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KR101504039B1 - 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR101504039B1
KR101504039B1 KR1020130140237A KR20130140237A KR101504039B1 KR 101504039 B1 KR101504039 B1 KR 101504039B1 KR 1020130140237 A KR1020130140237 A KR 1020130140237A KR 20130140237 A KR20130140237 A KR 20130140237A KR 101504039 B1 KR101504039 B1 KR 101504039B1
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강원대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 신규한 인간 및 마우스 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로서, 구체적으로 서열번호 1의 중쇄 가변영역 및 서열번호 5의 경쇄 가변영역을 포함하는 L1CAM(L1 cell adhesion molecule)에 특이적으로 결합하는 항체의 서열이 변이되어, 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 대해 높은 결합능을 보이는 항체, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환체, 상기 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법, 상기 항체를 포함하는 암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트, 상기 항체를 이용하는 암의 진단을 위한 정보의 제공방법 및 상기 항체에 약물이 결합된 항체-약물 결합체에 관한 것이다.

Description

인간 및 마우스 Ｌ１ＣＡＭ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도{Antibody specifically binding to L1CAM in humans and mice, and use thereof}
본 발명은 신규한 인간 및 마우스 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로서, 구체적으로 서열번호 1의 중쇄 가변영역 및 서열번호 5의 경쇄 가변영역을 포함하는 L1CAM(L1 cell adhesion molecule)에 특이적으로 결합하는 항체의 서열이 변이되어, 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 대해 높은 결합능을 보이는 항체, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환체, 상기 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법, 상기 항체를 포함하는 암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트, 상기 항체를 이용하는 암의 진단을 위한 정보의 제공방법 및 상기 항체에 약물이 결합된 항체-약물 결합체에 관한 것이다.
L1CAM(L1 cell Adhesion Molecule, CD171)은 세포 표면에서 세포간 부착 (cell to cell adhesion)을 중개하는 면역글로불린 수퍼패밀리 세포부착 단백질들 (Immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules, CAMs) 중의 하나로, 200 내지 220 kDa 크기의 당단백질이다. L1CAM은 뉴런(neuron)과 뉴런 사이에서 부착을 중개하고, 신경돌기(neurite)의 성장과 뉴런의 이동 등에 관여하는 단백질로 처음 알려졌다(Lee et al., PNAS 74, 5021, 1997; McGuire and Greene 15, 357, 1978). 인간 L1CAM은 1,257개의 아미노산으로 구성되어 있고, 세포막을 한번 통과하며 아미노기 부분이 세포막 외부에 존재하고 카복시 부분이 세포질 부분에 존재하는 타입 1에 속하는 내재성 막 단백질(Integral membrane glycoprotein)이다. 세포외 부분에는 면역글로불린 타입 2에 속하는 도메인이 6개, 파이브로넥틴 (fibronectin) III 유사 도메인이 5개 존재하며 20개의 N-당화-부위(N-glycosylation sites)가 존재한다.
L1CAM은 정상적인 인간에서는 뇌에서 가장 많이 발현되고, 몇몇 조혈세포들과 일부 신장세포 등과 말초 신경(peripheral nerves)과 신경절(ganglions)에서 발현되나 그 외의 정상세포에서는 발현되지 않는다(Huszar et al., Human Pathology 37, 1000-1008, 2006). 최근 흑색종(melaoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 난소암, 대장암, 췌장암 및 자궁내막암 등 암세포들에서 L1CAM이 과발현되고, L1CAM이 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 하며, L1CAM 과발현이 암의 불량 예후와 관련이 있음이 보고됨에 따라, L1CAM이 암치료제의 표적으로 부각되어 왔다(Raveh et al., Cancer Letters 282: 137-145, 2009).
L1CAM에 대한 항체를 이용한 암의 진단 및 치료방법에 관해서는 다양한 보고들이 있어 왔으며, 그 예로 유럽등록특허 EP1172654 및 미국등록특허 제7618785호에서는 L1CAM이 난소암, 자궁내막암과 같은 암의 존재에 대한 표식이 된다는 전제 하에, 난소암 또는 자궁내막암의 진단 및 예후판정을 위해 L1CAM에 대한 항체를 이용하여 환자의 샘플로부터 L1CAM 존재 여부와 양을 결정하는 것을 특징으로 하는 수단, 및 세포 독성을 가진 약물과 L1CAM 항체를 결합시켜 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법에 대해 개시하고 있다. 또한, 미국공개특허 US 2004-0115206호는 암세포에서 세포 성장을 저해하고 세포사를 유도할 수 있는 유효량의 항 L1CAM 항체를 세포에 접촉시킴으로써 세포의 성장을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 것이 개시되어 있다. 또한, 국제공개공보 WO2006/013051는 난소암 및 자궁내막암에서 과발현되는 L1CAM 단백질 및 그들의 발현을 저해하는 조성물 및 이를 이용하여 난소암 및 자궁내막암을 예방 및 치료하는 방법을 제공하고 있으며, 구체적으로 이 문헌은 L1CAM 단백질의 기능을 저해하는 L1CAM 항체 및 그의 유도체를 포함하는 조성물이 난소암 및 자궁내막암의 기능을 억제하여 암세포의 이동을 저지하여 암의 치료가 가능하다고 기재하고 있다. 또한, 본 발명자들은 담도암에서 L1CAM이 발현되어 담도암세포의 증식, 이동에 관여하고, L1CAM에 대한 단일클론항체가 담도암세포의 성장을 저해함을 규명하여 L1CAM 및 담도암과의 상관관계를 규명하였다(한국등록특허 제10-756051호 및 제10-0931976호).
그러나, 지금까지 개발된 L1CAM에 대한 항체들은 마우스 항체로서 인간 L1CAM에는 결합하지만 마우스의 L1CAM에는 결합하지 못하는 단점이 있었다. 항체의 항암효능을 검증하기 위한 동물실험은 주로 인간 암세포를 이식시킨 누드 마우스를 이용하는데, 이때 인간 L1CAM에는 결합하지만 마우스 L1CAM에는 결합하지 않는 항체는 인간 암조직에만 결합하고 마우스의 일부 정상 조직에서 발현하는 L1CAM에는 결합하지 않기 때문에, 암환자에서 항체의 임상실험을 하는 경우에 비하여 항체의 항암 효능 및 독성 평가가 정확하게 이루어지지 않는 단점이 있었다. 따라서, 이러한 문제를 해결하기 위해서는 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 결합하면서, 결합 능력이 우수하며 암 치료 효능 역시 뛰어난 항체의 개발이 요구되어 왔고, 본 발명자들은 인간 및 마우스 L1CAM에 대하여 결합력을 나타내는 L1CAM 결합 항체를 개발한 바 있다(한국공개특허 제10-2008-0123667호). 그러나, 여전히 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 결합하면서 결합력이 향상된 L1CAM 항체에 대한 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 마우스 및 인간 L1CAM에 교차반응성이 있을 뿐만 아니라 L1CAM에 대한 결합력이 뛰어난 항체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, Ab4의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 특정 아미노산의 변이를 통하여 기존 항체에 비하여 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 대한 친화도가 크게 증가된 항체를 제조하였고, 상기 항체가 우수한 암 치료 효능이 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 인간 및 마우스 L1CAM 단백질에 특이적으로 결합하는 신규한 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 L1CAM 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체에 약물이 결합된, 항체-약물 결합체를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 및 마우스 L1CAM(L1 cell adhesion molecule) 단백질에 특이적으로 결합하는 신규한 항체를 제공한다.
본 발명에서는, 서열번호 2의 중쇄 CDR1; 서열번호 3의 중쇄 CDR2; 서열번호 4의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 서열번호 8의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체, 바람직하게는 서열번호 1의 중쇄 가변영역 및 서열번호 5의 경쇄 가변영역을 포함하는 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체에 대하여, 이의 항원에 대한 결합도, 물성, 또는/및 정제 효율을 개선시킬 수 있는 변이 위치를 규명하여, L1CAM에 대하여 효과적으로 결합하는 신규한 항체를 개발하였다.
본 발명에서 용어, "L1CAM(L1 cell adhesion molecule)"은 면역글로불린 수퍼패밀리 세포부착단백질들(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules, CAMs)에 속하는 내재성 막 당단백질(integral membrane glycoprotein)중 하나를 의미한다. 상기 L1CAM 단백질에 대한 정보는 미국국립보건원(NCBI) 유전자 은행(GenBank)와 같은 공지의 데이터베이스를 통하여 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession number가 AAI36448인 L1CAM 단백질 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 L1CAM은 뉴런, 조혈세포 및 신장 세포 등에서 발견되며(Bateman et al, EMBO J. 15:6050-6059; 1996), 뉴런의 이동, 신경 돌기의 성장, 세포 이동에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 암과의 연관성 또한 알려져 있다. 구체적으로, L1CAM이 흑색종(melanoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 난소암 및 대장암 등 여러 암에서 발현되고, 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 하며, L1CAM 과발현이 암의 불량 예후와 관련이 있음이 보고되고 있다(Raveh et al., Cancer Letters 282: 137-145, 2009). 따라서, L1CAM 단백질을 특이적으로 인지하는 항체는 L1CAM이 과발현되어 있는 암과 같은 질환의 진단, 및 예방 또는 치료에 사용될 수 있어, 본 발명자들은 인간 및 마우스 L1CAM 단백질에 고친화적으로 결합하는 항체를 개발하였다. 본 발명의 항체는 인간 및 마우스 L1CAM 단백질 모두에 고친화적으로 결합하여 마우스 모델을 이용한 임상 실험과 같은 분야 및 L1CAM 단백질이 과발현되어 있는 질환의 진단 분야에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 현저한 암 성장 억제 효과를 나타내므로 암의 예방 또는 치료 분야에 있어서도 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중디설파이드Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명에서 용어, "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, 이는 3가지 이상의 잠재적인 장점을 가질 수 있다. 먼저, 이는 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다. 둘째로, 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는 이점이 있다. 셋째로, 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 이점이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 모든 아미노산 서열이 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성된, L1CAM 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체를 제조하였다. 이와 같은 인간 단일클론항체는 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로, 암의 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 상기와 같은 본 발명의 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그 예로, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 불변 영역으로부터 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다.
본 발명에서 용어, "하이브리드(hybrid)"란 단쇄 면역 글로불린 중쇄 불변 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하며, 그 예로 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다.
본 발명에서 용어, "L1CAM(L1 cell adhesion molecule)에 특이적으로 결합하는 항체"는 L1CAM 단백질에 결합하여 L1CAM 단백질의 활성을 저해할 수 있는 항체를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체는 L1CAM의 Ig5 영역에 결합하는 항체이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 및 마우스 L1CAM 단백질에 고친화성으로 결합하는 특성을 지닌다. 본 발명의 항체와 달리 인간 단백질에만 특이적으로 결합하는 항체의 경우, L1CAM을 발현하는 인간 암 세포를 이식시킨 마우스 모델(Xenograft 모델)에 있어 인간 암세포가 아닌 마우스의 일부 정상조직 등에서 발현하는 L1CAM 단백질에는 결합하지 않으므로 암 치료 효능을 정확하게 평가할 수 없으며, 독성시험 역시 마우스가 아닌 원숭이와 같은 영장류에서 수행할 수 밖에 없는 단점이 있다. 따라서, 인간 및 마우스 L1CAM 단백질에 고친화성으로 결합하는 본 발명의 항체는 Xenograft 모델 등에 있어 인체에서의 임상실험과 유사한 상황에서 암 치료 효능을 시험할 수 있고, 또한 설치류 동물에서 독성실험을 수행할 수 있는 장점이 있으므로 전임상실험 비용의 절감을 가져올 수 있는 이점이 있다.
상기 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 또는/및 마우스 L1CAM에 대한 친화도를 높이기 위하여, 서열번호 2의 중쇄 CDR1; 서열번호 3의 중쇄 CDR2; 서열번호 4의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 서열번호 8의 경쇄 CDR3를 포함하는 항체, 바람직하게는 서열번호 1의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 5의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체에 대하여 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환시킨 항체이다.
상기 항체는 구체적으로, (i) 서열번호 2의 중쇄 CDR1; (ii) 서열번호 3의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR2에서 1번째 아미노산인 발린이 페닐알라닌으로 치환된 중쇄 CDR2(서열번호 9); 및 서열번호 3의 중쇄 CDR2에서 1번째 아미노산인 발린이 페닐알라닌으로 치환되고 5번째 아미노산인 아스파라긴산이 글루탐산으로 치환된 중쇄 CDR2로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 CDR2(서열번호 16), 및 (iii) 서열번호 4의 중쇄 CDR3, 또는 서열번호 4의 중쇄 CDR3에서 3번째 아미노산인 히스티딘이 알라닌으로 치환된 중쇄 CDR3(서열번호 10) 중 어느 하나인 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (iv) 서열번호 6의 경쇄 CDR1, 또는 서열번호 6의 경쇄 CDR1에서 8번째 아미노산인 이소류신이 세린으로 치환된 경쇄 CDR1(서열번호 17); (v) 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 및 (vi) 서열번호 8의 경쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR3에서 5번째 아미노산인 아스파라긴산이 알라닌으로 치환된 경쇄 CDR3(서열번호 11), 및 서열번호 15의 경쇄 CDR3로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 인간 L1CAM(L1 cell adhesion molecule) 단백질에 결합하는 항체일 수 있으며, 여기서 서열번호 2의 중쇄 CDR1; 서열번호 3의 중쇄 CDR2; 서열번호 4의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 서열번호 8의 경쇄 CDR3를 포함하는 항체는 제외된다.
보다 바람직하게 상기 항체는, (i) 서열번호 2의 중쇄 CDR1; (ii) 서열번호 9의 중쇄 CDR2, 또는 서열번호 9의 중쇄 CDR2에서 5번째 아미노산인 아스파라긴산이 글루탐산으로 치환된 중쇄 CDR2(서열번호 16)로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 CDR2, 및 (iii) 서열번호 10의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (iv) 서열번호 6의 경쇄 CDR1, 또는 서열번호 6의 경쇄 CDR1에서 8번째 아미노산인 이소류신이 세린으로 치환된 경쇄 CDR1(서열번호 17); (v) 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 및 (vi) 서열번호 11의 경쇄 CDR3 또는 서열번호 15의 경쇄 CDR3 중 어느 하나인 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 인간 L1CAM(L1 cell adhesion molecule) 단백질에 결합하는 항체일 수 있다.
