병증(radiculopathy) 또는 척수병증(myelopathy)을 수반하는 기계적 척수 통증으로 이루어진다. 이는 일반적으로 침해감수성 척수 통증이 뿌리 분포(root distribution)를 모방하며 광범위하게 방사될 수 있다는 것으로 인지되지는 않는다. 주요 통증 형태를 동정하고 그리고 적절하게 치료하는 것은 어려울 수 있다. 이러한 환자들은 주의 깊은 검사, 심상화(imaging) 및 신경생리학적 조사를 필요로 한다.
신경병증성 통증에 원인이 있는 병리생리학적 특성들은 5개의 군들; 즉,
손상된 일차 구심성 신경섬유(primary afferent fibers)들에서의 이소성 흥분(ectopic impulse) 발생, 신경섬유 상호작용(fiber interactions), 중추적 감작화(central sensitisation), 억제불능(disinhibition ; 정상적인 억제 메카니즘의 실패 또는 감소) 및 가소성(plasticity ; 변형된 연결성(connectivity)와 연관된 퇴해성 및 재생성 변화들)로 폭 넓게 분류될 수 있다.
통증은 신경계 질환의 빈발하는 증후군이고, 그리고 비록 치료에 있어서 일부 진전이 있었으나, 통증은 종종 모든 치료 양상들에 대하여 미반응인 채로 남는다. 신경병증성 통증에 대한 리뷰에 대해서는, 예를 들면, 문헌 Scadding J. ACNR, v.3 n. 2 MAY/JUNE 2003, pages 8-14을 참조하시오. 신경병증성 통증은 말초신경들에 대한 암의 직접적인 결과(예를 들면, 종양에 의한 압박)로서 그리고 많은 화학요법 약물들의 부작용으로서 암에서 흔하다.
이질통
글자 그대로 "다른 힘"을 의미하는 이질통은 정상적으로 통증을 일으키지 않으며 열적인 것 또는 기계적인 것이 될 수 있는 자극으로 인한 통증이다. 이질통은 신경병증, 복합부위 통증 증후군(complex regional pain syndrome), 대상포진 후 신경통(postherpetic neuralgia), 섬유근육통(fibromyalgia) 및 편두통(migraine) 등과 같은 많은 고통스러운 상태들의 임상적 특징이다. 이질통은 또한 척수 손상을 포함하여 신경 손상을 치료하는 데 사용되는 줄기세포들의 일부 모집단들에 의해 야기될 수 있다.
기계적 이질통(Mechanical allodynia ; 또한 촉각 이질통(tactile allodynia)로도 알려짐); 정적 기계적 이질통(Static mechanical allodynia) - 가벼운 접촉/압력에 반응하는 통증; 동적 기계적 이질통 - 솔질(brushing)에 반응하는 통증; 열(뜨겁거나 또는 찬) 이질통 - 감염된 영역 내에서의 정상적으로 완만한 피부 온도로부터의 통증;을 포함하여 서로 다른 종류 또는 형태의 이질통들이 존재한다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 신경병증성 통증을 치료하는 데 유용하다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 이질통을 치료하는 데 유용하다.
감각운동 다발신경병증( Sensorimotor polyneuropathy )
신경 전도 속도가 신경의 길이에 비례하여 느려지기 때문에 보다 긴 신경 섬유는 보다 짧은 신경 섬유에 비해 더 큰 정도로 영향을 받는다. 이러한 증후군에 있어서, 발가락들에서 쌍방향적으로 감소된 자극 및 반사 작용의 손실이 먼저 발생하고, 계속해서 상방으로 연장된다. 이는 대개는 장갑-스타킹 착용부위의 범위의 무감각, 감각 상실, 감각 장애(dysesthesia) 및 야간 통증(nighttime pain)으로 기술된다. 상기 통증은 화끈거림(burning), 따끔거리는 감각(pricking sensation), 아픔(achy) 또는 둔감(dull) 같이 느껴질 수 있다. 저리는(쥐가 난) 감각이 흔하다. 고유수용성감각(proprioception)의 상실 즉, 사지가 공중에 있는 감각이 초기에 영향을 준다. 이들 환자들은 이들이 지저깨비(splinter)와 같은 이물질(foreign body) 상에 서 있는 경우 또는 이들이 맞지 않는 신발로부터의 굳은살(callous)이 발달하는 경우를 느끼지 못할 수 있다. 따라서, 이들은 발 및 다리에 궤양 및 감염이 발달하게 되는 위험에 있으며, 이는 절단을 야기할 수 있다. 유사하게, 이들 환자들은 무릎, 발목 또는 발의 다중 골절을 입고 신경성 관절(Charcot joint)로 발전할 수 있다. 운동 기능의 상실은 발가락들의 배굴 경축(dorsiflexion contractures)을 야기하며, 망치발가락으로 불리운다. 이들 경축들은 발에서 뿐만 아니라 또한 손에서도 일어난다.
일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 감각운동 다발신경병증을 치료하는 데 유용하다.
세포 골격 조절( Cytoskeleton regulation )
세포 운동성, 세포 골격 조절, 미세소관 조직
Rho족 구아노신트리포스페이트 분해효소들은 표면 수용기(surface receptors)들을 연결하여 액틴 세포 골격(actin cytoskeleton)을 조직하고 그리고 기초 세포 과정(fundamental cellular processes)들에서 중요한 역할을 수행하는 조절 분자들이다. RhoA는 액틴을 중합하도록 기능하고 그리고 미세소관의 형성에 영향을 주는 비계 특성(scaffolding properties)들을 갖는다. 액틴은 상기 Rho족의 작은 구아노신트리포스페이트 분해효소들에 의하여 조절된다. 이동하는 세포는 액틴 세포 골격의 특징적인 편극(polarization)을 나타낸다. 액틴 필라멘트(actin filaments)는 세포의 돌출 전방(protruding front) 내에서 중합하는 반면에 액틴 필라멘트 다발은 세포체(cell body) 내에서 수축되며, 이는 세포의 후방(cell's rear)의 수축을 야기한다. 상기 액틴 세포 골격은 세포 이동에 대한 구동력을 제공한다. 최근의 연구는 상기 액틴 세포 골격에 더하여, Rho 구아노신트리포스페이트 분해효소들이 또한 미세소관의 조직 및 동력학(dynamics)에 영향을 줄 수 있다는 것을 제안하고 있다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 세포 운동성, 세포 골격 조절, 미세소관 조직과 연관된 장애 또는 질병을 예방 또는 치료하는데 유용하다.
신생혈관생성, 정맥 질환, 동맥 질환
이미 존재하는 혈관으로부터의 새로운 혈관의 생성인 신생혈관생성은 복잡한 다단계 과정이다. 여기에는 혈관내피세포들 상의 혈관형성성장인자 수용기들의 자극, 내피세포 기저막(basal membrane)의 단백질분해적 파괴, 내피세포 증식 및 이동, 주변 세포외 기질의 분해, 혈관 성숙, 지지세포(예를 들면, 주위세포(pericytes))들의 점증 및 종국적으로 새로이 형성된 동정맥 루프(arteriovenous loops)의 폐쇄들이 포함된다(문헌 Folkman J. 1971. Tumour angiogenesis: therapeutic implications. NEJM 285: 1182-1185; Yancopoulos GD et al. 2000. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature 407: 242-248; Carmeliet P. 2003. Angiogenesis in health and disease. Nat Med 9: 653-660 참조). 이들 단계들 각각은 자극(혈관형성인자) 및 억제(혈관형성억제제(angiogenic inhibitors))의 둘 다의 작용에 의하여 긴밀하게 조절된다(문헌 Carmeliet P & Jain JK. 2000. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 407: 249-257 참조). 정상 상태에서, 상기 혈관들은 상기 혈관형성억제제의 작용이 지배적으로 됨에 따라 휴지상태가 된다. 혈관형성인자를 활성화시키는 저산소증 또는 감염 등과 같은 특정의 조건들 하에서는, 균형이 '혈관형성 스위치(angiogenic switch)'로 명명되는 사건인 혈관형성이 선호되는 쪽으로 이동될 수 있다.
예를 들면, 증식성 망막병증(proliferative retinopathies)과 연관된 맹목(blindness)을 방지하고 그리고 종양 성장을 제한하기 위한 것과 같은 여러 병리학에 대한 치료로서 혈관형성의 억제가 바람직하다. 연구들에 의하여 새로운 혈관들 내로의 내피세포 조립을 조절함에 있어서의 Rho 활성의 절대적이고 그리고 선택적인 역할이 확인되고 그리고 신혈관화(neovascularization)의 조직화 단계들을 억제하기 위한 전략으로서 Rho 활성의 억제가 확인된다.
맥관 구조(vasculature)에 있어서 Rho 신호화 경로들이 평활근 수축, 이동, 증식 및 분화와 마찬가지로 내피의 장벽 기능(endothelial barrier function), 염증 및 내피세포를 통한 백혈구 이동(transendothelial leukocyte migration), 혈소판 활성화, 혈전증 및 산화성 스트레스에 연관되며, 따라서 아테롬 발생(atherogenesis)과 연관된 많은 변화들에 연관된다. 결국, 스타틴(statins)의 Rho 단백질 활성화를 억제하는 능력의 결과로서 이들의 많은 이로운, 비-지질 저하 효과가 발생한다고 여겨진다((예를 들면, 문헌 Hoang MV et al. Rho activity critically and selectively regulates endothelial cell organization during angiogenesis. PNAS U S A. 2004 February 17; 101(7): 1874-1879; Rolfe BE et al. Rho and Vascular disease. Atherosclerosis. 2005 2005 Nov;183(l): l-16. 참조).
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 신생혈관생성을 억제하는 데 유용하다. 여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 정맥 질환을 치료하는 데 유용하다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 동맥 질환을 치료하는 데 유용하다.
안구의 신생혈관생성 - 각막, 망막, 맥락막
현존하는 맥관계(vascular tree)로부터의 새로운 혈관의 형성인 안구의 신생혈관생성은 심각한 시각 상실의 주요 원인이다. 이는 망막, 맥락막 및 각막을 포함하여 안구 내의 서로 다른 구조들에 영향을 줄 수 있다.
전형적으로 증식성 당뇨병 망막병증, 망막 정맥 교합(retinal vein occlusion) 또는 미숙아의 망막병증에서 나타나는 망막 신생혈관생성은 망막 허혈 또는 저산소증에 대한 비정상적인 혈관 반응의 결과이다. 망막 신생혈관생성 동안, 망막 정맥 내피 세포는 내경계막(internal limiting membrane)을 통하여 유리체(vitreous) 내로 증식을 시작하고, 여기에서 이들은 유리체 출혈 또는 견인 망막박리(tractional retinal detachment)를 야기할 수 있다.
맥락막(망막하의) 신생혈관생성. 노인황반변성(AMD) 의 신 혈관 형태에 있어서, 맥락막 혈관들이 퇴화된 브루크막(Bruch's membrane)을 통하여 망막하 공간 내로 성장하여 망막하 삼출(subretinal exudation) 및 출혈을 야기한다(문헌 Ambati J et al. 2003. Age-related macular degeneration: aetiology, pathogenesis and therapeutic strategies. Surv Ophthalmol 48: 257-293 참조). 이러한 맥락막 신생혈관생성 반응에 대한 초기 자극은 여전히 논란 중에 있다. 국소 감염이 혈관 내생(vascular ingrowth)을 촉발하는 모델이 현재 가장 선호되고 있다(문헌 Tezel TH et al. 2004. Pathogenesis of age-related macular degeneration. Trends Mol Med 10: 417-420 참조).
각막 신생혈관생성. 각막의 신혈관화는 그의 투명도를 위태롭게 하며 심각한 시각 장애를 야기한다(문헌 Chang JH et al. 2001. Corneal neovascularization. Curr Opin Ophthalmol 12: 242-249 참조). 이는 만성 저산소증 또는 전염성 각막염(infectious keratitis), 알칼리 화상(alkali burns) 및 이식 거부 등과 같은 여러 염증 자극의 반응에서 나타나는 흔한 임상적 문제이다. 각막 신생혈관생성은 사지의 혈관(limbal vessels)으로부터 출현되고 따라서 안구 표면 장애(ocular surface disorders)가 표피 신혈관화 되도록 하게 하는 한편으로, 기질각막염(stromal keratitis)은 혈관의 심부 침입을 야기한다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 망막 신생혈관생성과 연관된 질병, 장애 또는 손상을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 맥락막(망막하의) 신생혈관생성과 연관된 질병, 장애 또는 손상을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 각막 신생혈관생성과 연관된 질병, 장애 또는 손상을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
황반변성
미국에서 65세 이상의 개개인들에서 감소된 최대-교정 시력의 가장 흔한 원인은 노인황반변성(AMD)으로도 알려진 망막 장애이다. 노인황반변성이 진행됨에 따라, 상기 질병은 선명한 중심 시력의 상실로 특징지워진다. 노인황반변성에 영향을 받은 눈의 영역은 주로 광수용체 세포들로 이루어진, 망막의 중앙 내의 작은 영역인 황반이다. 노인황반변성 환자의 대략 85% 내지 90%에 달하는 것으로 추산되는 소위 "건식(dry)" 노인황반변성은 눈 색소 분포의 변화, 광수용체들의 상실 및 세포들의 전체적 위축으로 인한 감소된 망막 기능을 포함한다. 소위 "습식(wet)" 노인황반변성은 망막 하 공간에서 응혈(clots) 또는 반흔을 야기하는 비정상적인 맥락막 혈관의 증식을 포함한다. 따라서, 습성 노인황반변성의 발병은 신경 망막 아래의 비정상적인 맥락막 신생혈관망의 형성(맥락막 신생혈관화, choroidal neovascularization ; CNV) 때문에 일어난다. 새로이 형성된 혈관은 과도하게 누출성이다. 이는 망막하 액체 및 혈액의 누적을 야기하여 시각의 예리함의 상실을 야기한다. 종국적으로, 맥락막과 망막을 포함하는 큰 원반 모양의 반흔이 형성됨에 따라, 연관된 영역 내에서 총체적 망막 기능이 상실된다. 건식 노인황반변성 환자들이 감소되기는 하나 시각을 보유할 수 있는 반면에, 습식 노인황반변성은 종종 실명을 야기한다(문헌 Hamdi & Kenney, Age-related Macular degeneration - a new viewpoint, Frontiers in Bioscience, e305-314, May 2003 참조). 맥락막 신생혈관망의 형성은 습식 노인황반변성에서 뿐만 아니라 안구 히스토플라스마증 증후군(ocular histoplasmosis syndrome), 혈관무늬병증(angiod streaks), 브루크막의 파손(ruptures in Bruch's membrane), 근시성 퇴화(myopic degeneration), 안종양(ocular tumors) 및 일부 망막 퇴화 질병 등과 같은 다른 눈의 병리학에서도 또한 일어난다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 망막 퇴화 질병을 치료하는 데 유용하다. 여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 노인황반변성(AMD)을 치료하는 데 유용하다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 습식 노인황반변성(AMD)을 치료하는 데 유용하다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 건식 노인황반변성(AMD)을 치료하는 데 유용하다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 안구 히스토플라스마증 증후군을 치료하는 데 유용하다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 혈관무늬병증을 치료하는 데 유용하다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 브루크막의 파손을 치료하는 데 유용하다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 근시성 퇴화를 치료하는 데 유용하다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 눈종양을 치료하는 데 유용하다.
미세혈관 장애
미세혈관 장애는 주로 미세 모세관 및 림프관에 영향을 주는 광범위한 증상의 군으로 이루어지며, 따라서 직접적인 외과적 개입의 범위를 벗어난다. 미세혈관 질환은 혈관경련(vasospastic), 혈관염(vasculitis) 및 림프관 폐색(lymphatic occlusive)들로 폭 넓게 분류될 수 있다. 게다가, 공지된 혈관 상태들 중 다수는 미세혈관 요소를 갖는다.
혈관경련 질환
혈관경련 질환은 알려지지 않은 이유로 인하여 말초 혈관수축 반사가 과민성인 비교적 흔한 증상의 군이다. 이는 부적절한 혈관 수축 및 조직 허혈을 야기하고 심지어 조직 손실까지 야기한다. 혈관경련 증후군은 대개는 온도 또는 진동하는 기계의 사용과 연관되지만, 다른 상태들에 이차적(부수적)인 것이 될 수도 있다.
혈관염 질환
혈관염 질환은 미세순환에서 일차 염증 과정을 포함하는 것이다. 혈관염은 대개 자가면역 또는 결합 조직 장애의 구성요소이며, 일반적으로 외과적 치료가 가능하지 않으나, 그러나 증후군이 심각한 경우 면역억제 치료를 필요로 한다.
림프관 폐색 질환
하지 또는 상지의 만성 팽윤(림프부종)은 말초 림프관 폐색의 결과이다. 이는 일부는 선천적이고 일부는 후천적인 많은 원인을 갖는 상대적으로 희귀한 상태이다. 치료의 중심은 정확하게 맞춘 압박의류(compression garments) 및 간헐적인 압박기구의 사용이다.
당뇨병 연관 미세혈관 병리학
당뇨병은 실명의 주요 원인이고, 절단 및 발기부전의 첫 번째 원인이고, 그리고 가장 흔하게 일어나는 만성 소아 질환의 하나이다. 당뇨병은 또한 다른 신장 질환과 비교하여 31%의 유병율을 갖는 미국에서 말기 신장 질환의 주요 원인이다. 당뇨병은 또한 모든 이식 수술의 22%에 달하는 것으로 추산되는 신장 이식의 가장 흔한 지표이다.
일반적으로, 당뇨병 합병증들은 미세혈관 질환 또는 대혈관 질환으로 크게 분류될 수 있다. 미세혈관 합병증에는 신경병증(신경 손상), 신장병(신장 질환) 및 시각 장애(예를 들면, 망막병증, 녹내장, 백내장(cataract) 및 각막 질환)들이 포함된다. 망막, 사구체(glomerulus) 및 신경속 혈관(vasa nervorum)에서 유사한 병태생리학적 특징이 당뇨병-특이적 미세혈관 질환으로 특정된다. 당뇨병과 연관된 미세혈관 병리학은 예를 들면 장기간 당뇨병을 앓은 사람들에서 일어날 수 있는 가장 작은 혈관(모세혈관)의 질병으로 정의된다. 혈관의 벽은 비정상적으로 두꺼우나 그러나 약하게 된다. 따라서, 이들 혈관들은 출혈을 야기하고, 단백질을 누출시키고 그리고 전신을 통한 혈액의 흐름을 늦춘다.
임상 및 동물 모델 데이터는 만성 고혈당증이 모든 형태의 당뇨병 미세혈관 질환에서의 중심 개시 인자(central initiating factor)임을 나타내고 있다. 고혈당증의 지속기간 및 정도는 둘 다 당뇨병 미세혈관 질혼의 진전의 정도 및 속도에 강하게 연관된다. 비록 모든 당뇨병 세포들이 상승된 수준의 혈장 당 수준에 노출됨에도 불구하고, 고혈당증 손상은 세포내 고혈당증을 발전시키는 이들 세포 형태들(예를 들면, 내피세포)에 한정된다. 많은 다른 세포들과는 달리, 내피세포는 세포외 고혈당증에 노출되는 경우 당 수송을 하향-조절할 수 없기 때문에 세포내 고혈당증을 발전시킨다.
비정상적인 내피세포 기능: 진성 당뇨병(diabetes mellitus)의 과정의 초기, 구조적 변화가 분명하기 이전에, 고혈당증은 망막, 사구체 및 말초 신경 신경속 혈관에서의 혈류 및 혈관투과성의 이상을 야기한다. 혈류 및 모세관 내 압력의 증가는 모세혈관상의 원심측(efferent side) 상에서의 고혈당증-유발의 감소된 일산화질소(NO) 생성 및 가능하게는 안지오텐신 II(angiotensin II)에 대한 증가된 감수성을 반영한다고 생각된다. 모세관 압력의 증가 및 내피세포 기능이상의 결과로서, 망막 모세혈관은 플루오레세인(fluorescein)의 누설의 증가를 나타내고 그리고 사구체 모세관은 알부민 분비 속도(albumin excretion rate ; AER)가 증가된다. 말초신경의 신경속 혈관에서 필적할만한 변화들이 일어난다. 당뇨병 과정의 초기에, 증가된 투과성은 가역적이나, 그러나 시간이 경과함에 따라 비가역적으로 된다.
증가된 혈관벽 단백질 축적
당뇨병 미세혈관 질환의 흔한 병태생리학적 특징은 혈관판(vascular lumina)의 진행성 협착화 및 종국적인 폐색이며, 이는 영향을 받은 조직의 부적절한 관류 및 기능을 야기한다. 초기 고혈당증-유발 미세혈관 고혈압 및 증가된 혈관 투과성은 하기 3가지 과정들에 의한 비가역적 미세혈관 폐색에 기여한다:
첫 번째는 과요오드산-쉬프(periodic acid-Schiff ; PAS) 양성, 탄수화물-함유 혈장 단백질의 비정상적인 누설이며, 이는 모세관벽에 침착되고 그리고 주위세포 및 혈관간막세포(mesangial cells) 등과 같은 혈관주위세포들을 자극하여 성장 인자 및 세포외 기질을 동화(elaborate)시킬 수 있다.
두 번째는 형질전환 성장 인자(transforming growth factor) β1(TGF-β1) 등과 같은 성장 인자의 관외유출(extravasation)이며, 이는 세포외 기질 성분의 과형성을 직접적으로 자극하고, 그리고 특정의 합병증-연관 세포 유형에서 세포자살을 유도할 수 있다.
세 번째는 내피세포 및 지지세포에 의한 병리학적 유전자 발현의 고혈압-유도 자극이며, 이는 글루트-1(glut-1) 당 전달체, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 세포외 기질 성분 및 순환 백혈구(circulating leukocytes)를 활성화시킬 수 있는 부착 분자를 포함한다. 당뇨병 미세혈관 질환의 중증도에서의 편측 감소가 눈 또는 신동맥 협착을 갖는 측면에서 일어난다는 관측이 이러한 개념과 일치한다.
미세혈관 세포 상실 및 혈관 폐색
당뇨병 미세혈관판(diabetic microvascular lumina)의 진행성 협착화 및 폐색은 또한 미세혈관 세포 상실을 수반한다. 망막에 있어서, 진성 당뇨병은 뮐러세포(Muller cells) 및 신경절 세포, 주위세포 및 내피세포들의 예정된 세포사를 유도한다. 사구체에 있어서, 신장 기능의 감소는 광범위한 모세관 폐색 및 다리세포(podocyte) 상실과 연관되나, 그러나 사구체 세포 상실의 내재하는 메카니즘은 아직 알려지지 않았다. 신경속 혈관에 있어서, 내피세포 및 주위세포 변성이 일어나며, 이들 미세혈관 변화들은 당뇨병 말초 신경병증의 발전에 선행하는 것으로 나타난다. 당뇨병에서의 축삭변성(axonal degeneration)의 다초점 분포(multifocal distribution)는 미세혈관 폐색에 대한 원인적 역할을 지지하나, 그러나 신경영양물질에 있어서의 고혈당증-유발 감소가 정상적인 축삭 복구 및 재생을 방해하는 것에 의하여 기여할 수 있다.
당뇨병 미세혈관 질환의 다른 통상적인 특징은 고혈당증 기억(hyperglycemic memory) 또는 정상 당 항상성(glucose homeostasis)의 후속 기간 동안의 고혈당증-유발 미세혈관 변형의 존속 또는 진행으로 정의된다. 이러한 현상의 가장 충격적인 예는 2.5년의 고혈당증에 후속하는 정상화된 혈당의 2.5년 동안의 기간 동안 전적으로 발생하는 당뇨병개의 조직학적으로 정상인 눈에서의 심각한 망막병증의 발전이다. 선택된 기질 유전자 전사의 고혈당증-유발 증가는 또한 생체 내에서 정상 혈당의 복귀 이후 수주 동안 존속되고, 덜 현저하기는 하나, 질적으로 유사한, 선택된 기질 유전자 전사의 고혈당증-유발 증가의 연장이 배양된 내피세포에서 발생한다.
더 이상의 정보를 위해서는, 예를 들면, 문헌 "Shared pathophysiologic features of microvascular complications of diabetes" (Larsen: Williams Textbook of Endocrinology, 10th ed., Copyright ⓒ 2003 Elsevier)을 참조하시오.
미세혈관 합병증은 명백한 당뇨병에서 뿐만 아니라 내당능장애(IGT)로 인하여도 또한 발생한다. 내당능장애의 미세혈관 합병증은 신경병증, 망막병증 및 신장 미소단백뇨증(renal microproteinuria)들이다. 여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 미세혈관 장애를 치료하는 데 유용하다.
당뇨병 사지 허혈 및 당뇨병 족부궤양
당뇨병 및 압력은 미세혈관 순환을 손상시킬 수 있으며, 하지(lower extremities) 상의 피부에 변화를 야기할 수 있으며, 이는 차례로 궤양 및 후속의 감염을 야기할 수 있다. 미세혈관 변화는 말초 허혈을 발전시키는 소인 및 허혈 현상에 대한 감소된 신생혈관생성 보상 반응(angiogenesis compensatory response)과 마찬가지로 사지 근육 미세혈관병증(microangiopathy)을 야기한다. 미세혈관 병리학은 죽상동맥경화증으로 인하여 다리에서의 동맥의 협착화시키는 대혈관 합병증인 말초혈관질환(Peripheral Vascular Disease(PVD) 또는 말초동맥질환(Peripheral Arterial Disease(PAD) 또는 하지동맥질환(Lower Extremity Arterial Disease(LEAD))을 악화시킨다. 말초혈관질환은 당뇨병 초기에서 발생하며, 보다 심각하고 그리고 보다 광범위하며, 종종 다리, 눈 및 신장에 영향을 주는 병발성 미세순환상 문제점들을 포함한다.
족부궤양 및 괴저(gangrene)는 말초동맥질환의 빈발하는 동반질환(comorbid) 상태이다. 손상된 감각(impaired sensation)을 수반하는 동시 말초 신경병증은 발이 외상, 궤양 및 감염에 감수성이 되도록 한다. 당뇨병에서의 말초동맥질환의 진전은 말초 신경병증 및 발과 하지가 통증 및 외상에 대한 둔감(insensitivity)과 같은 동반질환에 의해 복합화된다. 손상된 순환 및 손상된 감각과 함께, 궤양 및 감염이 발생한다. 골수염 및 괴저로의 진행은 절단을 필요로 할 수 있다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 당뇨병 사지 허혈을 치료하는 데 유용하다. 여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 궤양을 치료하는 데 유용하다. 여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 당뇨병 족부 궤양을 치료하는 데 유용하다.
당뇨병에서의 관상 미세혈관 기능이상
당뇨병에서 조직병리현상 및 미세순환 기능이상 사이의 상관관계는 오래된 실험 연구 및 생검으로부터 잘 알려져 있으며, 여기에서 기저막의 후막화(thickening), 혈관주위 섬유증(perivascular fibrosis), 혈관 희박화(vascular rarefication) 및 모세관 출혈이 빈번하게 발견된다. 비록 최근 논문이 병리학 및 눈의 미세혈관 기능이상 사이의 상관관계가 입증되었음에도 불구하고, 이들 데이터를 생체 내에서 확인하는 것은 어렵다(문헌 (Am J Physiol 2003;285 참조). 그러나, 다량의 임상적 연구들은 명백한 당뇨병 뿐만 아니라 손상된 대사조절(impaired metabolic control)이 관상 미세순환에 영향을 줄 수 있다는 것을 나타내고 있다(문헌 Hypert Res 2002;25:893 참조). 베르너(Werner)는 경색 관련 동맥의 성공적인 재개방(reopening) 이후의 환자의 미세혈관 기능이상의 지속을 나타내는 중요한 논문(문헌 Sambuceti et al (Circulation 2001; 104: 1129)을 언급하였으며, 이는 상기 환자에 있어서 증가된 심혈관 동반질환 및 사망율을 설명할 수 있다. 동반질환과 사망율이 경색 관련 동맥의 재개방 자체와는 연관이 없으나, 그러나 심근경색 환자의 혈전용해 치료 유동 +/- 심근 홍조(Thrombolysis In Myocardial Infarction(TIMI) flow +/- myocardial blush)에 보다 더 의존적이라느 대량의 급성 재관류 연구들로부터의 증거가 쌓이고 있다(문헌 Stone 2002; Feldmann Circulation 2003 참조). 헤르만은, 다른 무엇보다도, 관상 미세순환의 온전성(integrity)이 이러한 정황에서 가장 중요한 임상적 및 예후인자(prognostic factor)일 것이라고 지적하였다(문헌 Circulation 2001 참조). 보호기구(protection devices)의 중성효과(neutral effect ; 심근경색 환자의 혈전용해 치료 유동, ST 분해능 또는 MACE(Major Adverse Cardiac Event)에 대하여 연관된 변화 없음)가 미세순환의 기능이상이 예후의 주요 결정인자임을 나타낼 수 있다. 또한, 관상 미세혈관 기능이상이 비 폐쇄성 관상동맥질환(non obstructive CAD(coronary artery disease)에서 중요한 역할을 한다는 증거가 증가하고 있다. 이들 환자들에서 관상 내피세포 기능이상은 강력한 예후 예보인자(prognostic predictor)로 남아 있다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 관상 미세혈관 기능이상을 치료하는 데 유용하다.
당뇨병 신경병증(당뇨병을 앓는 환자의 신장 기능이상)
당뇨병 신경병증은 미세알부민뇨(microalbuminuria ; 미세혈관 질환 효과), 단백뇨(proteinuria) 및 말기 신질환(End-Stage Renal Disease ; ESRD)을 포함한다. 당뇨병은 새로운 사례의 40% 이상으로 추산되는 신부전(kidney failure)의 가장 흔한 원인이다. 약물 및 식이요법으로 당뇨병을 조절할 수 있는 경우에서조차도, 당뇨병은 신장병증 및 신부전을 야기할 수 있다. 당뇨병을 앓는 대부분의 사람들은 신부전을 일으킬 정도로 심각한 신장병증을 일으키지 않는다. 미국에서 약 1600만명(16 million people)이 당뇨병을 앓고 있으며, 약 100,000명이 당뇨병의 결과로 신부전을 앓는다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 당뇨병 신장병증을 치료하는 데 유용하다.
망막병증
망막병증은 눈의 망막에 대한 비-염증성 손상을 의미하는 보편 명사이다. 망막병증의 원인은 다양하며, 예를 들면, 당뇨병(당뇨병 망막병증), 동맥 고혈압(artherial hypertension ; 고혈압 망막병증), 신생아의 미숙(미숙아의 망막병증), 망막 정맥 또는 동맥 교합들이 포함된다. 많은 형태의 망막병증이 진행성이고 그리고 맹목 또는 심각한 시각 상실 또는 손상을 가져올 수 있다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 망막 정맥 또는 동맥 교합과 연관된 질병, 장애 또는 손상을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 스텐트 내 망막병증(in-stent retinopathy)을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 스텐트 내 망막병증을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 고혈압 망막병증을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 미숙아의 망막병증을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
당뇨병 망막병증
당뇨병 망막병증은 당뇨병의 합병증이며, 맹목의 주요 원인이다. 이는 당뇨병이 망막 내의 작은 혈관들을 손상시키는 경우에 발생한다. 당뇨병 망막병증은 4단계를 갖는다:
- 경미한(mild) 비증식성 망막병증: 망막 혈관 내 미세동맥류(microaneurysms).
- 중등도(moderate) 비증식성 망막병증. 망막병증이 진행함에 따라 망막을 영양하는 일부 혈관들이 차단된다.
- 중증(severe) 비증식성 망막병증. 보다 많은 혈관들이 차단되어 망막의 여러 영역들에서 혈액 공급을 허용치 않으며, 새로운 혈관의 성장에 의해 극복된다.
- 증식성 망막병증. 새로운 혈관들이 망막을 따라 그리고 유리체의 표면을 따라 성장한다. 혈관들이 혈액을 누출하는 경우, 심각한 시각 상실 및 심지어 맹목이 야기될 수 있다.
임신 중, 당뇨병 망막병증이 당뇨병을 앓는 여성에 대하여 문제가 될 수 있다.
이론에 구속됨이 없이, 당뇨병 망막병증으로 손상된 혈관은 두 가지 방법: 즉, 취약한, 비정상적인 혈관이 발달하고 그리고 눈의 중심 내로 혈액을 누설시켜 시각을 흐리게 할 수 있다. 이는 증식성 망막병증이며, 이 질병의 4단계이고 그리고 가장 진보한 단계이다. 유체가 황반의 중심 내로 누설되어 흐려진 시각을 야기할 수 있다. 이러한 상태를 황반 부종(macular edema)라고 부른다. 비록 상기 질병이 진전됨에 따라 나타날 수 있는 것으로 여겨지며, 당뇨병 황반 부종(diabetic macular edema ; DME)로 알려져 있기는 해도, 이는 당뇨병 망막병증의 임의의 단계에서 발생할 수 있다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 당뇨병 망막병증을 예방 및 치료하는 데 유용하다.
