KR101502797B1 - 신규한 양친매성 고리형 펩티드, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 안정한 자기조립 나노전달체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 양친매성 고리형 펩티드, 이를 포함하는 안정한 자기조립 나노구조체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 고리형 양친매성 펩티드를 포함하는 자기조립 나노구조체는 열적 안정성이 우수하며, 종래 선형 펩티드 양친매성 물질에서 관찰되지 않는 속박된(constrained) 구조를 가져서 특이적인 나노 자기조립체를 만들 수 있으므로, 다양한 약물의 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 양친매성　고리형 펩티드, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 안정한 자기조립 나노전달체{Novel amphiphilic cyclic peptides,　method for the preparation thereof and stable self-assembly nano-carrier comprising the same}

본 발명은 신규한 양친매성 고리형 펩티드, 이를 포함하는 안정한 자기조립 나노구조체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

입자성 약물　전달체는 오일, 지질, 계면활성제 또는 천연 및 합성 고분자를 사용하여 제조되는 에멀전, 리포솜, 나노입자 형태의 구조체로서 지금까지 입자성 약물　전달체의 제조, 특성 규명, 약물 봉입에 관한 수많은 연구가 이루어져 약물 전달체로서의 가능성이 충분히 입증되어왔다. 대표적인 예로서 리포솜(liposome)과 폴리머솜(polymersome)이 가장 많이 사용되고 있으며, 그 외에 나노 에멀젼, 고형지질 나노입자 그리고 초가변형 나노 입자 등이 있고, 최근에는 생체를 모방으로 하는 분산계, 초분자, 고분자, 액정 등의 소프트 재료의 나노구조 형성과 기능 발현에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

자기조립은 나노기술의 원천기술로서, 분자들 간에 서로 밀치거나 당기는 힘을 인위적으로 조절하여 재현 가능한 나노구조를 자발적으로 형성하도록 한 것이다. 이러한 자기조립 기술은 질병진단에 응용되는 바이오칩, 나노튜브를 비롯한 전자재료 및 신소재 분야, 고집적 반도체 제조에 필요한 나노구조체 제조 등에서 기술적 융합을 통해 발전될 가능성이 큰 분야이다.

펩타이드 기반의 자기조립 물질들은 특정 분자에 대한 뛰어난 인지능력과 다양한 화학적 특성, 생체친화적이라는 장점 때문에 이를 이용한 새로운 나노소재 개발, 특히 나노 바이오 분야에서 응용이 기대되고 있다. 또한, 펩티드는 단백질과 동일한 화학적 구조로 되어 있으나, 길이는 짧고, 단백질에 비해 보다 쉽게 합성과 대량생산이 가능하고 더 넓은 화학적 다양성을 갖는다는 사실을 포함하여 몇 가지 이점이 있다. 그러나, 펩티드와 펩티드 에피토프는 짧은 사슬 길이와 열역학적 불안정성 때문에 통상 구조화되지 않아 특이적 분자 인식의 경우와 같이 정확하고 안정한 배좌가 요구될 때에는 유용성이 제한되기도 한다.

이에 반하여 고리형 구조를 갖는 거대 고리형 분자는 그 위상 특징이 거대 고리형 분자의 화학적, 물리적 및 생물학적 성질에 크게 영향을 줄 수 있고, 특히 고리형 분자에 대응되는 선형 분자보다 강직하고 형태적으로 제약된 구조를 보다 효과적으로 유지할 수 있는 장점이 있다.

현재까지 다양한 유형의 펩티드 양친매성 물질이 개발되어 왔고 많은 생물학적 응용분야에서 유용한 것으로 보고되어 왔으며, 고리형 분자의 독특한 성질에도 불구하고, 지금까지 개발된 모든 펩티드 양친매성 물질은 구성 단위로서 선형 펩티드 분자를 사용하고 있다. 그러나, 상기 선형 펩티드가 일반적으로 불안정한 배좌를 갖기 때문에 선형 펩티드 양친매성 물질로부터 자기-조립된 나노구조체 또한 구조 안정성에 있어서 제한되는 경향이 있다.

