KR101546487B1

KR101546487B1 - 저밀도 지질단백질과 항산화제를 포함하는 정자 동결보존용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101546487B1
Application number: KR1020130076066A
Authority: KR
Inventors: 오신애; 조원모; 조상래; 조인철; 고문석; 최선호; 박용상; 채현석; 김남영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2015-08-25
Anticipated expiration: 2033-06-28
Also published as: KR20150003058A

Abstract

본 발명은 저밀도 지질단백질(LDL)과 항산화제를 포함하는 정자의 동결보존용 조성물 및 조성물을 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 동결보존된 정자의 활성을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 정자 동결보존용 조성물을 이용하면, 가축의 정자를 동결 및 융해시킬 경우, 정자의 손상을 최소화 할 수 있으므로, 가축의 품종개량에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

저밀도 지질단백질과 항산화제를 포함하는 정자 동결보존용 조성물 및 이의 용도{Composition for cryopreservating sperm comprising LDL and anti-oxidant and uses thereof}

본 발명은 저밀도 지질단백질과 항산화제를 포함하는 정자 동결보존용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 동결보존시에 정자의 활성저하를 억제할 수 있는 저밀도 지질단백질(LDL)과 항산화제를 포함하는 정자의 동결보존용 조성물 및 상기 조성물을 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 동결보존된 정자의 활성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

정자의 동결과 저온 보관은 가축 등의 품종의 보존과 번식에 유용하며 생명공학 분야에서 활발히 연구되고 있는 분야이다. 특히, 동결 과정 중에 정자는 세포 내 빙정 형성, 삼투압의 차이 그리고 저온 스트레스에 의해 손상을 받게 되는데, 이러한 손상을 감소시키는 물질이 동결보존제이며 대표적인 물질로는 글리세롤(Glycerol)이 있다. 동결과정에 쓰이는 원 정액은 농도가 높기 때문에 희석액을 사용하여 묽히게 되는데, 희석 과정 중에 동결보존제가 희석액과 함께 투여된다. 글리세롤은 세포에 독성이 있는 물질이고 특히, 돼지의 정자는 다른 가축 동물의 정자보다 외부 자극에 대한 감수성이 높기 때문에 글리세롤에 의해 쉽게 손상을 받을 수 있다.

이러한 동결보존(cryopreservation)은 실험 및 인공수정(artificial insemination, AI)을 위한 정자 세포의 유용성을 확장시킨다. 다양한 기술적 제약에도 불구하고, 정자에의 접근가능성은 인공수정 및 시험관내 수정(in vitro fertilization, IVF)의 발전을 가능케 하였다. 그러나, 동결-융해된 정자는 신선 정자(fresh sperm)와 같은 동일한 수정능(fertilizing potential)을 가지지 못하는데, 이는 22℃에서 1℃로 냉각되는 동안 냉각 과정이 세포막 내 지질 및 단백질 재배열을 유도하기 때문이다.

이러한 변이는 저온에서 액상에서 겔상으로 변화하는 막에 의해 유도된다. 이는 동결보존 시 정자의 생존력 및 수정능을 감소시키는 주된 원인 중 하나이다. 그 중에서도 정자 막의 콜레스테롤/인지질 비율은 동결보존 시 막 유동성 및 안정성에 있어서 주요 결정인자이다. 인간 및 토끼 정자와 같은, 매우 높은 콜레스테롤/인지질 비율을 가지는 종에서 얻은 정자는 냉각될 때 이러한 막 손상을 겪지 않음이 보고되었다.

통상적으로, 막의 손상은 세포사멸에 대한 주요 원인 중 하나로 여겨지고 있다. 막의 주요 구성 요소인, 콜레스테롤은 막 기능의 조절과 같은 중요한 역할을 하고, 세포막에서 콜레스테롤은 막 유동성 및 투과성의 주요 결정인자로 알려져 있다.

