KR101500613B1 - Discrimination method for rice genetic resource and primers for discrimination of rice having amylose content - Google Patents
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Abstract
본 발명은 벼 유전자원을 판별하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 벼 식물의 아밀로스 함량과 관련성이 알려지지 않은 유전자 및 상기 유전자의 변이를 포함하는 단일염기다형을 사용하여 신속하고 정확하며 간단히 판별할 수 있는 벼 유전자원 판별방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for discriminating rice genetic resources, and more particularly, to a method for discriminating rice genetic resources quickly, accurately and simply by using a gene having unknown relation with the amylose content of a rice plant and a single base polymorphism including a mutation of the gene The present invention relates to a method for discriminating rice genetic resources.
Description
본 발명은 벼 유전자원을 판별하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 벼 식물의 아밀로스 함량과 관련성이 알려지지 않은 유전자 및 상기 유전자의 변이를 포함하는 단일염기다형을 사용하여 신속하고 정확하며 간단히 판별할 수 있는 고 벼 유전자원 판별방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for discriminating rice genetic resources, and more particularly, to a method for discriminating rice genetic resources quickly, accurately and simply by using a gene having unknown relation with the amylose content of a rice plant and a single base polymorphism including a mutation of the gene The present invention relates to a method for identifying a genome of a rice plant.
전분(starch)은 쌀, 옥수수 및 감자를 포함하는 많은 식물에서 중요한 저장성 다당류이며, 일반적으로 D-글루코스 동종중합체(D-glucose homopolymers)인 아밀로오스(amylose)와 아밀로펙틴(amylopectin)으로 구성된다. 아밀로오스는 선형 α-1,4 글루칸 쇄로 이루어지며, 아밀로펙틴은 α-1,6 결합에 의해 연결된 선형 α-1,4 글루칸쇄로 이루어진 분지된 분자이다. 아밀로펙틴의 구조는 전분 입자의 결정구성(crystalline organization)에 기여하고 좋은 아밀로펙틴 클러스터들은 종자(seed)의 가장 큰 부분을 이루는 알맞은 배유(endosperm) 전분을 형성하는데 기여한다.Starch is an important storage polysaccharide in many plants, including rice, corn and potatoes, and is generally composed of D-glucose homopolymers, amylose and amylopectin. Amylose is composed of linear α-1,4 glucan chains, and amylopectin is a branched molecule composed of linear α-1,4 glucan chains linked by α-1,6 linkages. The structure of amylopectin contributes to the crystalline organization of starch particles and good amylopectin clusters contribute to the formation of appropriate endosperm starch, which forms the largest part of the seed.
전분합성효소(SS)는 글루칸 사슬의 비환원 말단(non-reducing end)에서 ADP 글루코스(ADPGlc)의 글루코실 유닛(glucosyl unit) 전이를 촉매함으로써 선형 글루칸 사슬을 합성한다. 가지화효소(BE)는 폴리글루칸(polyglucan) 사슬에서 α-1,6 glucosidic 결합의 형성을 촉매하는 유일한 효소이며, 비가지화효소(DBE)는 폴리글루칸의 α-1,6 glucosidic 결합을 가수분해하는 것으로 알려져 있다.Starch synthase (SS) synthesizes a linear glucan chain by catalyzing the glucosyl unit transfer of ADP glucose (ADPGlc) at the non-reducing end of the glucan chain. Binding enzymes (BE) are the only enzymes that catalyze the formation of α-1,6 glucosidic bonds in the polyglucan chain. Non-glycosylation enzymes (DBE) hydrolyze α-1,6 glucosidic bonds of polyglucan .
고등식물에서는 5개의 전분합성효소, 1개의 GBSS(granule-bound starch synthase)와 4개의 가용성(soluble) 전분합성효소가 동정되었다. GBSS는 아밀로오스 사슬을 합성하며, GBSSI은 저장 조직에서, GBSSⅡ는 비저장 조직에서의 아밀로오스 합성에 관여한다. 많은 연구에서 고등식물의 가용성 전분합성 효소는 4가지 그룹의 형태(SSI ~ SSIV)를 가지며 각각 여러 동형체(isoforms)를 가진다고 보고되어 있는데, 그 중 벼(Oryza sativa)에서는 OsSSI, SSⅡs(OsSSⅡa, OsSSⅡb, OsSSⅡc), SSⅢs(OsSSⅢa, OsSSⅢb) 및 SSIV(OsSSⅣa, OsSSⅣb)으로 8개의 동형체들이 보고되어 있다. 대부분의 OsSS 동형체들은 배유에서 발견되었으며, 이들은 종자 발달에 있어 유전자 발현 패턴을 바탕으로 초기(early), 후기(late) 및 모든 시기(steady expressers)의 세 그룹으로 나뉜다. 벼 종자 배유에서 발달 진행은 전저장기(pre-storage)와 전분필링기(starch filling phase)로 구성된다.In higher plants, five starch synthases, one GBSS (granule-bound starch synthase) and four soluble starch synthases were identified. GBSS synthesizes an amylose chain, GBSSI is involved in storage, and GBSS II is involved in the synthesis of amylose in non-storage tissues. In many studies, the soluble starch synthase of higher plants has been reported to have four types of groups (SSI to SSIV) and several isoforms, among which Ossia, SSIIs, OsSS IIb, OsSS IIc), SSIIIs (OssCIIIa and OsSSIIIb), and SSIV (OssCIIa and OssCIIb). Most OsSS phenotypes were found in endosperm, and they are divided into three groups, early, late, and steady expressers, based on gene expression patterns in seed development. Developmental progression in rice seed-seed oil consists of pre-storage and starch filling phase.
쌀 (Oryza sativa L.)은 개발도상국에서 가장 중요한 곡물 작물이며, 넓은 지역에서, 특히 전세계의 약 90%를 아시아에서 생산하고 있다.Rice (Oryza sativa L.) is the most important grain crop in developing countries, producing about 90% of the world in Asia, especially in large areas.
전분은 식품, 제지 및 화학 산업에서 널리 사용되고 있다. 전분의 물리적 구조는 식료품 및 비식료품 또는 공업 제품에 대한 전분의 영양 및 취급 특성에 대하여 상당한 영향을 미칠 수 있다. 특정의 성질은 아밀로펙틴 쇄 길이 분포, 결정화도 및 결정화 유형, 물성, 예컨대 젤라틴화 온도, 점도 및 팽윤 부피를 비롯한 전분 구조의 표시로서 취급될 수 있다. 아밀로펙틴 쇄 길이에서의 변화는 아밀로펙틴의 변경된 결정화도, 젤라틴화 또는 노화의 지수가 될 수 있다.Starch is widely used in the food, paper and chemical industries. The physical structure of starch can have a significant impact on the nutritional and handling properties of starch for foodstuffs and non-food or industrial products. Specific properties can be treated as an indication of the starch structure, including amylopectin chain length distribution, crystallinity and crystallization type, physical properties such as gelatinization temperature, viscosity and swelling volume. The change in amylopectin chain length can be an index of amylopectin's altered crystallinity, gelatinization or senescence.
전분 조성, 특히 높은 아밀로스 함량과 관련될 수 있는 난소화성 전분으로 지칭되는 형태는 장 건강, 특히 대장 건강에 대하여 매우 중요한 의미가 있다. 따라서, 아밀로스 전분은 장 건강을 촉진하는 수단으로서 식료품에 사용하기 위한 옥수수 및 보리와 같은 특정의 곡류에서 개발되어 왔다. 난소화성 전분의 이로운 효과는 장 미생물총이 발효되어 특히 단쇄 지방산을 형성하는 에너지원을 제공하는 대장에 영양분을 제공하는 것에서 유래한다. 이러한 단쇄 지방산은 결장세포에 대한 영양분을 제공하며, 대장을 통하여 특정의 영양분의 섭취를 증가시키고, 결장의 생리적 활성을 촉진한다. 일반적으로 난소화성 전분 또는 기타의 식이 섬유가 제공되지 않을 경우, 결장은 대사가 상대적으로 불활성이 된다.Forms referred to as starburstable starch, which may be associated with starch composition, particularly high amylose content, have significant implications for bowel health, particularly for bowel health. Thus, amylose starch has been developed in certain grains such as corn and barley for use in food as a means of promoting bowel health. The beneficial effect of indigestible starches stems from providing intestinal nutrients to the intestinal microflora providing energy sources that specifically ferment and form short chain fatty acids. These short-chain fatty acids provide nutrients to the colon cells, increase the uptake of certain nutrients through the large intestine, and promote the physiological activity of the colon. Generally, when no indigestible starch or other dietary fiber is provided, the colon becomes relatively inactive in metabolism.
하지만, 전분 합성과 관련된 벼 유전자원을 신속하고 정확하며 간단히 판별할 수 있는 방법은 알려져 있지 않아 판별방법의 개발이 요구되는 실정이다.However, it is not known how to discriminate rice genetic resources related to starch synthesis rapidly, accurately and simply.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 벼 유전자원 판별에 이용될 수 있는 변이된 벼 식물 유래 유전자를 제공하고, 이를 이용한 벼 유전자원 판별방법을 제공하려는 목적이 있다.Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made in an effort to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide a gene derived from a mutated rice plant which can be used for discriminating rice genetic resources,
상술한 바와 같이, 아밀로스 함량에 따라 벼에 대한 선호도가 달라질 수 있다. 따라서, 아밀로스를 다량 함유하는 쌀을 수확할 수 있는 벼를 판별하는 방법은 매우 중요하다.