당뇨병 황반 부종( DME )
당노병 황반 부종은 망막의 혈관에 영향을 주는 질병인 당뇨병 망막병증의 합병증이다. 당뇨병 망막병증은 망막 후막화 및 부종, 출혈, 지연 혈류(impeded blood flow), 혈관으로부터의 유체의 과도한 누출 및 말기 단계에서의 비정상적 혈관 성장을 포함하여 망막 내에서의 다중의 비정상의 결과이다. 이러한 혈관 성장은 큰 출혈 및 심각한 망막 손상을 야기할 수 있다. 당뇨병 망막병증의 혈관 누출이 황반 내에서 팽윤을 야기하는 경우, 이를 당뇨병 황반 부종이라 칭한다. 당뇨병 황반 부종의 주요 징후는 중심 시력의 상실이다. 당뇨병 황반 부종과 연관되는 위험 인자들에는 불충분하게 조절되는 혈당 수준, 높은 혈압, 유체 정체(fluid retention)를 야기하는 비정상적인 신장 기능, 고콜레스테롤 수준 및 다른 일반적인 전신적인 인자들이 포함된다.
세계보건기구(World Health Organization)에 따르면, 당뇨병 망막병증은 취업연령(working age) 성인에서의 맹목의 주요 원인이며, 당뇨병에서의 시각 상실의 주요 원인이다. 미국당뇨병협회(American Diabetes Association)는 미국 내에 약 1800만명(18 million)의 당뇨병 환자들이 존재하며, 미국 내에서 매년 대략 130만건의 새로이 진단되는 당뇨병 사례들이 존재한다고 보고하고 있다. 미국실명방지위원회(Prevent Blindness America) 및 미국국립안연구센터(National Eye Institute)는 미국 내에 당뇨병 황반 부종을 앓는 약 500,000명을 포함하여 당뇨병 망막병증을 앓는 18세 이상의 사람이 530만명 이상이 존재한다고 추산하고 있다. 미국질병관리본부(Center for Disease Control ; CDC)는 미국 내에서 매년 약 75,000건의 당뇨병 황반 부종의 새로운 사례들이 있다고 추산하고 있다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 당뇨병 황반 부종(DME)을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
망막 미세혈관병증( Retinal microvasculopathy ; AIDS 망막병증 )
망막 미세혈관병증은 후천성면역결핍증(AIDS) 환자 100%에서 발견된다. 이는 망막 내 출혈, 미세동맥류, 로트반점(Roth spots), 면화반(cotton-wool spots ; 신경섬유층의 미세경색) 및 혈관주위초 형성(perivascular sheathing)으로 특징지워진다. 순환 면역 복합체(circulating immune complexes), 세포독성 물질의 국부적 방출, 비정상 혈류현상(abnormal hemorheology) 및 내피세포의 인간면역결핍바이러스 감염에 기인하는 것으로 고려되고 있음에도 불구하고, 상기 망막병증의 병인은 알려지지 않았다. AIDS 망막병증에 대한 특별한 치료법은 없다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 AIDS 망막병증을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
골수이식( Bone marrow transplantation ; BMT ) 망막병증
골수이식 망막병증은 1983년에 처음 보고되었다. 이는 전형적으로 골수이식 6개월 이내에 발생하나, 그러나 62개월 이후에도 발생할 수 있다. 당뇨병 및 고혈압 등과 같은 위험 인자들이 허혈성 미세혈관병증을 증가시키는 것에 의하여 골수이식 망막병증의 발달을 가능하게 할 수 있다. 골수이식 망막병증의 발달에 대하여 알려진 연령, 성별 또는 인종에 대한 호발(predilection)은 없다. 환자는 감소된 시력(decreased visual acuity) 및/또는 시야 결손(visual field deficit)을 갖게 된다. 후방 분절 소견(posterior segment findings)은 전형적으로 양쪽성이고 대칭이다. 임상적 징후들에는 다수의 면화반, 모세혈관확장증, 미세동맥류, 황반 부종, 경성 삼출물(hard exudates) 및 망막 출혈이 포함된다. 플루오레세인 혈관조영검사(fluorescein angiography)는 모세관 비관류 및 손실(dropout), 망막 내 미세혈관 이상, 미세동맥류 및 황반 부종을 증명하고 있다. 비록 골수이식 망막병증의 정밀한 병인이 설명되고 있지는 않지만, 여려 인자들: 즉, 사이클로스포린 독성(cyclosporine toxicity), 전신 방사선 조사(total body irradiation ; TBI) 및 화학요법제(chemotherapeutic agents)에 의하여 영향을 받는 것으로 여겨진다. 사이클로스포린은 이식물-대-숙주(graft-versus-host) 면역 반응을 억제하는 강력한 면역조절제이다. 이는 내피세포 손상 및 신경학적 부작용을 유발할 수 있으며, 그 결과로서, 골수이식 망막병증의 원인으로 제시되어 왔다. 그러나, 골수이식 망막병증은 사이클로스포린의 미사용 시에도 발달할 수 있으며, 자가(autologous) 또는 유전적동계(syngeneic) 골수이식 수용자에서 골수이식 망막병증을 야기하는 것으로 나타나지 않았다. 따라서, 사이클로스포링은 골수이식 망막병증의 단독 원인인 것으로 여겨지지는 않는다. 전신 방사선 조사(TBI) 또한 골수이식 망막병증의 원인으로 연루되어 왔다. 방사선은 망막 미세혈관계를 손상시키고 그리고 허혈성 혈관병증을 야기한다. 방사선의 총 조사량(total dose) 및 방사와 골수 절제 사이의 시간 간격 등과 같은 변수들이 중요한 것으로 여겨진다. 그러나, 골수이식 망막병증은 전신 방사선 조사를 받지 않은 환자에게서도 일어날 수 있으며, 골수이식 망막병증은 유사한 방사선 조사량을 받은 고형 기관(solid organ) 이식 수용자에서는 관찰되지 않았다. 따라서, 전신 방사선 조사는 단독 원인이 아니나, 그러나 골수이식 망막병증의 발전에서의 다른 기여 인자(contributing factor)이다. 화학요법제가 골수이식 망막병증에서의 잠재적인 기여 인자로 여겨져 왔다. 시스플라틴(cisplatin), 카무스틴(carmustine) 및 사이클로포스파미드(cyclophosphamide) 등과 같은 약물들은 울혈유두(papilledema), 시신경염(optic neuritis), 시야 결손 및 피질맹(cortical blindness)을 포함하여 눈 부작용(ocular side effects)을 야기할 수 있다. 이들 화학요법제들이 환자의 방사선-유발 망막 손상을 받게 만들고 그리고 방사선의 해로운 효과를 강화시킬 수 있다. 대체로, 골수이식 망막병증을 앓는 환자들은 양호한 예후를 갖는다. 망막병증은 대개는 사이클로스포린의 투약(dosage)을 중단하거나 또는 감소시킨 2 내지 4개월 이내에 해소된다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 골수이식 망막병증을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
각막 이식
오늘날 인간에 있어서 가장 흔한 이식 수술 중의 하나는 관통각막이식술(penetrating keratoplasty ; 각막 이식)이다. 후천적(예를 들면, 감염) 및 선천적(예를 들면, 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome) 각막 질환으로부터의 맹목을 방지하기 위하여 현재 40,000건 이상의 각막 이식이 매년 세계적으로 수행된다. 각막 이식의 주 목적은 시각을 개선하고, 통증을 감소시키고, 그리고 구조적 손상을 회복하는 것이며, 성공적인 시각적 결과(visual outcome)는 이식물의 장기간의 생존에 의존한다. 시간의 경과에 따라, 각막 이식 실패의 가능성은 증가하고, 따라서 많은 혈관성 기관 이식(vascularized organ grafts)과는 대조적으로, 각막 이식에 대한 감손율(attrition rate)은 전형적으로 느리나 그러나 피할 수 없는 것이다. 실패한 각막 이식의 재-이식(re-grafting)에 대한 요구는 각막 이식술에 대한 주요 지표들 중의 하나이다.
각막 이식의 실패는 좋지 않은 기증자 조직(bad donor tissue ; 원발성 실패(primary failure)의 결과로서 또는 초기 또는 후기 수술후합병증으로 인하여 발생할 수 있다. 그러나, 각막 이식 실패에 대한 가장 흔한 이유들 중의 하나는 면역학적 각막 이식 거부이며, 이는 사례들 중의 약 30%로 발생한다.
각막 이식의 성공은 주로 혈관의 결여, 림프의 결여(lack of lymphatics), 혈액-눈 장벽(blood-eye barrier), 중심 각막 내에서의 성숙 항원제공세포(antigen presenting cells ; APCs)의 상대적인 결핍 및 안방수에서의 면역조절 인자의 존재를 포함하는 다중 메카니즘을 통한 눈의 면역-특권 상태(immune-privileged status)를 유지하는 것에 의존한다. 그러나, 각막 내에서의 염증 및 이상 그리고 그 결과의 신혈관화는 눈 내에서의 면역 특권의 상실을 야기하고 그리고 각막 이식 거부의 결과를 가져오는 세포-매개 면역 반응을 야기한다.
정상적으로 무혈관의 숙주 각막(avascular host cornea) 내에서의 신혈관화는 각막 이식 거부의 가장 잘 구축되고 그리고 인식되는 위험 인자로서 만연한다. 정상 각막은 혈관 및 림프관을 결여하는 무혈관이며, 이는 투명도와 시각 둘 다를 위하여 그리고 각막에 면역-특권을 부여하여 기증자 각막이 손상되는 것을 보호하고, 각막 이식의 장기간 생존을 위한 중요한 예후 인자로 만드는 데 필수적이다. 각막 이식 이전 또는 이후 둘 중의 하나에서 신혈관화가 존재하는 경우, 새로운 림프관의 성장(림프관신생(lymphangiogenesis))이 상기 이식물로부터 소속림프절(regional lymph node)에로의 항원제공세포 및 항원성 물질(antigenic material)의 퇴장을 가능하게 하는 한편으로, 새로운 혈관의 성장(신생혈관생성)은 이식물에로의 면역-매개 세포의 진입의 경로를 제공한다. 따라서, 각막에로 면역반응매개체(immune reaction mediators)가 침입하고 그리고 이에 민감화되고, 그리고 비록 면역 반응 그 자체는 아님에도 불구하고, 신혈관화는 면역학적 각막 이식 거부를 야기할 수 있는 면역 반응을 유발한다.
눈의 4상한(four quadrants) 모두에서 신혈관화가 나타나는 사람에 대하여 무혈관의 눈(avascular eye)의 2/3로 각막 이식 거부의 위험이 발생한다.
현재, 구축된 치료법에는 눈 내에서의 면역 반응을 다스리기 위한 항-염증성 약물(즉, 코르티코스테로이드(corticosteroids)) 및/또는 면역억제제의 사용이 포함되며, 이들은 만기 단계(later phases)에서는 아니지만, 거부의 초기 단계(early phase)에서는 도움이 될 수 있다. 따라서, 환자들이 각막 이식 이후에도 시각을 유지하는 것을 확실하게 하기 위하여 각막 이식 거부를 관리하기 위한 새로운 접근법이 요구되고 있다. 후속하는 면역 반응 또는 염증의 치료 보다는 오히려 신혈관화를 예방 또는 치료하는 가능성에 대한 조사들이 수행되어 왔다. 그러나, 지금까지 각막 신혈관화를 치료하는 것을 보증하는 특별한 치료법은 없었다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 각막 신혈관화를 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
신생내막 증식 및 평활근 세포 이동의 억제(스텐트)( Inhibition of neointima proliferation and smooth muscle cell migration ( stents ))
스텐트 내 재협착(in-stent restenosis)은 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell ; VSMC) 증식, 이동 및 과도한 기질 생성으로 야기되는 병리생물학적 과정(pathobiologic process)이다.
인간 내유동맥(human internal mammary arteries)의 생체 외 기관 배양 모델 내에서의 RhoA의 분석(문헌 J Vase Res. 2005 Jan-Feb;42(l):21-8)은 스텐트시술(stenting)이 p27 발현에서 동반 감소(concomitant decrease)와 연관되는 RhoA 활성에서의 시간-의존적인 증가를 유발한다는 것을 증명하였다. 스텐트화된 동맥의 RhoA 억제제로의 치료는 신생내막의 형성 및 p27 발현에서의 감소 둘 다를 억제하였다. 스텐트 이식은 지속된 RhoA 활성화를 유발하고 그리고 RhoA 발현에 대한 라파마이신(rapamycin)의 억제 작용이 항재협착 효과(antirestenotic effect)에서 핵심 역할을 한다는 것을 입증하고 있다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 스텐트 내 재협착을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
폐고혈압(p ulmonary h ypertension)
폐동맥고혈압(pulmonary arterial hypertension ; PAH)은 염증과 마찬가지로 폐혈관수축(pulmonary vasoconstriction) 및 혈관재구성(vessel remodeling)으로 인한 폐동맥 압력 및 혈관 저항의 진행성 상승으로 특징지워지는 파괴적인 질병이다.
휴지 시(at rest) 25mmHg 이상, 운동 시(upon exertion) 30mHg 이상의 상승되고 지속되는 폐동맥 압력의 증가로 특징지워지는 폐동맥고혈압(PAH)은 나쁜 예후를 가지며 대개는 치료하지 않고 방치하는 경우 5년 이내에 사망하는 진행성 질병이다. 더욱이, 원발성 또는 특발성 폐고혈압(idiopathic pulmonary hypertension ; IPAH)은 치료하지 않으면 우심실기능상실(right ventricular failure)로 3년의 중기 내에, 현행의 치료법에도 불구하고 15%의 1년 이내 사망율로 사망을 야기할 수 있다. 폐동맥고혈압에 기여하는 인자들에는 연장된 혈관 수축, 혈관 재구성, 염증성 세포 이동 및 혈관 장애의 형성을 야기하는 원위치 혈전증(in situ thrombosis)이 포함된다. 현재는 폐동맥고혈압에서 발생하는 상승된 폐혈관 저항의 일차적인 원인이 혈관 재구성으로부터의 기계적인 장애로 인한 것이라고 여겨진다. 게다가, 병리학적 소견은 폐동맥고혈압이 내막 및/또는 중막 비대(intimal and/or medial hypertrophy), 내막 섬유증 및 총상병변(plexiform lesions)과 연관된다는 것을 나타내고 있다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 폐고혈압을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
염증
염증은 독소, 손상된 세포 또는 자극물(irritants) 등과 같은 해로운 자극에 대한 혈관 조직의 복잡한 생물학적 반응의 일부이다. 염증과 연관된 이상에는 엄청나게 다양한 인간 질병들에 내재하는 대규모의 공식적으로는 무관한 장애들의 군이 포함된다. 면역계는 종종 염증 장애들에 연루되며, 알러지 반응(allergic reactions) 및 일부 근병증성(myopathies) 둘 다에서 많은 면역계 장애들이 비정상적인 염증을 야기하는 것으로 입증되었다. 염증 과정에서 병인적 원인(etiological origins)을 갖는 비-면역 질환에는 암, 죽상동맥경화증 및 허혈심장병이 포함되는 것으로 여겨진다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 염증을 예방 또는 치료하는 데 유용하다. 여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 염증성 장애를 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
종양 형성(o ncogenesis)
최근, Rho 족 단백질들이 종양 성장, 진전, 전이 및 신생혈관생성에 관여한다는 것이 연구들에서 밝혀졌다. 비록 Rho 단백질 개입에 대한 경로가 실제로는 알려지지 않았음에도 불구하고, Rho 단백질과 암 사이의 연관(links)은 실제한다. 특히, RhoA 단백질은 특정의 형태의 암에 과도한 연관을 갖는 것으로 여겨진다. RhoA 과발현은 결장(colon), 유방(breast), 폐(lung), 고환생식세포(testicular germ cell) 및 두경부 편평상피세포(head and neck squamous-cell) 종양(carcinoma tumors)에 연관되는 것으로 밝혀졌다.
RhoA의 과발현의 수준은 그의 3가지의 공지된 효과기(effectors)의 증가된 활성화와 연관될 수 있으며, 이는 차례로 종양형성(tumorigenesis)을 허용하는 가능한 기능의 원인이 된다. 상기 3가지의 효과기들에는 ROCK(Rho-associated kinase) I, II 족들이 포함된다. 이들 효과기들은 액토미오신 수축(actomyosin contraction), 변성 및 SRF(serum response factor) 유전자의 전사를 야기하는 인산화효소(kinases)들이다. 또한, 이들 효과기들은 액틴을 중합하고 그리고 미세소관의 형성에 영향을 주도록 기능하는 비계 특성(scaffolding properties)들을 나타낸다. 두 번째 효과기는 내포작용(endyocytosis)을 야기하는 PRK1/PKN 단백질들이다. 그리고 마지막으로 RhoA는 효과기 시트론 원인 세포질분열(Citron causing cytokinesis)에 결합한다. 이들 효과기들은 세포 운동성 및 세포 극성에의 RhoA의 개입을 암시하는 것으로 여겨진다. 이들 두 기능들에 대한 RhoA 발현의 효과는 종양의 형성에 대한 원인이 될 수 있는 것으로 여겨질 수 있다. 실제로 가장 흔하게 암을 일으키는 조직들인 내피세포들에서의 극성의 손실 및 이들의 증가된 세포 운동성은 비정상적인 세포주들을 생성하는 것으로 여겨질 수 있다.
RhoA의 과발현은 결장, 유방, 폐 및 고환생식세포 및 두경부 편평상피세포 종양과 연관된다. 이들 암들에서의 RhoA의 역할에 관한 다른 가설이 탐구되고 있다. 그 중 하나는 RhoA의 구아노신트리포스페이트 분해효소 활성이 수송소포(vesicle transport) 및 세포 형태 변화 등과 같은 종양형성에 필요한 과정에 에너지를 제공한다는 것이다. 모순적이지는 않으나, 다른 하나의 가설은 암의 전이가 세포 운동성 및 과정 형성에서 RhoA의 역할에 의하여 영향을 받을 수 있다는 것이다.
"암(cancer)" 및 "암질환(cancerous disease)"은 상호호환적으로 사용되며, 부적절하게 높은 수준의 세포 분열, 부적절하게 낮은 수준의 세포자살 또는 이들 둘 다에 의해 야기되고 그러한 결과를 낳는 질환을 의미한다. 암질환의 제한없는 예들에는 백혈병(leukemias ; 예를 들면, 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수아구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단구성 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 급성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병), 진성다혈구증(polycythemia vera), 림프종(lymphoma ; 호지킨병(Hodgkin's disease), 비-호지킨병(non-Hodgkin's disease)), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄 질환(heavy chain disease) 및 육종(sarcomas)과 암종(carcinomas ; 예를 들면, 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골육종(osteogenic sarcoma), 척색종(chordoma), 혈관육종(angiosarcoma), 내피종(endotheliosarcoma), 림프관 육종(lymphangio sarcoma), 림프관내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyo sarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장암(colon carcinoma), 췌장암(pancreatic cancer), 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 기저세포암(basal cell carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 땀샘암종(sweat gland carcinoma), 피지샘암(sebaceous gland carcinoma), 유두상암(papillary carcinoma), 유두상선암(papillary adenocarcinomas), 췌장낭선암(cystadenocarcinoma), 수질암(medullary carcinoma), 기관지원성암종(bronchogenic carcinoma), 신장암(renal cell carcinoma), 간암(hepatoma), 담관암(nile duct carcinoma), 융모암(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 태생기암(embryonal carcinoma), 윌름스 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁암(uterine cancer), 고환암(testicular cancer), 폐암(lung carcinoma), 소세포폐암(small cell lung carcinoma), 방광암(bladder carcinoma), 상피성 난소암(epithelial carcinoma), 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상의세포종(ependymoma), 송과체부종양(pinealoma), 혈관아세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 핍지신경교종(oligodenroglioma), 신경초종(schwamioma), 뇌수막종(meningioma), 흑색종(melanoma), 신경아세포종(neuroblastoma) 및 망막아세포종(retinoblastoma)) 등과 같은 고형종양(solid tumors)들이 포함된다. 일부 바람직한 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 화합물들은 폐암 및 폐 내에서의 전이를 치료하는 데 유용하다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증식성 질환(proliferative disease)"은 악성이건 양성이건 간에 세포 증식이 상태의 병인에 기여하는 질환을 의미한다. 이러한 원치않는 증식은 암 및 많은 만성 염증성 질환의 특징이며, 따라서 "증식성 질환"의 예들에는 앞서 언급된 암들 및 건선(psoriasis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease) 및 류마티스 관절염 등과 같은 만성 염증성 증식성 질환; 재협착 등과 같은 증식성 심혈관 질환; 당뇨병 망막병증 등과 같은 증식성 안 질환; 및 혈관종(hemangiomas) 등과 같은 양성 과증식성 질환(benign hyperproliferative diseases);들이 포함된다.
여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 암을 예방 및 치료하는 데 유용하다. 여러 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 암종, 종양 및/또는 악성 질환들을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 결장암을 예방 또는 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 유방암을 예방 또는 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 폐암을 예방 또는 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 고환생식세포암을 예방 또는 치료하는 데 유용하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 경부편평세포암(neck squamous-cell carcinoma)을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.
앞서 언급한 질환 및 장애를 치료하기 위한 보다 효과적인 치료법이 큰 치료가치가 될 수 있다.
결론적으로, 본 출원에서 기술된 상태들(예를 들면, 녹내장, 척수손상, 중추신경계 손상, 신경퇴화)을 예방 및/또는 치료하기 위한 효과적인 치료법, 확실히 조직의 수축에 대한 효과적인 치료법 뿐만 아니라 또한 눈의 반흔화(ocular scarring)에 대한 효과적인 치료법이 존재하지 않는다. 그 중에서도 획득가능한 치료법들은 선택적 표적화(selective targeting)의 결여로 인한 심각한 부작용의 단점들로 고통을 받으며, 따라서 이들 목적들을 위한 신규한 화합물 및 치료방법들을 개발할 필요가 있다.
여러 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 화합물 및 약제학적 조성물은 이하에서 기술되나 이들에 제한되지 않는 질환들, 장애들 및 손상 등과 같은 중추신경계(CNS)에 영향을 주는 여러 질환들, 장애들 및 손상을 치료하거나 또는 예방하는 데 유용하다. 이론에 구속됨이 없이, 본 출원에서 제공되는 치료용 dsRhoA 분자는 다중 메카니즘에 의하여 중추신경계 장애, 질환 및 손상을 치료하여 신경 보호 및 신경 재생을 유도하는 것으로 여겨진다.
RhoA 단백질
RhoA는 작은 구아노신트리포스페이트 분해효소의 Ras 동족 유전자 족의 구성원이다. 이들 단백질들은 GTP의 GDP로의 가수분해에 의하여 그들의 활성형태(GTP-결합)으로부터 그들의 비활성형태(GDP-결합)으로 순환한다. 특정의 구아닌 교환 인자(guanine exchange factors ; GEFs)가 GDP의 새로운 GTP러의 치환을 촉매하는 것에 의하여 상기 구아노신트리포스페이트 분해효소를 재활성화시킨다. 다른 조절 인자들에는 그의 구아노신트리포스페이트 분해효소 활성을 향상시키는 것에 의하여 RhoA를 비활성화시키는(따라서 상기 단백질을 보다 빨리 그의 GDP-결합 비활성 형태로 전환시키는) 구아노신트리포스페이트 분해효소-활성화 단백질(GTPase-activating proteins ; GAPs) 및 GAP의 활성화 및 후속하여 느린 RhoA의 구아노신트리포스페이트 분해효소 활성을 억제하는 구아닌 뉴클레오티드 해리 억제제(guanine nucleotide dissociation inhibitors ; GDIs)들이 포함된다.
세포 내에서의 RhoA의 기능들은 주로 세포 골격 조절에 연관된다. 최근의 연구들은 미오신 포스포릴화(myosin phosphorylation) 및 병소 부착(focal adhesions) 및 액틴 스트레스 섬유(actin stress fibers)의 형성 등과 같은 스트레스에 대한 세포 반응들에서의 이들의 간접적인 개입(연관된 인자들을 통한)을 밝혔다. 미오신 쇄 연신(myosin chain elongation), 액틴 필라멘트 재배열(actin filament rearrangement), 유전자 발현, 세포-형상 결정 및 세포 증식에 직접적으로 연관된다는 것 또한 밝혀졌다.
RhoA의 과발현은 결장, 유방, 폐 및 고환생식세포암들 및 두경부 편평세포암종과 연관된다. 이들 암에서의 RhoA의 역할과 관련한 다른 가설들이 탐구되고 있다. 그 중 하나는 RhoA의 구아노신트리포스페이트 분해효소 활성이 수송소포 및 세포 형태 변화 등과 같은 종양형성에 필요한 과정에 에너지를 제공한다는 것이다. 모순적이지는 않으나, 다른 하나의 가설은 암의 전이가 세포 운동성 및 과정 형성에서 RhoA의 역할에 의하여 영향을 받을 수 있다는 것이다.
dsRNA 올리고리보뉴클레오티드 화합물
표 1, 2, 3 및 4들에는 미변성 및 화학적으로 변성된 RhoA dsRNA 화합물을 제조하는 데 유용한 센스 및 대응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 핵산 시퀀스들이 제공된다. 표 1, 2 및 3들에 제공된 상기 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RhoA 발현을 하향-조절하고 그리고 본 출원에서 기술되는 질병 및 장애를 치료하는 데 유용한 합성 siRNA 화합물(듀플렉스)의 생성에 유용한 바람직한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
공지의 유전자들에 대응하는 dsRNA 화합물의 선택 및 합성은 광범위하게 보고되어 있다; 예를 들면, Ui-Tei et al, J Biomed Biotechnol. 2006; 65052; Chalk et al, BBRC. 2004, 319(l):264-74; Sioud and Leirdal, Met. Mol Biol; 2004, 252:457-69; Levenkova et al, Bioinform. 2004, 20(3):430-2; Ui-Tei et al, NAR 2004, 32(3):936-48를 참조하시오. 변성된 siRNA의 용도 및 그의 제조의 예들에 대하여는 Braasch et al, Biochem., 2003, 42(26):7967-75; Chiu et al., RNA, 2003, 9(9):1034-48; PCT publications WO 2004/015107 (atugen); WO 02/44321 (Tuschl et al), and US Patent Nos. 5,898,031 and 6,107,094를 참조하시오.
여러 군들이 세포 내에서 siRNA를 생성할 수 있는 DNA-기반 벡터의 개발을 기술하였다. 상기 방법은 대체로 능률적으로 가공되어 세포 내에서 siRNA들을 형성하는 짧은 헤어핀 RNA들의 전사를 포함한다(문헌 Paddison et al. PNAS USA 2002, 99:1443-1448; Paddison et al. Genes & Dev 2002, 16:948-958; Sui et al. PNAS USA 2002, 8:5515-5520; 및 Brummelkamp et al. Science 2002, 296:550-553 참조). 이들 보고들은 여러 내생적으로 그리고 외생적으로 발현되는 유전자들을 특이적으로 표적화할 수 있는 siRNA들을 생성하는 방법을 기술하고 있다.
본 발명은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드(예를 들면, dsRNA들)를 제공하며, 이는 본 발명에 따라 RhoA의 발현을 하향-조절한다. 본 발명의 dsRNA 화합물은 센스 가닥이 RhoA의 mRNA 시퀀스로부터 유래되고 그리고 안티센스 가닥이 상기 센스 가닥에 상보적인 듀플렉스 올리고리보뉴클레오티드이다. 대체로, 상기 dsRNA 활성을 절충함이 없이 상기 표적 mRNA 시퀀스로부터의 일부 편차(deviation)이 허용된다(예를 들면, 문헌 Czauderna et al, 2003, NAR 31(11), 2705-2716을 참조하시오). 본 발명의 dsRNA 화합물은 상기 mRNA을 파괴하거나 또는 파괴함이 없이 전사-후 수준에서 유전자 발현을 하향-조절한다. 이론에 구애됨이 없이, dsRNA는 특정의 개열 및 변성에 대하여 상기 mRNA를 표적할 수 있거나 및/또는 표적화된 메시지(targeted message)로부터의 번역을 억제할 수 있다.
본 출원에서 기술되는 상기 dsRNA 화합물은 본 출원에서 기술되는 구조들내에서 규정된 변성들에 따라 또는 일렬의 dsRNA(tandem dsRNA) 또는 RNA성상(RNAstar)로서 화학적으로 및 또는 구조적으로 변성된다.
RhoA 를 억제하기 위한 약제학적 조성물
RhoA 유전자 발현의 하향-조절을 매개하거나 또는 RhoA 유전자 발현에 대한 RNA 간섭을 매개할 수 있는 짧은 간섭 핵산(siNA), 간섭 RNA(RNAi), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(miRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 분자 등과 같은 작은 핵산 분자들을 사용하는 것에 의하여 RhoA 발현을 하향-조절하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본 출원에서 기술되는 상기 조성물 및 방법은 또한 여러 신경퇴행성 및 신경학적 장애 및 통증을 치료하는 데 유용하다.
본 발명의 핵산 분자(들) 및/또는 방법들은 예를 들면 젠뱅크 수탁번호 NM 001664(Genbank Accession NM 001664)로 언급되는 mRNA를 인코딩하는 RhoA의 발현을 하향 조절하는 데 사용된다.
비록 본 발명의 상기 화합물이 원료 화학물질로서 투여되는 것이 가능할 수 있기는 하나, 이들을 약제학적 조성물로 제공하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 상기 화합물들 및 약제학적으로 수용가능한 담체(carrier)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이 조성물은 둘 또는 그 이상의 다른 핵산 화합물들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 출원에서 제공되는 조성물들, 방법들 및 킷트들은 하나 또는 그 이상의 핵산 분자들(예를 들면, dsRNA) 및 독립적으로 또는 조합하여 RhoA 단백질 및/또는 RhoA 단백질을 인코딩하는 유전자들, 예를 들면, 중추신경계 장애, 질병 및 손상의 유지 및/또는 발전과 연관되는 단백질들 및/또는 유전자들(예를 들면, 젠뱅크 수탁번호 NM_001664들로 언급되는 시퀀스들을 포함하는 시퀀스들을 인코딩하는 유전자들) 또는 RhoA 유전자 족 구성원의 발현을 조절(예를 들면, 하향조절)하는 방법들을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 유전자들 또는 유전자 족 시퀀스들은 시퀀스 상동성을 공유하다. 여러 관점들 및 구체예들의 기술이 예시적인 유전자 RhoA를 참조하여 제공된다. 그러나, 상기 여러 관점들 및 구체예들은 또한 특정의 RhoA 유전자들과 연관되는 상동 유전자들 및 전사 변종들(transcript variants) 및 다형체들(polymorphisms ; 예를 들면, 단일 핵산 다형체(single nucleotide polymorphism(SNPs)) 등과 같은 다른 연관된 RhoA 유전자들에로 지향된다. 마찬가지로, 상기 여러 관점들 및 구체예들은 또한 단일 형질도입의 RhoA 매개 경로들 또는 예를 들면 본 출원에서 기술되는 질병들, 특성들(traits) 또는 상태들의 유지 또는 발달에 연루되는 유전자 발현에 연루되는 다른 유전자들에로 지향된다. 이들 부가의 유전자들은 본 출원에서 상기 RhoA 유전자에 대하여 기술되는 방법들을 사용하여 표적 자리들에 대하여 분석될 수 있다. 따라서, 다른 유전자들의 하향-조절 및 상기 다른 유전자들의 이러한 조절의 효과들은 본 출원에서 기술되는 바와 같이 수행되고, 결정되고그리고 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 RhoA 발현을 하향조절하기에 충분한 양의 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물들에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되는 본 발명의 적어도 하나의 화합물; 및 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 화합물은 내인성 세포 복합체들에 의하여 세포내 가공되어 본 발명의 하나 또는 그 이상의 올리고리보뉴클레오티드들을 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 약제학적으로 수용가능한 담체 및 인간 세포 내에서의 RhoA의 발현을 억제하기에 유효한 양의 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물들을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 화합물은 (N)x의 시퀀스에 실질적으로 상보적인 시퀀스를 포함한다.