여기서, 상기 항체의 FR(framework region)의 중쇄 가변영역은 바람직하게는 서열번호 22인 중쇄 구조영역 1(FR1), 또는 서열번호 22에서 16번째 아미노산인 아르기닌이 글리신으로 치환된 FR1 중 어느 하나인 FR1(서열번호 26); 서열번호 23인 FR2; 서열번호 24인 FR3, 또는 서열번호 24인 FR3에서 10번째 아미노산인 라이신이 알라닌으로 치환되고 22번째 아미노산인 프롤린이 알라닌으로 치환된 FR3 중 어느 하나인 FR3(서열번호 27); 및 서열번호 25인 FR4를 포함하고, 경쇄 가변영역은 서열번호 28인 경쇄 FR1; 서열번호 29인 경쇄 FR2 또는 서열번호 29에서 3번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환되고, 5번째 아미노산인 아르기닌이 라이신으로 치환되고, 8번째 아미노산인 라이신인 글루타민으로 치환된 경쇄 FR2; 서열번호 30인 경쇄 FR3(서열번호 32) 또는 서열번호 30에서 19번째 아미노산인 발린이 이소류신으로 치환되고 28번째 아미노산인 글리신이 알라닌으로 치환된 경쇄 FR3(서열번호 33); 및 서열번호 31인 경쇄 FR4를 포함하는 것일 수 있다.
이하 하기에서는 상기에서 기술한 본 발명의 항체에 대하여 보다 상세히 기술한다.
본 발명의 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체는 바람직하게는 서열번호 1의 중쇄 가변영역 및 서열번호 5의 경쇄 가변영역을 포함하는 L1CAM(L1 cell adhesion molecule)에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 서열번호 1의 중쇄 가변영역의 50번 아미노산 잔기인 발린(valine, V)의 페닐알라닌(phenylalanine, F)으로의 치환, 상기 중쇄 가변영역의 101번 아미노산 잔기인 히스티딘(histidine, H)의 알라닌(alanine, A)으로의 치환 및 경쇄 가변영역의 93번 아미노산 잔기인 아스파라긴산(Aspartic acid, D)의 알라닌(Alanine, A)으로의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 항체일 수 있다.
상기 서열번호 1의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 5의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체는, 본 발명자에 의해 개발된 L1CAM에 결합하는 단일클론항체로서 한국공개특허 제10-2010-0064985호에 의해 개시된 항체로, 본 명세서에서 Ab4로 명명된다. 상기 Ab4 항체는 서열번호 2의 중쇄 CDR1; 서열번호 3의 중쇄 CDR2; 서열번호 4의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 서열번호 8의 경쇄 CDR3를 포함하며, 서열번호 22의 중쇄 FR1; 서열번호 23의 중쇄 FR2; 서열번호 24의 중쇄 FR3; 및 서열번호 25의 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 28의 경쇄 FR1; 서열번호 29의 경쇄 FR2; 서열번호 30의 경쇄 FR3; 및 서열번호 31의 경쇄 FR4를 포함한다.
본 발명자들은 상기 Ab4 항체에 비하여 고친화도를 나타내는 항체를 개발하기 위하여, Ab4의 여러 아미노산 중에서 친화도를 증진시킬 수 있는 특정 아미노산을 규명하여, 중쇄 및 경쇄 가변영역을 구성하는 일부 아미노산의 변이를 통해 기존 Ab4에 비하여 최대 40배 이상 결합력이 증진된 항체를 개발하였다.
상기 Ab4 항체의 서열번호 1의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 5의 경쇄 아미노산 서열에서, L1CAM 단백질에 대한 친화도를 증진시킬 수 있는 아미노산 잔기로는, Ab4의 중쇄 가변영역(서열번호 1)의 50번 아미노산 잔기인 발린(중쇄 CDR2에 위치), Kabat 번호로 Ab4의 중쇄 가변영역 97번 아미노산 잔기이며 서열번호 1에서 101번 아미노산 잔기에 해당하는 히스티딘(중쇄 CDR3에 위치)이 있으며, Ab4의 경쇄 가변영역(서열번호 2)의 93번 아미노산 잔기인 아스파라긴산(경쇄 CDR3에 위치)이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 Ab4 항체의 중쇄 가변영역의 50번 아미노산 잔기인 발린은 중쇄 CDR2에 위치하며, 상기 발린이 페닐알라닌(phenylalanine, Phe)으로 치환되는 경우, 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 대해서 보다 높은 친화도를 나타낸다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 Ab4 항체의 50번 아미노산 잔기인 발린이 알라닌으로 치환되는 경우에는 대조군인 야생형 Ab4 항체에 비하여 인간 및 마우스 L1CAM 단백질 모두에서 현저히 감소된 결합력을 나타내나, 페닐알라닌으로 변이시키는 경우에는 인간 및 마우스 L1CAM 단백질 모두에 대하여 높은 결합력을 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 1a 및 1c; 및 도 2). Ab4 항체에서 중쇄 가변영역의 50번 아미노산 잔기인 발린이 페닐알라닌으로 치환된 Ab4 항체의 변이체를 'V50F'로 명명하였으며, 상기 항체는 서열번호 2의 중쇄 CDR1; 서열번호 9의 중쇄 CDR2; 서열번호 4의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 서열번호 8의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.
또한, 상기 Ab4 항체의 중쇄 가변영역(서열번호 1)에서 kabat 번호로 97번 아미노산 잔기인 히스티딘은, 서열번호 1에서 101번 아미노산 잔기에 해당하며, Ab4 항체의 중쇄 가변영역의 중쇄 CDR3에 위치한다. 상기 히스티딘이 알라닌으로 치환되는 경우, 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 대해서 보다 높은 친화도를 나타낸다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 kabat 번호로 중쇄 가변영역의 97번 아미노산 잔기인 히스티딘을 알라닌으로 치환한 항체를 'H97A'로 명명하였다. 상기 히스티딘을 알라닌으로 치환하는 경우, HCDR1 내지 3의 26 여개의 다른 아미노산 잔기와 달리 인간 및 마우스 L1CAM 단백질에 대해 증가된 친화도를 나타내었다(도 1a). 상기 H97A 항체는 서열번호 2의 중쇄 CDR1; 서열번호 3의 중쇄 CDR2; 서열번호 10의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 서열번호 8의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하며, 인간 L1CAM에 대하여 친화도를 제공하는데, 이때 인간 L1CAM에 대한 결합/해리 상수(KD value)는 경쟁적 ELISA 방법으로 측정하였을 때, 2.9x10-8M을 나타내었다.
또한, 상기 Ab4 항체에서 중쇄 가변영역의 발린 및 히스티딘이 각각 페닐알라닌 및 알라닌으로 치환되는 경우, Ab4에 비하여 L1CAM에 대한 높은 친화도를 나타낸다. 상기 두 아미노산 잔기 모두가 치환된 항체를 'V50F/H97A'로 명명하였으며, 상기 V50F/H97A는 서열번호 2의 중쇄 CDR1; 서열번호 9의 중쇄 CDR2; 서열번호 10의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 서열번호 8의 경쇄 CDR3을 포함한다. 상기 V50F/H97A 항체는 인간 L1CAM에 대하여 친화도를 제공하는데, 이때 인간 L1CAM에 대한 결합/해리 상수(KD value)는 경쟁적 ELISA 방법으로 측정하였을 때, 1.8x10-8M을 나타내었다.
상기 Ab4 항체의 경쇄 가변영역에서 93번 아미노산 잔기인 아스파라긴산은 경쇄 CDR3(LCDR3)에 위치하며, 상기 아스파라긴산이 알라닌으로 치환되는 경우, 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 대해 보다 높은 친화도를 나타낸다. 특히, 상기 아스파라긴산이 알라닌으로 치환되는 경우 인간 L1CAM에 대한 친화도가 현저히 증가하게 된다(도 1b). 본 발명의 일 실시예에서는 상기 경쇄 가변영역의 93번 아미노산 잔기인 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 항체를 'D93A'로 명명하였으며, 상기 D93A는 서열번호 2의 중쇄 CDR1; 서열번호 3의 중쇄 CDR2; 서열번호 4의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 서열번호 11의 경쇄 CDR3을 포함하며, 인간 L1CAM에 대하여 친화도를 제공하는데, 이때 인간 L1CAM에 대한 결합/해리 상수(KD value)는 경쟁적 ELISA 방법으로 측정하였을 때, 3.0x10-8M을 나타내었다.
또한, 본 발명의 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체는 Ab4 항체의 중쇄 가변영역인 서열번호 1에서 50번 아미노산 잔기인 발린이 페닐알라닌으로 치환되고, 101번 아미노산인 히스티딘이 알라닌으로 치환되고, 경쇄 가변영역인 서열번호 5에서 93번 아미노산인 아스파라긴산이 알라닌으로 치환된 항체일 수 있다. 이러한 항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 10으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변영역 및 서열번호 5의 경쇄 가변영역의 CDR에 위치한 상기 3개의 아미노산 잔기 외에도 추가적으로 구조 형성 지역(frame work region)에 위치한 경쇄 가변영역의 75번 아미노산 잔기인 발린의 이소류신으로의 치환 및 경쇄 가변영역의 84번 아미노산 잔기인 글리신의 알라닌으로의 치환으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 추가로 포함할 수 있다. 상기 경쇄 가변영역의 75번 아미노산 잔기인 발린 및 84번 아미노산 잔기인 글리신은 항체의 FR3에 위치한 아미노산 잔기로서, 상기 아미노산 잔기를 각각 이소류신 및 알라닌으로 치환하는 경우, L1CAM 단백질에 대한 항원 결합능을 보다 향상시킬 수 있다. 상기 두 잔기가 모두 이소류신 및 알라닌으로 치환된 FR3는 서열번호 33의 아미노산 서열을 가진다.
바람직하게는 서열번호 1의 중쇄 가변영역 및 서열번호 5의 경쇄 가변영역을 포함하는 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 서열번호 1의 중쇄 가변영역의 50번 아미노산 잔기인 발린이 페닐알라닌으로 치환되며, 서열번호 1의 중쇄 가변영역의 101번 아미노산 잔기인 히스티딘(histidine)이 알라닌으로 치환되고, 서열번호 5의 경쇄 가변영역의 93번 아미노산 잔기인 아스파라긴산이 알라닌으로 치환된 항체일 수 있으며, 추가로 서열번호 5의 경쇄 가변영역의 75번 아미노산 잔기인 발린이 이소류신으로 치환되고, 경쇄 가변영역의 84번 아미노산 잔기인 글리신이 알라닌으로 치환된 항체일 수 있다.
상기 항체는 서열번호 2의 중쇄 CDR1; 서열번호 9의 중쇄 CDR2; 서열번호 10의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 서열번호 11의 경쇄 CDR3을 포함하며, 이의 중쇄 구조영역(FR)은 서열번호 22의 중쇄 FR1; 서열번호 23의 중쇄 FR2; 서열번호 24의 중쇄 FR3; 및 서열번호 25의 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 28의 경쇄 FR1; 서열번호 29의 경쇄 FR2; 서열번호 30의 경쇄 FR3; 및 서열번호 31의 경쇄 FR4를 포함하거나, 서열번호 22의 중쇄 FR1; 서열번호 23의 중쇄 FR2; 서열번호 24의 중쇄 FR3; 및 서열번호 25의 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 28의 경쇄 FR1; 서열번호 29의 경쇄 FR2; 서열번호 33의 경쇄 FR3; 및 서열번호 31의 경쇄 FR4를 포함할 수 있으며, 그 예로 서열번호 12의 중쇄 가변영역 및 서열번호 13의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 12의 중쇄 가변영역 및 서열번호 13의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 'Ab4M'으로 명명하였다. 상기 Ab4M은 인간 및 마우스 L1CAM에 대하여 친화도를 제공하는데, 이때 Ab4M의 인간 L1CAM에 대한 친화도(KD value)는 경쟁적 ELISA 방법으로 측정하였을 때 2.9x10-9M이었고, 마우스 L1CAM에 대한 친화도(KD value)는 2.2x10-10M이었다. Ab4의 인간 L1CAM에 대한 친화도(KD value)는 경쟁적 ELISA 방법으로 측정하였을 때 1.3x10-7M이었고, 마우스 L1CAM에 대한 친화도(KD value)는 1.7x10-9M이었으므로, 상기 Ab4M은 Ab4 항체에 비하여 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 대하여 현저히 향상된 친화도를 제공한다.
또한, 본 발명자들은 상기 Ab4M 항체의 친화도를 보다 향상시킬 수 있는 최적의 경쇄 CDR3 서열(서열번호 15)을 규명하여, Ab4M 항체에 비하여 발현 및 친화도 모두가 향상된 항체를 개발하였으며, 이를 Ab417로 명명하였다.
Ab4M 항체에 비하여 발현 및 친화도가 보다 향상된 본 발명의 항체는 서열번호 2의 중쇄 CDR1; 서열번호 9의 중쇄 CDR2; 서열번호 10의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 서열번호 15의 경쇄 CDR3을 포함하며, 이의 중쇄 구조영역(FR)은 서열번호 22의 중쇄 FR1; 서열번호 23의 중쇄 FR2; 서열번호 24의 중쇄 FR3; 및 서열번호 25의 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 28의 경쇄 FR1; 서열번호 29의 경쇄 FR2; 서열번호 30의 경쇄 FR3; 및 서열번호 31의 경쇄 FR4를 포함하거나, 서열번호 22의 중쇄 FR1; 서열번호 23의 중쇄 FR2; 서열번호 24의 중쇄 FR3; 및 서열번호 25의 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 28의 경쇄 FR1; 서열번호 29의 경쇄 FR2; 서열번호 33의 경쇄 FR3; 및 서열번호 31의 경쇄 FR4를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 항체는 그 예로 서열번호 12의 중쇄 가변영역 및 서열번호 14의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 상기 항체는 인간 및 마우스 L1CAM에 대하여 친화도를 제공하는데, 이때 인간 L1CAM에 대한 친화도(KD value)는 SPR 방법으로 측정하였을 때 0.18x10-9M이었고 상기 항체의 마우스 L1CAM에 대한 친화도는 34.8pM이었다. 또한, Ab417의 인간 L1CAM에 대한 친화도(KD value)는 경쟁적 ELISA 방법으로 측정하였을 때 1.2x10-9M이었고, 마우스 L1CAM에 대한 친화도(KD value)는 2.1x10-10M이었다.
