[go: up one dir, main page]

KR101542703B1 - 항-재흡수 및 골 형성 식이보충제 및 이의 사용 방법 - Google Patents

항-재흡수 및 골 형성 식이보충제 및 이의 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101542703B1
KR101542703B1 KR1020147001052A KR20147001052A KR101542703B1 KR 101542703 B1 KR101542703 B1 KR 101542703B1 KR 1020147001052 A KR1020147001052 A KR 1020147001052A KR 20147001052 A KR20147001052 A KR 20147001052A KR 101542703 B1 KR101542703 B1 KR 101542703B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
extract
bone
composition
pomegranate
quercetin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020147001052A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140012214A (ko
Inventor
데이비드 더블유. 크렘핀
마리 에이. 머레이
유메이 린
케빈 더블유. 글렌벡
실비아 알. 다 코스타
레온 엠. 윌킨스
헤리 로-슈미트
자틴더 라나
존 에프. 레번
데이비드 제이. 패스트
Original Assignee
크렘핀, 로리에
마리 에이. 머레이
유메이 린
케빈 더블유. 글렌벡
실비아 알. 다 코스타
레온 엠. 윌킨스
헤리 로-슈미트
자틴더 라나
존 에프. 레번
데이비드 제이. 패스트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 크렘핀, 로리에, 마리 에이. 머레이, 유메이 린, 케빈 더블유. 글렌벡, 실비아 알. 다 코스타, 레온 엠. 윌킨스, 헤리 로-슈미트, 자틴더 라나, 존 에프. 레번, 데이비드 제이. 패스트 filed Critical 크렘핀, 로리에
Publication of KR20140012214A publication Critical patent/KR20140012214A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101542703B1 publication Critical patent/KR101542703B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/87—Vitaceae or Ampelidaceae (Vine or Grape family), e.g. wine grapes, muscadine or peppervine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/25—Araliaceae (Ginseng family), e.g. ivy, aralia, schefflera or tetrapanax
    • A61K36/254—Acanthopanax or Eleutherococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/25—Araliaceae (Ginseng family), e.g. ivy, aralia, schefflera or tetrapanax
    • A61K36/258—Panax (ginseng)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/484—Glycyrrhiza (licorice)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/489—Sophora, e.g. necklacepod or mamani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/80—Scrophulariaceae (Figwort family)
    • A61K36/804—Rehmannia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

본 발명은 골 생장의 증가 또는 촉진, 골 재흡수의 감소 또는 예방, 골 강도 증가, 골 구조 개선, 골 구성의 개선을 위한 식이보충제 조성물 및 방법에 관계하는데, 조성물은 제1조성물과 제2조성물로 구성되는데, 제1조성물은 퀘르세틴, Rehmannia sp., Rehmannia sp. 뿌리, 시베리아 인삼, Sophora japonica, 감초, 그리고 이프리플라본 중 최소 두가지의 복합물로 구성되고, 이때 복합물은 개체에서 골 형성 단백질-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시키고; 제2조성물은 석류 추출물과 함께 시베리아 인삼, 은행나무, 녹차, Sophora japonica, Rehmannia sp., 포도씨, 동콰이, 그리고 이프리플라본중 최소 두 가지 복합물로 구성되고, 이때 복합물은 RANK-L의 발현을 저해하는 것으로 구성된다.