실질적으로 상보적은 다른 시퀀스에 대하여 약 84% 이상의 상보성(complementarity)을 의미한다. 예를 들면, 19개의 염기쌍들로 구성되는 듀플렉스 영역 내에서 하나의 미스매치는 94.7%의 상보성의 결과를 가져오고, 2개의 미스매치는 약 89.5%의 상보성의 결과를 가져오고, 그리고 3개의 미스매치는 약 84.2%의 상보성의 결과를 가져와서 상기 듀플렉스 영역에 실질적으로 상보적인 결과를 부여한다. 따라서 실질적으로 동일한은 다른 시퀀스에 대하여 약 84% 이상의 동일성을 의미한다.
게다가, 본 발명은 본 발명의 RhoA의 mRNA 전사물을 본 발명의 하나 또는 그 이상의 상기 화합물들과 접촉하는 것을 포함하는, 대조군(control)과 비교하여 적어도 40%로, 바람직하게는 50%로, 60%로 또는 70%로, 보다 바람직하게는 75%로, 80%로 또는 90%로 RhoA의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 올리고리보뉴클레오티드 화합물들, 조성물들 및 방법들은 상기 RhoA 유전자를 억제/하향-조절하고, 그에 의하여 상기 억제/하향-조절이 유전자 기능의 억제/하향-조절, 폴리펩티드의 억제/하향-조절 및 mRNA 발현의 억제/하향-조절을 포함하는 군으로부터 선택된다.
하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 조성물들 및 방법들은 RhoA 유전자(예를 들면, 시퀀스 동정 번호: 1로 예시화되는 인간 RhoA에 대한 시퀀스를 코딩하는 mRNA)의 발현을 하향-조절하는 이중-가닥 짧은 간섭 핵산(siNA) 화합물을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 분자는 약 15 내지 약 49개의 염기쌍들을 포함한다.
하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 핵산은 상기 RhoA 유전자 또는 RhoA 유전자 족의 발현을 억제하는 데 사용될 수 있으며, 여기에서 상기 유전자들 또는 유전자 족 시퀀스들은 시퀀스 동종성을 공유한다. 이러한 동종성 시퀀스들은 당해 기술분야에서 공지된 바와 같이, 예를 들면, 시퀀스 정렬(sequence alignments)을 사용하여 동정될 수 있다. 핵산 분자들은 이러한 동종성 시퀀스들을 표적하도록, 예를 들면, 완전하게 상보적인 시퀀스들을 사용하거나 또는 비-정준적인 염기쌍(non-canonical base pairs)들, 예를 들면, 별도의 표적 시퀀스를 제공할 수 있는 미스매치 및/또는 동요 염기쌍(wobble base pairs)을 포함시키는 것에 의하여 설계될 수 있다. 미스매치가 동정된 경우에 있어서, 비-정준적인 염기쌍들(예를 들면, 미스매치 및/또는 동요 염기들)은 하나 이상의 유전자 시퀀스를 표적하는 핵산 분자들을 생성하는 데 사용될 수 있다. 비-제한적인 실시예에 있어서, UU 및 CC 염기쌍 등과 같인 비-정준적인 염기쌍들이 시퀀스 동종성을 공유하는 다른 RhoA 표적들에 대한 시퀀스들을 표적화할 수 있는 핵산 분자들을 생성하는 데 사용된다. 마찬가지로, 본 출원에서 기술되는 dsRNA들을 사용하는 하나의 잇점은 단일 핵산이 상기 동종성 유전자들 사이에서 보존되는 핵산시퀀스에 대하여 상보적인 핵산 시퀀스를 포함하도록 설계될 수 있다는 것이다. 이러한 접근법에 있어서, 단일 핵산은 서로 다른 유전자들을 표적하는 하나 이상의 핵산 분자를 사용하는 대신에 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다.
핵산 분자들은 RhoA 족 유전자들 등과 같은 유전자 족 또는 유전자 족들에 대응하는 보존된 시퀀스들을 표적하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 다중 RhoA 표적들을 표적하는 핵산 분자들은 증가된 치료학적 효과를 제공할 수 있다. 게다가, 핵산은 다양한 응용예들에서 유전자 기능의 경로들을 특정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자들은 유전자 기능 분석, mRNA 기능 분석 또는 전사 분석에서 경로 내에서의 표적 유전자(들)의 활성을 억제하여 특정되지 않은 유전자(들)의 기능을 결정할 수 있다. 상기 핵산 분자들은 여러 질병들 및 상태들에서 연루되는 잠재적인 표적 유전자 경로들을 결정하여 약제학적 개발 쪽으로 사용될 수 있다. 상기 핵산 분자들은 신경퇴행성 장애들 등과 같은 중추신경계 장애들 및/또는 염증성 질병들, 장애들 및/또는 상태들에 연루되는 유전자 발현의 경로들을 이해하는 데 사용될 수 있다.
하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 화합물들, 조성물들 및 방법들은 상기 RhoA 폴리펩티드를 억제하고, 그에 의하여 상기 억제가 기능의 억제(이는 그 중에서도 천연의 유전자/폴리펩티드의 공지의 교류자(interactor)와의 효소적 측정법(enzymatic assay) 또는 결합측정법(binding assay)에 의하여 검사될 수 있음), 단백질의 억제(이는 그 중에서도 웨스턴 블럿팅(Western blotting), 효소결합면역흡착분석법(ELISA) 또는 면역침강법(immuno-precipitation)에 의하여 검사될 수 있음) 및 mRNA 발현의 억제(이는 그 중에서도 노던블럿팅(Northern blotting), 정량적 역전사-중합효소연쇄반응(quantitative RT-PCR), 원위치 교잡화(in-situ hybridisation) 또는 마이크로어레이 교잡화(microarray hybridisation)에 의해 검사될 수 있음)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
하나의 구체예에 있어서, 본 출원에서 제공되는 상기 조성물들 및 방법들은 RhoA RNA에 대하여 RNAi 활성을 갖는 핵산 분자를 포함하며, 여기에서 상기 핵산 분자는 시퀀스 동정 번호: 1에서 규정된 시퀀스 등과 같은 RhoA 인코딩 시퀀스를 갖는 임의의 RNA에 대하여 상보적인 시퀀스를 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 핵산 분자는 RhoA RNA에 대하여 RNAi 활성을 가질 수 있으며, 여기에서 상기 핵산 분자는 변종 RhoA 인코딩 시퀀스, 예를 들면, 시퀀스 동정 번호: 1에서 나타나지 않으나 그러나 당해 기술분야에서 신경퇴화 및/또는 신경병증의 발병 및/또는 유지 및/또는 발달과 연관되는 것으로 알려진 다른 돌연변이 RhoA 유전자들, 예를 들면, 단일 핵산 다형체를 갖는 RNA에 대하여 상보적인 시퀀스를 포함한다. 본 출원에서 기술되는 임의의 핵산 구조물에 본 출원에서 기술되는 바와 같은 화학적 변성들이 적용될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 본 출원에서 기술되는 핵산 분자는 RhoA 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스와 상호작용할 수 있으며, 그에 의하여, 예를 들면, RhoA 유전자 발현을 하향-조절 또는 침묵화를 매개할 수 있는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하며, 여기에서 상기 핵산 분자는 상기 RhoA 유전자의 염색질구조(chromatin structure) 또는 메틸화 패턴(methylation patterns)을 조절하는 세포과정에 의하여 RhoA 유전자 발현의 조절을 매개하고 그리고 상기 RhoA 유전자의 전사를 방지한다.
별도의 구체예들에 있어서, 본 발명은 RhoA의 상승된 수준에 의하여 수반되는 질병으로 고통받는 대상체를 치료하는 방법들을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에 본 발명의 화합물을 치료학적으로 유효한 투여량으로 투여하고 그에 의하여 상기 대상체를 치료하는 것을 포함한다.
특히, 본 발명은 하나의 가닥이 5'로부터 3'까지 표 1, 2, 3 및 4에서 정의된 상기 화합물들 또는 그의 동족체를 갖는 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 상기 리보뉴클레오티드의 2개까지에서 각각에서 말단영역이 변형된 올리고리보뉴클레오티드를 제공한다.
핵산 분자들 및 약제학적 제형들의 전달
본 발명의 핵산 분자들은 담체 또는 희석제(diluent)와 함께 제조된 원래 상태의 분자들의 직접적인 투여에 의하여 표적 조직에 전달될 수 있다.
"원래 상태의 핵산(naked nucleic acid)" 또는 "원래 상태의 dsRNA" 또는 "원래 상태의 siRNA"는 바이러스 시퀀스(viral sequences), 바이러스 입자(viral particles), 리포좀 제형(liposome formulations), 리포펙틴(lipofectin) 또는 침강제(precipitating agents) 등을 포함하여 세포 내로의 진입을 보조하거나(assist), 촉진하거나(promote) 또는 용이하게 하는(facilitate) 작용을 하는 임의의 전달 비히클(delivery vehicle)로부터 유리된 핵산 분자들을 의미한다. 예를 들면, 인산염완충염수(PBS) 내의 dsRNA는 "원래 상태의 dsRNA"이다.
핵산 분자들은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 중추신경계 장애들(예를 들면, 신경퇴행성, 눈, 귀) 질병들, 특징들, 상태들 및/또는 장애들 및/또는 세포 또는 조직 내에서 RhoA의 수준들에 연관되거나 도는 그에 반응하는 임의의 다른 특징, 질병, 장애 또는 상태를 예방하거나 또는 치료하는 용도로 적용될 수 있다.
본 출원에서 기술되는 핵산 분자들은 담체 또는 희석제와 함께 그러나 바이러스 벡터(viral vectors), 바이러스 입자, 리포좀 제형, 리포펙틴 또는 침강제 등을 포함하여 세포 내로의 진입을 보조하거나, 촉진하거나 또는 용이하게 하는 작용을 하는 임의의 전달 비히클 없이 직접적으로 전달되거나 또는 투여될 수 있다.
핵산 분자는 리포좀(liposomes)을 포함하여 대상체에의 투여를 위한 전달 비히클, 담체들 및 희석제들 및 이들의 염들을 포함할 수 있거나 및/또는 약제학적으로 수용가능한제형들 내에 제공될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 dsRNA 분자들은 리포좀 제형들 및 리포펙틴 제형들 등 내에서 전달될 수 있으며 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 잘 알려진 방법들에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 방법들은, 예를 들면, 미합중국 특허 제5,593,972호, 동 제5,589,466호 및 동 제5,580,859호들에서 기술되며, 이들은 본 출원에 참조로 포함된다.
향상되고 그리고 개선된 siRNA의 포유동물 세포들 내로의 전달을 특별히 목표로 하는 전달 시스템(delivery systems)들이 개발되었다(예를 들면, 문헌 Shen et al, FEBS Let. 2003, 539: 111-114; Xia et al, Nat. Biotech. 2002, 20: 1006-1010; Reich et al, Mol. Vision 2003, 9: 210-216; Sorensen et al, J. Mol. Biol. 2003. 327: 761-766; Lewis et al, Nat. Gen. 2002, 32: 107-108 및 Simeoni et al, NAR 2003, 31,11 : 2717-2724을 참조하시오). siRNA는 영장류(primates)에서 유전자 발현의 억제를 위하여 최근 성공적으로 사용되었다(예를 들면, 문헌 Tolentino et al, Retina 24(4):660을 참조하시오).
소정의 대상체 내로의 핵산의 도입을 용이하게 하는 폴리펩티드들이 당해 기술분야에서 예를 들면 미합중국 공개특허 제20070155658호에서 기술된 것(예를 들면, 2,4,6-트리구아니디노트라이진(2,4,6-Triguanidino Traizine) 및 2,4,6-트라미도사르코실멜라민(2,4,6-Tramidosarcocyl Melamine) 등과 같은 멜라민 유도체, 폴리아르기닌 폴리펩티드(polyarginine polypeptide) 및 교호하는 글루타민과 아스파라긴 잔기들을 포함하는 폴리펩티드) 등과 같이 공지되었다.
이식물 담체들(implant carriers)과 마찬가지로 약제학적으로 수용가능한 담체들, 용매들, 희석제들, 부형제들(excipients), 보조제들(adjuvants) 및 비히클들은 일반적으로 본 발명의 활성성분들과 반응하지 않는 비활성, 비-독성의 고체 또는 액체 충진제들(fillers), 희석제들 또는 캡슐화 물질(encapsulating material)들을 의미하며, 이들에는 리포좀들 및 미세소구(microspheres)들이 포함된다. 본 발명에서 유용한 전달 시스템들의 예들에는 미합중국 특허 제5,225,182호; 동 제5,169,383호; 동 제5,167,616호; 동 제4,959,217호; 동 제4,925,678호; 동 제4,487,603호; 동 제4,486,194호; 동 제4,447,233호; 동 제4,447,224호; 동 제4,439,196호; 및 동 제4,475,196호들이 포함된다. 많은 다른 이러한 이식물들, 전달 시스템들 및 모듈(modules)들이 당해 기술분야에서 숙련된자들에게는 잘 알려져 있다.
핵산 분자들을 전달하는 방법들이 문헌 Akhtar et al., Trends Cell Bio., 2: 139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, (1995), Maurer et al, Mol. Membr. Biol, 16: 129-140 (1999); Hofiand and Huang, Handb. Exp. Pharmacol, 137: 165-192 (1999); 및 Lee et al, ACS Symp. Ser., 752: 184-192 (2000); 미합중국 특허 제6,395,713호; 동 제6,235,310호; 동 제5,225,182호; 동 제5,169,383호; 동 제5,167,616호; 동 제4,959217호; 동 제4.925,678호; 동 제4,487,603호; 및 동 제4,486,194호 및 Sullivan et al, PCT WO 94/02595; PCT WO 00/03683 및 PCT WO 02/08754; 및 미합중국 공개특허 제2003077829호에 기술되어 있다. 이들 프로토콜(protocols)들은 실제로 임의의 핵산 분자의 전달에 활용될 수 있다. 이온영동법(iontophoresis)에 의하거나 또는 생분해성 중합체들, 하이드로겔(hydrogels), 사이클로덱스트린(cyclodextrins ; 예를 들면, 문헌 Gonzalez et al, Bioconjugate Chem., 10: 1068-1074 (1999); 왕 등(Wang et al)의 국제특허 공개 제WO 03/47518호 및 동 제WO 03/46185호를 참조하시오), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic)acid ; PLGA) 및 PLCA 미세소구(예를 들면, 미합중국 특허 제6,447,796호 및 미합중국 공개특허 제2002130430호를 참조하시오), 생분해성 나노캡슐(biodegradable nanocapsules) 및 생접착성 미세소구(bioadhesive microspheres) 등과 같은 다른 비히클들 내로의 도입(incorporation)에 의하거나 또는 단백성 벡터(proteinaceous vectors ; 오헤어와 노르망드(O'Hare and Normand)의 국제특허공개 제WO 00/53722호)에 의한 리포좀 내의 캡슐화(encapsulation)를 포함하나, 이들에 제한되지 않는, 당해 기술분야에서 숙련된자들에게 공지된 다양한 방법들에 의하여 핵산 분자들을 세포들 내로 투여할 수 있다. 달리, 상기 핵산/비히클 조합은 직접적인 주사에 의하거나 또는 주입 펌프(infusion pump)의 사용에 의하여 국소적으로 전달된다. 안내(intravitreal), 피하(subcutaneous), 경고실(transtympanic), 근육내(intramuscular) 또는 피내(intradermal)를 불문하고, 본 발명의 상기 핵산 분자들의 직접적인 주사는 표준 바늘 및 주사기 방법론을 사용하거나 또는 문헌 Corny et al, Clin. Cancer Res., 5: 2330-2337 (1999) 및 배리 등(Barry et al)의 국제특허공개 제WO 99/31262호에서 기술된 것 등과 같은 무-바늘 기술에 의하여 수행할 수 있다. 본 발명의 상기 분자들은 약제학적 시약으로서 사용될 수 있다. 약제학적 시약들은 대상체 내의 질병 상태의 증후군을 어느 정도까지(바람직하게는 상기 증후군들의 전부) 예방하거나, 발생을 조절하거나 또는 치료하거나 또는 완화시킨다. 본 발명의 하나의 특정한 구체예에 있어서, 국소 및 경피제형들이 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 dsRNA들 또는 약제학적 조성물들은 개개 대상체의 임상적인 상태, 치료되어야 할 질병, 투여의 장소 및 방법, 투여 계획, 환자 나이, 성별, 체중 및 의사(medical practitioners)들에게 공지된 다른 인자들을 고려하여 양호한 의료행위(medical practice)에 따라 투여되고 그리고 투여량이 조절된다.
다른 구체예에 있어서, 상기 투여에는 점안액, 점이액(ear drops) 또는 연고를 통하는 것과 같은 국소적 또는 국부적 적용이 포함된다. 비-제한적인 예들에 있어서, RhoA를 표적하는 dsRNA 화합물들은 신경 망막(neural retina)에의 손상으로 고통받는 대상체를 치료하는 데 유용하며, 여기에서 상기 dsRNA 화합물들은 국소적 전달(예를 들면, 점안액, 점이액 또는 연고)을 통하여 눈에 전달된다. 비-제한적인 예에 있어서, RhoA를 표적하는 dsRNA 화합물들은 망막 신경절 세포(RGC) 손실로 고통받는 대상체를 치료하는 데 유용하며, 여기에서 상기 dsRNA 화합물들은 국소적 전달(예를 들면, 점안액, 점이액 또는 연고)을 통하여 눈에 전달된다. 비-제한적인 예에 있어서, RhoA를 표적하는 dsRNA 화합물들은 녹내장으로 고통받는 대상체를 치료하는 데 유용하며, 여기에서 상기 dsRNA 화합물들은 국소적 전달(예를 들면, 점안액, 점이액 또는 연고)을 통하여 눈에 전달된다.
핵산 분자들은 양이온성 지질들로 복합체화될 수 있거나, 리포좀 내에 패키지화될 수 있거나(packaged) 또는 달리 표적 세포들 또는 조직들에로 전달될 수 있다. 상기 핵산 또는 핵산 복합체들은 생체외 또는 생체 내에서 생체고분자 내로의 이들의 도입 또는 도입 없이 직접적인 피부 적용(dermal application), 경피 적용(transdermal application) 또는 주사를 통하여 연관된 조직들에 국부적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 핵산 분자들은 본 출원에서 표 1 내지 4에 나타난 시퀀스들을 포함할 수 있다. 이러한 핵산 분자들의 예들은 표 1 내지 4에 제공된 시퀀스들로 필수적으로 구성된다.
전달 시스템들에는 폴리(에틸렌글리콜) 지질(poly (ethylene glycol) lipids)을 포함하는 표면-변성 리포좀(surface-modified liposomes ; PEG-변성(PEG-modified)되거나 또는 장기-순환 리포좀(long-circulating liposomes) 또는 스텔스 리포좀(stealth liposomes))이 포함될 수 있다. 이들 제형들은 표적 조직들 내에서의 약물의 축적을 증가시키는 방법을 제공한다. 약물 담체들의 이러한 부류는 단핵구 식세포계(mononuclear phagocytic system ; MPS 또는 RES)에 의한 옵소닌화(opsonization) 및 제거(elimination)에 저항하고, 그에 의하여 상기 캡슐화된 약물에 대한 보다 긴 혈액 순환 시간 및 증가된 조직 노출을 가능하게 한다(문헌 Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al, Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011 참조).
핵산 분자들은 예를 들면 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토사민(PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N-아세틸갈락토사민(PEI-PEG-triGAL) 유도체, 이들의 갈락토스 PEI, 콜레스테롤 PEI, 항체 유도 PEI 및 폴리에틸렌글리콜 PEI(PEG-PEI) 유도체 등과 같은 분지된 PEI들로 제형화되거나 또는 복합체화될 수 있다(예를 들면, 문헌 Ogris et al., 2001, AAPA PharmSci, 3, 1-11; Furgeson et al, 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847; Kunath et al., 2002, Pharmaceutical Research, 19, 810-817; Choi et al., 2001, Bull. Korean Chem. Soc, 22, 46-52; Bettinger et al, 1999, Bioconjugate Chem., 10, 558-561; Peterson et al, 2002, Bioconjugate Chem., 13, 845-854; Erbacher et al, 1999, Journal of Gene Medicine Preprint, 1, 1-18; Godbey et al, 1999., PNAS USA, 96, 5177-5181; Godbey et al, 1999, Journal of Controlled Release, 60, 149-160; Diebold et al, 1999, Journal of Biological Chemistry, 274, 19087-19094; Thomas and Klibanov, 2002, PNAS USA, 99, 14640-14645; 사가라(Sagara)의 미합중국 특허 제6,586,524호 및 미합중국 공개특허 제20030077829호를 참조하시오).
핵산 분자들은 미합중국 공개특허 제20010007666호에서 기술된 것과 같은 막파괴제(membrane disruptive agents)와 함께 복합체화 될 수 있다. 상기 막파괴제 또는 막파괴제들 및 상기 핵산 분자는 또한 미합중국 특허 제6,235,310호에 기술된 지질 등과 같은 양이온성 지질 또는 헬퍼 지질 분자(helper lipid molecule)와 함께 복합체화 될 수 있다.
본 출원에서 기술되는 핵산 분자들은 중추신경계(CNS) 또는 말초신경계(PNS)에 투여될 수 있다. 뉴런들에 의한 핵산들의 생체 내 효율적인 흡수(uptake)가 실험들로 입증되었다. 예를 들면, 문헌 Sommer et al, 1998, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 8, 75; Epa et al, 2000, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 10, 469; Broaddus et al, 1998, J. Neurosurg., 88(4), 734; Karle et al, 1997, Eur. J. Pharmocol., 340(2/3), 153; Bannai et al, 1998, Brain Research, 784(1,2), 304; Rajakumar et al, 1997, Synapse, 26(3), 199; Wu-pong et al, 1999, BioPharm, 12(1), 32; Bannai et al, 1998, Brain Res. Protoc, 3(1), 83; 및 Simantov et al, 1996, Neuroscience, 74(1), 39을 참조하시오. 따라서, 핵산 분자들은 중추신경계 및/또는 말초신경계 내의 세포들, 예를 들면, 뉴런들, 마크로파지들, 백질 축삭들(white matter axons) 및 내피세포들에로 전달되고 그리고 흡수될 수 있다.
중추신경계로의 핵산 분자들의 전달은 다양한 서로 다른 전략들에 의하여 제공된다. 사용될 수 있는 중추신경계 전달에 대한 전통적인 접근법에는 척수강내 및 뇌혈관내(intracerebroventricular) 투여, 카테터 및 펌프의 이식, 손상의 자리 또는 병소에의 직접적인 주사 또는 관류, 뇌동맥계 내로의 주사 또는 혈액-뇌 장벽의 화학적 또는 삼투적 개방들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 중추신경계로의 핵산 분자들의 전달의 비외과적인 방법(noninvasive methods)들이 또한 공지되어 있으며, 예를 들면, 코를 통하거나(경비적), 눈(예를 들면, 점안액) 또는 귀(예를 들면, 점이액) 투여들이 포함된다. 외과적 및 비-와과적 투여방법들의 조합이 또한 사용될 수 있다. 다른 접근법들에는 여러 수송 및 담체 시스템들의 사용, 예를 들면, 공액물(conjugates) 및 생분해성 중합체들의 사용이 포함될 수 있다. 더욱이, 예를 들면, 문헌 카플리트 등(Kaplitt et al)의 미합중국 특허 제6,180,613호 및 데이비슨(Davidson)의 국제공개특허 제WO 04/013280호에서 기술된 바와 같은 유전자요법 접근법(gene therapy approaches)이 중추신경계 내에서 핵산 분자들을 발현시키는 데 사용될 수 있다.
전달 시스템들에는 예를 들면 수성 및 비수성 겔(aqueous and nonaqueous gels), 크림(creams), 다중 에멀젼(multiple emulsions), 마이크로에멀젼(microemulsions), 리포좀(liposomes), 연고(ointments), 수성 및 비수성 용액, 로션(lotions), 에어로졸(aerosols), 탄화수소 베이스(hydrocarbon bases) 및 분말들이 포함될 수 있으며, 가용화제(solubilizers), 투과증진제(permeation enhancers ; 예를 들면, 지방산, 지방산에스테르, 지방알코올 및 아미노산) 및 친수성 중합체(예를 들면, 폴리카르보필(polycarbophil) 및 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone)) 등과 같은 부형제들을 포함할 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 상기 약제학적으로 수용가능한 담체는 리포좀 또는 경피증강제(transdermal enhancer)이다. 본 발명의 상기 화합물들과 함께 사용될 수 있는 리포좀들의 비-제한적인 예들에는 하기의 것들이 포함된다: (1) 셀펙틴(CellFectin), 양이온성 지질 N,NI,NII,NIII-테트라메틸-N,NI,NII,NIII-테트라팔미트-y-스페르민(N,NI,NII,NIII-tetramethyl-N,NI,NII,NIII-tetrapalmit-y-spermine)과 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine ; DOPE)(기브코 비알엘사(GIBCO BRL)의 1 : 1.5(M/M) 리포좀 제형); (2) 사이토펙틴(Cytofectin) GSV, 양이온성 지질과 DOPE(글렌리서치사(Glen Research)의 2 : 1(M/M) 리포좀 제형); (3) DOTAP(N-[1-(2,3-디올레오일옥시)-N,N,N-트리-메틸-암모늄메틸설페이트)(베링거만하임사(Boehringer Manheim)); 및 (4) 리포펙타민(Lipofectamine), 다가양이온성 지질 DOSPA, 중성 지질 DOPE(기브코 비알엘사)와 디-알킬화 아미노산(Di-Alkylated Amino Acid ; DiLA2)의 3 : 1(M/M) 리포좀 제형.
전달 시스템들에는 패치(patches), 정제(tablets), 좌약(suppositories), 페서리(pessaries), 겔(gels), 수성 및 비수성 용액, 로션 및 크림들이 포함될 수 있고, 그리고 가용화제 및 강화제(예를 들면, 프로필렌글리콜, 담즙산염(bile salts) 및 아미노산) 및 다른 비히클(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤, 지방산에스테르 및 유도체 및 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 및 히알루론산 등과 같은 친수성 중합체) 등과 같은 부형제들을 포함할 수 있다.
핵산 분자들에는 생체공액화물(bioconjugate), 예를 들면, 문헌 바기스 등(Vargeese et al)의 미합중국 특허출원 제10/427,160호; 미합중국 특허 제6,528,631호; 동 제6,335,434호; 동 제6,235,886호; 동 제6,153,737호; 동 제5,214,136호; 동 제5,138,045호에서 기술된 바와 같은 핵산 공액화물이 포함될 수 있다.
본 출원에서 기술되는 조성물들, 방법들 및 킷트들에는 핵산 분자의 발현을 허용하는 방법으로 본 발명의 적어도 하나의 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 시퀀스를 포함하는 발현 벡터(expression vector)가 포함될 수 있다. 세포의 환경 내로의 핵산 분자들 또는 dsRNA의 가닥들을 발현할 수 있는 하나 또는 그 이상의 벡터들을 도입하는 방법은 세포의 형태 및 그의 환경의 구성에 의존적일 수 있다. 상기 핵산 분자 또는 벡터 구성물(vector construct)은 세포 내로 직접적으로 도입되거나(즉, 세포 내로); 또는 체강(cavity), 틈새공간(interstitial space) 내로, 유기체의 순환 내로 세포 외로 도입되거나, 경구적으로 도입될 수 있거나 또는 dsRNA를 포함하는 용액 내에의 유기체 또는 세포의 담그기(bathing)에 의하여 도입될 수 있다. 상기 세포는 바람직하게는 포유동물 세포; 보다 바람직하게는 인간 세포이다. 상기 발현 벡터의 상기 핵산 분자는 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함할 수 있다. 상기 안티센스 영역은 RhoA를 인코딩하는 RNA 또는 DNA 시퀀스에 상보적인 시퀀스를 포함할 수 있고, 그리고 상기 센스 영역은 상기 안티센스 영역에 상보적인 시퀀스를 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자는 상보적인 센스 영역 및 안티센스 영역을 갖는 2개의 구별되는 가닥들을 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자는 상보적인 센스 영역 및 안티센스 영역들을 갖는 단일 가닥을 포함할 수 있다.
표적 RNA 분자와 상호작용하고 그리고 표적 RNA 분자들을 인코딩하는 유전자를 하향-조절하는 핵산 분자들(예를 들면, RhoA mRNA, 시퀀스 동정 번호: l)은 DNA 또는 RNA 벡터들 내로 삽입된 전사단위들(transcription units)로부터 발현될 수 있다. 재조합 벡터들은 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 될 수 있다. 바이러스 벡터를 발현하는 핵산 분자는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 알파바이러스(alphavirus)들에 기초하여 구축될 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다.상기 핵산 분자들을 발현할 수 있는 상기 재조합 벡터들은 본 출원에서 기술되는 바와 같이 유도될 수 있으며, 표적 세포들 내에서 존속할 수 있다. 달리, 핵산 분자들의 일시적인 발현을 제공하는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터들은 필요에 따라 반복적으로 투여될 수 있다. 일단 발현되면, 상기 핵산 분자들은 결합하고 그리고 예를 들면 RNA 간섭(RNAi)을 통하여 유전자 기능 또는 발현을 하향-조절한다. 핵산 분자 발현 벡터들의 전달은 정맥 내 또는 근육 내 투여에 의하거나, 국부적 투여에 의하거나, 대상체로부터 체외-이식된(ex-planted) 표적 세포들에로 투여 후 상기 대상체 내로 재도입하는 것에 의하거나 또는 소정의 표적 세포 내로의 도입을 허용하는 임의의 다른 수단에 의하는 것과 같은 침투성(systemic)이 될 수 있다.
발현 벡터는 상기 핵산 분자의 발현을 허용하는 방법으로 본 출원에서 기술되는 적어도 하나의 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 시퀀스를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 듀플렉스를 포함하는 핵산 분자의 가닥들 둘 다를 인코딩하는 시퀀스(들)을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 또한 자가-상보적(self-complementary)이고 따라서 핵산 분자를 형성하는 단일 핵산 분자를 인코딩하는 시퀀스(들)을 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터들의 비-제한적인 예들은 문헌 Paul et al, 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee et al, 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; 및 Novina et al, 2002, Nature Medicine, advance online publication doi: 10.1038/nm725에 기술되었다. 발현 벡터는 또한 포유동물(예를 들면, 인간) 세포 내에 포함될 수 있다.
발현 벡터는 둘 또는 그 이상의 핵산 분자들을 인코딩하는 핵산 시퀀스를 포함할 수 있으며, 이는 동일하거나 또는 서로 다를 수 있다. 발현 벡터들은 젠뱅크 수탁번호 NM 001664로 언급되는 핵산 분자에 상보적인 핵산 분자에 대한 시퀀스, 예를 들면, 표 1, 2, 3 및 4에 나타난 것들을 포함할 수 있다.
발현 벡터는 핵산 듀플렉스의 하나 또는 두 가닥들 또는 핵산 듀플렉스로 자가 교잡(self hybridize)하는 단일 자가-상보적 가닥을 인코딩할 수 있다. 핵산 분자를 인코딩하는 상기 핵산 시퀀스는 상기 핵산 분자의 발현을 허용하는 방법으로 작동가능하게 연결될 수 있다(예를 들면, 문헌 Paul et al, 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee et al, 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; 및 Novina et al, 2002, Nature Medicine, advance online publication doi:10.1038/nm725을 참조하시오).
발현 벡터는 하기의 것들 즉, a) 전사 개시 영역(transcription initiation region ; 예를 들면, 진핵 pol I, II 또는 III 개시 영역); b) 전사 종결 영역(transcription termination region ; 예를 들면, 진핵 pol I, II 또는 III 종결 영역); c) 인트론(intron) 및 d) 상기 핵산 분자의 적어도 하나를 인코딩하는 핵산 시퀀스 중의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 시퀀스는 상기 핵산 분자의 발현 및/또는 전달을 허용하는 방법으로 개시 영역(initiation region) 및 종결 영역(termination region)에 작동가능하게 연결된다. 상기 벡터는 선택적으로 단백질에 대하여 상기 핵산 분자를 인코딩하는 상기 시퀀스의 5'-측 또는 3'-측 상에 작동가능하게 연결되는 전사해석틀(open reading frame ; ORF) 및/또는 인트론들(개재 시퀀스(intervening sequences))을 포함할 수 있다.
