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KR101526019B1 - 증대된 단백질 발현 및 정제를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

증대된 단백질 발현 및 정제를 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR101526019B1
KR101526019B1 KR1020097016018A KR20097016018A KR101526019B1 KR 101526019 B1 KR101526019 B1 KR 101526019B1 KR 1020097016018 A KR1020097016018 A KR 1020097016018A KR 20097016018 A KR20097016018 A KR 20097016018A KR 101526019 B1 KR101526019 B1 KR 101526019B1
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Abstract

본 발명은 숙주 세포에서 이종성 융합 단백질의 발현 수준, 분비 및 정제를 증대시키는 방법에 관해 개시한다.

Description

증대된 단백질 발현 및 정제를 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCED PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION}
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2006년 12월 29일에 출원된 미국 가특허 출원 제60/877,914호를 기초로 우선권을 주장한다. 상기 가특허 출원은 본원에서 참고로 인용한다.
본 발명은 재조합 cDNA 발현 및 발현된 단백질의 정제 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 다종 다양한 숙주 종으로부터 이종성 단백질의 발현을 증대시키고 정제를 촉진하기 위한 재료 및 방법을 제공한다.
본 발명이 속하는 기술 분야의 선행 기술을 설명하기 위해서 명세서 전반에 걸쳐서 여러 간행물들과 특허 문헌들을 인용한다. 본 명세서 전반에서 이러한 참고 문헌들이 자세히 인용된 것을 볼 수 있다. 이러한 인용문들은 각각 전체가 기재된 것과 마찬가지로 본원에서 참고 문헌으로 포함된다.
이종성 발현 시스템에서 생물학적 활성 단백질을 균일하게 발현시키고 정제하는 기술이 없음으로 인해 기능성 게놈 연구는 제약을 받아왔다[Ryan and Patterson (2002) Trends Biotechnol, 20:S45-51]. 특정 발현 벡터에서 동일한 전사 신호과 번역 신호를 사용함에도 불구하고, 발현된 단백질 수준은 매우 다양하게 관찰되었다[Weickert et al. (1996) Curr. Opin. Biotechnol., 7:494-9]. 이러한 이유로 인해, 박테리아, 효모, 포유동물 및 곤충 세포에서 이종성 단백질을 유전자 융합으로서 발현시키기 위한 몇 가지 방법이 개발되었다[Ecker et al. (1989) J. Biol. Chem., 264:7715-9; Butt et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci., 86:2540-4; Kapust and Waugh (1999) Protein Sci., 8:1668-74; Ikonomou et al. (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol., 62:1-20].
박테리아에서 이종성 유전자를 발현시키는 것은 연구 목적 또는 상업적 목적을 위해 이용될 수 있는 가장 간단하고 비용이 가장 저렴한 수단이다. 그러나, 일부 이종성 유전자 생성물은 이. 콜라이(E. coli)에서 이들의 정확한 3차원 입체구조를 형성하지 못하는 한편, 다른 일부 유전자 생성물은 과생산될 때 불용성의 거대 응집체 또는 "봉입체"에 결박되게 된다[Jonasson et al. (2002) Biotechnol. Appl. Biochem., 35:91-105; Georgiou and Valax (1999) Methods Enzymol., 309:48-58]. 재조합 단백질을 적당한 수율로 생산하기 위해서는, 주요 변성제 유도 가용화 방법을 행한 후 리폴딩이 촉진되는 조건하에 변성제를 제거하는 것이 종종 필요하다.
구조 유전체학 프로젝트를 위한 오픈 리딩 프레임(ORF)의 선택 역시, 이. 콜라이에서 발현된 유전자의 약 20%만이 가용성이거나 정확하게 폴딩되는 단백질을 생성한다는 것을 보여주었다[Waldo et al. (1999) Nat. Biotechnol., 17:691-5]. 이러한 수치는, 특히, 대부분의 과학자들이 유전자 생성물을 발현시키기 위한 첫 시도에서 이. 콜라이에 의존하고 있다는 점을 감안할 때 엄청나게 실망스러운 것이 다. NUS A, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST) 및 티오레독신(TRX)과 같은 태그에 접합시켜 단백질을 발현시키는 몇 가지 시스템이 개발되었다[Jonasson et al. (2002) Biotechnol. Appl. Biochem., 35:91-105]. 이러한 시스템 모두 비효율적인 발현 내지 소정의 구조로부터의 일관되지 않은 절단 등과 같은 특정한 결점을 가지고 있다.
유비퀴틴(Ub) 및 유비퀴틴 유사 단백질(Ubl)은 문헌을 통해 알려져 있다[Jentsch and Pyrowolakis (2000) Trends Cell Biol., 10:335-42; Yeh et al. (2000) Gene, 248:1-14; Larsen and Wang (2002) J. Proteome Res., 1:41 1-9]. SUMO 시스템 역시 규명되어 있다[Muller et al. (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2:202-10.]. SUMO(소형 유비퀴틴 관련 변경 인자)는 공개된 문헌에서 Sentrin, SMT3, PIC1, GMP1 및 UBL1로도 알려져 있는 Ubl이다. SUMO 경로는 진핵생물계 전체에 존재하고 SUMO 단백질은 효모에서 인간에 이르기까지 매우 보존되어 있다[Kim et al. (2002) J. Cell. Physiol., 191:257-68]. 유비퀴틴과 SUMO 간의 전체적인 서열 상동성이 18%에 불과하지만, 핵 자기 공명(NMR)에 의한 구조 결정은 두 단백질이 α-나선 둘레에 감싸진 β-시트를 갖는 치밀하게 팩킹된 구형 접힘 구조를 특징으로 하는 공통된 3차원 구조를 보유한다는 것을 보여준다[Bayer et al. (1998) J. Mol. Biol, 280:275-86; Kim et al. (2000) J. Biol. Chem., 275: 14102-6]. SUMO의 샤페론 특성을 조사하여, 이것이 불안정한 단백질의 N 말단에 부착되면 단백질 폴딩을 위한 핵으로서 작용하여 단백질이 응집되는 것을 막을 수 있다는 것을 밝혔다.
모든 SUMO 유전자는 보존된 C 말단의 Gly-Gly 모티프를 넘어 연장되는 짧은 C 말단 서열을 갖는 전구체 단백질을 코딩한다[Muller et al. (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2:202-10]. 연장 서열은 길이가 다양하며 일반적으로 2∼12개 아미노산이다. SUMO 프로테아제(하이드롤라제로도 알려져 있음)는 세포 내에서 SUMO화(sumoylation)되기 전에 C 말단 연장부를 제거한다[Coloma et al. (1992) J. Immunol. Methods, 152:89-104]. SUMO의 C 말단을 표적 단백질의 라이신 잔기의 ε-아미노기에 접합하는 것이 SUMO화로서 알려져 있다. 세포내 단백질의 SUMO화는 핵내 수송, 신호 전달, 스트레스 반응 및 세포 주기 진행을 조절하는 것으로 제안되었다[Kretz-Remy and Tanguay (1999) Biochem. Cell. Biol., 77:299-309]. SUMO는 다양한 세포내 구획 간의 단백질 전위 신호를 보낼 가능성이 매우 크지만, SUMO의 이러한 기능에 관한 정확한 기계적인 상세사항은 알려져 있지 않다. 이러한 두 단백질 변형이 제공하는 다양한 효과를 고려할 때 SUMO 경로와 유비퀴틴 경로 간의 유사성은 현저하다[Goettsch and Bayer (2002) Front. Biosci., 7:a148-62].
NusA는 아마도 그 큰 크기로 인해 파트너 단백질의 용해를 촉진하는 또 다른 융합 태그이다[Davis et al. (1999) Biotecnol. Bioeng., 65:382-8]. 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)[Smith and Johnson (1988) Gene, 67:31-40] 및 말토스 결합 단백질(MBP)[diGuan et al. (1988) Gene, 67:21-30] 융합 태그 역시 융합 파트너의 발현 및 수율을 증대시키는 것으로 제안되었다. 그러나, GST가 이량체의 형태로서 사용되고 단백질 용해를 지연시킬 수 있을 경우 발현 증대가 항상 관찰되는 것은 아니다. 이러한 융합 시스템 모두에 있어서의 또 다른 문제는 목적 단백질이 융합 체로부터 제거될 수 있어야 할 수도 있다는 것이다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 인자 Xa, 트롬빈, 엔테로키나제 또는 Tev 프로테아제 부위와 같은 프로테아제 부위를 종종 융합 태그의 하류에서 조작한다. 그러나, 이러한 프로테아제가 융합체/표적 단백질 내에 존재할 수 있는 짧은 특정 아미노산 서열을 인식하기 때문에 부적절한 절단이 종종 관찰된다[Jonasson et al. (2002) Biotechnol. Appl. Biochem., 35:91-105]. 본 발명은 이러한 문제를 극복한다. 또한, SUMO 프로테아제와 달리, Tev 프로테아제는 융합 단백질의 절단 후 관심있는 단백질의 N 말단에 바람직하지 않은 서열을 남기는 서열 특이적 프로테아제이다. 이와는 대조적으로, SUMO 프로테아제는 SUMO의 C 말단으로부터 임의의 서열을 절단하여, 융합 단백질에 소정의 N 말단(프롤린 제외)을 생성한다.
[발명의 개요]
본 발명에 따르면, 야생형 SUMO 프로테아제에 의해 절단될 수 없는 조작된 SUMO 단백질이 제공된다. 상기 조작된 SUMO 단백질을 코딩하는 핵산 분자 역시 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 조작된 SUMO는 SUMO 프로테아제 상호작용 도메인 내의 하나 이상의 아르기닌 잔기가 또 다른 아미노산, 바람직하게는 비염기성 아미노산으로 변경된 SUMO 단백질이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 조작된 SUMO 단백질은 아미노산 서열 X1FX2X3X4GX5X6(서열 번호 2)을 포함하며, 여기서, X1 및 X6은 아르기닌 이외의 임의의 아미노산이고, X2, X3, X4 및 X5는 임의의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, X1은 글루타민, 트레오닌 및 페닐알라닌으로 구성된 군에서 선택되고, X6은 루신 및 글루탐산으로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 조작된 SUMO는 서열 번호 1과 90% 이상의 동일성을 갖는다.
본 발명에 따르면, 조작된 SUMO 단백질을 절단할 수 있는 조작된 SUMO 프로테아제가 제공된다. 상기 조작된 SUMO 프로테아제를 코딩하는 핵산 분자 역시 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 조작된 SUMO 프로테아제는 SUMO 상호작용 도메인이 변경된 SUMO 프로테아제이다. 더 구체적인 실시형태에서, 상기 조작된 SUMO 프로테아제는 아미노산 서열 WLNX1X2X3X4X5(서열 번호 6)을 포함하며, 여기서, X1 및 X5는 임의의 비산성 아미노산이고, X2, X3, X4 및 X5는 임의의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, X1은 세린이고, X2는 글리신 및 트레오닌으로 구성된 군에서 선택되며, X5는 세린, 알라닌 및 메티오닌으로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 조작된 SUMO 프로테아제는 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 숙주 세포에서 관심있는 단백질의 발현 수준을 증대시키는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 이러한 방법은 i) 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산을, 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결함으로써, 융합 단백질을 코딩하는 구성체를 생성하는 단계, 및 ii) 상기 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 융합 단백질 내의 조작된 SUMO의 존재가 숙주 세포에서 관심있는 단백질의 발현 수준을 증가시키는 것인 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 융합 단백질을 단리하는 단계 및 경우에 따라 상기 융합 단백질을 절단하여 상기 관심있는 단백질을 방출시키는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 숙주 세포에서 관심있는 단백질의 변경된 아미노 말단을 생성하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 이들 방법은 a) 상기 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계; b) 상기 핵산 내의 N 말단 아미노산 코딩 서열을 변경하는 단계; c) 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산을 상기 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결하는 단계; d) 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현시키는 단계; 및 e) 상기 숙주 세포에서 조작된 SUMO를 절단할 수 있는 조작된 SUMO 프로테아제를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 조작된 SUMO 프로테아제는 조작된 SUMO를 절단시킴으로써, 세포 내에서 변경된 아미노 말단을 갖는 관심있는 단백질을 생성한다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 변경된 아미노 말단을 갖는 관심있는 단백질을 단리하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 숙주 세포로부터 관심있는 단백질의 분비 수준을 증대시키는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 이들 방법은 i) 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산 분자를, 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결함으로써, 융합 단백질을 코딩하는 구성체를 생성하는 단계, 및 ii) 상기 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 융합 단백질 내의 조작된 SUMO의 존재가 숙주 세포로부터 관심있는 단백질의 분비를 증가시킨다.
프로모터 및 다중 클로닝 부위에 작동 가능하게 연결된 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 역시 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 이 다중 클로닝 부위는, 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산이, 조작된 SUMO의 Gly-Gly 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열의 3'쪽에 클로닝될 수 있도록 한다. 특정 실시형태에서, 상기 재조합 벡터는, 본래의 관심있는 단백질과 상이한 아미노 말단을 생성하기 위해 상기 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산을 변경하기 위한, 올리고뉴클레오티드에 기초한 부위 지정 돌연변이 유발을 위한 시약 및 숙주 세포를 더 포함할 수 있는 키트 내에 포함된다.
또 다른 실시형태에서, i) a) 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산; b) 프로모터; c) 다중 클로닝 부위; 및 경우에 따라, d) 친화성 태그를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터(여기서, 상기 프로모터는 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고, 친화성 태그를 코딩하는 핵산 서열이 존재한다면, 이 핵산 서열은, 상기 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산 분자에 인프레임으로 작동 가능하게 연결되고, 상기 다중 클로닝 부위는, 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산이 상기 조작된 SUMO의 Gly-Gly 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열의 3'쪽에 클로닝될 수 있도록 함), 및 ii) 조작된 SUMO 프로테아제 또는 조작된 SUMO 프로테아제를 코딩하는 벡터를 포함하는 조성물(여기서, 상기 조작된 SUMO 프로테아제는 Gly-Gly 절단 부위 다음에서 조작된 SUMO를 특이적으로 절단함)을 포함하는 숙주 세포로부터 단백질을 정제하기 위한 키트가 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 키트는 1종 이상의 숙주 세포, 친화성 태그를 결합시키기 위한 고체 지지체, 용해 완충액, 세척 완충액, 용리 완충액, 절단 완충액 및 설명 자료를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 관심있는 단백질에 연결된 조작된 SUMO 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 마이크로어레이(microarray)가 제공된다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 야생형 SUMO 및 야생형 SUMO 프로테아제와 비교한, 원핵 세포 및 진핵 세포로부터 단백질을 제조하고 정제하기 위한, 조작된 SUMO 태그(예를 들어, SUMO*) 및 상응하는 조작된 SUMO 프로테아제의 잠재적 용도를 예시하는 모식도이다.
도 2는 야생형 SUMO를 이용한 것과 같이, SUMO*가, 태그 미부착 GFP와 비교할 때, 박테리아 세포에서 융합 파트너의 발현 및 용해도(가용성)를 크게 증대시킨다는 것을 보여주는 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔의 이미지이다. U = 비유도 배양물; I = 유도 배양물; S = 가용성 분획; IB = 불용성 봉입체.
도 3A 및 3B는 SUMO* 융합 태그가 각각 효모 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 SUMO 프로테아제 또는 곤충 세포 SUMO 프로테아제에 의해 절단되지 않음을 보여주는 웨스턴 블롯의 이미지이다. 도 3A의 경우, 효모를 GFP(레인 1 및 2), SUMO-GFP(레인 3 및 4) 또는 SUMO*-GFP(레인 5 및 6)를 발현하는 구성체로 형질전환시켰다. 도 3B의 경우, SUMO*-GFP 또는 SUMO-GFP를 곤충 Sf9 세포 추출물 존재하(레인 1 및 2) 또는 부재하(레인 3 및 4)에 22℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 단백질을 15% SDS-PAGE 겔에서 분리하고 항GFP 항체로 검출하였다. * = GFP 분해 생성물.
도 4A 및 4B는 Smt3 및 ULP1의 결정 구조 및 이들의 잠재적 상호작용을 도시한다. SUMO-ULP1 상호작용의 일부인, SUMO 내의 2개의 잔기(아르기닌 64 및 아르기닌 71) 및 ULP1 내의 2개의 잔기(글루탐산 455 및 아스파르트산 451)가 구체적으로 도시되어 있다. 도 4A 및 4B에 상이한 시야각이 도시되어 있다.
도 5는 ULP1과 접할 것으로 예측되는 SUMO의 영역을 도시한다. R64 및 R71 위치의 아르기닌이 강조되어 있다. 서열 번호 66이 제시된다.
도 6은, 야생형 SUMO(Smt3)는 시험관내에서는 ULP1 및 SENP2(SUMO 프로테아제 1 및 2)에 의해 절단되나, SUMO*(돌연변이 Smt3)는 시험관내에서 둘 중 어느 프로테아제에 의해서도 절단되지 않는다는 것을 보여주는, 동일한 겔의 쿠마시 염색 SDS-PAGE(윗쪽 패널) 및 항Smt3 웨스턴 블롯(아래쪽 패널)의 이미지를 도시한다.
도 7은 조작된 SUMO를 절단할 수 있는 조작된 SUMO 프로테아제를 스크리닝하는 데 사용되는 실험 시스템의 모식도이다. β-락타마제는 이것이 주변세포질 영역으로 이출될 때에만 이. 콜라이에서 암피실린에 내성을 부여한다. 도 7A에 도시된 바와 같이, β-락타마제가 SUMO 및 불용성 단백질의 N 말단에 연결될 경우, 이것은 세포 내부에 포획되어 박테리아는 암피실린 함유 플레이트에서 증식하지 못한다. β-락타마제 복합체 이외에도 SUMO 프로테아제가 세포 내로 도입된다면, β-락타마제가 SUMO 프로테아제에 의해 방출되고, 그 후 이것은 주변세포질로 이출되며, 여기에서 이것은 암피실린에 대한 내성을 부여한다(도 7B). β-락타마제 상의 SUMO 태그가, 이것이 야생형 SUMO 프로테아제에 의해 절단되지 않도록 돌연변이될 경우(예를 들어, 상기 SUMO는 SUMO*임), 이 세포는 암피실린에 대한 감수성을 나타내게 된다(도 7C). SUMO 프로테아제가 이것이 돌연변이 SUMO*를 절단하도록 돌연변이/변경될 경우에만, 상기 박테리아 세포는 암피실린에 대한 내성을 다시 얻게 된다(도 7D). Insol. protein = 불용성 단백질; WT SUMO 프로테아제 = 야생형 SUMO 프로테아제; BLA = β-락타마제; SUMO* = 조작된 SUMO.
도 8은, 프로테아제가 SUMO 함유 기질을 절단할 수 없을 경우 이. 콜라이가 암피실린 상에서 증식하지 못한다는 것을 보여주는, 생체내 β-락타마제 스크리닝의 배양물 이미지이다.
도 9는 야생형 SUMO 프로테아제 ULP1 내 영역 및 돌연변이되었을 때 SUMO*에 대한 효소 활성을 회복한 특정한 특이적 잔기의 모식도이다. 서열 번호 24가 제시된다.