또한, 본 발명자들은 인간 및 마우스 L1CAM에 대하여 우수한 친화도를 보이고, 우수한 항암 활성을 나타내는 상기 Ab417 항체에 대하여, 이의 항원에 대한 친화도를 유지 또는 증진시키면서도 이의 생산성 및 물성을 증가시킬 수 있는 변이 위치들을 규명하였다.
구체적으로, 서열번호 12인 중쇄 가변영역을 기준으로, 16번째 아미노산인 아르기닌의 글리신으로의 치환; 중쇄 가변영역의 54번째 아미노산인 아스파라긴산의 글루탐산(glutamic acid)으로의 치환; 중쇄 가변영역의 76번째 아미노산인 라이신의 알라닌으로의 치환; 또는 중쇄 가변영역의 88번째 아미노산인 프롤린의 알라닌으로의 치환 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 서열번호 14인 경쇄 가변영역을 기준으로, 31번째 아미노산인 이소류신의 글루탐산로의 치환; 경쇄 가변영역의 37번째 아미노산인 아르기닌의 글루타민(glutamine)으로의 치환; 경쇄 가변영역의 39번째 아미노산인 아르기닌의 라이신으로의 치환; 또는 경쇄 가변영역의 42번째 아미노산인 라이신의 글루타민으로의 치환 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
Ab417 항체에 대하여 이의 항원에 대한 친화도를 유지 또는 증진시키면서도 이의 생산성 또는/및 물성이 증가된 중쇄 가변영역은, 바람직하게 서열번호 12인 중쇄 가변영역을 기준으로, 16번 아미노산인 아르기닌이 글리신으로 치환되고, 76번 아미노산인 라이신이 알라닌으로 치환되고, 88번 아미노산인 프롤린이 알라닌으로 치환된 중쇄 가변영역(서열번호 20); 또는 서열번호 12인 중쇄 가변영역을 기준으로, 16번 아미노산인 아르기닌이 글리신으로 치환되고, 76번 아미노산인 라이신이 알라닌으로 치환되고, 88번 아미노산인 프롤린이 알라닌으로 치환되고, 54번 아미노산인 아스파라긴산이 글루탐산으로 치환된 중쇄 가변영역(서열번호 18)일 수 있다. 상기에서 생산성 및 물성을 증가시킬 수 있는 잔기들 중 16번 아미노산인 아르기닌은 중쇄 FR1에 위치하며, 서열번호 22에서 16번째 아미노산인 아르기닌이 글리신으로 치환된 FR1 서열(서열번호 26)을 나타낼 수 있다. 또한, 상기 76번 아미노산인 라이신 및 88번 아미노산인 프롤린은 FR3에 위치하여, 서열번호 24인 FR3에서 10번째 아미노산인 라이신이 알라닌으로 치환되고 22번째 아미노산인 프롤린이 알라닌으로 치환된 것(서열번호 27)일 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 20인 중쇄 가변영역을 'H5'로, 서열번호 18인 중쇄 가변영역을 'H6'로 명명하였다.
또한, Ab417 항체에 대하여 이의 항원에 대한 친화도를 유지 또는 증진시키면서도 이의 생산성 또는/및 물성이 증가된 경쇄 가변영역은, 바람직하게 서열번호 14의 경쇄 가변영역을 기준으로 31번째 아미노산인 이소류신이 세린으로 치환된 경쇄 가변영역(서열번호 19); 또는 37번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환되고 39번째 아미노산인 아르기닌이 라이신으로 치환되고, 42번째 아미노산인 라이신이 글루타민으로 치환된 경쇄 가변영역(서열번호 21)일 수 있다. 여기서, 31번째 아미노산인 이소류신은 LCDR1에 위치하므로, 서열번호 6의 LCDR1에서 8번째 아미노산인 이소류신이 세린으로 치환되는 것에 해당하며, 이는 서열번호 17의 아미노산 서열을 가진다. 또한, 37번째 아미노산인 아르기닌, 39번째 아미노산인 아르기닌, 및 42번째 아미노산인 라이신은 경쇄 FR2에 위치하므로, 서열번호 29인 경쇄 FR2에서 3번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환되고, 5번째 아미노산인 아르기닌이 라이신으로 치환되고, 8번째 아미노산인 라이신인 글루타민으로 치환된 것에 해당하며, 이는 서열번호 32의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명에서는, 서열번호 19인 경쇄 가변영역을 'L2'로, 서열번호 21인 경쇄 가변영역을 'L1'으로 명명하였다.
상기 Ab417 항체에 대하여 생산성 및 물성을 증가시키도록 변이된 항체는, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR2, 서열번호 10으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 17로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 15로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 18의 중쇄 가변영역(H6) 및 서열번호 19의 경쇄 가변영역(L2)을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 18의 중쇄 가변영역 및 서열번호 19의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 'Ab417-H6L2'로 명명하였다.
상기 Ab417 항체에 대하여 생산성 및 물성을 증가시키도록 변이된 항체는, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR2, 서열번호 10으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 15로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 18의 중쇄 가변영역(H6) 및 서열번호 21의 경쇄 가변영역(L1)을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 'Ab417-H6L1'으로 명명된다.
상기 Ab417 항체에 대하여 생산성 및 물성을 증가시키도록 변이된 항체는, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 중쇄 CDR2, 서열번호 10으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 15로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 20의 중쇄 가변영역 및 서열번호 21의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 20의 중쇄 가변영역(H5) 및 서열번호 21의 경쇄 가변영역(L1)을 포함하는 항체를 'Ab417-H5L1'으로 명명하였다.
상기 Ab417 항체에 대하여 생산성 및 물성을 증가시키도록 변이된 항체는, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 중쇄 CDR2, 서열번호 10으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 17로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 15로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 20의 중쇄 가변영역(H5) 및 서열번호 19(L2)의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 'Ab417-H5L2'로 명명하였다.
이와 같이 본 발명의 다양한 L1CAM 결합 항체는 인간 및 마우스 L1CAM에 대해 기존 항체에 비하여 높은 친화도를 제공하여 L1CAM에 대해 특이적으로 높은 결합을 할 수 있음을 시사하므로, 본 발명의 항체를 L1CAM에 대한 항원 인식을 유용하게 사용할 수 있는 임의의 적용에 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 인간 및 마우스 L1CAM의 결합 항체인 Ab4의 다양한 아미노산을 치환시키는 과정을 통하여, 중쇄 가변영역(서열번호 1)의 kabat 번호로 97번 아미노산 잔기(서열번호 1의 101번 아미노산 잔기)인 히스티딘의 알라닌으로의 치환(H97A), 중쇄 가변영역 50번 아미노산 잔기인 발린의 페닐알라닌으로의 치환(V50F), 경쇄 가변영역(서열번호 5)의 93번 아미노산 잔기인 아스파라긴산의 알라닌으로의 치환(D93A)이 L1CAM 간의 친화도를 높이는데 중요함을 확인하였다(도 1). 특히, 상기 H97A, V50F, D93A를 모두 포함하며, 추가로 경쇄 가변영역의 75번 아미노산 잔기인 발린의 이소류신으로의 변이 및 84번 아미노산 잔기인 글리신의 알라닌으로의 변이를 추가적으로 수행한 항체인 Ab4M의 경우, 인간 및 마우스 L1CAM을 모두 인지하는 특이성을 지닐 뿐만 아니라, 기존 항체인 Ab4에 비하여 약 45배 가량 현저히 증가된 결합능을 나타냄을 확인하였다(도 2 내지 3). 또한, 이와 같은 항체가 L1CAM 단백질을 인지함으로써 ADCC에 의한 암세포 독성을 나타낼 수 있으며, 체중 감소를 가져오지 않으면서도 항암 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 4 내지 5). 또한, 고친화성을 나타내는 Ab4M 항체의 친화도를 보다 더 높이기 위하여 Ab4M 항체의 경쇄 CDR3의 아미노산 변이를 추가적으로 수행하여 Ab4M 항체에 비하여 친화도가 더욱 향상된 본 발명의 항체인 Ab417을 개발하였고, 상기 항체는 Ab4M 항체에 비하여 인간 L1CAM에 대한 친화도가 2배 이상 향상되면서도 고발현을 나타냄을 확인하였다(도 6 내지 7). 또한, 상기 Ab417은 L1CAM 단백질을 인지함으로써 ADCC에 의한 암세포 독성을 나타낼 수 있으며, 체중 감소를 가져오지 않으면서도 항암 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 8 내지 9). 또한, Ab417의 물성 또는/및 생산성을 증가시키기 위하여 Ab417의 중쇄 및 경쇄 가변영역에 대하여 R16G, K76A 및 P88A인 중쇄가변영역(H6); R16G, D54E, K76A 및 P88A인 중쇄가변영역(H5); I31A인 경쇄가변영역(L2); 및 R37Q, R39K 및 K42Q인 경쇄가변영역을 제조하였고, Ab417-H6L2 및 Ab417-H5L1의 생산량 및 물성을 확인한 결과, Ab417-H6L2의 경우, L1CAM에 대한 항원결합능이 Ab417과 유사하였고, 그 생산량 및 물성 모두 우수하였으며, Ab417-H5L1의 경우에도 항원결합능이 Ab417과 유사하면서 물성이 개선된 효과를 나타내었다(실시예 6). 상기와 같은 결과는 본 발명의 항체가 L1CAM 단백질의 인지가 필요한 분야, 예컨대 L1CAM 단백질이 과발현된 질환의 진단; 및 치료 등에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체는 공지의 항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파아지 디스플레이(phage display) 기술 등을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다클론항체의 제조방법은 공지의 항체 제조기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
파아지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파아지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파아지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적으로 파아지 디스플레이 기술은 1) 파아지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ (또는 pⅣ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; 4) 수용체에 결합된 펩티드-파아지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파아지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하는 단계로구성된다.
바람직하게 본 발명의 단일클론항체의 제조방법은 파아지 디스플레이 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자는 공지의 파아지 디스플레이 기술, 예를 들어 Barbas 등(METHODS : A Companion to Methods in Enzymology 2:119, 1991 및 J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9) 및 Winter 등(Ann. Rev.Immunol. 12:433, 1994) 의 논문 등에 공지된 방법을 참고하여 상기 본 발명의 제조방법의 각 단계를 용이하게 수행할 수 있다. 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파아지는, 예를 들어 필라멘트성 파아지(filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파아지가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파아지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터에는 예를 들어, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파아지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8 또는 pSEX 등의 파아지미드 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 증폭을 위한 재조합 파아지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파아지에는, 예를 들 어 M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 효모 디스플레이 기술은 효모 세포의 표면에 단백질을 발현시키는 기술이다. 효모는 진핵생물의 단백질 발현 시스템을 사용하고 있기 때문에 이 기술을 사용하면 발현되는 단백질의 번역후변형(post-translational modification)이 일어나므로 파지 또는 리보좀 디스플레이 방법보다 보다 인간 단백질에 가까운 재조합 단백질을 얻을 수 있다. 또한 효모 디스플레이 기술은 FACS(fluorescense-activated cell sorting) 방법을 통해 클론을 선택하므로 선택 과정과 동시에 양적인 분석이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 일반적으로 scFv 항체의 효모 디스플레이 기술은 1) 효모의 세포벽 단백질인 Aga2의 C-말단에 짧은 아미노산 linker로 연결된 scFv 라이브러리, 그리고 태그의 서열을 삽입하는 단계; 2) Aga2 및 scFv 항체 유전자가 효모 세포벽 단백질인 Aga1에 이황화 결합으로 연결됨으로써 효모 세포 표면에 발현되도록 하는 단계; 3) 효모 표면에 발현된 scFv 항체 라이브러리에 항원을 결합시키는 단계; 4) 항원 및 태그를 특이적으로 인식하는 형광 물질이 결합된 이차 항체를 처리하는 단계; 5) FACS를 통해 항원에 특이적으로 결합하는 scFv 항체를 발현하는 효모들을 골라내는 단계; 6) FACS에 의해 선별된 클론들의 DNA 서열 정보를 얻어 높은 항원결합능을 갖는 항체 가변 영역 서열을 결정하는 단계로 구성된다.
본 발명의 하이브리도마 유래의 단일클론항체 또는 디스플레이 클론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 그 예로, 하이브리도마 또는 파아지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 일단 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론항체를 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 인간 단일클론항체의 제조 방법은 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터에서 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 포함하는, 인간 단일클론항체의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체에 약물이 결합된 항체-약물 결합체를 제공한다.
상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "항체-약물 결합체"는 항체가 가지는 표적 특이성, 혈액 순환 동안 독성 없음, 및 약동학적 장점을 이용하여 항체에 약물을 결합시킨 형태의 물질을 의미한다. 이러한 항체-약물 결합체는 통상 단일클론항체-링커-약물, 3 가지의 구성 요소를 포함하며 항체가 표적으로 하는 세포, 특히 암 세포에 약물을 전달하여 항체에 의한 치료 효과를 상승시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "약물"은 항체에 직접 또는 간접적으로 결합되어 효과적으로 상기 항체가 표적으로 하는 질환의 치료를 가져올 수 있는 물질을 의미한다. 항체와 결합될 수 있는 약물에는 방사성핵종, 약제, 림포카인, 독소, 이중특이적 항체 등을 포함한다. 또한, 상기한 방사선핵종에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다. 또한 상기 약제 또는 독소의 예로서, 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드 등을 들 수 있으나, 상기 예에 의해 본원발명의 항체에 결합될 수 있는 약제 또는 독소가 제한되는 것은 아니다.