따라서, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 고리형 펩티드를 이용한 양친매성 물질을 제조하고, 이를 포함하는 안정한 자기조립 펩티드 나노구조체, 즉, 경우에 따라서는 자연계 중에서 과거에 없었던 기능을 새로이 나노구조체에 부여 하거나 기존 성질의 개선, 강화를 통하여 천연 단백질의 다양한 생물학적 기능을 모방 또는 대체할 수 있는 자기조립 펩티드 나노구조체를 제조하고, 이를 약물의 전달체로 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 신규한 고리형 양친매성 펩티드 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 상기 고리형 양친매성 펩티드를 포함하여 다양한 약물전달체로 활용이 가능한 자기조립 2중 나노전달체와 상기 나노전달체를 포함하는 질환 진단용 영상화제를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,

하기 [구조식 1]로 이루어지는 고리형 양친매성 펩티드를 제공한다:

[구조식 1]

R _l -X _m -W _n -Y _o

상기 [구조식 1]에서,

상기 X 및 Y는 각각 동일하거나 상이하며, 아르기닌, 트립토판, 시스테인, 히스티딘, 이소루신, 메티오닌, 세린, 발린, 알라닌, 글리신, 루신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민 중에서 선택되고,

상기 R은 아르기닌이며,

상기 W는 트립토판이고,

상기 l, m, n 및 o는 각각 독립적으로 2 내지 20의 정수이다.

또한, 본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,

(a) 고체상에 연결된 펩티드를 합성하는 단계로써, 첫 번째 아미노산 서열인 아미노 말단이 보호기로 보호된 Arg(pbf)-OH 또는 Gly-OH을 제조하는 단계;

(b) 상기 Arg(pbf)-OH 또는 Gly-OH 말단에 아미노산을 순서대로 합성하여 상기 [구조식 1]로 표시되는 펩티드를 포함하는 사슬형 펩티드를 제조하는 단계; 및

(c) 상기 사슬형 펩티드 서열의 마지막 아미노산의 말단의 보호기를 제거하여 고리화시키는 단계;를 포함하는 고리형 양친매성 펩티드의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 고리형 양친매성 펩티드를 포함하여 약물전달체로 활용이 가능한 자기조립 2중 나노전달체를 제공하고, 나아가서 상기 나노전달체를 포함하는 질환 진단용 영상화제를 제공한다.

본 발명에 따른 고리형 양친매성 펩티드를 포함하는 자기조립 나노구조체는 열적 안정성이 우수하며, 종래 선형 펩티드 양친매성 물질에서 관찰되지 않는 속박된(constrained) 구조를 가져서 특이적인 나노 자기조립체를 만들 수 있으므로, 다양한 약물의 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 일 실시예의 나노구조체 분자모형을 나타내는 개념도이다.
도 2는 본 발명에 따른 일 실시예의 수중 펩티드 양친매성 물질의 나노구조 형상을 나타내는 TEM 및 AFM 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따른 일 실시예의 고리형 펩티드 양친매성 물질의 자기-조립 거동 특성을 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 일 실시예의 HeLa 세포에서의 세포독성 양상을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은 하기 [구조식 1]로 이루어지는 고리형 양친매성 펩티드에 관한 것이다.

[구조식 1]

R _l -X _m -W _n -Y _o

상기 [구조식 1]에서,

상기 X 및 Y는 각각 동일하거나 상이하며, 아르기닌, 트립토판, 시스테인, 히스티딘, 이소루신, 메티오닌, 세린, 발린, 알라닌, 글리신, 루신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민 중에서 선택되고, 바람직하게는 글루타민 및 세린 중에서 선택되며,

상기 R은 아르기닌이고,

상기 W는 트립토판이며,

상기 l, m, n 및 o는 각각 독립적으로 2 내지 20의 정수이다.