도 10A∼10D는, SUMO* 프로테아제는 GFP를 갖는 융합 단백질로부터 SUMO*를 효율적으로 절단하지만, ULP1은 SUMO* 태그를 절단하지 못한다는 것을 보여주는 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔의 이미지이다. 경사부는 각각의 연속된 레인이 이전 레인보다 2배 적은 프로테아제를 함유하고 있는 프로테아제 적정을 나타낸다. 도 10A는 ULP1이 SMT3 태그를 절단한다는 것을 보여준다. 도 10B는 SUMO* 프로테아제 1이 SUMO* 태그를 절단한다는 것을 보여준다. 도 10C는 ULP1이 SUMO* 태그를 절단하지 못한다는 것을 보여준다. 도 10D는 SUMO* 프로테아제 1은 야생형 SUMO를 절단하지만, SUMO*보다 덜 효율적으로 절단한다는 것을 보여준다. U = 비절단 SUMO 또는 SUMO*-GFP(프로테아제가 존재하지 않음); P = 프로테아제만 있는 레인, 1차 절단 반응에서와 동량의 프로테아제가 사용되었다.
도 11A∼11C는 다양한 종 유래의 SUMO 단백질의 서열을 제시한다. 밑줄친 영역은 SUMO 프로테아제와의 상호작용 영역이다.
도 12A 및 12B는 다양한 종 유래의 SUMO 프로테아제의 서열을 제시한다. 밑줄친 영역은 SUMO 단백질과의 상호작용 영역이다.
도 13은 곤충 세포에서 SUMO* 태그 부착 트립타제가 6xHis 태그 부착 트립타제보다 더 높은 수준으로 발현되고 절단되지 않는다는 것을 보여주는 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔의 이미지이다.
도 14는 피치아 세포에서 SUMO* 태그 부착 GzmB가 6xHis 태그 부착 GzmB보다 더 높은 수준으로 발현되고 절단되지 않는다는 것을 보여주는 웨스턴 블롯의 이미지이다.
도 15A는 곤충 sf9 세포에서 SUMO* 융합체에 의해 이종 발현된 UBP43 단백질의 현저한 증대를 보여주는 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔의 이미지이다. 화살표는 비융합 UBP43 또는 SUMO* 융합 UBP43의 크기를 가르킨다. 도 15B는 HEK293T 세포에서의 마우스 X 군 포스포리파제 2A(mX PLA2; 왼쪽 패널) 및 데유비퀴티나제 JOSD2(오른쪽 패널)의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯의 이미지를 도시한다. SUMO*를 가진 PLA2 융합체만이 배지로 분비되는 반면, 6xHis를 가진 융합체 및 야생형 SUMO는 분비되지 않는다. 상기 6xHis-PLA2 및 완전히 절단된 SUMO-PLA2는 세포 추출물에서 거의 검출되지 않는다. 화살표는 야생형 SUMO로부터 절단된 PLA2 및 SUMO*-PLA2의 예상 크기를 가르킨다. JOSD2는 세포내에서 발현되고 SUMO*는 그 발현을 크게 증대시킨다. H = 6xHis; S = SUMO; 및 S* = SUMO*.
도 16은 형질감염(HEK-293T) 48시간 후 초기 마우스 sPLA2-X 구성체[활성형(도 16A) 및 비활성형(도 16B) 둘 다]로부터 얻은 배지(15 ㎕)의 웨스턴 블롯의 이미지를 도시한다. 하기 5개의 N 말단 융합 태그를 테스트하였다: 6xHis, 6xHis-CTHS, 6xHis-SUMOmut, 6xHis-SUMO 및 6xHis-hSUMO3. 모든 구성체는 또한 마우스 IgG 카파 분비 신호를 포함하였다. 결과는 3회의 독립적 실험의 대표값이다.
도 17은 형질감염(HEK-293T) 48시간 후 변경된 마우스 sPLA2-X 구성체[비활성형(도 17A) 및 활성형(도 17B) 둘 다]로부터의 배지(15 ㎕)의 웨스턴 블롯의 이미지를 도시한다. 하기 7개의 N 말단 융합 태그를 테스트하였다: 6xHis, 6xHis-SUMO, 6xHis-SUMO mut, 6xHis-hSUMO1 , 6xHis-hSUMO1 mut, 6xHis-hSUMO3 및 6xHis-hSUMO3 mut. 모든 구성체는 또한 마우스 IgG 카파 분비 신호를 포함하였다. 결과는 3회의 독립적 실험의 대표값이다.
도 18은 형질감염(HEK-293T) 48시간 후 sPLA2-IIC(도 18A, 세포내 분획), IIE[도 18B, 배지(15 ㎕)], III[배지(15 ㎕)] 및 V[배지(15 ㎕)] 구성체의 웨스턴 블롯의 이미지를 도시한다. 대조군으로서 사용되는 6xHis 태그를 갖는 야생형과 돌연변이형 둘 다에서 3종의 UMO를 사용하여, 각각의 sPLA2를 비교하였다. 모든 구성체는 또한 마우스 IgG 카파 분비 신호를 포함하였다. 결과는 2∼3회의 독립적 실험의 대표값이다.
[상세한 설명]
본 발명은 진핵 세포 시스템에서 야생형 SUMO 프로테아제에 의해 절단되지 않는 신규한 조작된 SUMO 단백질 및 그 사용 방법을 제공한다. 실제로, SUMO의 발현 증대 특성을 이용하기 위해, 진핵 세포에서 절단되지 않는 신규한 조작된 SUMO 태그(예를 들어, SUMO*)를 개발하였다. SUMO 프로테아제는 모든 진핵 세포에 존재한다. 따라서, 본 발명의 조작된 SUMO 단백질과는 달리, 야생형 SUMO 융합체는 진핵 세포에서 발현될 때 절단된다. 특히, 원핵 세포는 SUMO 경로 또는 SUMO 프로테아제를 갖고 있지 않다. 따라서, SUMO 융합체(야생형 또는 조작된 형태)는 원핵 세포에서 발현될 때 절단되지 않는다.
조작된 SUMO 단백질을 절단할 수 있는 신규한 조작된 SUMO 프로테아제 역시 제공된다. 상기 조작된 SUMO 단백질 및 SUMO 프로테아제는, 진핵 세포 및 원핵 세포 시스템에서, 조작된 SUMO에 융합된 관심있는 단백질의 발현 및 정제를 가능하게 한다(예를 들어, 도 1 참조). 상기 시스템은 또한 원하는 N 말단을 갖는 본래 단백질을 생성을 가능하게 한다.
예를 들어, 한 유기체로부터 이종 숙주 유기체로 핵산 서열을 삽입함으로써, 재조합 단백질을 제조할 수 있다. 상기 이종 숙주는 삽입된 핵산 분자로부터 재조합 단백질(관심있는 단백질)을 합성한다. 그 후, 제조된 단백질은 일반적으로 후속 정제 단계에서 세포로부터 분리한다. 원핵 세포, 진핵 세포, 박테리아, 효모, 곤충 및 포유동물 세포를 모두 재조합 단백질을 발현시키는 데 사용할 수 있다. 관심있는 단백질을 코딩하는 영역 바로 앞 또는 뒤에 DNA 서열이 삽입된 단백질 "태그"를 제작하였다. 생성된 융합 단백질은 태그와 관심있는 재조합 단백질을 포함한다. 단백질 태그는 용해도, 적절한 폴딩, 발현 수준 및 관심있는 단백질을 정제할 수 있는 능력을 증대시킬 수 있다.
박테리아 이. 콜라이에서 단백질 발현 및 용해도를 증대시키는 다종 다양한 단백질 태그가 수년에 걸쳐 개발되었다. 이러한 단백질 태그로는 GST(글루타티온 S-트랜스퍼라제), MBP(말토스 결합 단백질), Thx(티오레독신), NusA, Ub(유비퀴틴) 및 SUMO를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 이들 태그는 박테리아에서 성공적으로 사용되고 있지만, 이것들은 진핵 세포로 전달될 수 없는데, 왜냐하면, 이종성 단백질의 낮은 발현율 또는 Ub 또는 SUMO 태그의 경우 내인성 프로테아제로 인하여 융합 단백질로서 남아있지 못하는 점과 같은 다양한 한계가 있기 때문이다.
융합 파트너로서의 상기 SUMO 단백질은 박테리아 세포와 진핵 세포 둘 다에서 재조합 단백질 발현의 수준과 품질을 크게 증대시킬 수 있다[예를 들어, 미국 특허 제7,060,461호; 미국 특허 출원 제2004-0018591호 및 제2006-0040335호; 및 PCT/US04/20778 참조]. 단백질의 SUMO 패밀리는 세포내 조절의 일부로서 진핵 세포 단백질로부터 자연적으로 첨가되고 제거된다. SUMO의 구조와 SUMO 단백질 첨가 및 제거의 과정은 진핵 세포에서 고도로 보존되어 있다. SUMO 단백질에 있어서의 높은 구조 보존성은 SUMO 융합 태그와 이종 숙주의 내인성 SUMO 변경 효소의 교차 종 반응성으로 이어진다. 따라서, 진핵 세포는 SUMO 태그를 절단할 수 있고, 많은 경우, 이것은 태그 및 재조합 단백질의 분리를 초래한다. 진핵 세포로부터의 "비절단" 또는 비가공 야생형 SUMO 융합 단백질의 발현 및 정제는 종종 불가능하다. 진핵 세포에서 단백질 생산 증대를 위해 "미성숙" 태그 절단이라는 이러한 장애를 극복하기 위해, 내인성 SUMO 프로테아제에 내성이 있도록 신규한 SUMO 단백질을 조작하였다.
본 발명의 발견은 단백질 발현 분야에 있어서의 4가지 이상의 주요 문제점들을 해결한다. 첫째, 전술한 바와 같이, 진핵 세포에서 SUMO, Ub 및 다른 유비퀴틴 유사 단백질 융합체를 사용하는 것은 진핵 세포에 본래 존재하는 하이드롤라제에 의한 융합체 결합의 즉각적인 절단에 의해 제한되었었다. 이러한 절단으로 인해, 관심있는 단백질의 정제를 촉진하기 위해 SUMO-하이드롤라제의 절단 부위 또는 패신저 단백질의 C 말단 다음에 친화성 태그를 위치시켜야 한다. 융합 단백질의 하류 적용을 위해 상기 친화성 태그를 제거하고자 한다면, 프로테아제 부위 역시 조작되어야 한다. 본원에 제시된 시스템은 원핵 세포 시스템에의 SUMO 태그의 제약을 극복함으로써, 진핵 세포를 비롯한 모든 시스템에서 융합 단백질의 친화성 정제를 위해 본 발명의 돌연변이 SUMO 단백질 또는 상기 돌연변이 SUMO 단백질의 아미노 말단에 부착된 친화성 태그를 사용할 수 있게 한다. 본원에서 제공되는 조작된 SUMO 프로테아제에 의하면 시험관내 또는 생체내에서 태그를 효율적으로 제거할 수 있다.
둘째, 많은 단백질이 진핵 세포 및 원핵 세포에서 불안정하거나 발현율이 낮다. 조작된 SUMO 단백질을 갖는 융합체는 비융합 단백질 대응물(예를 들어, 도 3A 참조) 및 심지어 야생형 SUMO에 융합된 단백질(예를 들어, 실시예 4 참조)보다도 현저히 더 높은 수준으로 단백질이 발현될 수 있게 한다. 또한, 후술하는 바와 같이, 조작된 SUMO 단백질을 갖는 융합체는 비융합 단백질 또는 심지어 야생형 SUMO에 융합된 단백질보다 더 높은 수준으로 관심있는 단백질의 분비를 촉진할 수 있다. 관심있는 단백질에 대한 SUMOP 분자의 부착은 또한 단백질을 안정화시킬 수 있다.
셋째, 특정 단백질은, 특히 이종적으로 발현될 경우, 세포에 독성을 나타낸다. 이러한 독성 단백질에 대한 SUMO의 부착은 단백질의 독성을 줄이거나 제거하여 이전에 발현시키기 어려웠던 독성 단백질의 발현을 더 많이 지속적으로 유지할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 아미노 말단에 SUMO 분자가 존재하는 것은 그 단백질의 영역에 국재화된 단백질의 임의의 독성 활성을 억제할 수 있다. 실제로, 하기 실시예 4에서 입증되는 바와 같이, 세포에 독성/치사적이며 그 활성을 위해 자유 N 말단을 필요로 하는 단백질 PLA2는 조작된 SUMO에 융합될 경우 진핵 세포에서 높은 수준으로 발현될 수 있다. 발현 및 정제시, SUMO 분자는 독성 단백질로부터 절단됨으로써 그 독성 및/또는 활성을 회복할 수 있다.
넷째, 원핵 세포에서 발현된 각종 융합체는 시험관내 또는 생체내에서 절단되어, 자연에서는 메티오닌으로부터만 단백질 합성을 개시하기 때문에 지금까지 생성이 불가능하였던 신규한 N 말단을 생성할 수 있다. 이 시스템의 이러한 특징은 특정 N 말단이 생리학적 활성 및 생화학적 활성을 유지하는 데 필요한 단백질(예를 들어, RNA-폴리머라제, 프로테아제 및 사이토카인)에 특히 유용하다.
I. 정의
하기 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 것이다.
본원에서 사용될 때 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 임의의 DNA 또는 RNA 분자를 의미하며, 단일 가닥일 경우, 그 상보적 서열의 분자는 선형 또는 원형이다. 핵산 분자를 말할 때, 본원에서는 5'에서 3' 방향으로 서열을 제시하는 일반적 관행에 따라 특정 핵산 분자의 서열 또는 구조를 표현할 수 있다. 본 발명의 핵산과 관련하여, "단리된 핵산"이란 용어가 종종 사용된다. 이 용어는, DNA에 적용될 때, 이것이 유래된 유기체의 천연 게놈에서 바로 인접하고 있는 서열들로부터 분리된 DNA 분자를 의미한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터로 삽입되거나 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA로 통합된 DNA 분자를 포함할 수 있다.
"단리된 핵산"이란 용어가 RNA에 적용될 경우 이것은 상기에 정의된 것과 같은 단리된 DNA 분자에 의해 코딩되는 RNA 분자를 의미할 수 있다. 대안으로, 상기 용어는 자연 상태에서(즉, 세포 또는 조직에서) 회합되어 있는 다른 핵산으로부터 충분히 분리된 RNA 분자를 의미할 수도 있다. 단리된 핵산(DNA 또는 RNA)은 또한 생물학적 또는 합성 수단에 의해 바로 제조되어 그 제조 과정에 존재하는 다른 성분들로부터 분리된 분자를 나타낼 수 있다.
단일 가닥 핵산, 특히 올리고뉴클레오티드와 관련하여, "특이적으로 하이브리드화하는"이란 표현은 당업계에서 일반적으로 이용되는 소정의 조건하에 그러한 하이브리드화를 허용하도록 충분히 상보성이 있는(때때로 "실질적으로 상보적인"이라고 함) 서열로 된 2개의 단일 가닥 뉴클레오티드 분자 간의 회합을 의미한다. 특히, 이 표현은 본 발명의 단일 가닥 DNA 분자 내에 포함된 실질적으로 상보적인 서열과 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화를 의미하며, 비상보적 서열의 단일 가닥 핵산과 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화는 실질적으로 배제한다. 다양한 상보성을 갖는 단일 가닥 핵산 분자의 특이적 하이브리드화를 가능하게 하는 적절한 조건은 당업계에 잘 알려져 있다.
예를 들어, 특정 서열 상동성을 갖는 핵산 분자 간의 하이브리드화를 달성하는 데 요구되는 엄격도 조건을 계산하기 위한 일반식은 다음과 같다[Sambrook et al., 1989]:
Tm = 81.5℃ + 16.6Log[Na+] + 0.41(% G+C) - 0.63(% 포름아미드) - 600/#bp(이중 가닥)
상기 식에 예시된 바와 같이, [Na+] = [0.368] 및 50% 포름아미드, GC 함량 42% 및 평균 프로브 크기 200 염기를 이용할 때, Tm은 57℃이다. DNA 이중 가닥의 Tm은 상동성이 1%씩 감소할 때마다 1∼1.5℃ 감소한다. 따라서, 서열 동일성이 약 75%를 넘는 표적은 하이브리드화 온도 42℃를 이용할 때 관찰된다. 예를 들어, 하이브리드화는 Sambrook 등의 문헌에 기재된 방법에 따라 5×SSC, 5×덴하르트 시약, 1.0% SDS, 100 ㎍/ml의 변성 및 단편화된 연어 정자 DNA, 0.05% 파이로인산나트륨 및 50% 이하의 포름아미드를 포함하는 하이브리드화 용액을 이용하여 수행할 수 있다. 하이브리드화는 37∼42℃에서 적어도 6시간 동안 수행된다. 하이브리드화 후, 30분마다 용액을 교환하면서, (1) 2×SSC 및 1% SDS에서 실온에서 5분; (2) 2×SSC 및 0.1% SDS에서 실온에서 15분; (3) 1×SSC 및 1% SDS에서 37℃에서 30분∼1시간; (4) 1×SSC 및 1% SDS에서 42∼65℃에서 2시간 동안 필터 세척을 수행한다.
하이브리드화 및 세척의 엄격도는 염 농도 및 용액의 온도에 주로 좌우된다. 일반적으로, 프로브와 그 표적의 어닐링 속도를 최대화하기 위해서는, 하이브리드화를 일반적으로 하이브리드의 계산된 Tm보다 20∼25℃ 낮은 온도 및 염 조건에서 수행한다. 세척 조건은 표적에 대한 프로브의 동일성 정도에 대해 가능한 한 엄격하도록 해야 한다. 일반적으로, 세척 조건은 하이브리드의 Tm보다 약 12∼20℃ 낮게 선택된다. 본 발명의 핵산과 관련해서, 중간 엄격도 하이브리드화는 42℃에서 6×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/ml의 변성된 연어 정자 DNA에서의 하이브리드화 및 55℃에서 15분 동안의 2×SSC 및 0.5% SDS에서의 세척으로서 정의된다. 고엄격도 하이브리드화는 42℃에서 6×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/ml의 변성된 연어 정자 DNA에서의 하이브리드화 및 65℃에서 15분 동안의 1×SSC 및 0.5% SDS에서의 세척으로서 정의된다. 초고엄격도 하이브리드화는 42℃에서 6×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/ml의 변성된 연어 정자 DNA에서의 하이브리드화 및 65℃에서 15분 동안의 0.1×SSC 및 0.5% SDS에서의 세척으로서 정의된다.