Description

항-재흡수 및 골 형성 식이보충제 및 이의 사용 방법{Anti-Resorptive and Bone Building Dietary Supplements and Methods of Use}
본 출원은 미국 예비 출원 No. 60/854,312(2006년 10월 24일 출원됨), 미국 예비출원 No. 60/925,914(2007년 4월23일)에 대해 우선권을 청구하고, 이들 문헌은 참고문헌으로 첨부한다.
건강한 뼈는 지속적으로 리모델링 과정을 거치는데, 이때 활성 뼈 세포의 제휴 작용을 통하여, 가령 뼈 형성 골아세포(osteoblast) 및 뼈 재흡수 파골세포(ostepclast)사이에 제휴 작용을 통하여 뼈 재흡수와 뼈 형성에 균형이 이루어진다. 뼈 리모델링 과정은 비광화된(unmineralized) 뼈를 덮고 있는 세포들, 즉, 주위 세포(lining cell)의 활성화로 시작된다. 주위 세포들은 비광화된 뼈를 재흡수하고, 그 다음 철수하여 오래된 광화된 뼈를 재흡수하는 파골세포를 위한 공간을 남겨두고, 동일한 부위에 골아세포를 유인하는 환경을 만든다. 그 다음 골아세포들이 유기 매트릭스를 내려놓으면, 결과적으로 광화되어 새로운 뼈가 형성된다. 골량(mass)은 파골세포에 의한 뼈의 재흡수(resorption)와 골아세포에 의한 뼈 형성사이에 균형에 의해 결정된다.
뼈에서 미네랄의 양은 뼈의 단단함을 결정짓고, 구조적 단백질 콜라겐과 같은 물질 또한 뼈의 기계적인 강도에 기여한다. 조밀한 가장 가장자리 뼈는 피질골(cortical bone)로 알려져 있으며, 좀더 스폰지 같은 내부 형은 망상골(cancellous) 또는 지주골(trabecular bone)로 알려져있다.
대부분의 골 질환은 뼈 리모델링 과정의 균형의 파괴로 인한 것이다. 일반적으로 파괴란 뼈 재흡수가 증가되는 것이다. 예를 들면, 가장 흔한 골 질환중에 하나인 골다공증(Osteoporosis)은 뼈의 미소 구조의 변화와 함께 골량의 감소를 특징으로 하나, 뼈 자체의 화학적 조성상에는 영향이 없기 때문에 뼈 파열 가능성이 증가된다. 특히, 피질 골이 얇아지고 다공성으로 되는 반면, 지주골은 얇아지고, 관통구멍화되고, 끊기게 된다. 골다공증은 뼈의 리모델링 사이클에서 네가티브 균형, 예를 들면, 재흡수된 것보다 더 적은 양의 뼈가 형성되는 결과로 보인다.
따라서, 골 질환을 치료하는 치료요법적 물질은 뼈 재흡수를 저해시키고, 뼈 형성을 증가시키게 된다. 뼈 리모델링 과정에 관여하는 많은 분자들 및 경로가 있고, 상이한 분자들 및 경로를 표적으로 하는 현재 이용할 수 있는 다양한 치료물질들이 있다. 예를 들면, 비스포스네이트(bisphosphonates; 예를 들면 알레드로네이트 및 리세드로네이트)는 파골세포 활성을 차단시킴으로써 뼈 재흡수를 방해한다. 다른 치료요법제들도 TNF 수용체/리간드 패밀리 예를 들면 핵 인자 K B 리간드용 수용체 활성 물질(RANK-L), 뼈 재흡수에 관여하는 세포, 파골세포를 활성화시키는 사이토킨에 결합을 방해함으로써 뼈 재흡수를 저해하려고 한다. RANK-L 방출 저해로 뼈 미네랄 손실이 방지된다.
다른 치료요법적 물질은 뼈 형성을 증가시키는 것을 목적으로 한다. 예를 들면 활성화된 뼈 형태학적 단백질 유전자는 골아세포 세포 분화 및 뼈 형성을 촉진시키는데 직접적인 효과를 가지는 것으로 알려져있다. 재조합 뼈 형성 단백질-2(BMP-2)의 전달로 뼈 또는 연골 형성이 유도되었다는 것이 확인되었다. 그러나, 재조합 BMP-2와 같은 약학적 그리고 생물학적 물질의 전신 투여는 내장 및 다른 조직에 유해한 영향을 줄 수 있다. 따라서, 뼈 재흡수를 저해하고, 뼈 형성을 증가시킴으로써 골 질환을 예방 및/또는 치료를 목적으로 하는 영양 보충재에 사용할 수 있는 자연적인 그리고 식물에서 유도된 추출물이 요구된다.
본 발명은 다양한 자연적인 그리고 식물에서 유도된 추출물의 신규한 복합으로 (1) 뼈로부터 칼슘 방출을 저해함으로써, 또는 RANK-L의 발현 또는 방출을 저해, 감소 또는 방지함으로써 뼈 재흡수를 저해할 수 있고, (2) BMP-2의 단백질 발현 및 유전자의 발현을 증가 또는 자극함으로써 뼈 생장을 증가시키고, 그리고 (3) 뼈 강도를 개선 또는 유지시킬 수 있다는 발견에 기초한다.
예를 들면, 본 발명은 다음 중 최소 두 가지 복합물을 포함하는 자연적, 식물-유도된 추출물로 구성된 뼈 생장을 증가 또는 자극시킬 수 있는 조성물이다: 퀘르세틴 디하이드라에트(quercetin dihydrate), 퀘르세틴 안하이드레이트, Rehmannia sp.의 추출물, Rehmannia sp. 뿌리 추출물, 시베리아 인삼(Siberian ginseng) 추출물, Sophora fructus japonica의 추출물, Sophora japonica의 추출물, 감초(licorice)의 추출물, 그리고 이프리플라본(ipriflavone), 이때 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 퀘르세틴 디하이드라에트 또는 안하이드레이트, 시베리아 인삼 추출물, Sophora japonica의 추출물, 감초의 추출물의 복합물로 구성된 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 조성물인데, 이때 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 약 10-1000mg의 퀘르세틴 디하이드라에트 또는 안하이드레이트, 약 100-800mg의 시베리아 인삼 추출물, 약 10-500mg의 감초의 추출물의 복합물로 구성된 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 조성물인데, 이때 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
추가 구체예에서, 본 발명은 약 10-1000mg의 퀘르세틴 디하이드라에트 또는 안하이드레이트, 약 10-500mg의 감초의 추출물의 복합물로 구성된 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 조성물인데, 이때 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 약 10-1000mg의 퀘르세틴 디하이드라에트 또는 안하이드레이트, 약 100-800mg의 시베리아 인삼 추출물의 복합물로 구성된 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 조성물인데, 이때 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
본 발명은 개체에서 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 방법에 관한 것으로, 개체에 다음 중 최소 두 가지 복합물을 포함하는 조성물을 투여하는 것으로 구성된다: 퀘르세틴 디하이드라에트, 퀘르세틴 안하이드레이트, Rehmannia sp.의 추출물, Rehmannia sp. 뿌리 추출물, 시베리아 인삼 추출물, Sophora fructus japonica의 추출물, Sophora japonica의 추출물, 감초의 추출물, 그리고 이프리플라본, 이때 복합물은 개체에서 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
본 발명은 개체에서 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 방법에 관한 것으로, 개체에 다음 중 최소 두 가지 복합물을 포함하는 조성물을 투여하는 것으로 구성된다: 약 10-1000mg의 퀘르세틴 디하이드라에트 또는 안하이드레이트, 약 100-800mg의 시베리아 인삼 추출물, 약 10-500mg의 감초의 추출물의 복합물로 구성된 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 조성물인데, 이때 복합물은 개체에서 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
본 발명은 개체에서 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 방법에 관한 것으로, 개체에 다음 중 최소 두 가지 복합물을 포함하는 조성물을 투여하는 것으로 구성된다: 약 10-1000mg의 퀘르세틴 디하이드라에트 또는 안하이드레이트, 약 10-500mg의 감초의 추출물의 복합물로 구성된 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 조성물인데, 이때 복합물은 개체에서 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
본 발명은 개체에서 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 방법에 관한 것으로, 개체에 다음 중 최소 두 가지 복합물을 포함하는 조성물을 투여하는 것으로 구성된다: 약 10-1000mg의 퀘르세틴 디하이드라에트 또는 안하이드레이트, 약 100-800mg의 시베리아 인삼 추출물의 복합물로 구성된 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 조성물인데, 이때 복합물은 개체에서 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 뼈 재흡수를 방해, 감소 또는 저지시키는 조성물에 관계하는데, 이 조성물은 석류(pomegranate) 추출물, 푸니칼라진(punicalagins) 또는 이들 두 가지와 다음의 성분들중 하나 또는 그이상과 복합된 것으로 구성된다: 퀘르세틴 디하이드라에트, 퀘르세틴 안하이드레이트, Rehmannia sp.의 추출물, Rehmannia sp. 뿌리 추출물, 시베리아 인삼 추출물, Sophora fructus japonica의 추출물, Sophora japonica의 추출물, 감초의 추출물, 그리고 이프리플라본, 이때 석류 추출물, 푸니칼라진 또는 이들 둘은 RANK-L의 발현, 생산, 그리고/또는 방출을 저해한다.
한 구체예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 뼈 재흡수를 저해 또는 감소시키기 위해, 푸니칼라진으로 공지된 화합물을 포함하는 석류(Punica grantum)의 과일 및 껍질의 추출을 이용하는 것에 관계한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 석류 추출물, 예를 들면 푸니칼라진로 구성된 석류 추출물은 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방치시키는 조성물 및 방법에 이용될 수 있는데, 이때 석류 추출물은 RANK-L의 발현, 생산, 그리고/또는 방출을 저해한다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지시키키 위한 조성물로 석류 추출물, 최소한 한가지 푸니칼라진 또는 이들 둘을 포함하는 것에 관계한다. 또는 본 발명은 석류 추출물, 최소 한가지 푸니칼라진 또는 이들 둘로 구성된 조성물을 투여하는 것으로 구성되며, 이때 조성물은 RANK-L의 발현, 생산 및/또는 방출중 하나를 저해한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하기 위한 조성물에 관계하는데, 조성물은 다음의 성분들중 최소한 두 가지 복합물을 포함하는 자연적인, 식물-유도된 추출물로 구성된다: 푸니칼라진을 선호적으로 포함하는 석류 추출물, 올리브 추출물, 시베리아 인삼 추출물, 은행나무(Ginkgo biloba) 추출물, 녹차 추출물, Sophora japonica의 추출물, Rehmannia sp.의 추출물, 포도씨 추출물, 동콰이(Dong Quai) 추출물, 그리고 이프리플라본, 이때 복합물은 RANK-L의 발현, 생산, 그리고/또는 방출을 저해한다.
추가 실시예에서, 본 발명은 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하기 위한 조성물에 관계하는데, 조성물은 석류 추출물, 포도씨 추출물, 이프리플라본, 녹차 추출물로 구성된 복합물이며 이때 복합물은 RANK-L의 발현, 생산, 그리고/또는 방출을 저해한다.
추가 실시예에서, 본 발명은 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하기 위한 조성물에 관계하는데, 조성물은 약 10-2000mg의 석류 추출물, 약 35-250mg의 포도씨 추출물, 약 400-700mg의 이프리플라본로 구성된 복합물이며 이때 복합물은 RANK-L의 발현, 생산, 그리고/또는 방출을 저해한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하기 위한 조성물에 관계하는데, 조성물은 약 10-2000mg의 석류 추출물, 약 35-250mg의 포도씨 추출물, 약 400-700mg의 이프리플라본로 구성된 복합물이며 이때 복합물은 뼈로부터 칼슘 방출을 저해한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 개체에서 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하기 위한 방법으로 다음의 성분들중 최소한 두 가지 복합물을 포함하는 자연적인, 식물-유도된 추출물로 구성된 조성물을 투여하는 것으로 구성된다: 푸니칼라진을 선호적으로 포함하는 석류 추출물, 올리브 추출물, 시베리아 인삼 추출물, 은행나무 추출물, 녹차 추출물, Sophora japonica의 추출물, Rehmannia sp.의 추출물, 포도씨 추출물, 동콰이 추출물, 그리고 이프리플라본, 이때 복합물은 RANK-L의 발현, 생산, 그리고/또는 방출을 저해한다.
추가 실시예에서, 본 발명은 개체에서 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하기 위한 방법으로 석류 추출물, 포도씨 추출물, 이프리플라본의 복합물을 투여하는 것으로 구성되는데, 이때 복합물은 RANK-L의 발현, 생산, 그리고/또는 방출을 저해한다.
추가 실시예에서, 본 발명은 개체에서 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하기 위한 방법으로 약 10-2000mg의 석류 추출물, 약 35-250mg의 포도씨 추출물, 약 400-700mg의 이프리플라본로 구성된 복합물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하며 이때 복합물은 RANK-L의 발현, 생산, 그리고/또는 방출을 저해한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하기 위한 방법으로 약 10-2000mg의 석류 추출물, 약 35-250mg의 포도씨 추출물, 약 400-700mg의 이프리플라본로 구성된 복합물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하며 이때 복합물은 뼈로부터 칼슘 방출을 저해한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 뼈 생장을 증가 또는 자극시키며, 그리고 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하기 위한 식이보충제에 관계하는데, 이는 퀘르세틴 디하이드라에트, 퀘르세틴 안하이드레이트, Rehmannia sp.의 추출물, Rehmannia sp. 뿌리 추출물, 시베리아 인삼 추출물, Sophora fructus japonica의 추출물, Sophora japonica의 추출물, 감초의 추출물, 그리고 이프리플라본 중 최소 두가지의 복합물로 구성된 제1조성물, 이때 복합물은 개체에서 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시키고; 석류 추출물, 올리브 추출물, 시베리아 인삼 추출물, 은행나무추출물, 녹차 추출물, Sophora japonica의 추출물, Rehmannia sp.의 추출물, 포도씨 추출물, 동콰이 추출물, 그리고 이프리플라본중 최소 두 가지 복합물로 구성된 제2조성물, 이때 복합물은 RANK-L의 발현을 저해하는 것으로 구성된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 여기에서 설명하는 특정 조성물, 방법 또는 프로토콜에 한정됨이 아님을 이해해야 한다. 또한, 다른 명시가 없는 한, 여기에서 설명하는 모든 기술적 그리고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 당분야에 당업자가 인지하는 것과 동일한 의미를 가진다. 여기에서 사용된 용어들은 특정 구체예를 설명하기 위함이지 본 발명을 이에 국한시키고자 함이 아님도 인지해야 하고, 본 발명은 청구범위에 의해 한정될 것이다.
본 발명은 다음의 물질중 두가지 또는 그 이상을 포함하는 성분의 독특한 복합물이 BMP-2 프로모터, 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가 또는 자극시켜 뼈 생장을 증가시키고, 또는 RANK-L의 발현을 저해 또는 감소 또는 방해하여 뼈 재흡수를 저해시키고 또는 뼈로부터 칼슘의 방출을 저해, 감소 또는 저지시켜 뼈 재흡수를 저해하는 놀라운 발견에 근거한다; 퀘르세틴 디하이드라에트, 퀘르세틴 안하이드레이트, Rehmannia sp.의 추출물, 시베리아 인삼 추출물, Sophora japonica의 추출물, 감초의 추출물, 그리고 이프리플라본의 추출물, 석류 추출물, 올리브 추출물, 은행나무 추출물, 녹차 추출물, 포도씨 추출물, 동콰이 추출물.
BMP-2는 연장된 형질변환 생장인자 B 슈퍼패밀리에 신규한 인자들이 되는 뼈 형성 단백질 패밀리 중에 하나의 구성분이다. 재조합 BMP-2 및 BMP-4는 쥐의 피하 조직으로 국소 주사될 경우 새로운 뼈 형성을 유도할 수 있다(Wozney J. Molec (1992) 32: 160-67). BMP-2 및 BMP-4는 이들이 분화될 때 정상적인 골아세포에 의해 발현되고, in vitro에서 골아세포 분화 및 뼈 마디 형성 뿐만 아니라 in vivo에서 뼈 형성도 자극한다. 따라서, BMP-2 프로모터 활성, 유전자 발현, 및/또는 단백질 발현을 증가 또는 자극시킴으로써, 본 발명의 독특한 조성물이 뼈 생장을 증가 또는 촉진시키며, 다양한 뼈 질환을 치료 또는 예방하는데 유용하다.
핵 인자(NF)-kB 리간드의 수용체 활성물질 (또는: 오스테오프로테그린[Osteoprotegerin] 리간드, OPGL), 종양 괴사 인자 (TNF) 패밀리의 구성요소인 RANK-L는 뼈 재흡수를 돕는 뼈 세포인 성숙한 파골세포 형성을 위한 주요 자극 요소이며, 파골세포의 생존에 필수적이다. RANK-L는 골아세포 계통(lineage) 세포와 활성화된 T 임파세포에 의해 생산된다. RANK-L는 파골세포와 수지상 세포상에 위치한 특이적인 수용체 RANK를 활성화시킨다. 본 발명의 조제물에 대한 한 가지 전략은 IL-1에 의해 자극될 때 RANK-L 발현을 직접적으로 저해시키는 것이다. IL-1으로 자극될 때 RANK-L의 활성화로 파골세포형성과정(osteoclastogenesis)(그리고 뼈 재흡수)를 직접적으로 촉진시킬 수 있다. 따라서, RANK-L 발현, 생산 또는 방출을 저해, 감소 또는 저지시킴으로써, 본 발명의 독특한 조성물은 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지시키고, 골 손실, 골다공증, 골용해성(osteolytic) 뼈 등을 포함하는 다양한 골 질환에 유용하다.
퀘르세틴 추출물, 퀘르세틴 디하이드레이트, 퀘르세틴 무수물과 같은 다양한 형태의 퀘르세틴은 본 발명의 독특한 조성물에 유용한 한 가지 화합물이다. 퀘르세틴은 많은 다른 플라보노이드 예를 들면, 시트러스 플라보노이드 루틴(citrus flavonoids rutin), 헤스페리딘(hesperidin), 나링긴(naringin) 및 탄게리틴(tangeritin)을 포함하는, 플라보노이드에 기본을 형성하는 플라보노이드이다. 퀘르세틴은 연구에서 가장 활성이 있는 플라보노이드이고, 많은 의학적 식물은 이들 활성의 대부분이 높은 퀘르세틴 함량 때문이라는 것이다. 퀘르세틴은 염증의 몇 가지 초기 과정을 직접적으로 저해하기 때문에 상당한 항-염증 활성을 가지는 것으로 설명된다. 예를 들면, 히스타민 및 다른 알레르기/염증 중개물질의 제조 및 방출을 모두 저해한다. 또한, 강력한 항산화 활성과 비타민 C-절약 작용을 발휘한다.
퀘르세틴은 또한 암, 전립선염, 심장 질환, 백내장, 알레르기, 염증 및 호흡기 질환 가령, 기관지염 및 천식을 예방하거나 이에 맞서는데 긍정적인 효과를 가질 수 있다. 또한, US 특허 5,478,579에 따르면, 50-1500mg/day의 양이 이용되는 경우, 퀘르세틴 무수물 및/또는 퀘르세틴 디하이드레이트는 뼈 조직으로 칼슘의 흡수를 강화시킬 수 있다.
퀘르세틴이 풍부한 음식에는 사과, 블랙 및 그린 티, 양파, 나무딸기, 포도주, 적포도, 감귤류, 브로콜리, 잠두(fava beans), 다른 푸른 잎 야채 및 체리가 포함된다.
하기에서 더욱 상세하게 논의되겠지만, 본 발명은 퀘르세틴이 BMP-2-프로모터 활성 및 단백질 발현의 강력한 활성물질이라는 발견에 일부 근거한다. 또한, 하기에서 논의되는 검사 결과에서 퀘르세틴 디하이드레이트를 시베리아 인삼, 감초 또는 이들 둘과 함께 복합 투여하는 경우에, 임의 성분 단독으로 사용한 경우에 얻을 수 있는 결과에 비해 BMP-2 프로모터 활성 및 단백질 발현에 놀라운 시너지 효과를 얻었다.
본 발명에 이용되는 퀘르세틴 성분은 다양한 소스를 통하여 상업적으로 수득할 수 있는데 예를 들면, Twinlab (American Fork, Utah), Jarrow Formulas (Los Angeles, California), Natural Factors (Coquitlam, British Columbia, Canada), NOW Foods (Bloomingdale, Illinois)등이 포함된다. 또한, 퀘르세틴은 하기에서 좀더 상세하게 설명되는 또는 당분야에 공지된 추출 방법에 의해 수득될 수도 있다.
본 발명의 독특한 조성물에 유용한 또 다른 식물인 Rehmannia은 중국에 산재된 Lamiale에서 6종의 꽃식물의 속(genus)이다. 중국어로 지황(地黃)으로 알려진 이 약초는 빈혈, 현기증, 변비와 같은 다양한 질병에 이용된다. Rehmannia 에는 비타민 A, B, C, D, 뿐만 아니라 다른 유용한 화합물이 포함되어 있다.
Rehmannia sp. 추출물 또는 Rehmannia sp . 뿌리 추출물을 포함하는 Rehmannia sp ., 추출물은 EUL Herb Manufacturing (La Verne, California) 및NuPharma Neutraceuticals (Miami Beach, Florida)을 포함하는 다양한 상업적인 소스로부터 구입할 수 있다. 또한, Rehmannia sp.의 추출물은 하기에서 충분히 설명하는 또는 공지의 추출 방법에 의해 수득될 수도 있다.
본 발명의 독특한 조성물에 유용한 화합물중에 하나인 Eleutherococcus senticosus으로도 알려진 시베리아 인삼은 북동아시아가 자생지인 Araliaceae 패밀리의 작고, 나무로된 관목 종이다. 시베리아 인삼은 강력한 강장성 허브로 다양한 건강상 좋은 점을 가지고 있다. 예를 들면, 시베리아 인삼은 유방(유선) 암종, 위암종, 구강 암종, 피부 흑색종, 난소 암종에 대해 면역보호 효과를 가진다. 헬퍼/유도물질 타입이 주가 되는 T 임파세포 뿐만 아니라 세포독성 및 천연 킬러 세포에서 탁월한 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다. 또한, 시베리아 인삼은 골다공증에 대해 보호효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. Kropotov et al., "Effects of Siberian ginseng extract and ipriflavone on the development of glucocorticoid-induced osteoporosis." Bull Exp Biol Med., 2002. 133(3):252-4.
하기에서 충분히 논의되는 바와 같이, 본 발명은 시베리아 인삼 (또는 시베리아 인삼 추출물)이 BMP-2 프로모터 활성, BMP-2 유전자 발현 및 BMP-2 단백질 발현의 강력한 활성물질이라는 발견에 일부 근거한다. 또한, 하기에서 논의되는 검사 결과에서 시베리아 인삼 추출물과 퀘르세틴 디하이드레이트를 복합하여 투여하면, 이와 같은 복합으로 이들 성분을 단독으로 사용하였을 때 얻어지는 효과에 비해, BMP-2 프로모터 활성, 유전자 발현 및 단백질 발현에 놀라운 시너지 효과를 얻는다.
시베리아 인삼 추출물은 Xi'an Tianxingjian Natural Bio-products Group (Xi'an, Shaanxi, China)과 같은 다양한 공급업자로부터 상업적으로 수득할 수 있다. 또한, 시베리아 인삼 추출물은 하기에서 논의되는 또는 당분야에 공지된 임의 추출방법을 이용하여 수득할 수 있다. 한 실시예에서, 시베리아 인삼 추출물은 시베리아 인삼의 뿌리 또는 근경(rhizome)의 알코올 액체 추출방법으로 수득할 수 있다.
본 발명의 독특한 조성물에 유용한 또 다른 화합물인 Sophora japonica 또는 Sophora fructus japonica는 Pagoda Tree라고도 불리는데 동아시아가 자생지이다. Sophora japonica 추출물에서 볼 수 있는 활성 화합물인 루틴(Rutin)은 모세관의 침투성(예를 들면 팽창의 해결 및 다공성)을 증가시키는데 이용된다. 루틴에 추가하여, 퀘르세틴 무수물 및 퀘르세틴 디하이드레이트를 Sophora japonica 식물의 잎, 줄기, 꽃, 씨, 뿌리 등을 포함하여 식물로부터 추출하여 수득할 수 있다.
하기에서 충분히 설명되는 바와 같이, 본 발명은 Sophora japonica (또는 Sophora japonica 추출물)의 추출물이 BMP-2 프로모터 활성, 유전자 발현 및 단백질 발현에 강력한 활성물질이라는 발견에 일부 근거한다.
Sophora japonica 추출물은 NuPharma Nutraceuticals (Miami Beach, Florida)와 같은 다양한 공급업자로부터 시판되는 것을 구할 수 있다. 또는 Sophora japonica 추출물을 하기에서 논의되는 또는 당분야에 공지된 임의 추출방법을 이용하여 수득할 수 있다. 한 가지 예를 들면, Sophora japonica의 숙성된 씨를 이용하여 본 발명에 유용한 Sophora japonica 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 독특한 조성물에 이용할 수 있는 감초 추출물은 카타르, 기관지염 및 일반적인 기침과 같은 기관지 질환을 치료하는데 널리 이용된다. 감초는 또한 소화기 궤양, 위염 및 궤양을 다스리는데 중요한 성분이 된다. JP 2002 179585 및 US 20020009506에 따르면, 일일 50-100mg의 양으로 투여하였을 때, 감초는 골다공증의 치료, 골 대사의 개선 및 석회화를 촉진시키는데 이용할 수 있다.
하기에서 충분히 논의되는 바와 같이, 본 발명은 감초 추출물 예를 들면 감소의 에탄올 및 에탄올-물 추출물은 BMP-2 프로모터 활성, 유전자 발현 및 단백질 발현에 강력한 활성 물질이라는 놀라운 발견에 근거한다. 또한, 하기에서 논의되는 검사 결과에서, 감초 추출물을 퀘르세틴 디하이드레이트와 복합 투여하면, 복합물은 각 성분을 단독으로 사용하였을 때 수득되는 결과에 비해 BMP-2 프로모터 활성, 유전자 발현 및 단백질 발현에 놀라운 시너지 효과를 수득할 수 있다.
감초 추출물은 Herbs Forever, Inc. (Los Angeles, California)와 같은 다양한 공급업자로부터 상업적으로 시판되는 것을 얻을 수 있다. 또한, 감초 추출물은 하기에서 논의되는 또는 당분야에 공지된 임의 추출방법을 이용하여 수득할 수 있다. 한 가지 예를 들면, 감초 추출물은 Glycyrrhiza glabra의 뿌리, 러너(runner) 및/또는 근경에서 수득되는 감초의 에탄올 추출물이 될 수도 있다.
본 발명의 독특한 조성물에 유용한 화합물중 또 다른 한 가지인 이프리플라본(Ipriflavone)은 이소플라본이다. 이프리플라본은 알파파와 같은 콩과 식물에 소량 발견될 수도 있지만, 이프리플라본은 일반적으로 출발 물질로써 폴리페놀을 이용하여 7-이소프로폭시 이소플라본으로 합성하여 제조한다.
하기에서 충분히 설명되는 것과 같이, 본 발명은 이프리플라본이 RANK-L 발현의 강력한 저해물질이라는 발견에 일부 근거한다. 이프리플라본은 다양한 소스로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다. 예를 들면, Ostivone은 Technical Sourcing International, Inc. (Missoula, Montana)에서 이용할 수 있는 합성 이프리플라본 화합물이다.
석류(Pomegranates)는 본 발명의 독특한 조성물에 유용한 석류 추출물을 만들기 위해 추출될 수도 있다. 추출하였을 때, Punica granatum으로 공지된 석류는 일반적으로 엘라그산(ellagic acid) 또는 푸니칼라진 함량으로 표준화시킨다. 푸니칼라진는 2,3,헥사하이드로디페놀-갈라길-D-글루코즈의 이성체로 존재한다. 예시적인 구조는 하기와 같다:
Figure 112014003952727-pat00001
석류 추출물은 또한 하이드록실세이블 탄닌과 같은 폴리페놀에 많이 있고 특히 푸니칼라진에 많이 있고, 푸니칼라진은 석류 쥬스의 자유 라디칼 소거 능력을 맡고 있는 것으로 보인다.
일본에서, 석류는 골량 감소를 저해시키는데 이용하여 왔었다. 참고 JP 1999 0049884. 본 발명은 석류 추출물이 RANK-L 발현의 강력한 저해물질이라는 발견에 일부 근거한다. 한 실시예에서, 석류 추출물에 있는 푸니칼라진이 RANK-L 발현의 저해 또는 감소시킨다. 따라서, 푸니칼라진, 엘라그산 또는 이들 두 가지로 구성된 석류 추출물은 RANK-L의 생산, 방출 및/또는 발현의 저해, 감소 또는 방지시키기 위한 조성물 및 방법에 유용하다.
석류 추출물은 Nature's Way (Springville, Utah), Nature's Herbs (American Fork, Utah), Swansen's Health Products (Fargo, North Dakota) 및Doctor's Trust Vitamins (Orlando, Florida)을 포함하는 다양한 소스로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다. 또한, 석류 추출물을 하기에서 논의하는 방법 또는 당분야에 공지된 추출 기술을 이용하여 수득할 수도 있다.
본 발명의 독특한 조성물에 유용한 추출물인 은행나무 추출물은 다음의 세가지 효과를 가지는 것으로 알려져 있다: (1) 대부분의 조직과 기관으로의 혈류 개선(작은 미세혈과의 마이크로순환을 포함); (2) 자유 라디칼로부터 산화성 세포 손상에 대해 보호(항산화제); 그리고 (3) 혈소판 응집 및 혈액 응고 효과를 차단.
은행나무 추출물은 Puritan's Pride (Long Island, New York)을 포함하는 다양한 소스로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다. 또한, 은행나무 추출물은 하기에서 논의하는 방법 또는 당분야에 공지된 추출 기술을 이용하여 수득할 수도 있다. 예를 들면, 은행나무 추출물은 여기에서 설명하는 추출 과정에 의해 또는 건조된 또는 새로운 잎 또는 씨를 추출하기 위해 공지의 방법을 이용할 수도 있다.
본 발명의 독특한 조성물에 이용할 수 있는 화합물들중 하나를 만들기 위해 추출되는 녹차는 두통, 온몸이 쑤심, 소화불량을 치료하기 위한 약초로써 그리고 삶의 질 및 수명을 개선하기 위해 중국에서 오랫동안 사용되어 왔었다. 녹차 추출물에는 항산화성 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 포함하는 바이오플라보노이드가 풍부하다. 녹차 추출물에 EGCG는 소화 및 호흡기 감염으로부터 보호하고, 카시노겐 작용을 차단하여 항균물질로 기능을 할 수 있으며, 콜레스테롤 수준을 낮추는데 도움을 줄 수 있다.