이러한 항체-약물 결합체는 당업계에 공지된 다양한 항체-약물 결합체의 제조 방법을 통하여 제조될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 항체는 암에서 과발현되어 있으며, 암 세포의 성장 및 전이에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 L1CAM 단백질에 고친화도로 결합하므로, L1CAM 단백질의 활성의 억제, 중화 또는/및 세포 독성 반응을 가져와 L1CAM 단백질이 과발현되어 있는 질환의 예방 또는 치료를 가져올 수 있다. 상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "암"은 본 발명의 항체에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암이라면 그 종류에 제한없이 포함하나, 그 예로 담도암, 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 및 다발성 골수종 혈액암일 수 있다. 본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 조성물의 투여에 의해 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있으며, 상기 "치료"란 상기 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 Ab4 항체의 대표적인 항체 변이체인 Ab4M 및 Ab417이 체중 감소를 가져오지 않으면서도 효과적으로 ADCC 반응 및 암의 성장을 억제할 수 있음을 확인하여, 본 발명의 항체가 암의 예방 및 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(도 4, 5, 8 및 9).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 암을 치료하는 방법은 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 암이 발병되거나 발명 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 암을 치료하는 방법은 바람직하게는 항체를 포함하는 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있다.
상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한없이 포함한다.
이때, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 L1CAM 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다. 또한, 이 방법은 암을 진단하는 방법일 수 있다.
상기 항체, 암, 개체 및 L1CAM 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. L1CAM 단백질은 여러 암에서 과발현되어 있는 것으로 알려져 있으므로, L1CAM 단백질이 과발현된 것으로 알려진 암의 진단에 본 발명의 항체를 유용하게 사용할 수 있다.
상기 암의 진단을 위한 정보의 제공방법은 본 발명의 L1CAM에 특이적인 인간 단일클론항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 L1CAM 단백질을 검출할 수 있으며, 이를 통해 암의 진단을 위한 정보의 제공을 할 수 있다.
구체적으로, (a) 상기 항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에 처리하여 L1CAM 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계; (b) 상기 (a)에서 검출된 L1CAM 단백질의 수준을 대조군과 비교하여, 대조군에 비하여 L1CAM 단백질 수준이 높으면 암 환자로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법 또는 암의 진단 방법일 수 있다.
본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 L1CAM 단백질의 존재 또는 암의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 시료 중의 L1CAM 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3 +, Eu3 + 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA,고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 L1CAM 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 진단용 조성물을 사용하여 L1CAM 단백질의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환, 예컨대 암을 진단할 수 있다.
또 본 발명의 양태로서, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 조성물 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 암 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 항체는 인간 및 마우스 L1CAM 단백질에 고친화적으로 결합하므로, 상기 항체가 필요한 분야, 예컨대 L1CAM 단백질이 과발현되어 있는 암과 같은 질환의 진단 및 치료 분야에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은, L1CAM 결합 항체인 Ab4 항체의 CDR 서열을 구성하는 아미노산 잔기를 치환한 다음, 치환 변이체들의 인간 및 마우스 L1CAM에 대한 결합능을 간접 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 Ab4 항체의 VH CDR1, 2 및 3, 도 1b는 VK CDR3를 구성하는 아미노산 잔기들을 각각 알라닌으로 치환하여 치환 변이체들의 인간 및 마우스 L1CAM에 대한 결합능을 간접 ELISA로 측정하여 Ab4의 결합능에 대한 상대적 비율을 표기한 것이다. 도 1c는 Ab4 VH의 50번 발린을 다른 아미노산 잔기로 치환한 변이체의 항원 결합능을 Ab4의 항원결합능에 대한 상대적 비율로 표시한 것이다.
도 2는, Ab4, Ab4M 및 Ab417 항체의 인간 및 마우스 L1CAM에 대한 항원 결합 친화도를 분석 및 비교하기 위하여 경쟁적 ELISA를 수행한 결과이다. 도 2a는 Ab4, Ab4M 및 Ab4 변이체의 인간 L1CAM에 대한 항체의 친화도를 나타낸 것이고, 도 2b는 Ab4, Ab4M 및 Ab417의 마우스 L1CAM에 대한 친화도를 나타낸 것이다. 여기서 항체의 친화도(KD)는 항체의 항원과의 결합능을 50% 저해하는데 필요한 경쟁적 항원의 농도로 정의하였다.
도 3은, Ab4M 및 Ab417 항체의 인간 및 마우스 L1CAM 항원에 대한 특이성을 확인하기 위해 유세포 분석(flow cytometry)을 수행한 결과이다. 음성 대조군으로서 Human IgG를 사용하였으며, 양성대조군으로서는 인간 L1CAM에만 결합하고 마우스 L1CAM에는 결합하지 않지 않는 항체인 키메릭 A10-A3(cA10-A3) 항체를 사용하였다.
도 4는, Ab4M 항체의 ADCC 효과를 실험한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는, 누드 마우스 담도암 모델에서 Ab4M 항체의 항암 효능을 isotype 음성대조군으로 Synagis 항체를 사용하여 실험한 결과를 나타낸 도이다. 도 5a는 암의 부피를 측정한 결과이고, 도 5b는 마우스 모델의 체중을 측정한 결과이다.
도 6a는, 효모 표면에 발현된 Ab4M scFv가 항원인 Ig5-Fc(1x10-5 내지 1x10-8M)에 결합하는 것을 FACS로 측정한 결과를 나타낸 도이다. 도 6b는 효모 표면에 Ab4M scFv 및 Ab4M-18 scFv가 발현되는 정도 및 항원인 Ig5-Fc에 대한 결합능을 FACS로 측정한 결과를 나타낸 도이다. 도 6b에서, 그래프 상의 점 각각이 효모 세포 한 개체를 의미한다. 또한, 그래프의 세로축은 scFv의 발현 정도를 나타내는 Cy5 형광 신호이며, 가로축은 scFv의 항원에 대한 결합능을 나타내는 FITC 형광 신호이다.
도 7은, Octet RED(ForteBio) 시스템을 사용하여 SPR 방법으로 Ab4M 및 Ab417 항체의 인간 L1CAM 및 마우스 L1CAM에 대한 친화도를 측정한 실험 결과를 나타낸 도이다. 도 7a는 인간 L1CAM에 대한 항체의 친화도를 나타낸 것이며, 도 7b는 마우스 L1CAM에 대한 항체의 친화도를 나타낸 것이다.
도 8은, Ab417 항체의 ADCC 효과를 실험한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는, 누드 마우스 담도암 모델에서 Ab417 항체의 항암 효능을 나타낸 결과로서, 도 9a는 암의 부피를 측정한 결과이고, 도 9b는 21일째 암의 무게를 측정한 결과이며, 도 9c는 누드마우스 모델의 체증을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은, 본 발명의 L1CAM 결합 항체인 Ab4M 또는 Ab417 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 서열을 나타낸 도로서, 도 10a는 Ab4M 또는 Ab417 항체의 중쇄 가변영역(서열번호 12)을, 도 10b는 Ab417 항체의 경쇄 가변영역(서열번호 14)을 나타내며, 도 10c는 Ab4M 항체의 경쇄 가변영역(서열번호 13)을 나타낸다. 도 10에서 숫자는 Kabat Numbering을 의미하며, 밑줄로 표시된 부분은 CDR을 나타낸다.
도 11은, Ab417-H6L2 및 Ab417-H5L1 변이체의 pI값을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 및 마우스 L1CAM 결합항체 Ab4 의 제조
인간 및 마우스 L1CAM 결합항체 Ab4 및 이의 제조과정에 대해서는 한국공개특허 제10-2008-0123667호에 개시되어 있으며, 그 제조과정은 하기와 같다.
( 실시예 1-1) 인간 L1CAM 항원 및 인간 L1CAM - Fc 항원의 제조
인간 L1CAM 항원을 제조하기 위하여, 인간 L1CAM의 세포외 도메인(아미노산 잔기 위치 1-1112; 이하 '인간 L1CAM'이라 표기함)을 암호화하는 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드 pJK-dhfr2-L1-monomer(한국등록특허 제10-0931976호)를 우태아혈청을 10% 함유하고 있는 DMEM(Hyclone, 미국) 배지에서 키운 HEK293T 세포에 리포펙타민(lipofectamine) 2000(Invitrogene, 미국)을 이용하여 형질전환(transfection)하고 37℃, 5% CO2 항온기에서 4-6 시간 배양한 후 혈청을 함유하고 있지 않은 CD293(Gibco, 미국) 배지로 갈아주었다. 계속해서 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하면서 3일에 한 번씩 새로운 배지로 갈아주고 3회 상층액을 모은 후 CNBr 세파로스(Amersham Phamacia, 영국)에 A10-A3 항체를 결합시켜 만든 컬럼 (column)을 이용하여 친화성 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 제조하였다.
인간 L1CAM-Fc 항원을 제조하기 위하여, 인간 L1CAM의 세포외 도메인(아미노산 잔기 위치 1-1112)의 서열을 포함하고 있는 pJK-dhfr2-L1-monomer(한국등록특허 제10-0931976호)로부터 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 실시한 다음, 수득한 DNA 단편을 EcoRI과 XhoI으로 처리한 후, pJK-dhfr2-Fc의 EcoRI과 XhoI 위치 사이에 클로닝하였으며, 제조된 플라스미드를 pJK-dhfr2-hL1Fc라 명명하였다.
인간 L1CAM-Fc를 발현시키기 위하여 pJK-dhfr2-hL1Fc를 HEK293T 세포에 형질감염한 다음, 무혈청배지에서 배양하였다. 배양 상청액을 Protein G column (Upstate 사, 미국)을 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행하여 단백질을 정제하여 제조하였다.
( 실시예 1-2) 마우스 L1CAM 항원 및 마우스 L1CAM - Fc 항원의 제조
마우스 L1CAM의 세포외 도메인(이하 '마우스 L1CAM'이라 표기함)을 제조하기 위하여, pJK-dhfr-mL1-Fc 발현 벡터로부터 마우스 L1CAM을 합성하고, pJEX2T vector로부터 S1 tag을 합성하여 두 DNA 조각을 PCR로 재조합하였다. 재조합된 DNA 조각은 pJK-dhfr-mL1-Fc 발현 벡터의 EcoRI과 XhoI 사이에 클로닝하였으며, 얻어진 마우스 L1CAM monomer 발현 벡터를 pJK-dhfr-mL1-S1이라 명명하였다. 이 플라스미드를 HEK293T 세포에 형질감염하고 무혈청배지에서 배양한 후 상층액을 모은 후 CNBr 세파로스(Amersham Phamacia, 영국)에 KR127 항체를 결합시켜 만든 컬럼을 이용하여 친화성 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 제조하였다.
마우스 L1CAM-FC 항원은 마우스 L1CAM의 세포외 도메인과 인간 IgG1의 Fc 영역과의 융합단백질 형태로 제조하였다. 먼저 마우스 줄기세포주 SH-J1로부터 RT-PCR 과정을 통하여 증폭하고 클로닝하여 염기서열을 분석한 줄기세포 타입(암타입과 동일)의 L1CAM cDNA를 얻었다. 마우스 L1CAM의 세포외 부분만을 발현하는 벡터를 만들기 위하여 마우스 L1CAM의 아미노산 잔기 위치 1-1113에 해당하는 DNA 단편을 중합효소연쇄반응으로 증폭하였고, 여기에서 얻어진 DNA 단편을 아가로즈 겔 정제 키트(iNtRON, 대한민국)를 이용하여 분리 정제하였으며 인간 항체 IgG1 의 Fc를 가지고 있는 벡터인 pJK-dhfr2-Fc의 EcoRI과 XhoI 사이에 클로닝하였다. 상기에서 얻어진 발현 벡터 DNA를 pJK-dhfr-mL1-Fc라 명명하였다. 이 플라스미드를 HEK293T 세포에 형질감염하고 무혈청배지에서 배양한 후 상층액을 단백질 G 컬럼(Upstate, 미국)을 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행하여, 마우스 L1CAM-Fc를 정제하여 제조하였다.
( 실시예 1-3) 인간 및 마우스 L1CAM 에 모두 결합하는 Ab4 항체의 발굴
인간 L1CAM과 마우스 L1CAM을 동시에 인식하는 항체를 발굴하기 위하여 1차와 2차 패닝(panning)은 인간 L1CAM을 항원으로, 3차 패닝은 마우스 L1CAM-Fc를 사용하였다. 그 결과, 인간 L1CAM에 대하여는 2차 패닝 결과 양성 클론이 축적되기 시작하였으며 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM에 동시에 결합하는 클론은 3차 패닝 결과 얻을 수 있었다.
3차 패닝 후 용출된 파지들을 104, 105, 106배로 희석하여 E. coli TG1에 감염시킨 후 2YTA 고체배지에 도말하여 37℃ 항온기에 넣고 밤새 키웠다. 125개의 콜로니를 무작위로 선택하여 각각 2YTA 액체 배지 5㎖에 접종하고 37℃ 항온기에서 흔들면서 각 클론의 흡광도가 600nm에서 0.7 과 0.8 사이가 될 때까지 키웠다. 그 다음, IPTG를 최종 농도 1mM로 가하고 30℃ 항온기에서 밤새 흔들면서 키운 후, 배양 상층액을 회수하여 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM을 동시에 인식하는 항체를 검출하기 위한 간접 ELISA를 수행하였다.
인간 L1CAM과 마우스 L1CAM에 결합하는 21 개의 클론들을 선택하여 플라스미드 DNA를 분리한 후 제한효소 BstNI(Roche, 스위스)로 잘라 절단 단편의 길이가 다른 클론들을 그룹화한 후 서로 다른 단편 길이를 가진 클론들 6개(Ab4, Ab6, Ab8, Ab10, Ab12, Ab13)를 골라 염기서열을 분석한 결과, 이들이 서로 다른 클론임을 확인하였다.