상기 핵산 분자 시퀀스들의 전사는 진핵 RNA 중합효소 I(pol I), RNA 중합효소 II(pol II) 또는 RNA 중합효소 III(pol III)에 대한 프로모터(promoter)로부터 구동될 수 있다. pol II 또는 pol III 프로모터들로부터의 전사는 모든 세포들 내에서 높은 수준으로 발현되고; 주어진 세포 형태 내의 주어진 pol II 프로모터의 수준들은 근처에 존재하는 유전자 조절 시퀀스(인핸서(enhancers), 사일렌서(silencers) 등)의 속성에 의존적이다. 원핵 RNA 중합효소가 적절한 세포들 내에서 발현된다는 전제 하에, 원핵 RNA 중합효소 프로모터가 또한 사용된다(문헌 Elroy-Stein and Moss, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6743-7; Gao and Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21, 2867-72; Lieber et al, 1993, Methods EnzymoL, 217, 47-66; Zhou et al, 1990, Mol. Cell. Biol, 10, 4529-37 참조). 이러한 프로모터들로부터 발현된 상기 핵산 분자들이 포유동물 세포들 내에서 기능할 수 있다는 것이 여러 조사자들에 의해 증명되었다(예를 들면, 문헌 Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Ojwang et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen et al, 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6340-4; L'Huillier et al, 1992, EMBO J., 11, 4411-8; Lisziewicz et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 90, 8000-4; Thompson et al, 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Sullenger & Cech, 1993, Science, 262, 1566 참조). 특히, U6 소형 핵(U6 small nuclear(snRNA)), 전달 RNA(tRNA) 및 아데노바이러스 VA RNA를 인코딩하는 유전자들로부터 유도된 것들 등과 같은 전사단위들이 세포들 내에서 siNA 등과 같은 높은 농도의 소정의 RNA 분자들을 생성하는 데 유용하다(톰슨 등(Thompson et al)의 상기 문헌; 꾸뚜레 및 스팅크콤(Couture and Stinchcomb)의 1996 상기 문헌; 문헌 Noonberg et al, 1994, Nucleic Acid Res., 22, 2830; 눈버그 등(Noonberg et al)의 미합중국 특허 제5,624,803호; Good et al, 1997, Gene Ther., 4, 45; 바이젤만 등(Beigelman et al)의 국제특허공개 제WO 96/18736호 참조). 상기 핵산 전사유닛들은 포유동물 세포들 내로의 도입을 위하여 플라스미드 DNA 벡터, 바이러스 DNA 벡터(아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스 벡터 등과 같은) 또는 바이러스 RNA 벡터(레트로바이러스 또는 알파바이러스 벡터들 등과 같은) 등을 포함하나, 이들에 제한되지 않는 다양한 벡터들 내로 포함될 수 있다(꾸뚜레 및 스팅크콤의 1996 상기 문헌을 참조하시오).
핵산 분자는 세포들 내에서 진핵 프로모터들로부터 발현될 수 있다(예를 들면, 문헌 Izant and Weintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry and Lindquist, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 399; Scanlon et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5; Kashani-Sabet et al, 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic et al, 1992, J. Virol, 66, 1432-41; Weerasinghe et al, 1991, J. Virol, 65, 5531-4; Ojwang et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen et al, 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver et al, 1990 Science, 247, 1222-1225; Thompson et al, 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Good et al, 1997, Gene Therapy, 4, 45 참조). 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 임의의 핵산이 진핵 세포들 내에서 적절한 DNA/RNA 벡터로부터 발현될 수 있다는 것을 이해하고 있다. 이러한 핵산들의 활성은 효소핵산(enzymatic nucleic acid)에 의한 1차전사물(primary transcript)로부터의 이들의 방출에 의하여 증가될 수 있다(문헌 드레이퍼 등(Draper et al)의 국제특허공개 제WO 93/23569호 및 설리반 등(Sullivan et al)의 국제특허공개 제WO 94/02595호; Ohkawa et al, 1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6; Taira et al, 1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30; Ventura et al, 1993, Nucleic Acids Res., 21, 3249-55; Chowrira et al, 1994, J. Biol. Chem., 269, 25856 참조).
바이러스 입자 내로 패키지화된 바이러스 구조물은 발현 구조물의 상기 세포 내로의 효율적인 도입 및 상기 발현 구조물에 의하여 인코딩된 dsRNA 구조물의 전사 둘 다를 수행할 수 있다.
경구 도입(oral introduction)을 위한 방법들에는 음식으로 사용되는 종이 RNA를 발현하도록 조작되고 계속해서 영향을 받게 될 유기체에 급이하는 유전자조작 접근법(engineered approaches)과 마찬가지로 RNA의 유기체의 음식과의 직접적인 혼합이 포함된다. 핵산 분자 용액을 상기 세포 내로 도입하는 데 물리적인 방법들이 사용될 수 있다. 핵산들을 도입하는 물리적인 방법들에는 상기 핵산 분자를 포함하는 용액의 주사, 상기 핵산 분자로 피복된 입자들에 의한 폭격(bombardment), 상기 RNA의 용액 내에 상기 세포 또는 유기체를 담그는 것(soaking) 또는 상기 핵산 분자의 존재 중에서의 세포막들의 전기천공(electroporation)이 포함된다.
칼슘포스페이트(calcium phosphate) 등과 같은 화학적으로 매개된 전달(chemical mediated transport) 등과 같이 세포들에로 핵산들을 도입하기 위하여 당해 기술분야에서 공지된 다른 방법들이 사용될 수 있다. 따라서 상기 핵산 분자들은 하기의 활성들 즉: 상기 세포에 의한 RNA 흡수의 향상시키거나, 상기 듀플렉스 가닥들의 어닐링(annealing)을 촉진시키거나, 어닐링된 가닥들(annealed strands)을 안정화시키거나 또는 달리 상기 표적 유전자의 억제/하향-조절을 증가시키는 것들 중의 하나 또는 그 이상을 수행하는 성분들과 함께 도입될 수 있다.
중합체 나노캡슐(polymeric nanocapsules) 또는 마이크로캡슐은 상기 세포내로의 dsRNA의 전달 및 캡슐화되거나 또는 결합된 dsRNA의 상기 세포내로의 방출을 용이하게 한다. 이들에는 특히 폴리부틸시아노아크릴레이트(polybutylcyanoacrylate)를 포함하는 중합체 및 단량체 물질들이 포함된다. 물질들 및 제조방법들의 요약이 공개되어 있다(문헌 Kreuter, 1991를 참조하시오). 중합/나노입자 생성 단계에서의 단량체 및/또는 올리고머 전구체(oligomeric precursors)로부터 형성된 상기 중합체 물질들은 그 자체로 당해 기술분야로부터 공지되어 있으며, 마찬가지로 나노입자를 제조하는 분야에서 숙련된 자는 통상의 기술에 따라 상기 중합체 물질의 분자량 및 분자량분포를 적절하게 선택할 수 있다.
핵산 분자들은 마이크로에멀젼(microemulsion)으로 제형화될 수 있다. 마이크로에멀젼은 단일의 광학적으로 등방성이고 열역학적으로 안정한 액체 용액인, 물, 오일 및 양친매성 물질(amphiphile)의 계(system)이다. 전형적으로 마이크로에멀젼은 먼저 오일을 수성 계면활성제 용액 내에 분산시키고, 그리고 계속해서 충분한 양의 4번째 성분, 일반적으로 중간 쇄-길이의 알코올(intermediate chain-length alcohol)을 첨가하여 투명한 계를 형성하는 것에 의하여 제조된다.
마이크로에멀젼의 제조에서 사용될 수 있는 계면활성제들에는 단독으로 또는 공계면활성제(cosurfactants)와 함께 이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 부리지 96(Brij 96), 폴리옥시에틸렌올레일에테르(polyoxyethylene oleyl ethers), 폴리글리세롤지방산에스테르(polyglycerol fatty acid esters), 테트라글리세롤모노라우레이트(tetraglycerol monolaurate ; ML310), 테트라글리세롤모노올레이트(tetraglycerol monooleate ; MO310), 헥사글리세롤모노올레이트(hexaglycerol monooleate ; PO310), 헥사글리세롤펜타올레이트(hexaglycerol pentaoleate ; PO500), 데카글리세롤모노카프레이트(decaglycerol monocaprate ; MCA750), 데카글리세롤모노올레이트(decaglycerol monooleate ; MO750), 데카글리세롤세퀴올레이트(decaglycerol sequioleate ; SO750), 데카글리세롤데카올레이트(decaglycerol decaoleate ; DA0750)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 대개는 에탄올, 1-프로판올 및 1-부탄올 등과 같은 단쇄 알코올(short-chain alcohol)인 상기 공계면활성제는 계면활성제 막 내로 투과하고 그리고 그에 따라 계면활성제 분자들 사이에 생성된 빈 공간(void space)으로 인하여 교란된 막을 형성하는 것에 의하여 계면 유동성(interfacial fluidity)을 증가시키도록 기능한다.
전달 제형들에는 하나 또는 그 이상의 분해가능한 가교화 지질 성분(crosslinking lipid moiety), 하나 또는 그 이상의 PEI 성분 및/또는 하나 또는 그 이상의 mPEG(PEG(메톡시폴리(에틸렌글리콜))의 메틸에테르 유도체)를 포함하는 수용성의 분해가능한 가교화된 중합체들이 포함될 수 있다.
투여량( dosages )
투여되어야 할 유용한 투여량 및 특정한 투여의 방법은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 쉽게 이해될 수 있는 바와 같이, 세포 형태, 또는 생체 내 사용을 위하여는, 연령, 체중 및 치료되어야 할 특정의 동물 및 그의 국부, 특정의 핵산과 사용되는 전달 방법, 고려되는 치료적 또는 진단적 용도 및 제형의 형태, 예를 들면, 현탁액, 에멀젼, 미셀 또는 리포좀 등과 같은 인자들에 따라 변할 수 있다. 전형적으로, 투여량은 낮은 수준에서 투여되고 그리고 원하는 효과가 달성될 때까지 증가된다.
따라서, 본 출원에서 목적하는 "치료적으로 유효한 투여량"은 당해 기술분야에서 공지된 바와 같은 고려사항들에 의하여 결정된다. 상기 투여량은 개선된 생존율 또는 보다 신속한 회복 또는 증후군 및 당해 기술분야에서 숙련된 자들에 의하여 적절하게 측정되는 바와 같은 다른 지표들(indicators)의 개선 또는 제거들을 포함하나 이들에 제한되지 않는 개선을 달성하는 데 유효하여야 한다.
핵산 분자들의 적절한 양들이 도입될 수 있으며, 이들 양들은 표준 방법들을 사용하여 경험적으로 결정될 수 있다. 세포의 환경 내에서의 개개 핵산 분자종들의 유효한 농도는 약 1펨토몰(femtomolar), 약 50펨토몰, 100펨토몰, 1피코몰(picomolar), 1.5피코몰, 2.5피코몰, 5피코몰, 10피코몰, 25피코몰, 50피코몰, 100피코몰, 500피코몰, 1나노몰(nanomolar), 2.5나노몰, 5나노몰, 10나노몰, 25나노몰, 50나노몰, 100나노몰, 500나노몰, 1마이크로몰(micromolar), 2.5마이크로몰, 5마이크로몰, 10마이크로몰, 100마이크로몰 또는 그 이상이 될 수 있다.
일반적으로, 인간에 대한 핵산 화합물의 활성 투여량은 단일 투여량, 1일 당 1회 또는 1일 당 2회 또는 3회 또는 그 이상의 횟수로 1 내지 4주 또는 그 이상의 기간 동안의 투여기준(regimen)으로 1일 당, 수령인(recipient)의 체중 ㎏ 당, 1ng/㎏ 내지 약 20 내지 100㎎/㎏, 바람직하게는 1일 당, 수령인의 체중 ㎏ 당, 0.01㎎ 내지 약 2 내지 10㎎/㎏의 범위 이내이다. 핵산 분자들의 적절한 투여량 단위는 1일 당, 수령인의 체중 ㎏ 당, 0.001 내지 0.25㎎/㎏의 범위 이내, 또는 1일 당, 체중 ㎏ 당, 0.01 내지 20㎍/㎏의 범위 이내, 또는 1일 당, 체중 ㎏ 당, 0.01 내지 10㎍/㎏의 범위 이내, 또는 1일 당, 체중 ㎏ 당, 0.10 내지 5㎍/㎏의 범위 이내, 또는 1일 당, 체중 ㎏ 당, 0.1 내지 2.5㎍/㎏의 범위 이내가 될 수 있다. 투여량은 체중 ㎏ 당, 0.01㎍ 내지 1g(예를 들면, 체중 ㎏ 당, 0.1㎍, 0.25㎍, 0.5㎍, 0.75㎍, 1㎍, 2.5㎍, 5㎍, 10㎍, 25㎍, 50㎍, 100㎍, 250㎍, 500㎍, 1㎎, 2.5㎎, 5㎎, 10㎎, 25㎎, 50㎎, 100㎎, 250㎎ 또는 500㎎)이 될 수 있다.
1일 당, 체중 ㎏ 당, 약 0.1㎎ 내지 약 140㎎의 위계(order)의 투여량 수준들이 상기 표시된 상태들의 치료에서 유용하다(1일 당, 대상체 당 약 0.5㎎ 내지 약 7g). 단일 투여량 형태를 생성하기 위하여 상기 담체 물질과 결합될 수 있는 활성성분의 양은 치료되는 숙주 및 투여의 특정의 방법에 따라 변한다. 투여량 단위 형태들은 일반적으로 약 1㎎ 내지 약 500㎎ 사이의 활성성분을 포함한다.
임의의 특정의 대상체에 대한 특정의 투여량 수준이 사용되는 특정의 화합물의 활성, 연령, 체중, 종합적인 건강, 성별, 식이요법, 투여의 시간, 투여의 경로 및 방출의 속도, 약물 조합 및 치료를 수행하는 특정의 질병의 중증도 등을 포함하여 여러 인자들에 의존적이라는 것은 이해된다.
본 발명의 상기 화합물은 임의의 통상의 투여 경로들에 의하여 투여될 수 있다. 상기 화합물이 화합물로서 또는 약제학적으로 수용가능한 염으로서 투여될 수 있고 그리고 단독으로 또는 약제학적으로 수용가능한 담체들, 용매들, 희석제들, 부형제들, 보조제들 및 비히클들과 함께 활성성분으로서 투여될 수 있다는 것을 주의하여야 한다. 상기 화합물은 경구적으로, 피하적으로 또는 정맥 내, 동맥 내, 근육 내, 복막 내(intraperitoneally), 코 내, 눈 및/또는 귀 투여와 마찬가지로 척추강 내(intrathecal) 및 주입기술을 포함하여 비경구적으로 투여될 수 있다. 상기 화합물의 이식물들이 또한 유용하다. 액체 형태들이 주사를 위하여 제조될 수 있으며, 이 용어는 피하, 경피, 정맥 내, 근육 내, 척추강 내, 경고실 주사 및 다른 비경구적 투여의 경로들을 포함한다. 상기 액체 조성물들에는 유기 공-용매들과 함께 또는 이들이 없는 수성 용액, 수성 또는 유성 현탁액, 식용유(edible oils)로의 에멀젼과 마찬가지로 유사한 약제학적 비히클들이 포함된다. 하나의 구체예에 있어서, 상기 투여는 정맥 내 투여를 포함한다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 투여에는 국소적 투여, 특히 이도(ear canal)에의 국소적 투여, 고막에의 국소적 투여, 눈에의 국소적 투여 또는 이들의 조합들이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원의 상기 화합물은 점이액으로서 상기 고막에 적용된다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원의 상기 화합물은 점안액으로서 눈에 적용된다. 일부 바람직한 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 dsRNA 분자는 경고막 주사에 의하거나 또는 점이액에 의하여 투여된다. 다른 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 dsRNA 분자는 경막(epidural) 또는 척추강 투여에 의하여 투여된다.
본 출원에서 기술되는 상기 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 1일 1회(QD), 1일 2회(bid), 1일 3회(tid), 1일 4회(qid) 또는 의학적으로 적절한 임의의 기간 동안 임의의 간격으로 투여될 수 있다. 그러나, 치료제(therapeutic agent)는 또한 1일에 걸쳐 적절한 시간 간격들에서 투여되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 부-용량(sub-doses)들을 포함하는 투여량 단위들로 투여될 수 있다. 이 경우에 있어서, 각 부-용량 내에 포함되는 상기 핵산 분자는 총 1일 투여량 단위를 달성하도록 대응되게 적은 양이 될 수 있다. 상기 투여량 단위는 또한 예를 들면 수 일의 기간에 걸쳐 상기 dsRNA의 지연되고 그리고 지속되는 방출을 제공하는 통상의 지연방출 제형(sustained release formulation)을 사용하여 수 일에 걸쳐 단일의 투여량으로 조성될 수 있다. 지연방출 제형들은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 상기 투여량 단위는 상기 1일 투여량의 대응하는 배량을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 핵산의 다중의 단위들의 총합이 충분한 투여량을 포함하도록 하는 방법으로 조성될 수 있다.
약제학적 조성물, 킷트 및 용기
환자에게 상기 핵산 분자를 투여하거나 또는 분배하기 위한, RhoA의 발현을 하향-조절하기 위한, 본 출원에서 제공되는 것과 같은 핵산 분자(예를 들면 siNA 분자)를 포함하는 조성물, 킷트, 용기 및 제형들이 또한 제공된다. 킷트는 적어도 하나의 용기(container) 및 적어도 하나의 표지(label)를 포함할 수 있다. 적절한 용기들에는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기 및 시험관들이 포함된다. 상기 용기들은 유리, 금속 또는 합성수지 등과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 상기 용기는 아미노산 시퀀스(들), 작은 분자(들), 핵산 시퀀스(들), 세포 모집단(들) 및/또는 항체(들) 및/또는 연관된 실험, 예측, 진단, 예방 및 치료를 목적을 위하여 요구되는 임의의 다른 구성요소를 보유할 수 있다. 이러한 용도들을 위한 용법들(indications) 및 안내들(directions)이 이러한 용기 상에 또는 그 안에 포함될 수 있으며, 마찬가지로 이들 목적들을 위하여 사용되는 시약들, 다른 조성물들 또는 도구들이 포함될 수 있다.
상기 용기는 달리 상태를 치료, 진단, 예측 또는 예방하기에 유효한 조성물을 보유할 수 있으며, 또한 멸균진입구(sterile access port ; 예를 들면, 상기 용기는 피하주사바늘(hypodermic injection needle)에 의하여 천공될 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥 내로 들어가는 용액을 담은 백(intravenous solution bag) 또는 바이알이 될 수 있음)를 가질 수 있다. 상기 조성물 내의 활성제(active agents)는 RhoA mRNA를 특이적으로 결합하거나 및/또는 RhoA의 기능을 하향-조절할 수 있는 핵산 분자가 될 수 있다.
킷트는 인산염-완충 염수(phosphate-buffered saline), 링거액(Ringer's solution) 및/또는 덱스트로스 용액 등과 같은 약제학적으로 수용가능한 완충제를 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 교반기, 바늘, 주사기 및/또는 용법 및/또는 사용을 위한 지시사항들(instructions)을 수반하는 포장 삽입물을 포함하여 상용적이고 그리고 사용자 관점에서 바라는 다른 물질들을 더 포함할 수 있다.
인간의 치료에서의 약제학적 조성물의 사용은 연방정부의 정부기관(agency)의 승인을 받을 것을 요구하고 있다. 미합중국에서는, 시행은 미국 식품의약국(Food and Drug Administration)의 책임이며, 미국 식품의약국은 이러한 승인을 확고히 하는 적절한 법령들을 상세하게는 21 U.S.C. § 301-392에 공표하고 있다. 동물의 조직으로부터 제조되는 제품을 포함하여 생물학적 물질에 대한 법령은 42 U.S.C. § 262 하에 나타나 있다. 대부분의 외국에 의해서도 유사한 승인이 요구되고 있다. 법령들은 나라마다 다르기는 하나, 그러나 개개 절차들은 당해 기술분야에 속하는 자에게는 잘 알려져 있으며, 따라서 본 출원에서 제공되는 상기 조성물 및 방법은 바람직하게는 만족한다.
본 출원에서 기술되는 상기 핵산 분자는 단독으로 또는 다른 치료법들과 함께 중추신경계, 말초신경계, 전정감각계, 시각계 및/또는 순환계(정맥, 동맥) 내에서의 질병, 상태 또는 병적 측면 등과 같이 RhoA 연관 질병, 상태 또는 장애 및 세포 또는 조직 내에서의 RhoA의 수준에 연관되거나 또는 반응할 수 있는 임의의 다른 질병 또는 상태(예를 들면, 비정상적인 및/또는 혼란된 세포 운동성, 세포 골격 조절 및/또는 미세소관 조직과 연관된 질병 또는 장애)를 치료하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 본 출원에서 기술되는 조성물, 킷트 및 방법들은 표지 또는 포장 삽입물을 포함하는, 본 출원에서 기술되는 핵산 분자 포장(packaging)을 포함할 수 있다. 상기 표지는 척수 손상(SCI), 녹내장, 비동맥전방허혈성시신경증, 알쯔하이머병, 메니에르병 및 본 출원에서 기술되는 임의의 다른 질병 또는 상태를 포함하나 이들에 제한되지 않는 중추신경계(CNS), 말초신경계(PNS), 시각계, 순환(정맥, 동맥)계 또는 전정감각계의 질병, 장애, 손상 및 상태들을 치료 또는 예방하기 위한 용도 등과 같은 상기 핵산 분자의 용도에 대한 용례를 포함할 수 있다. 상기 표지는 신경퇴화의 치료 또는 예방 또는 완화를 위한 용도 등과 같은 상기 핵산 분자의 용도에 대한 지침들을 포함할 수 있다. 신경퇴화에는 예를 들면 망막 신경절 세포를 포함하는 시신경 및 망막; 청신경(또한 전정와우신경 또는 내이신경이라고도 알려져 있으며, 내이로부터 뇌로의 소리 및 평형정보의 전달을 담당함); 이는 와우신경과 전정신경으로 이루어지고, 연수로부터 돌출되고 그리고 안면 신경을 따라 측두골 내의 속귀길(또는 내이도)을 통하여 두개골 내로 들어가며, 상기 청신경을 통하여 뇌로 정보를 전달하는 상기 내이의 모세포의 퇴화가 포함된다. 상기 표지는 악성종양 또는 암의 치료 또는 예방을 위한 용도 등과 같은 상기 핵산 분자의 용도에 대한 지침들을 포함할 수 있다. 상기 표지는 단독으로 또는 다른 치료법들과 함께 RhoA의 수준에 연관되거나 또는 반응할 수 있는 임의의 다른 질병 또는 상태들의 치료 또는 예방을 위한 용도 등과 같은 상기 핵산 분자의 용도에 대한 지침들을 포함할 수 있다. 표지는 RhoA의 발현을 감소 및/또는 하향-조절하는 용도에 대한 지침을 포함할 수 있다. "포장 삽입물(package insert)"은 용례, 용법, 투여량, 투여방법, 사용금지사유(contraindications), 포장된 제품과 결합되어야 하는 다른 치료제품들 및/또는 이러한 치료제품들의 사용에 관한 경고들(warnings) 등에 대한 정보를 포함하는 치료제품들의 상용적인 포장들에 통상적으로 포함되는 지침들을 의미하는 것으로 사용된다.
당해 기술분야에서 숙련된 자들은 당해 기술분야에서 공지된 다른 치료, 약물 및 요법들(therapies)이 본 출원의 상기 핵산 분자들(예를 들면, dsNA 분자들)과 쉽게 결합될 수 있으며, 따라서 본 출원에서 고려될 수 있음을 인식할 수 있을 것이다.
치료의 방법들
다른 관점에 있어서, 본 출원은 대상체에 RhoA의 발현을 감소시키거나 또는 억제하는 양의 억제제를 투여하는 것을 포함하는, RhoA의 비정상적인 발현과 연관되는 질병 또는 장애에 대하여 치료를 필요로 하는 대상체의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.
RhoA는 세포골격의 조절 및 그에 따라 예를 들어 세포 운동성, 침습, 증식을 포함하여 세포골격 재구성과 연관되는 모든 과정들에 관여하는 구아노신트리포스페이트 분해효소이다. 그의 신경퇴화에 대한 연관은 직접적으로 이들 특성들에 기인한다.
하나의 구체예에 있어서, 핵산분자들은 질병 또는 상태(예를 들면, 신경퇴화)와 연관된 RhoA 및/또는 RhoA 단상형 다형체들(RhoA haplotype polymorphisms)로부터 일어나는 RhoA 및/또는 RhoA 단백질의 발현을 하향 조절하거나 또는 억제하는 데 사용될 수 있다. RhoA 및/또는 RhoA 유전자 또는 RhoA 및/또는 RhoA 단백질 또는 RNA 수준들의 분석은 이러한 다형체들을 갖는 대상체들 또는 본 출원에서 기술되는 특징들, 상태들 또는 질병들로 발전하는 위험이 있는 이들 대상체들을 동정하는 데 사용될 수 있다. 이들 대상체들은 본 출원에서 기술되는 핵산 분자들 및 RhoA 및/또는 RhoA 유전자 발현과 연관된 질병들의 치료에 유용한 임의의 다른 조성물로의 치료로 치료될 수 있다. 마찬가지로, RhoA 및/또는 RhoA 단백질 또는 RNA 수준들의 분석은 대상체의 치료에서 치료의 형태 및 치료법의 과정을 결정하는 데 사용될 수 있다. RhoA 및/또는 RhoA 단백질 또는 RNA 수준들의 모니터링(monitoring)은 치료 결과를 예측하고 그리고 특징, 상태 또는 질병과 연관되는 특정의 RhoA 및/또는 RhoA 단백질들의 수준 및/또는 활성을 조절하는 화합물들 및 조성물들의 효능(efficacy)을 결정하는 데 사용될 수 있다.
RhoA 유전자 발현을 하향-조절하거나 또는 RhoA 유전자 발현에 대한 RNA 간섭을 매개할 수 있는 짧은 간섭 핵산(siNA), 간섭 RNA(RNAi), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(miRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 분자들 등과 같이 본 출원에서 기술되는 바와 같은 작은 핵산 분자들을 사용하는 것에 의하여 RhoA 발현을 억제하는 조성물들 및 방법들이 제공된다. 본 출원에서 기술되는 상기 조성물 및 방법들은 또한 예를 들어 중추신경계, 말초신경계 및 전정감각계 장애들, 질병 및 손상, 눈의 장애, 메니에르병 및 통증 등과 같은 여러 상태들 또는 질병들을 치료하는 데 유용하다.
본 출원에서 기술되는 상기 핵산 분자들은 개별적으로 또는 다른 약물들과 함께 또는 결합하여 본 출원에서 기술되는 질병, 장애 및 손상 등과 같이 RhoA와 연관된 질병, 특징, 상태 및/또는 장애를 예방하거나 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 출원에서 기술되는 상기 핵산 분자들은 시퀀스 특이적인 방법(sequence specific manner)으로 RhoA의 발현을 하향-조절할 수 있다. 상기 핵산 분자들은 RhoA mRNA의 일부에 대하여 적어도 부분적으로 상보적인(안티센스) 인접하는 뉴클레오티드들을 포함하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, RhoA에 특이적인 dsRNA가 신경스테로이드(neurosteroids ; 예를 들면, 프로게스테론(progesterone), 프레그네놀론(pregnenolone)), 불안완화제(anxiolytic drugs ; 예를 들면, 에티폭신(Etifoxin)), 성장 인자, 향신경성 인자(neurotrophic factors ; 예를 들면, 모양체신경영양인자(ciliaryneurotrophic factor ; CNTF), 안내압(IOP) 강하제(예를 들면, 라타노프로스트(latanoprost) ; 잘라탄®(Xalatan®)), 줄기세포 등과 같은 그러나 이들에 제한되지 않는, 신경보호 및/또는 신경-재생 및/또는 신경신생을 보조하는 다른 치료제들 및/또는 다른 분자 표적들에 대하여 특이적인 dsRNA와 함께 사용될 수 있다.
신경퇴화 장애, 신경 장애, 종양 장애 및 뇌혈관 장애들이 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자들을 사용하는 RNA 간섭에 의하여 치료될 수 있다. 예시적인 신경퇴화 장애들에는 알쯔하이머병, 파킨슨씨병, 척수 손상 및 안신경퇴행성 장애들이 포함된다. 본 출원에서 기술되는 상기 핵산 분자들은 시퀀스 특이적인 방법으로 RhoA의 발현을 하향-조절할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내의 RhoA 연관 질병 또는 상태를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 신경퇴화를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 알쯔하이머병(AD), 근육위축가쪽경화증(ALS), 파킨슨씨병(PD), 혈관확장성 운동실조증(AT), 뇌졸증 후 치매(PSD), 안신경퇴행성 질환 및/또는 청신경퇴행성 질환(Auditory neurodegenerative disease)들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 신경퇴화 장애를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 척수 손상(SCI), 뇌 손상, 신경 장애, 뇌졸증 및 파킨슨씨병 증상 원인들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중추신경계의 손상을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 눈의 허혈 상태, 예를 들면, 전방 허혈성 시신경병증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뇌혈관장애의 손상을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 신경병증을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
자율신경병증, 암-연관 신경병증, 압박성 신경병증, 당뇨병 신경병증, 약물-유발 신경병증, 중독성 신경병증, 화학요법-유발 신경병증, 위장관 신경병증, 영양-연관 신경병증, 유전성 신경병증, 면역-매개 신경병증 및 만성 면역-매개 다발 신경병증, 전염성 신경병증 및 신경병증성 통증들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 대상체 내에서의 신경병증을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 당뇨병 신경병증으로 고통받는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 이질통으로 피해를 입는다.
대상체 또는 유기체 내에서의 신경재생을 촉진하는 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체에 신경보호를 부여하는 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
자율신경병증, 암-연관 신경병증, 압박성 신경병증, 당뇨병 신경병증, 약물-유발 신경병증, 중독성 신경병증, 화학요법-유발 신경병증, 위장관 신경병증, 영양-연관 신경병증, 유전성 신경병증, 면역-매개 신경병증, 전염성 질병-매개 신경병증, 신경병증성 통증 및 이질통들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 신경병증의 위험이 있거나 그로부터 고통받는 대상체 또는 유기체에 신경보호를 부여하는 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
신경 손상 또는 신경퇴행성 질환으로 영향을 받는 대상체 또는 유기체에 신경보호를 부여하는 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 비정상적인 및/또는 혼란된 세포 운동성, 세포 골격 조절 및/또는 미세소관 조직과 연관된 질병 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 혈관형성 장애, 관다발계 질병 및/또는 동맥 질환을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 안혈관신생 질병 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 각막 안혈관신생 질병 또는 장애, 망막 안혈관신생 질병 또는 장애, 맥락막 안혈관신생 질병 또는 장애 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 안혈관신생 질병 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 망막병증을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 당뇨병 망막병증을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
각막 이식 대상체 또는 유기체 내에서의 각막 이식 거부를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 협착재발을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대상체 또는 유기체 내에서의 암 또는 악성종양 또는 암종 또는 종양형성(tumoriginesis)을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법은 상기 대상체 또는 유기체 내에서의 RhoA 유전자의 발현을 하향-조절하기에 적절한 상태들 하에서 상기 대상체 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예들에 있어서, 치료되는 상기 대상체는 온혈동물 및 특히 인간을 포함하여 포유동물이다.
본 발명의 상기 방법들은 상기 대상체에 RhoA의 발현을 하향-조절하는 하나 또는 그 이상의 억제화합물들(inhibitory compounds); 및 특히 siRNA를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하고 그에 의하여 상기 대상체를 치료하는 것을 포함한다.
용어 "치료(treatment)"는 치료상의 치료(therapeutic treatment) 및 예방적 또는 예방책(preventative measures) 둘 다를 의미하며, 여기에서 상기 대상체가 앞서 열거된 바와 같은 연관된 장애들을 예방하거나 또는 늦추어진다(완화된다). 치료를 필요로 하는 대상체들에는 상기 질병 또는 상태를 이미 경험하고 있는 대상체들, 상기 질병 또는 상태를 가질 경향이 있는 대상체들 및 상기 질병 또는 상태가 예방되어야만 하는 대상체들이 포함된다. 본 발명의 상기 화합물들은 상기 질병 또는 상태 또는 이들과 연관된 증후군들의 발병 이전에, 발병 동안에 또는 발병에 후속하여 투여될 수 있다. 치료가 예방을 목적으로 하는 경우들에 있어서는, 그때에는 본 발명은 상기 질병 또는 장애의 발병을 지연시키거나 또는 회피하는 방법과 연관된다.
본 발명은 RhoA의 발현을 하향-조절하는 화합물들의 용도, 특히 RhoA의 발현의 하향-조절이 유리한 질병들 또는 상태들의 치료에서의 신규한 이중 가닥의 RNA 화합물들(dsRNAs)에 관한 것이다.