하기에서 충분히 논의하겠지만, 본 발명은 녹차 추출물이 RANK-L 발현의 강력한 저해물질이라는 발견에 일부 기초한다. 녹차 추출물은 Life Extension (Fort Lauderdale, Florida)을 포함하는 다양한 소스로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 녹차 추출물은 하기에서 충분히 논의되는 또는 당분야에 공지된 추출 기술을 이용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 독특한 조성물에 유용한 또 다른 화합물인 포도 씨 추출물에는 인체에서 항산화제로 작용하는 올리고머 프로안토시아니딘 또는 OPC(자유 라디칼 소거물질)로 공지된 플라보노이드 복합체 클래스를 포함한다. OPCs는 내부 및 환경적 스트레스(즉, 흡연, 오염, 정상적인 신체 대사 과정 지원) 영향에 대항하여 보호하는데 도움을 줄 수 있다.
본 발명에 이용되는 포도씨 추출물은 상업적으로 시판되는 것을 구할 수 있다. 예를 들면, 포도씨 추출물은 Kikkoman Corporation (Tokyo, Japan), Polyphenols, Inc. (Madera, California), Bio Serae Laboratories SA (Bram, France), OptiPure (Los Angeles, California), Dry Creek Nutrition, Inc. (Modesto, California),또는 다른 소스로부터 구입할 수 있다. 또한, 하기에서 충분히 설명하는 추출 기술 또는 당분야에 공지의 기술을 이용하여 본 발명에 유용한 포도씨 추출물을 생산할 수 있다.
본 발명의 독특한 조성물에 이용할 수 있는 추출물중에 하나인 동콰이(Dong Quai)는 Angelica sinensis 또는 "여성용 인삼(female ginseng)"으로도 알려져 있고, 중국이 자생지인 Apiaceae 패밀리의 허브이다. 이 뿌리는 중국어로 동콰이 또는 당기(歸)로 흔히 알려져 있고, 부인과 질환, 피로, 가벼운 빈혈 및 고혈압 치료를 위해 한약에 널리 이용된다. 동콰이는 진통제, 소염제 및 진정 효과를 가진다. 식물의 식물 화학물질로는 코우마린(coumarins), 파이토스테롤(phytosterols), 폴리사카라이드, 페루레이트(ferulate), 플라보노이드로 구성된다.
동콰이 추출물은 Capricorns Lair (Ogden, Utah)을 포함하는 여러 소스로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다. 또한, 여기에서 설명하는 또는 당분야에 공지된 추출 기술을 이용하여 추출할 수도 있다.
본 발명에 이용되는 각 추출물을 시판되는 것을 이용할 수도 있지만 시판되는 것을 구입하지 않고 본 발명에 이용되는 추출물을 만들기 위한 다양한 추출 방법도 있다. 본 발명에 이용되는 추출물을 만들기 위해 이용할 수 있는 추출방법중 일부 실시예를 하기에서 설명한다. 다른 실시예는 다양한 공개 및 특허를 포함하여 당분야에 공지되어 있다. 여기에서 설명하는 추출 방법은 예를 들어 설명하는 것이며, 당업자는 본 발명에 이용할 수 있는 추출물을 수득하기 위해 다른 추출 기술 및 방법을 이용할 수도 있다는 것을 인지할 것이다.
본 발명에서 이용되는 추출물은 상이한 품종(varieties) 및 종을 포함하는 다양한 소스로부터 얻을 수 있다. 예를 들면 임의 색깔이나 종의 포도에서 얻은 포도씨를 이용하여 포도씨 추출물을 얻을 수 있다. 또한, 식물의 임의 부분, 예를 들면, 열매, 과실껍질, 씨, 줄기, 잎, 뿌리, 나무 껍질, 근경, 러너 등으로부터 추출할 수도 있다.
한 실시예에서, 본 발명의 독특한 조성물에 유용한 추출물은 유기 용매 추출 기술을 이용하여 수득할 수도 있다. 좀더 구체적으로, 본 발명에 유용한 추출물, 가령, 감초 추출물 또는 감초 뿌리 추출물은 감초 또는 감초 뿌리를 유기 용매 예를 들면 핵산, 에틸 아세테이트, 에탄올 또는 하이드로-에탄올로 추출하여 만들 수 있다.
또 다른 실시예에서, 용매 연속 추출을 이용하여 본 발명의 독특한 조성물에 유용한 추출물을 수득할 수도 있다. 예를 들면, 이와 같은 기술을 이용하여 포도씨 추출물은 포도씨를 헥산, 에틸 아세테이트, 하이드로-에탄올로 연속 추출하여 수득할 수 있을 것이다. 일련의 각 단계에서 수득된 추출물(분취물)에는 이들을 추출하는데 이용된 용매와 유사한 극성이 증가되는 화학물질이 포함된다. 분취물을 건조시켜 용매를 기화시키면 포도씨 추출물을 얻는다. 당업자는 많은 다른 용매를 이용하여 연속적인 분취 추출을 실시할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
전체적인 하이드로-에탄올 추출 기술을 이용하여 본 발명의 독특한 조성물에 유용한 추출물을 수득할 수 있다. 일반적으로 이는 일괄(lump-sum) 추출이라고 한다. 이 과정에서 생성된 추출물에는 지방 또는 물에 가용성인 것을 포함하는 추출된 물질에 존재하는 다양한 식물성 화학물질을 포함할 것이다. 추출물 용액을 수거한 후에, 용매는 기화시켜 추출물을 얻는다. 한 실시예에서, 이와 같은 기술을 이용하여 석류를 추출할 수 있을 것이다.
본 발명에서는 전체 에탄올 추출을 이용할 수도 있다. 이 기술은 용매로 하이드로-에탄올보다는 에탄올을 이용한다. 이 추출 기술로 물에 용해되는 화합물에 추가하여 지방 가용성 또는 친지성 화합물이 포함되는 추출물을 만들 수 있다. 녹차 추출물은 이 기술을 이용하여 수득할 수 있다.
본 발명에 유용한 추출물을 수득하는데 이용될 수 있는 추출 기술의 또 다른 예는 초임계 이산화탄소 추출(SFE)이다. 이 추출과정에서 추출될 물질은 임의 유기 용매에 노출되지 않는다. 다만 추출 용매는 초임계 조건(> 31.3℃ 및 > 73.8 bar)에서 수정물질 존부하에 이산화탄소가 된다. 당업자는 온도 및 압력 조건은 추출물의 최대 수률을 위해 변화될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이 기술에 의해 상기에서 설명하는 전체 헥산 및 에틸 아세테이트 추출과 유사하게, 지방 용해성 및/또는 친지성 화합물 추출물이 형성된다.
당업자는 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있는 추출물을 얻기 위해 이용할 수 있는 당분야에 공지된 그리고 다양한 특허 및 공보에 공개된 많은 다른 추출 과정이 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면 다음의 문헌에서 설명되는 추출 과정을 본 발명의 실시에 이용할 수 있을 것이다: Murga et al., "extraction of natural complex phenols and tannins from grape seeds by using supercritical mixtures of carbon dioxide and alcohol." J. Agric Food Chem. 2000 Aug:48(8):3408-12; Hong et al., "Microwave-assisted extraction of phenolic compounds from grape seed." Nat Prod Lett. 2001 ;15(3):197-204; Ashraf-Khorassani et al., "Sequential fractionation of grape seeds into oils, polyphenols, and procyanidins via a single system employing CO2-based fluids." J. Agric Food Chem., 2004 May 5;52(9):2440-4.
발명의 조성물
본 발명의 조성물은 수용가능한 캐리어내에서 조제되고, 뼈 생장을 증가 또는 촉진시키고, 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하고, 뼈 강도를 증가시키고, 뼈 구조를 개선시키고, 뼈 구성을 개선시키거나 또는 골절, 골다공증, 치주질환, 전이성 골질환, 골용해성 골 질환을 포함하나 이에 국한되지 않은 다양한 골 질환 치료, 예방 또는 관리를 위해 준비되고, 포장되고 라벨을 붙여질 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명은 뼈 생장을 증가 또는 자극하기 위한 조성물로 다음의 성분중 최소 두 가지를 포함하는 복합물로 구성된다: 퀘르세틴 디하이드라에트, 퀘르세틴 안하이드레이트, Rehmannia sp.의 추출물, 시베리아 인삼 추출물, Sophora japonica의 추출물, 감초의 추출물, 그리고 이프리플라본, 이때 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 뼈 생장을 증가시키기 위한 조성물로 다음의 물질중 최소 두 가지의 복합물로 구성된 조성물에 관계한다: 퀘르세틴 디하이드라에트, 퀘르세틴 안하이드레이트, Rehmannia sp.의 추출물, 시베리아 인삼 추출물, Sophora japonica의 추출물, 감초의 추출물, 그리고 이프리플라본, 이때 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시키고, 이때 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트이 존재하는 경우, 그 양의 범위는 약 10-1000mg, 좀더 적절하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg의 양으로 존재하며; Rehmannia sp. 추출물은 그 양이 약 10-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 100-900mg, 좀더 바람직하게는 약 200-800mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500 mg으로 존재하며; 시베리아 인삼 추출물은 그 양이 100-800mg, 좀더 바람직하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 존재하고; Sophora japonica 추출물은 그 양이 10-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 100-900mg, 좀더 바람직하게는 약 200-800mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 존재하고; 감초 추출물은 그 양이 10-500mg, 좀더 바람직하게는 약 25-450mg, 좀더 바람직하게는 약 50-400mg, 좀더 바람직하게는 약 75-350mg, 좀더 바람직하게는 약100-300mg, 좀더 바람직하게는 약 125-250mg, 좀더 바람직하게는 약 25-175mg으로 존재하고; 그리고 이프리플라본은 200-700mg, 좀더 바람직하게는 약 250-650mg, 좀더 바람직하게는 약 300-600mg, 좀더 바람직하게는 약 400-500mg, 좀더 바람직하게는 약 600mg으로 존재한다.
또 다른 예에서, 본 발명은 뼈 생장을 증가시키기 위한 조성물로 다음의 물질중 최소 두 가지의 복합물로 구성된 조성물에 관계한다: 퀘르세틴 디하이드라에트, 퀘르세틴 안하이드레이트, 시베리아 인삼 추출물, Sophora japonica의 추출물, 감초의 추출물 이때 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시키고, 이때 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트이 존재하는 경우, 그 양의 범위는 약 10-1000mg, 좀더 적절하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg의 양으로 존재하며; 시베리아 인삼 추출물은 그 양이 100-800mg, 좀더 바람직하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 존재하고; Sophora japonica 추출물은 그 양이 10-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 100-900mg, 좀더 바람직하게는 약 200-800mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 존재하고; 감초 추출물은 그 양이 10-500mg, 좀더 바람직하게는 약 25-450mg, 좀더 바람직하게는 약 50-400mg, 좀더 바람직하게는 약 75-350mg, 좀더 바람직하게는 약100-300mg, 좀더 바람직하게는 약 125-250mg, 좀더 바람직하게는 약 25-175mg으로 존재한다.
또 다른 예에서, 본 발명은 뼈 생장을 증가시키기 위한 조성물은 약 10-1000mg의 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트, 좀더 적절하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg과 100-800mg의 시베리아 인삼 추출물, 좀더 바람직하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg과 10-500mg의 감초 추출물, 좀더 바람직하게는 약 25-450mg, 좀더 바람직하게는 약 50-400mg, 좀더 바람직하게는 약 75-350mg, 좀더 바람직하게는 약100-300mg, 좀더 바람직하게는 약 125-250mg, 좀더 바람직하게는 약 25-175mg의 복합물이며, 이때 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 조성물로, 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트, 시베리아 인삼 추출물, 감초 추출물의 복합물로 구성되며, 이때 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시키고, 또한 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트, 시베리아 인삼 추출물, 감초 추출물은 동량으로 존재하고, 좀더 적절하게는 시베리아 인삼 추출물은 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트의 양의 1/2로 존재하고, 감초 추출물은 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트의 양의 1/10양으로 존재한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 뼈 생장을 증가 또는 촉진시키는 조성물에 관계하는데, 이조성물은 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트, 시베리아 인삼 추출물로 구성되는데, 이때 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트는 조성물의 약 10-75% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 50% w/w이 되며, 시베리아 인삼 추출물은 조성물의 약 10- 75% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 50% w/w이며, 이때 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트 및 시베리아 인삼 추출물의 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 뼈 생장을 증가 또는 촉진시키는 조성물에 관계하는데, 조성물은 다음의 물질중 최소 두가지 복합물로 구성되며; 퀘르세틴 무수물, 퀘르세틴 디하이드레이트, 시베리아 인삼 추출물, Sophora japonica 추출물, 감초 추출물: 이때 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트은 조성물의 약 10-75% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 50% w/w로 존재하고; 시베리아 인삼 추출물은 조성물의 약 10-75% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 50% w/w으로 존재하고; Sophora japonica 추출물은 조성물의 약 1-50% w/w 이 되며, 좀더 적절하게는 조성물의 약 2-15% w/w이 되고, 좀더 적절하게는 조성물의 약 5-10% w/w이 되고: 감초 추출물은 조성물의 약 1-50% w/w이 되고, 좀더 적절하게는 조성물의 약 2-15% w/w이며, 좀더 적절하게는 조성물의 약 5-10% w/w이 되며, 이들 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
또 다른 예에서, 본 발명은 뼈 생장을 증가시키기 위한 조성물로 약 10-1000mg의 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트, 좀더 적절하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg과 10-500mg의 감초 추출물, 좀더 바람직하게는 약 20-125mg, 좀더 바람직하게는 약 20-100mg, 좀더 바람직하게는 약 25-75mg, 좀더 바람직하게는 약 50mg의 복합물에 관계하고, 이때 복합물은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
또 다른 예에서, 본 발명은 뼈 생장을 증가시키기 위한 조성물로 약 10-1000mg의 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트, 좀더 적절하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg과 100-800mg의 시베리아 인삼 추출물, 좀더 바람직하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg의 복합물로 구성되며, 이때 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트와 시베리인 인삼은 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
추가 실시예에서, 본 발명은 개체에서 뼈 생장을 증가 또는 자극시키는 방법으로 조성물로 다음의 성분중 최소 두 가지를 포함하는 복합물로 구성된 조성물을 개체에 투여하는 것으로 구성된다: 퀘르세틴 디하이드라에트, 퀘르세틴 안하이드레이트, Rehmannia sp.의 추출물, Rehmannia sp.의 뿌리 추출물, 시베리아 인삼 추출물, Sophora japonica의 추출물, 감초의 추출물, 그리고 이프리플라본, 이때 복합물은 개체에서 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 구체예는 개체에서 뼈 생장을 증가시키는 방법에 관계하는데, 약 10-1000mg의 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트, 좀더 적절하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg과 100-800mg의 시베리아 인삼 추출물, 좀더 바람직하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg과 10-500mg의 감초 추출물, 좀더 바람직하게는 약 25-450mg, 좀더 바람직하게는 약 50-400mg, 좀더 바람직하게는 약 75-350mg, 좀더 바람직하게는 약100-300mg, 좀더 바람직하게는 약 125-250mg, 좀더 바람직하게는 약 25-175mg로 구성된 복합물을 개체에 투여하는 것으로 구성되며, 이때 복합물은 개체에서 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 구체예는 개체에서 뼈 생장을 증가시키는 방법에 관계하는데, 약 10-1000mg의 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트, 좀더 적절하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg과 10-500mg의 감초 추출물, 좀더 바람직하게는 약 20-125mg, 좀더 바람직하게는 약 20-100mg, 좀더 바람직하게는 약 25-75mg, 좀더 바람직하게는 약 50mg로 구성된 복합물을 개체에 투여하는 것으로 구성되며, 이때 복합물은 개체에서 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시킨다.
본 발명은 개체에서 뼈 생장을 증가시키는 방법에 관계하는데, 약 10-1000mg의 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트, 좀더 적절하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg과 100-800mg의 시베리아 인삼 추출물, 좀더 바람직하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg의 복합물을 개체에 투여하는 것으로 구성되며, 이때 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트와 시베리인 인삼의 복합물은 개체에서 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현 및/또는 활성을 증가시킨다.
또 다른 실시예에서 다음의 자연적, 식물에서 유도된 추출물중 최소 한가지와 석류 추출물로 구성된 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 예방하는 조성물에 관계한다: 시베리아 인삼 추출물, 은행나무 추출물, 녹차 추출물, Sophora japonica 추출물, Rehmannia sp . 추출물, 포도씨 추출물, 동콰이 추출물, 그리고 이프리플라본, 이때 조성물은 RANK-L의 발현, 생산 및/또는 방출을 저해하고, 석류 추출물은 약10-2000mg의 양으로 존재하고, 좀더 바람직하게는 약 300-1700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-1500mg, 좀더 바람직하게는 약 500-1250mg, 좀더 바람직하게는 약 600-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 700-900mg; 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 존재하고; 시베리아 인삼 추출물이 있는 경우에, 그 양은 약 100-2000mg, 좀더 바람직하게는 약 300-1700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-1500mg, 좀더 바람직하게는 약 500-1250mg, 좀더 바람직하게는 약 600-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 700-900mg; 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 존재하고; 은행나무 추출물은 약 10-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 100-900mg, 좀더 바람직하게는 약 200-800mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 존재하고; 녹차 추출물은 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 350-650mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg 양으로 존재하고; Sophora japonica 추출물은 약 10-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 100-900mg, 좀더 바람직하게는 약 200-800mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 존재하고; Rehmannia sp . 추출물은 약 10-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 100-900mg, 좀더 바람직하게는 약 200-800mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500 mg으로 존재하고; 포도씨 추출물은 약 35-250mg으로 존재하고, 좀더 바람직하게는 약 50-150mg, 좀더 바람직하게는 약 75-125mg으로 존재하고; 동콰이 추출물은 약 10-1000mg으로 존재하고, 좀더 바람직하게는 약 100-900mg, 좀더 바람직하게는 약 200-800mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 존재하고; 그리고 이프리플라본은 약 400-700mg으로 존재하고, 좀더 바람직하게는 약 450-650mg, 좀더 바람직하게는 약 500-600 mg, 좀더 바람직하게는 약 600mg으로 존재하고; 이때 이들 복합물은 RANK-L 발현, 생산 및/또는 RANK-L의 방출을 저해하거나 뼈로부터 칼슘 방출을 저해한다.
추가 구체예에서, 본 발명은 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 예방하는 조성물로, 조성물은 약10-2000mg의 석류 추출물, 좀더 바람직하게는 약 400-1700mg, 좀더 바람직하게는 약 500-1500mg, 좀더 바람직하게는 약 600-1250mg, 좀더 바람직하게는 약 700-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 800-900mg; 약 35-250mg의 포도씨 추출물, 좀더 바람직하게는 약 50-150mg, 좀더 바람직하게는 약 75-125mg으로 존재하고; 약 400-700mg의 이프리플라본, 좀더 바람직하게는 약 450-650mg, 좀더 바람직하게는 약 500-600mg, 좀더 바람직하게는 약 600mg, 약 300-700mg의 녹차 추출물, 좀더 바람직하게는 약 350-650mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 구성되고; 이때 이들 복합물은 RANK-L 발현, 생산 및/또는 RANK-L의 방출을 저해하거나 뼈로부터 칼슘 방출을 저해한다.
추가 구체예에서, 본 발명은 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 예방하는 조성물로, 조성물은 약10-2000mg의 석류 추출물, 좀더 바람직하게는 약 400-1700mg, 좀더 바람직하게는 약 500-1500mg, 좀더 바람직하게는 약 600-1250mg, 좀더 바람직하게는 약 700-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 800-900mg; 약 35-250mg의 포도씨 추출물, 좀더 바람직하게는 약 50-150mg, 좀더 바람직하게는 약 75-125mg으로 존재하고; 약 400-700mg의 이프리플라본, 좀더 바람직하게는 약 450-650mg, 좀더 바람직하게는 약 500-600mg, 좀더 바람직하게는 약 600mg으로 구성되고; 이때 이들 복합물은 RANK-L 발현, 생산 및/또는 RANK-L의 방출을 저해하거나 뼈로부터 칼슘 방출을 저해한다.
추가 구체예에서, 본 발명은 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 예방하는 석류 추출물, 포도씨 추출물, 그리고 이프리플라본의 복합물로 구성된 조성물에 관계하는데, 포도씨 추출물은 석류 추출물의 1/10양으로 존재하고, 이때 이프리플라본은 400-700mg, 좀더 바람직하게는 약 450-650mg, 좀더 바람직하게는 약 500-600mg, 좀더 바람직하게는 약 600mg으로 존재하고; 이때 이들 복합물은 RANK-L 발현, 생산 및/또는 RANK-L의 방출을 저해하거나 뼈로부터 칼슘 방출을 저해한다.
추가 실시예에서, 본 발명은 석류 추출물, 포도씨 추출물, 이프리플라본 및 녹차 추출물의 복합물로 구성된 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 예방하는 조성물에 관계하는데, 석류 추출물이 존재하는 경우, 그 양은 조성물의 약 25-100% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 30-90% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 40-80% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 45-60% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 50% w/w양으로 존재하고, 포도씨 추출물은 조성물의 약 1-25% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 2-15% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 5-10% w/w로 존재하고; 이프리플라본은 조성물의 약 25-100% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 30-90% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 40-80%, 좀더 적절하게는 조성물의 약 45-60%, 좀더 적절하게는 조성물의 약 50% w/w으로 존재하고; 녹차 추출물은 조성물의 약 1-25% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 2-15% w/w, 좀더 적절하게는 조성물의 약 5-10% w/w으로 존재하고, 이때 이들 복합물은 RANK-L 발현, 생산 및/또는 RANK-L의 방출을 저해하거나 뼈로부터 칼슘 방출을 저해한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 개체에서 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하는 방법에 관한 것으로 이 방법은 석류, 시베리아 인삼, 은행나무, 녹차, Sophora japonica, Rehmannia sp., 포도씨, 동콰이, 이프리플라본의 추출물중 최소 하나를 포함하는 자연, 식물에서 유도된 추출물로 구성된 조성물을 개체로 투여하는 것이며, 이때 조성물은 RANK-L 발현, 생산 및/또는 RANK-L의 방출을 저해하거나 뼈로부터 칼슘 방출을 저해한다.
추가 구체예에서, 본 발명은 개체에서 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하는 방법에 관한 것으로 이 방법은 약10-2000mg의 석류 추출물, 좀더 바람직하게는 약 400-1700mg, 좀더 바람직하게는 약 500-1500mg, 좀더 바람직하게는 약 600-1250mg, 좀더 바람직하게는 약 700-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 800-900mg; 약 35-250mg의 포도씨 추출물, 좀더 바람직하게는 약 50-150mg, 좀더 바람직하게는 약 75-125mg으로 존재하고; 약 400-700mg의 이프리플라본, 좀더 바람직하게는 약 450-650mg, 좀더 바람직하게는 약 500-600mg, 좀더 바람직하게는 약 600mg, 약 300-700mg의 녹차 추출물, 좀더 바람직하게는 약 350-650mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 구성된 조성물을 개체로 투여하는 것이며; 이때 이들 복합물은 RANK-L 발현, 생산 및/또는 RANK-L의 방출을 저해하거나 뼈로부터 칼슘 방출을 저해한다.