한편, 콜레스테롤은 막의 전이온도를 낮추고, 낮아진 온도에서 그들을 액상으로 유지시켜 저온에서 발생하는 막손상을 감소시킨다고 알려져 있다.

이러한 콜레스테롤은 정자 막의 안정화에 중요한 역할을 한다. 특히, 정자의 수정능획득(capacitation) 시, 막은 콜레스테롤을 상실하고, 더욱 불안정한 막 구조를 갖게 함으로써 첨체반응을 가능하게 한다. 정자 수정능획득은 정자 막에서 콜레스테롤 유출로 유도될 수 있다. 유사하게, 정자가 냉각 또는 동결되면, 막들은 상전이가 일어나는데, 이는 막 지질과 단백질의 재배열 및 막으로부터 지질의 소실을 초래하고, 차례로, 막내 단백질과 지질 응집 및 막-선택적 투과성의 소실을 유발함으로써, 정자의 조숙한 수정능획득이 일어나게 하고, 이러한 조숙한 수정능획득은 정자의 수정 및 수명의 감소를 초래한다고 알려져 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 가축의 정자를 보다 효율적으로 동결보존할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 저밀도 지질단백질(LDL)과 항산화제를 포함하는 정자의 동결보존용 조성물을 이용할 경우, 종래의 동결보존제를 사용할 경우보다도 가축의 정자를 효율적으로 동결보존할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL)과 항산화제를 포함하는 정자의 동결보존용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 동결보존된 정자의 활성을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL)과 항산화제를 포함하는 정자의 동결보존용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 제주산 흑우를 개량하기 위하여 상기 흑우 중에서 우수한 품종으로부터 수득한 정자를 장기간 동안 보존하고자 하였다. 그러나, 종래의 정자보존용 조성물은 정자의 동결 및 융해시에 정자를 보존하는 효율이 낮기 때문에, 보다 높은 효율로 정자를 동결보존할 수 있는 성분을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 정자의 동결 및 융해에 의하여 영향을 받는 주된 손상부위가 정자막이라는 점에 주목하였다. 다른 세포와는 달리, 정자는 세포질 성분이 거의 존재하지 않기 때문에, 동결 및 융해에 의하여 세포질 손상에 의한 영향을 거의 받지 않으므로, 정자를 둘러싼 정자막의 손상을 최소화할 경우에는, 동결 및 융해에 따른 정자의 손상을 현저하게 감소시킬 수 있을 것으로 예상하였다. 이에, 정자막에 상응하는 세포막에 대한 동결보호효과를 나타내는 것으로 알려진 LDL을 동결보호제로서 사용하여 그의 효과를 비교한 결과, 종래의 동결보호제로 사용되어온 글리세롤보다는 우수한 효과를 나타내지만, 현저한 효과를 나타내지는 못함을 확인하고, 상기 LDL의 정자막 보호효과를 보조할 수 있는 성분을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 항산화제가 상기 LDL의 정자막 보호효과를 보조하여 상승효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. ROS는 세포막의 유동성을 감소시키는 효과를 나타내기 때문에 정자막의 손상에 직접적인 영향을 미칠 수 있고, 이러한 ROS의 작용은 항산화제에 의하여 방지할 수 있기 때문에, 상기 LDL에 항산화제를 추가하면 정자의 동결 및 융해에 의하여 야기되는 정자막의 손상을 보다 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 예상하고, 이를 실험적으로 확인하였다.