본 발명에 따라 상기 [구조식 1]로 이루어지는 고리형 양친매성 펩티드는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 고리형 양친매성 펩티드의 제조방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

(a) 고체상에 연결된 펩티드를 합성하는 단계로서, 첫 번째 아미노산 서열인 아미노 말단이 보호기로 보호된 Arg(pbf)-OH 또는 Gly-OH를 제조하는 단계;

(b) Arg(pbf)-OH 또는 Gly-OH 말단에 아미노산을 순서대로 합성하여 상기 [구조식 1]로 표시되는 펩티드를 포함하는 사슬형 펩티드를 제조하는 단계;

(c) 상기 사슬형 펩티드 서열의 마지막 아미노산의 말단의 보호기를 제거하여 고리화시키는 단계.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (a)의 보호기는 9-플루오렌일메톡시카르보닐(Fmoc), 2-(페닐술포닐)에톡시카르보닐, 트리메틸실릴에톡 시카르보닐(Teoc), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸페닐술포닐(Mtr), 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 페닐아세틸, 벤조일, 톨루일, 페녹시아세틸, 메톡시카르보닐, 에톡시카로보닐, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, tert-부틸카바메이트(t-Boc), 2-요오도에톡시카르보닐,아릴옥시카르보닐(Aloc), 카르복시벤질(CBZ), 4-메톡시벤질 옥시카르보닐(MOZ) 및 4-니트로벤질옥시카르보닐 중에서 선택되는 1종이고, 보다 바람직하게는 9-플루오렌일메톡시카보닐(Fmoc)이다.

또한, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (b)의 사슬형 펩티드는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (b)의 보호기로 보호된 Arg(pbf)-OH 또는 Gly-OH 말단에 아미노산을 합성하는 방법은 아마이드 결합의 반복을 통해 수행할 수 있다. 구체적으로, 고체상에 연결된 첫 번째 아미노산의 아미노말단(N-terminal)과 새롭게 도입되는 아미노산의 카르복시 말단(C-terminal) 사이에 물(H₂O) 분자가 빠지면서 결합하는 아마이드 결합의 반복을 통하여 사슬형 펩티드를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (c)의 사슬형 펩티드를 고리화하기 위한 마지막 아미노산의 말단의 보호기를 제거하는 반응은 피페리딘 (piperidine)을 사용하여 제거할 수 있다. 구체적으로, 고체상에 연결된 사슬형 펩티드를 레진에서 제거한 후, 아미노산 말단의 보호기를 제거하는 반응을 통해 고리형 양친매성 펩티드를 얻을 수 있다.

한편, 상기 사슬형 펩티드를 레진에서 제거하는 방법은 아세트산, 삼불화에탄올 및 이염화메탄을 2:2:6의 비율로 혼합한 혼합용매를 사용할 수 있다.

또한, 아미노산 말단의 보호기는 피페리딘(piperidine)을 디메틸포름아미드 (DMF)에 첨가하여 제거되는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 측면은 상기 고리형 양친매성 펩티드를 포함하는 자기조립 2중 나노전달체에 관한 것이고, 그 형태는 미셀 형태 또는 소낭 형태인 것을 특징으로 한다.

종래 선형 펩티드 양친매성 물질은 불규칙적인 물체로 응집하는 경향이 있는 반면에, 본 발명의 양친매성 고리형 펩티드는 축을 따라 연장된 배좌를 형성하여 친수성과 소수성 단위가 2층 구조로 서로 적층된 트립토판의 인돌 고리가 연결됨으로서, 미셀 또는 소낭 형태의 규칙적인 구체가 형성된다.

상기 자기조립 2중 나노전달체는 직경이 10 내지 100 nm인 것을 특징으로 하고, 그 크기가 10 nm 미만인 경우, 혈관 내 간극을 빠져나가거나, 신장을 통해 쉽게 배출되는 문제점이 있고, 100 nm를 초과하는 경우에는 간에 축적되거나, 대식세포에 의해 나노전달체가 제거될 수 있는 문제점이 있다.