추가 구체예에서, 본 발명은 개체에서 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하는 방법에 관한 것으로 이 방법은 약10-2000mg의 석류 추출물, 좀더 바람직하게는 약 400-1700mg, 좀더 바람직하게는 약 500-1500mg, 좀더 바람직하게는 약 600-1250mg, 좀더 바람직하게는 약 700-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 800-900mg; 약 35-250mg의 포도씨 추출물, 좀더 바람직하게는 약 50-150mg, 좀더 바람직하게는 약 75-100mg으로 존재하고; 약 400-700mg의 이프리플라본, 좀더 바람직하게는 약 450-650mg, 좀더 바람직하게는 약 500-600mg, 좀더 바람직하게는 약 600mg으로 구성된 조성물을 개체로 투여하는 것이며; 이때 이들 복합물은 RANK-L 발현, 생산 및/또는 RANK-L의 방출을 저해하거나 뼈로부터 칼슘 방출을 저해한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 뼈 생장을 증가 또는 자극시키며, 그리고 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하기 위한 식이보충제에 관계하는데, 이는 퀘르세틴 디하이드라에트, 퀘르세틴 안하이드레이트, Rehmannia sp.의 추출물, Rehmannia sp. 뿌리 추출물, 시베리아 인삼 추출물, Sophora fructus japonica의 추출물, Sophora japonica의 추출물, 감초의 추출물, 그리고 이프리플라본 중 최소 두가지의 복합물로 구성된 제1조성물, 이때 복합물은 개체에서 BMP-2 유전자 또는 단백질 발현을 증가시키고; 석류 추출물, 올리브 추출물, 시베리아 인삼 추출물, 은행나무추출물, 녹차 추출물, Sophora japonica의 추출물, Rehmannia sp.의 추출물, 포도씨 추출물, 동콰이 추출물, 그리고 이프리플라본중 최소 두 가지 복합물로 구성된 제2조성물, 이때 복합물은 RANK-L의 발현을 저해하는 것으로 구성된다.
추가 실시예에서, 본 발명은 뼈 생장을 증가 또는 자극시키며, 그리고 뼈 재흡수를 저해, 감소 또는 방지하기 위한 식이보충제에 관계하는데, 이때 제1조성물은 다음의 최소 두가지 복합물로 구성되고: 퀘르세틴 디하이드라에트, 퀘르세틴 안하이드레이트, 시베리아 인삼 추출물, 감초의 추출물, Sophora japonica의 추출물, 이때, 퀘르세틴 무수물 또는 퀘르세틴 디하이드레이트이 존재하는 경우, 그 양의 범위는 약 10-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg이 되며; 시베리아 인삼 추출물이 존재한다면, 그 양은 약 100-800 mg이 되며, 좀더 바람직하게는 약 200-750mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg이 되며; 감초 추출물이 존재한다면 그 양은 10-500mg, 좀더 바람직하게는 약 25-450mg, 좀더 바람직하게는 약 50-400mg, 좀더 바람직하게는 약 75-350mg, 좀더 바람직하게는 약 100-300mg, 좀더 바람직하게는 약 125-250mg, 좀더 바람직하게는 약 25-175mg이 되며; 그리고 Sophora japonica 추출물은 약 10-1000mg으로 존재하며, 좀더 바람직하게는 약 100-900mg, 좀더 바람직하게는 약 200-800mg, 좀더 바람직하게는 약 300-700mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 존재하고, 이때 제1조성물의 복합물은 BMP-2의 발현 및/또는 활성을 증가시키고; 석류 추출물, 포도씨 추출물, 이프리플라본, 녹차 추출물중 최소 두가지 복합물로 구성된 제2조성물에서, 이때 석류 추출물이 존재한다면 그 양은 약 10-2000mg이 되며, 좀더 바람직하게는 약400-1700mg, 좀더 바람직하게는 약 500-1500mg, 좀더 바람직하게는 약 600-1250 mg, 좀더 바람직하게는 약 700-1000mg, 좀더 바람직하게는 약 800-900mg이 되며; v포도씨 추출물이 존재한다면 그양은 약 35-250mg이 되며, 좀더 바람직하게는 약50-150mg, 좀더 바람직하게는 약 75-125mg이 되며; 이프리플라본은 약 400-700mg의 양으로 존재하고, 좀더 바람직하게는 약 450-650mg, 좀더 바람직하게는 약 500-600 mg, 좀더 바람직하게는 약 600mg의 양으로 존재하고; 녹차 추출물이 존재한다면 그 양은 약 300-700 mg이 되며, 좀더 바람직하게는 약 350-650mg, 좀더 바람직하게는 약 400-600mg, 좀더 바람직하게는 약 500mg으로 존재하고, 제2조성물 복합물은 RANK-L의 발현을 저해하거나 뼈로부터 칼슘의 방출을 저해한다.
투여 방식
본 발명의 조성물은 전신으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 전신 사용을 위해, 본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따라 장관외(parenteral)(가령, 정맥, 피하, 근육, 복막, 비강 또는 경피) 또는 장관(enteral)(가령, 경구 또는 직장) 투여에 맞도록 조제되어야 한다.
정맥 투여는 일련의 주사 또는 일정 기간동안 연속 주입을 통하여 이루어질 수 있다. 주사 또는 다른 별개의 위치에서 투여 경로를 통한 투여는 주단위로 또는 일일 1회 내지 3회 간격으로 실행할 수 있다. 또는, 여기에서 설명하는 조성물은 순환 방식(설명된 조성물의 투여; 투여없음; 설명된 조성물의 투여; 등과 같은 방법)으로 투여될 수도 있다. 원하는 결과를 얻을 때까지 처치는 계속된다. 또는 본 발명의 조성물 투여를 지속하여 치료를 위한 것보다는 예방차원이 될 수도 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 염, 완충염, 5% 덱스트로즈/물, 미량 금속 등을 포함하는 붕산염-완충된 염과 같은 미용상 또는 약학적으로 수용가능한 비이클이 포함될 수도 있다. 본 발명의 조성물에는 추가로 하나 또는 그 이상의 부형제가 포함될 수도 있는데, 예를 들면, 비타민 A, D 또는 칼슘; 보존제; 가용제; 완충제; 유리 표면상에 단백질 손상을 방지; 윤활제; 충진제; 안정화제 등이 포함될 수 있다. 조제 방법은 당업자에 잘 공지되어 있고, Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Mack Publishing Co., Easton PA, 1990에서도 설명되어 있으며 참고를 위해 전문을 첨부한다.
본 발명내에서 이용할 수 있는 조성물은 멸균, 비-발열 액상 용액 또는 현탁액, 피복된 캡슐, 좌약, 동결건조된 분말, 경피 패취 또는 당분야에 공지된 다른 형태가 될 수도 있다. 국소 투여는 손상 또는 감염 주위에 주사를 하거나 그 부위에 고형 캐리어를 삽입 또는 부착하거나 또는 점성 액체의 직접적인, 국소 투여를 통하여 이루어질 수 있다. 국소 투여를 위해 운반용 비이클은 뼈 또는 연골 생산을 위한 매트릭스로 제공하는 것이 적절하고, 좀더 바람직하게는 부작용없이 개체가 흡수 할 수 있는 것이 좋다.
수용성 현탁액에는 비타민 A, D, 칼슘, 현탁제 가령, 메틸 셀룰로오즈; 습윤제 가령, 레시틴, 리솔레시틴 또는 긴쇄 지방 알코올과 같은 약리학적으로 수용가능한 부형제와 혼합하여 본 발명의 추출 성분이 포함될 수 있다. 이와 같은 수용성 현탁액에는 보존제, 발색제, 향료, 감미제 및 산업 기준에 따른 이와 유사한 것들도 포함될 수 있다.
적절하게는 본 발명의 조성물은 알약, 정제, 분말, 바(bar), 음식, 음료, 트로치제(lozenge)의 형태로 경구 투여된다. 추가로, 본 발명의 조성물은 사용하기 전에 물 또는 다른 적절한 비이클로 재구성될 수 있는 건조된 분말형 산물로 제공될 수도 있다. 액상 준비물은 현탁제(가령, 솔비톨 시럽, 셀룰로오즈 유도체 또는 수화된 식용 지방); 에멸젼제(가령, 레시틴 또는 아카시아); 비-수용성 비이클(가령, 아몬드 오일, 오일 에스테르, 또는 분획화된 식물성 오일); 그리고 보존제(가령, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빈산)과 같은 약학적으로 수용가능한 보조제를 이용하여 통상적인 수단으로 준비될 수 있다.
음료 형태로 투여되는 경우에, 본 발명의 조성물은 물에, 우유에, 차에, 과일쥬스에 또는 이의 일부 복합 형태에 포함 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 결합제(가령, 선젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈); 충진제(가령, 락토즈, 미소결정 셀룰로오즈 또는 칼슘 하이드로젠 포스페이트); 윤활제(가령, 스테아레이트 마그네슘, 활석 또는 실리카); 붕해제(가령 감자 전분 또는 쇼듐 스타치 글리콜레이트) 또는 습윤제(가령, 쇼듐 라우릴 설페이트)와 같은 약리학적으로 수용가능한 부형제로 통상적인 수단에 의해 고형으로 경구 투여될 수 있다. 고형은 당분야에 공지된 방법에 의해 피복될 수도 있다. 적절한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 투피스의 경질 캡슐, 연질 젤라틴 캡슐 또는 경구 투여를 위한 액체에 용해될 수 있는 분말 형태를 취할 수 있다. 경구 투여를 위한 준비물은 활성 화합물을 조절 방출하기 위해 적절히 조제될 수 있을 것이다.
본 발명의 경구로 투여될 수 있는 조성물에는 추가로 산탄 검, 카르복시-메틸-셀룰로오즈, 카르복시에틸-셀룰로오즈, 하이드록시프로필-셀룰로오즈, 전분, 덱스트린, 발효된 유장, 두부, 말토덱스트린과 같은 농후제, 슈가 알코올을 포함하는 폴리올(가령, 소르비톨 및 만니톨), 탄수화물(가령, 락토즈), 프로필렌 글리콜 알기네이트, 겔란 검, 구아르, 펙틴, 트라가탄 검, 아카시아 검, 메뚜기 콩 검, 아라빅 검, 젤라틴 및 이들의 혼합물로 된 농후제를 추가 포함할 수 있다. 이와 같은 농후제는 일반적으로 특정 농후제에 따라, 그리고 원하는 점성 효과에 따라 본 발명의 조제물에 최소 약 0.1%까지 포함될 수 있다.
본 발명의 경구 투여되는 조성물은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 감미제 효과량을 포함하는데, 감미제에는 탄수화물 감미제 및 천연 및/또는 인공의 칼로리 없는 또는 칼로리가 낮은 감미제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조제물에 이용되는 감미제의 양은 다양하게 변화될 수 있지만, 일반적으로 이용되는 감미제의 타입 및 원하는 당도에 따라 달라질 수 있다.
기존에 설명된 조제물에 추가하여, 화합물은 지연된 또는 일정간격으로 방출되는 조제물로 조제될 수 있다. 통상의 시간지정 또는 제어된 방출 운반계에는 전분, 삼투펌프 또는 젤라틴 마이크로 캡슐을 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
조성물은 원하는 경우 본 발명의 조성물로 구성된 하나 또는 그 이상의 단위 약형으로 구성될 수 있는 포장 또는 디스펜스 장치를 통하여 제공될 수도 있다. 팩은 블리스터(blister) 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 포일로 구성될 수도 있다. 팩 또는 디스펜스 장치에는 투여 지침이 포함될 수도 있다.
국소 투여를 위한 본 발명의 조제물에는 저가 지방족 알코올, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리글리콜, 지방산 에스테르, 지방 및 실리콘으로 구성될 수 있는 미용학적으로 또는 약학적으로 적절한 비이클내에 에어로졸 스프레이, 로션, 겔 및 연고 형태로 구성될 수 있다. 준비물에는 추가로 아스코르브산 또는 토코페롤과 같은 항산화제, p-하이드록시벤조산 에스테르와 같은 보존제가 추가 포함될 수도 있다.
장관외 준비물에는 특정 멸균 또는 멸균된 산물로 구성될 수 있다.
주사용 조성물은 본 발명의 추출물 복합물과 주사용 공지 캐리어를 포함하는 형태로 제공될 수도 있다. 여기에는 삼투압을 조절할 수 있는 염도 포함될 수 있다.
다른 유용한 단위 약형은 당분야에 당업자가 인지할 수 있는 방법 및 기술에 의해 준비될 수 있으며, 정제, 캡슐, 또는 액체 약형을 만들기 위해 이용되는 추가 성분이 포함될 수 있다. 예시적인 약형, 투여 빈도, 투여 방법이 설명되어 있지만, 이는 단순히 예를 든 것 뿐이며, 투여, 투여 빈도, 투여 방법은 나이, 체중, 개별 소비자 또는 환자의 반응 및 상태, 이용되는 특정 조성물에 따라 다양하게 변화될 수 있다.
실시예
출원인은 동물 실험에 참여하지 않는다. 그러나, 본 발명의 조성물 및 방법에 이용된 잠재 성분의 in vitro 테스트를 통하여 유의적인 결과를 수득하였고, 이와 같은 in vitro 테스트가 유용한 정보를 제공하지만 이와 같은 테스트가 동물 연구를 대체할 수는 없다. 그 이유는 기관으로써의 뼈와 이를 조절하는 복합 기준이 실험실 상태와 유사할 수 없기 때문이다. 따라서, 출원인은 하기에서 설명하는 몇 가지 동물 연구를 실시하여 본 발명에서 유용한 조성물 및 방법의 활성을 확인하였다. 모든 동물 연구를 실행함에 있어서, 출원인은 Food and Drug Administration, Division of Metabolic and Endocrine Drug Products에서 1994년 4월에 공개한 폐경 골다공증 예방 및 치료에 이용되는 물질들의 전임상 및 임상 평가를 위한 지침서에서 제시한 바의 동물의 취급을 위한 지침을 준수하였다. (참고, Guidelines for Preclinical Evaluation and Clinical Trials in Osteoporosis published by the World Health Organization in 1998 (ISBN number 9789241545228) and Wark, John D. and Westmore, Ann, Studies of drugs and other measures to prevent and treat osteoporosis; 비전문가를 위한 안내 사이트www.who.int/entity/ageing/publications/noncommunicable/alc_osteoporosis_bhef.pdf - (last visited October 21 , 2007), 전문을 참고문헌으로 첨부함.)
실시예 1: BMP -2 프로모터, 유전자, 단백질의 발현/활성
리포터 유전자 루시페라제에 연결된 BMP-2 프로모터로 전이 감염된 뮤린 섬유아세포인 2T3-BMP2-Luciferase 세포를 alpha-MEM 10% FCS + 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 글루타민를 이용하여 배양하고, 이를 1주일에 한번씩 1/5로 분리하였다. 세포를 세포당 5 x 103 cells/1OO㎕/well의 밀도로 미량적정 플레이트상에 도말하였다. 세포는 37℃에서 5% CO2상태에서 24시간은 선 배양 시간을 이용하여 흡착되고 안정화되도록 하였다. 배지를 제거하고, 50㎕ alpha-MEM 4% FCS를 대체시켰다. 테스트할 화합물 또는 인자(2x)를 포함하는 50㎕ Serum Free(0.1%BSA)를 각 웰에 첨가하였다. 최종 용적은 100㎕ 이며, 최종 혈청 농도는 2% FCS이다. 이용되는 통상의 포지티브 콘트를은 재조합 사람 BMP2 ("rhBMP2") 또는 Chinese Hamster Ovary-BMP2 ("CHO-BMP2") 조건화 배지이다. 처리된 세포를 48시간 동안 37℃에서 5% CO2상태에서 항온처리하였다. 그 다음 배지를 제거하고 세포를 PBS로 3회 헹궈낸다. 과량의 PBS는 웰에서 제거하고, 100㎕ 세포 배양 용해 시약(Promega # E153A)을 각 웰에 첨가하고, 최소 10분간 항온처리하였다. 10㎕ 세포 용해물을 96웰 화이트 루미노메트릭 플레이트(Dynatech Labs # 0010107100)-100㎕ 루시퍼라제 검사 완충액과 기질(Promega # E152A) 포함-에 첨가하였다. 루시퍼라제 활성을 Dynatech ML2250 자동화 96 웰 루미노메터를 이용하여 판독한다. 데이터는 웰당 루시퍼라제 활성 또는 단백질 ㎍ 루시퍼라제 활성 비율로 나타낸다.
다음의 화합물들, [퀘르세틴, Rehmannia sp. 추출물, Rehmannia sp. 뿌리 추출물, 시베리아 인삼 추출물, Sophora japonica 추출물, 감초 추출물, 이프리플라본, 및 cal-z-뼈]를 BMP-2 프로모터를 활성화시키는 능력에 대해 테스트하였다. 표 1에서 그 결과 및 테스트된 농도에 대해 보고한다.
BMP2 프로모터 검사(대조군에 대한 비율)
Conc R-1 R-2 R-3 SFJ SJ SG Q I L CZB
㎍/
㎖		 FOLD*
100 1.00 0.90 0.80 2.00 0.80 1.10 5.20 4.50 1.40 0.90
50 0.90 0.90 0.90 1.60 0.70 0.90 4.80 4.40 1.40 0.90
25 0.90 1.10 0.95 1.00 0.84 1.30 3.60 3.90 1.00 1.10
12.5 0.90 1.30 0.93 1.00 0.77 1.20 2.90 3.60 0.80 1.90
6.3 1.00 1.10 0.88 0.90 0.87 1.30 2.30 2.90 0.80 1.40
3.2 1.10 1.10 0.93 0.90 0.87 1.40 1.80 2.10 0.90 1.10
1.6 1.00 1.20 0.95 1.40 0.88 1.20 1.30 1.50 0.70 1.30
0.8 1.10 1.10 0.98 0.90 0.85 1.20 1.15 1.20 0.80 1.20
0.4 0.90 1.00 0.99 0.90 0.85 1.10 1.00 0.90 0.80 1.20
0.2 1.00 0.90 0.86 0.90 0.79 1.20 1.10 1.00 0.80 1.10
0.1 0.90 0.90 0.87 0.80 0.82 1.10 1.10 0.90 1.20 1.10
0.05 0.80 0.90 1.08 1.20 0.84 1.00 1.00 1.00 0.70 1.10
표 1에서, R-1 = Rehmannia sp. 추출물 (EUL), R-2 = Rehmannia sp. 추출물 (Draco), R-3 = Rehmannia sp. 뿌리 (NuPharma), SFJ = Sophora fructus japonica, SJ = Sophora japonica (NuPharma), SG = 시베리아 인삼, Q = 퀘르세틴, I = 이프리플라본, L = 감초, CZB = Cal-Z-뼈. *주석: 폴드 값이 2 또는 그 이상이 되면, 처치로 인하여 BMP-2-프로모터를 상당히 활성화시켰다는 것을 말한다. 폴드값이 2미만이면, 처치는 BMP-2-프로모터 상에 효과가 없음을 말한다. 따라서, 이 검사에 따르면, 퀘르세틴 디하이드레이트 및 이프리플라본이 BMP-2 프로모터의 가장 강력한 활성물질임을 말한다.
BMP-2 프로모터를 테스트하기 위해 상기에서 설명된 것과 유사한 검사를 이용하여 BMP-2 유전자 발현 및 단백질 발현을 테스트하는 것도 가능하다. 특히, 유전자 발현을 위해, 사람의 골육종 세포주, MG-63 (ATCC# CRL-1427)를 MEM을 포함하는 페놀-레드(ATCC에서 추천함)에서 37℃, 5% CO2에 유지시켰다. 실험 24시간 전에 3x105 세포를 페놀-레드 없는 MEM으로 12-웰 플레이트상에 접종하였다. 각 실험을 위해 세포들을 테스트 추출물 10, 1, 0.1㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 하룻밤 항온처리후에, RNA를 통상의 트리졸/구아니딘 이소티오시아네이트계 용해를 이용하여 추출하였다. 분리된 RNA를 RNase-free DNase I으로 처리하여 임의 DNA 오염물질을 제거하고 랜덤 헥사머 및 oligo(dT) 프라이머(제조업자의 지시; Stratagene)를 이용하여 역전시켰다. 정량적인 실시간 PCR은 BMP-2에 대해 FAM-라벨된 특정 프라이머와 18S rRNA에 대해 HEX-라벨된 특정 프라이머를 이용하여 실시한다(Invitrogen). 모든 반응은 3중 반복하고, 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플에서 mRNA의 상대적인 양은 비교 CT 방법을 이용하여 계산한다(Applied Biosystems (2001)). 2배 또는 그이상의 유전자 발현 변화는 유의성이 있는 것으로 간주한다.
BMP-2 단백질 발현을 측정하기 위해, HuO9 세포를 1x104 cells/well의 밀도에서 96-웰 배양 플레이트상에서 도말시키고, 24시간 동안 10% FCS가 보충된 알파-MEM으로 배양시켰다. 세포를 24시간동안 상이한 프로테아좀 저해물질로 처리하였다. 항온처리후, 조건화된 배지를 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 2-3분간 14,000rpm에서 원심분리시켜 세포 찌꺼지를 제거한다. 상층액에 BMP-2 단백질의 농도는 표준 BMP- 2 Elisa Kit (R&D ELISA KIT DBP200)를 이용하여 측정한다. 재조합hBMP-2 (R&D)를 표준으로 이용한다.
다음의 화합물[퀘르세틴, Rehmannia sp. 추출물, Rehmannia sp. 뿌리 추출물, 시베리아 인삼 추출물, Sophora japonica 추출물, 감초 추출물, 이프리플라본, cal-z-뼈]의 BMP-2 유전자 발현 및 단백질 발현을 증가시키는 능력에 대해 테스트하였다. 표2에서는 단백질 발현 검사에 테스트된 농도와 그 결과를 나타낸다.
BMP-2 단백질 발현 검사
Conc R-1 R-2 R-3 SFJ SJ SG Q I L CZB
㎍/㎖ FOLD*
100 <1.3 <1.3 <1.3 3.0 <1.3 2.4 2.2 1.8 <1.3 <1.3
10 <1.3 <1.3 <1.3 3.0 <1.3 3.4 4.6 1.8 <1.3 <1.3
1 <1.3 <1.3 <1.3 2.2 <1.3 2.0 2.0 2.4 <1.3 <1.3
0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
표 2에서, R-1 = Rehmannia sp. 추출물 (EUL), R-2 = Rehmannia sp. 추출물 (Draco), R-3 = Rehmannia sp. 뿌리 (NuPharma), SFJ = Sophora fructus japonica, SJ = Sophora japonica (NuPharma), SG = 시베리아 인삼, Q = 퀘르세틴, I = 이프리플라본, L = 감초, CZB = Cal-Z-뼈. *주석: 폴드 값이 2 또는 그 이상이 되면, 처치로 인하여 BMP-2-프로모터를 상당히 활성화시켰다는 것을 말한다. 폴드값이 2미만이면, 처치는 BMP-2-프로모터 상에 효과가 없음을 말한다.
표3에서는 단백질 발현 검사에 테스트된 농도와 그 결과를 나타낸다. 유전자 발현에서 2배 또는 그 이상의 변화가 있는 증가는 유의적인 것으로 간주한다.
BMP-2 유전자 발현 검사, 10㎍/㎖
테스트성분: 유전자 발현의 변화
Rehmannia sp . 추출물(EUL) 28×증가
Rehmannia sp . 추출물 (Draco) 11.7×증가
Rehmannia sp . 뿌리 (NuPharma) 6.3×증가
Sophora fructus japonica 49×증가
Sophora japonica (NuPharma) 8.3×증가
시베리아 인삼 27×증가
퀘르세틴 2.6×증가
이프리플라본 효과 없음
감초 45×증가
유전자 발현 검사의 추가 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4에서, Q = 퀘르세틴, SG=시베리아 인삼, SJ= Sophora japonica , L = 감초, 유전자 발현에서 2배 또는 그 이상의 변화가 있는 증가는 유의적인 것으로 간주한다. 퀘르세틴 단독으로 사용하였을 때보다 감초에 대한 퀘르세틴의 비율이 10:5 또는 2:1 그리고 10:10 또는 1:1의 비율에서 시너지 효과가 관찰되었다.
BMP-2 유전자 발현 검사
성분(약량): N BMP-2 발현
(배수 변화)
Q(100㎍/ml) 1 14
Q(20㎍/ml) 2 4.61±0.07
Q(10㎍/ml) 1 5
Q(10㎍/ml) 2 3.48±0.08
Q(10㎍/ml) 2 3.54±0.12
Q(10㎍/ml) 2 3.52±0.12
Q(5㎍/ml) 2 2.51±0.14
Q(1㎍/ml) 1 2
Q(1㎍/ml) 1 2.03
Q(0.1㎍/ml) 1 변화없음 (-1.06)
SG(10㎍/ml) 2 11.26±0.14
SG(10㎍/ml) 2 12.38±1.00
SG(1㎍/ml) 2 5.61±1.45
SG(0.1㎍/ml) 2 2.58±0.38
SJ(10㎍/ml) 2 29.10±2.71
SJ(10㎍/ml) 2 32.45±0.32
SJ(10㎍/ml) 2 32.80±1.12
SJ(5㎍/ml) 2 23.43±0.23
SJ(2.5㎍/ml) 2 14.89±0.95
SJ(1㎍/ml) 2 11.64±2.04
SJ(0.1㎍/ml) 2 3.72±0.37
L(100㎍/ml) 1 29
L(10㎍/ml) 1 8
SJ(1㎍/ml) 1 4
Q+SG(각10㎍/ml) 2 변화없음
(0.07±1.82)
Q+SG(각10㎍/ml) 1 변화없음
(1.36)
Q+SJ(각10㎍/ml) 2 12.01±0.76
Q(10㎍/ml)+SJ(1㎍/ml) 2 7.09±0.76
Q(10㎍/ml)+SJ(0.1㎍/ml) 2 2.63±0.15
Q(1㎍/ml)+SJ(10㎍/ml) 2 변화없음
(1.30±0.17)
Q(5㎍/ml)+SJ(2.5㎍/ml) 2 4.07±0.02
Q(10㎍/ml)+SJ(5㎍/ml) 2 13.86±1.22
Q(20㎍/ml)+SJ(10㎍/ml) 2 16.86±0.41
SG(10㎍/ml)+SJ(10㎍/ml) 2 1.97±0.62
SG(10㎍/ml)+SJ(1㎍/ml) 2 3.36±0.04
SG(10㎍/ml)+SJ(0.1㎍/ml) 2 4.57±0.87
Q(100㎍/ml)+L(100㎍/ml) 1 38
Q(100㎍/ml)+L(10㎍/ml) 1 252
Q(100㎍/ml)+L(1㎍/ml) 1 35
Q(10㎍/ml)+L(100㎍/ml) 1 92
Q(10㎍/ml)+L(10㎍/ml) 1 71
Q(10㎍/ml)+L(1㎍/ml) 1 15
Q(1㎍/ml)+L(100㎍/ml) 1 31
Q(1㎍/ml)+L(10㎍/ml) 1 37
Q(1㎍/ml)+L(1㎍/ml) 1 6
Q+SG+SJ(각 10㎍/ml) 2 변화없음
(1.39±0.26)
Q(0㎍/ml) 3 1.01±0.05
Q(10㎍/ml) 3 7.22±0.51
L(0㎍/ml) 3 1.01±0.05
L(1㎍/ml) 3 1.34±0.12
L(5㎍/ml) 3 0.81±0.03
L(10㎍/ml) 3 1.04±0.04
Q(10㎍/ml)+L(1㎍/ml) 3 8.54±2.19
Q(10㎍/ml)+L(5㎍/ml) 3 13.50±4.49
Q(10㎍/ml)+L(10㎍/ml) 3 14.77±3.04
실시예 2: 뼈 생장을 측정하기 위한 두개골( Calvarial ) 검사
4일령 Swiss 흰쥐의 새로 태어닌 뮤리 두개골을 떼내어, BGJ 배지(Sigma)에 두고, 중간 봉합선을 따라 반으로 자른다. 1㎖ BGJ 배지+ 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 관련 인자들 또는 비이클이 첨가된 12웰 조직 배양 플레이트(Costar)의 각 웰에 첨가한다. 각 절반의 두개골을 배지/공기 사이면에서 상기 배지에 스테인레스 스틸 격자에 둔다. 통상 각 실험군에서 4개 뼈를 이용한다. 재조합 BMP-2 (5㎍/㎖), FGF (100ng/㎖) 또는 인슐린(10㎍/㎖)을 뼈 형성에 대한 포지티브 자극물질로 이용할 수 있다. 테스트되는 인자들을 0일(절단한 날)에 첨가하고, 배지는 24와 96시간(7일 검사가 필요한 경우)에 교환한다. 두개골은 37℃, 가습 대기(5% CO2)에 유지시킨다. 항온처리후에, 두개골을 제거하고, 10% 포르말린에 하룻밤동안 고정시킨다. 두개골을 그 다음 14% EDTA에서 석회질을 제거하고, 그 다음 파라핀 왁스에 끼워둔다. 표준 마이크로톰을 이용하여 중간 봉합선을 따라 단편들을 잘라내어 두정 봉합이 들어나고, 봉합 후부가 들어나도록 한다. 4개의 마이크로메터 단편을 두 개 연속 400nm 깊이에서 처음에 취한다. 단편들을 피복된 유리 슬라이드(Superfrost plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)상에 위치시키고, 헤마토옥시린 및 에오신으로 착색시킨다. 전체 그리고 새로운 뼈 부위(㎟으로 나타냄), 봉합 두께(mm), 및 뼈 표면을 덮고 있는 세포의 수를 시상봉합 후부에서 결정한다. Osteomeasure System (Osteometries INC, Atlanta, GA)을 이용하여 조직형태학적 분석을 실행한다.
이검사에서 테스트되는 추출물에는 Sophora fructus japonica 추출물, 시베리아 인삼 추출물, 퀘르세틴 디하이드레이트, 퀘르세틴 무수물, 이프리플라본, 감초, Cal-Z-뼈가 포함된다. 두개골 검사에서 이들 추출물의 테스트 결과는 하기 표 5와 6에 나타낸다. 표 5에서, SJ = Sophora fructus japonica, SG = 시베리아 인삼, Q = 퀘르세틴, I = 이프리플라본, L = 감초, CZB = Cal-Z-뼈이다. BMP-2 및Simvastatin을 포지티브 콘드롤로 이용하였다. 하기 테이블에서, 윗첨자(a)는 결과가 블랑크 샘플(농도가 0㎍/㎖임)에 대해 유의적으로 상이한 (p < 0.05) 것을 말한다. p < 0.05 (가령, 오류 경계가 5%미만 또는 이와 동등한 경우)의 차이는 유의적으로 간주한다. 표 5의 처음 네줄은 성분의 다양한 비율 혼합물에 근거한 것으로, 가령, "Q:SG"의 아래 1:1은 퀘르세틴 디하이드레이트와 시베리아 인삼 성분이 혼합물에서 동일한 양으로 존재한다는 것을 말한다.
두개골 검사 결과- 뼈 형성
Conc Q:SG Q:SJ Q:SG:SJ Q:L Q:SJ:L Q:SG:L Q:SG:
SJ:L
1:1 10:1 10:10:1 10:1 10:01:1 10:10:1 10:5:
1:1
㎍/ml ㎟×10-3
100 0.10±
0.12		 0.10±
0.15		 0.10±
1.20		 0.10±
0.15		 0.10±
0.15		 0.10±
0.15		 0.10±
0.15
10 11.40±1.15a 0.10±
0.15		 12.70±
0.86a 		8.22±
2.09		 3.52±
0.75		 13.10±
1.18a 		13.80±
2.49
1 13.00±0.30a 7.16±
1.39		 12.10±
1.71a 		10.20±3.52 12.50±1.60a 11.70±
1.28a 		9.85±
1.51
0 5.65±
0.36		 5.65±
0.36		 5.65±
0.36		 6.73±
0.58		 6.73±
0.58		 6.73±
0.58		 6.51±
0.58
Conc. SFJ SG Q I L CZB
㎍/ml M㎡×10-3
100 6.19±
0.74		 5.42±
0.54a 		13.55±
1.47a 		7.04±
0.69a 		7.31±
0.68		 6.12±
0.92
10 7.48±
0.92a 		5.43±
1.03a 		13.41±
2.50a 		6.05±
1.12		 5.99±
2.05		 6.02±
0.774
1 7.02±
0.98		 4.80±0.83a 7.57±
1.52		 2.44±
0.66		 9.08±
0.89a 		8.84±
1.35a
0 4.13±
0.62		 1.90±
0.43		 3.93±
0.80		 3.74±
0.42		 3.83±
0.42		 3.73±
0.42
Conc. BMP2 Conc Simvastatin
㎍/ml ㎟×10-3 μM ㎟×10-3
50 8.50±
1.20		 1 12.5±
1.00
0.5 0.5 9.50±
1.00
0.25 0.25 7.45±
1.34
0 5.90±
1.20		 0 5.90±
0.60
놀라운 것은, 상기 결과에서 퀘르세틴과 시베리아 인삼 추출물의 시너지 효과는 단순히 더 한 것 이상이다. 특히, 부가 효과로 간주하여 1㎍/㎖에서 약 12㎟X10㎣의 새로운 뼈가 형성되는 것으로 기대할 수 있다. 따라서, 퀘르세틴 및 시베리아 인삼 추출물 약 50% 농도에서 예상된 결과는 약 2㎟X10㎣이나 상기 결과에서 보면 퀘르세틴과 시베리아 인삼 추출물의 복합으로 수득된 결과에서 약 13㎟X10㎣의 새로운 뼈가 형성되었다.
상기에서 설명하는 두개골 검사를 본 발명의 조성물에서 이용할 수 있는 추출물의 다양한 복합을 이용하여 반복하였다. 표 6에서, Q = 퀘르세틴, SG = 시베리아 인삼, L = 감초이다. 하기 표에서 윗첨자(a)는 결과가 블랑크 샘플(농도가 0㎍/㎖임)에 대해 유의적으로 상이한 (p < 0.05) 것을 말한다. p < 0.05 (가령, 오류 경계가 5%미만 또는 이와 동등한 경우)의 차이는 유의적으로 간주한다. 각 조성물에 대한 결과를 하기 표 6에서 제공한다.
두개골 검사 결과 - 추출물 복합물에 의해 자극된 뼈 형성