본원에서 사용될 때 "프로브"란 용어는, 프로브에 상보적인 서열을 갖는 핵산에 특이적으로 하이브리드화하거나 이것과 어닐링할 수 있는, 정제된 제한 효소 분해에서 자연 발생하거나 합성 제조된 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 분자를 의미한다. 프로브는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 프로브의 정확인 길이는 온도, 프로브 공급원 및 방법의 용도를 비롯한 많은 요인들에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 진단 용도의 경우, 표적 서열의 복잡성에 따라, 올리고뉴클레오티드 프로브는 일반적으로 15∼25개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하지만, 이것은 더 적은 수의 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 본원에서 프로브는 특정 표적 핵산 서열로 된 상이한 가닥들에 상보적이 되도록 선택된다. 이는, 프로브가 소정의 조건 설정하에 그 개개의 표적 가닥과 "특이적으로 하이브리드화"하거나 어닐링할 수 있도록 충분히 상보성이 있어야 한다는 것을 의미한다. 따라서, 프로브 서열이 표적의 정확히 상보적인 서열을 반영할 필요는 없다. 예를 들어, 비상보적 뉴클레오티드 단편이 프로브의 5' 또는 3' 말단에 부착되고, 프로브 서열의 나머지 부분이 표적 가닥에 상보적이어도 좋다. 대안으로, 비상보적 염기 또는 더 긴 서열이 프로브로 산재될 수 있으나, 단, 프로브 서열이 표적 핵산의 서열과 충분한 상보성을 지녀서 그와 함께 특이적으로 어닐링되어야 한다.
본원에서 사용될 때 "프라이머"란 용어는, 적절한 환경하에 놓여질 때, 주형 의존적 핵산 합성의 개시인자로서 기능적으로 작용할 수 있는, 생물학적 시스템으로부터 유래되거나 제한 효소 절단에 의해 생성되거나 합성에 의해 제조된 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 적절한 핵산 주형, 핵산의 적절한 뉴클레오시드 트리포스페이트 전구체, 폴리머라제 효소, 적절한 보조인자, 및 적절한 온도 및 pH와 같은 조건이 제공될 때, 폴리머라제의 작용 또는 유사한 활성에 의한 뉴클레오티드의 부가에 의해 상기 프라이머는 3' 말단에서 연장되어 프라이머 연장 생성물을 생성할 수 있다. 상기 프라이머는 특정 조건 및 적용 요건에 따라 그 길이가 다양해도 좋다. 예를 들어, 진단 용도에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반적으로 그 길이가 15∼25개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이다. 상기 프라이머는 원하는 연장 생성물의 합성을 촉발할 수 있도록, 즉, 폴리머라제 또는 유사한 효소에 의한 합성의 개시에 사용하기 위한 적절한 병치로 프라이머의 3' 하이드록실 부분을 제공하기에 충분한 방식으로 원하는 주형 가닥과 어닐링할 수 있도록, 원하는 주형에 충분한 상보성을 지녀야 한다. 프라이머 서열이 원하는 주형의 정확한 상보 서열이 되어야 할 필요는 없다. 예를 들어, 비상보적 뉴클레오티드 서열이 다른 상보적 프라이머의 5' 말단에 부착되어도 좋다. 대안으로, 비상보적 염기가 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 내에 산재될 수 있으며, 단, 프라이머 서열은 연장 생성물의 합성을 위한 주형-프라이머 복합체를 기능적으로 제공하도록 원하는 주형 가닥의 서열과 충분한 상보성을 지녀야 한다.
"상보적 DNA(cDNA)"란 역전사 효소에 의해 mRNA로부터 형성될 수 있는 단일 가닥 DNA 분자이다. 일반적으로, mRNA의 일부에 상보적인 프라이머가 역전사 효소의 개시에 이용된다. "cDNA"란 용어는 또한 그러한 단일 가닥 DNA 분자 및 이의 상보적 DNA 가닥으로 구성된 군에서 선택되는 이중 가닥 DNA 분자를 의미할 수 있다. "cDNA"란 용어는 RNA 주형으로부터 합성된 cDNA 분자의 클론을 의미할 수도 있다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 대해서는 미국 특허 제4,683,195호, 제4,800,195호 및 제4,965,188호에 기재되어 있으며, 이들 특허 문헌의 전체 개시내용은 본원에 참고로 인용된다.
특정 핵산 서열을 언급할 때 "유사성(%)", "동일성(%)" 및 "상동성(%)"이란 용어는 위스콘신 대학의 GCG 소프트웨어 프로그램에 기재된 바와 같이 이용된다.
본원에서 사용될 때 "기능성"이란 표현은 핵산 또는 아미노산 서열이 인용된 분석 또는 목적에 대해 기능성이라는 것을 의미한다.
특정 핵산 서열의 "천연 대립유전자 변이체", "돌연변이체" 및 "유도체"는 특정 서열과 밀접하게 관련되어 있으나 자연적으로 또는 디자인에 의해 서열 또는 구조에 있어서의 변화를 보유할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. "밀접하게 관련된"이란, 서열의 뉴클레오티드의 약 75% 이상, 종종 90% 이상이 특정 서열 번호를 이용하여 언급된 핵산 서열의 일정한 길이에 걸쳐 일치한다는 것을 의미한다. 밀접하게 관련된 핵산 서열 간의 뉴클레오티드 서열의 변화 또는 차이는 자연적으로 특정 핵산 서열의 정상적인 복제 과정에서 발생하는 서열에 있어서의 뉴클레오티드 변화를 나타낼 수 있다. 다른 변화도 특이적으로 디자인하여 특정 목적을 위해 서열에 도입하여, 예컨대, 핵산의 조절 영역의 아미노산 코돈 또는 서열을 변화시킬 수 있다. 이러한 특이적 변화는, 다양한 돌연변이 유발 기법을 이용하여 시험관내에서 만들거나, 변화를 유도하거나 변화를 위해 선택되는 특정 선별 조건하에 놓여진 숙주 유기체에서 생성할 수 있다. 특이적으로 생성된 이러한 서열 변이체는 원래 서열의 "돌연변이체" 또는 "유도체"로서 언급될 수 있다.
특정 뉴클레오티드 또는 아미노산을 언급할 때 "필수적으로 구성되는"이란 어구는 특정 서열 번호의 특성을 갖는 서열을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열과 관련하여 사용될 때, 이 어구는 서열 그 자체 및 서열의 기본적이고 신규한 특성에 영향을 주지 않는 분자 변형을 포함한다.
본원에서 사용될 때 "프로모터"란 용어는 재조합 생성물을 코딩하는 DNA 서열에 인접하여 위치하는 DNA 서열을 의미할 수 있다. 프로모터는 바람직하게는 인접한 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는, 일반적으로, 프로모터가 존재하지 않을 때의 재조합 생성물 발현량과 비교하여 DNA 서열로부터 발현된 재조합 생성물의 양을 증가시킨다. 한 유기체로부터의 프로모터는 다른 유기체로부터 유래된 DNA서열로부터의 재조합 생성물 발현을 증대시키는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 척추동물 프로모터는 척추동물에서의 해파리 GFP의 발현을 위해 이용될 수 있다. 또한, 한 프로모터 요소가 직렬로 연결된 복수의 DNA 서열에 대해 발현된 재조합 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 따라서, 한 프로모터 요소가 1종 이상의 재조합 생성물의 발현을 증대시킬 수 있다. 복수의 프로모터 요소가 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에서 사용될 때 "인핸서"란 용어는 재조합 생성물을 코딩하는 DNA 서열에 인접하여 위치하는 DNA 서열을 의미할 수 있다. 인핸서 요소는 일반적으로 프로모터 요소의 상류에 위치하거나, 코딩 DNA 서열(예를 들어, 재조합 생성물로 전사 또는 번역되는 DNA 서열) 하류 또는 내부에 위치할 수 있다. 따라서, 인핸서 요소는 재조합 생성물을 코딩하는 DNA 서열의 상류 또는 하류쪽으로 100 염기쌍, 200 염기쌍, 또는 300 염기쌍 또는 그 이상의 위치에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 DNA 서열로부터 발현된 재조합 생성물의 양을 프로모터 요소에 의해 제공되는 발현 증가량보다 더 많이 증가시킬 수 있다. 당업자는 복수의 인핸서 요소를 용이하게 입수할 수 있다.
본원에서 사용될 때 "형질감염된" 및 "형질감염"이란 표현은 이종성 DNA를 세포로 전달하는 방법을 말한다. 이러한 방법은, 숙주 세포 외막 또는 외벽이 관심있는 핵산 분자에 투과성이 되도록, 세포를 고농도의 염, 전기장, 리포솜, 다양이온성 미셀, 또는 계면활성제로 처리하는 것과 같은 다양한 기법을 포함한다. 이러한 명시된 방법은 비한정적인 것이며, 본 발명은 당업자에게 잘 알려져 있는 임의의 형질전환 기법에 관한 것이다.
"레플리콘"은 대부분 그 자신의 제어하에 복제할 수 있는 임의의 유전 요소, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 박미드(bacmid), 파지 또는 바이러스이다. 레플리콘은 RNA 또는 DNA일 수 있으며 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
"벡터"는 다른 유전자 서열 또는 요소(DNA 또는 RNA)가 부착되어 부착된 서열 또는 요소의 복제를 유발할 수 있는 플라스미드, 코스미드, 박미드, 파지 또는 바이러스와 같은 레플리콘이다.
"발현 오페론"이란 전사 및 번역 제어 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(예를 들어, ATG 또는 AUG 코돈), 폴리아데닐화 신호, 종결 서열 등을 보유할 수 있고 숙주 세포 또는 유기체에서 폴리펩티드 코딩 서열의 발현을 촉진하는 핵산 분절을 의미한다.
본원에서 사용될 때 "올리고뉴클레오티드"란 용어는 본 발명의 서열 , 프라이머 및 프로브를 말하며, 2개 또는 그 이상, 바람직하게는 3개보다 많은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드로 이루어진 핵산 분자로서 정의된다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 크기는 다양한 요인과 특정 용도와 올리고뉴클레오티드의 용도에 따라 달라진다.
"실질적으로 순수한"이란 표현은 특정 물질(예를 들어, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질 등)을 적어도 50∼60 중량%를 포함하는 제제를 의미한다. 더 바람직하게는, 상기 제제는 특정 물질을 75 중량% 이상, 가장 바람직하게는 90∼95 중량% 포함한다. 순도는 특정 화합물에 적합한 방법(예를 들어, 크로마토그래피법, 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 등)으로 측정한다.
"유전자"란 용어는 엑손 및 (경우에 따라) 인트론 서열을 비롯하여 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산 서열을 말한다. 상기 핵산은 또한 프로모터 또는 인핸서 서열과 같은 비코딩 서열을 경우에 따라 포함할 수 있다. "인트론"이란 용어는 단백질로 번역되지 않고 일반적으로 엑손 사이에 존재하는 소정의 유전자의 DNA 서열을 가르킬 수 있다.
본원에서 사용될 때, "작동 가능하게 연결된"이란 어구는 다른 핵산 서열과의 기능적 관계로 위치하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 작동 가능하게 연결될 수 있는 핵산 서열의 예는 프로모터, 절단 부위, 정제 태그, 전사 종결 서열, 인핸서 또는 활성화 인자, 및 전사되고 적절하게 번역될 경우 단백질, 리보자임 또는 RNA 분자와 같은 기능성 생성물을 생성하는 이종성 유전자를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. "작동 가능하게 연결된"이란 어구는 또한, 예를 들어, 단백질 형태의 Ubl의 카복시 말단 도메인의 촉매 절단 활성이 관심있는 단백질의 방출을 유도하도록, Ubl의 카복시 말단을 코딩하는 핵산과 기능적 관계로 위치하는 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 의미할 수 있다.
"고체 지지체"란 어구는 임의의 칩(예를 들어, 실리카에 기초한 칩, 유리 칩 또는 금 칩), 유리 슬라이드, 멤브레인, 비드, 고체 입자(예를 들어, 아가로스, 세파로스, 폴리스티렌 또는 자성 비드), 컬럼(또는 컬럼 재료), 테스트 튜브 또는 미량적정 디쉬를 비롯한 임의의 고체 표면을 의미하나 이들에 한정되지 않는다.
"친화성 태그", "정제 태그" 및 "에피토프 태그"란 어구는 모두 관심있는 단백질을 정제하는 데 이용될 수 있는 태그를 의미할 수 있다. 정제/친화성/에피토프 태그는 모두 당업계에 잘 알려져 있으며(예를 들어, 문헌[Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory] 참조), 폴리히스티딘 태그(예를 들어, 6xHis), 폴리아르기닌 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, 인플루엔자 바이러스 HA 태그, 티오레독신, 스타필로코커스 단백질 A 태그, FLAG™ 에피토프, AviTag 에피토프(후속 바이오틴화를 위한 것), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 항체 에피토프(예를 들어, 항체에 의해 인식되고 결합되는 아미노산 서열), c-myc 에피토프 및 헴(heme) 결합 펩티드를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 사용될 때, "독성 단백질"이란 용어는 숙주 세포에서 발현될 때 세포 사멸을 초래하거나 세포 증식을 억제하는 단백질을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "설명 자료"는 본 발명의 방법을 수행함에 있어서 본 발명 조성물의 유용성을 전달하는 데 사용될 수 있는 간행물, 기록물, 다이아그램, 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명 키트의 설명 자료는, 예를 들어 본 발명 키트를 포함하는 용기와 함께 수송되도록 본 발명 키트를 포함하는 용기에 부착될 수 있다. 대안으로, 설명 자료는 설명 자료와 키트를 사용자가 조합하여 사용하게 할 목적으로 용기와 별도로 수송할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "변형된", "조작된", 또는 "돌연변이체"란 표현들은 변경된 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 말한다. 일 실시형태에서, SUMO 또는 SUMO 프로테아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써, 특히 부위 지정 돌연변이 유발에 의해, 변형/조작/돌연변이시킨다. 또한, 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 또한 무작위 돌연변이 유발 또는 DNA 셔플링 기법을 이용하여 제작할 수 있다. 특정 실시형태에서, 무작위 돌연변이 유발은 폴리뉴클레오티드의 소정의 영역, 특히 SUMO와 SUMO 프로테아제의 상호작용을 담당하는 아미노산을 코딩하는 것으로 생각되는 영역(들)에 한정된다. 일반적인 돌연변이 유발 기법은 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al. eds., John Wiley (2006)] 및 미국 특허 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 및 제5,837,458호에 기재되어 있다. 본원에서 사용될 때, "돌연변이" 또는 "변경"이란 천연 또는 정상 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 비해 유전자의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 있어서의 변화를 말한다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환으로부터 발생할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 돌연변이는 치환(즉, 하나 이상의 뉴클레오티드(들) 또는 아미노산을 다른 뉴클레오티드(들) 또는 아미노산 잔기(들)로 대체함)이다.
본원에서 사용될 때, "도메인"이란 용어는 단백질 또는 폴리펩티드의 기능성 부분, 분절 또는 영역을 의미한다. "상호작용 도메인"은 구체적으로 단백질, 폴리펩티드 또는 단백질 단편의, 다른 단백질, 단백질 단편 또는 단리된 도메인에 대한 상기 단백질, 단백질 단편 또는 단리된 도메인의 물리적 친화성에 관여하는 부분, 분절 또는 영역을 의미한다. 상호작용 도메인은 단백질의 1차 서열에서 연속된 아미노산 잔기일 수 있거나 또는 1차 서열에서 서로 가까이 있지는 않지만 폴리펩티드쇄의 3차 폴딩에 의해 서로 가까워지는 폴리펩티드쇄의 일부로부터의 아미노산 잔기로 이루어질 수 있다.
본원에서 사용될 때, "다중 클로닝 부위" 또는 "폴리링커"는 핵산 단편을 벡터와 같은 다른 핵산으로 클로닝할 목적으로 하나 이상의 제한 부위를 포함하는 인공적으로 만들어진 뉴클레오티드 서열을 말한다.
II. 조작된 SUMO 단백질
본 발명은 SUMO 프로테아제(예를 들어, Ulp1)에 의해 절단될 수 없는 SUMO 단백질을 포함한다. SUMO는 임의의 진핵 세포 종으로부터 유래되거나 임의의 SUMO 분자의 돌연변이 변형체일 수 있다. 특정 실시형태에서, SUMO는 효모 또는 인간이다. 효모와는 달리, 척추동물에서는 지금까지 4종의 SUMO 구성원이 밝혀졌다: SUMO-1 및 가장 가까운 동족체 SUMO-2, SUMO-3 및 SUMO-4. 이러한 척추동물 SUMO 단백질은 모두 본 발명에 포함된다. SUMO 단백질의 예는 도 11A∼11C에 제공된다. 인간 SUMO 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 예는 또한 GenBank 수탁 번호 NM_003352.4(SUMO1), NM_001005781.1(SUMO1), NM_001005782.1(SUMO1), NM_006937.3(SUMO2), NM_001 005849.1(SUMO2), NM_006936.2(SUMO3) 및 NM_001002255.1(SUMO4)에 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조작된 SUMO 단백질은 동일한 반응 조건하에(예를 들어, 표준 생체내 절단 분석 또는 진핵 세포에서의 발현) 야생형 SUMO의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 99%, 더욱 더 바람직하게는 100%를 절단하는 SUMO 프로테아제에 의해 10% 미만으로 절단된다. 더 바람직한 실시형태에서, 상기 조작된 SUMO는 5% 미만, 바람직하게는 1% 미만, 더 바람직하게는 0.1% 미만, 더욱 더 바람직하게는 0% 또는 그 이하의 검출 수준으로 절단된다. 이하에 기술하는 바와 같이, 상기 조작된 SUMO 단백질은 조작된 SUMO 프로테아제에 의해 절단될 수 있다.
조작된 SUMO 단백질은 SUMO 프로테아제와 접촉하거나 상호작용하는 하나 이상의 잔기를 변경하거나 변화시킴으로써 생성할 수 있다. 잔기는 20개의 다른 천연 아미노산 중 어느 하나로, 또는 합성 또는 변형된 아미노산(예를 들어, §2422의 MPEP의 표 4 참조)로 변화시킬 수 있다. 이 변화는 보존적 변화 또는 비보존적 변화일 수 있다. 보존적 변화는 한 아미노산을 유사한 특성을 갖는 아미노산으로 대체하는 것이다. 예를 들어, Asp 및 Glu는 둘 다 산성 아미노산이고; Lys, Arg 및 His은 염기성 아미노산이며; Asn, Gln, Ser, Thr 및 Tyr은 비하전 극성 측쇄를 보유하고; Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, Trp 및 Cys은 비극성 측쇄를 보유하며; Ala, Gly 및 Leu은 소형 아미노산이고; Phe, Tyr 및 Trp은 방향족 측쇄를 보유하며; Phe, Tyr, Trp, Val, Ile 및 Thr은 부피가 큰(bulky) 비하전 측쇄를 보유한다. 따라서, Asp를 Glu로 대체하는 것은 보존적 변화로 간주될 수 있으나, Asp를 His으로 대체하는 것은 보존적 변화가 아니다.
특정 실시형태에서, SUMO 프로테아제와 상호작용하는 영역 내에 변경이 이루어진다. 도 11에서 알 수 있듯이, SUMO 프로테아제와 상호작용하는 SUMO의 영역은 일반적으로 약 53번 잔기∼약 72번 잔기의 영역 내에 있다. 예를 들어, 효모 SUMO(Smt3)의 경우, 이 영역은 약 63∼72번 잔기의 영역이다. 특정 실시형태에서, 아르기닌 잔기 중 하나 이상, 바람직하게는 아르기닌 잔기 둘 다(또는 존재한다면 그 이상)가 변경된다(예를 들어, Smt3의 경우, SUMO 프로테아제 상호작용 도메인 내의 아르기닌 잔기는 64번 및 71번 위치이다). 바람직한 실시형태에서, 상기 아르기닌 잔기는 비염기성 아미노산으로 변경된다. 특정 실시형태에서, 64번 위치의 아르기닌은 트레오닌으로 변경되고, 71번 위치의 아르기닌은 글루탐산으로 변경된다.