본 발명의 용어 "저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL)"이란, β-리포단백질이라고도 하고, 콜레스테롤에스테르와 아포리포단백질 β로 구성되며, 비중 1.019~1.063의 비중을 갖는 혈장성 지질단백질을 의미한다. 상기 LDL의 주된 기능은 혈장내에 존재하는 콜레스테롤을 말초혈관까지 수송하는 것이며, 상기 LDL이 과량으로 존재할 경우 죽상동맥경화증과 같은 심혈관계 질환이 유발될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 LDL은 정자의 동결보존시에 사용되는 동결보존용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있고, 상기 조성물에 포함된 LDL의 함량은 정자의 동결보존 효과를 나타내게 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 조성물 최종 중량에 대하여 2 내지 10%(w/w), 보다 바람직하게는 3 내지 7%(w/w), 가장 바람직하게는 4%(w/w)가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "항산화제"란, 생체내 또는 세포내에서 발생되는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 흡착하여 제거할 수 있는 물질을 의미한다. 정자를 동결보존하기 위하여, 체외에서 작업할 경우에는 체내보다도 높은 농도의 산소에 노출되기 때문에, 과량의 ROS가 생성되고, 이처럼 생성된 ROS는 산화성 스트레스를 유발하여, 미토콘드리아의 호흡 억제, 세포막의 유동성 감소, 각종 효소의 불활성화 및 DNA와 RNA의 손상 등의 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항산화제는 정자의 동결보존 및 융해시에 발생하는 ROS를 제거하여 정자의 손상을 방지할 수 있으므로, 정자의 동결보존시에 사용되는 동결보존용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

이때 사용되는 항산화제의 종류는 정자의 동결보존 효과를 나타내게 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않고, 당업계에서 사용될 수 있는 통상적인 항산화제를 제한없이 사용할 수 있는데, 바람직하게는 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol, β-ME), 글루타치온(Glutathione, GSH), 아스코르브산(ascorbic acid), 비타민 E, 베타카로틴, 라이코펜, 코엔자임 Q-10(coenzyme Q-10), 셀레늄, 크롬, 마그네슘 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 타우린(taurine), 하이포타우린(hypotaurine), 트레할로스(trehalose) 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 타우린을 사용할 수 있다.

또한, 상기 조성물에 포함된 항산화제의 함량은 정자의 동결보존 효과를 나타내게 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 5 내지 100mM, 보다 바람직하게는 10 내지 60mM, 가장 바람직하게는 20mM이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "정자"란, 정충이라고도 하고, 정자는 웅성동물의 고환에서 생산되는 성세포를 의미하는데, 길이는 약 0.02㎜이며, 머리, 경부 및 긴 꼬리의 세 부분으로 구성된다. 머리 부분에는 웅성 동물의 DNA가 들어 있고, 머리 부분의 맨 앞쪽에 존재하는 첨체에는 난자의 난막을 녹일 수 있는 효소가 포함되어 있고; 상기 경부에는 에너지 저장고인 당분을 함유한 미토콘드리아가 포함되어 있으며; 상기 꼬리는 가는 실 묶음으로 되어 있는데 가는 실 묶음이 교묘하게 신축하여 꼬리를 움직이게 한다. 본 발명의 목적상 상기 정자는 특별히 제한되지 않으나, 가축의 정자, 바람직하게는 소, 개, 고양이, 돼지, 양, 염소, 말 등의 정자가 될 수 있고, 바람직하게는 소의 정자가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 제주산 흑우의 정자가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "동결보존"이란, 냉동을 통해 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 행위를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 동결보존은 정자의 동결보존을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "동결보존제(cryoprotectant)"란, 동결보호제라고도 하고, 생물세포를 동결상태에서 산채로 보존할 경우, 동해를 경감할 목적으로 매액(媒液)에 첨가시키는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 동결보존제는 가축의 정자를 동결보존하기 위하여 사용되며, 본 발명에서는 저밀도 지질단백질(LDL)을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "동결보존용 조성물"이란, 본 발명의 동결보존제로 사용되는 LDL과 항산화제를 포함하는 조성물을 의미한다.