농도		 Q
Conc		 SG
Conc.		 L
Conc.		 Q:SG
2.5:1		 Q:SG
5:1		 Q:L
2.5:1		 Q:L
5:1
㎟×10-3 ㎍/㎖ ㎟×10-3 ㎍/㎖ ㎟×10-3 ㎍/㎖ M㎡×10-3
0.10±
0.12		 5.7 7.90±
0.54a 		10 9.80±
0.45a 		20 0.10±
0.12		 0.10±
0.12		 0.10±
0.12		 0.10±
0.12
0.10±
0.10		 1.7 9.56±
0.67a 		5.7 10.45±
0.65a 		10 0.10±
0.10		 0.10±
0.10		 0.50±
0.32		 0.10±
0.10
10.30±
0.78a		 0.3 8.60±
0.78a 		1.7 11.56±
0.80a 		1 7.80±
0.67a 		9.60±
0.89a 		8.32±
0.87a 		6.40±
0.78
4.40±
0.52		 0 4.40±
0.52		 0.3 8.60±
0.67a 		0 4.80±
0.32		 4.80±
0.12		 5.20±
0.25		 5.20±
0.25
0 4.20±
0.45
일정한 농도
1㎍/㎖에서
Q+L
Q 		Conc. 일정농도
0.2
㎍/㎖에서
Q+L
Q		 Conc 일정
농도
2㎍/㎖
에서
Q+L
L		 Conc. 일정
농도
0.2
㎍/㎖
에서
Q+L
L
㎟×10-3 ㎍/㎖ ㎟×10-3 ㎍/㎖ ㎟×10-3 ㎍/㎖ ㎟×10-3
6.59±1.54 Q-0.2