이 구성체는 SUMO*이며, 하기 아미노산 서열(서열 번호 1)을 갖는다:
Figure 112009046701191-pct00001
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조작된 SUMO는 서열 번호 1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성, 특히 적어도 90% 또는 95%의 상동성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 64번 잔기와 71번의 잔기가 둘 다 아르기닌이 아니다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조작된 SUMO는 하기 서열(SUMO 프로테아제 상호작용 도메인):
X1FX2X3X4GX5X6(서열 번호 2)
(여기서, X1 및 X6은 아르기닌 이외의 임의의 아미노산이고, X2, X3, X4 및 X5는 임의의 아미노산이며 야생형(즉, 비돌연변이)일 수 있음)을 포함하도록 변경된 SUMO 단백질(예를 들어, 효모 SUMO(Smt3) 또는 인간 SUMO1)이다. 특정 실시형태에서, X1 및 X6은 임의의 비염기성 아미노산이다. 바람직한 실시형태에서, X2는 L 또는 R이고; X3은 F, W 또는 Y이며; X4는 D 또는 E이고; X5는 I, Q 또는 R이다. 특정 실시형태에서, X1은 글루타민, 트레오닌 및 페닐알라닌으로 구성된 군에서 선택되고/되거나, X6은 71번 위치의 루신 및 글루탐산으로 구성된 군에서 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조작된 SUMO는 하기 서열(SUMO 프로테아제 상호작용 도메인):
X1FX2F(서열 번호 65)
(여기서, X1 및 X2는 아르기닌 이외의 임의의 아미노산임)을 포함하도록 변경된 SUMO 단백질(예를 들어, 인간 SUMO2, SUMO3 및 SUMO4)이다. 특정 실시형태에서, X1 및 X2는 임의의 비염기성 아미노산이다. 특정 실시형태에서, X1은 비하전 측쇄를 보유하는 아미노산, 특히 트레오닌이고, X2는 산성 아미노산, 특히 글루탐산이다.
바람직하게는, 상기 조작된 SUMO 단백질은 야생형 SUMO의 적어도 한 가지 특성을 보유한다. 예를 들어, 상기 조작된 SUMO는 야생형 SUMO만큼 또는 더 많이 융합된 관심있는 단백질의 발현을 증가시키는 것이 바람직하다. 상기 조작된 SUMO는 또한 관심있는 단백질의 분비 및/또는 가용성을 증가시킬 수 있고/있거나, 관심있는 융합 단백질의 세포내 국재화를 변경할 수 있다.
절단 불가능한 SUMO 단백질을 코딩하는 핵산 분자 역시 본 발명에 포함된다. 본 발명의 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 상기 핵산 분자는 임의의 편리한 벡터, 특히 발현 벡터에서 유지시킬 수 있다. 발현에 사용되는 세포에 기초하여 핵산 서열의 발현을 유도하기 위해 다양한 프로모터를 사용할 수 있다. 형질전환된 세포의 선별이 가능하도록 이들 벡터에 항생제 내성 마커를 포함시키기도 한다. 본 발명의 조작된 SUMO 코딩 핵산 분자는 cDNA, DNA, RNA 및 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 그 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 조작된 SUMO 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 대한, 또는 이와 하이브리드화하는, 바람직하게는 야생형 SUMO에 비해 돌연변이 SUMO와 우선적으로 또는 독점적으로 하이브리드화하도록 야생형 서열로부터 돌연변이된 영역(들)에 대한, 프라이머, 올리고뉴클레오티드, 프로브, 안티센스 분자 및 siRNA 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 조작된 SUMO 단백질에 면역 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 조작된 SUMO에 대한 다클론 및 단일클론 항체를 표준 방법에 따라 제조할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 야생형 SUMO와 비교할 때 절단 불가능한 돌연변이 SUMO의 변경된 영역과 면역 특이적으로 반응한다. 절단 불가능한 돌연변이 SUMO 단백질과 면역 특이적으로 상호작용하는 다클론 또는 단일클론 항체를 그러한 단백질을 확인하고 정제하는 데 사용할 수 있다. 상기 항체는 야생형 SUMO를 제외하고 조작된 SUMO에 면역학적으로 특이적이거나 둘 다에 교차 반응성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 조작된 SUMO 단백질은 또한 번역 후 변형될 수 있다. 조작된 SUMO 단백질은 세포내에서 또는 시험관내에서 번역 후 변형될 수 있다. 아미노산의 번역 후 변형(PTM)은 단백질의 구조, 활성, 기능 및 안정성을 변경할 수 있다. PTM은 일반적으로 단백질의 아미노산에 아세테이트, 포스페이트, 지질 및 탄수화물을 포함하나 이에 한정되지 않는 생화학적 작용기의 부가를 포함한다. 단백질이 어떻게 번역 후 변형되는지는 단백질의 아미노산 서열을 변경하는 것에 의해 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr을 포함하도록 단백질의 아미노산 서열을 변경하면 아스파라긴이 글리코실화될 수 있다.
PTM은 아세틸화(일반적으로 단백질의 N 말단에의 아세틸기의 부가), 알킬화[알킬기(예를 들어, 메틸, 에틸)의 부가], 메틸화(일반적으로 라이신 또는 아르기닌 잔기에의 메틸기의 부가), 바이오틴화(바이오틴 부가물에 의한 보존된 라이신 잔기의 아실화), 글루타밀화(튜불린 또는 다른 단백질에의 글루탐산 잔기의 공유 결합), 글리실화(튜불린 C 말단 테일에의 하나 이상의 글리신 잔기의 공유 결합), 글리코실화(아스파라긴, 하이드록시라이신, 세린 또는 트레오닌에의 글리코실기의 부가로 인한 당단백질의 생성), 이소프레닐화[이소프레노이드기(예를 들어, 파르네솔 및 제라닐제라니올)의 부가], 지질화(지질의 부가), 리포일화(리포에이트 작용기의 부착), 포스포판테테이닐화(지방산, 폴리케타이드, 비리보솜 펩티드 및 루신 생합성에서와 같이, 조효소 A로부터의 4'-포스포판테테이닐 부분의 부가), 인산화(일반적으로 세린, 타이로신, 트레오닌 또는 히스티딘에의 포스페이트기의 부가), 황산화(타이로신에의 설페이트기의 부가), 셀렌화 및 C 말단 아미드화를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 번역 후 변형은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Creighton, T.E., Proteins - Structure and Molecular Properties. 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York, 1993]; 문헌[Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, Academic Press, New York. 1983]; 문헌[Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors" (1990) Meth. Enymol., 182:626-646]; 및 문헌[Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging" (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci, 663: 48-62] 참조).
본 발명의 조작된 SUMO 단백질은 하나 이상의 친화성 태그를, 바람직하게는 아미노 말단에 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 친화성 태그는 헴 결합 펩티드이다. 전체 길이 사이토크롬 C(CYC7, GenBank 수탁 번호 AAA34940)는 헴 보조 인자가 이것에 부착될 때 퍼옥시다제 활성을 갖는다[Sander C. Translocation and maturation of c-type cytochromes. Ph.D. Theses. 2001. University of Osnabrueck, Germany]. CYC7과 같은 사이토크롬 C의 헴 결합 모티프를 포함하는 펩티드가 본 발명의 조작된 SUMO 단백질 또는 임의의 관심있는 단백질의 친화성 태그로서 사용될 수 있다. 대표적인 헴 결합 펩티드는 헴 결합 모티프 CQQCH(서열 번호 63)를 포함한다. 헴 결합 펩티드의 구체적인 예는 GSAKKGATLFKTRCQQCH(서열 번호 64)이다. 헴 결합 펩티드는 약 5개∼약 50개 아미노산의 길이, 바람직하게는 약 5개∼약 25개 아미노산의 길이, 더 바람직하게는 약 5개∼약 20개 아미노산의 길이, 더 바람직하게는 약 5개∼약 15개 아미노산의 길이일 수 있다. 헴 결합 펩티드는 퍼옥시다제 활성을 갖는다. 특히, 이러한 활성은 펩티드에 대해 변성 SDS-PAGE 분석을 실시하고 펩티드를 멤브레인에 블로팅하여도 파괴되지 않는다. 따라서, 상기 친화성 태그에 의하면 퍼옥시다제 기질만을 사용해서 항체없이 검출이 가능하다. 또한, 상기 헴 결합 펩티드는 공유 결합된 관심있는 단백질이 적색으로 보이게 하여 검출을 용이하고 하고 정제 과정에서 추적이 가능하게 한다. 상기 헴 결합 펩티드는 사이토크롬 리아제(CYC3, 예를 들어, GenBank 수탁 번호 AAC04992.1)에 매우 높은 결합 친화력을 갖는다. CYC3를 고체 표면에 고정화하여 헴 결합 펩티드를 포함하는 단백질을 정제하기 위한 친화성 수지로서 사용할 수 있다.
III. 조작된 SUMO 프로테아제
본 발명은 또한, 야생형 SUMO 프로테아제에 의해 절단이 불가능한, 조작된 SUMO 단백질을 절단할 수 있는 조작된 SUMO 프로테아제를 포함한다. 상기 SUMO 프로테아제는 임의의 진핵 세포 종으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 SUMO 프로테아제는 절단하고자 하는 조작된 SUMO와 동일한 종으로부터 유래된다. SUMO 프로테아제의 예로는 ULP1 및 SENP1∼5를 포함하며, 특정 아미노산 서열이 도 12A∼12B에 도시되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조작된 SUMO 프로테아제는 조작된 SUMO를 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%, 90%, 또는 95%, 더 바람직하게는 적어도 99%, 더욱 더 바람직하게는 100% 절단할 수 있다.
조작된 SUMO 프로테아제는 야생형 SUMO 또는 조작된 SUMO와 접촉하거나 상호작용하는 하나 이상의 잔기를 변경 또는 변화시켜 생성할 수 있다. 상기 잔기는 다른 20종의 천연 아미노산 중 임의의 것, 또는 합성 또는 변형된 아미노산으로 변화될 수 있다. 이러한 변화는 보존적 또는 비보존적일 수 있다.
특정 실시형태에서, SUMO 프로테아제의 SUMO 상호작용 도메인 내에 변경이 이루어진다(예를 들어, 도 12 참조). 예를 들어, 효모 ULP1의 SUMO 상호작용 도메인은 약 446∼460번 잔기, 더 바람직하게는 약 451∼455번 잔기에 해당한다. 특정 실시형태에서, 451번, 452번 및 455번 잔기 중 적어도 하나가 변경된다. 바람직하게는, 적어도 451번 및 455번 잔기가 변경되며, 더 바람직하게는, 3개의 아미노산이 모두 변경된다. 특히, 451번 위치의 아스파르트산이 세린으로 변경되고, 452번 위치의 트레오닌 잔기가 글리신으로 변경되며, 455번 위치의 글루탐산 잔기가 세린으로 변경된다. 이 구성체는 하기 아미노산 서열(서열 번호 3)을 갖는다:
Figure 112009046701191-pct00002
특정 실시형태에서, 상기 SUMO 프로테아제는 아미노 말단(예를 들어, 402번 잔기를 포함하여 402번 잔기까지)의 결실 또는 아미노 말단 내의 결실을 가질 수 있다. 절두된 SUMO 프로테아제의 예시적인 아미노산 서열은 하기 서열(서열 번호 4)이다:
Figure 112009046701191-pct00003
SUMO* 프로테아제 1은 6x 히스티딘 태그를 갖는 절두된 SUMO 프로테아제로서, 하기 아미노산 서열(서열 번호 5)을 갖는다:
Figure 112009046701191-pct00004
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조작된 SUMO 프로테아제는 서열 번호 3, 4 또는 5와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 상동성, 특히 적어도 90% 또는 95%의 상동성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 451번 위치의 잔기는 아스파르트산이 아니고, 더 바람직하게는 산성 아미노산이 아니며; 455번 위치의 잔기는 글루탐산이 아니고, 더 바람직하게는 산성 아미노산이 아니며; 경우에 따라, 452번 위치의 잔기는 트레오닌이 아니다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조작된 SUMO 프로테아제는 하기 서열:
WLNX1X2X3X4X5(서열 번호 6)
[여기서, X1 및 X5는 임의의 비산성 아미노산이고, X2, X3 및 X4는 임의의 아미노산이며 야생형(즉, 비돌연변이형)일 수 있음]을 포함하도록 조작된 SUMO 프로테아제이다. 특정 실시형태에서, X1은 비하전 극성 측쇄 아미노산, 비극성 측쇄 아미노산 또는 소형 아미노산이다. X5는 비하전 극성 측쇄 아미노산, 비극성 측쇄 아미노산 또는 소형 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, X3은 I 또는 V이고; X4는 I 또는 T이다. 특정 실시형태에서, X1은 세린이고; X2는 글리신 및 트레오닌으로 구성된 군에서 선택되고/되거나; X5는 세린, 알라닌 및 메티오닌으로 구성된 군에서 선택된다.
조작된 SUMO 프로테아제를 코딩하는 핵산 분자 역시 본 발명에 포함된다. 본 발명의 조작된 SUMO 프로테아제를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 상기 핵산 분자는 임의의 편리한 벡터, 특히 발현 벡터에서 유지시킬 수 있다. 발현에 사용되는 세포에 기초하여 핵산 서열의 발현을 유도하기 위해 다양한 프로모터를 사용할 수 있다. 형질전환된 세포의 선별이 가능하도록 이들 벡터에 항생제 내성 마커를 포함시키기도 한다. 본 발명의 조작된 SUMO 코딩 핵산 분자는 cDNA, DNA, RNA 및 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 그 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 조작된 SUMO 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 대한, 또는 이와 하이브리드화하는, 바람직하게는 핵산 분자가 야생형 SUMO 프로테아제에 비해 돌연변이 SUMO 프로테아제와 우선적으로 또는 독점적으로 하이브리드화하도록 야생형 서열로부터 돌연변이된 영역(들)에 대한, 프라이머, 올리고뉴클레오티드, 프로브, 안티센스 분자 및 siRNA 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 조작된 SUMO 프로테아제에 면역 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 조작된 SUMO 프로테아제에 대한 다클론 및 단일클론 항체를 표준 방법에 따라 제조할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 야생형 SUMO 프로테아제와 비교할 때 조작된 SUMO 프로테아제의 변경된 영역과 면역 특이적으로 반응한다. 조작된 SUMO 프로테아제와 면역 특이적으로 상호작용하는 다클론 또는 단일클론 항체를 그러한 단백질을 확인하고 정제하는 데 사용할 수 있다. 상기 항체는 야생형 SUMO 프로테아제를 제외하고 조작된 SUMO 프로테아제에 면역학적으로 특이적이거나 둘 다에 교차 반응성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 조작된 SUMO 프로테아제는 또한 전술한 바와 같이 번역 후 변형될 수 있다. 상기 조작된 SUMO 프로테아제는 세포내 또는 시험관내에서 번역 후 변형될 수 있다.
본 발명의 조작된 SUMO 프로테아제는 바람직하게는 아미노 말단에 하나 이상의 친화성 태그를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 친화성 태그는 전술한 것과 같은 헴 결합 펩티드이다.
IV. 사용 방법
본 발명의 융합 단백질 기법은 단백질 및 펩티드의 제조 및 정제에 있어서 여러 가지 용도를 갖는다. 이 기법을 이용하는 예시적인 방법으로는 하기를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다:
(1) 조작된 SUMO 단백질에 대한 C 말단 융합체로서, 단백질 및 펩티드(관심있는 단백질), 특히 발현량이 불충분한 단백질 및 펩티드의 발현을 증대시키는 것. 조작된 SUMO 프로테아제 역시 세포로 형질전환되지 않는다면, 상기 SUMO-융합 단백질 구조는 원핵 세포(예를 들어, 이. 콜라이; 도 2 참조) 또는 진핵 세포(효모 및 곤충 세포; 도 3 참조)에서 발현 중에 절단되지 않는다. 예시적인 관심있는 단백질로는 다량체 단백질, 사이토카인, 백신, 효소, 성장 인자, 수용체, 인터페론, 조혈제, 알부민, 인슐린 및 호르몬을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
(2) 상기 조작된 SUMO 단백질을 친화성 태그와 융합시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 친화성 태그는 조작된 SUMO의 아미노 말단에 배치되고, 관심있는 단백질은 조작된 SUMO 단백질의 카복시 말단에 부가된다. 이 친화성 태그로 인해 융합 단백질의 정제가 가능하고, 본 발명의 조작된 SUMO 프로테아제에 의한 조작된 SUMO의 절단을 통해 관심있는 단백질을 얻을 수 있다.
(3) 상기 조작된 SUMO를 관심있는 단백질을 정제하는 데, 즉, 친화성 태그없이, 사용할 수 있다. 상기 조작된 SUMO는 관심있는 단백질의 N 말단에 연결할 수 있다. 이 융합 단백질을 발현시켜, 조작된 SUMO에 특이적으로 결합하는 제제, 예컨대 면역 특이적 항체로 정제할 수 있다. 그 후, 상기 관심있는 단백질을 본 발명의 조작된 SUMO 프로테아제에 의해 융합 단백질로부터 절단할 수 있다.
(4) 상기 조작된 SUMO 프로테아제를 시험관내에서 조작된 SUMO를 포함하는 융합 단백질을 절단하는 데 사용할 수 있다. 절단은, 예를 들어, 융합 단백질이, 존재한다면, SUMO 또는 친화성 태그와의 상호작용을 통해 고체 지지체에 결합될 경우, 용액 중에서 발생할 수 있다.
(5) 상기 조작된 SUMO 및 SUMO 프로테아제는, 친화성 태그 역시 포함할 수 있는 조작된 SUMO 함유 융합 단백질의 절단 후 혼합물로부터, 조작된 SUMO 및/또는 SUMO 프로테아제에 특이적으로 결합하는 제제, 예컨대 면역 특이적 항체를 포함하는 고체 지지체와 상기 반응 혼합물을 접촉시킴으로써 회수할 수 있다.
(6) 친화성 태그가 부착된 조작된 SUMO 및 친화성 태그가 부착된 조작된 SUMO 프로테아제는 친화성 리간드를 포함하는 고체 지지체와 반응 혼합물을 접촉시킴으로써 절단 후 혼합물로부터 회수할 수 있다(예를 들어 헥사히스티딘 태그가 부착된 조작된 SUMO 또는 SUMO 프로테아제는 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피를 이용하여 회수할 수 있다).
(7) 본 발명에 의하면 아미노 말단에 임의의 아미노산을 갖도록 관심있는 단백질을 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 조작된 SUMO의 카복시 말단에 연결된 관심있는 단백질을 갖는 융합 단백질을 생성할 수 있다. 관심있는 단백질의 아미노 말단 잔기를 코딩하는 코돈을, 원하는 아미노산을 코딩하도록 또는 돌연변이된 코돈에 의해 코딩되는 아미노산을 하나 이상 포함하는 라이브러리를 생성하도록, 지정 돌연변이 유발에 의해 변경할 수 있다. 상기 돌연변이 유발은 조작된 SUMO에 연결하기 전 또는 후에 수행할 수 있다. 그 후, 경우에 따라 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질이 발현되어 이 융합 단백질로부터 조작된 SUMO가 절단됨으로써 변경된 아미노 말단을 갖는 관심있는 단백질이 방출된 후, 조작된 SUMO 프로테아제를 생체내 또는 시험관내에서 사용할 수 있다.