상기 6개 다른 클론들의 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM에 대한 항원결합능을 분석하기 위하여 간접 ELISA를 수행한 결과 Ab4의 항원결합능이 가장 높음을 확인하였다
그 다음, Fab 형태의 Ab4를 whole Ig 형태로 전환하기 위하여 Ab4로부터 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 중합효소연쇄 반응에 의하여 증폭시켰고 1.5% 아가로즈 겔(Cambrex)을 통하여 분리한 다음 Zymo 겔 추출 키트(Zymoresearch, 미국)을 이용하여 정제하였다. 또한, 항체를 동물세포에서 발현 생산할 수 있도록 pdCMV-dhfrC(대한민국 특허 등록번호 제10-0476363호)로부터 중쇄와 경쇄의 리더 시퀀스를 PCR에 의하여 합성하고 분리하고 1.5% 아가로즈 겔(Cambrex) 과 Zymo 겔 추출 키트(Zymoresearch)를 통하여 분리 정제하였다. 그 다음 중쇄 리더 시퀀스와 중쇄 가변영역을, 경쇄 리더 시퀀스와 경쇄 가변영역을 각각 재조합(recombination) PCR을 이용하여 연결시켰고, 1.5% 아가로즈 겔(Cambrex) 과 Zymo 겔 추출 키트를 통하여 분리 정제하였다. 그 다음, 중쇄는 제한효소 EcoRI (Roche, 스위스)과 ApaI (Roche, 스위스)으로, 경쇄는 HindⅢ (Roche, 스위스)와 BsiWI(Roche, 스위스)로 잘라 동일한 제한효소로 절단하고 정제한 pdCMV-dhfrC 벡터의 중쇄와 경쇄 불변영역 위쪽에 각각 클로닝하고 pdCMV-dhfrC-Ab4라 명명하였다. 본 발명자들은 상기의 pdCMV-dhfrC-Ab4 발현벡터를 2008년 11월 21일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호; KCTC11431BP).
이와 같은 과정으로 수득한 Ab4 항체는 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 대해서 높은 결합능을 나타내는 항체로서, 서열번호 1인 중쇄 가변영역 및 서열번호 5인 경쇄 가변영역을 포함한다.
( 실시예 1-4) Ab4 항체의 에피토프 분석
L1CAM의 세포외 도메인에는 6개의 Ig-like domain(Ig1, Ig2, Ig3, Ig4, Ig5, Ig6)과 5개의 FnIII domain(Fn1, Fn2, Fn3, Fn4, Fn5)의 11개의 도메인이 포함되어있으므로, Ab4가 결합하는 도메인을 확인하기 위하여, 인간 L1CAM-Fc와 대한민국 특허출원 제10-2006-0107428호에 기재된 L1CAM 결손 변이체들인 L1Ig(1-6)Fc, L1Ig(1-5)Fc, L1Ig(1-4)Fc, L1Ig(1-3)Fc, L1Fn(1-5)Fc 단백질들을 8% SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)시킨 후, PVDF 막(Millipore, 한국)으로 옮겨 웨스턴 블럿을 하였다. 이때 Ab4 항체를 1차 항체로, anti-hIgG(Fc)-HRP (Pierce, 1/5000)를 2차 항체로 사용하였으며 ECL 시약(Amersham Biosciences)으로 검출시켰다. 그 결과 Ab4항체는 L1Fc, L1Ig(1-6)Fc, L1Ig(1-5)Fc에는 결합하지만, L1Ig(1-4)Fc, L1Ig(1-3)Fc, L1Fn(1-5)Fc에는 결합하지 않았다. 상기와 같은 결과는 Ab4가 L1CAM의 다섯번째 면역글로불린 도메인인 Ig5에 결합함을 의미한다.
실시예 2. Ab4 항체의 결합친화도 향상
실시예 1에서 제조한 Ab4 항체의 인간 L1CAM에 대한 친화도를 증진시키기 위하여 Ab4 항체의 가변영역을 구성하는 아미노산 각각이 Ab4 항체의 결합능에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 이를 위해서 Ab4 항체의 중쇄 가변영역(이하 'VH'로 표기하기로 함, 서열번호 1)의 HCDR1(서열번호 2), HCDR2(서열번호 3), HCDR3(서열번호 4) 및 경쇄 가변영역(이하 'VK'로 표기하기로 함, 서열번호 5) LCDR3(서열번호 8)를 구성하는 각각의 아미노산 잔기를 알라닌으로 치환한 후, 각 변이체의 인간 L1CAM 및 마우스 L1CAM에 대한 결합능을 ELISA 방법을 이용하여 기존 Ab4 항체와 하기와 같이 비교 분석하였다.
( 실시예 2-1) HCDRs 의 알라닌 치환 변이체의 제작 및 항원결합능 분석
Ab4 항체의 HCDR을 구성하는 각 아미노산 잔기를 알라닌(Alanine)으로 바뀌도록 프라이머를 제작하여 중합 효소 연쇄 반응을 통하여 치환한 후, 이 반응의 산물을 1.5% 아가로즈 겔에 전기영동한 다음 DNA가 있는 겔의 부분만을 잘라내 Zymo 겔 추출 키트 (Zymoresearch, USA)을 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA는 제한효소인 EcoR 및 Apa(Roche, German)을 사용해 양 말단을 절단하고, 이 DNA 조각이 들어가게 될 pdCMV-dhfrC-Ab4 벡터(기탁번호 KCTC11431BP)의 DNA 또한 동일한 제한효소로 절단하여 이 두 DNA 조각을 T4 리가아제(TaKaRa, Japan)를 사용하여 연결하였고, 이와 같이 제작된 플라스미드 DNA를 대장균 DH5α에 형질전환시켜 증폭하였다.
각 변이체의 발현 벡터는 대량으로 얻어 Lipofectamine 2000(invitrogen)을 사용하여 인간 배아 신장 세포인 HEK293T 세포에 형질감염(transfection)하고, 이 세포를 배양하였다. 트랜스펙션으로 형질전환된 세포는 완전한 형태의 항체를 만들어 세포 바깥으로 내보내게 되는데 이 배양액의 상층액을 취하여 다음과 같이 간접 ELISA 실험을 수행하였다. 96-웰 플레이트(MaxiSorp, Nunc)에 정제된 인간 L1CAM의 세포외 도메인(이하 '인간 L1CAM'이라 표기함) 및 마우스 L1CAM의 세포외 도메인(이하 '마우스 L1CAM'이라 표기함)을 항원으로 사용하여 각각 100ng/웰의 농도로 코팅 완충용액(15mM Na2CO3, 34.84mM NaHCO3, pH 9.6)에 희석하여 4℃에서 하루 밤 동안 코팅한 후, 다음날 0.05% PBS-T 완충용액으로 두 번 씻어내었다. 0.05% PBS-T 완충용액에 Difco 스킴밀크(BD)를 2%의 농도로 녹여 각 웰에 200㎕씩 넣어준 후, 37℃에서 한 시간 동안 둔 뒤, 0.05% PBS-T 완충용액으로 두 번 씻어내었다. 여기에 상층액을 100㎕씩 넣어 37℃에서 한 시간 반응시킨 후, 0.05% PBS-T 완충용액으로 세 번 씻어내어 항원에 결합하지 못한 여분의 항체를 제거하였다. 2차 항체로는 인간 항체의 Fc 부위를 특이적으로 인지하는 Goat anti-human IgG(Fc)-HRP(Pierce, 1/5000)를 넣어주어 37℃에서 한 시간 반응시킨 후, 0.05% PBS-T 완충용액으로 네 번 씻어내어 여분의 2차 항체를 깨끗이 제거하였다.
친화도룰 발색반응으로 확인하기 위하여 2차 항체에 공유결합되어 있는 효소인 HRP의 기질인 TMB가 들어있는 용액(BD OptEIA, BD)을 웰 당 100㎕씩 넣고 상온에서 십 분간 기다렸다가 2.5 M H2SO4 용액을 웰 당 100㎕씩 넣어 효소 반응을 중단시켰다. 반응이 끝난 플레이트는 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다(VERSAmax microplate reader, Molecular Devices).
그 결과, 도 1a에 나타난 와 같이, 상기 간접 ELISA 실험 결과, 중쇄 가변영역 변이체들 Kabat 번호로 97번 아미노산 잔기(서열번호 1의 101번 아미노산 잔기)인 히스티딘을 알라닌으로 바꾼 변이체(이하 'H97A'라 표기함)의 경우 Ab4 항체에 비하여 인간 및 마우스 L1CAM에 모두에 대한 결합능이 증가하는 결과를 나타내었다.
( 실시예 2-2) LCDR3 의 알라닌 치환 변이체의 제작 및 항원결합능 분석
Ab4 항체의 LCDR3을 구성하는 각 아미노산 잔기를 알라닌으로 바뀌도록 프라이머를 제작하여 중합 효소 연쇄 반응을 통하여 치환한 후, 이 반응의 산물을 1.5% 아가로즈 겔에 전기영동한 다음, DNA가 있는 겔의 부분만을 잘라내 Zymo 겔 추출 키트 (Zymoresearch, USA)을 이용하여 정제하였다.
정제한 DNA는 제한효소인 BsiI 및 HindIII(Roche, German)를 사용해 양 말단을 절단하고, 이 DNA 조각이 들어가게 될 pdCMV-dhfrC-Ab4 벡터 또한 동일한 제한효소로 절단하여 이 두 DNA 조각을 T4 리가아제(TaKaRa, Japan)를 사용하여 연결하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드 DNA를 대장균 DH5α에 형질전환시켜 증폭하였다.
그 다음, 각 변이체를 상기 실시예 2-1에서와 같이 HEK293T 세포에 형질감염하고 완전한 형태의 IgG를 세포배양액으로부터 회수하여 ELISA 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이, 93번 아미노산 잔기인 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 변이체(D93A)가 Ab4 항체에 비하여 인간 및 마우스 L1CAM에 대한 결합능이 증가하는 것을 확인하였다.
( 실시예 2-3) 항원결합능이 증가된 Ab4 변이체(Ab4M)의 제작
Ab4 항체의 VH 및 VK의 아미노산 서열을 Ab4 항체가 유래한 인간 항체 VH 생식세포계열(germline) 서열인 VH3-30과 VL 생식세포계열 서열인 VK1-39과 비교하였다.
이 작업을 통해 기존 Ab4 항체의 경쇄 가변영역 FR3의 75번 발린(valine, V)과 84번 글리신(Glycine)을 생식세포계열 서열에 존재하는 이소류신(Isoleucine, I)과 알라닌(Alanine, A)으로 각각 치환하여 Ab4-V75I/G84A 변이체를 제작하였다.
또한, 상기 실시예 2-1에서 Ab4 VH의 V50A 변이체의 항원결합능이 Ab4 보다 더 떨어졌으므로(도 1a), 항원 결합능을 높일 수 있는 알라닌이 아닌 다른 아미노산 잔기를 알아보기 위하여, Ab4 VH의 50번 아미노산 잔기인 발린을 다시 글루탐산(V50E), 페닐알라닌(V50F), 아르기닌(V50R), 또는 트레오닌(V50T)으로 치환한 중쇄 변이체와 V75I/G84A 서열의 경쇄 변이체를 갖는 항체를 실시예 2-1에서와 같이 제작 및 발현하여 인간 및 마우스 L1CAM에 대한 항원결합능을 각각 분석하였고 그 결과를 도 1c에 나타내었다.
그 결과, 도 1c에 나타난 바와 같이, 페닐알라닌으로 치환된 변이체(V50F)의 경우, 다른 변이체와 달리 인간 및 마우스 L1CAM에 대한 항원결합능이 모두가 현저히 향상된 결과를 나타내었다.
추가적으로, 상기 V50F의 항원결합능을 더욱 향상시키기 위하여, 상기 실시예 2-1과 2-2에서 항원결합능이 Ab4보다 증가된 VK의 D93A 및 VH의 H97A 변이를 포함시켜, Ab4 항체에서 VK의 V75I, G84A, D93A 및; VH의 V50F, H97A의 변이를 갖는 변이체를 제작하였고, 이를 'Ab4M'이라 명명하였다. 또한, Ab4M의 서열을 갖는 발현 벡터를 pdCMV-dhfrC-Ab4M이라 명명하였다.
실시예 3. Ab4M 항체의 특성 분석
( 실시예 3-1) 항체의 정제
Ab4 항체와 실시예 2에서 제조한 Ab4M 항체 간의 항원결합 친화도를 비교분석하기 위하여 항체를 정제하였다. 또한, Ab4의 VH의 H97A 변이체(VH H97A), V50F/H97A 변이체(VH V50F/H97A), VK의 D93A 변이체(VK D93A)도 정제하였다. 이 항체들의 발현 벡터의 플라스미드 DNA를 각각 대량으로 얻어 상기 실시예 2-1에서와 같이 HEK293T 세포에서 발현시킨 후, 배양액을 원심분리하여 상층액 만을 모았다. 모아진 상층액은 친화성 크로마토그래피 방법으로 정제하였다. 단백질 A가 결합되어 있는 비드가 들어있는 컬럼에 상층액을 통과시키고, 0.1 M 시트르산(pH3.2) 용액으로 단백질 A에 붙어있는 Ab4M 항체를 떼어내고 떨어진 항체는 곧바로 1.0M 트리스 용액(pH8.0)을 넣어 중화시킴으로써 항체의 구조를 유지하였다. 정제된 항체는 10% SDS-PAGE를 수행한 후, 쿠마시 방법으로 염색하여 중쇄와 경쇄가 각각 잘 발현되고 또한 IgG 형태로 조립되었음을 확인하였다.
( 실시예 3-2) 항체의 친화도 측정
정제된 항체의 인간 L1CAM에 대한 친화도를 경쟁적 ELISA 방법으로 측정하였다. 인간 L1CAM은 PBS 완충용액에 각각 1 X 1-6M의 농도로 만들고 1 X 1-11M의 농도까지 순차적으로 희석하고, 각 항체는 결합능에 따라 PBS 완충용액에 특정 농도로 희석하여 준비하였다. 희석된 항원과 항체는 동일한 부피 비율로 섞어 상온에서 2시간 동안 반응하였다.