본 발명의 용어 "동결보존액"이란, 본 발명의 동결보존용 조성물과 희석액이 혼합된 액상의 정자 동결보존용 제제를 의미한다. 상기 동결보존액은 본 발명의 동결보존용 조성물에 더하여 희석액을 추가로 포함하여 구성할 수 있다. 상기 희석액은 원 정액의 농도를 저하시켜서, 동결보존시 정자간의 충돌로 인하여 발생할 수도 있는 손상을 방지하기 위하여 사용된다. 상기 희석액은 특별히 이에 제한되지 않으나, 당류, 유기산, 난황, 항생제 등을 포함하는 완충액이 될 수 있는데, 바람직하게는 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 덱스트란 등의 당류; 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산 등의 유기산; 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 등의 항생제; 및 난황을 포함하는 완충액이 될 수 있고, 이들 각성분은 당업자가 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 종래의 동결보존제로 사용되어온 글리세롤을 포함하는 동결보존액(대조군)과 본 발명의 LDL과 항산화제를 포함하는 동결보존액(실험군)을 사용하여 제주산 흑우의 정자를 동결보존 및 해동시키고, 상기 해동된 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성, 첨체막의 변화 및 난자로의 침투능력을 평가하였다. 그 결과, 운동성의 측면에서는 대조군과 실험군에 차이가 없었으나(표 1), 생존율(표 2), 정자막 온전성(표 3), 첨체막의 변화(도 1) 및 난자로의 침투능력(표 4)의 측면에서는 대조군 보다도 실험군이 현저하게 우수함을 확인하였다. 대부분의 비교항목에서 동결보존제로서 LDL을 단독으로 포함하는 것보다는 LDL과 항산화제를 같이 포함하는 경우에 더욱 효과가 우수하였으므로, 항산화제가 LDL의 효과를 배가시키는 것으로 분석되었다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 (a) 상기 동결보존용 조성물을 포함하는 동결보존액에 정자를 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는 동결보존된 정자의 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.

이때, 상기 동결보존용 조성물은 LDL 및 항산화제를 포함할 수 있고, 바람직하게는 타우린, 하이포타우린, 트레할로스 등의 항산화제를 단독으로 또는 조합하여 LDL과 함께 포함할 수 있고; 상기 정자의 활성은 특별히 이에 제한되지 않으나, 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성, 첨체막의 변화, 난자로의 침투능력 등을 단독으로 또는 조합한 특성이 될 수 있으며; 상기 조성물에 포함된 LDL의 함량은 조성물 최종 중량에 대하여 2 내지 10%(w/w)가 될 수 있고; 상기 조성물에 포함된 항산화제의 함량은 5 내지 100mM이 될 수 있다.

또한, 상기 동결보존액에 포함되는 동결보존용 조성물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 내지 80%(w/w), 보다 바람직하게는 10 내지 50%(w/w), 가장 바람직하게는 30%(w/w)가 될 수 있다.

또한, 상기 동결보존액은 본 발명의 동결보존용 조성물에 더하여, 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, DMSO, 덱스트란, 1,2-프로판디올, 히알루론산 등의 공지된 동결보존제를 단독으로 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수도 있다.

또한, 상기 동결보존액에 포함되는 정자의 수는 바람직하게는 동결보존액 단위부피(㎖)당 1 X 10⁷ 내지 10 X 10⁷개 이고, 보다 바람직하게는 단위부피(㎖)당 3 X 10⁷ 내지 7 X 10⁷개 이며, 가장 바람직하게는 단위부피(㎖)당 5 X 10⁷개 이다.

또한, 상기 동결 및 보존은 정자를 동결보존할 수 있는 한 공지된 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으나, 바람직하게는 액화질소를 사용하여 -196℃에서 동결 및 보존을 수행할 수 있고, 상기 동결된 정자는 반영구적으로 보존할 수 있다.

아울러, 본 발명의 방법은 상기 동결보존된 정자를 융해시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.