(8) 조작된 SUMO를 포함하는 융합 단백질을 원핵 세포 및/또는 진핵 세포에서 발현시켜 펩티드 라이브러리를 생성할 수 있다.
(9) 관심있는 단백질에 연결된 조작된 SUMO와, 경우에 따라 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질을 원핵 세포 및/또는 진핵 세포에서 발현시켜 펩티드 라이브러리를 생성할 수 있다. 그 후, 발현된 단백질 라이브러리를 조작된 SUMO 또는 친화성 태그를 통해 정제할 수 있다. 경우에 따라, 상기 조작된 SUMO 및 존재할 경우 친화성 태그는 조작된 SUMO 프로테아제에 의해 융합 단백질로부터 절단됨으로써, 절단된 태그로부터 라이브러리를 단리하는 것에 의해 순수한 단백질 또는 펩티드를 생성할 수 있다.
(10) 조작된 SUMO 및 경우에 따라 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질의 cDNA 라이브러리를 생성할 수 있다. 이러한 cDNA 라이브러리는 임의의 숙주에서 융합 단백질을 발현시키는 데 사용할 수 있다.
(11) 조작된 SUMO 및 경우에 따라 친화성 태그를 포함하는 발현된 융합 단백질을 또한 고체 지지체 상에 고정화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 융합 단백질은 관심있는 단백질의 라이브러리를 포함하며 고체 지지체 상에 어레이로 배열된다. 상기 융합 단백질은 SUMO 태그 또는 친화성 태그를 통해 고체 지지체 상에 고정화될 수 있다. 생성된 어레이는, 예를 들어 고정화된 관심있는 단백질과의 단백질 상호작용을 검출 및/또는 정량하는 데 사용될 수 있다.
V. 키트
본 발명은 또한 관심있는 단백질의 발현, 분비, 정제, 국재화(위치 지정) 및 관심있는 단백질의 아미노 말단의 변경을 증대시키는 데 사용하기 위한 키트를 포함한다. 이러한 키트는, 원하는 숙주 세포에서의 발현에 적합한 프로모터 및 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산 서열과 인프레임으로 관심있는 단백질을 클로닝하는 데 적합한 다중 클로닝 부위에 작동 가능하게 연결된, 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 벡터를 포함한다. 상기 프로모터는 바람직하게는 강력한 프로모터이며, 항상성 프로모터 또는 조절성 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있으며, CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터, ADH1 프로모터, T7 프로모터 및 CUP1 프로모터를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
상기 재조합 벡터는 또한 조작된 SUMO를 코딩하는 서열과 인프레임으로 하나 이상의 친화성 태그를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 친화성 태그를 코딩하는 핵산 서열은 조작된 SUMO를 코딩하는 서열의 5' 말단에 작동 가능하게 연결된다. 또한, 1종 이상의 고체 지지체(예를 들어, 친화성 태그 중 하나 이상에 결합할 수 있는 것), 용해 완충액, 세척 완충액 및 용리 완충액을 포함하나 이에 한정되지 않는 시약들을, 발현된 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 키트 내에 포함시킬 수 있다.
상기 키트는 조작된 SUMO를 절단하기 위한 1종 이상의 조작된 SUMO 프로테아제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조작된 SUMO 프로테아제는 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 발현 벡터)로서 및/또는 용액 중의 발현된 단백질로서 제공될 수 있다. 상기 조작된 SUMO 프로테아제는 경우에 따라 조작된 SUMO에 부착된 친화성 태그와 같거나 다른 친화성 태그를 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 1종 이상의 절단 완충액, 숙주 세포 냉동 보존물 및/또는 사용 설명 매뉴얼을 더 포함할 수 있다.
상기 키트는 또한 천연 내지 야생형 단백질의 아미노 말단과는 상이한 아미노 말단을 생성하기 위해 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산을 변경하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 핵산의 변경 방법 역시 당업계에 잘 알려져 있으며, 부위 지정 돌연변이 유발 및 올리고뉴클레오티드에 기초한 부위 지정 돌연변이 유발을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds., 2006, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.] 참조). 대표적인 시약으로는 DNA 폴리머라제, PCR 완충액 및 dNTP 용액을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시형태를 예시하기 위해 제공된 것이다. 이 실시예는 예시를 위한 것으로서 본 발명을 어떠한 식으로든 한정하려는 것이 아니다.
실시예 I
재료 및 방법
동일한 이. 콜라이 세포에서 SMT3-GFP와 ULP1 프로테아제를 동시에 발현시키기 위해, T7-SMT3-GFP 카세트를 프라이머 23(5'- GGCGCTCGAGTCCCGCGAAATTAATACGACTCA-3'; 서열 번호 7) 및 46(5'-CGCAAAGCTTGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3'; 서열 번호 8)를 사용하여 pET24d-Smt3-GFP 벡터로부터 증폭시키고[Malakhov et al. (2004) J. Struct. Funct. Genomics, 5: 75-86], XhoI 및 HindIII로 분해하여 XhoI 및 HindIII로 절단한 pACYC177 벡터(GenBank 수탁 번호 X06402)에 삽입하였다. 이러한 조작은 pACYC 177에서의 Kan 내성 유전자를 SMT3-GFP 발현 카세트로 교체하여 pACYC-SMT3-GFP 벡터를 생성하였다. pACYC-SMT3-GFP를 BL21(DE3) 컴피턴트 세포(competent cell)로 형질전환하였다. pACYC-SMT3-GFP를 보유하는 세포는 암피실린 함유 배지에서 증식하였으며 표준 CaCl2 방법을 이용하여 컴피턴트 세포로 만들었다. 이들 컴피턴트 세포를 유도성 T7 프로모터 하에 ULP1 프로테아제를 보유하는 또 다른 벡터 pET24-ULP1로 공지된 방법에 의해 형질전환시켰다[Malakhov et al. (2004) J. Struct. Funct. Genomics, 5: 75-86]. 암피실린 및 카나마이신을 함유한 LB 배지에서 형질 전환체를 선별하였다. IPTG로 유도하였을 때 ULP1 프로테아제를 동시에 발현하는 세포에서 SMT3-GFP 융합체가 SMT3(20 kD) 및 GFP(28 kD)로 가공되었다. ULP1을 동시 발현하지 않는 세포는 48 kD 크기의 전체 길이 SMT3-GFP 융합체를 생성하였다.
R64 및 R71 위치를 무작위화하기 위해, pACYC-SMT3-GFP를 주형으로 사용하여 2개의 중첩 PCR 생성물을 생성하였다. 1차 PCR은 프라이머 23 및 80(5'-AATACCGTCGTACAAGAANNNTAAGGAGTCCA-3'; 서열 번호 9)으로 행하였고, 2차 PCR은 프라이머 79(5'-TCTTGTACGACGGTATTNNNATTCAAGCTGATCAGA-3'; 서열 번호 10) 및 46으로 행하였다. 2개의 PCR 단편을 겔 단리하고 혼합하여 프라이머 23 및 46을 사용한 2차 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. 얻어진 돌연변이 SUMO-GFP 단편의 라이브러리를 XhoI-HindIII로 분해한 pACYC177 벡터로 클로닝하였다. 결찰 혼합물을 pET24-ULP1 플라스미드를 보유하는 BL21(DE3) 컴피턴트 세포로 형질전환시켰다.
조작된 SUMO의 선별을 위해, 암피실린 및 카나마이신이 보충된 LB 배지에서 형질전환된 콜로니를 OD 0.5까지 배양한 후 1 mM IPTG로 유도하였다. 유도는 20℃에서 12시간 동안 지속하였다. 세포를 수거한 후 동결시켜 -80℃에 보관하였다. 1 mM EDTA 및 1 단위/ml의 라이소자임을 함유하는 10 mM TRIS 완충액(pH 8.0)에 펠릿을 재현탁시켰다. 실온에서 10분 동안 항온처리한 후, 최종 농도가 10 mM이 되도록 MgCl2를 첨가하고 농도가 10 단위/ml가 되도록 DNaseI을 첨가하였다. 10분 동안 항온처리한 후, 염료 1 ㎕를 샘플에 첨가하여 이것을 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 사용하지 않는 12% 네이티브 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다. 겔은 15 V/cm로 1 시간 동안 전개하고 365 nM UV 박스에서 가시화하였다.
도 7에 도시된 β-락타마제 구성체는 하기 방법으로 생성하였다. β-락타마제 유전자는 올리고 쌍 65(5'-CGCGACATATGAGGGTGCTTGTACTAGCTCTTGCTGTGGCTCTCGCAGT-3'; 서열 번호 11)/61(5'-CGCGAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTGAGCCT-3'; 서열 번호 12) 및 66(5'-CGCGCAGGTCTCTAGGTAGGGTGCTTGTACTAGCTCTTGCTGTGGCTCTCGCAGT-3'; 서열 번호 13)/61, 또는 프롤린에서 출발하는 β-락타마제의 경우 67(5'-CGCGCAGGTCTCTAGGTCCTAGGGTGCTTGTACTAGCTCTTGCTGTGGCTCTCGCAGT-3'; 서열 번호 14)/61을 사용하여 2회의 연속된 PCR 반응으로 증폭시켰다. 얻어진 β-락타마제는 β-락타마제 오픈 리딩 프레임(ORF)에 융합된 15개 아미노산 분비 신호를 포함하였다. 돌연변이 SUMO는 올리고 26(5'-TGTACAGAGCTCACGCGTGCATGCTCGGACTCAGAAGTCAATCA-3'; 서열 번호 15) 및 61을 사용하여 증폭시켰다. 얻어진 SUMO 및 β-락타마제 PCR 생성물을 Eco31I 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 서로 결찰시켰다. 이 결찰 생성물을, 올리고 26 및 59(5'-CGCGAGTCGACTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCA-3'; 서열 번호 16)을 사용한 PCR 반응의 주형으로 사용하여 융합 생성물(돌연변이 SUMO)-(분비 신호)-(β-락타마제)를 생성하였다. 불용성 단백질 MMP 13을 돌연변이 SUMO의 N 말단에 부가하기 위해, T7 프로모터와 함께 발현 카세트 내의 MMP13의 ORF를, 올리고 60(5'-GGCGAAGCTTTCCCGCGAAATTAATACGACTCA-3'; 서열 번호 17) 및 35(5'-CGCAGCATGCGGGGTCTTCATCTCCTGGACCA-3'; 서열 번호 18)를 사용하여 p24d-MMP13 벡터 로부터 증폭시켰다. 얻어진 생성물 T7-MMP13을 HindIII 및 SphI으로 분해하여, SphI-SalI으로 분해한 (돌연변이 SUMO)-(분비 신호)-(β-락타마제)와 함께 3개 단편의 결찰로 HindIII-SalI으로 분해된 pACYC184로 클로닝하였다. 이로써 pACYC-mutSUMO-Lac 플라스미드를 얻었다.
아라비노스 유도성 프로모터 P-BAD 하에 ULP1 발현 벡터를 생성하기 위해, pET24d-ULP1 내에 T7 프로모터와 함께 있는 LacI 유전자를 AraC 유전자 및 P-BAD 프로모터로 대체하였다. 구체적으로, pBAD/His/A 벡터(Invitrogen)를 NcoI 및 AccI으로 분해하고, araC 유전자 및 P-BAD 프로모터를 보유하는 단편을 겔 단리하였다. 이 단편을 NcoI-AccI으로 분해된 pET24d-ULP1에 결찰시켜 pARA-6His-ULP 플라스미드를 얻었다.
ULP1을 돌연변이시키기 위해, 상기 유전자의 5' 말단은 올리고 88(5'-GGAATTAACCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGAGGT-3'; 서열 번호 19) 및 91(5'-TTAGCCATCTTCGTGGTGCCAAGGTCT-3'; 서열 번호 20)을 사용하여 증폭시키는 반면, 3' 부분은 올리고 191(5'-AAGACCTTGGCACCACGAAGATGGCTAAATNNNNNNATCATTNNNTTTTTTATGA-3'; 서열 번호 21) 및 89(5'-GTGGTGCTCGAGTCATTTTAAAGCGTCGGTTA-3'; 서열 번호 22), 또는 192(5'-AAGACCTTGGCACCACGAAGATGGCTAAATNNNNNNNNNNNNNNNTTTTTTATGA-3'; 서열 번호 23) 및 89를 사용하여 증폭시켰다. 5' 및 3' 부분을 겔 단리하여, 프라이머 88 및 89를 사용하여 돌연변이된 ULP1(즉, 돌연변이 SUMO 프로테아제)을 증폭시키기 위해 2차 PCR에서 주형으로서 사용하였다. 얻어진 PCR 생성물을 NcoI 및 XhoI으로 분해하여 pARA-6His 벡터로 클로닝하였다.
돌연변이 SUMO 프로테아제의 라이브러리를, pACYC-mutSUMO-Lac 플라스미드를 보유하는 컴피턴트 TOP10 이. 콜라이로 형질전환시켰다. 42℃에서 열 충격을 가한 후, 세포를 37℃의 2xYT 배지에서 1시간 동안 회복시켰다. 그 후, 4배 부피의 LB 배지를 첨가하고, 세포를 37℃에서 2시간 동안 진탕시켰다.세포를 34 mg/L의 클로람페니콜, 50 mg/L의 카나마이신, 50 mg/L의 암피실린 및 0.02%의 아라비노스가 보충된 LB 플레이트에 도말하였다. 비돌연변이 Ulp1 유전자를 보유하는 플라스미드는 암피실린에서의 증식을 지지하지 못한다. 증식한 양성 돌연변이 클론의 서열을 분석하고, 시험관내 절단을 위해 프로테아제 정제에 사용하였다. 돌연변이 SUMO 프로테아제는 표준 Ni-세파로스 방법으로 정제하였고 공지된 방법으로 표준 절단 반응에 사용하였다[Marblestone et al. (2006) Protein Sci., 15: 182-9). (돌연변이 SUMO)-GFP는 절단 반응에서 기질로서 사용하였다.
결과
SUMO 단백질을 융합 단백질로서 관심있는 단백질에 연결할 경우 이 SUMO 단백질은 박테리아 세포와 진핵 세포 둘 다에서 재조합 단백질의 발현 수준과 품질을 크게 증대시킬 수 있다(도 2 및 도 3A 참조; Malakhov et al. (2004) J. Struct. Funct. Genom., 5:75-86). SUMO 단백질 패밀리는 자연적으로 세포내 조절의 일부로서 진핵 세포 단백질로부터 첨가되고 제거된다. SUMO의 구조 및 SUMO 단백질 첨가 및 제거의 과정은 진핵 세포에서 고도로 보존되어 있다. SUMO 단백질에 있어서 고도의 구조적 보존성은 이종 숙주의 내인성 SUMO 변경 효소와 SUMO 융합 태그와의 종 교차 반응성을 초래한다. 따라서, 진핵 세포는 SUMO 태그를 절단할 수 있고, 이 러한 절단은 일반적으로 재조합 단백질로부터의 태그의 분리로 이어진다. 따라서, 진핵 세포로부터 "비절단" 또는 비가공 야생형 SUMO 융합 단백질을 발현 및 정제하는 것이 용이하지가 않다.
원핵 세포에서의 단백질 생산을 증대시키기 위해 "미성숙" 태그의 절단이라는 장애를 극복하기 위해서, 이른바 SUMO*라 불리는 신규한 SUMO 단백질을 내인성 SUMO 프로테아제에 저항성이 되도록 조작하였다. 사카로마이세스 세레비시아 유전자 SMT3를 SUMO 태그 등을 개발하기 위한 유전적 기반으로서 사용하였다.
Smt3 및 이의 상응하는 프로테아제 Ulp1의 결정 구조를 평가한 후(단백질 데이터 뱅크 #1EUV)(도 4), Ulp1과 상호작용하는 것으로 보이는 Smt3 단백질 영역을 돌연변이시켰다(도 5). 첫째, 아미노산 64∼71을 코딩하는 영역을 일반적인 PCR 돌연변이 유발 기법을 이용하여 무작위화하였다. 그 후, 64번 및 71번 위치의 아르기닌(R64 및 R71)은 Ulp1에 바로 접하기 때문에(도 4A 및 4B), 이들 잔기를 PCR 돌연변이 유발에 의해 특이적으로 돌연변이시켰다. 얻어진 SUMO-GFP 돌연변이체를 신규 생체내 절단 분석, 즉 UlP1으로 형질전환시킨 이. 콜라이를 이용하여 스크리닝하였다.
이. 콜라이 생체내에서 ULP1 존재하에 절단을 나타내지 않은 돌연변이는 64 번 위치의 아르기닌 대신에 트레오닌을, 71번 위치의 아르기닌 대신에 글루탐산을 포함한다. 이러한 특정 돌연변이체를 본원에서 SUMO*라 칭한다. 특정 SUMO 돌연변이체를 하기 표 1에 제시한다.
표 1
명칭 R64 및 R71에 대한 변형 ULP1에 의한 절단율(%)
야생형 없음 100%
1A3 R64 → Q 10%
1C1 R64 → L 10%
2E4 R64 → T; R71 → E 0%
2E11 R64 → F; R71 → E 0%
2F4(SUMO*) R64 → T; R71 → E 0%

SUMO의 특정 돌연변이체의 R64 및 R71 위치에서의 아미노산 변화 및 ULP1에 의해 절단될 수 있는 그 능력
도 3A 및 3B에서 알 수 있듯이, SUMO-GFP는 각각 효모 및 곤충 SUMO 프로테아제에 의해 거의 충분히 절단된 반면, SUMO*-GFP는 비절단 상태로 남았다. 또한, SUMO* 융합체는 태그 미부착 GFP에 비해 GFP의 발현을 크게 증대시킨다(레인 1 및 2와 레인 5 및 6 비교).
SUMO*-GFP를 정제하여 시험관내 절단에 적용하였다. SUMO 프로테아제 1(Ulp 1) 및 SUMO 프로테아제 2(SENP2) 둘 다 테스트하였다(도 6). 어느 프로테아제도 SUMO*를 절단하지 못했다(도 6). 실제로, SUMO* 태그가 부착된 융합체를 Ulp1과 SUMO를 완전히 절단하는 데 필요한 효소 농도의 1,000배 과량까지 그 양을 증가시키면서 함께 항온처리하였으나, 절단은 전혀 검출되지 않았다(도 10). 또한, 효모 또는 곤충 세포에서 SUMO*-GFP를 발현시킬 경우, 야생형 Smt3 태그와는 달리 돌연변이된 태그는 어느 유기체에서도 천연 SUMO 프로테아제에 의해 절단되지 않았다(도 3).