As described above, the preference for rice may vary depending on the content of amylose. Therefore, it is very important to identify the rice that can harvest rice containing a large amount of amylose.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 21의 61번째 뉴클레오타이드인 G가 C로 치환된 단일염기다형; 서열번호 1로 표시되는 유전자의 인트론(intron) 21의 7번째 뉴클레오타이드와 8번째 뉴클레오티드 사이에 삽입된 C를 포함하는 삽입결실다형; 및 서열번호 1로 표시되는 유전자의 3'유티알(3'UTR)의 63번째 뉴클레오타이드인 G가 C로 치환된 단일염기다형;를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 변이된 유전자를 제공한다.The present invention relates to a single nucleotide polymorphism in which G, the 61st nucleotide of
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 유전자는 벼 식물에서 유래된 것을 사용할 수 있다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the gene of the present invention may be derived from rice plants.
또한, 본 발명은 벼 시료에서 핵산분자를 분리하는 1 단계; 및 상기 1단계에서 분리한 핵산분자에서 단일염기다형(SNP)의 염기타입을 확인하는 2 단계; 를 포함하고, 상기 SNP는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손 21의 61번째 뉴클레오타이드, 서열번호 1로 표시되는 유전자의 인트론 21의 8번째 뉴클레오타이드, 또는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 3'유티알의 63번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일염기다형(SNP)을 포함하는 벼 유전자원 판별방법을 제공할 수 있다.The present invention also relates to a method for separating nucleic acid molecules from a rice sample, And a second step of identifying a base type of a single nucleotide polymorphism (SNP) in the nucleic acid molecule isolated in
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 이용하여 상기 분리된 핵산분자를 증폭하여 실시하는 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손 21의 61번째 뉴클레오타이드; 서열번호 1로 표시되는 유전자의 인트론 21의 8번째 뉴클레오타이드; 또는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 염색체 3의 63번째 뉴클레오타이드;를 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the isolated nucleic acid molecule is amplified using a pair of primers designed to amplify the polynucleotide, and the polynucleotide comprises the
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 2단계에서 SNP의 염기타입 확인이 1단계에서 분리한 핵산분자와 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손 21의 61번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP가 G/C인 이형유전자형; 1단계에서 분리한 핵산분자와 서열번호 1로 표시되는 유전자의 인트론 21의 8번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP가 C/C인 동형유전자형; 또는 1단계에서 분리한 핵산분자와 서열번호 1로 표시되는 유전자의 3'유티알의 63번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP가 G/C인 이형유전자형;을 확인하는 것일 수 있다.
According to another preferred embodiment of the present invention, in the
나아가, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 21의 61번째 뉴클레오타이드인 G가 C로 치환된 단일염기다형; 서열번호 1로 표시되는 유전자의 인트론(intron) 21의 7번째 뉴클레오타이드와 8번째 뉴클레오티드 사이에 삽입된 C를 포함하는 삽입결실다형; 및 서열번호 1로 표시되는 유전자의 3'유티알의 63번째 뉴클레오타이드인 G가 C로 치환된 단일염기다형;를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 아밀로스 함유 벼 판별용 프라이머를 제공할 수 있다.
Furthermore, the present invention relates to a single nucleotide polymorphism in which G, the 61st nucleotide of
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.Hereinafter, terms of the present invention will be described.
본 발명의 "표지 또는 분자표지"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 의미한다. 이 용어는 또한 표지 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍으로 사용되는 핵산과 같은 표지 서열에 상보적인 핵산 서열에도 포함하는 의미이다. 또한, 분자표지의 유전지도상의 위치는 유전자좌로 일컬어진다."Marker or molecular marker" of the present invention refers to a nucleotide sequence used as a reference point when identifying genetically unrelated loci. This term is also meant to include a nucleic acid sequence complementary to a marker sequence such as a nucleic acid used as a primer pair capable of amplifying a marker sequence. In addition, the location on the genetic map of the molecular marker is referred to as the locus.
또한, 본 발명의 "단일염기다형(SNP; single nucleotide polymorphism)"은 대립 유전자좌로부터 얻은 염기서열의 배열에서 관찰되는 아데노신(A), 구아노신(G), 티미딘(T), 시토신(C) 염기의 상호 치환에 의해 나타나는 다형성을 의미한다. 나아가, SNP을 이용하여 개발한 분자표지는 SNP 표지로 통상적으로 일컬어진다.The term " single nucleotide polymorphism " (SNP) of the present invention refers to the nucleotide sequence of adenosine (A), guanosine (G), thymidine (T), cytosine (C) Quot; means a polymorphism caused by mutual substitution of bases. Furthermore, molecular markers developed using SNPs are commonly referred to as SNP markers.
더불어, 본 발명의 "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함함을 의미한다.In addition, "nucleotides" of the present invention are deoxyribonucleotides or ribonucleotides that are present in single-stranded or double-stranded form, and include analogs of natural nucleotides unless specifically stated otherwise.
또한, 본 발명의 "핵산분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.In addition, the "nucleic acid molecule" of the present invention has a meaning inclusive of DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecule, and the nucleotide which is a basic constituent unit in the nucleic acid molecule is not only natural nucleotide, ≪ / RTI > analogs.
나아가, 본 발명의 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건 (4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼 하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 500 내지 1,200bp의 길이로서 사용할 수 있다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적일 수 있다.Furthermore, the term "primer " of the present invention is a single strand of oligonucleotides, which is hybridized under suitable conditions (presence of four different nucleoside triphosphates and polymerase such as DNA or RNA polymerase) Quot; means acting as a starting point for initiating template-directed DNA synthesis under the buffer. The suitable length of the primer is determined depending on the characteristics of the primer to be used, but it is usually 500 to 1,200 bp in length. The primer need not be exactly complementary to the sequence of the template, but may be complementary enough to form a hybridcomplex with the template.
더불어, 본 발명의 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는 단일가닥의 프로브가 혼성화에서의 최대 효율을 보일 수 있다.In addition, the term "probe" of the present invention means a linear oligomer having a natural or modified monomer or bond, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides that can hybridize to a specific nucleotide sequence. Preferably, single-stranded probes can exhibit maximum efficiency in hybridization.
또한, 본 발명의 "동형 유전자형 (homozygotic genotype)"은 SNP 변이 위치에 해당하는 상동 염색체(homologous chromosome)상의 대립형 염기(allelic base)가 서로 동일한 염기인 경우를 의미한다.The term " homozygotic genotype "of the present invention means a case where allelic bases on the homologous chromosome corresponding to the SNP mutation position are the same base.
나아가, 본 발명의 SNP 변이 위치에서의 "이형 유전자형 (heterozygotic genotype)" 란 SNP 변이 위치에 해당하는 상동 염색체상의 대립형 염기가 서로 다른 염기인 경우를 의미한다.Furthermore, the term "heterozygotic genotype " at the SNP mutation position of the present invention means a case where the homologous base on the homologous chromosome corresponding to the SNP mutation position is a different base.
더불어, 본 발명의 "유전자원"은 유전형질과 변이의 자원을 의미하는 것으로, 식물의 육종에 필요한 소재로 사용할 수 있는 유전자를 가지는 자원을 의미한다.In addition, the term "genetic resource" of the present invention means a resource having a genetic trait and a mutation, and means a resource having a gene that can be used as a material necessary for plant breeding.
본 발명은 종래에 벼 식물의 아밀로스 함량과의 연관성이 밝혀지지 않았던 벼 유래 유전자 및 상기 유전자에 아밀로스 함량과 연관성이 있는 부위를 밝혀내었다. 또한, 상기 유전자를 변형시킨 분자마커를 개발하여 다양한 벼 유전자원에서 아밀로스 함량과 관련된 유전자를 신속하고 정확하게 선발하는데 활용될 수 있다.The present invention has revealed a rice-derived gene which has not been previously associated with the amylose content of rice plants, and a region associated with the amylose content in the gene. In addition, the present invention can be utilized to quickly and accurately select genes associated with amylose content in various rice genetic resources by developing a molecular marker modified from the gene.
도 1 a 내지 c는 본 발명에서 사용한 벼 유전자원의 정보이다.
도 2는 실시예 1에서 83개의 변이 타입에 대한 변이의 개수를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 3-1에서 계산한 유전적 통계값을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 3-3에서 작성한 FV에서의 대립유전자 영향 그래프이다.
도 5는 실시예 3-3에서 작성한 TV에서의 대립유전자 영향 그래프이다.
도 6은 실시예 3-3에서 작성한 AC에서의 대립유전자 영향 그래프이다.
도 7은 실시예 3-3에서 작성한 PV에서의 대립유전자 영향 그래프이다.1 (a) to (c) are information on the rice genetic resources used in the present invention.
Fig. 2 is a graph showing the number of variations for 83 variation types in Example 1. Fig.
3 is a graph showing the genetic statistics calculated in Example 3-1.
4 is an allele effect graph in FV prepared in Example 3-3.
5 is an allele effect graph in the TV prepared in Example 3-3.
6 is an allele effect graph in AC prepared in Example 3-3.
FIG. 7 is an allele effect graph in PV prepared in Example 3-3. FIG.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
상술한 바와 같이, 벼 유전자원 판별에 이용될 수 있는 변이된 유전자 및 이를 이용한 아밀로스 함량과 관련성이 있는 벼 유전자원 판별방법이 요구되는 실정이다.