이때, 상기 융해방법은 상기 동결보존된 정자를 정상상태로 회복시킬 수 있다면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있는데, 바람직하게는 동결보존된 정자를 상온에서 일정시간 동안 정치시킴으로써 상기 정자에 포함된 냉매를 휘발시켜 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 1 내지 10℃의 물에 2 내지 10분 동안 침지하거나, 30 내지 40℃의 물에 10 내지 30초 동안 침지하거나 또는 60 내지 80℃의 물에 1 내지 5초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 동결보존된 정자를 상온에서 10 내지 20초 동안 정치시켜서 냉매를 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 4℃의 물에 5분 동안 침지하거나, 37℃의 물에 20초 동안 침지하거나, 70℃의 물에 3초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 동결보존된 정자를 상온에서 20초동안 동안 정치시켜서 냉매를 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 37℃의 온수에서 20초 동안 침지함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 정자 동결보존용 조성물을 이용하면, 가축의 정자를 동결 및 융해시킬 경우, 정자의 손상을 최소화 할 수 있으므로, 가축의 품종개량에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 동결 융해된 정자의 첨체막 변화에 대한 동결보호제의 효과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 제주흑우 정액 채취

정액채취에 이용된 흑우는 3세 이상의 수컷 6두를 선발하여 별도 공간에서 자유 급식하여 사육하였으며, 월 4회 정액을 채취하였다. 정액 채취는 인공질 (Model 66000-D, Nasco, FHK, Japan)을 사용하여 채정하였다. 정액 채취를 위하여 암컷을 안전하게 정액 채취실 보정틀에 고정시킨 후, 제주흑우 수컷을 2~3회 암컷의 주위를 맴돌게 하여 흥분을 유도하였다. 승가가 이루어지면 수컷의 penis 를 인공질에 삽입하여 정액을 채취하였다. 인공질의 온도는 38℃를 유지하였으며, 인공질에는 penis의 삽입을 원활하게 하기 위하여 젤을 도포하였다. 인공질 끝 부분에 15㎖ 시험관을 채취 전에 장착하여 사출된 정액을 회수하였다.

실시예 2: 정액의 처리 및 제조

상기 회수된 정액을 동일부피의 희석액(Tris 121.1 mM, Fructose 180.2 mM, Citric acid 294.1 mM, Egg yolk 10%, Streptomycin sulfate 10mg/㎖)과 혼합하고 냉각하는 방식을 2시간 동안 5회 반복수행하여 정자희석액을 수득하였다. 이어, 상기 정자희석액에 동결보호제(4% LDL과, 20mM의 타우린, 하이포타우린 또는 트레할로스를 각각 포함)를 가하고, 2시간 동안 방치한 다음, 상기 희석액을 사용하여 50×10⁶/ml로 정자의 농도를 조절하고, 이를 0.5㎖ straw에 충전 봉합하였다. 충전된 straw는 액체질소 표면 5cm 높이에서 10분간 노출시켜 예비동결을 실시한 후에 액체질소에 침지하여 동결을 완료하였다. 동결된 정액은 LN₂ tank에서 보관하고 필요시에는 공기중에서 약 10초간 정치한 다음, 37℃ 온수에 20초간 침지시켜 융해시켰다. 이때, 대조군으로는 동결보호제로서 7%의 글리세롤을 사용한 정자를 사용하였다.

실시예 3: 정자의 운동성 평가

정자의 운동성은 MicroLux 현미경 (X 70, Olympus, Japan)하에서 정자의 활력을 측정하여 평가하였다. 구체적으로, 혈구계산판에 5㎕의 정액을 가하고, 커버글래스로 덮은 후, 100배율에서 정자의 운동성을 평가하였다. 평가기준은, 혈구계산판의 격자 2군데를 반복적으로 관찰하여 거의 모든 정자들이 소용돌이 치며 활발하게 움직이는 것을 90% 이상으로, 생존 정자들을 격자 별로 100개 가량을 관찰하여 활발하게 움직이는 정자들이 80개 이상일 때 80%로, 70개 이상일 때 70%로 판단하고 움직이는 정도가 전진 운동 또는 느리게 전진 운동하는 수준일 때 50%, 느리게 전진운동 하거나 진자 운동 혹은 미동하는 수준일 때 30%로 평가하였다(표 1).

동결 융해된 정자의 운동성에 대한 동결보호제의 효과

		Motility (%)
대조군		64.00±9.62
실험군	LDL LDL+타우린 LDL+하이포타우린 LDL+트레할로스	67.00±5.70 70.00±5.00 68.00±5.70 70.00±5.00

a, b Values with different superscripts within same column are significantly different by ANOVA (p<0.05).