융합체-태그를 최적으로 만들기 위해서는, 이것이 후속 정제 단계에서 제거되어서 관심있는 단백질만을 남길 수 있는 능력을 지녀야 한다. SUMO* 태그를 절단하는 프로테아제를 조작하기 위해, 이. 콜라이에서 그 융합 파트너로부터 돌연변이 SUMO를 절단할 수 있는 능력에 대해 하이드롤라제를 스크리닝하였다(도 7). 이 스크리닝은, 암피실린 내성 단백질인 β-락타마제가 세포 내에서 발현될 경우 항생제 암피실린을 함유하는 배지에서 이. 콜라이가 증식할 수 있는 능력에 기초한 것이다. 비융합 β-락타마제만이 암피실린 내성을 부여할 수 있는 것으로 입증되었다. 따라서, SUMO 태그가 β-락타마제에 융합되었다면, 이것은 암피실린 내성을 부여하지 못할 것이다. β-락타마제는 SUMO*의 C 말단에 융합되었고 다양한 하이드롤라제와 동시에 발현되었다. 태그가 절단된 경우에만, β-락타마제가 그 활성형으로 방출되어, 암피실린 내성을 부여함으로써 세포가 생존할 수 있게 한다. 단백질이 프롤린에서 출발한다면, SUMO-단백질 융합체는 Ulp1에 의해 절단되지 않는다는 것이 알려져 있다. 따라서, Smt3 태그 다음의 첫 번째 아미노산이 프롤린인 융합체, 즉 Smt3-pro-BLA 융합 단백질을 스크리닝 구상의 증거로서 작제하였다(도 8).
Ulp1의 구조를 분석하여, SUMO 아미노산 R64 및 R71과 상호작용하는 아미노산 잔기를 결정하여 450번 잔기와 456번 잔기 사이의 영역에 배치시켰다. R64 및 R71과 상호작용할 가능성이 있는 아미노산은 각각 451번 위치의 아스파르트산과 455번 위치의 글루탐산뿐만 아니라 452번 위치의 트레오닌이다(도 4 및 9). Ulp1 내의 이들 3개의 잔기를 PCR 포화 돌연변이 유발 기법을 이용하여 무작위로 돌연변 이시켰다. 돌연변이 유발 후, 생체내 β-락타마제 분석을 이용하여 암피실린 함유 플레이트 상에서 돌연변이체를 선별하였다. 다양한 정도의 절단 효율을 갖는 스크리닝에서 Ulp1 돌연변이체를 확인하였다. 가장 효율적인 돌연변이체 2.2를 선택하여 "SUMO* 프로테아제 1"이라 명명하였다(도 10). 대표적인 돌연변이체를 하기 표 2에 제시하였다.
표 2
명칭 451번∼455번 잔기의 서열
(서열 번호)		 SUMO* 태그의
절단율(%)
야생형 - D T I I E -
(24)		 0%
mut 2.2 (SUMO* 프로테아제) - S G I I S -
(25)		 100%
mut 2.3 - A M I I A -
(26)		 10%
mut 1.38 - S T I I A -
(27)		 75%
mut 1.48 - S T I I M -
(28)		 75%

- 야생형 ULP1 및 특정 돌연변이체에서의 451번과 455번 사이의 아미노산 서열 및 SUMO*를 절단할 수 있는 그 능력
실시예 II
야생형 SUMO와 마찬가지로, 조작된 SUMO는 이종성 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 실제로, 도 3A은 GFP가 이 단백질이 SUMO*에 융합되었을 때 태그 미부착 GFP에 비해 사카로마이세스 세레비시아에서 더 높은 수준으로 발현된다는 것을 입증한다. 또한, 도 13은 곤충 세포에서 SUMO*가 이종성 단백질의 발현을 증대시킨다 는 증거를 제시한다. 구체적으로, 트립타제를 6xHis 태그 또는 SUMO* 태그를 갖는 pFastBac 벡터에 클로닝하였다. 이 융합 단백질을 곤충 sf9 세포에서 발현시켰다. 세포내 단백질의 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔은, 6xHis 태그가 부착된 트립타제에 비해 SUMO*-트립타제의 발현이 증대되었음을 분명히 보여준다. 특히, SUMO*-트립타제 융합체는 곤충 세포에서 절단되지 않는다.
또한, 본 발명의 조작된 SUMO는 야생형 SUMO와 유사하게 이종성 단백질의 분비를 증가시킨다. 도 14는 6xHis 태그를 갖는 그랜자임(Granzyme B; GzmB) 또는 SUMO*에 융합된 GzmB를 발현하는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터의 배지 단백질의 웨스턴 블롯이다. 이 배지를 세포로부터 분리하여 SDS-PAGE를 실시하고 항GzmB 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석하여 SUMO*-GzmB 및 6xHis-GzmB를 가시화하였다. 분명히, SUMO*-GzmB 융합체는 피치아 세포에서 절단되지 않는다.
실시예 III
곤충 발현 벡터는 pFastBac(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 기초한 것으로서, 피치아와 유사하게 두 단계로 제조하였다. 먼저, 6xHis, SUMO 및 SUMO* 융합 태그를 P-polh 프로모터 다음에 클로닝하였다. 그 후, 유비퀴틴 프로테아제인 UBP43[Liu et al. (1999) Mol. Cell. Biol., 19: 3029-3038]을, 융합 태그와 인프레임으로, BsmBI-XbaI으로 미리 분해한 벡터에 삽입하였다. 마우스 UBP43은 BfuAI으로 분해한 프라이머:
#265 (CGCGACCTGCATCGAGGTATGGGCAAGGGGTTTGGGCTCCTGAGG; 서열 번호 29) 및
#266 (CGCGACCTGCATGTCTAGATTAGGATCCAGTCTTCGTGTAAACCAAG; 서열 번호 30)
을 이용하여 증폭시켰다. 박미드는 DH10bac 이. 콜라이 세포에서 생성하였다. 바이러스를 입수하여 적정한 후, sf9 세포를 형질감염시키고 샘플을 72시간 후 단백질 생산에 대해 분석하였다.
포유동물의 경우 발현 pCDNA3.1 벡터를 이용하였다. 마우스 IgG 카파 분비 신호 및 3개의 단백질 태그, 즉 6xHis, 6xHis-SUMO 및 6xHis-SUMO*를 CMV 프로모터 다음의 HindIII - BamHI 부위로 클로닝하였다. 마우스 분비 X 군 PLA2를 프라이머 576(ATCACGTCTCGAGGTGGACTCCTGGAGCTGGCAGGGAC; 서열 번호 31) 및 285(GCATCGTCTCACTAGTCAATTGCACTTGGGAGAGT; 서열 번호 32)를 사용하여 증폭시키고, BsmBI 제한 엔도뉴클레아제로 분해하고, 6xHis 또는 SUMO 또는 SUMO* 융합 태그 다음에 클로닝하였다. JOSD2는 카파 분비 태그없이 세포내에서 발현시켰다. 상기 JOSD2 오픈 리딩 프레임을 DNA 올리고 344(ATGATGGGTCTCAAGGTATGTCCCAGGCCCCGGGAGCA; 서열 번호 33) 및 345(ATGATGGGTCTCTCTAGATCAGTCTGTCCGCAGCCA; 서열 번호 34)를 사용하여 증폭시키고, 6xHis 또는 SUMO* 태그 다음에 pCDNA3.1계 벡터에 클로닝하였다.
각각의 정제된 플라스미드 2.5 ㎍을, 2 ml 배지에 HEK293T 세포를 함유하는 6웰 플레이트의 각각의 웰을 형질감염시키는 데 사용하였다. 48시간 후, 세포와 배 지를 수거하여 웨스턴 블로팅으로 분석하였다.
도 15A 및 15B에서 알 수 있듯이, SUMO* 융합 태그는 융합 파트너 단백질의 발현을 증대시키며, 곤충 및 포유동물 세포에서 절단되지 않는다.
실시예 IV
sPLA2 효소는 인지질의 sn-2 에스테르 결합의 촉매 반응, 즉 가수분해 반응을 특징으로 한다. 가수분해 후, 리소인지질 및 유리 지방산이 생성된다. 이러한 지방산은 신호 전달에서 2차 메신저로서 작용할 수 있는 한편, 리소인지질은 특히 인지질 리모델링을 촉진한다.
PLA2는 1890년에 코브라 독액에서 처음 발견되었다[Six and Dennis (2000) Biochim. Biophys. Acta., 1488:1-19]. 현재, 마우스에서, 아미노산 서열 상동성 및 구조적 유사성에 기초하여 분류된 11종의 상이한 sPLA2 군이 확인되었다. 공지된 11개의 군 중에서, IIC, IIE, III, V 및 X 군을 이들 연구에 사용되었다(문자는 특정 군의 상이한 동족체에 해당함). 8개의 디설파이드 결합을 갖는 IIC 군은 설치류 고환, 뇌 및 췌장에서 발견되나, 인간에서는 발현되지 않는다[Six and Dennis (2000) Biochim. Biophys. Acta., 1488:1-19]. 생체내 염증 반응을 나타내는 IIE 군은 인간(폐 조직) 및 마우스(뇌, 심장 및 간 조직)에서 발견된다. 흥미로운 점은, 봉독으로부터 처음 단리된 III 군이 인간에 있어서 수상 돌기 성숙을 유도하지만, 인간의 병리 내피 세포에서도 많이 발현되고 종양 세포에서 혈관신생을 증가시키는 것으로 생각된다는 것이다[Murakami et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:24987-24998]. 6개의 디설파이드 결합을 갖는 14 kDa 단백질인 V 군 PLA2는 그 구조 내에 독특한 루프를 갖고 있지 않으며 염증 자극이 있을 때 래트 및 인간의 심장에서 발현된다[Six and Dennis (2000) Biochim. Biophys. Acta., 1488:1-19]. 분석된 PLA2 중 마지막 군인 X 군은 123개의 아미노산을 포함하고 I 군, II 군 및 V군에 대해 27∼35%의 서열 동일성을 갖는다. 이것은 인간의 비장, 백혈구, 폐, 폐포 조직 및 흉선과 마우스의 위에서 발견된다. 대부분의 PLA2와 마찬가지로, X 군 PLA2는 염증 자극이 있을 때 존재하고 신호 전달에도 관여한다.
많은 진핵 세포 단백질은 정확한 폴딩 및 활성을 위해 복잡한 번역 및 번역 후 환경을 필요로 한다. 이러한 조건은 이. 콜라이 또는 효모와 같은 유기체에는 존재하지 않아서, 이들 숙주에서 재조합 발현을 시도할 때 부정확한 가공 및/또는 불충분한 수율로 이어질 수 있다. 분비된 포스포리파제 A2는 이. 콜라이에서 생산하기 어려운 단백질류로서, 종종 봉입체로서 발현된다. 또한, 상대적으로 많은 수, 일반적으로 5∼8개의 디설파이드 결합으로 인해, PLA2는 가용화 후 리폴딩이 어렵다. 발현율은 일반적으로 낮고 후속 리폴딩 과정은 종종 불충분한 수율로 귀결된다. 명쾌한 프로토콜로 열의를 다해도, 리폴딩 단백질 활성이 그 본래 형태의 활성과 차이가 있을 수 밖에 없어서, 적절한 특징 분석이 어렵다. 포유동물 세포에서 sPLA2를 발현시키고자 하는 이전의 시도는 일반적으로 발현 수준을 감소시켰다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같이, 이종성 단백질의 발현은, 소형 유비퀴틴 유사 변 경 인자(SUMO) 패밀리의 구성원에의 융합을 통해, 이. 콜라이, 피. 파스토리스 및 배큘로바이러스/곤충 세포 시스템에서 증대시킬 수 있다. 따라서, 이전에 수행하였던 것과 유사한 방법이 포유동물 세포에서 sPLA2, 구체적으로 마우스 PLA2 군의 생산을 증대시킬 수 있다고 가정하였다.
또한, PLA2의 자유 N 말단은 PLA 단백질 패밀리의 생물학적 활성에 필수적이다. 활성 PLA2의 생산은 세포에 유해하고, PLA2의 과대 생산은 세포를 사멸시킨다. PLA2의 N 말단에 조작된 SUMO를 포함하는 융합 단백질은 세포 내에서 절단되지 않아서, 휴지 상태/비활성의 PLA2가 세포내에 축적되거나 배지로(세포외) 분비되게 한다. 그 후, 조작된 SUMO-PLA2 융합체를 정제하고 시험관내에서 조작된 SUMO 프로테아제로 절단하여 활성 PLA2 단백질을 생성할 수 있다. 따라서, 조작된 SUMO 융합체는, 특히 단백질의 독성이 단백질의 N 말단과 관련되어 있을 경우, 활성 독성 단백질을 발현시키는 우수한 수단을 제공한다. 특히, 트립신, 인자 X, 트롬빈 및 그랜자임 B와 같은 다른 단백질은 과발현될 경우 세포에 독성을 나타낼 수 있고 그 활성을 위해 자유 N 말단을 필요로 한다. PLA2와 마찬가지로, 이들 단백질은 조작된 SUMO 융합체로서 쉽게 발현시킬 수 있으며, 그 후, 조작된 SUMO 프로테아제에 의해 SUMO 태그로부터 분리할 수 있다.
재료 및 방법
융합 태그 벡터의 구성
모든 벡터에 대해, 구성체 pcDNA3.1/V5-His(Invitrogen)를 골격으로서 이용하였다. 고충실도 백금 Taq DNA 폴리머라제(Invitrogen)를 모든 PCR 반응에 사용하는 한편, 모든 제한 효소 및 T4 DNA 리가제는 Fermentas(Burlington, Ontario, Canada)로부터 입수하였다. 클로닝은 표준 기법에 따라 수행하였다. 모든 클론들은 서열 분석으로 확인하였다. 먼저, 2개 프라이머(각각 프라이머 1+2 및 3+4; 프라이머 서열에 대해서는 표 3 참조) 사이에 상동성 영역을 갖는 중첩 프라이머를 사용하여 카파 S.S. 및 6xHis 태그를 생성하였다. 카파 S.S와 His 태그를 프라이머 1+4를 사용하여 2차 PCR 반응에서 연결하였다. 카파-6xHis 융합체를 HindIII 및 BamHI 제한 부위를 통해 pcDNA3.1에 삽입하여, pcDNA3.1-카파-6xHis를 생성하였다. 프라이머 3 및 4는, His 태그 다음에 2개의 글리신이 오고 반대쪽 가닥의 BamHI 부위 상류에 Esp3I/BsmBI 제한 부위가 오도록 디자인하였다. Esp3I을 사용하여 분해하자, 비코딩 가닥 상에, 디글리신 ggaggt 코딩 서열로부터 tcca로 구성되는 4 염기 돌출부가 만들어졌다. CTHS, SUMO, SUMOmut 및 hSUMO3은 각각 프라이머 5+6, 7+6, 7+6 및 8+9를 사용하여 증폭시켰다. 모든 역방향 프라이머는 다양한 SUMO 말단의 디글리신 코돈의 하류에 Esp3I 인식 부위를 재생성하는 한편, 하류에 제2의 Esp3I 인식 부위를 이용하였다. Eco31I 및 BamHI 제한 부위를 통해 SUMO 태그를 pcDNA3.1-카파-6xHis에 삽입하여 하기 벡터를 만들었다: pcDNA3.1-카파-6xHis-CTHS, pcDNA3.1-카파-6xHis-SUMO, pcDNA3.1-카파-6xHis-SUMOmut, pcDNA3.1-카파-6xHis-hSUMO3.
초기 마우스 sPLA 2 -X 구성체 작제
프라이머 10+11을 이용하여 활성 sPLA2-X를 PCR로 증폭시켰다. 비활성 sPLA2-X는 프라이머 12+11을 사용하여 동일한 클론으로부터 증폭시켰다. 활성 sPLA2-X 구성체와 비활성 sPLA2-X 구성체 모두 PCR 생성물 및 벡터를 Esp3I으로 분해하여 생성하였다.
융합 태그 벡터의 증폭
인간 SUMO-1은 프라이머 13+14를 이용하여 cDNA로부터 PCR로 증폭시켰고, Esp3I 및 XbaI 제한 부위를 통해 pcDNA3.1-카파-6xHis로 클로닝하여, pcDNA3.1-카파-6xHis-hSUMO1을 생성하였다. 돌연변이 인간 SUMO-1 및 3을 PCR 부위 지정 돌연변이 유발로 생성하였으며, 이때 N 말단 반쪽과 C 말단 반쪽은 별개의 반응에서 생성되었고, 이것을 겔 단리하여 후속 PCR 반응에서 결찰시켰다. 인간 SUMO-1 1차 PCR은 N 말단 및 C 말단 반응을 위해 각각 프라이머 13+15 및 16+14를 사용하였다. 인간 SUMO-3 1차 PCR은 N 말단 및 C 말단 반응을 위해 각각 프라이머 8+17 및 18+9를 사용하였다. 2차 PCR에서는, 각각의 인간 SUMO에 대해 정제된 1차 생성물을 혼합하고, 프라이머 13+14를 hSUMO1mut에 사용하는 한편, 프라이머 8+9를 hSUMO3mut에 사용하였다. 생성물을 pcDNA3.1-카파-6xHis에 삽입하여, pcDNA3.1-카파-6xHis-hSUMO1mut 및 pcDNA3.1-카파-6xHis-hSUMO3mut를 생성하였다.
마우스 sPLA 2 구성체의 증폭
마우스 sPLA2-IIC, IIE, III 및 V에 대한 cDNA는 Open Biosystems(Huntsville, AL)로부터 구입하였다. PLA2 프라이머는 정제 및 태그 제거 후에 성숙 단백질을 생성할 목적으로 디자인하였다. 따라서 분비 신호 및 프로펩티드는 리뷰 문헌 및 SignalP 분석에 기초하여 프라이머 디자인에서 생략하였다. 마우스 sPLA2-IIC는 GenBank 등록 번호 BC029347에 해당하는 cDNA로부터 프라이머 19+20을 사용하여 클로닝하였다. 마우스 sPLA2-IIE는 GenBank 등록 번호 BC027524에 해당하는 cDNA로부터 프라이머 21+22를 사용하여 클로닝하였다. 전체 길이 마우스 sPLA2-III는 GenBank 등록 번호 BC079556에 해당하는 cDNA로부터 프라이머 23+24를 사용하여 클로닝하였다. 마우스 sPLA2-V는 GenBank 등록 번호 BC030899에 해당하는 cDNA로부터 프라이머 25+26을 사용하여 클로닝하였다. 마우스 sPLA2-III의 활성 도메인[Murakami et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:24987-24998]은 GenBank 등록 번호 BC079556으로부터 프라이머 27+28을 사용하여 클로닝하였다. 활성 및 비활성 sPLA2-X를 포함하는 모든 sPLA2 유전자를 pcDNA3.1-카파-6xHis, pcDNA3.1-카파-6xHis-SUMO, pcDNA3.1-카파-6xHis-SUMOmut, pcDNA3.1-카파-6xHis-hSUMO1, pcDNA3.1-카파-6xHis-hSUMOlmut, pcDNA3.1-카파-6xHis-hSUMO3 및 pcDNA3.1-카파-6xHis-hSUMO3mut에 서브클로닝하였다.