본 출원에서 RhoA를 하향-조절하는 방법들, 분자들 및 조성물들이 본 출원에서 상세히 논의되었으며, 상기 분자들 및/또는 조성물들 중의 임의의 것이 상기 상태들 중의 임의의 것으로부터 고통받는 대상체의 치료에 유리하게 사용될 수 있다. RhoA에 대한 siRNA의 제조에서 유용한 바람직한 올리고머 시퀀스들이 표 1, 2, 3 또는 4에 나열되어 있다.
본 발명의 상기 화합물들이 치료제로서 유용한 특정의 용례들의 상세들이 본 출원에서 기술된다.
본 발명은 이하에서 실시예들을 참조하여 상세히 설명되나, 그러나 이에 제한되는 것으로서 이해되어야 하는 것은 아니다.
본 출원에서의 임의의 문헌의 인용은 그 문헌이 적절한 선행기술이거나 또는 본 출원의 임의의 청구항의 특허성에 대한 인용문헌으로서 간주됨을 인정하는 것으로서 의도되는 것은 아니다. 임의의 문헌의 내용 또는 날짜에 대한 임의의 진술은 출원 시에 출원인이 획득가능한 정보에 기초하고 있으며, 이러한 진술의 정확성에 대한 인정을 구성하지는 않는다.
실시예들
분자생물학에서의 일반적인 방법들
당해 기술분야에서 공지된 표준 분자생물학 기술들 및 특별히 기술되지 않은 것은 대체로 문헌 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)에서와 같은, 그리고 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)에서와 같은, 그리고 Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988)에서와 같은, 그리고 Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York 그리고 Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)에서와 같은 그리고 미합중국 특허 제4,666,828호; 동 제4,683,202호; 동 제4,801,531호; 동 제5,192,659호 및 동 제5,272,057호에서 규정된 바와 같은 방법론에 따르며, 이들을 본 출원에 참조로 인용한다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 대체로 문헌 PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서와 같이 수행된다. 유세포측정기(Flow Cytometry)와 조합한 원위치(세포 내) 중합효소연쇄반응이 특정의 DNA 및 mRNA 시퀀스들을 포함하는 세포들의 검출에 사용될 수 있다(문헌 Testoni et al., 1996, Blood 87:3822 참조). 역전사-중합효소연쇄반응을 수행하는 방법 또한 당해 기술분야에서 공지되어 있다.
실시예 1: RhoA에 대한 활성 dsRNA 화합물들에 대한 시퀀스들의 생성 및 dsRNA 화합물의 생산
적절한 알고리즘들(algorithms) 및 인간 RhoA mRNA(시퀀스 동정번호: 1)의 시퀀스를 사용하여, 많은 잠재적인 dsRNA 화합물들의 시퀀스드를 생성하였다. 이 방법을 사용하여 생성된 상기 시퀀스들은 대응하는 인간 RhoA mRNA 시퀀스(표 1, "18량체들(18 mers)", 표 3 및 4, "19-량체들"에 추분히 상보적이거나 또는 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드와 표적 mRNA 사이에 미스매치를 포함한다(표 2, "18+1-량체"). 인실리코(가상실험에서의 컴퓨터 프로그래밍)에서 인간 RhoA mRNA 및 집쥐(rat), 생쥐(mouse), 붉은털원숭이(Rhesus monkey) 및/또는 침팬지(chimpanzee)를 포함하는 적어도 하나 이상의 종들 RhoA mRNA에 대하여 가장 활성인 것으로 예측된 후보 dsRNA 화합물들을 선별하였다.
인간 RhoA mRNA의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 미국국립생물정보국(NCBI) 참조 시퀀스(Reference Sequence): NM_001664.2로 동정되고, 그리고 시퀀스 동정 번호: 1로 규정된다. 상기 RhoA mRNA는 시퀀스 동정 번호: 2로 규정된, NCBI 참조 시퀀스 NP_001655.1에서 동정된 폴리펩티드를 인코딩한다. 각 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드의 상기 시퀀스 동정 번호는 표들에서 규정된다. 본 출원의 표들에서는 하기의 약어들이 사용되었으며: "X=-종(X=-species)"은 다른 동물들에 대하여 동정되는 교차종(cross species)을 의미하며: Rt-집쥐, Rh-붉은털원숭이, Ms-생쥐; Cp-침팬지이다. ORF: 전사해독틀, 19-량체 및 18+1-량체들은 각각 19 및 18+1(안티센스의 포지션 1에서의 U, 센스 가닥의 포지션 19에서의 A)의 리보핵산 길이의 올리고머들을 의미한다. 각 선택된 시퀀스쌍(듀플렉스)은 3' 말단 디뉴클레오티드 dTdT 오버행을 갖는 19-량체 듀플렉스(_S709 화합물)로서 시험된다.
표 1: 18- 량체 올리고뉴클레오티드쌍들
Figure 112013006138949-pct00013
Figure 112013006138949-pct00014
(표 1 내지 표 5에서, Name = 이름, Sense 5->3(18) = 센스 5->3(18), SEQ ID NO = 시퀀스 동정 번호, Antisense 5->3(18) = 안티센스 5->3(18), mRNA position = mRNA 포지션, Human X-sp = 인간 X-종, position in mRNA= mRNA 내의 위치임)
표 2: 18+1- 량체 올리고뉴클레오티드쌍들
Figure 112013006138949-pct00015
Figure 112013006138949-pct00016
표 3: 19- 량체 올리고뉴클레오티드쌍들
Figure 112013006138949-pct00017
표 4는 화학적으로 변성된 dsRNA 분자들을 생성하는 데 유용한 올리고뉴클레오티드쌍들을 제공한다. 이들 올리고뉴클레오티드쌍들은 본 출원의 양수인에게 양도된 국제특허공개 제WO 2009/044392호에 기술되어 있다.
표 4:
Figure 112013006138949-pct00018
표 5는 비교 활성 연구를 위한 올리고뉴클레오티드쌍들을 제공한다.
표 5:
Figure 112013006138949-pct00019
이미 동정되고 그리고 적어도 인간 및 집쥐 종등과 호환가능한 활성 dsRhoA 화합물과 마찬가지로 이들 RhoA dsRNA(dRhoA) 분자를 합성하고 그리고 인간 세포주 내에서의 잔류 RhoA mRNA 수준들의 qPCR 분석을 활용하여 시험관 내(in-vitro) RNAi 활성에 대하여 스크리닝하였다. =<5nM 농도에서 적어도 85% 넉다운(knockdown)(5mM에서 15% 잔류 mRNA)을 제공하는 dsRNA 화합물을 집쥐 세포주에서 재-시험하고 그리고 후속의 최적화(optimization)로 진행하였다. 선별된 후보 dsRNA 분자를 뉴클레아제 저항성을 부여하고, 오프-타겟(off-target) 활성을 감소시키는 한편으로 온-타겟(on-target) 활성을 보존하거나 증가시키고, 그리고 염증유발 반응들(proinflammatory responses)을 감소시키기 위하여 화학적 변성들에 결합시키는 것에 의하여 최적화시켰다. 다른 형태의 화학적 변성들 및 dsRNA 시퀀스를 평가하였다. 합성된 상기 화학적으로 변성된 dsRNA를 도 1에 나타내었다. 이들 변성된 dsRNA 화합물들을 합성하고 그리고 세포 배양물(cell culture) 내에서 RNAi 활성에 대하여 스크리닝하였다. 부모 분자(parent molecules)들에 대하여 유사하거나 또는 개선된 활성을 갖는 것들을 후속의 특정화(characterization)로 진행하였다. 먼저, dsRNA 화합물들의 뉴클레아제 저항성을 인간 혈장, 인간 혈청, CSF(뇌척수액) 및/또는 세포 용해물(cell lysates)들에서 평가하였다. 혈장, 혈청, 뇌척수액 및 또는 세포 용해물 내에서 적어도 10시간의 안정성을 나타내는 dsRNA 화합물들을 오프-타겟 분석으로 진행시켰으며, 이를 위하여 psiCHECK(TM)(프로메가사(Promega) 루시퍼라아제 리포터 시스템(luciferase reporter system)이 사용되었다. 세포 배양물 내에서 루시퍼라아제 발현의 RNAi-매개 억제를 분석하였다.
3가지 서로 다른 시험관 내 방법들: 즉 (a) TLR/RIGI/Mda5-의존성 루시퍼라아제 리포터의 dsRNA 활성화의 평가; (b) dsRNA-처리된 인간 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells ; PBMC) 내에서의 사이토카인 생산의 평가; (c) dsRNA-처리된 인간 PBMC들 내에서의 인터페론(interferon ; IFN)-반응성 유전자들의 발현을 분석하는 것에 의한 인터페론 반응의 활성화의 평가;를 사용하여 dsRNA 화합물들에 대한 선천성 면역의 잠재적인 활성화에 대한 시험이 수행되었다. 이들 방법들은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 친숙하고 그리고 쉽게 수행될 수 있다.
대조 세트의 시험관 내 시험
상기 대조 세트는 19-량체 듀플렉스 및 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥들의 3' 말단들에 공유적으로 결합된 디뉴클레오티드 dTdT를 갖는 dsRNA 화합물들을 포함한다. 상기 대조 화합물들은 RHOA_X_S709로 명명되었다. RhoA 유전자를 내생적으로 발현하는 약 2*105의 인간 PC3 세포들을 1.5㎖ 성장 배지(growth medium)에 접종시켜 24시간 후에 30 내지 50%의 융합(confluence)에 도달하도록 하였다. 세포들을 dsRNA 리포펙타민™(Lipofectamine™) 2000으로 형질감염시켜 형질감염된 세포 당 0.3 내지 5nM의 최종 농도로 만들었다. 세포들을 37±1℃, 5% 이산화탄소(CO2)에서 48시간 동안 배양시켰다. 형질감염 효율에 대하여 Cy3-표지된 dsRNA 듀플렉스들을 양성대조로 사용하였다. 넉다운 활성에 대하여는 단지 리포펙타민™으로만 처리된 세포들을 음성대조로 사용하였다. dsRNA 형질감염된 세포들을 수확하고 그리고 EZ-RNA™ 킷트[바이올로지칼 인더스트리즈사(Biological Industries) ; #20-410-100)]를 사용하여 RNA를 단리시켰다. 이 프로토콜(protocol)을 사용하여 시험된 상기 dsRNA 화합물들에는 표 1, 2, 3 및 5에서 규정된 쌍들이 포함된다. 미변성된 18+A 듀플렉스들에 대한 활성 데이터를 하기 표 A에 제공하였다. 18+A는 19-염기쌍 듀플렉스를 의미하며 여기에서 포지션 1 내지 18[(N')y]에서 표적 mRNA에 대한 완전매치 및 포지션 19에서의 A(N2, 아데노신)을 갖는 올리고뉴클레오티드 (N')y-N2는 상보적 올리고뉴클레오티드 (N)x-N1와 듀플렉스화된다. 시험관 내 활성의 시험을 위하여 상기 화합물들을 미변성시키고 그리고 3' dTdT 오버행으로 합성하였다. 표 A 및 표 B 내의 활성 결과들을 5nM, 0.5nM 및 0.1nM의 농도에서의 dsRNA의 적용 후 %잔류표적(% residual target)으로 제공하였다.
표 A - 두 가닥들에서 미변성된 리보뉴클레오티드 및 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥들의 3' 말단들에 dTdT 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 18+1량체 dsRNA에 대한 넉다운 활성 결과들(%잔류 mRNA)
Figure 112013006138949-pct00020
Figure 112013006138949-pct00021
Figure 112013006138949-pct00022
표 B - 두 가닥들에서 미변성된 리보뉴클레오티드 및 두 가닥들의 3' 말단들에 dTdT 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 18량체 dsRNA에 대한 넉다운 활성 결과들(%잔류 mRNA)
Figure 112013006138949-pct00023
대조 분자들(78-84)에 비하여 특정의 선호되는 분자들(48, 50 58)의 활성을 표 C에 나타내었다.
표 C
Figure 112013006138949-pct00024
화학적으로 변성된 dsRNA 분자들 및 개괄된 활성(넉다운)을 도 1에 제공하였다. 상기 변성들에 대한 범례(legend)는 다음과 같다: 접두어 "z"는 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드에 공유적으로 결합된 부분(뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드)을 지시한다. 예를 들면, zdT는 dT 오버행을 의미하고; zdT;zdT는 dTdT 오버행을 의미한다. 접두어 "y"는 뉴클레오티드 치환을 지시하며, 예를 들면, yLdA는 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에서 리보뉴클레오티드에 대하여 치환된 L-디옥시리보아데닌을 의미하고; 그리고 yrU는 상기 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에서 다른 리보뉴클레오티드에 대하여 치환된 우리딘을 의미한다. 접두어 "m"은 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드를 의미한다. 다른 코드들은 이하 표 D에서 규정한다.
표 D - 화학적으로 변성된 dsRNA 분자들에 대한 범례
Figure 112013006138949-pct00025
Figure 112013006138949-pct00026
Figure 112013006138949-pct00027
RhoA 핵산 분자들의 시험관 내 시험
세포주들: 인간 전립선암(prostate adenocarcinoma) PC3 세포들(ATCC(미국표준균주배양수록보존소 ; American Type Culture Collection), 카테고리 번호(Cat#) CRL-1435)을 10% 우태혈청(FBS) 및 2mM L-글루타민으로 보충된 RPMI(Rosewell Park Memorial Institute에서 개발) 배지에서 성장시키고 그리고 인간 상피성 자궁경부암(epithelial cervical cancer) HeLa 세포들(ATCC, Cat#CCL-2)을 10% FBS, 2mM L-글루타민으로 보충된 둘베코변성이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium ; DMEM) 내에서 유지시켰다. 세포들은 37℃에서 5% CO2에서 유지시켰다.
RhoA 유전자를 내생적으로 발현하는 약 2*105 인간 PC-3 세포들을 1.5㎖ 성장 배지에 접종시켜 24시간 후에 30 내지 50%의 융합에 도달하도록 하였다. 세포들을 dsRNA 및 리포펙타민™ 2000 시약으로 형질감염시켜 형질감염된 세포 당 0.1 내지 5nM의 최종 농도로 만들었다. 세포들을 37±1℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양시켰다. 형질감염 효율에 대하여 Cy3-표지된 dsRNA 듀플렉스들을 양성대조로 사용하였다. siRNA 활성에 대하여는 리포펙타민™ 2000 시약으로 처리된 세포들을 음성대조로 사용하였다. dsRNA 형질감염된 세포들을 수확하고 그리고 EZ-RNA™ 킷트[바이올로지칼 인더스트리즈사 ; #20-410-100)]를 사용하여 RNA를 단리시켰다.
각 시험된 dsRNA에 의한 표적 유전자 발현의 억제율을 세포로부터의 표적 mRNA의 qPCR 분석에 의하여 결정하였다. 상기 세포들로부터 cDNA를 합성하고 그리고 실시간 qPCR에 의하여 표적 유전자 mRNA 수준들을 결정하는 것에 의하여 역전사를 수행하였다. 측정된 세포 mRNA 수준들을 각 샘플에 대하여 사이클로필린 A(CYNA, PPIA) mRNA의 수준들에 대하여 정규화(normalized)시켰다. dsRNA-처리된 샘플들 대 비-형질감염된 대조 샘플들에서의 표적 유전자 mRNA 양의 비교에 기초하여 넉다운 활성을 결정하였다.
각 시험된 dsRNA에 의한 표적 유전자 발현의 억제율을 세포로부터의 표적 mRNA의 qPCR 분석에 의하여 결정하였다. 상기 세포들로부터 cDNA를 합성하고 그리고 실시간 qPCR에 의하여 표적 유전자 mRNA 수준들을 결정하는 것에 의하여 역전사를 수행하였다. 측정된 세포 mRNA 수준들을 각 샘플에 대하여 사이클로필린 A(CYNA, PPIA) mRNA의 수준들에 대하여 정규화시켰다. dsRNA-처리된 샘플들 대 비-형질감염된 대조 샘플들에서의 표적 유전자 mRNA 양의 비교에 기초하여 넉다운 활성을 결정하였다.
RhoA dsRNA들의 뉴클레아제 안정성의 특정화
dsRNA RhoA 화합물들의 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 안정성을 다음과 같이 결정하였다
(1) 인간 혈장 및/또는 인간 뇌척수액(CSF)(엔도뉴클레아제 안정성)
비변성 겔(nondenaturing gels)의 브롬화에티듐(ethidium bromide ; EthBr) 염색에 의한 dsRNA 온전성의 평가
변성 겔(denaturing gels)로부터 수득되는 노던 블럿(Northern blots)에 대한 시퀀스-특이적 탐침(sequence-specific probes)들의 교잡화에 의한 듀플렉스 내 각 dsRNA 가닥의 안정성의 평가
(2) 인간 HCT116의 추출(엑소뉴클레아제 안정성)
변성 겔로부터 수득되는 노던 블럿에 대한 시퀀스-특이적 탐침들의 교잡화에 의한 듀플렉스 내 각 dsRNA 가닥의 안정성의 평가.
(3) 혈장 내 안정성(엔도뉴클레아제 저항성)
RhoA dsRNA 화합물들을 37℃에서 24시간 동안 완전 인간 혈장 또는 뇌척수액 내에서 배양시켰다. 3㎕ 분획(aliquots)들을 수집하고 그리고 배양의 1, 3, 6, 12 및 24시간에서 액체 N2 내에서 급속-동결(snap-frozen)시켰다. dsRNA 온전성은 (1) 천연의 15% 천연의 폴리아크릴아미드 겔을 통한 전기영동(약 40ng/레인)(PAGE ; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법)에 후속하여 브롬화에티듐(EthBr) 염색(인간 혈장 샘플만)에 의하여 그리고 (2) 변성 8M 우레아 8% PAGE를 통한 전기영동(1ng/레인)(포름알데히드 내에서의 1:87 희석)에 후속하여 나일론 막(Nylon membranes ; 하이본드-엑스엘(Hybond-XL)으로의 전기-블럿팅(electro-blotting) 및 상기 dsRNA 듀플렉스의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 검출하는 방사성으로 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들(oligonucleotide probes)과의 혼성화에 의하여 분석하였다. 각각 5㎕ PBS 내에 용해되고 그리고 천연의 또는 변성 PAGE 상에 적하된(loaded)된 40ng 또는 1ng dsRNA가 무손상의 미처리된 dsRNA 분자에 대한 이동 기준(migration references)들로서 기능한다. 비-변성된 dsRNA 카운터파트들(counterparts), 즉 리보뉴클레오티드들의 전부가 미변성된 동일한 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 dsRNA 화합물들을 엔도뉴클레아제 안정성에 대한 음성대조로 사용하였다.
인간 HCT116 시토졸 추출물(cytosolic extracts)에서의 안정성(엑소뉴클레아제 저항성): dsRNA RhoA 화합물들의 엑소뉴클레아제 저항성을 인간 HCT116의 시토졸 추출물 내에서 37℃에서 서로 다른 시간 간격들((1, 3, 6, 12 또는 24시간) 동안의 배양에 의하여 평가하였다. 여러 배양 시간들 후의 dsRNA 온전성을 변성 겔들을 통한 전기영동(PAGE), 블럿팅 및 후속하는 방사성 표지된 가닥-특이적 탐침들(dsRNA 화합물 듀플렉스의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥들을 검출하는 올리고뉴클레오티드 탐침들)에의 혼성화에 의하여 분석하였다.
시험된 화합물들의 안정성 결과들을 본 출원에서 하기 표 E, F 및 G에 나타내었다. 안정성 데이터는 시간들로 제공되었으며, 즉, 24는 24시간을 의미한다. 바람직한 분자들의 일부는 혈장 또는 혈청 내에서 3시간 이상 동안 안정하였다.
표 E는 대조화합물들(RHOA_48, 50 및 58(S709))에 대한 그리고 RHOA48 및 RHOA_48u에 기초하는 화학적으로 변성된 dsRNA에 대한 안정성을 나타내고 있다.
표 E
Figure 112013006138949-pct00028
표 F는 RHOA_50에 기초하는 화학적으로 변성된 dsRNA에 대한 안정성 데이터를 나타내고 있다.
표 F
Figure 112013006138949-pct00029
표 G는 RHOA_58에 기초하는 화학적으로 변성된 dsRNA에 대한 안정성 데이터를 나타내고 있다.
표 G
Figure 112013006138949-pct00030
Figure 112013006138949-pct00031
RhoA 화합물들의 온- 타겟 대 오프 - 타겟 넉다운의 평가
인간 HeLa 세포들 내에서의 활성: dsRNA RhoA 화합물(대 비-변성 카운터파트들)의 넉다운 효율을 인간 HeLa 세포들 내에서의 "온-타겟" 프사이-체크(psi-CHECK) 시험(상기 dsRNA 화합물들의 가이드 가닥들(guide strands)에 대하여 대응하는 매칭된 상보적 표적을 포함하는 루시퍼라아제 리포터 플라스미드 구조물들의 활성을 분석)을 사용하여 시험하였다. 각 dsRNA를 4pM 내지 100nM의 5가지 농도들에서 형질감염시켰다. 리포펙타민-노출 세포들이 음성대조로 사용되었다.
오프-타겟 활성: dsRNA RHOA 화합물들의 잠재적 시드-매개 오프-타겟 효과들을 프사이-체크 플라스미드 리포터 시스템(프로메가 티엠사(Promega TM)) 내에서 분석하였다. 이 시스템은
가이드 가닥(Guide strand ; GS) - "완전 매칭된시퀀스에 대한 "온-타겟" 활성;
가이드 가닥 시드 영역(Guide strand seed region) - "오프-타겟" miRNA-유사 활성;
패신저 가닥(Passenger strand ; PS) - RISC 내로의 패신저 가닥 완전 적하(PS-CM)로 인한 "오프-타겟" 효과들
고유의 효력(intrinsic potency)의 평가를 가능하게 한다.
모든 표적 시퀀스들을 루시퍼라아제 리포터 구조물의 3'-UTR 내로 삽입하고 그리고 siRNA 활성을 dsRNA 형질감염에 후속하는 루시퍼라아제 리포터 형광(luciferase reporter luminescence)의 특이적 환원으로서 결정하였다. 각 후보 dsRNA 1차 시퀀스(primary sequence)에 대하여 4개의 프사이체크™-2-기반 구조물들(psiCHECKTK™-2-based constructs)을 준비하였다. 상기 프사이 체크 구조물들은 매칭된 상보적 가이드(GS-CM) 또는 패신저(PS-CM) 가닥 시퀀스들의 단일 복제들(single copies) 또는 이들 사이에서 최적의 거리들에서 복제된 상기 가이드 가닥 시드 영역들(GS-SM)에 상보적인 시퀀스들의 3가지의 복제들(가장 가혹한 조건들에서의 잠재적 시드-매개 오프-타겟 효과들을 시험하기 위함)을 포함하거나 또는 "전장 센서" 프사이체크 구조물들은 상기 가이드 가닥의 "전장-센서" 시퀀스의 4개의 일렬로 연결되는 복제물들을 포함하고, 이 시퀀스는 시드 영역, 포지션 2-8((5'>3')의 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 RNA 가닥, 후속하여 4개의 비-표적 뉴클레오티드 및 계속해서 상기 안티센스 가닥의 중앙 영역(central region), 포지션 13-19들로 이루어진다(이들 구조물들은 매우 광범위한 염기쌍 오프-타겟들을 모방하기 위하여 생성되었다).
상기 온-타겟 및 오프-타겟 활성의 결과들을 하기 표 H, J, K, L, M, N, P, Q, R, S , T 및 U에 제공하였다.
표 H: dsRHOA_48 및 dsRHOA_48u 분자들의 안티센스 가닥의 표적에 대한 완전 매치(온-타겟)
Figure 112013006138949-pct00032
Figure 112013006138949-pct00033
표 J: dsRHOA_48 및 dsRHOA_48u 분자들의 안티센스 가닥의 그의 표적에 대한 시드 매치(오프-타겟)
Figure 112013006138949-pct00034
표 K: dsRHOA_48 및 dsRHOA_48u 분자들의 센스 가닥의 표적에 대한 완전 매치(오프-타겟)
Figure 112013006138949-pct00035
표 L: dsRHOA_48 및 dsRHOA_48u 분자들의 안티센스 가닥의 그의 시드 뉴클레오티드들 및 뉴클레오티드들 13-17에 대한 매치(오프-타겟)
Figure 112013006138949-pct00036
Figure 112013006138949-pct00037
표 M: dsRHOA_50 분자들의 안티센스 가닥의 그의 표적에 대한 완전 매치(온-타겟)
Figure 112013006138949-pct00038
표 N: dsRHOA_50 분자들의 안티센스 가닥의 시드에 대한 시드 매치(오프-타겟)
Figure 112013006138949-pct00039
표 P: dsRHOA_50 분자들의 센스 가닥의 그의 표적에 대한 완전 매치(오프-타겟)
Figure 112013006138949-pct00040
표 Q: dsRHOA_50 분자들의 안티센스 가닥의 시드 뉴클레오티드들+뉴클레오티드들 13-17에 대한 매치(오프-타겟)
Figure 112013006138949-pct00041
표 R: dsRHOA_58 분자들의 안티센스 가닥의 표적에 대한 완전 매치
Figure 112013006138949-pct00042
Figure 112013006138949-pct00043
표 S: dsRHOA_58 분자들의 안티센스 가닥의 시드에 대한 시드 매치(오프-타겟)
Figure 112013006138949-pct00044
Figure 112013006138949-pct00045
표 T: dsRHOA_58 분자들의 센스 가닥의 그의 표적에 대한 완전 매치(오프-타겟)
Figure 112013006138949-pct00046
표 U: dsRHOA_58 분자들의 안티센스 가닥의 시드 뉴클레오티드들+뉴클레오티드들 13-17에 대한 매치(오프-타겟)
Figure 112013006138949-pct00047
후보 분자들
특정의 현재 선호되는 dsRNA(dsRHOA) 분자들을 각 분자에 대하여 제공된 넉다운 활성(qPCR), 온-타겟(프사이-AS-CM), 오프-타겟(프사이-AS-SM 및 프사이-SSM) 및 안티센스 가닥 안정성 데이터와 함께 표 W에 규정하였다.
표 W
Figure 112013006138949-pct00048
na: 해당없음. 시험되지 않거나 또는 분석이 품질관리(QC)를 통과하지 못함.
5nM에서의 qPCR 넉다운: +++ ≤ 15 %; ++ 15 < 30%; + 31 < 50%
RHOA dsRNA 분자들에 대한 선천적 면역 반응:
신선한 인간 혈액(실온(RT)에서)을 실온에서 멸균 0.9% NaCl과 1:1로 혼합하고 그리고 피콜(Ficoll ; 림포프렙사(Lymphoprep), Axis-Shield cat# 1114547) 상에 완만하게 적하(1:2 비율)시켰다. 샘플들을 스윙 원심분리기(swinging centrifuge)에서 30분간 실온(22℃, 800g)에서 원심분리시키고, RPMI1640으로 세척하고 그리고 10분간 원심분리(실온, 250g)시켰다. 세포들을 계수하고 그리고 성장 배지(RPMI1640 + 10% FBS + 2mM L-글루타민 + 1% Pen-Strep(페니실린-스트렙토마이신)) 내에 1.5*106 세포/㎖의 최종 농도로 접종하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 dsRNA 처리를 하였다.
세포들을 여러 농도들에서 제조업자들의 지시사항들에 따라 리포펙타민™2000 시약(인비트로겐사(Invitrogen))을 사용하여 시험 dsRNA들과 접촉시키고 그리고 37℃에서 5% CO2 배양기 내에서 24시간 동안 배양시켰다. 인터페론 반응(IFN response)에 대한 양성대조로서, 세포들을 TLR3 리간드(인비보겐사(InvivoGen) Cat# tlrl-pic)인 이중가닥 RNA(dsRNA)의 합성 유사체인 폴리(아이씨)(poly(I:C))로 최종농도 0.25 내지 5.0㎍/㎖로 또는 TLR 7/8 리간드(인비보겐사 Cat# tlrl-c75)인 티아졸라퀴놀론(Thiazolaquinolone ; CL075)로 최종농도 0.075 내지 2㎍/㎖로 처리하였다. 리포펙타민™2000 시약으로 처리된 세포를 인터페론 반응에 대한 음성대조(기준)로서 사용하였다.
배양 약 24시간 후, 세포들을 수집하고 그리고 상청액(supernatant)을 새로운 시험관으로 옮겼다. 샘플들을 액체 질소로 즉각적으로 냉동시키고 그리고 인터류킨-6(IL-6) 및 알파-종양괴사인자(TNF-α) 사이토카인들의 분비를 인터류킨-6, 듀오셋 엘리사 킷트(DuoSet ELISA kit ; 알앤드디 시스템사(R&D System) DY2060) 및 알파-종양괴사인자, 듀오셋 엘리사 킷트(알앤드디 시스템사 DY210)을 사용하여 제조업자들의 지시사항들을 따라 시험하였다. 세포 펠릿들로부터 RNA를 추출하고 그리고 인간 유전자들 IFIT1(테트라트리코펩타이드 반복 1(tetratricopeptide repeats 1)을 갖는 인터페론-유도 단백질(interferon-induced protein)) 및 MX1(믹소바이러스(myxovirus ; 인플루엔자 바이러스) 저항 1, 인터페론-유도가능 단백질 p78)의 mRNA 수준들을 qPCR로 측정하였다. 측정된 mRNA 양들을 대조 유전자 펩티딜프롤릴 이성질화효소 에이(peptidylprolyl isomerase A ; cyclophilin A; CycloA)의 mRNA 양에 대하여 정규화시켰다. 인터페론-신호화의 유도는 무-처리된 세포들에서의 양들과 비교한 처리된 세포들로부터의 IFIT1 및 MX1 유전자들로부터 mRNA의 양을 비교하는 것에 의하여 평가되었다. 상기 qPCR 결과들을 통과한 품질관리 기준들의 결과들이었다. 즉, 표준곡선경사(standard curve slope)의 값은 간격 [-4, -3], R2>0.99 이었으며, 프라이머(primer), 이량체(dimers)들은 없었다. 상기 품질관리 요건들을 통과하지 못하는 결과들은 분석으로부터 실격시켰다.
실시예 2: 동물 모델들
녹내장의 모델계
녹내장을 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 활성 dsRNA 화합물의 시험을, 예를 들어 다음 문헌[Maeda, K. et aI., "A Novel Neuroprotectant Retinal Ganglion Cell Damage in a Glaucoma Model and an Optic Nerve Crush Model in the rats", Investigative Ophthalmology and visual Science (IOVS), March 2004, 45(3)851]에 기재된 시신경 압박 동물 모델에서 수행한다. 구체적으로, 시신경 절단을 위하여, 마취된 쥐의 안와 시신경(ON)을 안와상 접근법을 통해 노출시키고, 뇌막을 절단하고, 사판(lamina cribrosa)으로부터 2㎜의 부분을 핀셋을 이용하여 10초간 압박하여 ON 내의 모든 축삭을 절단한다.
본원에서 기재한 RhoA dsRNA 화합물을 이러한 동물 모델에서 시험한 결과, 이들 RhoA dsRNA 화합물은 녹내장을 치료 및/또는 예방하는데 유용한 것으로 확인된다.
쥐 시신경 압박( ONC ) 모델: 초자체내 ( IVT ) dsRNA 전달 및 점안에 의한 dsRNA 전달
시신경 절단을 위하여, 마취된 쥐의 안와 시신경(ON)을 안와상 접근법을 통해 노출시키고, 뇌막을 절단하고, 사판으로부터 2㎜의 부분을 핀셋을 이용하여 10초간 압박하여 ON 내의 모든 축삭을 절단한다.
dsRNA 화합물은 단독으로 또는 점안액 형태로 5㎕ 체적(10㎍/㎕)으로 전달한다. 시신경 압박(ONC) 후 즉시, 20㎍/10㎕ 시험 dsRNA 화합물 또는 10㎕ PBS를 성숙한 윈스터 집쥐(Wistar rats)의 한쪽 또는 양쪽 눈에 투여하고, 주사 후 5 시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 14일 및 21일째에, 절개 및 순간 동결한 망막에 흡수된 dsRNA의 수준을 측정한다. 점안액을 통해 투여된 dsRNA 화합물의 활성 및 효능을 시험하기 위하여 유사한 실험을 수행한다.