Data are presented as mean ± SD.

상기 표 1에서 보듯이, 대조군과 실험군의 동결보호제를 처리한 경우에, 동결 융해된 정자의 운동성에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다.

실시예 4: 정자의 생존율 평가

정자의 생존율은 Eosin-Y 염색법을 이용하여 평가하였다. 구체적으로, 융해된 정액 0.5㎖와 37℃의 DPBS 1㎖를 혼합하고, 이를 400 Xg에서 3분간 원심분리하여 침전물을 수득함으로써, 동결보호제를 제거하였다. 상기 수득한 침전물에 500㎕의 DPBS를 가하고 현탁시킨 다음, 상기 현탁액 10㎕를 슬라이드 글라스에 가하고, 동량의 Eosin-Y 염색액을 가하여 혼합하였으며, 상기 혼합액의 상부에 커버슬라이드를 덮고, MicroLux 현미경 (X 70, Olympus, Japan)를 이용하여 100배율에서 염색 상태를 관찰하여 2개표본(200개의 정자/1개 표본)에서 붉게 염색된 죽은 정자를 계수하고, 이들의 비율을 측정하는 방식으로 정자의 생존율을 평가하였다(표 2). 이때, 상기 Eosin-Y 염색액은 0.9% NaCl 용액에 0.5% Eosin-Y를 용해하여 제조하였다.

동결 융해된 정자의 생존율에 대한 동결보호제의 효과

		Viability (%)
대조군		56.25±6.42
실험군	LDL	63.40±7.39^ab
	LDL+타우린	69.70±6.12^a
	LDL+하이포타우린	67.25±3.21^a
	LDL+트레할로스	64.55±2.43^ab

Data are presented as mean ± SD.

상기 표 2에서 보듯이, 대조군에 비하여 다양한 동결보호제를 처리한 실험군에서 생존율이 유의하게 증가함을 알 수 있었다.

실시예 5: 정자막 온전성 평가

정자막 온전성은 Jeyendran 등 (1984)의 방법을 변형하여 저삼투압 용액을 이용한 정자 미부의 팽창형태를 분석(Hypo-Osmetic Swelling Test: HOST)함으로써 평가하였다. 구체적으로, 37℃의 저장액(150mOsm/kg, 0.45% NaCl 용액) 1㎖에 융해된 정액 100㎕를 가하고, 혼합한 다음 37℃에서 5분간 정치시켰으며, 이를 슬라이드 글라스에 도말하였다. 도말한 표본으로부터 각 표본당 200개의 정자 중에서 정자막이 정상상태인 것을 계수하고, 이의 비율을 측정하는 방식으로 정자막 온전성을 평가하였다(표 3).

동결 융해된 정자의 정자막 온전성에 대한 동결보호제의 효과

		Swelled sperm(%)
대조군		51.90±9.99^c
실험군	LDL	61.65±5.18^b
	LDL+타우린	70.55±5.16^a
	LDL+하이포타우린	64.45±5.85^ab
	LDL+트레할로스	64.50±2.78^ab

a, b, c Values with different superscripts within same column are significantly different by ANOVA (p<0.05).

Data are presented as mean ± SD.

상기 표 3에서 보듯이, 대조군에 비하여 다양한 동결보호제를 처리한 실험군에서 정자막 온전성이 유의하게 증가함을 알 수 있었다. 특히, LDL과 타우린을 포함하는 동결보호제는 가장 높은 수준의 정자막 온전성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 6: 첨체막 변화 양상의 평가

Chlortetracyclin (CTC) 염색법을 사용하여, 정자 첨체막의 변화 양상을 평가하였다.