L-2		 10.10±
1.52a 		L-2, Q-1 15.30±
2.41a 		L-0.2,
Q-1		 12.60±
1.70a
10.30±2.00 Q-0.2
L-0.5		 6.41±
1.11		 L-2, Q-0.2 13.90±
0.42a 		L-0.2,
Q-0.2		 13.20±
0.77a
12.80±4.42 Q-0.2

L-
0.125		 7.04±
1.31		 L-2, Q-0.625 11.10±
0.38		 L-0.2
Q-0.625		 10.30±
1.27a
13.70±3.20a Q-0.2
㎍/㎖		 6.90±
0.56		 L-2 ㎍/㎖ 9.10±
0.45a 		L-0.2 ㎍/㎖ 6.80±
0.76
6.23±0.84 Q-0
㎍/㎖		 6.15±
0.65		 L-0 ㎍/㎖ 6.27±
0.34		 L-0 ㎍/㎖ 6.54±
0.65
실시예 3: 뼈 생장을 측정하기 위한 In Vivo 연구
체중이 약 200-250그램인 암컷, 온전한 쥐(주령이 12-14)를 이용한 in vivo 연구에서 상이한 세가지 조제물을 테스트하였다. 조제물 1에는 퀘르세틴 무수물과 감초: 250 mg 퀘르세틴: 250 mg 감초 에탄올 추출물 그리고 500 mg 퀘르세틴: 500 mg 감초 에탄올 추출물을 포함한다. 조제물 2에는 퀘르세틴 무수물과 감초: 250 mg 퀘르세틴: 125 mg 감초 에탄올 추출물; 500 mg 퀘르세틴:250 mg 감초 에탄올 추출물; 그리고 1000 mg 퀘르세틴:500 mg 감초 에탄올 추출물을 포함한다. 조제물 3 에는 퀘르세틴과 감초: 1000 mg 퀘르세틴:200 mg 감초 에탄올 추출물을 포함한다. 이 연구는 35일간 지속한다. 8개 별도 그룹의 쥐를 테스트하는데, 각 그룹에는 15마리 쥐로 구성된다. 테스트된 8개 그룹중에 2개는 대조군이다. 하나는 플라시보 대조군이고 다른 하나는 50㎍/kg (10㎍/200g)/3 x per week 부갑상선 호르몬을 제공받았다. 동화작용 물질로 공지된 부갑상선 호르몬이 포지티브 대조군으로 작용한다. 참고, Turner et al., "Disuse in adult male rats attenuates the bone anabolic response to a therapeutic dose of parathyroid hormone." J. Appl Physiol. 2006. Vol. 101 :881-886, 전문을 참고문헌으로 첨부한다.
하기 표 7에서는 8개 테스트 군 각각에 제공된 조제물을 나타낸다. 표 7에서 약량은 사람의 일일 권고량에 기초한다. FDA 약량 전환 식(사람의 등가 약량(HED, mg/kg) = 쥐 약량 mg/kg x (쥐 체중 kg/사람 체중 kg)0.33)을 이용하여 사람 약량을 쥐 약량으로 변환시켰다. HED = rat NOAEL x (W-rat/W-human)(1-b), b=0.67.
표 7에서, Q = 퀘르세틴, L = 감초이다.
In Vivo 연구에서 테스트된 조제물
Group# Formula: 사람 일일 약량 (mg):
1 Q + L(Gormula 1)-1:1 Q = 250, L = 250
2 Q + L(Gormula 1)-1:1 Q = 500, L = 500
3 Q + L(Gormula 2)-2:1 Q = 250, L = 125
4 Q + L(Gormula 2)-2:1 Q = 500, L = 250
5 Q + L(Gormula 2)-2:1 Q = 1000, L = 500
6 Q + L(Gormula 3)-5:1 Q = 1000, L = 200
7 플라시보 (null treatment)
8 포지티브대조군 (부갑상선
호르몬 = 50㎍/kg
(10㎍/200g)/3 x per week)
암컷, Sprague Dawley 쥐를 이용하였다(각 200-250gm, ~ 12-14주령). 동물에게 상기 나열된 조제물 또는 플라시보 음식을 일일 15gm으로 실험 시작일로부터 35일간 공급하였다. 음식은 매일 쥐 한 마리당 15g씩 아침에 이용할 수 있도록 하였다. 쥐들은 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였고, 실험 전과정동안 적당한 우리에 가두어둔다. 전제 실험 기간(35일간)동안 활동에 제한을 주지 않는다.
뼈 형성동안에 조제물의 효과를 생체 기계학적 측정(뼈 강도 및 기능 정도의 평가), 마이크로-CT(실질적인 골량 및 기능 정보 분석) 및 조직형태적 측정(골량과 기능 정보 분석)을 포함하는 성과 평가를 통하여 평가된다. 조직형태학적 측정을 실시하는 방법은 Pa Revell, "Histomorphometry of bone," J. Cline. Pathol., 1983. Vol. 36:1321-1331, (전문은 참고문헌으로 첨부됨)에서 설명되어 있다. 이용된 용어 및 단위는 뼈와 미네랄 연구를 위한 Histomorphometry Nomenclature Committee of the American Society에서 권장하는 것들이다. 마이크로-CT 측정을 위한 방법은 Jiang et al, "Micro CT and Micro MR imagining of 3D architecture of animal skeleton." J. Musculoskel Neuron Interact. 2000. Vol. 1 :45-51, (전문을 참고문헌으로 첨부함)에서 설명한다. 이들 측정들은 처치 35일후에 결정된다.
각 군에서 6마리 동물을 처치 35일 후에 희생시킨다. 대퇴골을 조직형태학적 분석에 이용하였다. 뼈 형성에 대해 상이한 조제물의 효과를 검사하기 위해, 지주골 용적, 지주골 세포 수 및 지주골 분리를 조직형태학적 기술을 이용하여 평가하였다. 아래 표 8에서, 윗첨자(a)는 결과가 플라시보 군(null 처리)에 대해 유의적으로 상이한 (p < 0.05) 것을 말한다. p < 0.05 의 차이는 유의적으로 간주한다. 표8에서, 포지티브 대조군은 플라시보군과 비교하였을 때, PTH로 처리된 후에 뼈 용적에서 상당한 증가(55.83%), 지주골 세포주의 상당한 증가(19.57%), 지주골 분리감소(38.30%)를 나타내었다. 유사하게, Group 3에 투여된 조제물은 플라시보군과 비교하였을 때, PTH로 처리된 후에 뼈 용적에서 상당한 증가(47.59%), 지주골 세포주의 상당한 증가(24.19%), 지주골 분리 감소(23.52%)를 나타내어, 이의 효과는 PTH 처리와 필적하였다.
조직형태학적 측정
군 골용적
%		 지주골 수 지주골
분리		 지주골
두께		 골 미네랄 부가 속도 골형성
속도
1 3.01% 7.42% -8.18% -6.83% -0.23% 4.14%
2 -6.44% 2.06% -8.51% -11.47% -2.81% 15.82%
3 47.59%a 24.19%a -23.52% 13.04% 26.60%a 51.37%a
4 11.23% 4.71% -7.26% -6.14% 9.19% 16.61%
5 29.01%a 4.96% -9.07% -8.95% 3.18% 20.28%
6 -6.63% -8.33% -7.35% 5.36% 9.59% 3.20%
PTH 55.83%a 19.57%a -38.30% 7.35% 28.51%a 45.83%a
표 8에서는 그룹5에 투여된 조제물이 플라시보와 비교하였을 때 지주골 뼈 용적에서 상당한 차이가 있음을 설명한다(P<0.05).
또한, 표 8에서는 지주골 뼈 두께 측정도 보고한다. 뼈 두께 값이 큰 것은 뼈에 침착된 미네랄 양이 많다는 것으로 이는 골량의 증가를 결과할 수 있다. 그룹 3에 투여된 조제물은 플라시보와 비교하였을 때 지주골 두께가 상당히 증가하여(13.04%), 이의 효과가 PTH 처리와 필적하였다(7.35%).
표 8에서 보고된 바의 뼈 미네랄 부가 속도 (MARs)는 투여된 두 가지 플루로크롬(flurorchromes)사이에 시간 간격(5일)로 평균 라벨간 거리(mean interlabel distance)를 나누어 측정하여 결정된다. 뼈 미네랄 부가 속도 (또는 미네랄화된 표면)이 크다는 것은 새로운 뼈가 더 많이 침착되어 있다는 것을 말한다. 이와 같은 결과는 지주골 뼈 두께에 상응해야만 한다. 또한 처리 35일 후에, 그룹 3에 투여된 조제물에서 플라시보와 비교하였을 때 뼈 미네랄 부가 속도가 상당히 증가되었으며(26.60%), 이 효과는 PTH 처리와 필적하였다(28.51 %).
표 8에서는 추가로 뼈 형성 속도(BFRs)에 대한 값도 제공한다. BFRs은 테트라사이클린(에피플로로센으로 볼 수 있음)으로 라벨된 뼈 표면의 정도와 두 개 라벨(칼세인 및 테스라사이클린)이 존재하는 경우 부위에서 라벨간의 거리로부터 계산되는데, 이는 하루에 평방 밀리미터당 제곱 마이크로미터(㎛2/㎣/day)로 나타낸다. 뼈 형성 속도 값이 크다는 것은 새로운 뼈 조직이 많이 형성될 수 있음을 나타낸다. 뼈 형성 속도의 결과는 뼈 미네랄 부가 속도의 관찰된 변화와 일치하였다. 그룹 3에 투여된 조제물에서 플라시보와 비교하였을 때 뼈 형성 속도가 상당히 증가되었으며(51.37%), 이 효과는 PTH 처리와 필적하였다(45.83%).
이 연구에서 이용된 또 다른 효과 결정 기술은 마이크로-CT 측정인데, 이는 실질적인 골량, 구조 및 기능적 정보를 제공할 수 있다. 이 분석 결과를 하기 표 9에서 제공한다.
뼈 미네랄 밀도(BMD), 뼈 용적(뼈 용적 %/전체 용적), 지주골 수, 지주골 분리와 같은 다양한 범위의 변수들로부터 정보를 수득하는 것이 정량적 및 정성적인 뼈 구조 평가에 중요하다. 이들 변수들 중에, 뼈 용적, 지주골 수, 지주골 분리는 뼈 건강과 연관된다.
표 9에서 나타낸 결과에서, 그룹 2와 5에 투여된 조제물이 골아세포 형성을 효과적으로 강화시키고, 플라시보와 비교하였을 때 뼈 미네랄 밀도(BMD)를 상당히 증가시켰음을 나타내어, 이들 효과가 PTH 처리와 필적하였다. 또한, 결과에서 그룹 1, 2, 5에서 투여된 조제물이 플라시보와 비교하였을 때, 뼈 용적, 지주골 세포의 수의 상당한 증가 및 지주골 분리의 감소가 있었다는 것을 알 수 있다. 표 9에서, 윗첨자(a)는 결과가 플라시보 군에 대해 유의적으로 상이한 (p < 0.05) 것을 말한다. p < 0.05 의 차이는 유의적으로 간주한다.
마이크로 CT-측정
군
#		 골
미네랄 밀도
(BMD)		 뼈 용적 %
/전체 용적		 지주골 수 (N/6 ㎟) 지주골 분리
(mm)
1 17% 32%a 15%a -22%a
2 71%a 33%a 14%a -22%a
3 20% 15% 7% -9%
4 31% 13% 5% -8%
5 74%a 25%a 14%a -19%a
6 20% 9% 4% -4%
PTH 86%a 32%a 25%a -28%a
골량, 골 용적 평가이외에, 골 강도는 두 가지 상이한 변수를 이용하여 기계적으로 검사하였다. 한 가지 변수는 뼈를 파괴하는데 요구되는 최대 힘을 측정하는 것이고, 다른 하나는 뼈의 단단함(탄성)을 결정하는 것이다. 뼈 강도 및 단단함을 측정하는 방법은 Sturmer et al., "Standardized Bending and Breaking Test for the Normal and Osteoporotic Metaphyseal Tibias of the Rat: Effect of Estradiol, Testosterone, and Raloxifene," J. bone and Mineral Research, 2006. Vol. 21(1 ):89-96에서 설명되어 있으며, 전문을 참고문헌으로 첨부한다.
표 10에서, 결과는 뼈를 파열시키는데 필요한 최대 힘과 포지티브 대조군(PTH)와 플라시보 군을 포함하는 임의 처리군사이에 뼈의 단단함에 통계적인 차이가 없다는 것을 나타낸다. 포지티브 대조군에서 효과가 없는 것은 주당 3회의 빈도로 이용된 PTH의 약량이 상대적으로 낮기 때문일 것이다. PTH가 강력한 동화작용 물질이나, PTH 약량은 임의 부작용의 유발없이 뼈 형성에 중간정도의 효과를 제공하기 위해 특이적으로 선택되었다.
생체기계적인 측정
군 # 뼈를 파괴하기위해
필요한 최대 힘		 뼈의 단단함
1 -0.1% -0.1%
2 -0.1% 0.0%
3 0.0% 0.0%
4 0.0% 0.0%
5 -0.1% -0.1%
6 0.0% 0.0%
PTH 0.0% 0.0%
실시예 4: RANK -L 저해 연구
각 성분을 150 내지 250 mg 정도 달아서 15㎖ 원뿔 바닥 튜브에 넣는다. 50% DMSO:30% 에탄올:20% 물의 용액에 용해시키고, 최종 원액이 50㎍/㎖이 되도록 한다. 용매 기준으로 1.5㎖ DMSO, 0.9㎖ 에탄올, 0.6㎖ 물을 혼합한다. 완전하게 볼텍스한다. 수조에서 실온, 10분간 소니케이트시킨다. 다시 완전하게 볼텍스한다. 새로운 페놀이 없는 배지에 성분 원액을 희석한다.
사람 골육종 세포주, MG-63 (ATCC# CRL-1427)는 37℃ 5% CO2에서 페놀-레드를 포함하는 MEM(ATCC에서 권장함)에 유지시킨다. 실험 24시간 전에 3x105 세포를 페놀-레드없는 MEM이 있는 12웰 플레이트에 접종한다. 사용된 배지는 웰에서 제거하고, MG-63 세포 (ATCC # CRL-1427)는 37℃ 5% CO2에서 각 테스트 성분의 농도 1 , 0.1, 0.01㎍/㎖ 또는 30 ng/ml TGF-beta (+ control)에서 4시간 동안 선처리하였다. TGF-beta 원액은 30㎍/㎖(R&D Systems, cat# 100-B-001)이다.
선처리 항온처리 기간 후에, 10㎍/㎖ IL-1b (Calbiochem (catalog # 407615) , 원액 10㎍/㎖, cat # 407615)을 37℃에서 18시간 동안 세포 배양물에 첨가하였다. 처리된 그리고 자극된 세포로부터 상청 배지를 제거하고, 전체 RANK-L 단백질은 제조업자가 설명하는 것과 같이(APOTECH, catalog # APO-54N-016-k101), RANK-L ELISA (3회 반복)을 이용하여 측정하였다. 생성된 단백질 양은 배지(null) 처리, 자극된 세포의 것과 비교하여 전체 RANK-L 단백질의 감소 비율을 결정하였다. T
상기 설명된 검사 과정을 이용하여 다음 추출물 : 은행나무, 녹차, Sophora fructus japonica, Rehmannia sp ., 석류, 시베리아 인삼, 이프리플라본, 포도씨, 동콰이, Sophora japonica이 RANK-L 발현, 생산 또는 방출을 저해하는 능력을 결정하였다. 이 검사 결과는 하기 표 11에 나타내었다. 10% 또는 그 이상의 감소가 유의적인 것으로 간주된다.
RANK-L 단백질의 생산/방출 (미처리된 기준에 비교하여)
성분 (1㎍/ml에서 테스트): 미처리된 기준에 비교하여 생산/방출 감소에서 변화 %
은행나무(Ginkgo biloba) 31% 감소
녹차 19% 감소
Sophora Fructus Japonica 45% 감소
Rehmannia sp . 74% 감소
석류 20% 감소
석류 (Naturex) 14% 감소
시베리아 인삼 50% 감소
이프리플라본 효과없음
포도씨 추출물 11% 감소
동콰이(20:1 추출비율) 16% 감소
Sophora japonica (NuPharma) 42% 감소
표 11에 보고된 결과에 근거하여, 석류 추출물, 이프리플라본(Ostivone), 포도씨 추출물 (40% 프로안토시아니딘) 및 녹차 추출물 (40% EGCG)은 RANK-L 생산/방출의 저해에 포지티브한 효과를 가진다는 것이다. 따라서, 상기에서 설명하는 RANK-L 저해 검사를 이용하여 RANK-L 생산/방출의 저해 수준을 결정하기 위해 이들 성분들의 다양한 복합물을 테스트하였다. 그 결과는 아래 표 12에 보고하였다. 이 보고에서 설명하는 것과 같이, 10 ㎍/㎖ 석류, 10㎍/㎖ 이프리플라본, 1㎍/㎖포도씨 추출물, 1㎍/㎖ 녹차는 골아세포 세포의 IL-1B 단백질의 자극에 반응하여 RANK-L 합성 저해를 최대화하는 조제물인 것으로 밝혀졌다. 이 결과에서 또한 석류가 어떠한 것과도 일반적으로 잘 어울린다는 것을 볼 수 있다. 이들 성분들 중에 주요 간섭이 발견되지는 않았다.
RANK-L 저해
성분 (약량): n RANK-L
저해(%)
유기 올리브 쥬스 분말 (100㎍/ml) 2 41.5±4.0
유기 올리브 쥬스 분말(10㎍/ml) 6 19.7±2.2
유기 올리브 쥬스 분말 (1㎍/ml) 6 No inhibition
유기 올리브 쥬스 분말 (0.1㎍/ml) 3 No inhibition
석류 추출물 (30㎍/ml) 2 858.6±1.5
석류 추출물 (20㎍/ml) 2 56.2±2.6
석류 추출물 (10㎍/ml) 3 48.3±3.1
석류 추출물 (10㎍/ml) 2 46.9±10.7
석류 추출물 (10㎍/ml) 2 48.4±1.1
석류 추출물 (10㎍/ml) 3 49.4±3.3
석류 추출물(1㎍/ml) 3 19.3±2.1
석류 추출물 (0.1㎍/ml) 3 4.7±4.2
이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml) 3 0±4.3
이프리플라본(Ostivone)(10㎍/ml) 3 2.8±3.9
이프리플라본(Ostivone)(10㎍/ml) 3 0±2.5
이프리플라본 (Ostivone)(1㎍/ml) 2 0.8±0.3
포도씨 추출물(40% OPC)(10㎍/ml) 3 18.7±6.9
포도씨 추출물 (40% OPC)(10㎍/ml) 2 21.9±0.6
포도씨 추출물 (40% OPC)(5㎍/ml) 3 13.1±3.4
포도씨 추출물 (40% OPC)(2㎍/ml) 2 10.3±1.6
포도씨 추출물 (40% OPC)(1㎍/ml) 3 8.0±2.2
포도씨 추출물 (40% OPC)(1㎍/ml) 2 10.7±1.0
포도씨 추출물 (40% OPC)(0.1㎍/ml) 2 0±4.3
포도씨 추출물 (40% EGCG)(10㎍/ml) 3 23.9±1.4
포도씨 추출물 (40% EGCG)(10㎍/ml) 3 22.6±7.5
포도씨 추출물 (40% EGCG)(1㎍/ml) 3 10.2±1.6
포도씨 추출물 (40% EGCG)(0.1㎍/ml) 3 0±2.6
석류+이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml each) 2 45.7±2.4
석류+이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml each) 2 48.0±2.8
석류+이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml each) 3 46.9±5.3
석류(10㎍/ml)+이프리플라본 (Ostivone)(1㎍/ml) 2 48.3±3.5
석류(10㎍/ml)+이프리플라본 (Ostivone)(0.1㎍/ml) 2 45.6±4.0
석류(1㎍/ml)+이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml) 3 21.6±5.2
석류(10㎍/ml)+이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml)+
포도씨추출물 (10㎍/ml)		 2 63.3±0.7
석류(10㎍/ml)+이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml)+
포도씨추출물 (1㎍/ml)		 2 64.6±4.9
석류(10㎍/ml)+이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml)+
포도씨추출물 (0.1㎍/ml)		 2 49.9±2.5
석류+이프리플라본(Ostivone)+포도씨추출물
(각 10㎍/ml )		 2 42.8±8.9
석류(10㎍/ml)+이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml)+
포도씨추출물 (10㎍/ml)		 3 39.0±2.9
석류(10㎍/ml)+이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml)+
포도씨추출물 (1㎍/ml)		 2 54.6±1.1
석류(10㎍/ml)+이프리플라본 (Ostivone)+
포도씨추출물 (1㎍/ml)		 2 37.5±8.1
석류(10㎍/ml)+이프리플라본(Ostivone)+
포도씨추출물 (1㎍/ml each		 3 2.5±2.3
석류(10㎍/ml)+이프리플라본(Ostivone)(10㎍/ml)+
포도씨추출물(10㎍/ml)+녹차추출물(10㎍/ml)		 3 42.9±1.1
석류(10㎍/ml)+이프리플라본(Ostivone)(10㎍/ml)+
포도씨추출물(10㎍/ml)+녹차추출물(0.1㎍/ml)		 2 60.8±0.9
석류(10㎍/ml)+이프리플라본(Ostivone)(10㎍/ml)+
포도씨추출물(1㎍/ml)+녹차추출물(0.1㎍/ml)		 3 55.1±1.8
석류(10㎍/ml)+이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml)+
포도씨추출물(1㎍/ml)+녹차추출물(1㎍/ml)		 3 68.6±2.6
석류(10㎍/ml)+이프리플라본 (Ostivone)(10㎍/ml)+
포도씨추출물(1㎍/ml)+녹차추출물(10㎍/ml)		 3 65.2±1.1
석류(10㎍/ml)+이프리플라본(Ostivone)(10㎍/ml)+
포도씨추출물(0.1)+녹차추출물(1㎍/ml)		 3 52.3±0.7
석류+이프리플라본(Ostivone)+포도씨추출물+
녹차추출물(각 10㎍/ml)		 3 38.0±3.5
이프리플라본(Ostivone)+포도씨추출물+
녹차추출물(각 10㎍/ml)		 3 9.7±2.8
석류+포도씨추출물+녹차추출물 (각 10㎍/ml) 3 26.9±4.8
석류(10㎍/ml)+포도씨추출물(1㎍/ml) 2 52.7±1.0
석류(10㎍/ml)+포도씨추출물(1㎍/ml) 2 51.1±1.8
석류(20㎍/ml)+포도씨추출물(2㎍/ml) 2 58.2±0.5
석류(30㎍/ml)+포도씨추출물(1㎍/ml) 2 64.3±2.1
석류(30㎍/ml)+포도씨추출물(2㎍/ml) 2 59.9±1.2
석류(30㎍/ml)+포도씨추출물(5㎍/ml) 2 57.2±3.1
실시예 5: 석류로부터 푸니칼라진의 분리
신선한 석류의 껍질을 벗겨 껍질에서 씨들을 분리하였다. 씨, 껍질, 과육을 물과 알코올 복합물(80:20)을 이용하여 별도로 추출하였다. 껍질, 씨 그리고 과육 각각에서 푸니칼라진을 가진 추출물이 생성되나 석류 껍질 추출물에서 가장 높은 수준의 푸니칼라진이 얻어진다. 또한, 물이 석류를 추출하기 위한 가장 좋은 추출 용매인 것으로 확인되었다.
실시예 6: 푸니칼라진에 의한 RANK -L의 저해
푸니칼라진 테스트 샘플을 석류 껍질, 스킨, 과육 및 씨로부터 100% DMSO 100㎎/㎖에서 추출하였다. 추출에서 미립자를 제거하지는 않는다. 석류 테스트 샘플을 페놀레드없는 MEM(estrogenic) 및 0.1 % FBS로 희석시켜 최종 농도의 10배로 배경 시그날을 낮추었다. 최종 DMSO 농도는 0.2%보다 낮게 유지시키고 처리동안 일정하게 유지시킨다. DMSO 용매 대조군은 처리안된 군에 이용한다.
사람에서 유도된 골육종 세포주, MG63 세포(ATCC # CRL-1472)를 10% FBS에서 페놀 레드 없는 MEM이 포함된 12웰 플레이트의 각 웰에 200,000 세포로 도말한다. 그 다음날 배지는 0.1% FBS에서 페놀 레드 없는 MEM로 교체한다. 세포는 4시간 동안 항온처리하고, 농도가 1, 10, 100㎍/㎖의 푸니칼라진 테스트 샘플로 처리하였다.
처리 4시간 후에, IL-1b (Calbiochem (catalog # 407615), 원액 10㎍/㎖, cat # 407615)을 최종 농도가 3 ng/mL이 되도록 첨가한다. IL-1b로 자극받은 처리된 세포를 37℃에서 16시간 동안 항온처리한다.
16시간 후에, 세포를 용해시키고, 세포로부터 RNasy 정제 키트(Qiagen)로 세포로부터 RNA를 추출한다. RNA를 cDNA로 역전사시키고, 2-단계 qRT-PCR 시약(Invitrogen), 4㎕ 정제된 RNA를 이용하여 qPCR한다. 어닐링 온도는 Stratagene Mx4000 + 1㎕ RANK-L 유전자 특이적 프라이머/50㎕ 반응(10μM 초기 농도; HLUX3013920, Invitrogen Inc.)에서 57℃이다.
RANK-L 및 GAPDH 유전자 발현 Ct 데이터를 수득한다. RNA는 GAPDH 발현을 위해 조정을 시켜 정량화한다. RANK-L 발현을 위한 처리안된 대조군 값을 이용하여 처리 효과를 평가한다. 그 결과를 하기 표 13에서 보고한다.
RANK-L 발현상에 푸니칼라진의 효과
성분 N RANK-L 발현 (증가 배수)
처리안됨 2 1.0±0.1
IL 1B(3㎍/ml) 2 3.3±0
푸니칼라진 1㎍/ml 2 2.65±0.5
푸니칼라진 10㎍/ml 2 1.9±0.4
푸니칼라진 100㎍/ml 2 0.7±.02
표 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 석류에서 정제된 푸니칼라진는 약량 의존적인 방식으로 IL-1b 자극된 RANK-L 유전자 발현을 저해하고, 100㎍/㎖에서는 RANK-L의 발현을 완전하게 저해한다.
실시예 7: 석류의 푸니칼라진에 의해 타입 IV 콜라게나제 ( MMP9 ) 단백질 발현의 저해
케라틴세포와 섬유아세포를 0.5% BSA를 포함하는 DMEM에서 공동배양시켰다. 공동배양물을 석류로부터 추출된 다양한 농도(0.1%-10%)의 푸니칼라진에 노출시켰다. 특히, 0.1㎍/㎖, 10㎍/㎖, 100㎍/㎖ 농도에서 타입 IV 콜라게나제 단백질(매트릭스 메탈로프로테아제-9/MMP9)를 저해시키는 석류 추출물의 능력을 테스트하였다. 석류 추출물에 노출시킨 후에 공동 배양 세포를 18시간 동안 10 ng/ml IL-1 B으로 자극하였다. 18시간 동안 IL-1 B으로 자극시킨 후에, 표 14에서 볼 수 있는 바와 같이 배지에서 MMP9 농도를 측정하였다.
MMP9 (type IV 콜라게나제) 단백질 발현상에 석류 추출물의 효과
테스트된 석류 추출물 N MMP9 저해
처리안됨 2 1.0±0.1
IL 1B(3㎍/ml) 2 1.65
석류 1㎍/ml 4 1.5±.06
석류 10㎍/ml 4 1.2±.04
석류 100㎍/ml 4 1.0±0.1
표 14에 보고된 결과에서 석류의 푸니칼라진이 in vitro에서 케라틴세포로부터 IL-1b 자극된 콜라게나제 방출을 저해한다는 것을 설명한다. 이 결과에서 푸니칼라진이 세포외 매트릭스의 염증-자극된 파괴를 저해한다는 것을 설명한다. 활성화된 파골세포는 뼈 강도를 감소시키고 매트릭스 분해 효소(MMPs)의 방출에 의해 골 손실이 증가되어 뼈 콜라겐/인산칼슘염 프레임워크를 분해시킨다. 뼈 콜라겐/칼슘 프레임워크의 파괴를 차단시키면 뼈 강도 및 뼈 구조를 유지/개선시킬 수 있을 것으로 기대된다. 증가된 뼈 강도 및 뼈 구조는 증가된 뼈 미네랄 밀도, 증가된 뼈 용적, 증가된 지주골 세포 수, 지주골 분리 감소, 개선된 뼈 구조, 뼈를 파열시키는데 필요한 최대 힘의 증가, 뼈의 단단함 증가로 특징화된다.
실시예 8: 포도씨추출물 및 석류 추출물에 의해 C. histolyticum 콜라게나제의 활성 저해
샘플을 분말 100mg을 무게를 달아 준비한다. 샘플의 전체 추출물 50㎎/㎖은 DMSO:에탄올:물을 5:3:2의 비율로 연속 첨가하여 준비한다. 따라서, 100 mg의 분말의 경우, 1㎖ DMSO, 0.6㎖ 에탄올, 0.4㎖ 물이 이용된다. 용액을 볼텍스하여 혼합하고, 초음파 수조에서 10분간 항온처리한다. 샘플을 원액 50㎎/㎖ 농도에서 테스트 농도로 희석한다.
시판되는 키트(Molecular Probes, Eugene, OR)을 이용하여 콜라게나제 활성 저해를 검사한다. 키트는 형광(fluorescence) 태그로 라벨된 콜라겐 기질을 분해하는 능력에 기초한다. 분해전에 기질의 형광은 억제시킨다. 콜라게나제에 노출후에, 기질은 절단하여 퀸칭 효과를 제거하여 형광이 증가된다. 샘플(상기 과정에 의해 준비된)을 우선 키트에서 제공하는 콜라게나제(0.2 Units/ml)에 첨가한다. 형광 기질(50㎍/㎖)을 그 다음 첨가하고, 반응물은 실온에서 한 시간 동안 항온처리한다. 형광은 495/515nm의 여기/방출에서 플레이트 판독기로 판독한다. 데이터는 첨가된 임의 저해물질 없이 MMP와 비교하여 %로 나타낸다. 100% 전체 총 효소 활성에서의 감소는 포지티브 반응으로 간주된다.
석류 추출물 및 포도씨추출물에 대해 콜라게나제 활성의 감소에 대한 약량 반응을 관찰하였다(표 15).
활성화된 파골세포는 뼈 강도를 감소시키고 매트릭스 분해 효소(MMPs)의 방출에 의해 골 손실이 증가되어 뼈 콜라겐/인산칼슘염 프레임워크를 분해시킨다. 여기에서 제시한 기전에 의해 특히 포도씨 추출물과 석류 추출물이 콜라게나제 활성의 강력한 저해물질로 밝혀졌다. 이와 같은 활성에 의해 콜라겐 생산의 전체 포지티브 균형으로 뼈 강도 및 뼈 일체성이 유지 또는 개선되는 결과를 얻을 수 있다.
포도씨추출물 및 석류 추출물에 의해 C. histolyticum 콜라게나제의 활성 저해
샘플 농도(㎍/ml) % 콜라게나제활성
석류 추출물 1 96.7±10.0%
10 86.3±5.9%
100 29.2±5.7%
포도씨추출물 1 98.9±3.0%
10 48.8±2.3%
100 -7.2±4.3%
콜라게나제 단독 0 100.0±0.8%
실시예 9: 뼈 재흡수 저해를 측정하기 위한 두개골 검사
자궁내 신생 생쥐 세포를 라벨하기 위해, 임신한 CD-1 암컷 생쥐(15일 시점에서)에 45Ca (25uCi/mouse)를 주사하였다. 4일된 새끼의 두개골(skull bone)을 잘라내어 절반으로 나눈다. 잘라낸 절반의 두개골을 첨가된 글루타민 및 Pen/Step와 0.1% BSA를 포함하는 BGJ 생장 배지(Sigma) 1㎖에 금속 그리드(표면에)에 둔다. 뼈는 첨가된 인자들(IL-1, PTH, 및 또는 화합물)을 가진 1㎖ 배지를 포함하는 웰로 옮겨진 후에 24시간 동안 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이트에서 항온처리하였다. 처리된 뼈들을 추가 72시간동안 상기 조건에서 항온처리하였다. 이와 같은 항온처리후에, 뼈를 꺼내어 1.5시간동안 신틸레이션 바이알에 20% TCA에 두고(뼈에 있는 라벨된 칼슘을 측정하기 위함), 신틸레이션 유체로 카운트한다. 또한, 0.4㎖ 배지도 카운트한다(뼈로부터 방출된 라벨된 칼슘의 양을 측정하기 위함). 그 결과는 % 45Ca 방출로 나타내고, 또한 T/C 비율로 보고될 수도 있다.
일부 인자들과 화합물의 경우에, 이과정을 변형하여 사용할 수도 있다. 대부분의 파골세포가 선배양 기간동안에 두개골에서 형성되기 때문에, 파골세포 형성에 영향을 주는 인자들은 선 배양 기간 동안에 더 큰 효과를 가질 수도 있다. 따라서, 다수의 화합물의 경우에 이들이 선배양 배지에 포함된다.
이 검사에 테스트되는 추출물에는 은행나무 추출물, 녹차 추출물, Sophora fructus japonica 추출물, Rehmannia sp . 추출물, 석류 추출물, 시베리아 인삼, 이프리플라본, 포도씨추출물, 동콰이 추출물이 포함된다. 두개골 검사에서 이들 추출물의 결과는 하기 표 16에서 보고한다.
표 16에서, R-1 = Rehmannia sp. (EUL), SFJ = Sophora Fructus Japonica, SG = 시베리아 인삼, SJ = Sophora Japonica (NuPharma), I = 이프리플라본, GB = 은행나무, GT = 녹차, P-1 = 석류 추출물, P-2 = 석류 추출물 (Naturex), GS = 포도씨, DQ = 동콰이 추출물을 나타낸다. 하기 표에서 윗첨자(a)는 결과가 블랑크 샘플(농도가 0㎍/㎖임)에 대해 유의적으로 상이한 (p < 0.05) 것을 말한다. p < 0.05 (가령, 오류 경계가 5%미만 또는 이와 동등한 경우)의 차이는 유의적으로 간주한다. 표 16에서 보는 바와 같이, 석류, 이프리플라본, 녹차추출물, 포도씨추출물이 IL-Ib 유도된 뼈 재흡수/칼슘 방출을 저해한다.
두개골 데이타 - 뼈 재흡수/Ca2 + 방출의 저해
Conc
IL-1+
㎍/ml		 R-1 SFJ SG SJ I GB GT P-1 P-2 GS DQ
% 방출
IL-1+
100
㎍/ml		 35.50
±2.18		 30.50
±1.85		 38.25
±1.93		 34.50
±2.78		 19.25
±1.03a 		33.50
±2.78		 11.00
±0.71a 		12.00
±1.41a 		8.75
±0.25a 		13.75
±1.41a 		38.50
±1.32
IL-1+
10㎍/ml		 25.70
±1.49		 29.00
±2.74		 41.25
±1.11		 31.70
±1.11		 32.50
±3.30		 34.50
±3.52		 36.00
±2.04		 25.50
±1.71a 		25.25
±2.36a 		42.75
±1.71		 37.25
±2.14
IL-1+
1㎍/ml		 31.50
±0.96		 28.25
±2.25		 39.25
±1.38		 33.00
±3.42		 38.00
±1.41		 37.50
±1.44		 40.25
±2.29		 39.00
±2.95		 36.50
±1.85a 		37.75
±2.97		 40.50
±1.55
IL-1 28.70
±2.56		 28.70
±2.56		 45.70
±1.65		 32.50
±3.18		 40.00
±2.12		 31.50
±2.10		 31.50
±2.10		 38.25
±0.25		 45.70
±1.65		 40.00
±0.25		 38.25
±0.25
No IL-1 9.50
±0.65		 9.50
±0.65		 14.75
±2.40		 10.50
±0.65		 10.50
±0.85		 11.25
±1.32		 11.20
±1.32		 15.75
±1.80		 14.70
±2.43		 10.25
±1.80		 15.75
±1.70
상기에서 설명하는 두개골 검사를 본 발명의 조성물에 이용할 수 있는 추출물의 다양한 복합물로 반복하였다. 각 조제물의 결과는 하기 표 17에서 보고한다.
표 17에서, P = 석류, GS = 포도씨, GT=녹차를 나타낸다. 알렌드로네이트는 포지티브 대조군이다. 하기 표에서 윗첨자(a)는 결과가 블랑크 샘플(농도가 0㎍/㎖임)에 대해 유의적으로 상이한 (p < 0.05) 것을 말한다. p < 0.05 (가령, 오류 경계가 5%미만 또는 이와 동등한 경우)의 차이는 유의적으로 간주한다. 하기 표에서 테스트된 모든 복합물은 IL-Ib 유도된 뼈 재흡수/칼슘 방출을 저해한다.
두개골 데이타- 추출물의 복합물에 의해 뼈 재흡수/칼슘 방출의 저해
Conc.
μ/ml		 알렌드로네이트 방출% Conc.
㎍/ml		 P:GS:I
500:50:
600		 P:GS
1000:
100		 P:GT
1000:
100		 P:GS:GT
1000:100: 100		 P:I:GT
500:600:
50		 I
600
% 방출
IL-1+
100μM		 12.00±0.17a IL-1+100
㎍/ml		 9.00±
0.50a 		9.00±
0.41a 		9.75±
0.48a 		9.00±
0.41a 		9.50±
0.29a 		17.50±
1.66a
IL-1+
10μM		 14.07±1.05a IL-1+10
㎍/ml		 26.00±
2.06a 		22.25±
1.44a 		22.25±
2.14a 		21.25±
1.80a 		23.50±
2.06a 		30.25±
4.03
IL-1+1
μM		 17.00±1.15a IL-1+1
㎍/ml		 40.75±
4.48		 34.00±
3.70		 36.25±
4.94		 32.75±
3.82		 44.40±
0.96		 29.75±
4.54
IL-1+
0.1μM		 28.50±1.19 IL-1 35.50±
3.01		 35.50±
3.01		 30.25±
1.97		 30.25±
1.97a 		36.255±
2.18		 36.25±
2.18
IL-1 30.00±0.99 No IL-1 10.50±
0.65		 10.50±
0.65		 11.25±
0.75		 11.25±
0.75		 13.00±
1.08		 13.00±
1.08
No IL-1 10.00±0.78a
실시예 10: RANK -L 저해 및 뼈 재흡수 저해를 측정하기 위한 in vivo 연구
체중이 약 200-250그램인 암컷, 온전한 쥐(주령이 12-14)를 이용한 in vivo 연구에서 상이한 두가지 조제물을 테스트하였다. 조제물 1에는 표 18에서 보고된 바와 같이, 이프리플라본, 석류 추출물, 포도씨추출물의 다양한 약량을 포함한다. 조제물 2에는 표 18에서 보고된 바와 같이, 석류 추출물, 포도씨추출물의 다양한 약량과 고정된 양의 이프리플라본이 포함된다. 각 조제물에서 3가지 약량을 테스트하였다. 이 연구는 8개 별도 그룹의 쥐를 테스트하는데, 각 그룹에는 15마리 쥐로 구성된다. 약 35일간 지속한다.
하기 표 18에서는 8개 테스트 군 각각에 제공된 조제물을 나타낸다. 표 18에서 약량은 사람의 일일 권고량에 기초하고, FDA 약량 전환 식(사람의 등가 약량(HED, mg/kg) = 쥐 약량 mg/kg x (쥐 체중 kg/사람 체중 kg)0.33)을 이용하여 사람 약량을 쥐 약량으로 변환시켰다. HED = rat NOAEL x (W-rat/W-human)(1-b), b=0.67.
표 18에서, I=이프리플라본, P=석류 추출물, GS=포도씨추출물이다.
군 Formula: 약량(mg):
1 P + GS P = 500, GS = 50
2 P + GS P = 1250, GS = 125
3 P + GS P = 2,000, GS = 200
4 P + GS + I P = 0, GS= 0, I = 600
5 P + GS + I P = 500, GS = 50, I = 600
6 P + GS + I P = 1250, GS = 125, I = 600
7 플라시보
8 포지티브 콘트롤
(Alendronate - 0.5 mg/day)
In Vivo 연구에서 분석을 위한 약량 및 조제물
에스트로겐 철수에 의한 신속한 뼈 재흡수를 유도하기 위해, 난소제거된(OVX) 쥐 모델을 이 연구에 이용하였다. Alam et al., "Effects of Safflower Seed Oil in osteoporosis-induced Ovariectomized Rats," Am. J. Chinese Medicine, 2006. Vol. 34(4): 601-612, 참고문헌으로 첨부한다. 난소제거 과정에 의한 뼈 재흡수의 효과를 평가하는 것이 중요하여 난소 제거 과정을 거치지 않은 암컷 생쥐 군인 Sham 대조군(n=6)도 이 연구에 포함시켰다.
이 연구에서는 무작위의 플라시보 조절된 약량 반응만을 이용하였다. 12-14주령의, 체중이 약 200-250g인 총 120마리의 난소제거 생쥐(군당 n=15)를 35일간 무작위로 그룹지운다. 동물에게 상기 나열된 조제물 또는 플라시보 음식을 일일 15gm으로 실험 시작일로부터 35일간 공급하였다. 음식은 매일 쥐 한 마리당 15g씩 아침에 이용할 수 있도록 하였다. 쥐들은 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였고, 실험 전과정동안 적당한 우리에 가두어둔다. 전제 실험 기간(35일간)동안 활동에 제한을 주지 않는다.
항-재흡수에 대한 조제물의 효과를 DEXA 스캔(뼈 미네랄 밀도를 결정하기 위해), 생체 기계학적 측정(뼈 강도 및 기능 정도의 평가), 마이크로-CT(실질적인 골량 및 기능 정보 분석) 및 조직형태적 측정(골량과 기능 정보 분석)을 포함하는 성과 평가를 통하여 평가된다. 조직형태학적 측정을 실시하는 방법은 Pa Revell, "Histomorphometry of bone," J. Cline. Pathol., 1983. Vol. 36:1321-1331, (전문은 참고문헌으로 첨부됨)에서 설명되어 있다. 이용된 용어 및 단위는 뼈와 미네랄 연구를 위한 Histomorphometry Nomenclature Committee of the American Society에서 권장하는 것들이다. 마이크로-CT 측정을 위한 방법은 Jiang et al, "Micro CT and Micro MR imagining of 3D architecture of animal skeleton." J. Musculoskel Neuron Interact. 2000. Vol. 1 :45-51, (전문을 참고문헌으로 첨부함)에서 설명한다. 이들 측정들은 처치 35일후에 결정된다.
DEXA와 마이크로-CT 측정 결과에서 난소제거된(OVX) 생쥐는 sham 대조군(난소제거안된) 생쥐와 비교하여 뼈 미네랄 밀도가 실질적으로 손실되었다는 것을 나타내었다. 뼈를 파열시키기 위한 최대 힘과 뼈의 단단함 측정 그리고 OVX 쥐에서 전체 용적에 대한 뼈 용적%과 지주골 세포 수로 나타난 바와 같이, 뼈 강도 또한 상당히 감소되었다. 또한, 지주골 분리(지주골이 서로 얼마나 떨어져있는 지의 평균)가 OVX 쥐에서 상당히 증가되었음을 관찰할 수 있었다. 포지티브 콘트롤, ALD를 파골세포 형성을 감소시키는 것으로 알려진 효과적인 항-재흡수 물질인 알렌드로네이트 약물과 처리하였다. 참고; Iwamoto et al., "Comparative effects of alendronate and alfacalcidol on cancellous and cortical bone mass and 뼈 mechanical properties in ovariectomized rats." Exp. Anim. 2006. vol. 55(4):357-67, 전문을 참고문헌으로 첨부함. 포지티브 콘트롤(ALD)은 뼈 미네랄 밀도 증가, 전체 용적에 대한 뼈 용적비율% 증가, 지주골 세포 수 증가와 지주골 분리는 상당히 감소되었다.
이 연구에 이용된 효과적인 측정 방법중에 하나가 마이크로-CT 측정인데, 실질적인 골량, 구조 및 구조적 정보를 제공한다. 표 19에서 볼 수 있는 바와 같이, 처리 35일후에 2, 3, 4, 5, 6 그룹에 투여된 조제물은 뼈 재흡수 방지에서 플라시보(null 처리)보다 더 효과적이었다. 뼈 미네랄 밀도(BMD), 뼈 용적, 지주골 수 및 지주골 분리의 결과는 뼈 건강과 관련있다. 윗첨자(a)는 결과가 플라시보 군(null 처리)에 대해 유의적으로 상이한 (p < 0.05) 것을 말한다. p < 0.05 의 차이는 유의적으로 간주한다.
조직형태학적 측정
군 골 미네랄 밀도 뼈용적/
전체 용적
%		 지주골수
(N/6㎣)		 지주골
분리
1 21% 107%a 58%a -47%a
2 32%a 132%a 99%a -52%a
3 32%a 145%a 122%a -64%a
4 25%a 137%a 117%a -59%a
5 22% 156% 96% -42%
6 1% 11% 14% -18%
ALD 124%a 632%a 313%a -88%a
Sham 41%a 374%a 281%a -82%a
표 20에서 볼 수 있는 것과 같이 뼈 미네랄 밀도 결과에서 2, 3, 4 군에 투여된 조제물이 파골세포형성을 효과적으로 감소시켰고, 골 용적을 증가시키고, 지주골 세포 수를 증가시키고, 지주골 세포 분리를 감소시켰다. 윗첨자(a)는 결과가 플라시보 군에 대해 유의적으로 상이한 것을 말한다. p < 0.05 의 차이는 유의적으로 간주한다.
군 골 미네랄밀도
1 0%
2 7%a
3 10%a
4 5%a
5 5%a
6 3%a
ALD 35%a
Sham 14%a
DEXA 측정
조직형태학적 측정은 조제물 1과 2의 효과를 결정하는 도구로 이용될 수 있고, 각 군의 지주골 용적을 정량화하였다. 이 분석 결과를 표 21에 나타내었다. 윗첨자(a)는 결과가 플라시보 군에 대해 유의적으로 상이한 것을 말한다. p < 0.05 의 차이는 유의적으로 간주한다.
하기 표 21에서 볼 수 있는 것과 같이, 조제물 1은 플라시보 군과 비교하였을 때 지주골 용적이 상당히 증가시키는 원인이 되었다((61.4%)). 이와 같은 지주골 용적의 증가가 관찰되었지만 그 정도는 그룹 22 (13.5%) 와 3 (13.1%)에서 더 작았다.
조직형태학적 측정
군 % 뼈 용적
1 61.4%a
2 13.5%
3 13.1%a
4 -12.9%
5 6.4%
6 41.7%
ALD 214.1%a
Sham 127.9%a
골량, 골 용적 평가이외에, 골 강도는 두 가지 상이한 변수를 이용하여 기계적으로 검사하였다. 한 가지 변수는 뼈를 파괴하는데 요구되는 최대 힘을 측정하는 것이고, 다른 하나는 뼈의 단단함(탄성)을 결정하는 것이다. 뼈 강도 및 단단함을 측정하는 방법은 Sturmer et al., "Standardized Bending and Breaking Test for the Normal and Osteoporotic Metaphyseal Tibias of the Rat: Effect of Estradiol, Testosterone, and Raloxifene," J. bone and Mineral Research, 2006. Vol. 21(1 ):89-96에서 설명되어 있으며, 전문을 참고문헌으로 첨부한다. 이 분석 결과는 표 22에 나타낸다. 윗첨자(a)는 결과가 플라시보 군에 대해 유의적으로 상이한 것을 말한다. p < 0.05 의 차이는 유의적으로 간주한다.
표 22의 결과에서 그룹 2, 3에 투여된 조제물 1이 플라시보 군과 비교하였을 때 뼈를 파열시키는데 필요한 최대 힘이 각 8.3% 및 8.1% 증가되었다. 그룹 3에 투여되는 조제물 1은 플라시보 처리와 비교하여 뼈 단단함이 16.0% 증가를 결과한다.
군 뼈를 파열시키는데 필요한 최대 힘 뼈 단단함
1 -0.4 4.9
2 8.3a 0.6
3 8.1a 16.0a
4 -0.6 4.6
5 0.9 10.2
6 3.0 3.3
ALD -0.4 0.2
Sham -0.3 6.0
조직형태학적 측정
DEXA 스캔, 생체기계학적 측정, 마이크로-CT 측정, 형태조직학적 측정의 결과에서 석류, 포도씨추출물로 구성된 조제물 1은 에스트로겐 회수 동안에 뼈 구조 및 구조의 개선 및 뼈 강도를 증가시키는 능력을 발휘하였다. 상기 설명된 명세서는 제한시키고자 함이 아닌 설명을 위한 것이며, 다음의 청구범위(및 이의 등가 범위 포함하여)로 본 발명의 범위를 한정시킨다.