96-웰 플레이트(MaxiSorp, Nunc)에 분리 정제한 인간 L1CAM를 100ng/웰의 농도로 코팅 완충용액(15mM Na2CO3, 34.84 mM NaHCO3, pH9.6)에 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅한 후, 다음날 0.05% PBS-T 완충용액으로 두 번 씻어내었다. 0.05% PBS-T 완충용액에 Difco 스킴밀크(BD)를 2%의 농도로 녹여 각 웰에 200㎕씩 넣어준 후, 상온에서 한 시간 동안 둔 뒤, 0.05% PBS-T 완충용액으로 두 번 씻어내었다. 여기에 2시간 반응시킨 항원과 항체 반응물을 100㎕씩 넣어 상온에서 한 시간 반응시킨 후, 0.05% PBS-T 완충용액으로 세 번 씻어내어 항원에 결합하지 못한 여분의 항체를 제거하였다. 2차 항체로는 인간 항체의 Fc 부위를 특이적으로 인지하는 Goat anti-human IgG(Fc)-HRP (Pierce, 1/5000)를 넣어주어 상온에서 한 시간 반응시킨 후, 0.05% PBS-T 완충용액으로 네 번 씻어내어 여분의 2차 항체를 깨끗이 제거하였다. 친화도룰 발색반응으로 확인하기 위하여 2차 항체에 공유결합되어 있는 효소인 HRP의 기질인 TMB가 들어있는 용액(BD OptEIA, BD)을 웰 당 100㎕씩 넣고 상온에서 십 분간 기다렸다가 2.5M H2SO4 용액을 웰 당 100㎕씩 넣어 효소 반응을 중단시켰다. 반응이 끝난 플레이트는 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고 (VERSAmax microplate reader, Molecular Devices), 그 결과를 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, Ab4의 인간 L1CAM에 대한 친화도는 1.3 x 10-7M, Ab4의 VH H97A 변이체의 친화도는 2.9 x 10-8M, VH V50F/H97A 변이체의 친화도는 1.8 x 10-8M, VK D93A 변이체의 친화도는 3.0 x 10-8M, Ab4M의 친화도는 2.9 x 10-9M를 나타내어, 본 발명의 Ab4 항체의 변이체들이 모두 우수한 친화도를 나타냄을 확인하였으며, 그 중에서도 Ab4M은 Ab4의 친화도에 비하여 약 45배 증가되는 결과를 나타내어, 인간 L1CAM에 대하여 우수한 결합능을 가짐을 확인하였다.
또한, 도 2c에 나타난 바와 같이, Ab4 및 Ab4M의 마우스 L1CAM에 대한 친화도를 측정한 결과, 각각 1.7 x 10-9M 및 2.2 x 10-10M로 나타나, Ab4M의 친화도가 Ab4보다 약 8배 증가하였음을 확인하여, 본 발명의 Ab4M 항체가 Ab4 항체에 비하여 인간 및 마우스 L1CAM에 대하여 모두 우수한 결합능을 가짐을 확인하였다.
( 실시예 3-3) Ab4M 의 항원결합 특이성 분석
Ab4M 항체가 인간 및 마우스 L1CAM에만 선택적으로 결합하는지 알아보기 위하여 여러 종류의 세포를 이용한 유세포 분석(Flow cytometry)를 수행하였다. 이때 비교 항체로서는 인간 L1CAM에는 결합하나 마우스 L1CAM에는 결합하지 않는 키메릭 A10-A3 항체(cA10-A3, Lee et al., EMM 4:293-302, 2012)를 사용하였다.
또한, 인간 L1CAM을 발현하지 않는 세포로서 HEK293T, 췌장암 세포주 CFPAC (ATCC No. CRL-1918) 및 CHO-DG44(ATCC No. PTA-3356)를 배양하였고, 인간 L1CAM을 발현하는 세포로서 담도암 세포주 Choi-CK(Min et al., Clin Cancer Res. 16:3571-80, 2010), 인간 L1CAM을 과발현시킨 담도암 세포주 SCK-L1(Min et al., Clin Cancer Res. 16:3571-80, 2010) 및 마우스 L1CAM을 발현하는 세포로는 흑색종 세포주인 B16F1(ATCC No. CRL-6323)을 배양하였다. 배양한 세포는 해리 완충액(dissociation buffer, GIBCO, invitrogen)를 사용하여 수거한 다음, 1% PBA 용액에 다시 풀어 얼음에 20 분간 둔 뒤, 96-well RV 플레이트(Bioneer)에 웰 당 각 2x105개씩 넣어주었다.
정제한 Ab4M 항체는 PBS 용액에 10㎍/㎖의 농도로 희석하여 각 웰에 1㎍을 넣어 세포와 잘 섞어 얼음에서 한 시간 동안 반응시켰다. 이때, Ab4M의 음성 대조군으로 인간 IgG 항체(Pierce)를 동일한 조건으로 처리하였다. 2차 항체로는 인간 IgG의 Fc 부위에 특이적으로 결합하면서 FITC가 공유결합 되어 있는 항체(Sigma)를 각 웰 당 0.5㎍씩 넣어 잘 섞어준 후, 빛이 들어가지 않게 호일로 덮어 얼음에서 한 시간 반응시켰다. 여기에 마지막으로 세포 생존을 알아볼 수 있는 염색약인 PI를 1:100으로 처리하였다. 모든 반응이 끝난 세포는 FACS Calibur(BD)에서 FITC 및 PI 형광 신호를 읽었고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, Ab4M 항체가 L1CAM 음성 세포인 HEK293T, CFPAC 및 CHO-DG44에는 거의 결합하지 않고, L1CAM 양성 세포인 SCK-L1와 Choi-CK 및 B16F1에 확실히 결합하는 결과를 나타내었다. 또한, 대조군인, 마우스 L1CAM에는 결합하지 않고, 인간 L1CAM에 특이적으로 결합하는 cA10-A3 항체는 마우스 흑색종 세포주인 B166F1 세포에 결합하지 않는 결과를 나타내며, L1CAM을 발현하는 인간 세포주에만 결합하는 결과를 나타내어, 본 발명의 항체인 Ab4M 항체가 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 특이적으로 결합하는 항체임을 나타내었다.
( 실시예 3-4) Ab4M 의 ADCC ( antibody - dependent cellular cytotoxicity )에 의한 암세포 독성 측정
Ab4M 항체가 ADCC를 나타낼 수 있는지를 확인하기 위하여, 타겟 세포로는 SCK-L1 세포를, 효과기(effector) 세포로는 인간 PBMC 세포를 사용하여 LDH 어세이(lactate dehydrogenase assay, Cytotoxicity Detection Kit(LDH), Roche Applied Science)를 수행하였다.
구체적으로, 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 타겟 세포인 SCK-L1 세포(5x103 cells)를 포함한 RPMI-1640 배지(phenol red free, 1% FBS 포함) 50㎕씩 넣고, 여기에 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 및 0㎍/㎖의 농도의 Ab4M 항체 용액 25㎕를 가하여 섞고 15분 동안 배양하였다(37℃, 5.0% CO2). 여기에 방금 분리한 인간 PBMC(1.5x105 cells)가 들어있는 25㎕의 RPMI-1640 배지(phenol red free, 1% FBS 포함)를 넣어주고 4시간 동안 배양기에서 배양하였다(37℃, 5.0% CO2). 항체의 ADCC 효능에 의해 용해된 타겟 세포로부터 나오는 LDH 활성을 측정하기 위하여 LDH 어세이 키트에 포함되어 있는 반응 시약을 웰 당 100㎕씩 넣고 5분간 상온에서 배양하였다. 이후 각 웰에 키트에 포함되어 있는 반응 중단 시약을 50㎕씩 넣어준 후 10 초간 흔들어 잘 섞어주었다. 실험이 끝난 96-웰 조직 배양 플레이트는 492nm 파장에서 OD(optical density)를 읽었다.
PBMC와 항체에 의한 타겟세포의 특이적 세포 독성(ADCC)는 다음과 같은 식을 사용하여 specific lysis(%) 값을 계산하였다:
Specific lysis(%) = [(specific release-nonspecific release)/(maximum release-spontaneous release)] X 100.
이 식에서, specific release는 타겟 세포와 효과기 세포와 항체를 다 넣고 반응시킨 시료로부터 얻어진 OD 값을 말하고, nonspecific release는 타겟 세포와 효과기 세포만을 넣은 시료로부터 얻어진 OD 값을 말하며, maximum release는 타겟 세포를 키트에서 제공하는 세포 용해 시약으로 배양한 시료로부터 얻어진 OD 값을 말하며, spontaneous release는 타겟 세포와 항체만을 넣은 시료로부터 얻어진 값을 말한다.
그 결과, Ab4M의 농도가 증가함에 따라 SCK-L1 세포에 대한 ADCC 효능이 증가함을 하는 결과를 나타내어, Ab4M이 ADCC를 통하여 암 세포에 독성을 나타내어 암 치료 효과를 나타낼 수 있음을 시사하였다.
( 실시예 3-5) Ab4M 의 암 성장 저해 효능 분석
Ab4M 항체의 항암 효능을 알아보기 위하여, 누드마우스(BALB/c Slc-nu, SPF, 중앙실험동물)에 인간 유래 담도암 세포주인 Choi-CK세포를 주입하여 종양괴를 만들고, 약 100mm3 크기의 종양괴를 다시 누드마우스에 이식한 후 1주일 후부터 각 10마리씩 Ab4M 항체나 음성대조군으로서 Synagis 항체를 각각 10 mg/kg dose로 일주일에 세 번씩 4주 동안 정맥 내(i.v.) 주사하였고, 종양 크기를 도 5a에 마우스의 체중을 도 5b에 각각 나타내었다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, Ab4M 항체는 누드마우스의 체중을 감소시키지 않으면서도 암 성장을 매우 효과적으로 저해시키는 결과를 나타내었다.
실시예 4. Ab417 항체의 제조
Ab4M 항체의 L1CAM에 대한 친화도를 보다 더 향상시키기 위하여, Ab4M의 VK LCDR3의 변이체들을 scFv 형태로 효모 표면 발현(yeast surface display)시킨 후, 친화도가 더 좋은 변이체를 분리하였다.
( 실시예 4-1) Ab4M scFv 의 효모 표면 발현 확인
Ab4M의 scFv를 제조하여 효모 디스플레이 발현 벡터(pYD1, invitrogen)에 클로닝하였다. PCR을 통하여 Ab4M 항체의 VH 및 VK를 합성하고, 기존 scFv 서열에 존재하는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3를 암호하는 유전자서열을 합성한 후, 이 DNA 조각들을 재조합 PCR 방법으로 연결하여 scFv 유전자를 합성하였다. pYD1 DNA는 SphI 및 EcoRI으로 절단하였으며, 절단 후 아가로즈 젤에서 분리하고, 앞서 합성한 scFv DNA 조각과 1:5의 비율로 동시에 효모 균주인 EBY100(Invitrogrn)에 형질전환하여 효모 내에서 상동 재조합 과정을 통해 연결되도록 하였다. 형질전환으로 얻어진 효모 형질전환체는 갈락토오즈가 들어있는 배지에 접종하여 18 내지 36시간 배양하여 scFv 형태의 Ab4M 항체가 발현되도록 하였다.
36 시간 후, 효모 세포만을 따로 모아 1x PBS 완충용액에 0.1% 농도로 BSA를 넣어 만든 0.1% PBA 완충용액에 씻어준 뒤 1x10-5 내지 1x10-8 M로 순차 희석한 인간 L1CAM의 Ig5 도메인-Fc 융합단백질을 넣어 상온에서 한 시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 효모 세포는 다시 0.1% PBA 완충용액에 씻어주고 항원에 특이적으로 결합하는 항체인 goat-anti-human IgG(Fc)-FITC를 1:5000의 농도로 넣어 상온에서 한 시간 반응하였다. 반응이 끝난 후 효모 세포는 0.1% PBA 완충용액에 잘 씻어준 후, FACS Calibur (BD)에서 FITC 신호를 측정함으로써 scFv 형태의 Ab4M 항체의 항원 결합능을 측정하였고, 그 결과를 도 6a에 나타내었다.
그 결과, 항원의 농도가 높아질수록 scFv 형태의 Ab4M 항체가 더욱 잘 결합하는 것을 확인할 수 있었는데, 이로써 Ab4M 항체가 scFv 형태로 잘 발현됨은 물론 발현된 Ab4M의 scFv가 항원에 대한 결합능을 유지하고 있는 것을 확인하였다(도 6a).
( 실시예 4-2) Ab4M scFv 서열의 변이 및 효모 표면 발현
친화도가 높은 Ab4M의 변이체를 얻기 위하여 LCDR3를 구성하는 열 개의 아미노산 중 항원과 직접적으로 상호작용할 것으로 생각되는 일곱 개의 아미노산 잔기(T91, H92, A93, T94, R95, Q95a, 및 Y96)를 무작위로 치환하였다. 일곱 개의 아미노산을 지정하는 코돈을 XYZ(X는 38% G, 19% A, 26% T, 17% C; Y는 31% G, 34% A, 17% T, 18% C; Z는 24% G, 76% C를 지정)로 치환하는 프라이머(IDT, USA)를 합성하여 PCR하였다. 이때 PCR의 정확도를 높이기 위하여 Prime STAR(TAKARA, Japan) 폴리머라아제를 사용하였다.
PCR은 먼저 주형 DNA를 94℃에서 5분간 미리 변성(denaturation)시켰다. 그 다음, 94℃에서 30초간 변성시키고 55℃에서 30초간 프라이머를 주형 DNA에 결합할 수 있도록 한 뒤 72℃에서 30초간 DNA를 합성할 수 있도록 하는 과정을 25번 반복하였다. 25번의 반복 반응이 끝나면 72℃에서 7분간 DNA 연장 과정이 좀 더 일어나도록 하였다. 상기 PCR 과정을 통하여 얻은 DNA 조각을 SphI 및 EcoRI으로 절단한 효모 디스플레이 발현 벡터와 함께 효모 EBY100에 형질전환하였다. 형질전환한 효모 세포들은 각 10, 102, 105, 1010배로 희석하여 트립토판이 들어있지 않은 배지에 깔고 2일 동안 30℃에서 배양하여 형성된 콜로니의 개수를 세었다. 이렇게 얻어진 라이브러리의 다양성은 최종 2x109이었다
이 라이브러리로부터 인간 L1CAM에 대한 결합능을 가지는 변이체들만 골라내기 위해 MACS(magnetic-activated cell sorting)를 수행하였다. 형질전환체들을 갈락토오즈가 포함된 배지에 접종하여 18 내지 36 시간 키워 효모 표면에 scFv를 발현시킨 후, 효모 세포를 모아 0.1% PBA 완충용액에 씻어준 뒤 1x10-7 M로 희석한 인간 L1CAM의 Ig5-Fc를 넣어 상온에서 한 시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 효모 세포는 다시 0.1% PBA 완충용액에 씻어주고 항원에 특이적으로 결합하는 Protein G magnetic beads(NEB)를 넣어 수시로 섞어주면서 4℃에서 한 시간 동안 반응하였다. 이렇게 반응이 끝난 변이체들은 마그네틱 비드 때문에 자성을 띠게 되는데, 이것을 자성을 띤 지지대(QuadroMACSTM Separation Unit, Miltenyi Biotec)에 컬럼(MACS Separation Columns, Miltenyi Biotec)을 고정하여 통과시키면, 인간 L1CAM 항원에 결합능을 가지는 변이체만 컬럼에 결합하게 되고, 컬럼을 지지대에서 분리하면 결합되어 있던 변이체 만을 얻을 수 있게 되었다. 이렇게 얻어진 인간 L1CAM에 결합능을 가지는 변이체는 1.37x107개였다.