상기 자기조립 2중 나노전달체는 다양한 약물을 전달할 수 있는 약물전달체로 활용이 가능하다. 본 발명에 따른 자기조립 2중 나노전달체는 친수성과 소수성 특징을 가지는 이중막으로 구성되어 있고, 상기 나노전달체의 이중막에 소수성 약물을 담지시킬 수 있는 구조로 형성되어 있는 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명에 따른 자기조립 2중 나노전달체 내에는 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 무기 물질, 항생제, 항암제, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제. 항히스타민제, 국소 마취제, 항혈관형성제, 혈관활성제, 항응고제, 면역조절제, 세포독성제, 항체, 신경전달물질, 정신작용약, 올리고누클레오티드, 지질, 세포, 조직, 암 화학요법제 및 백신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 약물을 봉입할 수 있는 것을 특징으로 한다.

특히, 상기 약물은 소수성 약물인 것이 바람직하고, 일례로, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 시스플레틴, 카보플래틴, 5-FU, 에토포시드, 캄토테신의 항암제; 테스토스테론, 에스트로젠, 에스트라다이올의 성호르몬; 트리암시놀론 아세토나이드, 하이드로코티손, 덱사메타손, 프레드니솔론, 베타메타손의 스테로이드 유도체; 사이클로스포린; 또는 프로스타글란딘 등의 소수성 약물을 마이셀의 소수성 부분에 로딩할 수 있다. 이때, 소수성 약물이 로딩되면 해당 약물의 전달체로서, 약물의 전달효율이 더욱 향상된다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 자기조립 2중 나노전달체를 포함하는 질환 진단용 영상화제에 관한 것이다.

상기 영상화제는 나노전달체 내에 MRI 및 CT 조영제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종을 봉입하여 사용할 수 있다.

이때, 상기 MRI 조영제는 상자성 물질, 가돌리늄과 망간의 착화합물 형태로서, Gd-DTPA, Gd-DTPA-BMA, Gd-DOTA, Gd-DO3A 및 초상자성 물질인 산화철 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이고, 상기 PET 조영제로서 방사성 동위원소 ¹⁸F, ¹²⁴I, ⁶⁴Cu, ⁹⁹ _mTc 및 ¹¹In 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이고, 킬레이트 DOTA 및 DTPA 착화합물 형태로서 나노전달체에 도입 가능하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되지는 않음은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명할 것이다.

< 실시예 1> 사이클로필린 A-1( CyPA -1)의 제조

단계 1: Fmoc - Arg ( pbf )- OH 또는 Gly - OH 의 제조

고체상으로 이루어진 2-클로로트리틸 레진에서 본 발명의 펩티드 서열의 첫 번째 아미노산인 Fmoc-Arg(pbf)-OH 또는 Gly-OH를 우선적으로 합성하였다.

단계 2: 선형 Fmoc - Arg - Arg - Arg - Gly - Ser - Tri - Ser - Gly 의 제조

상기 단계 1에서 얻은 Fmoc-Arg(pbf)-OH 이후의 아미노결합을 이용한 아미노산들의 합성은 Protein Technologies, Inc사의 Tribute™ 펩티드 합성기를 이용하여 합성하였다.

본 단계에서는 Fmoc과 보호기가 함께 존재하는 아미노산을 이용하여 펩티드를 합성하였다. 특히, 레진에 합성된 아미노산의 아미노 말단(N-말단/-NH₂)과 새롭게 합성되는 아미노산의 카르복시 말단(C-말단/-COOH) 사이에 물 분자(H₂O)가 빠지면서 결합하는 아마이드 결합(-CO-NH-)의 반복을 통하여 사슬형 펩티드를 우선적으로 합성하였다.