구체적으로, 융해된 정액을 400 Xg에서 2분간 원심분리하여 침전물을 수득하고, 상기 침전물에 500㎕의 CTC 용액(750μM CTC, 130mM NaCl, 5mM cystein in 20mM Tris buffer; pH 7.8)을 가하여 혼합한 다음, 상온 및 암실조건에서 20초 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 10㎕의 12.5% glutaradehyde를 가하여 반응을 종결시키고, 평가기준에 따라 평가하였다. 상기 평가기준은 Fraser (1995)의 분류에 따라, 정자 두부가 전체적으로 형광 발광을 할 경우 수정능이 없는 F pattern으로 평가하고, 적도면 부분에 띠가 형성되어 첨체 아랫부분에서 형광 발광을 할 경우 수정능이 있는 B pattern으로 평가하였으며, 마지막으로 정자 두부가 형광 발광을 하지 않거나, 얼룩덜룩한 발광을 할 경우 첨체반응이 일어난 AR pattern으로 평가하였다(도 1). 도 1은 동결 융해된 정자의 첨체막 변화에 대한 동결보호제의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, F pattern의 경우에는 LDL을 단독으로 사용한 경우를 제외하고는 대조군에 비하여 다양한 동결보호제를 처리한 실험군에서 높은 수준을 나타내었고, B pattern의 경우에는 LDL을 단독으로 사용한 경우에 대조군에 비하여 높은 수준을 나타낸 반면 나머지 동결보호제를 처리한 경우에 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았으며, AR pattern의 경우에는 대조군에 비하여 다양한 동결보호제를 처리한 실험군에서 낮은 수준을 나타내었고, 특히 LDL과 타우린을 포함하는 동결보호제는 가장 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 7: 난자로의 침투능력 평가

10주~ 15주령 자성 햄스터에 30 IU의 PMSG를 복강주사하고, 48시간이 경과된 시점에서 30 IU의 hCG를 복강 주사하여 배란을 유도하였다. hCG 주사시점으로부터 15시간이 경과한 후에, 상기 햄스터로부터 배란된 난자를 수득하였다. 수득한 난자에 0.1% hyaluronidase를 처리하여 난구세포를 제거하고, 0.1% trypsin을 처리하여 투명대를 제거하였다.

융해된 정액을 400 Xg에서 2분간 원심분리하여 침전물을 수득하고, 수득한 침전물을 PBS에 현탁시킨 후, 다시 원심분리하여 침전물을 수득하여 동결보존액을 제거하고, 상기 침전물을 10㎍/㎖의 헤파린이 포함된 TALP 배양액에 현탁시킨 후, 39℃ 및 5% CO2 배양기에서 10분간 반응시켜 수정능이 회복된 정자를 수득하였다. 상기 정자를 2×10^5 live sperm/㎖의 농도로 조절하고, 상기 투명대가 제거된 햄스터 난자에 가한 후, 3.5시간 동안 공배양하였다. 배양이 종료된 후, 난자를 세척하고 슬라이드 글라스위에 놓은 다음, methanol : acetic acid (3:1, v/v) 용액을 가하고 24시간 동안 고정시켰다. 상기 고정된 난자에 1% lacmoid를 가하여 염색하고, 위상차 현미경(X 400)을 이용하여 난자로의 정자의 침투여부를 확인하였다(표 4). 이때, 정자의 침투능력은 Oh 등의 방법 (2010a)을 이용하여 평가하였다.

투명대가 제거된 햄스터 난자로의 정자의 침투능력에 대한 타우린, 하이포타우린 및 트레할로스의 효과

		PN	DC	EN	SFI
대조군		0.40±0.55^c	1.00±0.71^b	1.80±0.84	0.36±0.13^c
실험군	LDL	1.20±0.84^b	1.80±0.45^a	1.60±0.65	0.58±0.19^b
	LDL+타우린	2.00±0.00^a	2.40±0.55^a	2.40±0.55	0.88±0.11^a
	LDL+하이포타우린	1.40±0.55^ab	2.20±0.45^a	2.00±0.71	0.70±0.10^ab
	LDL+트레할로스	1.60±0.55^ab	2.20±0.45^a	2.00±0.00	0.74±0.13^ab

PN: Pronucleus,

DC: Decondenced sperm,

EN: Enlarged sperm

SFI: Sperm fertility index.