As described above, there is a need for a method for discriminating rice genetic origin, which is related to a mutated gene that can be used for the discrimination of rice genetic resources and amylose content using the same.
이에 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 21의 61번째 뉴클레오타이드인 G가 C로 치환된 단일염기다형; 서열번호 1로 표시되는 유전자의 인트론(intron) 21의 7번째 뉴클레오타이드와 8번째 뉴클레오티드 사이에 삽입된 C를 포함하는 삽입결실다형; 및 서열번호 1로 표시되는 유전자의 3'유티알(3'UTR)의 63번째 뉴클레오타이드인 G가 C로 치환된 단일염기다형;를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 변이된 유전자를 제공할 수 있다.
Accordingly, the present invention provides a polynucleotide comprising a single nucleotide polymorphism in which G, the 61st nucleotide of
본 발명의 변이된 유전자는 벼 식물에서 유래된 서열번호 1로 표시되는 유전자의 일부 부위의 변이를 일으킨 것을 포함할 수 있다. 상기 일부 부위의 변이는 엑손(exon) 21의 61번째 뉴클레오타이드인 G가 치환된 단일염기다형; 인트론(intron) 21의 7번째 뉴클레오타이드와 8번째 뉴클레오타이드 사이에 아미노산이 삽입된 삽입결실다형; 및 3'유티알의 63번째 뉴클레오타이드인 G가 치환된 단일염기다형; 를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 엑손(exon) 21의 61번째 뉴클레오타이드인 G가 C로 치환된 단일염기다형; 인트론(intron) 21의 7번째 뉴클레오타이드와 8번째 뉴클레오타이드 사이에 삽입된 C를 포함하는 삽입결실다형; 및 3'유티알의 63번째 뉴클레오타이드인 G가 C로 치환된 단일염기다형; 를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
The mutated gene of the present invention may include a mutation of a part of a gene of SEQ ID NO: 1 derived from a rice plant. The mutation in the partial region is a single base polymorphism in which G is the 61st nucleotide of
본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 하기 표 1 같이 약어로 기재하였다.The amino acid sequences used in the present invention are abbreviated as follows in accordance with the IUPAC-IUB nomenclature.
또한, 상기 유전자는 식물에서 유래된 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 벼 식물에서 유래된 것일 수 있다.
In addition, the gene is not particularly limited as long as it is derived from a plant, but preferably it may be derived from a rice plant.
나아가, 본 발명은 벼 시료에서 핵산분자를 분리하는 1 단계; 및 상기 1단계에서 분리한 핵산분자에서 단일염기다형(SNP)의 염기타입을 확인하는 2 단계;를 포함하는 벼 유전자원 판별방법을 제공한다.Furthermore, the present invention relates to a method for isolating a nucleic acid molecule from a rice sample, And a second step of identifying a base type of a single nucleotide polymorphism (SNP) in the nucleic acid molecule isolated in
상기 SNP는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손 21의 61번째; 서열번호 1로 표시되는 유전자의 인트론 21의 8번째; 또는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 3'유티알의 63번째 뉴클레오타이드;에 해당하는 단일염기다형(SNP)을 포함하는 것일 수 있다.
The SNP is the 61st of the
상기 1단계의 벼 시료에서 핵산분자는 통상적으로 식물체에서 핵산분자를 분리하는 부위, 예를 들면 벼의 잎, 벼의 줄기, 벼의 뿌리, 벼의 종자 또는 벼의 겨에서 분리할 수 있으며, 바람직하게는 벼의 잎에서 분리할 수 있다.The nucleic acid molecule in the
또한, 상기 1단계의 벼 시료에서 핵산분자를 분리하는 방법은 통상적으로 식물체에서 핵산분자를 분리하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, CTAB 반응(cetyltrimethyl ammonium bromide reaction)을 이용할 수도 있고, 식물 전용 DNA 추출 키트(예를 들면, 독일 소재 Macherey-Nagel사 NucleoSpin DNA extract kit 제품)를 이용할 수도 있다.
In addition, the method of isolating the nucleic acid molecule from the rice sample of the first step is not particularly limited as long as it is a method of isolating the nucleic acid molecule from the plant. For example, a CTAB reaction (cetyltrimethyl ammonium bromide reaction) may be used, or a plant-specific DNA extraction kit (for example, NucleoSpin DNA extract kit from Macherey-Nagel, Germany) may be used.
나아가, 상기 2 단계는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)) 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Further, the above two steps can be carried out by applying various methods known in the art, which are used for identifying specific sequences. For example, techniques that may be applied to the present invention include fluorescence in situ hybridization (FISH), direct DNA sequencing, PFGE analysis, Southern blot analysis, single-strand conformational analysis (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86: 2776 (1989)), RNase protection analysis (Finkelstein et al., Genomics, 7: 167 (1990)), dot blot analysis, denaturing globule electrophoresis (DGGE, Wartell et al., Nucl. Acids Res. (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25: 229-253 (1991)) using a protein recognizing a nucleotide mismatch (e.g., mutS protein of E. coli) Type-specific PCR, but are not limited thereto.
단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA)는 서열변화가 단일-가닥 분자 내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는데, SSCA는 이 밴드를 검출하는 방법이다. 또한, 상기 DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출하는 방법이다. 나아가, 이 외의 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용할 수 있다. 예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용될 수 있다. 상기 리보프로브와 식물체로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰될 수 있다.Single-stranded conformational analysis (SSCA) is the method by which sequence changes cause differences in base-linkage within a single-stranded molecule, resulting in the emergence of different bands, SSCA is the method of detecting this band. Further, the DGGE analysis is a method of detecting a sequence showing wild type sequence and other mobility using a modified gradient gel. Further, other techniques can generally use probes or primers complementary to sequences comprising the SNPs of the present invention. For example, in an RNase protection assay, a riboprobe complementary to a sequence comprising a SNP of the present invention may be used. The riboprobe is hybridized with DNA or mRNA isolated from a plant, and then cleaved with an RNase A enzyme capable of detecting a mismatch. If there is a mismatch and RNase A recognizes, a smaller band may be observed.
또한, 혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석을 활용할 경우, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용될 수 있다. 이러한 기술에서 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정할 수 있다.
In addition, when an analysis using a hybridization signal is utilized, a probe complementary to the sequence including the SNP of the present invention can be used. In this technique, hybridization signals of the probe and the target sequence can be detected to directly determine whether the SNP variant is present.
본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전히 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 단일염기다형(SNP)인 서열목록 1로 표시되는 유전자의 엑손 21의 61번째 뉴클레오타이드, 서열번호 1로 표시되는 유전자의 인트론 21의 8번째 뉴클레오타이드 또는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 3'유티알의 63번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8 내지 100 개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 가질 수 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach , IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
As a probe used in the present invention, a perfectly complementary sequence may be used in the sequence including the SNP, but a substantially complementary sequence may be used within a range that does not interfere with the specific hybridization have. Preferably, the 61st nucleotide of
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 2단계는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손 21의 61번째, 서열번호 1로 표시되는 유전자의 인트론 21의 8번째 또는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 3'유티알의 63번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 이용하여 상기 분리된 핵산분자를 증폭하여 실시할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the
본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), 복구연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Amplification techniques that can be used in the methods of the present invention include polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), ligase chain reaction (LCR) But not limited to, repair chain reaction, transcription-mediated amplification (TMA), self-sustained sequence replication, selective amplification of target polynucleotide sequences, PCR was performed using consensus primer polymerase chain reaction (CP-PCR), arbitrary primed polymerase chain reaction (PCR), nucleic acid sequence based amplification (NASBA ), Strand displacement amplification and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) or in the art Any other suitable method for amplifying a given nucleic acid molecule may be used, but is not limited thereto.
상기 방법 중 PCR이란, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수 있다.
Among the above methods, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a pair of primers that specifically bind to a target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art and commercially available kits can be used.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 상기 2단계에서 SNP의 염기타입 확인이 1단계에서 분리한 핵산분자와 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손 21의 61번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP가 G/C인 이형유전자형; 1단계에서 분리한 핵산분자와 서열번호 1로 표시되는 유전자의 인트론 21의 8번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP가 C/C인 동형유전자형; 또는 1단계에서 분리한 핵산분자와 서열번호 1로 표시되는 유전자의 3'유티알의 63번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP가 G/C인 이형유전자형;을 확인하는 것일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, in the
만약, 상기 SNP 염기타입 확인이 상기 조건(이형유전자형 또는 동형유전자형)에 부합할 경우, 아밀로스를 함유하는 벼 유전자원일 확률이 높다고 판단할 수 있다.
If the SNP base type identification matches the above-mentioned conditions (heterologous genotype or homozygous genotype), it can be judged that the probability of origin of a rice gene containing amylose is high.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 21의 61번째 뉴클레오타이드인 G가 C로 치환된 단일염기다형; 서열번호 1로 표시되는 유전자의 인트론(intron) 21의 7번째 뉴클레오타이드와 8번째 뉴클레오티드 사이에 삽입된 C를 포함하는 삽입결실다형; 및 서열번호 1로 표시되는 유전자의 3'유티알의 63번째 뉴클레오타이드인 G가 C로 치환된 단일염기다형; 를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 아밀로스 함유 벼 판별용 프라이머를 제공한다.The present invention also relates to a single nucleotide polymorphism in which G, the 61st nucleotide of
상기 프라이머는 통상적으로 아밀로스를 다량 포함하는 벼를 판별하는 용도라면 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머를 이용하여 벼 시료 DNA의 증폭반응을 수행하여 벼 시료의 아밀로스 함유 여부를 판별할 수 있다.