척수 손상을 위한 MASCIS 쥐 모델
대부분의 인간 척수 손상은 척수의 좌상을 동반한다. 쥐 척수 좌상의 충격 모델은 일관성있는 손상을 나타내고, 세포외 칼륨 및 칼슘 이동, 하향 유발 반응(descending evoked response) 및 척수 병소 체적을 비롯한 여러 가지 척도에 반영되는 것으로 약물 후보군을 시험하기 위한 매우 귀중한 생체 내 모델을 제공한다(문헌 Pinzon 외, 2008a; Pinzon 외, 2008b 참조). 상기 모델은 단지 7 마리의 쥐에서 메틸프레드니졸론(MP) 처리로 인해 유의한 병소 체적 변화를 검출할 수 있다(문헌 Young, 2002에서 검토됨). 또한, MASCIS 군은 충격 부위에서 조직학적 변화와 선형적으로 상관되는 21-점 서수 스케일인 바소-베티-브레스나한(Basso-Beattie-Bresnahan ; BBB) 보행 점수를 확인시켜주었다(문헌 Basso 외, 1995). 그 모델은 일관성있는 만성 조직학적 변화를 나타낸다(문헌 Beattie 외, 1997). 최근, 척수 손상 연구에 쥐를 사용하는 경향이 있어왔다. MASCIS 임펙터(Impactor)는 쥐에서 24 시간 병소 체적, 6주 백질 스페어링(white matter sparing) 및 보행 회복을 선형적으로 예측하는 매우 일관성있는 등급 있는 척수 손상을 나타내는 잘 표준화된 척수 좌상 모델이다(문헌 Young, 2002). 다른 척수 손상 모델이 이러한 손상과 관련이 있는 다수의 기작을 연구하는데 유용하였던 반면에, 척수의 절단은 2차 손상의 가장 나쁜 양상과 관련이 있는 광범위한 외상성 손상을 발생하지 않는다. 따라서, 절단에 효과적인 처리가 압박 손상에 효과적일 수 없다(문헌 Iseda 외, 2008).
본원에서 개시한 dsRNA 화합물을 이러한 동물 모델에서 시험한 결과, 이러한 dsRNA 화합물은 척수 손상을 치료 및/또는 예방하는데 효과적이라는 것이 확인된다.
실시예 3: SCI 치료에서 dsRhoA 화합물의 생체 내 효과
압박 SCI 후 RhoA 면역조직화학 분석
RhoA dsRNA 화합물로 처리하지 않은 동물에서 단백질의 상향 조절을 확인하기 위해 손상 후 1주, 2주 및 4주 후에 SCI 후의 RhoA의 면역학적 위치 정보(immunolocalization)를 조사했다. SCI 후, 비손상 무처리 동물과 비교한 RhoA 단백질의 증가를 관찰한다. RhoA 단백질의 증가는 4주 동안 유지되고, 1주와 2주 사이의 특정 시점에서 피크가 있는 것으로 보인다. 배근 및 복근은 혈관을 라이닝하는 내피 세포 외에도 RhoA의 강한 면역학적 위치정보를 보여준다. 공초점 현미경 분석 결과, 많은 RhoA가 혈장막 근처에 위치하므로(문헌 D'Alessandro 외, 2004), SCI 후, 활성 상태에 있는 것으로 판단된다.
척수 손상 및 뇌실질 내 전달 후 쥐의 척수에서 dsRNA 화합물의 세포 내 위치
Cy3.5 형광물질과 결합된 원래 상태의 뉴클레아제-안정화 dsRNA는 운동 뉴런, 대식세포, 백질 축삭 외에도, 배근 및 내포 세포의 뉴런 내에 혼입되는 것이 확인된다. 따라서, 압박 손상 후, 즉시 주입한 경우, dsRNA는 신경세포, 성상세포, 미세아교세포, 대식세포 및 내피 세포를 비롯한, RhoA 작용이 SCI에 관여한 많은 세포들에 의해 흡수될 수 있다. 따라서, 모든 이러한 세포들은 신경보호성(문헌 Dubreuil 외, 2003; Lord-Fontaine 외, 2008), 항염성(Schwab 외, 2004) 및 신경발생성(문헌 Bertrand 외, 2007; McKerracher 및 Higuchi, 2006)인 것으로 예측되는 RhoA의 억제를 위한 가능한 표적을 대표한다.
SCI 후 RhoA 단백질의 유도
RhoA 단백질 수준을 변경하기 위한 본 원의 RhoA dsRNA 화합물의 능력을 분석하기 위하여, 척수 조직의 5㎜ 분절로부터 단백질을 추출하고, 면역 블러팅 후 RhoA 단백질의 상대 수준을 측정한다. RhoA 단백질의 수준은 siGFP 대조구와 비교하여 dsRhoA 화합물로 처리되는 주사된 좌상 부위에서 더 낮으므로, RhoA 단백질의 유도가 억제된 것을 알 수 있다. 동일 추출물을 항-RhoA로 면역 블러팅한 결과, Rho에 대한 RhoA dsRNA 화합물의 면역 반응성이 siGFP 대조구와 비교하여 유사하게 감소한 것이 확인된다.
SCI 후 및 siRNA의 뇌실질 내 주사 후, 쥐의 하지 보행의 기능 회복(바소-베티-브레스나한(BBB) 스코어 테스트)
6주간의 보행기능 바소-베티-브레스나한 분석을 본원에서 개시한 dsRNA 화합물을 이용하여 RhoA에 대하여 수행한다. 대조구인 dsGFP 화합물과 비교한 dsRhoA 화합물의 척수 내 주사 후의 유의한 보행기능 개선이 관찰된다. 바소-베티-브레스나한 보행 스코어의 개선을 나타내는 효과가 아주 이른 시험 시기에 관찰되므로, siRNA 효과는 축삭의 성장에 더욱 긴 시간을 필요로 할 수 있는 재생을 촉진하는 기작 외에도 보호 기작에 기인할 수 있다는 것을 알 수 있다.
요추 천자 주입 후 SCI 부위에서 dsRNA 의 흡수
본원에서 개시한 dsRNA 화합물을 뇌척수액 내로 척수강내 주사한다. 뇌실질내 전달과 척수강내 전달을 비교하기 위하여, 압박 후 일시 투여를 이용하여 Cy3.5- 표지 원래상태의 화합물을 요추 팽대부에 투여한다. 그 결과, 척수강의 손상 중심 외에도, 척수의 이웃한 부리 및 꼬리 모양 부위에 염료가 광범위하게 혼입된 것이 확인된다. 동결절단 결과, dsRNA가 백질에 침투한 외에도, 손상 부위 내부 및 그 근처의 회질에 강하게 침투한 것이 확인된다. 약한 실질 신호가 더욱 말단부에서 관찰되지만, 그 신호는 중심 도관외에도 척수를 둘러싸는 부위에서 강하다. 이러한 결과는 아마도 손상 부위에의 dsRNA의 증가한 침투 때문에 손상 부위 근처의 실질에의 흡수가 더욱 크다는 것을 나타낸다. 요추 부위내로의 척수강 내 전달은 척수의 흉부에서 손상 부위 내부 및 그 근처에의 dsRNA의 바람직한 흡수를 나타낸다.
요추 천자를 통한 dsRNA 주입 3일 후 RhoA mRNA 발현의 억제
SCI에 의해 유발된 RhoA mRNA의 증가를 억제하기 위한 본원의 RhoA dsRNA의 능력을 정량적 RT-PCR을 통해 측정한다. 타박 후, 1일째에, RhoA dsRNA 화합물을 요추 천자를 통해 주입하고, 3일 후, 척수 조직의 RhoA mRNA의 상대 수준을 분석한다. 그 결과, SCI 후, 4일까지 손상 부위에서 RhoA mRNA의 상대 수준이 증가하고, 이러한 증가는 dsRhoA 화합물이 40㎍ 및 100㎍ 주입 시 감소하는 것이 확인된다.
유추 천자 후 쥐의 하지 보행의 기능 회복( BBB )
타박 손상후 1일째에 투여된 dsGFP 대조구와 비교한 본원의 dsRhoA 화합물의 요추 전자 주입의 치료 효과를 바소-베티-브레스나한 스코어법을 이용하여 측정한다. dsRhoA 화합물 처리는 dsGFP 대조구와 비교하여 더욱 높은 스코어를 나타내므로, 본원에서 제공된 올리고뉴클레오티드 서열 및 구조를 이용하는 dsRhoA 화합물은 SCI를 치료하는데 유용하다는 것을 알 수 있다.
실시예 4: 안질환, 장애 및 손상에 관한 모델계 및 결과
모델계로는 시신경 압박( ONC ), IOP 증가 및 시신경 절단 모델이 있다
쥐 녹내장 모델에서 초자체내 주입( IVP ) 또는 점안형태 주입( EL )을 통한 전달 후 dsRhoA 화합물의 IOP 감소 활성
증가된 IOP를 유도하기 위하여, IOP가 30% 이상 상승할 때(0일이라 나타낸 시간)까지 마이크로비드를 윈스터 집쥐의 눈의 전실(anterior chamber)내로 일주일에 1회 주입한다. IOP의 감소에 대한 dsRhoA의 상대적 효능을 평가하기 위하여 토노펜 엑스엘(TonoPen XL) 안압계를 이용하여 IOP를 1주일에 3회 측정한다. 점안형태(ED)의 전달: 3㎕ 2% 메틸셀룰로오스에 용해된 100㎍의 dsRhoA 화합물 또는 대조구인 dsRNA 화합물(siCNL) 또는 60ng의 라타노프로스트(양성 대조구) 또는 3㎕ 2% 메틸셀룰로오스 단독을 증가된 IOP 유도 후, 14일 동안 점안액 형태로 매일 전달한다(n=4). 초자체 내 주입에 의한 전달: 10㎕ PBS에 용해된 20㎍의 dsRhoA 또는 siCNL, 또는 60ng의 란타노프로스트 또는 10㎕ PBS 단독을 0일 및 7일째에 초자체 내 주입을 통해 전달한다(n=4). IVT-ED 병용 처리: 10㎕ PBS에 용해된 20㎍의 dsRhoA 또는 siCNL 또는 10㎕ PBS 단독을 0일째에 초자체 내 주입(IVT)을 통해 전달한 다음, 3㎕ 2% 메틸셀룰로오스(MC)에 용해된 100㎍의 dsRhoA 화합물 또는 대조구 dsRNA 화합물 또는 3㎕ 2% 메틸셀룰로오스 단독을 점안액 형태로 14일간 매일 전달한다.
쥐 ONC 모델에서의 dsRhoA 신경보호 효능
마취된 성숙한 윈스터 집쥐의 안와 시신경(ON)을 노출시킨 다음, 뇌막을 절단하고, 사판으로부터 2㎜ 부분을 교정된 핀셋을 이용하여 10초간 압박하여 ON 내의 모든 축삭을 절단한다. 10㎕ PBS에 용해된 10㎍의 dsRhoA 화합물 또는 대조구 dsRNA 화합물(siCNL) 또는 10㎕ PBS 단독을 ONC 후 0일째에 IVT 주입을 통해 전달한다(n=4). 5㎍의 뇌 유래 신경영양인자(BDNF)가 유사하게 주입된 눈을 양성 대조군으로 이용한다. 종료 2일 전에, 망막 신경절 세포(RGC)를 ON 내로의 형광금(Fluorogold)의 주입을 통해 역행 표지한다. 종료 시(ONC후 7일), 실험 동물에게 4% 파라포름알데히드를 심장을 통해 관류한다. ON을 갖는 눈을 적출하고, 각막을 블레이드를 이용하여 절개하고, 각막 및 수정체/초자체를 부드럽게 제거한다. 다음에, 망막을 절개해내고, 4% 파라포름알데히드에 30분간 고정시키고, UV 필터(365/420㎚)를 이용한 형광 현미경 하에서의 표지 RGC의 조사를 위해 준비한다. 각각의 망막 전체 마운트의 4분면의 각각으로부터 얻은 이미지로부터 역행 표지된 형광 RGC의 수를 측정한다. 손상되지 않은 눈의 RGC 밀도를 기선 대조군으로 이용한다.
ONC 모델에서 dsRhoA 효능
성숙한 피셔 집쥐(Fischer rats)의 ON을 전술한 바와 같이 압박하면서, 좌골 신경의 새로이 절개한 분절을 눈의 초자체 내로 이식하여 축삭 재생을 유도한다. 10㎕ PBS에 용해된 20㎍의 dsRhoA 화합물 또는 대조구 dsRNA 화합물(siCNL) 또는 10㎕ PBS 단독을 ONC 후 0, 7 및 14일째에 3회의 IVT 주입을 통해 전달한다(n=4). 5㎍의 BDNF가 주입된 군을 양성 대조군으로 이용한다. 21일째에 실험을 종료한다. GAP43 항체를 이용한 ON 절편의 면역조직화학 분석은 각각의 처리군에서 압박점을 초과하는 RGC 축삭 재생의 정도를 정량 및 정성적으로 측정하는 것을 가능하게 한다.
녹내장 모델에서 dsRhoA 화합물의 lOP 감소 효능
전술한 바와 같이 증가된 IOP를 유도한다. dsRhoA 시험 화합물 또는 대조군 dsRNA 화합물(siCNL) 또는 60ng의 란타노프로스트 또는 부형제 단독을, 수행된 실험에서 최상의 결과를 나타내는 전달 경로(예를 들어, IVT 주입, 점안 및 이들의 임의의 조합)중 하나의 경로를 통해 전달한다. IOP 감소에 대한 시험 RhoA dsRNA 화합물의 상대적 효능을 평가하기 위하여 IOP를 토노펜 엑스엘 안압계를 이용하여 일주일에 3회 측정한다.
세 동물 모델의 결과에 기반하여 최상의 생체 내 효능을 나타내는 선도 약물 후보군을 선택한다. 본원에서 제공되는 올리고뉴클레오티드 서열 및 구조를 이용하는 dsRhoA 화합물은 안질환, 장애 및 손상(예를 들어, 녹내장)을 치료하는데 유용하다.
선도 dsRhoA 약물 후보군을 이용한 처리 요법의 최적화(시신경 압박(ONC) 손상 모델, 망막 신경절 세포(RGC) 축삭 재생 모델, 증가된 안내압(IOP)모델에서의 투여량 반응 연구)
녹내장 모델에서 IOP 를 감소시키기 위한 선도 dsRhoA 화합물의 단계적 증가 투여량의 능력의 측정
증가된 IOP를 유도하고, 그 결과를 전술한 바와 같이 분석한다. 단계적으로 증가하는 투여량의 선도 dsRhoA 화합물을 IVT로 전달(단일 투여량으로서 5, 10, 20 및 40㎍의 10㎕), 또는 100㎍ siRNA가 14일간 20분의 간격을 두고 매일 3㎕ 체적으로 1회, 2회 또는 3회 전달되는 경우에는 점안액 형태(ED)로 투여하고, XX㎍ siRNA가 14일간 XX분의 간격을 두고 매일 X㎕ 체적으로 1회, 2회 또는 3회 전달되는 경우에는 점이액(ErD) 형태로 전달한다(n=4). siCNL을 음성 대조구로 이용하고, 라타노프로스트를 양성 대조구로 이용한다. IOP 감소에 대한 dsRhoA 화합물의 효능을 평가하기 위하여 IOP를 토노펜 엑스엘 안압계를 이용하여 1주일에 3회 측정한다.
쥐에서 ONC 후 RGC 생존을 유도하기 위한 단계적 증가 투여량의 dsRhoA 화합물의 능력의 측정
ONC 모델을 수행하고, 그 결과를 전술한 바와 같이 분석한다. 10㎕ PBS에 용해된 단계적으로 증가하는 투여량의 5, 10, 20 또는 40㎍의 dsRhoA 시험 화합물 또는 40㎍ siCNL 또는 10㎕ PBS 단독을 ONC 후, 0일째에 단일 IVT 주입을 통해 전달한다(n=4). BDNF가 주입된 눈을 양성 대조군으로 이용한다. ONC 후, 7일째에 연구를 종료한다.
실시예 5: 쥐에서 시신경 압박 후 RGC 축삭 재생을 유도하기 위한 단계적 증가 투여량의 dsRhoA 화합물의 능력을 측정하는 생체 내 연구
상기 연구를 수행하고 그 결과를 상기 ONC 모델에 대하여 기재한 바와 같이 분석한다. 10㎕ PBS에 용해된 단계적으로 증가하는 투여량의 10, 20 또는 40㎍의 시험 dsRhoA 화합물 또는 40㎍ dsEGFP 화합물 또는 10㎕ PBS 단독을 ONC 후, 0, 10 및 20일에 초자체(lVT) 주입을 통해 전달했다(n=4). 모양체 신경영양 인자(CNTF)가 주입된 군을 양성 대조군으로 이용했다. 30일째에 실험을 종료했다.
ONC 및 dsRNA 주입
200 내지 250g의 성숙한 암컷 윈스터 집쥐를 Hypnorm/Hypnovel 마취제(영국 옥스포드 소재 얀센 파마슈티칼스사(Janssen Pharmaceuticals))의 복막 내 주사를 통해 마취시키고, 양쪽 눈의 시신경(ON)을 안와내로 압박하여(ONC 모델) 모든 RGC 축삭을 완전히 절단했다. 모든 시약은 10㎕의 최종 체적으로 유리 마이크로피펫을 이용하여 초자체 내로 주입했다. 동물들은 ONC 후, 0일, 10일 및 20일에 하기의 것들로 처리했다:
(i) PBS;
(ii) 20㎍의 dsEGFP 대조 화합물 EGFP_5_S763_L1 dsRNA;
센스 가닥:
Figure 112013006138949-pct00049
안티센스 가닥:
Figure 112013006138949-pct00050
(mC, mG, mA 및 mU는 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드를 나타내고, C, G, A 및 U는 비변성 리보뉴클레오티드를 나타내고, $는 비말단 Pi를 나타냄),
(iii) 10㎍, 20㎍ 또는 40㎍의 dsRhoA 화합물 RHOA_4_S500("RhoA 배치 1이라고도 나타냄"):
센스 가닥:
Figure 112013006138949-pct00051
안티센스 가닥:
Figure 112013006138949-pct00052
(mC, mG, mA 및 mU는 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드를 나타내고, C, G, A 및 U는 비변성 리보뉴클레오티드를 나타냄).
(iv) 10㎍, 20㎍ 또는 40㎍의 dsRhoA 화합물 RHOA 29 S73("RhoA 배치 2"):
센스 가닥:
Figure 112013006138949-pct00053
(서열번호: 166)
안티센스 가닥
Figure 112013006138949-pct00054
(서열번호: 170)
(mC, mG, mA 및 mU는 2'OMe 당 변성 리보뉴클레오티드를 나타내고, C, G, A 및 U는 비변성 리보뉴클레오티드를 나타내고, $는 비말단 Pi를 나타냄), 또는
(v) 5㎍ CNTF (영국 런던 소재 펩프로텍사(Peprotech Ltd)).
ONC 후 30일에, 동물을 CO2에 노출시켜 희생시키고, 4% 포름알데히드(영국 알더마스톤 소재 탭 라보레토리즈사(TAAB Laboratories))를 심장 내로 관류했다. 망막을 절개해내고, 30분간 4% 포름알데히드(탭 라보레토리즈사)에 고정한 다음, PBS로 각각 30 분간 3회 세척했다. 다음에, 눈 및 시신경을 10, 20 및 30% 수크로스에서 각각 2 시간 동안 동결보호하고, O.C.T. 화합물에서 시료를 블로킹한 다음, 건조한 얼음 위에서 동결했다. 15㎛ 절편을 저온장치(cryostat)를 이용하여 절단하고 슈퍼프로스트(Superfrost) 슬라이드에 부착한 다음, 필요시까지 -20℃에서 보관했다.
RGC 카운트
시신경 유두가 눈에 보이는 지점에서 취한 눈의 절편을 실온에서 30분간 해동한 다음, 헤마톡실린(영국 풀 소재 시그마사(Sigma))으로 2분간 염색하고, 흐르는 수돗물로 2분간 세척하고, 스콧트스(Scotts) 수돗물로 1 분간 세척한 다음, 이오신(시그마사)으로 30초간 염색했다. 다음에, 그 절편을 흐르는 수돗물로 2분간 세척하고, 등급 있는 일련의 알코올을 통해 각각 1 분간 탈수시키고, 히스토클리어(Histoclear)에 1분 및 3분간 침적시킨 다음, 벡타마운트(Vectamount ; 영국 피터보로우 소재 벡터랩스사(Vector Labs))에 마운팅했다. 서로 등거리이고 망막의 전체 외주를 둘러싸는 각 망막의 5개의 부위를 이용하여 신경절 세포층에 존재하는 RGC들의 수를 측정했다. 조건당 5개 부위 및 4개 망막으로부터의 측정치들을 총계하고 평균하여 평균 RGC 측정치/망막±표준편차(SD)로 나타낸다.
면역조직화학적 분석
이중 면역형광 염색을 위하여, 절편을 100% 에탄올에 1 분간 고정하고, 인산염 완충액(PBS)으로 3회 세척하고, 0.1% 트리톤 엑스100(Triton X100)에 투과시키고, 세척하고, 블로킹한 다음, 0.5% 우혈청 알부민(BSA; 시그마사) 및 0.05% 트윈(Tween) 20(PBST-BSA)(시그마사)을 함유하는 PBS에 희석된 적절한 일차 항체(표 3)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양했다.
사용된 항체의 특성
항체 공급원 희석비
생쥐 항 GAP43 자이메드랩스사(Zymed Labs) 1:500
토끼 항 라민닌 시그마사 1:200
생쥐 항 토끼 CD68(ED1) 세로텍사(Serotec) 1:500
토끼 항 인간 피브로넥틴 시그마사 1:500
토끼 항 NG2 케미콘사(Chemicon) 1:500
생쥐 항 GFAP 시그마사 1:500
다음에, 절편을 PBS로 세척하고, PBST-BSA에 1:400으로 희석된 적절한 형광 표지 2차 항체(Alexa-488 또는 Texas Red; 미합중국 오레곤 소재 몰레큘라프로브스사(Molecular Probes))와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양한 다음, PBS로 세척하고, DAPI를 함유하는 Vectashield(벡터랩스사)에 마운팅했다. 대조군은 일차 항체 또는 특정 면역글로블린G(IgG) 대조구가 없는 절편을 포함했다. 절편을 자이스(Zeiss) 형광 현미경(영국 허트포드셔 소재 자이스사(Zeiss))하에서 관찰하고, 액시오비젼(Axiovision®) 소프트웨어에 의해 조절되는 액시오캠(AxioCam®HRc ; 자이스사, Version 4,2)를 이용하여 10배 배율(최초의 100배 배율)로 이미지를 얻었다. 모든 이미지들을 어도비 포토샵(Adobe Photoshop CS3(미합중국 캘리포니아주 산호세 소재 어도비시스템즈사(Adobe Systems))에 수집했다.
결과: dsRhoA 처리 후 평균 RGC 생존이 도 2에 도시되어 있다.
dsEGFP 화합물과 비교한 RhoA dsRNA 화합물에 의한 RGC 생존의 증진이 도 3에 도시되어 있다.
그 결과들로부터, dsRhoA 화합물 RHOA_29_S73("RhoA 배치 2"라고도 나타냄")은 30일에서 유의한 RGC 생존을 증진한 것이 확인된다. 이러한 dsRhoA 화합물로 서치 시, PBS 처리 대조군과 비교하여 50% 이상의 RGC 생존이 손상 후, 30일에 관찰되었고, CNTF 처리 대조군과 비교하여 약 20% 이상의 RGC 생존이 생존 후 30일에 관찰되었는데, 이는 오늘날의 신경보호 요법에 대한 유의한 진전을 나타낸다.
쥐의 망막 및 이의 조직 분포에 대한 시험 dsRhoA 화합물의 투여량-의존적인 약력학적 효과
8마리의 무손상의 집쥐(n=8)의 군들을 단계적으로 증가하는 투여량(5, 10, 20 및 40㎍)의 시험 dsRhoA 화합물 또는 대조 dsRNA 화합물(siCNL)로 IVT 주입하고 24 시간 후 희생시킨다. 군당 6 마리 쥐의 눈을 적출하고, 망막을 절개하고 RLM-RACE를 이용한 dsRNA 정량, mRNA 녹아웃 측정 및 RNAi 확인을 위해 사용한다. 군당 두 마리의 나머지 집쥐는 4% PFA를 심장 내 관류하고, 눈을 적출하고, 고정 및 파라핀에 포매하여, 눈에서 dsRNA 분포의 원위치(in situ) 혼성화 검출에 사용한다.
실시예 6: 최적 투여량/모델/전달 경로의 선택
dsRNA 효과의 지속 기간의 평가
시험 dsRhoA 화합물의 단일 투여의 치료 효과의 지속기간을 위에서 확인한 최적 조건하에서 분석한다. 평가 종점은 녹내장 모델에서 IOP 저하 활성의 지속기간 및 망막에서 RhoA 녹다운 효과의 지속기간이다.
고 IOP 모델에서 dsRhoA 시험 화합물 효과의 지속기간
고 IOP 모델을 전술한 바와 같이 유도한다. 집쥐(n=4)를 IVT를 통해 최적 투여량의 시험 dsRhoA 화합물로 처리하거나 전술한 바와 같이 확인된 최적 ED 요법(하루에 걸쳐서)으로 처리한다. 대조군 동물은 siCNL로 유사하게 처리한다. 시험 dsRhoA 후보 화합물의 효능 및 효과 지속 기간을, 약물 작용이 끝난 후 dsRhoA 군에서 IOP가 다시 상승할 때까지 IOP를 매일 측정하여 조사한다. 이론에 구속되지 않고, 이러한 시간은 섬유주대(trabecular meshwork)에서 dsRhoA RNAi 효과의 지속기간에 해당하는 것으로 판단된다.
망막에서 dsRhoA 시험 화합물의 약동학적( RNAi ) 효과의 지속기간
망막에서 시험 dsRhoA 후보 화합물의 효과 지속 기간을 확인하기 위하여, 전술한 바와 같이 확인된 최상 IVT 투여량의 dsRhoA 화합물을 미투여(naive) 쥐 내로 단일 IVT 주입 형태로 투여한다. 별개의 군의 쥐에는 동일 IVT 투여량의 siCNL을 투여한다. 주입 후 1, 2, 3, 5, 7, 10 및 14일째에 동물들을 희생시킨다(시점당 n=6). 눈을 적출하고, 망막을 절개하여 (1) 스템앤드루프(Stem&Loop) qPCR을 이용한 dsRNA 정량, (2) qPCR을 이용한 표적 녹아웃 측정 및 (3) RLM-RACE를 이용한 RNAi 확인에 사용한다.
실시예 7: 쥐의 시신경 압박( ONC ) 모델에서 신경 생존 및 축삭 재생에 대한 RhoA 표적 dsRNA 화합물의 효과
연구 디자인: 군에 대한 종료는 ONC 후 30 또는 50일이다. 모든 군에 대한 dsRNA 투여는 10일 마다 양측 초자체내 주입(IVT)을 통해 이루어진다. 군 1 내지 12 양측 ONC를 받는다. 각각의 쌍의 눈은 동일한 처리를 받는다.
[표 4] 연구 디자인
Figure 112013006138949-pct00055
Figure 112013006138949-pct00056
실험 디자인:
Figure 112013006138949-pct00057
측정된 종점:
고정 및 동결된 조직 절편의 조직 분석:
a) 시신경에서 RGC 축삭 재생을 위한 GAP43;
b) 망막에서 RGC 생존을 위한 TUJ1.
시험 dsRNA는 본 명세서에서 개시되어 있다. CNTF가 주입된 군을 양성 대조군으로 이용한다. 실험은 50일째에 종료되는 군 2를 제외하고 모든 군의 경우 30일째에 종료된다.
ONC 및 siRNA 주입
200 내지 250g의 성숙한 암컷 윈스터 집쥐를 Hypnorm/Hypnovel 마취제(얀센 파마슈티컬즈사)의 복막 내 주사를 통해 마취시키고, 양쪽 눈의 ON들을 안와내로 압박하여(ONC) 모든 축삭을 완전히 절단했다. 모든 시약은 10㎕의 최종 체적으로 유리 마이크로피펫을 이용하여 초자체 내로 주입했다. 동물들을 표 4의 연구 디자인에 따라 처리한다.
ONC 후, 30일 또는 50일 째에(연구 디자인에 따라), 동물들을 CO2에 노출시켜 희생시키고, 4% 포름알데히드(탭 라보레토리즈사)를 초자체내로 관류한다. 망막을 절개해내고 4% 포름알데히드(탭 라보레토리즈사)에 30분간 침적 고정한 다음, PBS로 각 30분씩 3회 세척한다. 다음에, 눈 및 ON을 10, 20 및 30% 수크로스에서 각각 2 시간 동안 동결보호한 다음, OCT에서 시료를 블로킹하고, 건조 얼음 위에서 동결한다. 15㎛ 두께 절편을 저온장치를 이용하여 절단하고, 슈퍼프로스트 슬라이드에 부착시키고 필요시까지 -20℃에서 보관한다.
RGC 카운트
시신경 유두가 눈에 보이는 지점에서 취한 눈의 절편을 실온에서 30분간 해동한 다음, 헤마톡실린(시그마사)으로 2분간 염색하고, 흐르는 수돗물로 2분간 세척하고, 스코트스 수돗물로 1 분간 세척한 다음, 이오신(시그마사)으로 30초간 염색했다. 다음에, 그 절편을 흐르는 수돗물로 2분간 세척하고, 등급 있는 일련의 알코올을 통해 각각 1분간 탈수시키고, 히스토클리어에 1분 및 3분간 침적시킨 다음, 벡터마운트(벡터랩즈사)에 마운팅했다. 서로 등거리이고 망막의 전체 외주를 둘러싸는 각 망막의 5개의 부위를 이용하여 신경절 세포층에 존재하는 RGC들의 수를 측정했다. 조건당 5개 부위 및 4개 망막으로부터의 측정치들을 총계하고 평균하여 평균 RGC 측정치/망막±표준편차로 나타낸다.
면역조직화학적 분석
이중 면역형광 염색을 위하여, 절편을 100% 에탄올에 1 분간 고정하고, 인산염 완충액(PBS)으로 3회 세척하고, 0.1% 트리톤 엑스100에 투과시키고, 세척하고, 블로킹한 다음, 0.5% 우혈청 알부민(BSA; 시그마사) 및 0.05% 트윈 20(PBST-BSA)(시그마사)을 함유하는 PBS에 희석된 적절한 일차 항체(표 3)와 함께 4℃에서 밤새 배양한다.
다음에, 절편을 PBS로 세척하고, PBST-BSA에 1:400으로 희석된 적절한 형광 표지 2차 항체(Alexa-488 또는 Texas Red; Molecular Probes, Oregon, USA)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양한 다음, PBS로 세척하고, DAPI를 함유하는 벡타쉴드(Vectashield ; 벡터랩즈사)에 마운팅한다. 대조군은 일차 항체 또는 특정 면역글로블린 G 대조구가 없는 절편을 포함한다. 절편을 자이스 형광 현미경(Zeiss, Hertfordshire, UK)하에서 관찰하고, 액시오비젼® 소프트웨어에 의해 조절되는 액시오캠®HRc(Zeiss, Version 4,2)를 이용하여 10배 배율(최초의 100배 배율)로 이미지를 얻는다. 모든 이미지들을 어도비포토샵 CS3(Adobe Systems, San Jose, CA, USA)에 수집한다.
본원에 개시한 dsRhoA 화합물을 본 실험에서 시험한 결과, 신경 보호를 유도하는 것으로 확인된다. ONC 후에 구조된 RGC들의 수는 dsEGFP 대조구 dsRNA로 처리한 군에서보다 dsRhoA 처리군에서 유의하게 높다.
실시예 8: 피질 신경세포의 보호
dsRhoA 화합물의 시험관 내 세포보호 효과를 평가하기 위하여, 배양 증식한 생쥐의 피질 신경세포를 NMDA에 5분간 노출시키고, 락테이트 디히드로게나제의 방출을 측정하여 24시간 후의 세포사를 측정한다(문헌 Choi 외, J. Neurosci. 7: 357, 1987). 가능한 치료 효능을 확인하기 위한 또 다른 시험은 생체 내 뇌졸중 모델을 포함한다. 이러한 모델에서, 뇌에 대한 주요 동맥을 죄어서 혈액 공급을 일시적으로 차단한다.