단계 3: 고리형 펩타이드의 제조

합성이 종료된 사슬형 펩티드를 고리형 펩티드로 합성하기 위하여 사슬형 펩티드 서열의 마지막 아미노산의 아미노 말단의 Fmoc보호기를 제거한다. 펩티드를 레진에서 분리하기 위하여 아세트산(AcOH)/삼불화에탄올(TFE)/이염화메탄(MC)를 2:2:6의 비율로 혼합한 혼합 용매를 사용하여 처리하였다. 1-2 시간 이후 여과법을 통해 용매를 여과시킨 후 남은 고체상의 레진은 버리고 여과액만 취하였다. 동일한 방법을 3번 정도 반복하여 시행하였다. 여과액에 헥세인을 첨가하여 여과액에 남아있을 수 있는 아세트산을 공비증류하여 제거하였다. 보호기가 결합된 펩티드는 MC, 헥세인을 첨가하고 이를 증발시키는 과정을 순차적으로 반복하면서 흰색 분말의 형태로 얻은 후, 상기 흰색 분말의 펩티드를 고리화하기 위하여 보호기가 결합 되어있는 선형 펩티드와 펩티드의 몰수와 비례하여 2 내지 10배의 DIPEA를 5 내지 10 mL의 DMF에 첨가한 후 이를 주사기에 옮겼다. 고배율로 희석된 조건을 얻기 위하여 펩티드가 포함된 DMF 용액을 PyBOP와 HOBt가 DMF에 혼합된 용액에 주사기 펌프를 통해 1분당 0.02 내지 0.10 mL의 저속으로 첨가하면서 동시에 용액을 교반하였다. PyBOP과 HOBt의 첨가량은 펩티드의 몰수와 비례하여 1 내지 5배의 양을 사용하였다. 첨가가 종료된 이후 충분한 반응을 위하여 5시간 이상 교반을 계속하였다. DMF를 증발시킨 후 남은 잔여물을 MC에 녹인 후 tert-부틸 메틸 에테르/헥산의혼합물을 첨가하여 분말화시키고 얻어진 분말과 용액을 분리하는 방법을 3회 반복하였다. 얻어진 물질은 삼불화아세트산(TFA)/삼이소 프로필실렌(TIS)/물(H₂O)이 95:2.5:2.5의 비율로 혼합된 보호기 제거 혼합 용액을 3-4시간 정도 처리하여 보호기를 제거하였다. 보호기가 제거된 합성물을 분말화하기 위하여 tert-부틸 메틸 에테르를 일정량 처리하였다. 보호기 제거 혼합 용액과 tert-부틸 메틸 에테르는 각각 반응 후 비활성 기체 (Ar₂)로 불어서 완전히 제거하였다. 합성이 완료된 선형/고리형 펩타이드는 역상 HPLC를 사용하여 정제 작업을 진행하고 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용하여 분자량을 비교하는 방법으로 합성을 확인하였다. 합성된 펩티드의 농도는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 트립토판의 몰흡광계수 값을 통해 계산하였다.

< 실시예 2> 사이클로필린 A-2( CyPA -2)의 제조

상기 실시예 1에서 구조식 R _l -X _m -W _n -Y _o 을 사용하는 대신 l과 n값에 대하여 l+1 또는 l-1, n+1 또는 n-1과 같이 새로운 정수 값을 부여하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 수행하여 사이클로필린 A-2를 제조하였다.

< 실험예 1> 특성 실험

(1) 투과전자현미경 측정( TEM )

본 발명에 따른 상기 실시에 1의 고리형 펩티드를물에 용해시키고(5-50 μM), 이들의 나노구조 형상을 투과전자현미경법(TEM)에 의해 조사하였다.

하기 도 2에 나타나 있는 바와 같이, 대조군 1로서, 선형 펩티드 양친매성 물질 liPA-1은 불규칙한 형상의 나노응집체라는 것을 알 수 있으며(도 2a 참조), 이와는 대조적으로 본 발명에 따른 고리형 펩티드 양친매성 물질 cyPA-1(실시예 1)은 직경이 약 11 nm인 규칙적 형상의 구형 물체로서 관찰되었다(도 2b).