The primers can be used without limitation as long as they are used for discriminating rice containing a large amount of amylose. For example, amplification reaction of the rice sample DNA using the primer can be performed to determine whether the rice sample contains amylose.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to explain the present invention to the average person skilled in the art in more detail.
[[ 실시예Example ]]
준비예Preparation Example 1. 식물 시료 1. Plant sample
본 발명에서 사용한 식물 시료는 도면 1 a 내지 c에 나타낸 것과 같이 24개국 107점의 수집자원을 사용하였다. The plant samples used in the present invention were collected from 107 countries in 24 countries as shown in Figs. 1 a to c.
도 1 a 내지 c에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에서 사용한 유전자원은 국내에서 수집한 자원이 55점(51.4%)으로 절반을 차지하고 있으며, 이외에 각 23개 국가별로 수집한 자원이다. 수집자원의 특성을 보면, 육성종(Bred.) 6점, 도입종(Intro.) 52점, 재래종(Landrace) 21점 및 잡초성(Weedy) 벼 28점으로 총 107점이다. As shown in Figs. 1 (a) to (c), the genetic resource used in the present invention accounts for 55% (51.4%) of the resources collected in Korea, and is also a resource collected in each of 23 countries. The characteristics of the collected resources are as follows: 6 points for Bred., 52 points for Intro., 21 points for Landrace, and 28 points for Weedy rice.
상기 유전자원은 공주대학교 시험포장에서 1군 및 2군으로 2회 파종 및 육묘하였고, 10일 후 이앙은 주당 1 본씩(10주/수집계통) 조간과 주간을 30 х 15 cm 간격으로 손이앙하였다. 또한, 시비량(N-P2O5-K2O)은 9-4-5 kg/10a 수준으로 하였다. 질소는 기비(50%), 분얼비(30%) 및 이삭거름(20%)으로 분시 시용하였고, 인산은 전량 기비로 시용하였으며, 칼리는 기비(70%) 및 수비(30%)로 나누어 시용하였다. 나아가, 병충해 방제는 수시로 진단하여 예방위주로 6 ~ 7회 실시하였으며 제초작업 및 기타 재배관리는 농촌진흥청 농사시험연구 벼 표준 재배볍에 준하여 실시하였다. 이후 식물의 종자를 수획하여 -80℃에서 저장하여 숙성하였다.The genetic resources were sown and seeded twice in
상기 숙성된 식물종자의 게놈 DNA는 NucleoSpin® Plant Ⅱ Midi(독일 소재 Macherey-Nagel사 제품)를 사용하여 추출하여 사용했다.
Genomic DNA of the aged plant seeds was extracted using NucleoSpin ( R) Plant II Midi (manufactured by Macherey-Nagel, Germany).
실시예Example 1. 변이 서열 제조 1. Mutation sequence production
본 실시예에서는 벼 종자에서 전분 합성에 중요한 10개의 유전자(OsGBSSI(서열번호 2 및 3), OsSSSⅡb(서열번호 4 및 5), OsSSSⅢa(서열번호 6 및 7), OsBE(서열번호 8 및 9), OsBEI(서열번호 10 및 11), OsBEⅡa(서열번호 12 및 13), OsBEⅡb(서열번호 14 및 15), OsISA(서열번호 16 및 17), OsISA3(서열번호 18 및 19) 및 OsGI(서열번호 20 및 21))를 선발하였다. 상기 10개의 유전자에 대한 프라이머는 NCBI 데이터베이스로부터 연관 게놈 서열 분석을 이용하여 디지인하였고, 디자인된 프라이머는 하기 표 2에 나타냈다.In this example, ten genes (OsGBSSI (SEQ ID NOS: 2 and 3), OsSSS lib (SEQ ID NOS: 4 and 5), OsSSS IIIa (SEQ ID NOS: 6 and 7), OsBE (SEQ ID NOS: 8 and 9) , OsBEI (SEQ ID NOs: 10 and 11), OsBEIIa (SEQ ID NOs: 12 and 13), OsBEIIb (SEQ ID NOs: 14 and 15), OsISA (SEQ ID NOs: 16 and 17),
준비예 1에서 수득한 게놈 DNA 40 ng, 상기 표 2의 전방 프라이머 4 pmol/㎕, 상기 표 2의 후방 프라이머 4 pmol/㎕, SolGent™사의 dNTP (dATP,dGTP,dCTP,dTTP) 200μM, 50mM 염화칼슘(KCl), 10mM 트리스-염화수소(Tris-HCl), 1.5mM 염화 마그네슘(MgCl2), 0.25unit 표지 DNA 중합효소(Tag DNA polymerase, DiaStar™사 Taq DNA Polymerase)를 사용하여 PCR반응을 수행하였다. 40 ng of the genomic DNA obtained in Preparation Example 1, 4 pmol / l of the forward primer of Table 2, 4 pmol / l of the back primer of Table 2, 200 μM of dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) of SolGent PCR reaction was carried out using 10 mM Tris-HCl, 1.5 mM magnesium chloride (MgCl 2 ), and 0.25 unit tag DNA polymerase (DiaStar ™ Taq DNA Polymerase).
PCR 반응은 PTC-200 thermocycler(MJ Research)을 이용하였으며, PCR 반응은 94 ℃에서 3분 동안 초기변성(pre-denaturation) 과정을 수행한 후, 94 ℃에서 30초 변성(denaturation), 45초 어닐링(annealing), 72℃에서 45초 증폭(extension), 이때 변성에서 증폭 과정은 34회 반복 수행하였으며, 72℃에서 15분 최종 증폭(final extension) 과정을 수행하여 증폭된 DNA를 제조하였다.PCR was performed using a PTC-200 thermocycler (MJ Research). The PCR reaction was pre-denaturation at 94 ° C for 3 minutes, denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing for 45 seconds and annealing at 72 ° C for 45 seconds. At this time, the amplification was repeated 34 times at 72 ° C, and final amplification was performed at 72 ° C for 15 minutes to prepare amplified DNA.
이후 증폭된 DNA인 엠블리콘(amplicon)은 blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용하는 NCBI의 뉴클레오타이드 데이터베이스 검색을 통해 선택했다.The amplified DNA, amplicon, was then selected by searching NCBI's nucleotide database using blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
상기 증폭된 DNA 50㎕에 PCR B(Solg™사 PCR Purification Kit에 함유되어 있는 buffer) 250㎕를 혼합하여 PCR 혼합물을 제조하였다.50 [mu] l of the amplified DNA was mixed with 250 [mu] l of PCR B (buffer contained in Solg (TM) PCR Purification Kit) to prepare a PCR mixture.
스핀컬럼(Spin column)을 2㎖ 수집튜브(Collection tube)에 장착한 후 초 점결재 용액(Solg™사 PCR Purification Kit에 포함되어 있는 Super Binder™ Solution) 100㎕를 첨가하였다. 이후 원심분리기를 이용하여 10,000rpm으로 1분간 원심분리 후 컬럼 밑으로 내려간 용액(Solution)을 제거하고 다시 스핀 컬럼(Spin column)에 장착하였다. 상기 PCR 혼합물을 스핀 컬럼에 첨가한 뒤 원심분리기를 이용하여 10,000 rpm으로 30초간 원심분리 후 컬럼 밑으로 내려간 용액을 제거하고 다시 스핀 컬럼에 장착하였다. The spin column was mounted on a 2 ml collection tube and 100 μl of Super Binder ™ Solution in Solg ™ PCR Purification Kit was added. Thereafter, the solution was centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute using a centrifuge, and the solution dropped to the bottom of the column was removed, and the solution was mounted on a spin column. The PCR mixture was added to the spin column, centrifuged at 10,000 rpm for 30 seconds using a centrifuge, and then the solution descending under the column was removed and mounted on the spin column again.
이후 스핀컬럼(Spin column)에 80% 에탄올 750㎕를 첨가한 뒤 원심분리기를 이용하여 10,000rpm으로 30초간 원심분리 후 컬럼 밑으로 내려간 용액(Solution)을 제거하고, 상술한 것과 같은 에탄올 첨가 후 원심분리과정을 다시 한 번 반복 수행하였다. 이후 원심분리기를 이용하여 10,000rpm으로 3분간 공회전을 시킨 후 수집 튜브를 제거하고 스핀 컬럼을 1.5 ㎖ 마이크로 튜브(micro tube)에 장착했다. 이후 3차원 증류수(Solg™사 PCR Purification Kit에 함유되어 있는 제품)를 30 ~ 50㎕ 첨가한 후 상온에서 1분간 정치시켰다. 이후 원심분리기를 이용하여 10,000rpm으로 1분간 원심분리 후 스핀 컬럼을 제거하고 1% 아가로스 젤에 전기영동하여 농도를 확인하였다.Then, 750 쨉 l of 80% ethanol was added to a spin column, followed by centrifugation at 10,000 rpm for 30 seconds using a centrifugal separator. Then, the solution dropped under the column was removed, and centrifugation The separation process was repeated once again. after After centrifuging at 10,000 rpm for 3 minutes using a centrifuge, the collection tube was removed and the spin column was mounted in a 1.5 ml micro tube. After that, 30 to 50 μl of 3-D distilled water (product contained in Solg ™ PCR Purification Kit) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 minute. After centrifugation at 10,000 rpm for 1 minute using a centrifuge, the spin column was removed and the concentration was confirmed by electrophoresis on 1% agarose gel.