Claims (11)

  1. 350-2000mg의 석류 추출물과 35-200mg의 포도씨 추출물을 포함하고, 이때 석류 추출물 대 포도씨 추출물의 비율은 10:1이 되는, 골 성장의 증가 또는 촉진용 식이 보충제.
  2. 청구항 제 1 항에 있어서, 이프리플라본(ipriflavone)이 더 포함된, 식이 보충제.
  3. 삭제
  4. 청구항 제 1항 또는 제 2 항에 있어서, 1250mg의 석류 추출물과 125mg의 포도씨 추출물이 포함된, 식이 보충제.
  5. 청구항 제 1 항에 있어서, 석류 추출물은 최소한 하나의 퍼니갈라긴(punicalagin)을 포함하는, 식이 보충제.
  6. 청구항 제 1 항에 있어서, 뼈 재흡수를 저해시키고, 핵인자 k B 리간드의 수용체 활성물질(Receptor Activator for Nuclear Factor k B Ligand:RANK-L)의 방출 또는 발현을 억제, 저해 또는 감소시키는, 식이 보충제.
  7. 청구항 제1항, 제5항 또는 제6항에 있어서, 퀘르세틴, 감초 추출물을 더 포함하는, 식이 보충제.
  8. 삭제
  9. 청구항 제 7 항에 있어서, 식이보충제의 섭취는 뼈 재흡수를 억제시키고, RANK-L의 방출 또는 발현을 억제, 저해 또는 감소시키는, 식이 보충제.
  10. 청구항 제 7 항에 있어서, 10-1000mg 퀘르세틴, 10-500mg 감초 추출물을 포함하는, 식이 보충제.
  11. 청구항 제 7 항에 있어서, 식이 보충제의 섭취는 다음중 하나 이상의 결과를 야기하는 식이 보충제: 골 미네랄 밀도 증가, 골 용적 증가, 지주골 세포 증가, 지주골 분리 감소, 골 두께 증가, 골 미네랄 병치율(apposition rate) 증가, 골 형성 속도 증가, 개선된 골 구조, 골 강도 증가 및 골 경도 증가.