또한, 대조군 2로서, 선형 펩티드 양친매성 물질인 liPA-2와 본 발명에 따른 실시예 2의 고리형 펩티드 양친매성 물질인 cyPA-2(실시예 2)는 자기-조립하는 도중에 유사한 경향성이 관찰되었다(그림 2c와 2d).

그러나, 대조군(liPA-2)의 응집체는 불규칙적인 형상을 나타내는 반면에, 실시예 2(cyPA-2)의 응집체는 구형 물체가 균질하게 집단을 이루는 것이 관찰되었다(직경 약 11 nm).

(2) 원자힘현미경 ( AFM ) 측정

사슬 길이가 자기-조립 거동에 영향을 미치는지 여부의 문제를 다루기 위하여 원자힘현미경(AFM)을 이용하여 측정하였다.

원자간력 현미경법(AFM)으로 조사하였더니 구형의 형상과 균질성이 추가로 입증되었다(도 2e).

따라서, 이로부터 선형과 고리형 펩티드 양친매성 물질의 자기-조립 거동이 서로 상당히 다르다는 것을 명백히 알 수 있다. 선형 펩티드 양친매성 물질은 불규칙적인 물체로 응집하는 경향이 있는 반면에, 고리형 펩티드 양친매성 물질은 규칙적인 구체를 형성한다.

(3) 원평광이색성 분광( CD ) 측정

본 발명에 따른 실시예 1 및 2의 고리형 펩티드 양친매성 물질과 대조군 1 및 2의 선형 펩티드 양친매성 물질의 자기-조립 거동을 펩티드의 배좌를 통해 알아보기 위하여 원평광이색성 분광(Circular Dichroism)을 측정하였다.

그 결과, 하기 도 3에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2(cyPA-2)와 대조군(liPA-2)의 원평광이색성 분광 스펙트럼은 뚜렷한 최소 타원율 200-203 nm로 나타내는 것이 확인되었다. 이는 펩티드가 주로 무질서한 코일 상태로 존재하고 명확하게 정의된 2차 구조를 갖지 않는다는 것을 의미하고, 또한 이 2종의 펩티드들은 약 223-224 nm에서 음의 대역을 강하게 나타내었다. 이들 대역은 인돌이 서로 적층되어 있는 방향족 발색단에 의해 발생되는 여기자 결합으로부터 예상되는 트립토판의 거동인 것으로 판단된다.

특히, 하기 도 3a 에 나타낸 바와 같이, 대조군 2(liPA-2)의 온도-의존성 CD 스펙트럼은 224 nm에서 평균 잔기 타원율의 급격한 선형 감소를 나타내었다. 고온(84 ℃)에서 정규화 응집도는 4 ℃에서 정규화 응집도에 비해 62%로 감소되었으나, 본 발명에 따른 실시예 2(cyPA-2)의 경우 223 nm에서 타원율은 54 ℃ 이상에서 더 이상 감소하지 않았으며 응집도는 84 ℃의 고온에서도 약 82%로 유지되었다(도3b 참조).

따라서, 본 발명에 따른 고리형 펩티드 양친매성 물질이 선형 펩티드 양친매성 물질과 동일한 응집 메커니즘을 이용한다 하더라도 선형 펩티드 양친매성 물질보다 더 견고하고 열적 안정성이 우수한 나노구조체를 형성하는 것이 확인되었다.

(4) 형광 분광 측정( Fluorescence spectroscopy )

한편, 트립토판에 있는 인돌 발색단은 국소 환경의 특성에 매우 민감하므로 단백질 배좌 변화와 다른 분자와의 상호작용을 조사할 때 트립토판의 고유 형광을 이용할 수 있다. 이에, 트립토판 잔기에서 발생하는 형광을 측정하기 위하여 280 nm에서 여기되어 발생된 형광을 측정하였다. 이는 다양한 농도의 펩티드에서 형광 분광 측정을 통하여 합성된 펩티드가 나노 구조를 자기조립하기 시작하는 최소의 한계 농도를 구할 수 있음을 이용하였다.