상기 증폭된 DNA는 PCR 정제 Kit(대한민국 대전 소재 솔젠트사 제품)를 사용하여 정제하였고, 정제된 증폭 산물은 솔젠트사에 보내 ABI 3730 sequencing platform(미국 소재 applied biosystem사 제품)을 이용하여 서열분석하였다. 레어 대립유전자(rare allele)는 정제된 증폭 산물을 첨가하여 다시 서열분석을 진행하였다.
The amplified DNA was purified using a PCR purification kit (Solgent, Daejeon, Republic of Korea), and the purified amplified product was sent to Solzent Company for sequencing using the ABI 3730 sequencing platform (US applied biosystem) Respectively. The rare allele was sequenced again by adding the purified amplified product.
상기 10개의 유전자에 대해, 83개의 서열 변이(sequence variation)를 갖는 단일염기다형(SNP), 삽입결실다형(InDel) 또는 SSR(simple sequence repeat)을 제작하였다. 상기 83개의 변이 타입에 대한 변이의 개수는 도면 2에 나타내었다.Single nucleotide polymorphisms (SNPs), inserted deletion polymorphisms (InDel) or simple sequence repeats (SSRs) with 83 sequence variations were constructed for the 10 genes. The number of variations for the 83 variation types is shown in FIG.
도 2에서 확인되는 바와 같이, 가장 많은 갯수를 차지하는 C/T변이를 포함하는 SNP 및 A/G변이를 포함하는 SNP를 포함하는 SNP 73개, InDel 8개 및 SSR 2개를 포함하는 83개의 변이된 서열을 제작하였다.
As can be seen in FIG. 2, 83 mutations including 73 SNPs including SNPs including C / T mutation and SNPs including A / G mutation, 8 InDel and 2 SSRs occupying the largest number Lt; / RTI >
실시예Example 2. 표현형 조사 2. phenotype survey
아밀로스 함량(AC) 및 RVA(rapid viscosity analysis)측정을 포함한 표현형 조사는 1군 및 2군으로 나누어 각각 진행하였다. Phenotypic studies including amylose content (AC) and rapid viscosity analysis (RVA) measurements were performed in
각 식물별 전분은 Rapid ViscoAnalyser 기계(serial-3; 오스트레일리아 소재 Newport Scientific사 제품)를 이용하여 분리하였다. Each plant starch was isolated using a Rapid ViscoAnalyser machine (serial-3; Newport Scientific, Australia).
상기 AC는 Cho et al.(2008)가 제안한 비색정량분석(colourimetric)에 바탕을 둔 방법을 사용하여 수행하였다. 전분 점도 예측은 Rapid Visco Analyser(serial-3; 오스트레일리아 소재 Newport Scientific사 제품)을 사용하였다. 상기 각 식물별 전분 3g을 25 ㎖ 증류수에 녹여 사용하였다. 시간-온도 레지먼(regimen)은 50 ℃에서 1분, 이후 50 ℃에서 95 ℃까지 4.7 분 동안 가열하고, 95 ℃에서 2.5 분, 이후 3.7 분 동안 50 ℃까지 냉각하고, 50 ℃에서 2 분 동안 유지하여 수행하였다. The AC was performed using a colorimetric method proposed by Cho et al. (2008). Starch viscosity prediction was performed using Rapid Visco Analyzer (serial-3; Newport Scientific, Australia). 3 g of starch of each plant was dissolved in 25 ml of distilled water. The time-temperature regimen was heated at 50 ° C for 1 minute, then 50 ° C to 95 ° C for 4.7 minutes, cooled to 95 ° C for 2.5 minutes, then 3.7 minutes to 50 ° C, and at 50 ° C for 2 minutes Respectively.
상기 RVA 측정은 상기 준비예 1의 107개 벼의 최고 점도(peak viscosity; PV), 최저 점도(trough viscosity; TV), 강하 점도(breakdown viscosity; BDV = PV-TV), 최종 점도(final viscosity; FV), 치반 점도(setback viscosity; (SBV = FV-PV) 및 호화개시 온도(pasting temperature; PT)를 계산하여 수행하였다. The RVA measurement was performed using the peak viscosity (PV), the trough viscosity (TV), the breakdown viscosity (BDV) and the final viscosity (BDV) of the 107 rice plants of Preparation Example 1. FV), setback viscosity (SBV = FV-PV) and pasting temperature (PT).
측정한 AC 및 RVA는 표 3에 나타내었다.The measured AC and RVA are shown in Table 3.
표 3에서 확인되는 바와 같이, 각각의 연관성 중 절반 이상이 p < 0.01의 값을 보였다. 또한, 1군과 2군의 RVA 측정은 각 항목에서 중요한 연관성을 확인할 수 있었다. 특히, 1군과 2군의 최고점도(PV)와 최저점도(TV), 최종점도(FV)는 고도의 유의한 정의 상관(positive correlation)으로 나타내는데, 1군의 경우 최고점도는 최저점도(0.913)와 최종점도(0.825), 2군의 경우 최고점도는 최저점도(0.931)와 최종점도(0.923)으로 고도의 유의한 정의 상관(positive correlation)을 보였다. 반면, 1군의 경우 치반점도를 제외한 RVA 예측은 AC와 상관없는 것을 확인할 수 있었다. 나아가, 1군과 2군에 강하점도와 치반점도(-0.610, -0.427)는 고도의 유의한 부의 상관(negative correlation)을 보였다.
As seen in Table 3, more than half of each association showed a value of p < 0.01. In addition, RVA measurements in
실시예Example 3. 대립 유전자( 3. Allele ( AlleleAllele ) 발굴) excavation
상기 실시예 1에서 제작한 83개의 변이에 대해 대립 유전자를 발굴하였다.
Alleles were identified for the 83 mutations produced in Example 1 above.
실시예Example 3-1: 유전적 통계 3-1: Genetic Statistics
우선 유전적 통계는 유전자 자리당 대립 유전자 수(number of alleles per locus), 대립유전자 빈도(allele frequency), 유전자 다양성(gene diversity; GD) 및 동질 이성체 정보 내용(polymorphism information content; PIC)를 포함하고, 상기 유전적 통계는 PowerMarker v3.25 program (Liu and Muse, 2005)를 사용하여 계산했다. 상기 대립유전자 빈도로부터 순열 1000개를 PowerMarker 프로그램을 이용하여 UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean) tree를 구성하였다. 구성된 UPGMA tree는 MEGA v5.05(Tamura et al., 2011)로 편집하였다. 또한, POPGENE v1.32(Yeh and Boyle, 1997)로 관찰된 이형접합성(observed heterozygosity; Obs_Het), 예상 이형접합성(expected heterozygosity; Exp_Het) 및 섀넌의 정보 인덱스(Shannon’s information index; I)를 계산하였다. 상술한 방법으로 계산한 유전적 통계값은 도면 3에 나타냈다.
First, genetic statistics include the number of alleles per locus, allele frequency, gene diversity (GD), and polymorphism information content (PIC) , And the genetic statistics were calculated using the PowerMarker v3.25 program (Liu and Muse, 2005). From the above allele frequencies, 1000 permutations were constructed using the UPMMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) tree using the PowerMarker program. The constructed UPGMA tree was edited with MEGA v5.05 (Tamura et al., 2011). Observed heterozygosity (Obs_Het), expected heterozygosity (Exp_Het) and Shannon's information index (I) were also calculated with POPGENE v1.32 (Yeh and Boyle, 1997). The genetic statistics calculated by the above method are shown in FIG.
도 3에서 확인되는 바와 같이, 관찰된 이형접합성(observed heterozygosity; Obs_Het)의 평균은 이형접합성 손실(heterozygosis deficit)을 포함하는 예상 이형접합성(expected heterozygosity; Exp_Het)의 평균보다 낮은 것을 알 수 있다. 상기 이형접합성 손실은 근친교배(inbreeding) 등을 통해 유발될 수 있다. As can be seen in Figure 3, the average of observed heterozygosity (Obs_Het) is lower than the average of expected heterozygosity (Exp_Het) including heterozygosis deficit. The heterozygosity loss may be induced through inbreeding or the like.
또한, 모든 유전자 자리의 변이에 대한 섀넌의 정보 인덱스(Shannon’s information index; I)는 0.0530 내지 0.6767로 확인할 수 있고, 평균 섀넌의 정보 인덱스는 0.3014인 것을 알 수 있다.In addition, Shannon's information index (I) for all of the genetic variation can be confirmed to be 0.0530 to 0.6767, and the average Shannon information index is 0.3014.
나아가, 유전적 다양성 정도를 나타내는 동질 이성체 정보 내용(polymorphism information content; PIC) 값은 0.0183 내지 0.3667 범위에서 나타났고, 평균 PIC는 0.1550인 것을 확인할 수 있다. 더불어, I 및 PIC의 넓은 범위는 다층(multiple-level) 유전적 변이로 표현됐다.Furthermore, the polymorphism information content (PIC) value indicating the degree of genetic diversity appeared in the range of 0.0183 to 0.3667, and the average PIC was 0.1550. In addition, the broad range of I and PIC is expressed as multiple-level genetic variation.
상기와 같이, 개체 내 이형접합 형태의 대립유전자는 대단히 낮은 비율로 존재하였고, 관찰되는 이형 접합도는 기대치에 비해 확실히 낮게 탐색되었는데, 이는 벼의 경우 자식의 영향의 이형접합의 결손(deficit)으로 판단된다. 또한, 선발된 벼 자원에서 넓은 범위의 유전적 다양성과 Shannon’s information index는 선발된 자원의 multiple-level inheritable 변이가 반영된 것으로 판단된다.