HEK-293 세포에서의 일시적 형질감염
10% 우태 혈청을 함유하는 DMEM 배지에서 6웰 플레이트(Becton Dickinson; Sparks, MD)의 웰당 500,000 세포의 밀도로 HEK-293T 세포를 시딩하여, 37℃, 95% 공기/CO2에서 밤새 항온처리하였다. 제조업자(Invitrogen)의 지시에 따라 리포펙타민-LTX를 사용하여 pcDNA3.1 벡터 내의 다양한 PLA2 cDNA 구성체(2.5 ㎍/웰)로 세포의 일시적 형질감염을 행하였다. 형질감염 후, 세포를 37℃에서 48시간 동안 더 항온처리한 후 PLA2 발현에 대해 분석하였다.
발현 분석
형질감염에 이어 항온처리 48시간 후, 분석을 위해 배지 및 세포를 수거하였다. 각 웰로부터 배양 배지(약 1.5 ml)를 수거하여 원심분리로 잔해물을 분리하였다. SDS-PAGE/웨스턴 블로팅의 경우, 배지 100 ㎕를 6xSDS 로딩 완충액과 혼합하여 5분 동안 끓였다. 남아있는 배지는 후속 분석을 위해 -80℃에 저장하였다. 플레이트의 각 웰로부터 세포를 세척하여, 원심분리로 분리하고, 차가운 RIPA 완충액 180 ㎕에 재현탁시키고, 가볍게 초음파 처리하고, 6xSDS 로딩 완충액과 혼합하여 5분 동안 끓였다. 모든 샘플은, 4% 아크릴아미드 스택층이 있는 변성 15% 아크릴아미드 겔에서 분해하였다. Trans-Blot® SD 반건조 이전 셀(BioRad; Hercules, CA)을 이용하여, 겔을 Immoblin™ 니트로셀룰로스(Millipore; Billerica, MA)에 이전시켰다. 이전 후, 블롯을 PBS(pH 7.5) 중 5% 탈지유 + 0.05% Tween-20(PBST)으로 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 후, 블롯을 PBST + 밀크 중의 1:1,000의 단일 클론 항His 항체(Sigma)와 1시간 동안 항온처리하였다. 블롯을 PBST로 3회 세척하고 PBST + 밀크 중의 1:2,500의 항마우스 HRP 접합 항체(Sigma; St. Louis, MO)와 1시간 동 안 항온처리하였다. 블롯을 PBST로 다시 3회 세척하였다. SuperSignal® West Pico 화학발광 기질(Pierce; Rockford, IL)을 사용하여 HRP 접합체를 검출하였다. 블롯은 LAS-3000(Fujifilm Life Science; Stamford, CT)을 사용하여 이미지화하였다.
표 3
프라이머
Figure 112009046701191-pct00005
결과
포유동물 분비 경로에서 SUMO-융합 단백질을 발현시키는 것의 잠재적 유용성을 평가하기 위해, 마우스 sPLA2-X를 모델 단백질로서 사용하였다. 먼저, 하기 4개 의 N 말단 융합체를 테스트하였다: Smt3(SUMO), AA45-99를 포함하는 Smt3의 C 말단 반쪽(CTHS), 이중 돌연변이체, Smt3 R64T R71E(SUMOmut(SUMO*))(이것은 SUMO 프로테아제 및 인간 SUMO-3(hSUMO3)에 의해 절단되지 않음). 모든 태그는 헥사히스티딘(6xHis) N 말단을 갖도록 제조하였으며, 마우스 유래의 IgG 카파 분비 신호를 사용하여 분비가 유도되도록 하였다. 대조군으로서, 신호 서열과 6xHis 태그만을 갖는 벡터를 제조하여, SUMO에 기초한 태그에 있어서만 차이가 있는 총 5개의 벡터를 만들었다. Smt3에의 융합은 이. 콜라이에서 이종성 단백질의 발현을 증대시킨 것으로 확인된 반면, 인간 SUMO-3에의 융합은 이. 콜라이 및 피. 파스토리스에서 발현을 증대시켰다. 특정 발현 데이터를 하기 표 4에 제공한다.
표 4
Figure 112009046701191-pct00006
먼저 배큘로바이러스/곤충 세포 발현을 위한 CTHS를 제조하였는데, 그 이유는 전체 길이 SUMO 융합체가 내인성 데수모일라제(desumoylase)에 의해 절단되는 것으로 관찰되었기 때문이다(예를 들어, PCT/US04/20778 및 미국 특허 출원 제 10/504,785호 참조). 스플릿-유비퀴틴의 개발에 기초할 때[Johnsson and Varshavsky (1994) PNAS 91:10340-10344], N 말단 반쪽(NTHS)이 있는 경우에만 CTHS가 절단될 것이다. CTHS 융합은 내인성 절단을 방지하면서 융합 파트너의 생산을 증대시키는 것으로 확인되었다.
본원에 기재된 바와 같이, 돌연변이 Smt3는, 원핵 세포에서 확인되는 Smt3 융합체의 모든 양의 증대를 유지하면서, 진핵 세포 숙주에서는 생체내에서 절단되지 않는 SUMO 융합체를 제조할 목적으로 개발되었다. 그 천연 프로테아제 Ulp1에 결합된 Smt3의 광범위한 결정 구조 분석을 실시한 후, 합리적 돌연변이 유발 스크리닝 방법은 2개의 계면 아미노산의 변형을 유도하였다. 이러한 변형, 즉 R64T 및 R71E는 효소 농도에 관계없이 Ulp1에 의해 절단되지 않는 SUMO를 산출하였다. 스크리닝에서, 신규 SUMO는 야생형 Smt3를 이용하였을 때 얻어지는 것과 동등하게 그 융합 파트너의 발현 증대를 나타내었다. 돌연변이 Smt3를 생성한 후, Ulp1 역시 합리적 돌연변이 유발 스크리닝에 적용하여 시험관에서 돌연변이 Smt3 융합체를 절단할 수 있는 돌연변이 효소를 개발하였다.
HEK-293T 세포에서의 sPLA2-X의 발현은 도 16A에서 확인할 수 있다. SUMOmut는 다른 태그에 비해 sPLA2-X의 생산을 증대시켰음을 분명히 보여준다. 그러나, Smt3 및 hSUMO3 배양물은 48시간이 지나도 덜 융합성(confluent)인 것으로 보였다. 형질감염을 몇 차례 반복하였으나 동일한 결과를 얻었다. sPLA2-X는 본래 자이모겐(zymogen)으로서 제조되며, 그 성숙형을 다양한 태그 다음에 클로닝하였다. sPLA2-X의 과발현은 그 융합 파트너로부터 방출될 수 있는 시나리오에서 세포에 독성을 나타낼 수 있다. sPLA2-X에 의해 나타난 독성이 절단에 의한 것인지를 평가하기 위해, sPLA2-X의 N 말단 글리신을 생략하여 일련의 비활성 sPLA2-X 융합체를 생성하였다. HEK-293T 세포에서 비활성 sPLA2-X를 갖는 융합체의 발현은 도 16B에서 확인할 수 있다. 결과는, 절단 생성물을 관찰할 수 없지만, sPLA2-X 활성 및 절단에 대한 그 N 말단 프로펩티드의 감수성이 과발현에 분명히 역할을 한다는 것을 입증한다.
인간 SUMO-1, 2, 3 및 Smt3의 결정 구조의 비교는 SUMO 구조와 2개의 계면 아르기닌 잔기의 거의 동일한 위치 간에 현저한 보존성이 있음을 보여준다. 특히, SUMO-2와 SUMO-3은 97%의 동일성을 공유한다. 따라서, hSUMO-1과 SUMO-3을, SUMO-2가 동일한 SUMO-3으로 거동할 것을 예상하여 조사하였다. hSUMO1의 경우, 63번 위치의 아르기닌이 트레오닌으로 변경되었고(R63T), 70번 위치의 아르기닌에 글루탐산으로 변경되었다(R70E). hSUMO3의 경우, 58번 위치의 아르기닌이 트레오닌으로 변경되었고(R58T), 60번 위치의 아르기닌이 글루탐산으로 변경되었다(R60E). 활성 및 비활성의 sPLA2-X 융합체는 돌연변이형 및 야생형의 Smt3, hSUMO1 및 3을 갖도록 제조하였다. 비활성 및 활성 융합체를 48시간 동안 발현시킨 결과는 각각 도 17A 및 17B에서 확인할 수 있다. 야생형 Smt3, hSUMO1 및 hSUMO3을 발현하는 배양물은 sPLA2-X를 발현하지 못하는 것은 물론 증식하지 못하였다. 이는, 융합 단백질의 절 단과 독성 PLA2의 방출에 의한 것일 가능성이 있다. His 태그가 부착된 몇몇의 hSUMO1을 도 17A에서는 볼 수 있으나, 활성 sPLA2-X를 갖는 다른 야생형 SUMO 융합체에서는 볼 수 없다는 것이 흥미롭다.
마우스 sPLA2-X를 사용한 발현 데이터를 고려하여, 다른 sPLA2 군을 테스트하였다. 이전에 보고된 다양한 수준의 재조합 발현에 기초하여 4개의 추가적인 마우스 sPLA2 유전자를 테스트하였다[Rouault et al. (2007) Biochemistry 46: 1647-1662]. 마우스 sPLA2-IIC 및 sPLA2-III은 이전에 곤충 세포에서 각각 150 ng/L 및 70 ng/L의 수율로 제조된 바 있다. 현재로선 어느 sPLA2에 대한 리폴딩 프로토콜도 존재하지 않으며, 두 효소 모두 자연적으로 글리코실화되어 진핵 세포 생산을 필수적으로 만든다. 마우스 sPLA2-IIE는 박테리아 생산에서 800 ng/L의 보고된 최저 수율을 나타내는 반면, sPLA2-V는 20 mg/L의 최고 수율을 나타낸다. 마우스 sPLA2-X는 이. 콜라이에서 10 mg/L로 발현되었다.
마우스 sPLA2-IIC, sPLA2-IIE, sPLA2-III 및 sPLA2-V의 활성 변형체들을 테스트하였다. 48시간 후의 sPLA2-IIC의 세포내 발현은 도 18A에서 확인할 수 있다. His 태그가 부착된 단백질은 배지에서 검출이 불가능하였다. SUMO 태그를 모두 가질 경우 발현이 명백히 크게 증가하였음에도 불구하고, 분비는 웬일인지 억제되었다. sPLA2-IIE의 발현 및 분비는 도 18B에서 확인할 수 있다. 48시간 후, SUMO 융합체의 대부분에서 현저히 더 많은 sPLA2-IIE를 관찰할 수 있으나, 밀도 측정 분석법에 의하면, His 태그 단독의 경우보다 SUMOmut는 140배 더 많았고, hSUMO3mut는 190배 더 많았다. 마우스 및 인간 sPLA2-III은 55 kD 단백질로서 발현되나, 종종 번역 후 가공 및 세포 특이적 단백질 분해 가공에 의해 28 kD의 활성 도메인으로 성숙된다[Murakami et al. (2003) J. Biol. Chem., 278: 10657-10667; Murakami et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:24987-24998]. 비활성 또는 S 도메인 다음에 N 도메인이 위치하고 그 다음에 C 도메인이 위치한다. 먼저, 전체 길이 sPLA2-III를 갖는 융합체를 제조하되, 단, 본래의 분비 신호를 SUMO 및 카파 신호로 대체하였다. HEK-293 세포에서는, 모든 sPLA2-III 융합체가 그 첫 번째 절단 지점에서 가공되어, 도 18C에서 확인되는 바와 같이 N 도메인과 S 도메인으로 분할되며, 이때 다양한 SUMO를 갖는 His 태그가 부착된 단백질은 단지 12 kD 또는 약 32 kD이다. 세포내 블로팅은, 관찰 가능한 추가 형태를 갖지 않는 55 kD의 단백질이 제조되었음을 보여주었다. sPLA2-V의 발현 및 분비는 도 18D에서 확인할 수 있다. X 군과 마찬가지로, sPLA2-V의 발현에 있어서 돌연변이 SUMO 융합체에 대해서는 현저한 선호도가 있다. 야생형 SUMO 융합체의 발현이 부족함이 분명하였지만, sPLA2-V의 경우 유사한 세포 배양 문제가 관찰되지 않았다.
지금까지 본 발명의 바람직한 특정 실시형태를 설명하고 구체적으로 예시하였으나, 본 발명이 그러한 실시형태에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않도록 하기 청구의 범위에 기재된 바와 같이 본 발명에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Butt, Tauseef R. Panavas, Tadas Karwa, Amolkumar Peroutka, Raymond J. Marblestone, Jeffrey G. <120> Methods and Compositions for Enhanced Expression and Purification <130> 1955-P04249US01 <140> 12/521,468 <141> 2009-06-26 <150> PCT/US2007/089035 <151> 2007-12-28 <150> 60/877,914 <151> 2006-12-29 <160> 80 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 1 Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro 1 5 10 15 Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser 20 25 30 Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu 35 40 45 Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr 50 55 60 Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp 65 70 75 80 Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile 85 90 95 Gly Gly <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <220> <221> VARIANT <222> 1, 8 <223> Xaa = any amino acid other than arginine <220> <221> VARIANT 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ttgcacttgg gagagt 36 <210> 46 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 atcacgtctc gaggtctcct ggagctggca gggac 35 <210> 47 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 cgcaggtctc taggttctga ccaggaggca aaacct 36 <210> 48 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 cgcgtctaga gagacggcat gccgtctcaa cctcccgttt gttcctgata a 51 <210> 49 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 atgattatca gcaatttcct gaccctcaaa gagaaacgtg agtgaattca ttggaa 56 <210> 50 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 ccaatgaatt cactcacgtt tctctttgag ggtcaggaaa ttgctgataa tcatac 56 <210> 51 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 tggctgcccg tcgaactcga atgtgatctg cctcattgac a 41 <210> 52 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 tcaatgaggc agatcacatt cgagttcgac gggcagccaa t 41 <210> 53 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 gcgccgtctc taggtagttt ctggcagttc cagagga 37 <210> 54 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 gcgccgtctc tctagattag cactggagtt tgtccctgc 39 <210> 55 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 gcgcggtctc taggtaacct ggtccagttt ggagtga 37 <210> 56 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 gcgcggtctc tctagattag cagggtgggg tgggc 35 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 gcgcgaagac ataggtcgtc actgggacag tacctcctg 39 <210> 58 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 gcgcgaagac atctagatta tgagctccag aatttcttct gtcc 44 <210> 59 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 59 gcgccgtctc taggtggctt gctagaactc aagtccatg 39 <210> 60 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 60 gcgccgtctc tctagattag cagaggaagt tggggtaata c 41 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Leu Val Glu Thr Arg Gly Pro Leu Cys Ser Leu Arg Ser Glu 275 280 285 Lys Arg Cys Ser Lys Gly Lys Ile Thr Asp Thr Glu Thr Met Val Gly 290 295 300 Ile Arg Phe Glu Asn Glu Ser Arg Arg Gly Tyr Gln Leu Glu Pro Asp 305 310 315 320 Leu Ser Glu Glu Val Ser Ala Arg Leu Arg Leu Gly Ser Gly Ser Asn 325 330 335 Gly Leu Leu Arg Arg Lys Val Ser Ile Ile Glu Thr Lys Glu Lys Asn 340 345 350 Cys Ser Gly Lys Glu Arg Asp Arg Arg Thr Asp Asp Leu Leu Glu Leu 355 360 365 Thr Glu Asp Met Glu Lys Glu Ile Ser Asn Ala Leu Gly His Gly Pro 370 375 380 Gln Asp Glu Ile Leu Ser Ser Ala Phe Lys Leu Arg Ile Thr Arg Gly 385 390 395 400 Asp Ile Gln Thr Leu Lys Asn Tyr His Trp Leu Asn Asp Glu Val Ile 405 410 415 Asn Phe Tyr Met Asn Leu Leu Val Glu Arg Asn Lys Lys Gln Gly Tyr 420 425 430 Pro Ala Leu His Val Phe Ser Thr Phe Phe Tyr Pro Lys Leu Lys Ser 435 440 445 Gly Gly Tyr Gln Ala Val Lys Arg Trp Thr Lys Gly Val Asn Leu Phe 450 455 460 Glu Gln Glu Ile Ile Leu Val Pro Ile His Arg Lys Val His Trp Ser 465 470 475 480 Leu Val Val Ile Asp Leu Arg Lys Lys Cys Leu Lys Tyr Leu Asp Ser 485 490 495 Met Gly Gln Lys Gly His Arg Ile Cys Glu Ile Leu Leu Gln Tyr Leu 500 505 510 Gln Asp Glu Ser Lys Thr Lys Arg Asn Ser Asp Leu Asn Leu Leu Glu 515 520 525 Trp Thr His His Ser Met Lys Pro His Glu Ile Pro Gln Gln Leu Asn 530 535 540 Gly Ser Asp Cys Gly Met Phe Thr Cys Lys Tyr Ala Asp Tyr Ile Ser 545 550 555 560 Arg Asp Lys Pro Ile Thr Phe Thr Gln His Gln Met Pro Leu Phe Arg 565 570 575 Lys Lys Met Val Trp Glu Ile Leu His Gln Gln Leu Leu 580 585 <210> 79 <211> 1513 <212> PRT <213> Drospohila Melanogaster <400> 79 Met Ser Leu Pro Pro Glu Asp Thr Asp Leu Ser Thr Asn Ser Ala Tyr 1 5 10 15 Glu Ser Ala Leu Gln Ile Ala Ser Asn Val Ser Ala Ala Arg Val Val 20 25 30 Gly Ser Ala Val Gly Gln Arg Phe Ser Pro Ser Pro Ala Ala His Pro 35 40 45 Asn Val Ile Glu Arg Val Ala Ser His Val Asp Ser Arg Arg Ser Thr 50 55 60 Phe Pro Ser Trp Gly Asn Pro Ser Val Ala Pro Arg Gly Ser Glu Glu 65 70 75 80 Ala Ala Ala Asn Ala Thr Ala Thr Gln Leu Leu Trp Ala Glu Asn Gln 85 90 95 Gly Leu Pro Thr Ser His Leu Leu Pro Thr Glu Gln Ala Phe Glu Thr 100 105 110 Leu Asn Thr Asn Ala Tyr Cys Ser Pro Pro Gly Asp Ser Arg Phe Thr 115 120 125 Phe Pro Ser Gln Asn Tyr Ser Pro Leu Leu Pro Arg Cys Val Pro Val 130 135 140 Pro Asn Gln Arg Tyr Ser Pro Asp Gly Ser Pro Ile His Gln Leu His 145 150 155 160 Glu Leu Gln Asn Cys Pro Leu Ile Asp Ser Pro Ile Arg Leu Arg Phe 165 170 175 Pro Ser Pro Leu Pro Glu Pro Pro Ser Leu Pro Thr Ile Thr Leu Thr 180 185 190 Val Asp Ala Leu Ile Asp Leu Asp Gln Asn Asn Gln Val Ala Tyr Tyr 195 200 205 Val Gln Gln Tyr Asn Asn Gln Pro Val Leu Tyr Gln Gln Asn Ile His 210 215 220 Ile Gly Thr Gly Ile Gln Leu Cys Asp Gln Ala Ser Glu Asn Asn Gln 225 230 235 240 Pro Ile Ile Leu His Ile Val Glu His Asn Pro Gln Thr Ile Thr Glu 245 250 255 Ser Gln Glu Gln Phe His Gln Val Val Pro Glu Ile Gln Ile Asn Asn 260 265 270 Ile Gln Glu Gln Asp Gln Lys Phe Glu Asn Gly Ile Ser Glu Gln Asn 275 280 285 His Pro Ile Ala Thr Glu Ala Gln Asp Gln Thr Leu Thr Glu Ile Arg 290 295 300 Asp Glu Asn Gln Ile Val Leu Ala Val Gln Glu Lys Asn Leu Thr Arg 305 310 315 320 Ala Ser Glu Ile Gln Asp Gln Asn Gln Gln Thr Leu Thr Glu Ile Pro 325 330 335 Glu Lys Cys Leu Gln Ile Ala Ser Pro Val Thr Thr Asp Ile Gln Val 340 345 350 Gln Ser Pro Gln Val Val Ile Glu Ile Gln Glu Gln Asn His Gln Ser 355 360 365 Val Thr Glu Ile Gln Glu Glu Val His Gln Thr Ala Pro Glu Ile Gln 370 375 380 