펩티드 농도 함수로서 350 nm에서의 형광 세기를 그래프화한 것을 도 3c 및 3d에 그래프로 나타낸 결과, 대조군 2(liPA-2)와 본 발명에 따른 실시예 2(cyPA-2) 2종 모두 0.1 μM 내지 20 μM 범위의 농도에서 농도에 따라 트립토판 형광의 뚜렷한 증가가 관찰되었다. 소정 농도 이상에서는 상기 2종의 펩티드의 형광 세기가 급증하였고, 이러한 불연속적인 세기 변화는 아마도 응집의 개시와 임계 응집 농도(CAC)를 반영하는 것으로 판단되었다.

또한, 선형 회귀선의 교차점을 이용하여 펩티드의 CAC를 계산한 결과, 이 계산을 통해 liPA-2와 cyPA-2에 대한 CAC는 각각 5.7 μM와 3.3 μM임을 알 수 있다. 고리형 펩티드 양친매성 물질에 대한 CAC 값은 대응되는 선형의 펩티드 양친매성 물질에 대한 CAC 값보다 약간 더 낮았지만 그 차이는 유의적이지 않았다.

한편, 본 발명에 따른 실시예 2의 경우에 분자 길이는 약 2.5-3.0 nm로, 펩티드 배좌에 따라 다르며, 이러한 분자 길이를 구형 미셀 모형에 피팅하면 관찰된 구형 나노-물체의 직경(약 11 nm)보다 훨씬 작은 대략 5-6 nm 직경의 미셀이 얻어지는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명에 따른 실시예 1(cyPA-1)의 자기-조립된 구형 나노-물체의 직경 또한 소낭 모형에 잘 들어맞는다.

상기 소낭 모형은 펩티드의 분자 길이와 잘 부합하는데, 고리형 펩티드는 축을 따라 연장된 배좌를 형성하여 친수성과 소수성 단위와 2층 구조로 서로 적층된 트립토판의 인돌 고리를 연결하고, 상기 인돌 잔기의 적층은 CD 데이터와 잘 일치하는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명에 따른 고리형 펩티드 양친매성 물질의 분자 길이를 고려했을 때 특이적으로 작은 2층 소낭 나노구조체로 자기-조립될 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 고리형 펩티드 양친매성 물질의 독특한 자기-조립 거동, 높은 열적 안정성과 상당히 작은 소낭 구조의 형성은 이들의 제약된 구조와 자기-조립 과정 중에 고리형 위상의 엔트로피적 이점에 기인하는 것으로 보인다.

< 실험예 2> 세포독성 검사( Cytotoxticity Assay )

선형과 고리형 펩티드 양친매성 물질의 자기-조립 거동을 규명한 후, 이들 양친매성 물질이 포유류 세포와 상호작용하는 방식을 조사하고 잠재적인 세포 응용분야에서 이들의 차별화된 세포독성 양상을 얻는 것이 중요하다. 이를 위해, 합성된 펩티드의 세포 내에서 독성의 유무를 확인하기 위하여 WST-1 분석법을 이용하여 HeLa 세포에서 수행하였다.

계대배양된 HeLa 세포의 세포주에 대해서 세포 독성 검사를 수행하였다. HeLa 세포를 10 % FBS (Fetal Bovine Serum)이 첨가된 DMEM에서 계대배양하여 10⁴개의 세포를 취한 후 이에 대하여 다양한 농도의 펩티드를 첨가한 후 배양한 후, 일정 시간 후 WST-1 용액을 첨가하고, 4시간 이후 450 nm에서의 흡광도 측정을 통해 세포독성 검사 값을 얻었다.

그 결과, 하기 도 4에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 고리형 펩티드 cyPA-2 및 대조군으로서, 선형 펩티드인 liPA-2는 2종 모두 시험 농도 범위 내에서 독성이 확인되지 않았으며, 유사한 수준의 세포독성을 나타내었다.