As mentioned above, alleles in the form of heterozygosity in the individual were present at a very low rate, and the heterozygosity observed was clearly lower than expected, indicating that in the case of rice, the defect of the heterozygosity of the influence of the child . In addition, a wide range of genetic diversity and Shannon's information index in the selected rice resources are considered to reflect the multiple-level inheritable variation of selected resources.
실시예Example 3-2: 연관성 분석 3-2: Relationship Analysis
레어 대립유전자(rare allele, 빈도 5% 미만)는 연관성 분석(association analysis)에서 빈 대립유전자(null allele)로 간주했다. 마커와 표현형 특성 사이의 연관성은 일반적인 선형 모델(general linear model; GLM) 및 혼합된 선형 모델(mixed linear model; MLM)을 사용하여 계산하고, 마커들은 시험되고 하위집단 데이터(subpopulation data, Q matrix)는 고정된 영향 인자(fixed-effect factor)로 고려되며 킨쉽 메트릭스(kinship matrix)는 랜덤-영향 인자(random-effect factor)로 고려되는 TASSEL v2.1(Bradbury et al., 2007)에서 구현했다. 상기 킨쉽 메트릭스는 SPAGeDi 1.2g software (Hardy and Vekemans, 2002)에서 얻었다. 유전자의 자리(loci)와 특성(trait) 사이의 연관성의 중요도 확정을 위해, 멀티플 테스팅(multiple testing)에 대한 정정은 FDR(false discovery rate)을 사용하였다. 상기 FDR은 Q값으로 표현되고, 거절된 빈 가상(rejected null hypotheses)의 클라스에서 실제 빈 가상(true null hypotheses)의 예상 비율로 정의했다.A rare allele (frequency less than 5%) was considered a null allele in association analysis. The association between markers and phenotypic traits is calculated using a general linear model (GLM) and a mixed linear model (MLM), and markers are tested and subpopulation data (Q matrix) Was considered as a fixed-effect factor and the kinship matrix was implemented in TASSEL v2.1 (Bradbury et al., 2007), which is considered as a random-effect factor. The Kinship matrix was obtained from SPAGeDi 1.2g software (Hardy and Vekemans, 2002). To determine the significance of the link between the loci and trait of a gene, the correction for multiple testing uses a false discovery rate (FDR). The FDR is expressed as a Q value and is defined as the expected ratio of true null hypotheses in a class of rejected null hypotheses.
상술한 바와 같이 계산한 연관성 분석값은 하기 표 4에 나타냈다.The association analysis values calculated as described above are shown in Table 4 below.
표 4에서 확인되는 바와 같이, 쌀 염색체 2의 유전자 OsBEⅡb 종결 암호(termination codon)의 63번째 뉴클레오타이드 말단 부위의 C/G 변위를 포함하는 SNP는 여러 특성 인자들(trait indices)과 중요한 관련성을 확인할 수 있었다. 특히, 상기 SNP는 1군과 2군에 FV와 깊은 연관성을 확인할 수 있었고, 2군에 GLM 및 MLM에서 상기 SNP는 AC 및 TV와 연관성을 나타냈다. As can be seen in Table 4, SNPs containing the C / G displacement of the 63rd nucleotide end region of the OsBE IIb termination codon of
나아가, 염색체 6에서 OsBE 프로모터 레진의 -224번째 뉴클레오타이드의 C/T 변이는 2군의 GLM 분석에서 TV와 중요한 관련성을 확인할 수 있으나, MLM분석에서는 관련도를 보이지 않았다.Furthermore, the C / T variation of the -224th nucleotide of OsBE promoter resin in
더불어, 염색체 2에서 OsSSSⅡb 프로모터 레진의 같은 변위 패턴을 포함하는 4개의 SNP는 MLM 분석에서 2군에 TV와 적은 관련성을 보였다.In addition, four SNPs containing the same displacement pattern of OsSSSlib promoter resin on
상기 OsSSSⅡb는 Q value에서 보면 아밀로스 함량(9.64×10-3)에 깊은 연관성을 보이고, P_MLM 중 2군에서 최종점도(9.76×10-5)를 와 깊은 연관성이 있는 것을 확인할 수 있었다.
The OsSSS IIb showed a strong correlation with the amylose content (9.64 × 10 -3 ) in the Q value and the deep viscosity (9.76 × 10 -5 ) in the P_MLM group.
실시예Example 3-3: 대립 유전자 영향 3-3: Allele effect
대립 유전자 영향을 확인하기 위해 집단구조(population structure)분석을 수행하였다. 상기 집단 구조 분석은 하기 방법을 사용하였다.Population structure analysis was performed to confirm the allele effect. The group structure analysis used the following method.
쌀 염색체 2에서 OsBEⅡb 유전자 종결 암호(termination codon)의 63번째 뉴클레오타이드 말단 부위에서 SNP에 관하여, G 유전자형(genotype)은 pop1 및 pop2에서 발현됐고, pop3 및 pop4에서는 혼합된 C/G 유전자형 및 G 유전자형이 발현됐다.Regarding the SNP at the 63rd nucleotide end of the OsBE IIb termination codon in
베이즈 클러스터링 알고리즘(Bayesian clustering algorithm)은 유전적으로 비슷한 각각의 클러스터(cluster) 추론하고, 상기 준비예 1의 107개 샘플에서 STRUCTURE v2.3.3 프로그램(Pritchard et al., 2000)과 클러스터 사이의 유전적 혼합(genetic admixture) 비율 테스트를 수행하였다. 또한, 100,000번 반복의 초기 시험 기간(Burn-In Period)이 적용된 STRUCTURE의 복제 실행하여 추정치를 얻은 후 200,000번 반복을 추가 실행하였다. 상기 STRUCTURE의 결과 그래프는 Graphics Layout Engine 4.2.3b로 작성하였다. 작성된 결과 그래프는 도면 4 내지 7에 나타냈다.The Bayesian clustering algorithm deduces each genetically similar cluster and uses the STRUCTURE v2.3.3 program (Pritchard et al., 2000) in the 107 samples of
집단 구조 추론을 지원하기 위해서, 글로벌 F ST 값은 Fstat v2.9.3.2 (Goudet, 1995)을 사용하여 구했다. To support group structure inference, global F ST values were obtained using Fstat v2.9.3.2 (Goudet, 1995).
상술한 바와 같이 분석한 집단 구조 분석 결과는 하기 표 5에 나타냈다.The results of the analysis of the group structure analyzed as described above are shown in Table 5 below.
상기 고정지수(fixation index, F ST )는 미소부수체(microsatellite) 마커와 같은 유전적 다양성 정보에 근거하여 원 집단에서 기원된 부분집단(subpopulation) 간 분화를 측정하는 것으로 집단 내 또는 집단간 분화의 차이 정도를 나타내는 것이다. The fixation index ( F ST ) is a measure of subpopulation differentiation originating from the original population based on genetic diversity information such as microsatellite markers. Indicating the degree of difference.
표 5에서 확인되는 바와 같이, F ST 범위는 원집단과 부분집단 간에 분화가 일어나지 않은 경우를 0으로 하여 완벽한 분화를 나타내는 1까지의 범위를 갖는다. 부분집단 4개 사이에서의 쌍별(pairwise) F ST 값의 범위는 0.2934(Pop1과 Pop4)에서 0.4562(Pop1과 Pop2)이었다. 이는 벼 수집유전자원이 가지고 있는 전체 집단 및 집단 간 유전적인 분화 정도가 매우 높다는 것을 의미한다. 이는 수집자원이 매우 다양한 원산지를 가지고 있고 이러한 결과 유전적 배경이 매우 복잡하고 다양하기 때문일 것이다. 또한, 총 F ST 값은 상기 4개 소집단(Pop 1 내지 4) 사이의 적당한 분화를 포함하는 0.4228로 확인되었다.
As shown in Table 5, the F ST range has a range of up to 1, representing a perfect differentiation, with zero for no differentiation between original and sub-population. The range of the pairwise F ST values among the four subgroups was 0.4562 (Pop1 and Pop2) in 0.2934 (Pop1 and Pop4). This means that genetic differentiation between the whole population and the population of rice-harvesting genetic resources is very high. This may be because the collection resources have a wide variety of origin and the genetic background is very complex and diverse. In addition, the total F ST value was found to be 0.4228, including the proper differentiation between the four sub-populations (
도 4 내지 7은 OsBEⅡb 유전자 SNP 말단의 대립유전자 영향의 결과 그래프이다. 도 4는 FV에서의 대립유전자 영향, 도 5는 TV에서의 대립유전자 영향, 도 6은 AC에서의 대립유전자 영향 및 도 7은 PV에서의 대립유전자 영향 그래프이다.FIGS. 4 to 7 are graphs showing the results of the allelic influence of the OsBElib gene SNP terminal. Figure 4 is an allele effect in FV, Figure 5 is an allele effect in TV, Figure 6 is an allele effect in AC, and Figure 7 is an allele effect graph in PV.
도 4 내지 6에서 확인되는 바와 같이, pop3 및 pop4에서 C에서 G로의 변이(transversion)은 FV, TV 및 PV와 중요한 관련성이 있음을 확인할 수 있다. As can be seen in Figs. 4 to 6, it can be seen that the transversion from C to G in pop3 and pop4 is significantly related to FV, TV and PV.