이들 변이체로부터 Ab4M보다 인간 L1CAM에 대해 향상된 결합능을 가지는 변이체들을 선별하기 위해 FACS sorting 하였다. 상기 실시예 3-1의 Ab4M scFv를 사용한 FACS 실험에서 인간 L1CAM의 농도가 1x10-8M일 때까지 항원에 대한 결합능을 보였기 때문에 분류에 사용할 항원의 농도는 5x10-9M로 결정하였다. MACS를 거쳐 얻어진 변이체들을 앞선 방법과 동일하게 scFv를 발현시키고, 효모 세포를 모아, 5x10-9M 농도로 항원을 결합시킨 후 FITC로 염색하여 FACS Aria(BD)로 분류하였다. 이때 친화도가 향상된 변이체들만을 선별하기 위해 전체 변이체들 중 상위 0.1% 결합능을 가지는 변이체들만을 분류하도록 게이트 지정하였다. 총 두 번의 분류를 수행하였으며, 분류 결과 얻어진 변이체들 중 최종적으로 48개의 서로 다른 서열을 가지는 변이체들을 얻을 수 있었다.
48개의 변이체를 각각 발현시켜 항원에 대한 결합능과 scFv의 효모 표면 발현 정도를 분석하였다. 48개의 효모 클론을 각각 발현시키고 5x106개의 효모 세포를 모아 0.1% PBA에 2번 세척하였다. 여기에 항원인 인간 L1CAM의 Ig5-Fc를 1x10-8M로 넣고 세포를 잘 풀어준 뒤 상온에서 한 시간 두어 scFv와 항원이 결합하도록 하였다. 이것을 0.1% PBA로 2회 세척하였다. ScFv의 표면 발현 정도를 확인하기 위하여 V5 tag을 특이적으로 인지하는 래빗 항체(abcam, 1.00㎎/㎖)를 발현시킨 효모에 결합시키고, 이 항체를 특이적으로 인식하는 anti-mouse IgG-Cy5 항체(abcam, 0.50㎎/㎖)로 염색하였다.
또한 항원 결합능을 확인하기 위해서는 Ig5-Fc(1x10-8M)을 결합시키고 anti-human IgG(Fc)-FITC(Pierce, ㎎/㎖)로 염색하였다. 이것을 4℃에서 한 시간 반응시킨 뒤 0.1% PBA로 3번 세척하였다. 모든 반응이 끝난 효모 세포는 다시 모아 0.1% PBA에 풀어준 뒤, FACS Calibur(BD)에서 FACS를 수행하였다. FACS 실험 결과, Ab4M scFv의 발현 정도와 유사하나 항원에 대한 결합능이 증가한 변이체를 확인할 수 있었으며, 이 변이체를 'Ab4M-18'이라 명명하였다.
Ab4M 및 Ab4M-18의 scFv 발현 정도 및 항원 결합능을 비교 분석한 결과를 도 6b에 나타내었다. 구체적으로, 도 6b에서 세로축의 값이 증가할수록 발현이 잘 되며, 가로축의 값이 증가할수록 항원에 대한 결합능이 높다는 것을 의미한다. 즉, Up-Right(UR) 분면에 위치하는 개체가 많을수록 발현이 잘 되고 항원에 대한 결합능도 높다고 볼 수 있는데, Ab4M scFv에 비해 Ab4M-18 scFv의 결과에서 UR분면에 위치한 개체 비율이 높은 것을 확인할 수 있고, 따라서 항원에 대한 결합능이 증가한 것임을 알 수 있다. 따라서 상기 결과는 Ab4M-18의 경우, 항원 결합능 및 발현 정도가 Ab4M에 비하여 우수한 결과를 나타낸다는 것을 시사하는 결과이다.
( 실시예 4-3) Ab4M -18 항체의 코돈 최적화 및 발현량 증가 확인
상기 Ab4M-18 항체의 포유동물 세포에서의 발현량을 증가시키기 위해 Ab4M-18 항체의 중쇄 및 경쇄 코돈을 포유동물 세포에 대해 최적화하였다. Ab4M-18의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 토대로 EnCor Biotechnology Inc. 홈페이지 (http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm)에서 포유동물 세포에 최적화된 뉴클레오티드 서열 정보를 얻었으며, 이것을 토대로 IDT(U.S.A)에 경쇄 및 중쇄 유전자의 합성 의뢰하였다.
합성 완료된 코돈 최적화(codon-optimized)된 중쇄 불변영역 유전자는 ApaI과 NotI으로 양 말단을 절단하여 pdCMV-dhfrC-Ab4M의 ApaI-NotI 위치에 클로닝 하였으며, 코돈 최적화된 VH 유전자는 EcoRI과 ApaI으로 양 말단을 절단하여 코돈 최적화된 중쇄 불변영역이 들어있는 벡터에 클로닝 하였다. 그 결과 얻어진 벡터의 BsiWI-XbaI 위치에 합성 완료된 코돈 최적화된 경쇄 불변영역 유전자를 BsiWI과 XbaI으로 양 말단을 절단하여 서브클로닝 하였으며, 이 벡터의 HindIII-BsiWI 위치에 코돈 최적화된 VK 유전자를 HindIII와 BsiWI으로 양 말단을 절단하여 서브클로닝 하였다. 이 결과 얻어진, 코돈 최적화된 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 함유하고 있는 발현벡터를 pdCMV-dhfrC-Ab417이라 명명하였다.
완성된 pdCMV-dhfrC-Ab417 벡터를 상기 실시예 2에서와 같이 HEK293T 세포에 형질감염한 후, 무혈청 배지를 사용해 배양하였고, 상층액 만을 모아 샌드위치 ELISA 방법으로 인간 IgG를 표준으로 하여 발현량을 알아본 결과, 약 20% 정도의 발현량이 증가하는 결과를 나타내었다. 상기 pdCMV-dhfrC-Ab417 벡터로부터 발현된 IgG를 'Ab417' 항체라 명명하였다.
실시예 5. Ab417 항체의 친화도, 특이성 및 효능 분석
( 실시예 5-1) Ab417 항체의 생산 및 정제
pdCMV-dhfrC-Ab417 플라스미드 DNA를 키트(HiSpeed Plasmid Maxi Kit, QIAGEN)를 사용하여 대량 분리 정제하였다. 얻어진 플라스미드 DNA 10㎍, PEI (polyethyleneimine) 40㎍을 각각 150 mM NaCl(pH 5.4) 용액 500㎕에 희석한 뒤, 두 가지를 잘 섞어 상온에서 15 분간 두었다. 이것을 100 mm2 플레이트에 2x105 cells/㎖로 배양한 HEK293T 세포(70 내지 80% 밀도)에 골고루 뿌려주고 37℃, 5.0% CO2 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 6시간 후 배양액을 모두 제거하고 무혈청 배지 10㎖을 사용하여 세포를 배양하고, 3일, 6일 후 상층액 만을 취하였다. 모아진 상층액으로부터 실시예 2에서와 동일한 방법으로 항체를 정제하였다. 정제된 항체의 순도를 Bioanalyzer로 분석하였다.
( 실시예 5-2) Ab417 항체의 친화도 측정
정제된 Ab417 항체의 인간 L1CAM에 대한 친화도를 실시예 3-2에서와 동일한 방법으로 경쟁적 ELISA를 통하여 측정하였다. 그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, Ab417 항체의 인간 L1CAM에 대한 친화도는 1.2x10-9M를 나타내어 Ab4M의 친화도(2.9 x 10-9M)에 비하여 2.4배 증가하였으며, Ab4의 친화도(1.3x10-7M)에 비하여 약 100배 증가하였음을 알 수 있었다.
또한, 도 2c에 나타난 바와 같이, Ab417 항체의 마우스 L1CAM에 대한 친화도를 측정한 결과, 2.1x10-10M로 나타나, Ab4M의 마우스 L1CAM에 대한 친화도(2.2x10-10 M)와 동일하였으며, Ab4의 친화도(1.7x10-9M)보다 약 8배 증가하였음을 확인하였다. 이 결과로부터, 본 발명의 Ab417 항체가 Ab4 항체에 비하여 인간 및 마우스 L1CAM에 대하여 매우 우수한 결합능을 가짐을 확인하였다.
경쟁적 ELISA 방법과는 별도로, Ab417 항체와 Ab4M 항체의 인간 및 마우스 L1CAM에 대한 친화도를 SPR(surface plasma resonance) 방법으로 Octet RED(ForteBio, USA) 기기를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 의하여 측정하였다. 항체를 PBS에 2㎍/㎖의 농도로 희석하여 준비하고, 인간 L1CAM은 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 0nM의 농도로 PBS에 순차적으로 희석하고, 마우스 L1CAM은 30, 10, 3.3, 1.1, 0.37, 0.12, 0.04 및 0nM의 농도로 PBS에 순차적으로 희석하여 각 200㎕씩 빛이 통과하지 않는 불투명한 96-웰 플레이트에 넣어주었다. AHC(anti-human IgG Fc capture) 센서 칩이 PBS 용액, 항체, PBS 용액, 항원, PBS 용액의 순서로 옮겨가면서 항체에 항원이 결합했다가 떨어질 때 발생하는 굴절률의 변화를 통해 항체의 항원 결합 동역학(kinetics)을 분석하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 인간 L1CAM에 대한 Ab417 항체의 친화도(K D )는 0.18nM (Kon(1/Ms)=1.27x105;Kdis(1/s)=2.33x10-5)로 나타났으며, Ab4M의 친화도는 0.33nM (Kon(1/Ms)=1.30x105;Kdis(1/s)=4.30x10-5)로 나타났다. 또한 마우스 L1CAM에 대한 Ab417 항체의 친화도(K D)는 34.8pM(Kon(1/Ms)=2.33x105;Kdis(1/s)=8.10x10-6)로 나타났으며, Ab4M의 친화도는 89.3pM(Kon(1/Ms)=2.49 x 105;Kdis(1/s)=2.22x10-5)로 나타났다. 이 결과는 Ab417 항체의 친화도가 Ab4M에 비해 약 2배 높은 친화도를 나타냄을 의미한다.
( 실시예 5-3) Ab417 항체의 특이성 분석
(실시예 3-2)에서와 동일한 방법으로 Ab417 항체의 항원에 대한 선택적 특이성을 유세포 분석 방법으로 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, Ab4M 항체와 마찬가지로 Ab417 항체 역시 인간 및 마우스 L1CAM에 대해 특이성을 가지는 항체임을 나타내어, Ab417 항체를 인간 및 마우스 L1CAM 모두에 결합하는 항체로 이용할 수 있음을 시사하였다.
( 실시예 5-4) Ab417 항체의 ADCC 에 의한 암세포 독성
Ab417 항체의 ADCC 활성을 측정하기 위하여 상기 실시예 3-4와 같이 타겟 세포로는 SCK-L1 세포를, 효과기 세포로는 인간 PBMC 세포를 사용하여 LDH 어세이를 수행하여 세포 독성을 관찰하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, Ab417은 농도가 증가함에 따라 SCK-L1 세포에 대하여 ADCC를 일으키는 효과가 증가하는 결과를 나타내었다. 상기와 같은 결과는 본 발명의 Ab417항체가 ADCC 활성이 있음을 의미하는 것으로, 본 발명의 항체를 이용하여 암의 치료에 효과적으로 사용할 수 있음을 시사하는 것이다.
( 실시예 5-5) Ab417 의 암 성장 저해 효능 분석
Ab417 항체의 항암 효능을 검증하기 위해 상기 실시예 3-5에서와 같이 담도암 모델을 제작하고 각 10마리씩 인간 IgG Fc(대조군, 3.3㎎/㎖) 또는 Ab417 항체(실험군, 10mg/kg)를 주 3회, 총 9회 투여하면서 항암 효능이 있는지 관찰하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
그 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 인간 IgG Fc를 투여한 그룹보다 본 발명의 Ab417 항체를 투여한 그룹에서 유의성 있게 암 성장의 저해가 크게 나타났으며, 또한 투여 종료 후 누드마우스 모델에서 종양을 적출하여 무게를 측정한 결과 대조군에서보다 약 63% 정도 종양의 무게가 적게 측정되는 결과를 보였다(도 9b). 뿐만 아니라, 투여 중 그 어느 개체에서도 체중이 줄어들지 않았으며, 물질 투여로 인한 독성 또한 관찰되지 않았다(도 9c).
따라서, 상기와 같은 결과는 L1CAM에 대한 높은 결합능을 가지는 본 발명의 항체가 암의 예방 및 치료에 있어서 매우 효과적으로 사용될 수 있음을 시시하는 것이다.
실시예 6. Ab417 항체의 변이체 제조 및 특성 분석
( 실시예 6-1) Ab417 - H6L2 및 Ab417 - H5L1 변이체의 제조
Ab417 항체의 생산성을 높이기 위하여 Ab417 항체 가변영역의 물리화학적 성질을 개선하고자 항체 가변영역 표면의 아미노산 잔기 몇 개를 다른 잔기로 치환하여 생산성이 더 좋은지 확인하였다. 치환된 아미노산 잔기 및 클로닝 과정은 다음과 같았다.