이러한 유사한 수준의 세포독성 양상은 종래 안정한 분자 조립체는 세포 표면에 대한 각 양친매성 성분들의 자유로운 확산을 방지하고 펩티드 양친매성 물질의 세포독성은 이들의 CAC에 크게 비례한다는 것이 밝혀진 바, 본 발명에 따른 양친매성 고리형 펩티드와 선형 펩티드의 CAC가 유사하기 때문인 것으로 판단된다.

<110> Yonsei University <120> Novel amphiphilic cyclic peptides, method for the preparation thereof and stable self-assembly nano-carrier comprising the same <130> HPC-3212 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyPA-1 <400> 1 Arg Arg Arg Gly Ser Trp Trp Trp Trp Ser Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyPA-2 <400> 2 Arg Arg Arg Arg Gly Ser Trp Trp Trp Trp Ser Gly 1 5 10

Claims (10)

1. 삭제
2. 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 고리형 양친매성 펩티드.
3. 고리형 양친매성 펩티드의 제조방법에 있어서,
   (a) 고체상에 연결된 펩티드를 합성하는 단계로서, 첫 번째 아미노산 서열인 아미노 말단이 보호기로 보호된 Arg(pbf)-OH 또는 Gly-OH를 제조하는 단계;
   (b) 상기 Arg(pbf)-OH 또는 Gly-OH 말단에 아미노산을 순서대로 합성하여 아미노 말단이 보호기로 보호된 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어지는 사슬형 펩티드를 제조하는 단계; 및
   (c) 상기 단계 (b)의 사슬형 펩티드 서열의 마지막 아미노산 말단의 보호기를 제거하여 고리화시키는 단계;를 포함하는 고리형 양친매성 펩티드의 제조방법.
4. 삭제
5. 제3항에 있어서,
   상기 단계 (b)의 Arg(pbf)-OH 또는 Gly-OH 말단에 아미노산을 합성하는 방법은 아마이드 결합의 반복을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 고리형 양친매성 펩티드의 제조방법.
6. 제3항에 있어서,
   상기 단계 (c)의 사슬형 펩티드를 고리화하기 위한 마지막 아미노산의 말단의 보호기 제거는 디이소프로필에틸아민(DIPEA)를 사용하여 제거하는 것을 특징으로 하는 고리형 양친매성 펩티드의 제조방법.
7. 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어지는 고리형 양친매성 펩티드를 포함하는 자기조립 2중 나노 전달체로서, 형태가 미셀 형태 또는 소낭 형태이고, 직경이 10-100 nm인 것을 특징으로 하는 자기조립 2중 나노전달체.
8. 제7항에 있어서,
   상기 나노전달체 내에 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 무기 물질, 항생제, 항암제, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제. 항히스타민제, 국소 마취제, 항혈관형성제, 혈관활성제, 항응고제, 면역조절제, 세포독성제, 항체, 신경전달물질, 정신작용약, 올리고누클레오티드, 지질, 세포, 조직, 암 화학요법제 및 백신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 약물을 봉입할 수 있는 것을 특징으로 하는 자기조립 2중 나노전달체.
9. 제7항에 따른 자기조립 2중 나노전달체를 포함하는 질환 진단용 영상화제.
10. 제9항에 있어서,
    상기 질환 진단용 영상화제는 상기 자기조립 2중 나노전달체 내에 MRI 또는 PET 조영제를 봉입하고,
    상기 MRI 조영제는 가돌리늄과 망간의 착화합물 형태로서, Gd-DTPA, Gd-DTPA-BMA, Gd-DOTA, Gd-DO3A 및 초상자성 물질인 산화철로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이며,
    상기 PET 조영제는 방사성 동위원소 ¹⁸F, ¹²⁴I, ⁶⁴Cu, ⁹⁹ _mTc 및 ¹¹In로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 킬레이트 DOTA 또는 DTPA 착화합물 형태인 것을 특징으로 하는 질환 진단용 영상화제.

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