도 6에서 확인되는 바와 같이, pop3 및 pop4에서 상기 변이는 AC의 감소와 깊은 관련이 있음을 확인할 수 있다.
As can be seen in FIG. 6, it can be seen that the variation in pop3 and pop4 is strongly related to the decrease in AC.
준비예 및 실시예를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 유전자 변이 중 OsBEⅡb 유전자의 C/G 변이가 벼의 아밀로스 함량과 연관성이 깊은 것을 확인하였으며, 이로 인해 이 부분을 이용하여 미질과 관련하여 수집된 자원을 평가 및 선발할 수 있는 장점이 있고, 위 변이 부분을 통해 향후 마커 개발을 통하여 보다 쉽게 자원을 평가하고 선발하여 분자육종 기반의 미질특성에 관련된 신품종 개발에 활용할 수 있다.
As can be seen from the preparations and examples, it was confirmed that the C / G mutation of the OsBElib gene among the gene mutations of the present invention is highly related to the amylose content of rice, and thus, It can be used to develop new varieties related to molecular characterization based on molecular breeding, by evaluating and selecting resources more easily through development of markers through the above mutation part.
<110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Discrimination method for rice genetic resource and primers for discrimination of rice having amylose content <130> 1039749 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8657 <212> RNA <213> OS02G32660_OsBEIIb gene <400> 1 gcgcacaccc acacaccgac caccaggcag cgcctcctcg ctttggctct cgcgtgagga 60 gggtttaggt ggaagcagag cgcgggggtt gccgggggat ccgatccggc tgcggtgcgg 120 gcgagatggc ggcgccggcg tctgcggttc ccgggagcgc ggcggggcta cgggcggggg 180 ccgtgcggtt ccccgtgcca gccggggccc ggagctggcg tgcggcggcg gagctcccga 240 cgtcgcggtc gctgctctcc ggccggagat tccccggtaa tgatcccgcg ccaccttgtt 300 gttctcgtcc gccgcgacgc gccacgcgtg cgcctcggct cgaccaggtg gcgtgccgtg 360 tcgcgtcgcg ccgcgggtgc ggtaaatcgt cgtgatcttc attttggttt tgcctgcgtc 420 tcgtgtccag gtgccgttcg cgtggggggt tccggggggc gcgtggccgt gcgcgcggcg 480 ggcgcgtcag gggaggtgat gatccccgag ggcgagagcg acgggatgcc ggtttcagca 540 ggttcagacg atctgcaggt gcgtgatcat gattcatcct gccttgacaa tactattgct 600 acatatctaa cagcattttg catgtcatgt ttgaaaatgg agacatgttc ttgtgcagtg 660 ctaccttacg agatcatata catttcacgc agtccacgtc ttgagacgtg ttgatttctg 720 tttgtgacgg gattatgata tattcagtga ttcagtcctt ttttatgtac ttagtccata 780 ctagttgtct gcgtgcataa tgataatatg atctaggtct agagcaccct atatgaggcc 840 tcaaagggca caccatatgc gtaggattga tctagagtct tgcttgttgt cgctcattcc 900 gttcagttgt cattatgttt tacttctgaa cattttatct cttgtacatt gttgtagttg 960 ccagccttag atgatgaatt aagcacggag gttggagctg aagttgagat tgagtcatct 1020 ggagcaagtg acgttgaagg cgtgaagaga gtggttgaag aattagctgc tgagcagaaa 1080 ccacgagttg tcccaccaac aggagatggg caaaaaatat tccagatgga ctctatgctt 1140 aatggctata agtaccatct tgaatatcgg tatggctttc cgcccttctt tatagatcac 1200 atagtttcat taggttatgt ttttattatt ctccatctgt tcagtctttc acaagatgta 1260 tgcaaataac tacttacgtg tcacagctga tgagactctt gaagttttat ctttagtcct 1320 gcatatatac tctgatctgt tctcaaatgg aagttgtttt agaaatcatt cagtcatgct 1380 ttaaaattta acaagagtcc taaactacta atgtgcgaaa aaaaaataga tttaccatta 1440 taagaatttt taagtcaaca tatagttaga aaaaaaaagt taatggtcaa atgagtatat 1500 tggacataca tagtaaatag tactaataat acatagatag tactcttcac agtggttctg 1560 ggttggggcg gtactgcaaa ccaaacaaaa gagtgatagg atggcgtcag aactaagaaa 1620 tgcaatatta attttgcaaa tatttaatct gaaagttatc tatgatgtaa aatacataat 1680 gggttttaga ccttgctgac gtctgtcaac tggacaacaa ctttatttcc tttcttttat 1740 atcattgtta tactccctct gtcctagaaa aaacaacttt cgtacgtgaa cttggaaagt 1800 tgatttattt tatgatggag ggagcataga tgaagtcaat atgcccatgc taactctact 1860 agaaacctga ttatgcttta attgattgaa tacagatata gcctatatag gagactgcgt 1920 tcagacattg atcagtatga aggaggactg gaaacatttt ctcgcggtta tgagaagttt 1980 ggatttaatc acaggtatag tttcttttac attgtaaccg cacatcactt ctctgggtgt 2040 aacaaaataa ctcagtgata ttcatccttc ttcccatgta gtgctgaagg tgtcacttat 2100 cgagaatggg ctcccggggc acatgtatgt tcttttgata gtctcaccat ttacctaaaa 2160 tgctacatta ttagttccat atttctagta catgtagata taattaccat gccatatatt 2220 ctgagatatt ccagattgta tggaatttat aattctcaga tgaacaactt gtcaatgtac 2280 ttgactagac gttgttaaga actaattttt gcttccaatt gcagtctgca gcattagtag 2340 gtgacttcaa caattggaat ccaaatgcag accgcatgag caaagtaagc ccacaggctc 2400 acaaatatgc ccttcctttc ttcaaaaata ttttgtttac atttctttaa ctaatttatt 2460 tggttatagc attggtttca tctatactct agagttgagc tagtgatata tcatgcgaac 2520 gcatgtatag cgcagtggta aacctgactc gaacctggat tttcgcacaa aaaaaattaa 2580 atccctcctt gcaaatgctg gcagaagcgt gctccccatg tgaggttgag caatcccggt 2640 tgtgcgatgc gttcaggggt ggggttctca acttagcttc atgctgcggg ccatcttaac 2700 ccgccgattg agtttttata tatatatatc atgcacactc ttatatgtta ttgactgttg 2760 ccatgagtta actgttagtt atcggttttg atgctactgt agtggtagta cattaatgtt 2820 gtgtatgtta catgtacatt ctttagtacc tagatgtatt ttgcagtttt tgtggacttg 2880 ataggagaag atgagtagct tgaggttgta actaataatg catggaccta gtgttgtaat 2940 tccatatgat tggtaagttg gtagttaccg atgctcatat ctaatgcaac tgtttccaga 3000 atgagtttgg tgtttgggag atttttctgc ctaacaatgc tgatggctca tctcctattc 3060 cacatggctc acgtgtaaag gtaattcctt atcctgcttg gccagtgttt tagctctggg 3120 cctgtgagca tctccctgta tcaagcatgc cttttgtcat ctaggtgcga atggaaactc 3180 catctggtat aaaggattct attcctgcct ggatcaagta ctctgtgcag gccgcaggag 3240 aaatcccata caatggaata tattatgatc ctcctgaaga ggtacctccc cccccccccc 3300 ccaacacgtg cacacgccat ttgaatatgt tcttgttcct tgaaaaaagt gcttcatttg 3360 tacttgtgaa tacttctgta atgtccttgg actcttggaa atttctcttt ttgttggcat 3420 ctttagattg ttctttttat ctagttatta aaatgtttta tatgactatg caggagaagt 3480 acatattcaa gcatcctcaa cctaaaagac caaagtcatt gcggatatac gaaactcatg 3540 ttggaatgag tagcacggta atgcatcttt tcttttaatt actagccata tacagttcaa 3600 gttaacttac attctagaat tatattaaag tgctgttagc cttaattttt ataactgtct 3660 acttctaagc agtgataagt tgttacaagt ttcctctgta ataatatatt aatacaatca 3720 gcacattttt tgcacattcg tcaacaatta gccgtttata taacctttgc tggatggttg 3780 attcaaatat gatgttttga aacaaattac tgatatttac actgatataa tttttgattt 3840 atgttttctg ctaacatagg gtatatttaa ttaatctatg tttgtatttc ttacaaacgg 3900 gtacggttat tattacataa taaaaaatag cgaataacac catgcctacc atttgtatac 3960 attttttttt gggcgtctgt tggtaattta tgattttcct gtactatgct ggctggtatt 4020 aattttaata ttgcaatcag gagccaaaga tcaacacgta tgcaaacttt agggatgagg 4080 tgcttccaag aatcaaaaag cttggataca atgcagtgca aataatggca attcaagagc 4140 atgcatatta tggaagcttt gggtgatcaa attacatatt gctggattta tttcttgtct 4200 ttgcagttta catatatatg cttttagact ttatctttca tcttccttgt tccctttgta 4260 taatgtgata aactgcttca tctttcttat catctttatc ttccttttat actcatgaaa 4320 caatgctgtt actgacccct tttgtttccc cttttgtttt ggtacaattg aactgtaaca 4380 aatgacattc gccacctttt gaatgaatgg ctattgagat aattttcaat tgtcaattaa 4440 gacttttatt atgggtgagc aatgcagatt ttttactttt gtttcaggta ccatgtcacc 4500 aatttctttg caccaagtag tcgtttcggg accccagaag atttaaagtc attgattgat 4560 aaagctcatg agcttggttt agttgtgctc atggatgttg ttcacaggta attaattact 4620 ccctctgctc atttttataa ggcatatttt aattttagaa agtatttatg actgaaattt 4680 gacaattaat ttctcataaa atatatttat catagctata aaaccaatat aatgtgaaaa 4740 tactttgagg tatgaatcta gtggtatatg ttttatactc taaatatact tgtatatcaa 4800 ctaattattg gtcaaaatct ttcgagtttg