실시예 9: 메니에르병(Meniere's Disease)에 대한 모델계
본원에서 개시한 dsRhoA 화합물은 메니에르병으로 고생하는 환자의 청력 손실을 약화 또는 치료하는데 유용하고, 이론에 구속되지 않고, 메니에르 병과 관련이 있는 신경세포 손상으로부터 청각 신경 세포를 보호하는 작용을 한다. 메니에르 병을 치료하는데 있어서 또는 메니에르 병에서의 신경보호 및/또는 신경세포 재생 인자로서의 dsRhoA 화합물을 시험하기 위한 예시적인 모델로는 하기의 문헌에 기재된 것들이 있다:
[Sheykholeslami K, Megerian CA, Zheng QY. Vestibular evoked myogenic potentials in normal mice and Phex mice with spontaneous endolymphatic hydrops. Otol Neurotol. 2009 Jun;30(4):535-44; Megerian CA, Semaan MT, Aftab S, Kisley LB, Zheng QY, Pawlowski KS, Wright CG, Alagramam KN. A mouse model with postnatal endolymphatic hydrops and hearing loss. Hear Res. 2008 Mar;237(1-2):90-105; Semaan MT, Alagramam KN, Megerian CA. The basic science of Meniere's disease and endolymphatic hydrops. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 2005 Oct;13(5):301-7].
실시예 10: 메니에르 병의 생쥐 모델에서 청력 상실을 약화 또는 치료하는데 있어서 dsRhoA 화합물의 효능을 측정하는 시험관 내 연구
연구 목적:
기능 및 조직 평가를 이용함으로써 메니에르 병의 생쥐 유전적 모델에서 4 개의 선택된 dsRNA 화합물의 효능의 평가.
연구 디자인
[표 5] 연구 디자인
Figure 112013006138949-pct00058
주: "P"는 "출생후 일수"의 약어임.
29일째부터 매주 시험 또는 대조 시료의 투여 시 및 투여 전에 기능 시험을 수행한다. dsRNA 투여는 40 내지 60 분간의 동물 고정(마취)을 필요로 한다. 동일 연령의 손상되지 않은 무처리 생쥐에 대한 기능적 시험을 기선 대조구로 이용한다.
점안액을 통한 시료의 적용
마취: 생쥐를 체중 1㎏ 당 4㎖의 이퀴테신(Equithesine)으로 마취시킨다(복막 내, I.P.).
외이도(우측 (REAC) 점이액(ErD)) 전달: 3㎕의 시료 체적(따뜻한 10% 글리세롤계 점이액, 37℃)을 무딘 피펫 팁을 이용하여 우측 외이도(REAC)에 투여한다. REAC ErD 투여 동안 및 이후에, 생쥐들을 한 시간 동안 반대로 측면으로 누운 상태로 유지하고, 의식을 회복한 후, 케이지에 복귀시킨다.
10% 글리세롤에서 제형화 시료의 제조 - 시험 물질의 설명
dsRNA를 멸균 조건하에서 동결건조를 통해 침전시킨다.
10% 글리세롤 용액을 시험 화합물에 첨가하고 15분간 정치한다. 다음에, 10초간 휘젓기(vortexed)한다. 적용 전에, 점이액을 37℃로 조절한다.
종료 시, 생쥐의 내이를 절개하고, 고정하고, 파라핀에 포매하고, 청각 구획 및 전실 구획의 형태 외에도 나선형 신경절의 형태를 가지도록 절단한다. 슬라이드를 이용하여 내이 형태의 조직학적 평가를 실시한다.
슬라이드 당 두 개의 5 미크론 절편을 포함하는 귀당 6개의 슬라이드를 내이에서의 dsRNA 분포의 원위치 혼성화 분석에 사용한다. 손상되지 않은 무처리 생쥐 귀의 15개 슬리이드를 그 계의 검정에 사용한다.
이러한 연구에서 본원의 RhoA dsRNA 화합물을 시험한 결과, 6주의 모델 유도시, RhoA dsRNA는 비히클 처리군 및 대조 dsRNA 처리군과 비교하여 RhoA dsRNA 처리 생쥐의 모든 기능성 시험에서 유의한 개선을 유도한다는 것이 확인된다. 이러한 개선은 연구의 종료시까지 유지된다. 이러한 결과는 본원의 RhoA dsRNA 화합물이 메니에르 병을 치료하는데 유용하다는 것을 나타낸다.
실시예 11: 각막 신혈관 생성을 위한 모델계
본 연구의 목적은 각막 신혈관생성의 쥐과 봉합 모델에서 결막 하 주사에 의해 적용된 RhoA dsRNA 화합물의 치료 효과의 평가이다.
연구 디자인은 각각 5마리 생쥐를 포함하는 9개의 실험군을 포함한다. 각각의 생쥐의 양쪽 눈의 각막을 2 지점에서 11-0 나일론으로 봉합하여 각막 신혈관생성을 유도한다. 스크래핑(scraping)과 다르게, 봉합은 약 2주 내에 신혈관 생성을 제공하고, 눈들 사이의 혈관 성장의 더욱 큰 균일성을 제공하고, 더욱 많은 신혈관 생성을 유도한다. 각막 봉합 후 1일째에, 시험 dsRhoA 화합물 및 대조 PBS 비히클을 양쪽 눈에 결막하 주사한다. 다음에, dsRhoA 화합물 또는 PBS 비히클을 3, 7 및 10일째에 일주일에 2회 주사한다(총 4회 적용).
결막 하 주사가 신혈관 생성을 유도하는 가능성에 대한 대조를 위하여, dsRNA 화합물이 없는 비히클 주사를 이용하는 대조구 #9를 포함시킨다(표 6).
[표 6] 연구 디자인
Figure 112013006138949-pct00059
마취: 생쥐를 케타민/자일라진 또는 아베르틴으로 마취시킨다. 모든 생쥐의 각막을 5 마이크로미터의 프로파라카인(국소 마취제)으로 마취시킨다.
각막 봉합 과정: 각 생쥐의 양쪽 눈의 각막을 2 지점에서 11-0 나일론사로 봉합한다. 각막 봉합의 목적은 각막 신혈관 생성을 유도함에 있다. 봉합은 약 2주 내에 신혈관 생성을 제공한다. 스크래핑과 다르게, 봉합은 혈관 성장을 눈들 사이에 더욱 일관성있게 하고 더욱 많은 신혈관 생성을 유도한다.
수술 과정:
A) 생쥐를 아베르틴으로 마취한다.
B) 생쥐의 수염 및 과도하게 긴 눈썹을 가위로 절단한다.
C) 2-1-1 매듭을 이용하여 각막의 중심과 가장자리 사이의 12시 위치에서 첫 번째 11-0 나일론 봉합을 수행한다. 각막 내피 천자 봉합은 신혈관 생성을 유도하고 봉합을 적소에서 유지하기 위한 것이다.
D) 2-1-1 매듭을 이용하여 각막의 중심과 가장자리 사이의 6시 위치(첫 번째 봉합과 반대 위치)에서 두 번째 11-0 나일론 봉합을 수행한다.
E) 국소용 바시트라신 항생 연고를 눈 표면에 바른다.
F) 생쥐를 그의 케이지에 복귀시키고 보행시까지 관찰한다.
G) 다음날 생쥐를 검사하고 항생 연고를 바른다.
결막 하 주사:
봉합 후, 1일째 및 그 후 3, 7 및 10일째에, 생쥐에게 하기와 같이 1주일에 2회 양측 결막 하 주사한다:
a. 생쥐를 아베르틴으로 마취한다.
b. 생쥐를 JMEC A0612에서 수술용 현미경 하에 수재순환 가열 패드 상에 위치시킨다.
c. 5㎕의 트로피카미드(팽창) & 5㎕의 프로페리카인(국소 마취)을 마이크로피펫을 이용하여 각각의 눈에 국소 투여한다.
d. 임의의 과도하게 긴 눈썹을 바나스(vannas) 가위를 이용하여 다듬는다.
e. 32게이지의 기밀 마이크로주사기(Hamilton Company)를 양쪽 눈의 결막아래에 삽입하여 가장자리를 지나 1 mm 위치에 dsRhoA 화합물 또는 PBS(대조구)를 전달한다.
f. 바늘을 제거하고 국소용 바시트라신 항생 연고를 눈 표면에 바른다.
g. 생쥐를 케이지에 복귀시키고 보행시까지 관찰한다.
h. 다음날 눈을 검사하고 항생 연고를 다시 바른다.
평가
데이터 생성 및 분석
각막 맥관구조(신혈관 생성)의 이미지: 수술용 현미경에 부착된 카메라를 이용하여 현미경 사진을 찍는다. 연구의 각 단계에서 동일 위치를 비교한다(매주, 양쪽 눈의 봉합부 주변). 각막의 신혈관 생성을 혈관의 면적 및 세기에 따라 1 내지 5로 등금을 매긴다:
a. 0 - (신혈관생성 없음);
b. 1 - (가장자리로부터 약하고 조그마한 혈관);
c. 2 - (가장자리와 각막 봉합부 사이에서 성장하는 신혈관);
d. 3 - (봉합부까지 및 그 주변의 신혈관);
e. 4 - (봉합부까지 및 그 주변의 두껍고 비비꼬인 신혈관);
f. 5 - (봉합부 상에 존재하고 각막 중심부를 향하는 두껍고 비비꼬인 신혈관).
혈관 내피세포의 면역조직 화학적 염색: 생쥐의 눈(양쪽 눈)을 수집하고, 각막의 남아있는 가장자리 및 홍채를 다듬는다. 혈관 내피세포의 면역조직화학적 염색을 가면을 쓴 연구자에 의해 각막의 평평한 마운트 상에서 수행한다. 새로운 각막을 절개하고, 인산염 완충액(PBS)에 30분간 세정하고, 100% 아세톤(시그마사)에 20분간 고정한다. PBS에서 세척한 후, 비특이적 결합을 4℃에서 3일 밤 동안 O.1M PBS 및 2% 알부민(시그마사)을 이용하여 블로킹한다. 4℃에서 밤새, 0.1M PBS 및 2% 알부민에서 1:200 농도의 LYVE-l(토끼, ab 14917) 및 1:500 농도의 플루오레세인 이소티아시아네이트(FITC) 접합 모노클로날 항-생쥐 CD31 항체와 함께 배양한 다음, 1 시간 동안 1:1000 항-토끼 항체-A546(All 010)와 함께 배양하고, 실온에서 PBS로 세척한다. 각막에 항페이딩제(Gelmount; Biomeda, San Francisco , CA)를 첨가하고 형광 현미경을 이용하여 시각화한다.
신혈관생성의 디지털 정량: 혈관내피 세포에 대한 면역화학적 염색 및 각막의 평평한 마운팅 후, 형광 카메라에 부착된 카메라를 이용하여 각막 맥관구조의 이미지를 얻는다. 그 이미지를 상업적인 소프트웨어(Microscope Software AxioVision LE)를 구비한 컴퓨터상에서 분석하고, 각막 신혈관 생성을 정량한다. 각막 신혈관 생성의 디지털 정량을 수행한다. 형광 현미경에 부착된 CD-330 전하 결합 장치(CCD) 카메라를 이용하여 각막 맥관구조의 이미지를 얻는다. 그 이미지를 LSM-5 Image Examiner (Zeiss, Hamburg, Germany)를 이용하여 분석하고, 624 3 480 화소로 분해하고, 태깅 이미지 파일 포멧(TIFF) 파일로 전환했다. 혈관만이 포착되는 한계 수준의 형광을 설정함으로써 신혈관 생성 및 림프혈관 생성을 정량한다. 표본채취 바이어스를 최소화하기 위해 전체의 마운트된 각막을 분석한다. 신혈관 생성 및 림프혈관 생성의 정량은 차폐 방식(masked fashion)으로 수행한다. 그 전체 각막 부위의 윤곽을, 경계로서 각막 가장자리의 최내측 혈관을 이용하여 나타낸다. 신혈관 생성 및 림프혈관 생성의 전체 면적을 전체 각막 면적에 대하여 표준화한다.
본원에서 제공되는 올리고뉴클레오티드 서열 및 구조를 이용하는 dsRhoA 화합물을 이러한 모델에서 시험한 결과, CNV 유발 눈에서 신혈관 생성의 감소를 유도하는데 유용한 것으로 확인된다. dsRhoA 화합물 처리군에서 측정된 혈관의 수는 dsEGFP 화합물 처리군과 비교하여 유의하게 작다.
실시예 12: 정상 쥐에서 상이한 투여 방식에 따른 망막 신경절 세포( RGC )의 RhoA 표적 dsRNA 화합물에 의한 RhoA mRNA 절단의 평가
본 연구의 목적은 본원에서 기재한 dsRhoA 화합물을 이용하여 쥐 망막 신경절 세포(RGC)의 RhoA mRNA의 지시된 절단의 증거를 얻는데 있다. RACE(cDNA 말단의 신속 증폭) 분석을 본원에서 기재한 화합물의 하기의 세 가지 상이한 투여 방식에 따라 수행한다: 경고막(TT), 점이액 형태(ErD) 또는 초자체 내 주입(IVT).
시험 물질
(i) (제형화하지 않은 화합물): RhoA mRNA에 대한 본원의 물질 dsRNA 화합물
(ii) 제형화(제형화된 화합물): PBS에서 2㎎/㎖의 dsRNA 화합물-IVT 군 1 내지 6에 대한 것(112㎕의 6개 튜브로 나눈 672㎕ 용액 내의 1344㎍ dsRNA 화합물 (2㎎/㎖))
(iii) 제형화(제형화된 화합물): PBS 중의 (400㎍/30㎕/귀) dsRNA 화합물-TT 군 7 내지 10에 대한 것 (168㎕ PBS 용액에서 4.48㎎ siRNA(13.3㎎/㎖)를 함유하는 4개의 튜브)
(iv) 제형화(제형화된 화합물): 10% 글리세롤에서 (200㎍/10㎕/귀) dsRNA 화합물-ErD 군 11 내지 14에 대한 것(56㎕ 10% 글리세롤 용액에서 2.24㎎ siRNA(20㎎/㎖)를 함유하는 4 개의 튜브).
대조물질(들)(양성/음성 대조구 및 비히클 포함)
(i) 비히클 PBS x1 - TT 및 IVT의 경우
(ii) 비히클 - 실험을 위해 새로이 제조한 발열물질이 없는 물에서 10% 멸균 글리세롤 용액 - ErD의 경우.
시험계
사용된 동물: 10 내지 12주령의 스프라그 다우리(Sprague Dawley)™ Hsd : Sprague Dawley TM SD TM (SD) 집쥐
출처: 할란(Harlan ; 이스라엘 예루살렘)
체중 범위: 270 내지 320g
성별: 수컷
군의 크기: n=4/l2
동물의 총수: 80.
동물 사육: 사료: 동물에게 상업적인 설치류 사료(설치류용 할란 테크라드(Harlan Teklad) 사료)를 자유로 제공하고 음료수에의 자유 접근을 가능하게 한다.
환경: (i) 적어도 5일의 적응. (ii) 모든 동물은 전체 연구 기간 동안 환경 조절 수용 조건에서 제한된 접근 설비에 가두고, 승인된 표준 조작 과정(SOP)에 따라 유지한다. 자동 조절된 환경 조건은 연구실에서 20 내지 24℃, 30 내지 70% 상대 습도(RH)에서 12시간 간격의 명암주기로 시간 당 15 내지 30분간의 공기 변화를 유지하도록 설정한다. 온도, 상대습도(RH) 및 명 주기는 컨트롤에 의해 모니터한다.
실험 디자인
일반사항: 실험 구성은 16개의 실험군(각각 4 또는 12마리 쥐, 표 7의 연구 디자인)을 포함한다. 실험군 1 내지 6의 쥐에는 20㎍/10㎕의 RhoA dsRNA 화합물을 양측에 주사한다(IVT). 실험군 7 내지 10의 쥐에는 30㎕ PBSx1에 용해된 400㎍ RhoA dsRNA 화합물을 일측에 TT 주사한다(한쪽 귀). 실험군 11 내지 14의 쥐는 10㎕ 글리세롤 10%에 용해된 200㎍ RhoA dsRNA 화합물을 이용하여 우측귀에 점이액을 단일 일측 적용하여 처리한다. 군 15 내지 16은 무손상 대조군으로 이용한다. 안락사 및 시료 수집은 연구 디자인(표 7)에 따라 수행한다. 절개한 망막을 양성 세포로 분리하거나 표 7에서 기재한 바와 같이 qPCR 분석한다.
[표 7] 연구 디자인
Figure 112013006138949-pct00060
Figure 112013006138949-pct00061
마취 및 전약물처리 :
IVT 주입: 동물은 이소플루란 특수 회로 시스템(Stoelting, USA)을 이용하여 마취한다; 작업 구성: 600 내지 200㎖/분 02 유속으로 O2에서 3 내지 4.5% 이소플루란.
ErD 및 TT 처리: 전신 마취 전에, 모든 동물은 이소플루란 특수 회로시스템(Stoelting, USA)을 이용하여 가볍게 마취한다; 작업 구성: 600 내지 200㎖/분 02 유속으로 O2에서 3 내지 4.5% 이소플루란(3-4 분). 다음에, 이퀴테신으로 깊이 마취한다(복막내, I.P; 4㎖/㎏).
고막내 주입(TT): 30㎕ 시료 체적(따뜻한 시험 물질)을 0.3㎖ 주사기를 이용하여 고막을 통해(TT) 서서히 적하한다. 이러한 체적을 좌측의 중이 공동부에 전달한다. TT 적하 동안 및 이후에, 쥐들을 반대로 측면으로 누운 상태로 약 1시간 동안 유지하고, 의식을 회복한 후 케이지에 복귀시킨다. TT 적하는 쌍안 현미경 하에서 수행한다.
우외이도(REAC)에의 ErD 적용: 10㎕ 시료 체적(따뜻한 10% 글리세롤계 점이액)을 무딘 피펫 팁을 이용하여 REAC 내로 서서히 적하한다. REAC 적하 동안 또는 이후에, 쥐들은 약 1 시간 동안 반대로 측면으로 누운 상대로 유지하고, 의식을 회복한 후, 케이지에 복귀시킨다.
스케줄에 따른 안락사: 모든 동물은 이퀴테신(4㎖/㎏; I.P)으로 깊이 마취하고 연구 디자인(표 7, 시점)에 따라 안락사시킨다.
조직 수집: 양쪽 눈을 적출하고 망막을 절개하고 처리하여 하기와 같이 분석한다:
"분해 처리": 망막의 분석 처리 A 군으로부터의 양쪽 눈을 적출하고 얼음위에서 보관한다. 그 눈을 절개한다. 각각의 눈은 한 마리의 동물의 2개의 절개 망막을 함유한다. 절개된 망막을 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 6㎖ PBS가 채워진 15㎖ 튜브에 옮긴다. 그 튜브를 실온으로 옮기고 RGC를 분리한다.
RGC 분리: 망막의 튜브로부터의 세포를 "천연 조직-분해 키트-출생후 신경세포"(Miltenyi Biotec Cat#130-094-202)를 이용하여 제조 프로토콜에 기재된 바와 같이 분해한다. 다음에, 항 CD11b 마이크로비드(BD IMagTM, Cat# IMAG558013)를 이용하여 대식 세포를 제거하고, CD11b 비결합 분획으로부터의 세포를 제조 프로토콜에 기재된 바와 같이, "CD90.1 결합" 및 "CD90.1 비결합" 개체를 가지도록 PE 마이크로비드(BD IMagTM, Cat# 557899)에 의한 RGC 분리를 위해 항 CD90.1-PE Ab (eBioscience, Cat N 12-0900-83, Lot N E0138-253)로 염색한다. RGC의 순도를 FACS로 측정한다("결합된" 개체에서 CD90.1 순도 수준에 따른 시료 TBD의 실격).
전체 망막 처리: "망막 분석 처리군 B"로부터의 절개한 망막을 적출하고 얼음위에 보관한다. 그 눈을 절개하고, 적절한 시험 튜브(각 튜브는 1마리 동물로부터의 2개의 절개된 망막을 함유함)에 수집하고, 액체 질소에 즉시 동결하고, 전체 RNA의 추출 및 분석을 위해 운반한다.
평가
각각의 풀링된(pooled) 망막 쌍의 분석 처리 A 및 B로부터의 모든 시료를 RNA 추출한 다음, RhoA 절단 생성물을 RACE 분석 또는 유전자 발현을 평가한다.
RACE 분석: 쥐 망막의 RhoA 화합물 매개 절단을, 모든 연구 군으로부터의 풀링된 망막 쌍에서 RACE (cDNA 말단의 신속 증폭) 분석을 이용한 절단 생성물의 검출을 통해 측정한다. 그 절단 부위를 서열 분석을 통해 확인한다.
시료의 RNA 분리: 모든 군으로부터, RNA를 RGC의 (결합) 및 비결합 시료로부터 처리한다. 이중 추출을 통한 EZ RNA의 전체 RNA 분리. RNA의 일부를 cDNA로 제조하고 qPCR 분석한다.
본원에 기재한 dsRNA 화합물을 이러한 연구에서 시험한 결과, RhoA mRNA 직접 절단을 발생하는 것으로 확인된다.
실시예 13: 쥐에서 신경병성 통증의 척수 신경 결찰 ( SNL 또는 Chung ) 모델에서 dsRhoA 화합물의 항-자극 및 진통 활성의 생체내 연구
본 연구의 목적은 쥐에서 신경병성 통증에 대한 척수 신경 결찰(SNL 또는 Chung) 모델에서 본원의 dsRhoA 화합물의 항자극 및 진통 활성을 평가함에 있다.
연구 0일째에, 모든 동물을 좌측 L5-L6 척수 신경을 분리 및 절단하는 수술로 구성되는 청(Chung) 수술을 시행한다. 수술 일에 1M, 5M, 7M 및 9M 군의 동물에게 ALZET 삼투 펌프를 피하 이식하고 시험 물질로 연속적으로 처리한다. 펌프 성능의 지속 기간은 28일 반면에, 펌프는 0일에서 14일까지 시험 물질을 방출하고 14일에서 18일까지 식염수를 방출하거나 펌프는 0일에서 14일까지 식염수를 방출하고 14일에서 28일까지 시험물질을 방출한다. 2M, 4M, 6M 및 8M 군의 동물에게는 손상 후 1일 또는 14일째에, L4 내지 L5 수준으로 척수 공간에 삽입되는 척수강 내(IT) 튜브를 통해 환약 형태로 서서히 투여한다.
연구 디자인은 표 8에 기재되어 있다. 약어: 척수강 내 펌프(IT pump) - 척수강내 펌프 이식; 척수강 내 단일 요추 주입 - 요추 영역에 척수강 내 주입.
[표 8] 연구 디자인
Figure 112013006138949-pct00062
Figure 112013006138949-pct00063
*주: 이러한 군의 동물은 TI 투여되지 않는 날에 척수강 내 펌프 주입을 통해 염수를 주입한다. 5M 및 9M 군은 15일부터 28일까지 12㎕/day의 0.9% 식염수를 IT 투여한다. 7M 군은 0일부터 13일까지 12㎕/day의 0.9% 식염수를 IT 투여한다.
**주: 펌핑 속도는 0.5㎕/hr (±0.1㎕/hr)이다. 펌프 성능의 지속기간은 14일이다. 저장 용량은 200㎕이다.
시험 과정:
청(Chung) 유발 모델의 원리: 정 모델은 동물이 수술에서 깬 후 즉시 동물의 통증 한계치의 측정을 가능하게 하는 신경병증성 통증에 대한 신뢰가능한 모델이다.
수술 및 처리의 개략적 설명이 도 4 및 도 5에 도시되어 있다.
도 4는 펌프 이식 및 가바펜틴 처리를 통해 투여된 시험 물질에 대한 것이다. (*주: 처음 14일간(0일 내지 14일) 식염수를 적가한 다음, 14일 내지 28일의 추가의 14일 동안 약물을 인가한다(7M 군)).
도 5는 단일 요추 주입을 통해 투여된 시험 물질에 대한 것이다.
연구 스케줄 (연구 1일째 내지 연구 28일째)
일자 작업
-1 본 프라이(Von Frey) 반응 측정(기선); 체중 측정(기선)
0 정(Chung) 수술, AIZETIT 펌프 이식(1M, 5M, 7M 및 9M 군)
1 요추 TT 주입(4M 및 8M 군)
7 체중 측정, 선택.
14 체중 측정, 본 프라이 측정, 요주 주입(6M 군).
16 2M 및 6M 군에 대한 본 프라이 반응 측정.
21 체중 측정, 본 프라이 반응 측정.
28 체중 측정, 본 프라이 반응 측정, 종료
신경병증성 통증 유발: 케타민/자일라민 나트륨을 이용하여 마취한 상태에서 그 부위를 제모한 후, 쥐를 엎드리고, 좌측 척수 주변 근육을 L4 내지 S2 수준의 가시돌기로부터 분리한다. L6 척추 가로 돌기를 작은 뼈집게를 이용하여 조심스럽게 제거하여 L5 내지 L6 척수 신경을 확인한다. 좌측 L5-L6 척수 신경을 절단한다. 다음에, 근육을 4-0 실크 봉합사로 봉하고, 피부를 클램프로 봉한다. 수술 후, 쥐를 케이지에 복귀시키고 깨어날 때까지 가열 펌프 하에 유지한다.
예비선택을 위한 채택/배제 기준
a. 선택을 7일째에 수행한다.
b. 아래의 기준들 중 하나 이상이 만족되는 때 통증을 검출한다:
c. 수술된 발을 핥으면서, 입으로 발톱을 물거나 당긴다;
d. 다리를 공기 중에 둔다;
e. 신경 손상에 대한 반대쪽의 측으로 몸을 내민다;
f. 앞발의 기형 및 비정상적인 자세 및 보행;
g. 좌측 뒷발이 약함.
h. 이들은 모두 채택 기준이다.
i. 동물은 L4가 손상되지 않도록 하기 위하여 그 다리를 움직일 수 있어야 한다. 동물이 그 다리를 움직일 수 없는 경우, 이는 연구에서 배제한다.
또한, 실험 일자에서 조심스런 임상 검사를 수행한다. 관찰로는 피부, 털, 눈, 점막, 분비물 발생(예를 들어, 설사) 및 저율신경 활성(예를 들어, 최루, 타액분비, 입모, 동공 크기, 별난 호흡 패턴)의 변화가 있다. 또한, 걸음걸이, 자세 및 조종에 대한 반응의 변화 외에도, 이상 행동, 떨림, 경련, 졸음 및 혼수의 여부도 관찰한다. 상기 징후들 중 하나 이상을 보이는 동물은 연구에서 제외한다.
ALZET 삼투 펌프 제조 밍 이식: 수술 당일에 1M, 5M, 7M 및 9M 군의 동물에게 삼투 펌프를 피하 이식한다. 다음에, 피부 절개부를 4-0 실크 봉합사로 봉합한다. 폴리에틸렌 튜브를 척수의 L4 수준까지 척수의 척수강내에 이식한다. 다음에, 캐뉼라를 삼투 펌프에 연결하고 2주 투여에 필요한 양의 식염수를 채운다. 다음에, 캐뉼라를 소량의 공기로 채운다. 펌핑 속도는 0.5㎕/hr (±0.1㎕/hr)이다. 펌프 성능의 지속 기간은 14일이다. 그 펌프에 200㎕ 용적의 TI를 채운다. 척수강 내 카테터는 TI가 l4의 부위에 투여되도록 대조(Cisterna Magna)와 L4 척추 사이의 길이와 가능하면 일치하지 않는 길이로 삽입된다. 1M, 5M, 7M 및 9M 군의 동물은 표8에서 나타낸 바와 같이 처리한다.
요추 주입: 척수강 내 튜브를 L4-L5 수준의 척수 공간에 삽입하고, 시험 물질을 환약 형태로 서서히 투여한다.
처리
처리 개시: ALZET 펌프를 이용하여 IT 경로를 통해 14일간 연속적으로 처리(5M, 7M 및 9M 군). ALZET 펌프를 이용하여 IT 경로를 통해 14일간 연속적으로 처리 (1M 군).
요추 부위에서 IT 경로를 통한 신속 단일 처리.
수술 후 24시간째에, 요추 부위에서 경고막 주입을 이용하여 경기관 내 주입을 이용하여 연구 1일째에 한번 예방적 처치(4M 및 8M 군).
VF 테스트 전에 요추 주입을 이용하여 연구 14일째에 한번 치료적 처치(6M 군).
영성 대조군인 가바펜틴(3M 군)은 연구 14, 21 및 28일째에 통증 시험 2 시간 전에 하루에 한번 투여한다.
투여 경로
본 연구에서 사용되는 투여 경로가 다음 표 10에서 기재되어 있다.
투여 경로
(i) 시험 물질 dsRNA 1 및 dsRNA2 IT 펌프
(ii) 시험 물질 dsRNA 1 및 dsRNA2 IT 요추 주입
(iii) 비히클 1 IT 펌프
(iv) 비히클 2 IT 요추 주입
(iv) 양성 대조군(카바펜틴) IP
종료
연구의 종료 시, 동물은 CO2를 이용하여 안락사시킨다.
관찰 및 계산
통증 반응 평가:
기계적인 이질 통증에 대한 본 프라이 테스트(Von Frey test)를 이용하여 통증 반응을 평가했다. 기계적인 이질통증에 대한 본 프라이 테스트는 미투여(naive) 동물에 통증을 주지않는 단파장의 압력을 인가하는 것에 기초한다. 실제로, 미투여 동물의 발 움추림을 달성하기 위하여, 인가 압력은 60 g 보다 다소 높다. 흔히 이를 위하여는, 연구자는 미투여 약물의 발을 실질적으로 들어올리기에 충분한 압력을 본 프라이 필라멘트를 이용하여 인가할 필요가 있다. 그러나, 질병 상태에서, 동물은 아주 더 낮은 압력에 대하여 민감하고, 일반적으로 비통증성인 자극의 결과로서 통증을 경험한다.
기계적인 이질통증 평가(본 프라이 시험): 촉각 자극에 대한 이질통증 반응을 본 프라이 장치(Touch®)를 이용하여 평가한다. 쥐들을 울타리로 둘러싸고 금속 매시 표면상에 위치시키지만, 자유로이 움직일 수 있도록 한다. 쥐의 캐빈에 붉은 셀로판을 씌워서 환경적인 방해를 감소시킨다. 시험은 탐구 행동의 정지 후에 시작한다. 본 프라이 모노필라멘트들의 세트는 본 프라이 장치의 제조사(Ugo Basil사)에 의해 제공되는 바와 같이 대략 대수 스케일의 실질적인 힘 및 선형 스케일의 지각 세기를 제공한다.
작동 원리: 소정 길이 및 직경의 섬유의 끝을 피부를 향해 직각으로 밀착하면, 그 인가 력은 섬유가 구부러질 때까지 연구자가 탐침을 계속 전진시키는 경우 증가한다. 섬유가 구부러진 후, 탐침이 계속 전진하여, 추가의 힘이 발에 인가되지 않고도 섬유가 더욱 구부러진다.
하기 표 11은 힘(g) 및 이에 해당하는 모노필라멘트 크기를 도시한다.
[표 11] 힘(g) 및 이에 해당하는 모노필라멘트 크기
Figure 112013006138949-pct00064
설치류는 그 발을 갑작스럽게 건드리는 경우 발 움추림 반사를 나타낸다. 터치 시험(Touch Test™) 관능 평가장치를 쥐 발바닥의 표면상에서 사용할 수 있다. 그 동물은 발을 뒤로 끌어당김으로써 감각을 나타내게 된다. 이러한 움추림 반사를 평가하는데 필요한 최소의 힘을 기준값으로 나타낸다.
통계분석/데이터 평가
모든 데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다. 각각의 처리군은 일방 아노바(ANOVA) 및 이후의 터키(Tukey) 포스트-검사(소프트웨어: GraphPad Prism)을 이용하여 이의 관련 비히클 군과 비교한다. 일방 아노바 반복 측정 및 이후의 터키 포스트 검사를 이용하여 각 시험군에 대한 전처리 통증 반응을 후처리 통증 반응과 비교한다. p < 0.05의 값은 유의한 차이를 나타내는 것으로 간주한다.
결과
체중: 체중은 연구 -1, 7, 14, 21 및 28일째에 측정한다.
본 프라이 테스트: 결과는 좌측 다리의 움추림의 평균힘(g)으로 나타낸다.
기계적인 이질통증은 연구 14, 16, 21 및 28일째에 여러 시점에서 본 프라이 필라멘트에 대한 동물 민감성의 증가로서 나타낸다.
ALZET 펌프를 이용하여 IT 경로를 통해 처리한 동물의 본 프라이 반응: 비히클 처리 동물(1M 군)의 좌측 다리의 움추림에 필요한 기선 평균 힘을 측정한다. 연구 14, 21 및 28일째에, 좌측 다리의 움추리는 힘을 다시 측정하고 기선 측정치와 비교한다.
본원에서 개시한 dsRhoA 화합물을 이러한 연구에서 시험한 결과, 예방적 처치를 이용하여 IT 펌프를 통해 투여된 때 SNL 유발 신경병증성 통증을 감소시키는데 효과적인 것으로 확인된다.