Val Asn Val Phe Gln Thr Ser Ser Asp Ile Gln Gly Gln Asn His Gln 385 390 395 400 Ile Val Thr Glu Glu Gln Asn His Gln Thr Ile Thr Glu Thr Gln Glu 405 410 415 Asp Tyr Ser Ala Val Ser Glu Ile Gln Trp Glu Asn Leu Ser Phe Ser 420 425 430 Ala Glu Ile Gln Glu Gln Asn Gln Gln Ile Val Thr Glu Val Thr Lys 435 440 445 Leu Ala Ser Pro Ser Val Thr Asp Ile Gln Ala Gln Ser Pro Gln Ser 450 455 460 Val Ile Glu Ile Gln Asp Asp Asp Asp Glu Asp Leu Lys Phe Glu Ser 465 470 475 480 Asp Asp Leu His Thr Ile Pro Glu Ile Gln Glu Lys Asn Gln Gln Ser 485 490 495 Pro Gln Phe Val Ile Glu Ile His Tyr Asp Asn Glu Asp Leu Lys Phe 500 505 510 Ala Ser Asp Asn Gln Glu Gln Asp Gln Gln Thr Ala Glu Leu Gln Lys 515 520 525 Glu Arg Phe Gln Phe Ala Ser Glu Ile Glu Lys Arg Asp Leu Gln Ile 530 535 540 Val Thr Asp Thr His Lys Gln Asn Tyr His Asn Val Thr Asp Ile Pro 545 550 555 560 Phe Ala Thr Tyr Ile Gln Glu Glu Asn Glu Gln Leu Thr Pro Glu Asp 565 570 575 Gln Glu Glu Asp Gln His Tyr Leu Asn Phe Glu Gly Asn Gln Gln Phe 580 585 590 Gln Leu Gln Lys Gln Asp Gln Leu Ser Val Pro Gln Ile Gln Lys Gln 595 600 605 Thr His Gln Phe Glu Ser Lys Val Lys Lys Arg Lys Leu Gln Pro Phe 610 615 620 Ser Glu Tyr Gln Gln Lys Gly Gln Lys Asp His Ile Gln Glu Arg Gln 625 630 635 640 Tyr Ile Gln Gln Glu Phe Thr Ile His Ser Asn Gln Ala Tyr Ser Lys 645 650 655 Val Gln Tyr Ile Gln Thr Ile Gln Thr Ala Thr Pro Tyr Val Pro Gln 660 665 670 Leu Glu Ile Ser Gln Glu Asn Ser Phe Glu Val Gln Pro Ala Tyr Glu 675 680 685 Val Asn Glu Gly Gln Arg Asp Arg Glu Leu Val Ser Tyr Thr Gly His 690 695 700 Glu His Gln Asn Phe Val Asp Glu Val Ser Thr Pro Leu Pro Pro Ala 705 710 715 720 Glu Ala Gln Pro Gly Ser Thr Ser Glu Asp Ile Ser Asp Pro Val Ser 725 730 735 Pro Glu His Trp Glu Gln Leu Glu Ser Leu Asp Pro Ser Thr Ile Cys 740 745 750 Ile Arg Lys Thr Phe Asn Leu Ile Arg Asp Ile Ser Glu Ser Leu Val 755 760 765 Ala Asp Pro Glu Gln Pro Glu Ala Glu Ala His Arg Lys Ser Ile Phe 770 775 780 Leu Leu Arg Gln Lys Leu Ala Asp Val Cys His Lys Val Leu Thr Glu 785 790 795 800 Ile Ile His Gly Arg Ala Thr Asp Glu Ile Ile Ser Ile Leu Arg Glu 805 810 815 Ile Leu Glu Gln Thr Lys Glu Ile Pro Pro Arg Pro Thr Pro Lys Arg 820 825 830 Asp Leu Gln Glu Asp Ile Ser Met Gly Leu Glu Ile Leu Lys Lys Ile 835 840 845 Arg Gly Met Leu Ser Gly Trp Tyr Ser Ser Arg Glu Ser Glu Thr Asp 850 855 860 Ser Thr Asp Thr Gly Thr Gly Phe Gln Ala Gln Asn Gly Lys Gly Phe 865 870 875 880 Gly Ala Gly Arg Gln Pro Glu Asn Ser Phe Leu Ser Gln Lys Arg Arg 885 890 895 Asn Gln Glu Glu Asn Pro Arg Leu Ile Lys Tyr Arg Arg Val Asp Asn 900 905 910 Ser Phe Pro Arg Leu Ile Thr Asn Glu Thr Ala Glu Asp Leu Ile Pro 915 920 925 Asn Asn Ser Met Ala Lys Arg Asp Gln Pro Gln Ser Ser Lys Arg Leu 930 935 940 Ser Ile Phe Asn Pro Pro Val Tyr Thr Gln His Arg Val Arg Asn Asp 945 950 955 960 Ala Pro His Val Pro Thr Pro Phe Asp Asp Glu Glu Ser Ser Gln Arg 965 970 975 Leu Ala Asn Ala Gly Pro Ser Ser Arg Pro Met Thr Tyr Ser Asp Ala 980 985 990 Val Arg Leu Gly His Asn Gly Ile Ser Glu Ser Arg Val Asn Gly His 995 1000 1005 Ser Ser His Thr Val Arg Arg Glu Pro Ser Arg Leu His Arg Ser Ile 1010 1015 1020 Leu Ser His Glu Met Asn Cys Lys Asp Gln Glu Gln Tyr Asn Glu Leu 1025 1030 1035 1040 Ile Arg Thr Gln Thr Asn Tyr Val Gly Ser Arg Tyr Leu Lys Pro Gly 1045 1050 1055 Thr Pro Pro Thr Phe Gln Arg Ala Lys Ala Gln Ser Ala Thr Ser Ser 1060 1065 1070 Ser Cys Ser Leu Gln Asp Asn Gln Ser Asn Ile Thr Asp Ser Phe Pro 1075 1080 1085 Ser Pro His Gly Arg Ala Asn Pro Glu Leu Thr Glu Tyr Ala Lys Leu 1090 1095 1100 Ile Asn Arg Gln Glu Asn Glu Glu Asn Arg Ser Pro Ala Pro Gln Gln 1105 1110 1115 1120 Pro Lys Arg Asn Ala Ser Asn Ser Ser Ala Ser His Ala Ser Thr Ile 1125 1130 1135 Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser Cys Ser Thr Cys Ser Thr Cys Ser Ser 1140 1145 1150 Ser Asp Thr Glu Pro Met Leu Val Lys Asp Ser Pro Glu Val Lys Glu 1155 1160 1165 Ala Asn Glu Ala Asn Glu Ala Asn Glu Ala Asn Glu Ala Asn Glu Thr 1170 1175 1180 Lys Glu Asn Asp Ala Pro Gln Pro Thr Thr Thr Arg Ile Lys Lys Pro 1185 1190 1195 1200 Asp Phe Leu His Arg Arg Phe Ala Asn Cys Ile Phe Leu Arg Asn Asp 1205 1210 1215 Phe Ala Glu Asn Phe Lys Ala Arg Ala Asn Arg Arg Gln Leu Glu Ser 1220 1225 1230 Met His Leu Leu Gly Ile Ala Glu Gln Gln Ala Asn Glu Ser Lys Asp 1235 1240 1245 Glu Arg Leu Ala Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Glu Val Met Phe Arg Ser 1250 1255 1260 Gly Ala Pro His Arg Pro Phe Phe Glu Ile Gly Pro Leu Glu Gln Pro 1265 1270 1275 1280 Glu Glu Lys Lys Glu Thr Lys Leu Ile Pro Leu Thr Lys Glu Asp His 1285 1290 1295 Ala Arg Phe Gln Glu Met Thr Thr Ile Glu Val Thr Thr Asn Leu Ile 1300 1305 1310 Phe Lys Tyr Asn Leu Gln Ile Thr Thr Asp Asp Ile Phe Thr Phe Val 1315 1320 1325 Asp Gly Glu Trp Leu Asn Asp Ala Ile Ile Asn Phe Tyr Met Ser Met 1330 1335 1340 Leu Thr Glu Arg Ser Glu Lys Arg Ala Gly Glu Leu Pro Ala Thr Tyr 1345 1350 1355 1360 Ala Met Asn Thr Phe Phe Met Pro Arg Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Ala 1365 1370 1375 Gly Val Arg Arg Trp Thr Arg Lys Val Asp Leu Phe Ser Lys Asp Ile 1380 1385 1390 Ile Pro Val Pro Val His Cys Gly Asn Val His Trp Cys Met Ala Ile 1395 1400 1405 Ile His Leu Arg Asn Lys Thr Ile Phe Tyr Tyr Asp Ser Met Gly Arg 1410 1415 1420 Pro Asn Gln Pro Ala Leu Asp Ala Leu Val Lys Tyr Leu His Glu Glu 1425 1430 1435 1440 Ser Leu Asp Lys Arg Lys Gln Pro Phe Asp Met Thr Gly Phe Val Val 1445 1450 1455 Glu Asn Ala Gln Asn Ile Pro Arg Gln Gly Asn Ser Ser Asp Cys Gly 1460 1465 1470 Val Phe Ser Cys Met Phe Ala Glu Tyr Ile Thr Arg Asp Val Pro Ile 1475 1480 1485 Thr Phe Ser Gln Ala Glu Met Leu Tyr Phe Arg Thr Lys Met Ala Leu 1490 1495 1500 Glu Ile Ala Asp Gly Lys Leu Trp Gln 1505 1510 <210> 80 <211> 242 <212> PRT <213> Arabidopis Thaliana <400> 80 Met Phe Val Asp Ala Met Gln Asp Leu Ala Leu Val Asn Ser Ala Leu 1 5 10 15 Ser Lys Arg Asn Arg Lys Lys Ile Leu Val Ser His Lys Asn Ser Asn 20 25 30 Ile Asp Ile Ser Gly Glu Thr Leu Gln Cys Leu Arg Pro Asn Gln Trp 35 40 45 Leu Asn Asp Asp Val Thr Asn Leu Tyr Leu Glu Leu Leu Lys Glu Arg 50 55 60 Gln Thr Arg Asp Pro Gln Lys Tyr Phe Lys Cys His Phe Phe Asn Thr 65 70 75 80 Phe Phe Tyr Val Lys Leu Val Ser Gly Ser Gly Tyr Asn Tyr Lys Ala 85 90 95 Val Ser Arg Trp Thr Thr Lys Arg Lys Leu Gly Tyr Asp Leu Ile Asp 100 105 110 Cys Asp Ile Ile Phe Val Pro Ile His Ile Asp Ile His Trp Thr Leu 115 120 125 Gly Val Ile Asn Asn Arg Glu Arg Lys Phe Val Tyr Leu Asp Ser Leu 130 135 140 Phe Thr Gly Val Gly His Thr Ile Leu Asn Ala Met Ala Lys Tyr Leu 145 150 155 160 Val Asp Glu Val Lys Gln Lys Ser Gln Lys Asn Ile Asp Val Ser Ser 165 170 175 Trp Gly Met Glu Tyr Val Glu Glu Arg Pro Gln Gln Gln Asn Gly Tyr 180 185 190 Asp Cys Gly Met Phe Met Leu Lys Tyr Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Gly 195 200 205 Leu Ser Leu Gln Phe Ser Gln Val Ile Arg Asp Val Ile Lys Lys Asp 210 215 220 Met Pro Tyr Phe Arg Leu Arg Thr Ala Lys Glu Ile Leu Arg Leu Arg 225 230 235 240 Ala Asp

Claims (40)

  1. 조작된 SUMO를 코딩하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 조작된 SUMO는 SUMO 프로테아제 상호작용 도메인 내의 하나 이상의 아르기닌 잔기가 비염기성 아미노산으로 변경된 SUMO 단백질이고, 상기 조작된 SUMO는 서열 번호 1인 핵산 분자.
  2. 제1항의 핵산 분자에 의해 코딩되는 단리되고 조작된 SUMO 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 다중 클로닝 부위에 작동 가능하게 연결되며, 상기 다중 클로닝 부위는, 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산이, 조작된 SUMO의 Gly-Gly 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열의 3'쪽 바로 가까이에 인프레임으로(in-frame) 클로닝될 수 있도록 하는 것인 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 친화성 태그를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하며, 친화성 태그를 코딩하는 상기 핵산 서열은 상기 조작된 SUMO를 코딩하는 핵산 서열의 5'쪽에 인프레임으로 작동 가능하게 연결되는 것인 핵산 분자.
  5. 제1항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  6. 조작된 SUMO 프로테아제를 코딩하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 조작된 SUMO 프로테아제가
    a) 서열 번호 3,
    b) 서열 번호 4,
    c) 서열 번호 5,
    d) 451번 위치의 아스파르트산이 세린으로 변경되고 455번 위치의 글루탐산이 알라닌으로 변경된 서열번호 76, 및
    e) 451번 위치의 아스파르트산이 세린으로 변경되고 455번 위치의 글루탐산이 메티오닌으로 변경된 서열번호 76
    으로 구성된 군에서 선택되는 것인 단리된 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조작된 SUMO 프로테아제가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 구성된 군에서 선택되는 것인 단리된 핵산 분자.
  8. 제6항의 핵산 분자에 의해 코딩되는 단리되고 조작된 SUMO 프로테아제.
  9. 숙주 세포에서 관심있는 단백질의 발현 수준을 증대시키는 방법으로서,
    i) 제1항의 핵산을, 상기 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결함으로써, 융합 단백질을 코딩하는 구성체(construct)를 생성하는 단계, 및
    ii) 상기 핵산을 상기 숙주 세포에 도입하는 단계
    를 포함하며, 그에 따라 상기 융합 단백질 내의 SUMO의 존재가 상기 숙주 세포에서 상기 관심있는 단백질의 발현 수준을 증가시키는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵 세포, 포유동물 세포, 효모 세포, 이. 콜라이(E. coli), 곤충 세포, 및 진핵 세포로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 융합 단백질을 단리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 융합 단백질을 절단하여 상기 관심있는 단백질을 방출시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  13. 숙주 세포에서 관심있는 단백질의 변경된 아미노 말단을 생성하는 방법으로서,
    a) 상기 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계;
    b) 상기 핵산 내의 N 말단 아미노산 코딩 서열을 변경하는 단계;
    c) 제1항의 핵산을, 상기 관심있는 단백질을 코딩하는 상기 핵산 서열에 작동 가능하게 연결하는 단계;
    d) 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현시키는 단계; 및
    e) 상기 숙주 세포에서, 조작된 SUMO를 절단할 수 있는 조작된 SUMO 프로테아제를 발현시키는 단계
    를 포함하며, 그에 따라 조작된 SUMO 프로테아제가 조작된 SUMO를 절단함으로써, 변경된 아미노 말단을 갖는 관심있는 단백질을 생성하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 변경된 아미노 말단을 갖는 관심있는 단백질을 단리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 숙주 세포로부터 관심있는 단백질의 분비 수준을 증대시키는 방법으로서,
    i) 제1항의 핵산 분자를, 상기 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결함으로써, 융합 단백질을 코딩하는 구성체를 생성하는 단계, 및
    ii) 상기 핵산을 상기 숙주 세포에 도입하는 단계
    를 포함하며, 그에 따라 상기 융합 단백질 내의 조작된 SUMO의 존재가 상기 숙주 세포로부터 상기 관심있는 단백질의 분비를 증가시키는 것인 방법.
  16. 프로모터 및 다중 클로닝 부위에 작동 가능하게 연결된 제1항의 핵산 분자를 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 키트로서, 상기 다중 클로닝 부위는, 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산이, 조작된 SUMO의 Gly-Gly 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열의 3'쪽 바로 가까이에 인프레임으로 클로닝될 수 있도록 하는 것인 키트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 키트가 숙주 세포를 더 포함하는 것인 키트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵 세포, 포유동물 세포, 효모 세포, 이. 콜라이, 곤충 세포, 및 진핵 세포의 군에서 선택되는 것인 키트.
  19. 제16항에 있어서, 상기 키트가, 본래의(native) 관심있는 단백질과는 상이한 아미노 말단을 생성하기 위해 상기 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산을 변경하기 위한, 올리고뉴클레오티드에 기초한 부위 지정 돌연변이 유발을 위한 시약을 더 포함하는 것인 키트.
  20. i) a) 제1항의 핵산 분자;
    b) 프로모터;
    c) 다중 클로닝 부위; 및 경우에 따라,
    d) 친화성 태그를 코딩하는 핵산 서열
    을 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 프로모터는 제1항의 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고, 친화성 태그를 코딩하는 상기 핵산 서열은, 만약 존재한다면, 제1항의 핵산 분자에 인프레임으로 작동 가능하게 연결되며, 상기 다중 클로닝 부위는, 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산이 조작된 SUMO의 Gly-Gly 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열의 3'쪽 바로 가까이에 인프레임으로 클로닝될 수 있도록 하는 것인 재조합 벡터, 및
    ii) 조작된 SUMO를 Gly-Gly 절단 부위 다음에 특이적으로 절단하는 프로테아제를 포함하는 조성물
    을 포함하는, 숙주 세포로부터 단백질을 정제하기 위한 키트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 키트가 숙주 세포를 더 포함하는 것인 키트.
  22. 제20항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵 세포, 포유동물 세포, 효모 세포, 이. 콜라이, 곤충 세포, 및 진핵 세포의 군에서 선택되는 것인 키트.
  23. 제20항에 있어서,
    i) 친화성 태그를 결합시키기 위한 고체 지지체,
    ii) 용해 완충액,
    iii) 세척 완충액,
    iv) 용리 완충액,
    v) 절단 완충액, 및
    vi) 설명 자료
    로 구성된 군 중의 하나 이상을 더 포함하는 키트.
  24. 제16항에 있어서, 조작된 SUMO를 절단하는 조작된 SUMO 프로테아제를 코딩하는 발현 벡터를 더 포함하는 키트.
  25. 제20항에 있어서, 조작된 SUMO를 절단하는 조작된 SUMO 프로테아제를 코딩하는 발현 벡터를 더 포함하는 키트.
  26. 제6항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  27. 제5항의 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  28. 제26항의 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  29. 관심있는 단백질에 연결된 제2항의 조작된 SUMO 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 마이크로어레이(microarray).
  30. 제9항에 있어서, 상기 관심있는 단백질이 독성 단백질인 방법.
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