Ab417 항체의 VH에서 16번 아르기닌을 글리신으로(R16G), 76번 리신을 알라닌으로(K76A), 88번 프롤린을 알라닌으로(P88A) 치환하였으며, 번역 후 변형이 일어날 가능성이 있는 것으로 판단된 54번 아스파라긴산을 글루탐산으로(D54E) 치환하였다. 이와 같이 R16G, D54E, K76A 및 P88A를 포함한 VH DNA를 합성하여 인간 중쇄 불변 영역(human C1)과 중합효소연쇄반응으로 연결하였다. 이 반응 산물을 1.0% 아가로즈 겔에 전기영동한 다음, 합성된 DNA가 있는 겔의 부분만을 잘라내 Zymo 겔 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제한 중쇄 DNA는 제한효소인 EcoRI 및 NotI을 사용해 양 말단을 절단하고, 클로닝 벡터인 pcDNATM3.4(Life technologies)의 EcoRI - NotI 위치에 서브클로닝하여 pcDNATM3.4-Ab417-H6로 명명하였다. 또한 R16G, K76A, P88A를 포함한 VH DNA를 합성하여 인간 중쇄 불변 영역(human C1)과 중합효소연쇄반응으로 연결한 후 pcDNATM3.4의 EcoRI - NotI 위치에 서브클로닝하여 pcDNATM3.4-Ab417-H5로 명명하였다. 대장균 DH5에 도입된 pcDNATM3.4-Ab417-H6 와 pcDNATM3.4-Ab417-H5의 염기서열을 분석한 결과, 위 아미노산 잔기들이 치환된 것을 확인하였다.
Ab417 항체의 VK에서는 31번 이소류신을 세린으로 치환하여 만든 I31S 변이체를 경쇄 불변 영역(human C)과 중합효소연쇄반응으로 연결하였다. 이들 반응의 산물을 1.0% 아가로즈 겔에 전기영동한 다음, 합성된 DNA가 있는 겔의 부분만을 잘라내 Zymo 겔 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제한 경쇄 DNA는 제한효소인 HindIII 및 XbaI을 사용해 양 말단을 절단하고, 클로닝 벡터인 pcDNATM3.4의 HindIII - XbaI 위치에 서브클로닝하여 pcDNATM3.4-Ab417-L2로 명명하였다.
또한, Ab417의 pI 값을 낮추기 위하여, Ab417 VK에서 37번 아르기닌을 글루타민으로(R37Q), 39번 아르기닌을 라이신으로(R39K), 그리고 42번 라이신을 글루타민으로 치환한(K42Q) 변이체를 합성한 후 경쇄 불변 영역과 중합효소연쇄반응으로 연결하였다. 이 DNA 산물을 1.0% 아가로즈 겔에 전기영동한 다음, 합성된 DNA가 있는 겔의 부분만을 잘라내 Zymo 겔 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제한 경쇄 DNA는 제한효소인 HindIII 및 XbaI을 사용해 양 말단을 절단하고, pcDNATM3.4의 HindIII - XbaI 위치에 서브클로닝하여 pcDNATM3.4-Ab417-L1으로 명명하였다. 대장균 DH5에 도입된 pcDNATM3.4-Ab417-L2 와 pcDNATM3.4-Ab417-L1의 염기서열을 분석한 결과, 위 아미노산 잔기들이 치환된 것을 확인하였다.
( 실시예 6-2) Ab417 - H6L2 및 Ab417 - H5L1 변이체의 생산량 분석
Ab417 변이체인 Ab417-H6L2과 Ab417-H5L1의 생산성을 Ab417과 비교하였다. Ab417-H6L2 변이체를 발현하기 위하여, pcDNATM3.4-Ab417-H6 및 pcDNATM3.4-Ab417-L2 플라스미드 DNA를 PureYieldTM Plasmid Maxiprep System (Promega사)를 사용하여 대량 분리 정제한 후, HEK293T 세포에 실시예 5-1에서와 같은 방법으로 co-transfection시켰다. 또한, Ab417-H5L1 변이체를 발현하기 위하여 pcDNATM3.4-Ab417-H5 및 pcDNATM3.4-Ab417-L1 플라스미드 DNA를 분리하여 HEK293T 세포에 co-transfection시켰다. 이때 대조군인 Ab417 항체를 발현시키기 위하여 pcDNATM3.4-Ab417-H 및 pcDNATM3.4-Ab417-L를 분리하여 HEK293T 세포에 co-transfection시켰다.
형질감염된 세포를 배양한 3일 또는 6일 후 상층액을 취하여 실시예 2에서와 동일한 방법으로 항체를 정제하였다. 정제된 항체의 양을 측정하기 위하여 Nanodrop을 사용하였다.
그 결과, Ab417-H5L1 항체의 생산량은 Ab417에 비하여 증가하지 않았으나, Ab417-H6L2 항체의 생산량은 Ab417 항체에 비하여 약 2.5배 증가되었음을 확인하였다. 정제된 항체의 순도는 Bioanalyzer로 분석하였다.
( 실시예 6-3) Ab417 - H6L2 및 Ab417 - H5L1 변이체의 pI 값 분석
Ab417-H6L2와 Ab417-H5L1 변이체의 pI 값을 확인하기 위하여 pH gradient pre-cast gel인 IEF-PAG System(고마바이오텍)을 사용하여 pI 값을 측정하였다. 이때 대조군인 Ab417 항체의 pI도 같이 분석하였다. pH-gradient gel의 각 웰에 Ab417-H5L1, Ab417-H6L2 항체와 Ab417 항체를 각 5㎍씩 넣고, 이 젤을 양전하 완충용액과 음전하 완충용액을 채워 100V 전압에서 1 시간, 200V 전압에서 2 시간 내림으로써 등전기초점화하였다. 이 때 pI 값 표지로서 IEF Markers 3-10, SERVA Liquid Mix(SERVA Electrophoresis) 및 pI 값이 알려진 항체인 trastuzumab(Roche)을 함께 전기영동 하였다. 등전기초점화가 끝난 젤은 완충용액의 양전하 및 음전하 이온을 제거하기 위하여 3차 증류수로 10분씩 3회 씻어준 뒤, 10% tricloroacetic acid 용액에서 10분, 1% tricloroacetic acid 용액에서 16시간 동안 고정하였다. 고정이 끝난 젤은 3차 증류수로 10분씩 3회 씻어준 뒤, Coomassie Blue R-250을 사용하여 염색하고, 메탄올-아세트산 용액에서 탈색하여 남아있는 단백질 밴드를 관찰하였다.
그 결과 Ab417-H5L1, Ab417-H6L2 변이체의 pI 값은 Ab417 항체의 pI 값보다 감소한 것으로 나타났다(도 11 참조). 이러한 결과는, 항체 구조 표면의 아미노산 잔기 중 양전하가 많이 존재하면 음전하를 띤 분자와 응집될 수 있는 가능성이 높으므로, pI이 감소된 Ab417-H5L1, Ab417-H6L2 변이체의 물성이 Ab417 항체보다 더 좋을 수 있음을 의미하는 것이다.
( 실시예 6-4) Ab417 - H6L2 및 Ab417 - H5L1 변이체의 친화도 분석
Ab417-H6L2와 Ab417-H5L1 변이체의 항원결합능을 Ab417과 비교하기 위하여 인간 L1CAM을 항원으로 사용하여 ELISA 방법을 수행하였다.
그 결과, Ab417-H6L2, Ab417-H5L1의 항원결합능은 Ab417과 유사한 것으로 나타났다.
결론적으로, Ab417-H6L2 변이체는 Ab417 항체보다 생산성이 더 증가되었고 pI 값이 더 낮았으며, Ab417-H5L1 변이체는 Ab417 항체보다 pI 값이 더 낮았으나, 인간 L1CAM에 대한 결합능은 Ab417과 동일하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Antibody specifically binding to L1CAM in humans and mice, and use thereof <130> PA131171KR <150> KR 10-2012-0130590 <151> 2012-11-16 <160> 33 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of Ab4 <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg His Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of a heavy chain variable region of Ab4 <400> 2 Arg Phe Gly Met His 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of a heavy chain variable region of Ab4 <400> 3 Val Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a heavy chain variable region of Ab4 <400> 4 Gly Arg His Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of Ab4 <400> 5 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ile Tyr 20 25 30 Val Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr His Asp Thr Arg Gln 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of a light chain variable region of Ab4 <400> 6 Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ile Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of a light chain variable region of Ab4 <400> 7 Ala Ala Ser Asn Leu His Ser 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a light chain variable region of Ab4 <400> 8 Gln Gln Thr His Asp Thr Arg Gln Tyr Thr 1 5 10 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of a heavy chain variable region of V50F <400> 9 Phe Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a heavy chain variable region of H97A <400> 10 Gly Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a light chain variable region of D93A <400> 11 Gln Gln Thr His Ala Thr Arg Gln Tyr Thr 1 5 10 <210> 12 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of Ab4M and Ab417 <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of Ab4M <400> 13 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ile Tyr 20 25 30 Val Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr His Ala Thr Arg Gln 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of Ab417 <400> 14 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ile Tyr 20 25 30 Val Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Gly Arg Gly Val 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 of Ab417 <400> 15 Gln Gln Ser Ile Gly Arg Gly Val Val Thr 1 5 10 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 (H6) <400> 16 Phe Ile Ser Asn Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 (L2) <400> 17 Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ser Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region (H6) <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Asn Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Ala Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region (L2) <400> 19 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Gly Arg Gly Val 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region (H5) <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Ala Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region (L1) <400> 21 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ile Tyr 20 25 30 Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Gly Arg Gly Val 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFR1 <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFR2 <400> 23 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFR3 <400> 24 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFR4 <400> 25 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFR1 (H6) <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 27 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFR3 (H6) <400> 27 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Ala Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 28 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR1 <400> 28 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR2 <400> 29 Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 30 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR3 <400> 30 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR4 <400> 31 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR2 (L1) <400> 32 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Ser Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR3 (Ab4M) <400> 33 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30

Claims (24)

  1. (i) 서열번호 2의 중쇄 CDR1; (ii) 서열번호 9의 중쇄 CDR2, 또는 서열번호 9의 중쇄 CDR2에서 5번째 아미노산인 아스파라긴산이 글루탐산으로 치환된 중쇄 CDR2; 및 (iii) 서열번호 10의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    (iv) 서열번호 6의 경쇄 CDR1, 또는 서열번호 6의 경쇄 CDR1에서 8번째 아미노산인 이소류신이 세린으로 치환된 경쇄 CDR1; (v) 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 및 (vi) 서열번호 11의 경쇄 CDR3 또는 서열번호 15의 경쇄 CDR3 중 어느 하나인 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 인간 L1CAM(L1 cell adhesion molecule) 단백질에 결합하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 10으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 12의 중쇄 가변영역 및 서열번호 13의 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 10으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 12로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 14로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  6. 제4항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 20으로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 16으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 10으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 17로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 18로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 19로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 16으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 10으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 18의 중쇄 가변영역 및 서열번호 21의 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 10으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 17로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 20의 중쇄 가변영역 및 서열번호 19의 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 22인 중쇄 FR1(framework region 1), 또는 서열번호 22에서 16번째 아미노산인 아르기닌이 글리신으로 치환된 중쇄 FR1 중 어느 하나인 중쇄 FR1; 서열번호 23인 중쇄 FR2; 서열번호 24인 중쇄 FR3, 또는 서열번호 24인 중쇄 FR3에서 10번째 아미노산인 라이신이 알라닌으로 치환되고 22번째 아미노산인 프롤린이 알라닌으로 치환된 중쇄 FR3 중 어느 하나인 중쇄 FR3; 및 서열번호 25인 중쇄 FR4를 포함하고,
    경쇄 가변영역은 서열번호 28인 경쇄 FR1; 서열번호 29인 경쇄 FR2 또는 서열번호 29에서 3번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환되고, 5번째 아미노산인 아르기닌이 라이신으로 치환되고, 8번째 아미노산인 라이신인 글루타민으로 치환된 경쇄 FR2; 서열번호 30인 경쇄 FR3 또는 서열번호 30에서 19번째 아미노산인 발린이 이소류신으로 치환되고 28번째 아미노산인 글리신이 알라닌으로 치환된 경쇄 FR3; 및 서열번호 31인 경쇄 FR4를 포함하는 것인 항체.
  14. (i) 서열번호 2의 중쇄 CDR1; (ii) 서열번호 3의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR2에서 1번째 아미노산인 발린이 페닐알라닌으로 치환된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3의 중쇄 CDR2에서 1번째 아미노산인 발린이 페닐알라닌으로 치환되고 5번째 아미노산인 아스파라긴산이 글루탐산으로 치환된 중쇄 CDR2로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 CDR2; 및 (iii) 서열번호 4의 중쇄 CDR3, 또는 서열번호 4의 중쇄 CDR3에서 3번째 아미노산인 히스티딘이 알라닌으로 치환된 중쇄 CDR3 중 어느 하나인 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    (iv) 서열번호 6의 경쇄 CDR1, 또는 서열번호 6의 경쇄 CDR1에서 8번째 아미노산인 이소류신이 세린으로 치환된 경쇄 CDR1; (v) 서열번호 7의 경쇄 CDR2; 및 (vi) 서열번호 8의 경쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR3에서 5번째 아미노산인 아스파라긴산이 알라닌으로 치환된 경쇄 CDR3, 및 서열번호 15의 경쇄 CDR3로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 인간 L1CAM(L1 cell adhesion molecule) 단백질에 결합하는 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  16. 제15항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  17. 제16항의 발현 벡터가 도입된 형질전환체.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 암은 담도암, 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 및 다발성 골수종 혈액암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 이용하여, 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 L1CAM (L1 cell adhesion molecule) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암 진단용 조성물.
  22. 제21항의 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
  23. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체에 약물이 결합된, 항체-약물 결합체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 약물은 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 및 186Re으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 방사성 핵종, 또는 에토포시드 테이포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 그 동족체, 블레오마이신류, 에스페라이미신류, 5-플루오로우라실, 및 멜팔란으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 약물인 항체-약물 결합체.

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