본원에서 개시한 dsRhoA 화합물을 이러한 연구에서 시험한 결과, 치료적 처치를 이용하여 IT 펌프를 통해 투여된 때 SNL 유발 신경병증성 통증을 감소시키는데 효과적인 것으로 확인된다.
실시예 14: 당뇨성 신경병증의 모델계
본 연구의 목적은 각막 신혈관 생성의 설치류 봉합 모델에서 요추 부위에의 척수강내(IT) 펌프 이식 또는 IT 단일 요추 주입-척수강내 주입에 의해 적용된 RhoA dsRNA 화합물의 치료 효과를 평가함에 있다.
종: 스프라그 다우리(SD) 집쥐;
전체 개체수: 120; 군당 개체수: 12;
시험군: 1개의 비히클 군; 2개의 dsRNA 대조군; 6개의 시험 물질군(dsRhoA 및 dsTLR4 화합물 또는 여러 가지 투여 방법/경로들의 조합을 포함); 1개의 양성 대조군.
투여 방법: 선택 후 연구 16일째에 한번.
스트렙조토신(STZ)-유도 당뇨 쥐 연구 개요: 연구 0일째에 STZ를 IV 투여한다. BGL을 연구 3일째에 시험한 후 일주일에 1회 시험한다. 연구 16일째에 통증 한계치를 시험한다. 통증반응을 보이는 동물을 연구에 포함시키고 IT 경로를 이용하여 시험물질을 투여한다. 다음에 연구 21일 및 28일째에 통증 한계치를 다시 시험한다.
종료 시, 척수 및 DRG를 하기와 같이 수집하여 더욱더 분석한다: 6마리의 동물에 대한 조직을 조직학적 분석을 위해 수집하고 6마리의 동물의 조직을 RNA 분석을 위해 수집한다.
체중: 동물 체중을 매주 1회 측정한다.
판독: 본 프라이에 대한 반응.
본원에서 개시된 dsRhoA 화합물을 이러한 모델계에서 시험한 결과, 단독으로 투여 시 또는 TLR4 유전자를 표적하는 또 다른 dsRNA 화합물과 함께 투여 시 신경병증성 통증을 감소시키는데 효과적인 것으로 확인된다.
실시예 15: 미세혈관 장애의 모델계
본원에서 개시한 dsRhoA 화합물을 후술하는 바와 같이 미세혈관 장애의 동물계에서 시험한다.
1. 당뇨성 망막병증
당뇨병을 C57B16 생쥐에서 유발한 다음, 그 생쥐에 본 발명의 dsRhoA 화합물 및 대조 dsRNA 화합물을 척수강내 주입한다. 당뇨병의 유발을 위하여, 생쥐에게 스트렙조토신을 주사한다(밤새 금식 후 2일간 STZ 90 mg/kg/d). 연구 동안 동물의 혈당, 체중 및 헤마토크릿 수치의 변화를 측정한다. 비히클을 주사한 생쥐를 대조군으로 이용한다. 적절한 동물에게 본 발명의 항-RhoA dsRNA 화합물 또는 항-GFP 대조dsRNA 화합물을 척수강내 투여하여 처리한다. dsRNA 화합물을 연구 동안 2회(첫 번째 STZ 주입이 수행되는 0일째 및 STZ 주입후 14일째) 주입한다.
당뇨 4주 후, 동물의 망막 혈관 누출을 에반스-블루(EB) 기법을 이용하여 측정한다. 생쥐는 에반스-블루(EB) 측정 24 시간 전에 우측 경부 정맥에 이식된 카테터를 갖는다. 각 동물의 양쪽 눈의 망막 투과율 측정을 표준-에반스-블루 프로토콜에 따라 수행한다.
본원에 개시된 화합물을 이러한 모델계에서 시험한 결과, 당뇨병에 의해 유발된 망막 혈관 누출을 감소시키는데 효과적인 것으로 확인된다.
2. 미숙아 망막병증
시험 동물을 고산소 및 저산소 조건에 노출시킨 후 그의 망막에 대한 효과를 측정함으로써 미숙아 망막병증을 유발한다. 본원에서 개시된 dsRhoA 화합물을 이러한 모델계에서 시험한 결과, 미숙아 망막병증으로부터 보호하는데 효과적인 것으로 확인된다.
3. 심근경색
생쥐에서 단기 및 장기 좌전하 행동맥 결찰(Left Anterior Descending artery ligation)을 통해 심근 경색을 유발한다. 본원에서 개시된 dsRhoA 화합물을 이러한 모델계에서 시험한 결과, 심험 동물의 혈액에서 24 시간 경색 후 전체 크레아티닌 포스포키나아제(CPK-MB) 수준의 트로포닌-T (TnT) 및 MB 수준을 감소시키는데 효과적인 것으로 확인된다. 본원에서 개시한 dsRhoA 화합물로 처리한 동물은 대조 dsRNA 화합물로 처리한 동물과 비교하여 28일 경색 후 더욱 좋은 초음파심장진단도(구혈률)을 갖는다.
4. 폐쇄성 뇌손상( CHI )
실험용 TBI는 행동 결핍의 정도와 관련이 있는 신경 및 신경대사 장애에 기여하는 일련을 상황을 발생한다.
CHI를 마취하에서 유발하면서, 중간두정면의 좌측 반구체를 덮는 노출된 두개골에 위에 소정의 높이로부터 추를 자유 낙하시킨다(문헌 Chen 외, J. Neurotrauma 13, 557, 1996).
본원에서 개시된 dsRhoA 화합물을 이러한 모델계에서 시험한 결과, TBI를 치료하는데 효과적인 것으로 확인된다.
실시예 16: 황반 변성의 모델계
본원에서 개시한 dsRhoA 화합물을 하기의 맥락막 신혈관 생성의 동물 모델에서 시험한다. 모델 동물에서 레이저 처리를 통해 습식 노인황반변성의 이러한 특징(hallmark)을 유발한다.
생쥐 모델: 맥락막 신혈관 생성(CNV)의 유발
약물 처리군 평가를 위해 마스크한 개인에 의해 0일째에 각 생쥐의 양쪽 눈에 대하여 수행된 레이저 광응고술(532nm, 200mW, 100ms, 75㎛)를 통해 습식 노인황반변성의 특징인 맥락막 신혈관 생성(CNV)을 유발한다. 슬리트 램프 전달 시스템 및 점촉 렌즈로서 커버 슬립을 이용하여 표준화 방법으로 레이저 스팟을 시신경 주변에 인가한다.
처리 군: CNV를 하기의 생쥐 군(6 내지 8 주령의 수컷)에서 유발한다:
0일 및 7일째에 한쪽 눈에 본원의 0.25㎍의 RhoA dsRNA 화합물을 IVT 주입하고 또 다른 눈에 비활성 항-GFP dsRNA 화합물(음성 대조군)을 IVT 주입한 12마리의 야생형(WT) 생쥐;
0일 및 7일째에 한쪽 눈에 본원의 0.1㎍의 RhoA dsRNA 화합물을 IVT 주입하고 또 다른 눈에 PBS(음성 대조군)을 IVT 주입한 12 WT 생쥐;
0일 및 7일째에 한쪽 눈에 본원의 0.05㎍의 RhoA dsRNA 화합물을 IVT 주입하고 또 다른 눈에 PBS(음성 대조군)을 IVT 주입한 12 WT 생쥐.
각각의 생쥐의 양쪽 눈을 레이저 처리한다. 주입 체적은 2㎕ 이다.
평가
14일째에 실험을 종료한다. 평가를 위하여, 눈을 적출하고, 4℃에서 30 분간 4% 파라포름알데히드로 고정한다. 감각신경 망막을 떼어내고 시신경으로부터 절단한다. 남아있는 RPE-맥락막-공막 복합체를 임뮤-마운트(Immu-Mount)(VTectashield Mounting Medium, Vector)에 평평하게 탑재하고 커버슬립을 덮는다. 평평한 탑재물을 주사전자 공초점 현미경(TCS SP, Leica, Germany)을 이용하여 검사한다. 블루 아르곤 레이저를 이용하여 혈관을 시각화한다. 상기 RPE-맥락막-공막 복합체의 표면으로부터 수평 광학부(1㎛ 단차)를 얻는다. 병소에 연결되는 주변 맥락막 혈관 망상구조가 확인될 수 있는 가장 깊은 초점 면을 병소의 바닥면으로 판정한다. 레이저 처리 부위 및 이러한 기준 면에 있는 임의의 혈관은 CNV로 판정한다. 각 부위의 이미지를 디지털 방식으로 저장한다. CNV-관련 형광의 면적을 Leica TCS SP 소프트웨어를 이용하여 컴퓨터 지원 이미지 분석을 통해 측정한다. 각각의 수평 부위의 전체 형광 면적의 합계를 CNV 면적의 지표로 사용한다.
RPE/맥락막 또는 신경 망막으로부터 추출한 RNA에 대한 실시간 PCR을 이용하여 CNV의 RhoA mRNA 발현 (및 AMD 관련 기타 유전자의 발현)(본원에서 개시한 dsRNA 화합물로 처리 또는 비처리한 것)을 평가하기 위해 별개의 WT 생쥐(군당 5 개의 눈)를 이용한다.
본원에서 개시한 dsRhoA 화합물을 이러한 모델계에서 시험한 결과, CNV 체적의 감소를 유도하는 것으로 확인된다.
실시예 17: 종양 성장의 약화를 위한 RHOA 에 대한 dsRNA 의 평가
방법:
(a) 피하 종양 이종이식: 5 x 106 개의 A549 세포를 수컷 무흉선 누드 생쥐의 뒷다리에 주입하고, 피하 종양을 매주 측정한다. 종양 체적은 다음 식을 이용하여 측정한다: [길이(㎜) x 폭(㎜) x 폭(㎜) x 0.52]. 피하 종양 내로의 dsiRNA의 생체내 전달을 위하여, 시험 dsRNA 듀플렉스를 PBS에 희석하고 10㎍/㎖의 농도로 인슐린 주사기를 이용하여 뒷다리 종양에 주입한다. 다른 동물에게는, 카보플라틴을 40㎎/㎏ 체중의 투여량으로 복막 내 투여한다. 상기 dsRNA 및 카보플라틴은 일주일에 2회 4주간 투여한다. 생체 내에서 본 발명의 dsRNA의 항종양 활성을 시험하기 위하여, 피하 종양을 갖는 생쥐를 종양 내로 직접 주입을 통해 시험 dsRNA로 처리하고 4주간 일주일에 2회 카보플라틴으로 처리하고, 실험의 종료 시 종양 무게를 측정한다.
(b) 폐 전이 실험: 약 2x106 개의 A549-C8-luc 세포를 SCID-Beige 생쥐(미합중국 매사츄세츠 소재 찰스리버사(Charles River))에 정맥 내 주사하고, 발생되는 폐 종양을 매주 측정한다. 폐종양 내로 시험 또는 대조 dsRNA의 에어로졸 전달을 위하여, 100㎍의 dsRNA를 PBS에 희석하고 연무기(nebulizer)를 이용하여 에어로졸화한다. 생쥐에게 100㎍의 dsRNA를 매주 3회 4주간 연무기를 이용하여 투여한다. 대조군 생쥐에게는, 카보플라틴을 30㎎/㎏ 체중의 투여량으로 일주일에 2회 투여한다. 실험의 종료 시 종양 무게를 측정한다.
본원에서 개시한 dsRNA 분자를 이러한 동물 모델에서 시험한 결과, 생체내 종양 부하를 감소시키고 암을 치료하는데 유용한 것으로 확인된다.
본원에서 언급 또는 인용한 논문, 특허 문헌, 특허출원서, 및 기타 모든 문헌 및 전자적으로 이용가능한 정보의 내용은 그 개개의 간행물이 구체적이고 개별적으로 포함되는 경우와 동일한 정도까지 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
출원인은 이러한 논문, 특허문헌, 특허출원서 또는 기타 물리 또는 전자 문헌으로부터의 임의 및 모든 자료 및 정보를 본 출원에 물리적으로 포함시키는 것을 보류한다.
당업자는 본원에 개시된 발명에 대한 여러 가지 치환 및 변경이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있다. 따라서, 이러한 부가적인 구체예는 본 발명의 범위 및 특허청구범위에 속한다.
본 발명은 RNAi 활성을 매개하기 위한 개선된 활성을 갖는 핵산 작제물을 생성하는 것에 대하여 본원에서 개시한 화학적 변경들의 여러 가지 조합 및/또는 치환을 시험하는 것을 당업자에게 가르치고 있다. 이러한 개선된 활성은 RNAi를 매개하는 세포 반응의 개선된 안정성, 개선된 생체내 이용률 및/또는 개선된 활성화를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 개시한 특정 구체예들은 제한적인 것이 아니고, 당업자는 본원에 개시된 변경들의 특정 조합들이 개선된 RNAi 활성을 갖는 핵산 분자를 확인하는 것에 대한 과도한 실험이 없이 시험될 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있다.
본원에 예시적으로 개시한 본 발명은 본원에 구체적으로 개시하지 않은 임의의 요소(들) 또는 제한(들)이 없이 적당히 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명을 설명하는 문맥(특히 하기 특허청구범위의 문맥)에서 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 지시자(referent)는 본원에 달리 나타내지 않거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 경우 단수형 및 복수형을 모두 포함하는 것으로 해석된다. 용어 "포함하는", "갖는", "함유하는" 등은 제한함이 없이 개방적인 것으로 해석하여야 한다(예를 들어, 포함하나 그에 제한되지 않는다는 것을 의미함). 본원에서 수치 범위의 언급은 그저, 달리 나타내지 않는 경우 그 범위에 속하는 각각의 값을 개별적으로 나타내는 속기 방법으로 이용하고자 하는 의도가 있으며, 각각의 값은 개별적으로 본원에 언급되는 것과 마찬가지로 본 명세서에 포함된다. 본원에 기재한 모든 방법은 달리 나타내지 않거나 문맥에 의해 달리 명백히 모순되지 않는 경우 임의의 적당한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의 및 모든 예들 또는 예시적인 표현(예를 들어, 와 같은")의 사용은 그저 본 발명을 더욱 명백히 하기 위한 것으로서, 달리 청구하지 않는 경우 본 발명의 범위에 제한을 두는 것이 아니다. 본 명세서에서의 표현은 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되지 않는다. 게다가, 본원에서 사용되는 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로서 사용되었고, 이러한 용어 및 표현의 사용은 도시 및 설명된 특징 및 이의 부분의 임의의 등가물을 제외하려는 의도가 있는 것은 아니며, 여러 가지 변경이 본 발명의 범위 내에서 가능한 것으로 판단된다.
<110> Quark Pharmaceuticals, Inc. AVKIN-NACHUM, Sharon FEINSTEIN, Elena KALINSKI, Hagar METT, Igor <120> DOUBLE STRANDED RNA COMPOUNDS TO RHOA AND USE THEREOF <130> 221/PCT1 <150> US 61/358,012 <151> 2010-06-24 <160> 184 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1926 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 guggaugagc ugugagugcg cgcgcgugcg cggggccgcg accugugccg gcucgagccc 60 gcugggcacu cggaggcgcg cacgucguuc cccgcccucc cgccgccgcc cgcccucgcu 120 cucucgcgcu acccucccgc cgcccgcggu ccuccgucgg uucucucguu aguccacggu 180 cuggucuuca gcuacccgcc uucgucuccg aguuugcgac ucgcggaccg gcguccccgg 240 cgcgaagagg cuggacucgg auucguugcc ugagcaaugg cugccauccg gaagaaacug 300 gugauuguug gugauggagc cuguggaaag acaugcuugc ucauagucuu cagcaaggac 360 caguucccag agguguaugu gcccacagug uuugagaacu auguggcaga uaucgaggug 420 gauggaaagc agguagaguu ggcuuugugg gacacagcug ggcaggaaga uuaugaucgc 480 cugaggcccc ucuccuaccc agauaccgau guuauacuga uguguuuuuc caucgacagc 540 ccugauaguu uagaaaacau cccagaaaag uggaccccag aagucaagca uuucuguccc 600 aacgugccca ucauccuggu 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Ser Pro Asp Ser Leu Glu Asn Ile Pro 85 90 95 Glu Lys Trp Thr Pro Glu Val Lys His Phe Cys Pro Asn Val Pro Ile 100 105 110 Ile Leu Val Gly Asn Lys Lys Asp Leu Arg Asn Asp Glu His Thr Arg 115 120 125 Arg Glu Leu Ala Lys Met Lys Gln Glu Pro Val Lys Pro Glu Glu Gly 130 135 140 Arg Asp Met Ala Asn Arg Ile Gly Ala Phe Gly Tyr Met Glu Cys Ser 145 150 155 160 Ala Lys Thr Lys Asp Gly Val Arg Glu Val Phe Glu Met Ala Thr Arg 165 170 175 Ala Ala Leu Gln Ala Arg Arg Gly Lys Lys Lys Ser Gly Cys Leu Val 180 185 190 Leu <210> 3 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 3 ggaucuucgg aaugauga 18 <210> 4 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 4 caugcuugcu cauagucu 18 <210> 5 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 5 ggaagaaacu ggugauug 18 <210> 6 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 6 ggguacaugg aguguuca 18 <210> 7 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> 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<220> <223> Chemically synthesized <400> 16 uaagaaggau cuucggaa 18 <210> 17 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 17 guggcagagu uacaguuc 18 <210> 18 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 18 cagagauaug gcaaacag 18 <210> 19 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 19 gauuggcgcu uuugggua 18 <210> 20 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 20 gacagcccug auaguuua 18 <210> 21 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 21 gaaugaugag cacacaag 18 <210> 22 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 22 caaacaggau uggcgcuu 18 <210> 23 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 23 caucgacagc ccugauag 18 <210> 24 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 24 gaucuucgga augaugag 18 <210> 25 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 25 cuguggcaga guuacagu 18 <210> 26 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 26 ucuucggaau gaugagca 18 <210> 27 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 27 uguggcagag uuacaguu 18 <210> 28 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 28 ugaugagcac acaaggcg 18 <210> 29 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 29 guuuuuccau cgacagcc 18 <210> 30 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 30 uucggaauga ugagcaca 18 <210> 31 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 31 cgauguuaua cugaugug 18 <210> 32 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 32 guguuuuucc aucgacag 18 <210> 33 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 33 agcuguggca gaguuaca 18 <210> 34 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 34 ucgacagccc ugauaguu 18 <210> 35 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 35 ucaucauucc gaagaucc 18 <210> 36 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 36 agacuaugag caagcaug 18 <210> 37 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 37 caaucaccag uuucuucc 18 <210> 38 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 38 ugaacacucc auguaccc 18 <210> 39 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 39 ucauuccgaa gauccuuc 18 <210> 40 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 40 uugugugcuc aucauucc 18 <210> 41 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 41 uaucucugcc uucuucag 18 <210> 42 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 42 uguuugccau aucucugc 18 <210> 43 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 43 auaucugcca cauaguuc 18 <210> 44 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 44 uaucagggcu gucgaugg 18 <210> 45 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 45 aaaugcuuga cuucuggg 18 <210> 46 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 46 cauguaccca aaagcgcc 18 <210> 47 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 47 guagcaagau gacuucug 18 <210> 48 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 48 uuccgaagau ccuucuua 18 <210> 49 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 49 gaacuguaac ucugccac 18 <210> 50 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 50 cuguuugcca uaucucug 18 <210> 51 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 51 uacccaaaag cgccaauc 18 <210> 52 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 52 uaaacuauca gggcuguc 18 <210> 53 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 53 cuugugugcu caucauuc 18 <210> 54 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 54 aagcgccaau ccuguuug 18 <210> 55 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 55 cuaucagggc ugucgaug 18 <210> 56 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 56 cucaucauuc cgaagauc 18 <210> 57 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 57 acuguaacuc ugccacag 18 <210> 58 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 58 ugcucaucau uccgaaga 18 <210> 59 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 59 aacuguaacu cugccaca 18 <210> 60 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 60 cgccuugugu gcucauca 18 <210> 61 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 61 ggcugucgau ggaaaaac 18 <210> 62 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 62 ugugcucauc auuccgaa 18 <210> 63 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 63 cacaucagua uaacaucg 18 <210> 64 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 64 cugucgaugg aaaaacac 18 <210> 65 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 65 uguaacucug ccacagcu 18 <210> 66 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 66 aacuaucagg gcugucga 18 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 67 ggaucuucgg aaugaugaa 19 <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 68 caugcuugcu cauagucua 19 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 69 ggaagaaacu ggugauuga 19 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 70 ggguacaugg aguguucaa 19 <210> 71 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 71 gaaggaucuu cggaaugaa 19 <210> 72 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 72 ggaaugauga gcacacaaa 19 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 73 cugaagaagg cagagauaa 19 <210> 74 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 74 gcagagauau ggcaaacaa 19 <210> 75 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 75 gaacuaugug gcagauaua 19 <210> 76 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 76 ccaucgacag cccugauaa 19 <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 77 cccagaaguc aagcauuua 19 <210> 78 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 78 ggcgcuuuug gguacauga 19 <210> 79 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 79 cagaagucau cuugcuaca 19 <210> 80 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 80 cagaagucau cuugcuacu 19 <210> 81 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 81 uaagaaggau cuucggaaa 19 <210> 82 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 82 guggcagagu uacaguuca 19 <210> 83 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 83 cagagauaug gcaaacaga 19 <210> 84 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 84 gauuggcgcu uuuggguaa 19 <210> 85 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 85 gacagcccug auaguuuaa 19 <210> 86 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 86 gaaugaugag cacacaaga 19 <210> 87 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 87 caaacaggau uggcgcuua 19 <210> 88 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 88 caucgacagc ccugauaga 19 <210> 89 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 89 gaucuucgga augaugaga 19 <210> 90 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 90 gaucuucgga augaugagu 19 <210> 91 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 91 cuguggcaga guuacagua 19 <210> 92 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 92 ucuucggaau gaugagcaa 19 <210> 93 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 93 uguggcagag uuacaguua 19 <210> 94 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 94 ugaugagcac acaaggcga 19 <210> 95 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 95 guuuuuccau cgacagcca 19 <210> 96 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 96 uucggaauga ugagcacaa 19 <210> 97 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 97 cgauguuaua cugauguga 19 <210> 98 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 98 guguuuuucc aucgacaga 19 <210> 99 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 99 agcuguggca gaguuacaa 19 <210> 100 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 100 ucgacagccc ugauaguua 19 <210> 101 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 101 uucaucauuc cgaagaucc 19 <210> 102 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 102 uagacuauga gcaagcaug 19 <210> 103 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 103 ucaaucacca guuucuucc 19 <210> 104 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 104 uugaacacuc cauguaccc 19 <210> 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113 uguagcaaga ugacuucug 19 <210> 114 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 114 aguagcaaga ugacuucug 19 <210> 115 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 115 uuuccgaaga uccuucuua 19 <210> 116 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 116 ugaacuguaa cucugccac 19 <210> 117 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 117 ucuguuugcc auaucucug 19 <210> 118 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 118 uuacccaaaa gcgccaauc 19 <210> 119 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 119 uuaaacuauc agggcuguc 19 <210> 120 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 120 ucuugugugc ucaucauuc 19 <210> 121 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 121 uaagcgccaa uccuguuug 19 <210> 122 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 122 ucuaucaggg cugucgaug 19 <210> 123 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 123 ucucaucauu ccgaagauc 19 <210> 124 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 124 acucaucauu ccgaagauc 19 <210> 125 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 125 uacuguaacu cugccacag 19 <210> 126 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 126 uugcucauca uuccgaaga 19 <210> 127 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 127 uaacuguaac ucugccaca 19 <210> 128 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 128 ucgccuugug ugcucauca 19 <210> 129 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 129 uggcugucga uggaaaaac 19 <210> 130 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 130 uugugcucau cauuccgaa 19 <210> 131 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 131 ucacaucagu auaacaucg 19 <210> 132 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 132 ucugucgaug gaaaaacac 19 <210> 133 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 133 uuguaacucu gccacagcu 19 <210> 134 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 134 uaacuaucag ggcugucga 19 <210> 135 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 135 gcuucuuucu agaaagaga 19 <210> 136 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 136 accaguauuu agaagccaa 19 <210> 137 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 137 gcccugauag uuuagaaaa 19 <210> 138 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 138 cgacagcccu gauaguuua 19 <210> 139 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 139 cagcccugau aguuuagaa 19 <210> 140 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 140 agaaggaucu ucggaauga 19 <210> 141 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 141 uaagaaggau cuucggaau 19 <210> 142 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 142 ggaucuucgg aaugaugag 19 <210> 143 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 143 guggcagagu uacaguucu 19 <210> 144 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 144 cuucggaaug augagcaca 19 <210> 145 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 145 cuguggcaga guuacaguu 19 <210> 146 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 146 caucgacagc ccugauagu 19 <210> 147 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 147 cagcuguggc agaguuaca 19 <210> 148 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> 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19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 157 agaacuguaa cucugccac 19 <210> 158 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 158 ugugcucauc auuccgaag 19 <210> 159 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 159 aacuguaacu cugccacag 19 <210> 160 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 160 acuaucaggg cugucgaug 19 <210> 161 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 161 uguaacucug ccacagcug 19 <210> 162 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 162 gcucaucauu ccgaagauc 19 <210> 163 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 163 cggaaugaug agcacacaa 19 <210> 164 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 164 gaaggaucuu cggaaugau 19 <210> 165 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 165 ucggaaugau gagcacaca 19 <210> 166 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 166 ucgacagccc ugauaguuu 19 <210> 167 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 167 uugugugcuc aucauuccg 19 <210> 168 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 168 aucauuccga agauccuuc 19 <210> 169 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 169 ugugugcuca ucauuccga 19 <210> 170 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 170 aaacuaucag ggcugucga 19 <210> 171 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 171 aagucaucuu gcuaccagu 19 <210> 172 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 172 ggcagaguua caguucugu 19 <210> 173 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 173 agaagucauc uugcuacca 19 <210> 174 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 174 gcagaguuac aguucugug 19 <210> 175 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 175 uggcagaguu acaguucug 19 <210> 176 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 176 cagaguuaca guucugugg 19 <210> 177 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 177 gaagucaucu ugcuaccag 19 <210> 178 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 178 acugguagca agaugacuu 19 <210> 179 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 179 acagaacugu aacucugcc 19 <210> 180 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 180 ugguagcaag augacuucu 19 <210> 181 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 181 cacagaacug uaacucugc 19 <210> 182 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 182 cagaacugua acucugcca 19 <210> 183 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> Chemically Synthesized <400> 183 ccacagaacu guaacucug 19 <210> 184 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 184 cugguagcaa gaugacuuc 19

Claims (85)

  1. RHOA_48(시퀀스 동정 번호: 79 및 113)로서 기술된 올리고뉴클레오티드 또는 RHOA_48u(시퀀스 동정 번호: 80 및 114)로서 기술된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 이중 가닥 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염으로서,
    상기 이중 가닥 핵산 분자는 하기의 구조를 가지며:
    Figure 112015018987610-pct00079
    ,
    또는
    Figure 112015018987610-pct00080

    여기에서 각 "┃"는 염기쌍을 나타내고;
    여기에서 A, C, G 및 U 각각은 독립적으로 미변성된 리보뉴클레오티드, 변성된 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;
    여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 가닥이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분 또는 이들의 조합이고;
    여기에서 z"는 상기 센스 가닥의 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 성분인, 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 이중 가닥 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염.
  2. 삭제
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  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥에 있어서 미러 뉴클레오티드 또는 2'-5' 연결 리보뉴클레오티드가 포지션 5, 6, 7 또는 8(5'>3')들 중의 적어도 하나에 존재하고, 하나 또는 그 이상의 2'-O-메틸 당 변성 리보뉴클레오티드 및 Z가 존재하고, 그리고 3' 말단에 공유적으로 결합된 뉴클레오티드 성분 또는 비-뉴클레오티드 성분이고; 그리고 여기에서 상기 센스 가닥에 있어서 4 또는 5개의 연속적인 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드들이 3' 말단 또는 페널티메이트 포지션들에 존재하고, Z'가 존재하고 그리고 3' 말단에 공유적으로 결합된 뉴클레오티드 성분 또는 비-뉴클레오티드 성분이고, 하나 또는 그 이상의 2'-O-메틸 당 변성 리보뉴클레오티드가 존재하고, 그리고 Z"가 존재하는 상기 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 이중 가닥 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥(5'>3')에 있어서 2'-O-메틸 당 변성 리보뉴클레오티드가 포지션 1, 3, 11, 14, 15, 17 및 18(5'>3')에 존재하고; 그리고
    여기에서 상기 센스 가닥(5'>3')에 있어서 2'-O-메틸 당 변성 리보뉴클레오티드가 포지션 1에 존재하고 그리고 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드가 포지션 15, 16, 17, 18 및 19에 존재하는 상기 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 이중 가닥 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 센스 가닥에 있어서 Z'가 상기 3' 말단에 공유적으로 결합된 비-뉴클레오티드 C3Pi 성분이고, Z"가 어베이직 성분, 역전된 어베이직 성분, 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드, C6 아미노 및 미러 뉴클레오티드들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 상기 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 이중 가닥 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥에 있어서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드가 포지션 6, 포지션 7 또는 포지션 6 및 7에 존재하는 상기 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 이중 가닥 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥에 있어서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드가 포지션 6에 존재하고, 그리고 Z가 상기 3' 말단에 공유적으로 결합된 C3Pi-C3OH 성분이고, 그리고 여기에서 상기 센스 가닥에 있어서 Z'가 상기 3' 말단에 공유적으로 결합된 C3Pi 성분이고, 그리고 Z"가 역전된 어베이직 디옥시리보뉴클레오티드 캡핑 성분인 상기 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 이중 가닥 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥에 있어서 상기 5' 말단이 포스포릴화된 상기 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 이중 가닥 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥에 있어서 2'-O-메틸 당 변성 리보뉴클레오티드가 포지션 1, 3, 6, 11, 14, 15, 17 및 18(5'>3')에 존재하고; Z가 존재하고 그리고 상기 3' 말단에 공유적으로 결합된 C3Pi-C3OH 성분이고; 그리고 여기에서 상기 센스 가닥에 있어서 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드가 포지션 15, 16, 17, 18 및 19(5'>3')에 존재하고, Z'가 존재하고 그리고 상기 5' 말단에 공유적으로 결합된 캡핑 성분인 상기 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 이중 가닥 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염.
  11. 삭제
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  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥에 있어서 하나 또는 그 이상의 2'-O-메틸 당 변성 리보뉴클레오티드, 미러 뉴클레오티드 또는 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드가 포지션 5, 6, 7 또는 8(5'>3')에 존재하고, 그리고 뉴클레오티드 성분 또는 비-뉴클레오티드 성분이 3' 말단에 공유적으로 결합되고; 그리고 여기에서 상기 센스 가닥에 있어서 4 내지 5개의 연속적인 2'-5' 결합 리보뉴클레오티드들이 3' 말단 또는 페널티메이트 포지션들에 존재하고, 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분이 상기 3' 말단에 공유적으로 결합되고, 그리고 Z"가 존재하는 상기 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염.
  14. 청구항 제 1 항, 제 4 항 내지 제 10 항 및 제 13 항들 중의 어느 한 항의 상기 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염; 및 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 손상, 질병, 장애 또는 상태의 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 손상, 질병, 장애 또는 상태가 당뇨성 신경병증, 당뇨성 망막병증, 미숙아 망막병증, 심근경색, 폐쇄성 뇌손상, 척수 손상, 녹내장, 메니에르병(Meniere's disease), 황반변성, 신경병증성 통증(neuropathic pain, NP), 이질통, 암, 종양 성장 및 증식 질병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 손상이 척수 손상인 상기 약제학적 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 장애가 신경병증성 통증(NP) 또는 이질통인 상기 약제학적 조성물.
  17. 청구항 제 1 항, 제 4 항 내지 제 10 항 및 제 13 항들 중의 어느 한 항의 상기 이중 가닥 핵산 분자 또는 이러한 이중 가닥 핵산 분자의 약제학적으로 수용가능한 염; 및 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 중추신경계(CNS)에서의 손상, 질병, 장애 또는 상태에 의하여 손상되거나 또는 손상의 위험에 대한 신경보호 효과를 가져오는 약제학적 조성물로서,
    상기 손상, 질병, 장애 또는 상태가 당뇨성 신경병증, 폐쇄성 뇌손상, 척수 손상, 녹내장, 메니에르병, 신경병증성 통증(NP) 및 이질통으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 손상이 척수 손상인 상기 약제학적 조성물.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 장애가 신경병증성 통증(NP) 또는 이질통인 상기 약제학적 조성물.
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