SFI= (PN × 2 + DC + EN)/No. of oocytes.

SFI was calculated by method of Oh et al., (2010a).

Data are presented as mean ± SD.

상기 표 4에서 보듯이, LDL과 타우린을 포함하는 동결보호제를 처리한 실험군이 대조군에 대하여 유의적으로 높은 웅성전핵 형성율(PN)과 SFI를 나타냈을 뿐만 아니라, LDL의 단독 처리에 비하여도 유의적으로 높은 수준의 PN과 SFI를 나타냄을 확인하였다. 그러나, LDL과 하이포타우린을 포함하는 동결보호제를 처리한 실험군 및 LDL과 트레할로스를 포함하는 동결보호제를 처리한 실험군과 비교한 경우에는, LDL과 타우린을 포함하는 동결보호제를 처리한 실험군이 다소 높은 PN과 SFI를 나타내었다. 또한, decondenced sperm 비율(DC)에서는 대조군에 비하여 다양한 동결보호제를 처리한 실험군에서 유의하게 증가함을 확인하였다.

상기 실시예 3 내지 7의 결과를 종합하면, 동결 융해된 정자에 LDL을 처리하면, 정자의 생존율이 증가하고, 정자막의 온전성을 높은 수준으로 유지시킬 수 있으며, AR pattern의 비율을 감소시키고, 난자에 대한 침투능력을 향상시키는 효과를 나타냄을 확인하였고, 타우린, 하이포타우린, 트레할로스 등의 항산화제는 상술한 LDL의 효과를 배가시킴을 확인하였다. 아울러, 상술한 항산화제의 효과는 동결 및 융해시에 발생되는 ROS로부터 정자를 보호함에 의하여 나타나는 것으로 분석되었다.

Claims

저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL)과 타우린을 포함하는, 정자의 활성을 향상시키기 위한 동결보존용 조성물로서,
상기 정자의 활성은 정자막 온전성, 난자로의 침투능력 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 LDL의 함량은 조성물 최종중량에 대하여 2 내지 10%(w/w)인 것인 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 타우린의 함량은 5 내지 100mM인 것인 조성물.
제1항에 있어서,
상기 정자는 가축의 정자인 것인 조성물.
제6항에 있어서,
상기 가축은 제주산 흑우인 것인 조성물.
제1항에 있어서,
글리세롤, 글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, DMSO, 덱스트란, 1,2-프로판디올, 히알루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 동결보존제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
(a) 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 동결보존용 조성물을 포함하는 동결보존액에 정자를 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는, 동결보존된 정자의 활성을 향상시키는 방법으로서,
상기 정자의 활성은 정자막 온전성, 난자로의 침투능력 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 동결보존용 조성물의 함량은 1 내지 80%(w/w)인 것인 방법.
제9항에 있어서,
상기 정자의 수는 동결보존액 단위부피(㎖)당 1 X 10⁷ 내지 10 X 10⁷개인 것인 방법.
제9항에 있어서,
상기 동결 및 보존은 액화질소를 사용하여 -196℃에서 수행되는 것인 방법.
제9항에 있어서,
상기 동결보존기간은 반영구적인 것인 방법.
삭제
제9항에 있어서,
상기 동결보존된 정자를 융해시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서,
상기 동결보존된 정자의 융해는 (a) 동결보존된 정자를 상온에서 정치시킴으로써 상기 정자에 포함된 냉매를 휘발시켜 제거하는 단계; 및, (b) 상기 냉매가 제거된 정자를 1 내지 10℃의 물에 2 내지 10분 동안 침지하거나, 30 내지 40℃의 물에 10 내지 30초 동안 침지하거나 또는 60 내지 80℃의 물에 1 내지 5초 동안 침지하는 단계에 의하여 수행되는 것인 방법.