KR1020147001052A 2006-10-24 2007-10-24 항-재흡수 및 골 형성 식이보충제 및 이의 사용 방법 Active KR101542703B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85431206P 2006-10-24 2006-10-24
US60/854,312 2006-10-24
US92591407P 2007-04-23 2007-04-23
US60/925,914 2007-04-23
PCT/US2007/022619 WO2008051594A2 (en) 2006-10-24 2007-10-24 Anti-resorptive and bone building dietary supplements and methods of use

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097008128A Division KR101471215B1 (ko) 2006-10-24 2007-10-24 항-재흡수 및 골 형성 식이보충제 및 이의 사용 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140012214A KR20140012214A (ko) 2014-01-29
KR101542703B1 true KR101542703B1 (ko) 2015-08-06

Family

ID=39186019

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147001052A Active KR101542703B1 (ko) 2006-10-24 2007-10-24 항-재흡수 및 골 형성 식이보충제 및 이의 사용 방법
KR1020097008128A Active KR101471215B1 (ko) 2006-10-24 2007-10-24 항-재흡수 및 골 형성 식이보충제 및 이의 사용 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097008128A Active KR101471215B1 (ko) 2006-10-24 2007-10-24 항-재흡수 및 골 형성 식이보충제 및 이의 사용 방법

Country Status (6)

Country Link
US (3) US9446087B2 (ko)
EP (2) EP2081570A2 (ko)
JP (2) JP5296697B2 (ko)
KR (2) KR101542703B1 (ko)
CN (2) CN101646433B (ko)
WO (2) WO2008051594A2 (ko)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101542703B1 (ko) * 2006-10-24 2015-08-06 크렘핀, 로리에 항-재흡수 및 골 형성 식이보충제 및 이의 사용 방법
US20100004334A1 (en) * 2008-07-01 2010-01-07 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional Compositions Containing Punicalagins
CA2732205C (en) 2008-07-31 2018-01-02 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Composition useful for the prevention or reduction of the progression of prostate cancer
EP2389186A4 (en) * 2008-11-26 2012-06-20 Amit Agarwal PHYTOCHEMICAL COMPOSITION AND METHOD THEREFOR
US7897184B1 (en) * 2009-08-13 2011-03-01 Access Business Group International Llc Topical composition with skin lightening effect
US8337909B2 (en) * 2010-06-04 2012-12-25 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Process of extracting procyanidins by alkaline hydrolysis
PT3372228T (pt) * 2010-12-23 2025-05-26 Amazentis Sa Método não-terapêutico de aumento ou manutenção da função mitocondrial
WO2012147619A1 (ja) * 2011-04-27 2012-11-01 キッコーマン株式会社 血糖値上昇抑制剤
ES2391211B1 (es) * 2011-05-04 2013-10-02 Select Botanical, S.L. Combinacion sinergica de polifenoles
CN102526365B (zh) * 2012-02-09 2014-07-02 李晓英 一种治疗跌打损伤的接骨胶囊
CN103070940B (zh) * 2012-12-26 2014-06-04 东莞市照燕生物科技有限公司 一种改善女性更年期症状的营养保健品
JP2014185130A (ja) * 2013-03-25 2014-10-02 Maruzen Pharmaceut Co Ltd 育毛用頭髪化粧料
CN103690606A (zh) * 2013-12-16 2014-04-02 扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司 一种治疗腰椎间盘突出的中药组合物
CN104983755A (zh) * 2015-07-24 2015-10-21 青岛蓝盛洋医药生物科技有限责任公司 一种药物组合物用于制备治疗骨质疏松药物中的用途
KR102610447B1 (ko) 2018-09-28 2023-12-06 (주)아모레퍼시픽 회화나무 추출물을 포함하는 액상 식품 조성물
US20220125834A1 (en) * 2019-03-12 2022-04-28 Nostopharma, LLC Localized delivery of therapeutic agents
KR102620485B1 (ko) * 2023-06-09 2024-01-03 주식회사 매직바이오 미네랄수 및 오가피추출물을 함유한 동물성장 촉진용 음용수 제조방법 및 이에 의해 제조된 음용수

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000247896A (ja) * 1999-02-26 2000-09-12 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 骨量低下抑制組成物

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US60063A (en) * 1866-11-27 Impbpved shoe brush
US4742046A (en) * 1984-08-03 1988-05-03 Medisearch S.A. Methods and compositions for inhibiting the infectious activity of viruses
IT1241079B (it) * 1990-03-23 1993-12-29 Chiesi Farma Spa Composizioni farmaceutiche contenenti ipriflavone,procedimento per la loro preparazione e relativo impiego terapeutico
US5504105A (en) 1990-03-23 1996-04-02 Chinoin Pharmaceutical And Chemical Works Co. Ltd. Pharmaceutical compositions containing ipriflavone, process for the preparation thereof and relative therapeutic use
JPH049884A (ja) 1990-04-27 1992-01-14 Ricoh Co Ltd 光書込み装置
IT1244697B (it) * 1991-02-01 1994-08-08 Chiesi Farma Spa Associazione farmaceutica per la prevenzione e il trattamento dell'osteoporosi post-menopausale
US5478579A (en) * 1991-02-06 1995-12-26 Biodyn Medical Research, Inc. Method for treatment of osteoporosis
HU212932B (en) 1993-08-02 1996-12-30 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Parmaceutical composition containing ipriflavone, hydroxyapatit and tricalciumphosphate for treating lack of bones and process for producing the composition
JPH07196523A (ja) * 1994-01-07 1995-08-01 Oomiya Yakugyo Kk ケルセチン配糖体を含有する内用液剤
US5424331A (en) * 1994-06-10 1995-06-13 Bio-Virus Research Incorporated Pharmaceutical compositions and dietary soybean food products for the prevention of osteoporosis
CN1150271A (zh) 1995-11-02 1997-05-21 张天光 通用字元汉字排检、输入法及键盘
US6060063A (en) * 1996-12-31 2000-05-09 Lansky; Ephraim Philip Phytoestrogen supplements prepared from pomegranate material including pomegranate seeds
JPH1149884A (ja) 1997-08-07 1999-02-23 Showa Denko Kk 発泡体及びその製造方法
JP2000191542A (ja) * 1998-12-25 2000-07-11 Lion Corp 骨粗鬆症予防、治療剤
US6103240A (en) * 1999-02-05 2000-08-15 Zhou; James H. Herbal sweetening and preservative composition comprising licorice extract and mogrosides obtained from plants belonging to cucurbitaceae and/or momordica
IL132666A (en) * 1999-11-01 2007-07-24 Migal Galilee Technological Ct Phytoestrogenic pharmaceutical preparations
US6291533B1 (en) 1999-12-22 2001-09-18 Vitamerica, Inc. Dietary supplements for each specific blood type
US6793942B2 (en) * 2000-02-23 2004-09-21 Bioselect Innovations, Inc. Composition and method for treating the effects of diseases and maladies
WO2001087315A1 (en) 2000-05-12 2001-11-22 Anadis Limited Treatment or prevention of metabolic bone disorder
WO2001091768A2 (en) * 2000-06-01 2001-12-06 Theralife, Inc. Compositions for treating brain disorders and enhancing brain function, containing herbals and/or nutritional supplements and/or minerals and/or vitamins
DE10031651A1 (de) 2000-06-29 2002-01-17 Schwabe Willmar Gmbh & Co Extrakte aus Sophora-Arten, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung
KR100408231B1 (ko) * 2000-08-14 2003-12-01 한국 한의학 연구원 골다공증 예방 및 치료용 플라보노이드 유도체
US6291522B1 (en) 2000-09-27 2001-09-18 Allergan Sales, Inc. Cyclopentane heptan(ENE)oic acid, 2-thiocarbamoyloxy and 2-carbamoyloxy compounds as therapeutic agents
US6733797B1 (en) * 2000-11-15 2004-05-11 William K. Summers Neuroceutical for improving memory and cognitive abilities
JP4937445B2 (ja) 2000-12-14 2012-05-23 丸善製薬株式会社 骨代謝改善剤及び骨粗鬆症の予防又は治療用飲食物
CN1359671A (zh) * 2000-12-18 2002-07-24 孙庆寿 一种速效接骨片的配制方法
US7008633B2 (en) 2000-12-18 2006-03-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Local regional chemotherapy and radiotherapy using in situ hydrogel
JP2002226457A (ja) * 2001-02-02 2002-08-14 Ajinomoto Co Inc 新規シスチン誘導体及び炎症因子活性化抑制剤
AU2002305833A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-23 Peninsula International, Llc Methods and compositions for helping the body resist the effects of the aging process
KR20030033393A (ko) 2001-10-22 2003-05-01 주식회사 엘지이아이 유도가열조리기의 증기배출제어방법
US20030091665A1 (en) * 2001-11-09 2003-05-15 Avon Products, Inc Topical cosmetic composition with skin rejuvenation benefits
EP1325681A1 (en) 2001-12-11 2003-07-09 Société des Produits Nestlé S.A. Composition for promotion of bone growth and maintenance of bone health
US20030138467A1 (en) 2001-12-27 2003-07-24 Avon Products, Inc. Methods for improving the aesthetic appearance of skin
JP2003196982A (ja) 2001-12-27 2003-07-11 Mitsubishi Electric Corp 半導体記憶装置
US6579543B1 (en) * 2002-02-22 2003-06-17 Jackie H. McClung Composition for topical application to skin
US20050032882A1 (en) 2002-03-06 2005-02-10 Sophie Chen Botanical extract compositions and methods of use
CN1446549A (zh) * 2002-03-25 2003-10-08 广东医学院医药科技开发中心 甘草及甘草提取物防治骨质疏松症的新用途
US7118914B2 (en) * 2002-04-23 2006-10-10 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Method for producing human lactoferrin in plant cell culture
KR100946822B1 (ko) * 2002-05-01 2010-03-09 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조 칼슘 함유 조직 강화제 및 그 용도
KR20030087566A (ko) * 2002-05-07 2003-11-14 액세스 비지니스 그룹 인터내셔날 엘엘씨 식물생리활성 영양 보조물
JP5209174B2 (ja) * 2002-05-08 2013-06-12 ビーティーユー インターナショナル，インコーポレーテッド 複数の放射供給源を有した放射装置およびプラズマ装置
KR20030095669A (ko) * 2002-06-14 2003-12-24 주식회사 렉스진바이오텍 천연물로부터 수득된 이소플라본, 그의 제조 방법 및 용도
KR20040038481A (ko) * 2002-11-01 2004-05-08 주식회사 렉스진바이오텍 천연물로부터 분리된 이소플라본 함유 추출물을 포함하는건강보조식품
JP2004175680A (ja) * 2002-11-25 2004-06-24 Marine Bio Kk 生体バランス改善効果を備えたミネラル含有組成物
AU2003289290A1 (en) 2002-12-05 2004-06-23 Takara Bio Inc. Remedy
US6887497B2 (en) * 2002-12-19 2005-05-03 Vitacost.Com, Inc. Composition for the treatment and prevention of osteoarthritis, rheumatoid arthritis and improved joint function
US20040151788A1 (en) 2003-02-05 2004-08-05 Gluck Oscar S. Method for increasing bone mineral density
JP2004262818A (ja) 2003-02-28 2004-09-24 Toyo Shinyaku:Kk 骨代謝調整組成物
FR2853549B1 (fr) 2003-04-11 2007-11-09 Agronomique Inst Nat Rech Composition nutritionnelle ou therapeutique contenant le compose oleuropeine ou l'un de ses derives
US20050181083A1 (en) * 2003-04-18 2005-08-18 Toyo Shinyaku Co., Ltd. Diet food product
KR20040101694A (ko) * 2003-05-26 2004-12-03 (주)헬스마스터 갱년기 여성용 감마리놀렌산 가공식품
US7976880B2 (en) 2003-06-04 2011-07-12 Ramaswamy Rajendran Pregnane glycoside compositions and Caralluma extract products and uses thereof
US8703209B2 (en) * 2003-06-17 2014-04-22 Edward Larry McCleary Composition and method for modulating hydrogen ion physiology
KR100516911B1 (ko) * 2003-08-19 2005-09-27 (주)씨에이치내츄럴푸드 녹차환(丸)의 제조방법
CN100366628C (zh) * 2003-09-03 2008-02-06 北京中申专利科技有限公司 槐角黄酮有效部位、生产方法及其应用
WO2005025586A1 (en) 2003-09-12 2005-03-24 Access Business Group International Llc Cytokine modulators and related method of use
EP1697302A4 (en) 2003-12-24 2011-04-27 Univ Louisville Res Found COMPOUNDS FOR THE DIAGNOSIS, TREATMENT AND PREVENTION OF BONE INJURIES AND METABOLIC DISORDERS
KR20050081597A (ko) * 2004-02-16 2005-08-19 한국 메디텍 제약 주식회사 은행잎추출물을 유효성분으로 함유하는 발암억제효과를갖는 골다공증 치료제
CN100441555C (zh) * 2004-04-09 2008-12-10 汪云 含白藜芦醇和大豆异黄酮的组合物及其制备方法与应用
US20050232901A1 (en) 2004-04-14 2005-10-20 Zaghmout Ousama M Materials and methods for treating or preventing oxalate-related disease
JP2006117550A (ja) * 2004-10-19 2006-05-11 Univ Of Tokushima 破骨細胞分化抑制因子産生促進剤
WO2006079243A1 (fr) * 2005-01-26 2006-08-03 Mian Long Emploi du flavonol et des glycosides de type flavonol dans la stimulation de la croissance des cellules épithéliales rénales tubulaires pour sécréter le facteur de croissance osseuse
KR101542703B1 (ko) * 2006-10-24 2015-08-06 크렘핀, 로리에 항-재흡수 및 골 형성 식이보충제 및 이의 사용 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000247896A (ja) * 1999-02-26 2000-09-12 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 骨量低下抑制組成物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
European Journal of Oral Sciences, Vol. 113, pp. 47-52(2005년)*

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008051586A3 (en) 2008-09-25
US20080199546A1 (en) 2008-08-21
KR20140012214A (ko) 2014-01-29
CN102266440B (zh) 2015-06-17
JP2010507669A (ja) 2010-03-11
HK1139590A1 (en) 2010-09-24
KR20090089847A (ko) 2009-08-24
CN101646433A (zh) 2010-02-10
CN101646433B (zh) 2011-11-16
WO2008051586A2 (en) 2008-05-02
HK1162315A1 (en) 2012-08-31
US20160346344A1 (en) 2016-12-01
EP2415469A1 (en) 2012-02-08
WO2008051594A2 (en) 2008-05-02
EP2081570A2 (en) 2009-07-29
CN102266440A (zh) 2011-12-07
JP5706467B2 (ja) 2015-04-22
US20080199545A1 (en) 2008-08-21
US9446087B2 (en) 2016-09-20
US11207368B2 (en) 2021-12-28
WO2008051594A3 (en) 2008-10-09
JP5296697B2 (ja) 2013-09-25
JP2013173795A (ja) 2013-09-05
KR101471215B1 (ko) 2014-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101542703B1 (ko) 항-재흡수 및 골 형성 식이보충제 및 이의 사용 방법
Vinayagam et al. Antidiabetic properties of dietary flavonoids: a cellular mechanism review
Caliskan Mediterranean Hawthorn fruit (Crataegus) species and potential usage
Demir et al. Selective cytotoxic effect of Rhododendron luteum extract on human colon and liver cancer cells
Saryono et al. Anti-inflammatory effect of date seeds (Phoenix dactylifera L) on carrageenan-induced edema in rats
Usha et al. Pomegranate peel and its anticancer activity: A mechanism-based review
Williams et al. Antioxidants in grapes and wine: Chemistry and health effects
Sharma et al. Ananas comosus (Pineapple): A Comprehensive Review of Its Medicinal Properties, Phytochemical Composition, and Pharmacological Activities.
Djordjević et al. Hawthorn (Crataegus spp.) from botanical source to phytopreparations.
Han et al. Hawthorn-a health food
Putra et al. Benefits total phenolic and flavonoid content of Portulaca oleracea as Antioxidant and Antidiabetic: A Review
Khan et al. Secondary metabolite studies of some selected plants of District Gilgit, Gilgit-Baltistan
Al-talaqany et al. Date palm [Phoenix dactylifera]: Description, Components, Importance, and Medical Uses: A review.
Badole et al. Polyphenols from Pongamia pinnata (Linn.) Pierre in metabolic disorder
HK1162315B (en) Anti-resorptive and bone building dietary supplements and methods of use
HK1139590B (en) Anti-resorptive and bone building dietary supplements and methods of use
KR101472224B1 (ko) 소리쟁이 뿌리 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증의 예방 및 치료용 조성물
Biswas et al. T. chebula and Its Medicinal Value
Joshi et al. A SYSTEMATIC REVIEW ON MEDICINAL PLANT: POMEGRANATE
Pokhrel et al. Crataegus rhipidophylla Gand.
Eff et al. Renin inhibition activity, phenolic and flavonoid contents of Centella asiatica (L.) Urb.
Saeed et al. Bioactive Compounds, Their Mechanisms of Action, and Cardioprotective Effects of Pomegranate (Punica granatum): A Comprehensive Review
Manivasagam et al. Ameliorative Effect of Pomegranate
Chitrasree et al. COMPREHENSIVE REVIEW ON TERMINALIA CATAPPA: TRADITIONAL USES, PHARMACOLOGICAL PROPERTIES, AND BIOACTIVE COMPOUNDS
Al-Abdaly Effect of Flavonoids Extracted from Hawthorn (crataegus oxyacantha) on some hematological parameters of female mice

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 20140115

Application number text: 1020097008128

Filing date: 20090421

PA0201 Request for examination
PG1501 Laying open of application
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20140219

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20140820

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20150212

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20140820

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

Patent event date: 20140219

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
PJ0201 Trial against decision of rejection

Patent event date: 20150311

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event code: PJ02012R01D

Patent event date: 20150212

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PJ02011S01I

Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal

Decision date: 20150506

Appeal identifier: 2015101001341

Request date: 20150311

PB0901 Examination by re-examination before a trial

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20150311

Patent event code: PB09011R02I

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event date: 20150311

Patent event code: PB09011R01I

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20141017

Patent event code: PB09011R02I

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20140411

Patent event code: PB09011R02I

B701 Decision to grant
PB0701 Decision of registration after re-examination before a trial

Patent event date: 20150506

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PB07012S01D

Patent event date: 20150413

Comment text: Transfer of Trial File for Re-examination before a Trial

Patent event code: PB07011S01I

PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20150731

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20150731

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180628

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20180628

Start annual number: 4

End annual number: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190624

Year of fee payment: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20190624

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20200624

Start annual number: 6

End annual number: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20210702

Start annual number: 7

End annual number: 7

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20220622

Start annual number: 8

End annual number: 8

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20230626

Start annual number: 9

End annual number: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20240624

Start annual number: 10

End annual number: 10

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20250625

Start annual number: 11

End annual number: 11