actttctgaa atcaaaatat gcgttataaa 4860 agtgaacaga atgagtattt gttaactggt ctttcatatc taagttagta aggcgtggcc 4920 acagagataa aagaaagtcc ttataatata gaagaaggct gtggtggtaa gtctgccatt 4980 ataccaccac ctcttgagtt tgtgggatct tctgtggata aatagatcat ttatgcatgt 5040 ggctaggctg tttgtggatt aatgtttggt tccaaattgc ttacaaatta caattttttt 5100 cctgagaagt tcatgcatag ttcatttcat ttttatgata ttttttaaaa aaaatccact 5160 tctactcatg ggtatttagc taacggtatg attctctgtt ctataaaaaa aaagtacatc 5220 tagccctcat gttggtgaac cctaattatg actaatctac aaccgtagat cttctctctt 5280 ttatgcaaca tgtttaactt gaattattgc agtataagag ttttcacaat ttaaattggc 5340 tagcattcga gtttatctta ggatgggaag aaaatgaatt aaacagtttc attcatattt 5400 tctattcaat tattgaattt gagaattcaa attaatattt tattcgtgac atcttttgtt 5460 ggctttctgg tggacaacaa ctagaactaa tttacatgcc aaaatttgtc aatcaccatg 5520 gcccaaagtt tagctcattg gcctctgggt tctaagccct tttggtttca aatattaacc 5580 tttgtgttga tttactaagt ccccttttag ctgcatacct aatagcttta cctttgcccc 5640 ttttttttcc ttttgcagcc atgcgtcaaa taatacccta gatgggttga acggttttga 5700 tggtacagat acgcattact ttcatagtgg ttcacgcggc catcattgga tgtgggattc 5760 tcgccttttc aactatggga attgggaagt aaggaacacg ttaatcgcta cttcccttta 5820 caaagtatca ttattcatat gcattaatct ctattgtgtt tgccaacatt tttatcctta 5880 tacaggttct aagatttcta ctatccaatg caagatggtg gctcgaggag tataagtttg 5940 atggtttcag atttgacggt gtaacctcaa tgatgtacac tcatcatgga ttacaagtat 6000 attgcttcgt tttcattact ttatcttcac taccttctta attatgatgg ggtcaaacct 6060 agcagttgct atctgttaca atttcatatt tatttgcgtc ataaccttta tcttatgatt 6120 ccaccctcta ttttaggtag catttacggg gaactacagt gaatactttg gatttgccac 6180 tgatgctgat gcagtagttt acttgatgct ggtaaatgat ttaattcatg gactttatcc 6240 tgaggccata accatcggtg aagatgtaag tgctgactat atttgtcttt atgtactcat 6300 ttctttagca tgcatttata gcaatatttt ggcatctaga catgcttaag taagaagttg 6360 aaagcttgca ctgcatatta cgctaatgtc agttttgcct tctctagttc ataatgttgt 6420 atacccaaag cttagctttc caatcttagt gttacatatt tactattaac cccatcttga 6480 tagttgatca aattatgtcg ctggttcaag aaattgtttt ccttgggctt agaaaacagc 6540 aaggagtaat gatagttacc aaagattagt gaccacctgg tctctagtac agaagttgac 6600 catcaatgtt atacgagtat gttagtaaag aattatacaa atgtattgtt atgaaaaaaa 6660 ttcgtgacga atataatggc accatttgca tgtgaataac ctgattgttt ttatatatta 6720 ttctgagtta gagaagtttg aaatatgaac gcgtgcattc taaaaattta catatttctg 6780 aacaaaaaga gtacattttt tctgtaaaaa aagagagtat aattgtgtcc tcaaaaacag 6840 ctgtgcatgt tccatggtgc catactgtca taaccttttc ttctcttggg aaatccagcc 6900 tccctggaag tttgtgaagt acaaaaagca agttatacag tagctctgta tggtctacat 6960 ttttttttgg gaatacgcaa aatgcgtatc ttttgtatta agatcgggaa aagttgttag 7020 aacaggcaca gcaactatgt acagggagaa aggaagaaaa atgggtgtgg gaaacatata 7080 gtaatatctc gcggaacaat ttgatgacca aatgctccac ctagatgcgc gctcctgcct 7140 ccctccaggg cgcggcctcc gatgccacta gctccgctat ctcctgcatg gtcttgcatt 7200 gaccattgaa aacccggttt ttccactcct tttgtatcgt ccaggccacc aggatatgat 7260 gatggtgtca aaccctcatc tttgggccgc tatgattttg tctcggctgt cgcaccacca 7320 tacgaggaag ggctgctcat ttgatgggaa gcaatgggat tggccaatgc cgcatagaac 7380 tgtccaccat agctgtagtg tttctggaca ttggattaga aggtggtcaa ttgactccac 7440 actttgatca cagaagacac acttctgcag accacttgct cagcctgtcg cctgtatggt 7500 ctagagttgc aatagtagta acaatactct aaatcccata cgtaaaccta actctattgc 7560 aaaagataac ttaatttcaa ctgttctgtg gttaaatggc atataactac ttcaggtcag 7620 tggaatgcct acatttgccc ttcctgttca agatggtggg gttggttttg attatcgcct 7680 tcatatggct gttcctgaca aatggattga actcctcaag taagtgtttc aaattttggt 7740 taatagaaat actaattaca tatctaatga acataaactg ttttcttgtg ttaaattctt 7800 ttttgtatac attggtttcc ttgaccatga tatctctatt tctcttctga agttaattgg 7860 cataactcct gcccttgatt tttttttaaa aaaaaaaaag atcactcata tatagggtta 7920 taggcattta ccaatgtgat gtgctggatt tggtcatatg aacagtggtc gtgtgagttc 7980 cattattagt ataaaataag atgcaactac caacttatag agtttgactt ggcaacgtta 8040 catttttaat gctcctttat tatgtggtat aaaaatgccc atgctcatcg tatctcactt 8100 ttttgtcagc tgtttagctt ttatttagaa actgggaaag attgttattt tgtatccttt 8160 aattgaaaga tgtggtgcca gagtttcaat ttttatttta cacaggcaaa gtgatgaatc 8220 ttggaagatg ggtgatattg tgcacacact gactaacaga aggtggtcag agaagtgtgt 8280 tacttatgct gaaagtcatg atcaagcact agttggtgac aaaactattg cattctggtt 8340 gatggacaag gttaccacac atcaatctct aggttttagt gttttactga ttaggactgt 8400 aactaatggc tctttaatat atccttgata attatttgta ctgattttac tcaaatatac 8460 tcaatgcatt cattgtggat agtaagaacg gtatgaaaac cacagctaga tcagtgtttt 8520 aagttggata gctttaggct ttctgcagtc tacacccagt ttttcttgta ttagttgcaa 8580 catgtattta tgaattttct attctttact agttctttgg aaaatgttat ttccttgttt 8640 taatacttaa aacatat 8657 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 ctgcattctg ttcagaaact gac 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 3 catatcgtgc aagtgtgtct tgt 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 4 ccacaaccaa tcggagacgg ccat 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 5 gcttcgcaac ggcaggtttc acgt 24 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 6 tccacagtgg ggaaaatg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 7 cacccatgac aggcactt 18 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 8 ctaaggcagg ttcgtgtggg ttcac 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 9 gagcgcaaga atccattgtt ggaga 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 10 tttctcagtt cctgcgactg cgcg 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 11 tccaccccca tgcctaaagc gaaa 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 12 tacacttcca tccacactgg ttta 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 13 tggagaaggg aagtactctc agat 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 14 ctaagcatca agattcaagc atcac 25 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 15 agacgaactg gatgtgttgg t 21 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 16 ctcactatct taccaggatg aacttctg 28 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 17 caatctacaa taaattcacg gaccacagga 30 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 18 cccaccacca caccataaat g 21 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 19 tattaaccaa ccaagccagc at 22 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 20 gaactaactg gcggcttcaa c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 21 gatgcgtgac agaatcggat g 21 <110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Discrimination method for rice genetic resource and primers for discrimination of rice having amylose content <130> 1039749 <160> 21 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 8657 <212> RNA <213> OS02G32660_OsBEIIb gene <400> 1 gcgcacaccc acacaccgac caccaggcag cgcctcctcg ctttggctct cgcgtgagga 60 gggtttaggt ggaagcagag cgcgggggtt gccgggggat ccgatccggc tgcggtgcgg 120 gcgagatggc ggcgccggcg tctgcggttc ccgggagcgc ggcggggcta cgggcggggg 180 ccgtgcggtt ccccgtgcca gccggggccc ggagctggcg tgcggcggcg gagctcccga 240 cgtcgcggtc gctgctctcc ggccggagat tccccggtaa tgatcccgcg ccaccttgtt 300 gttctcgtcc gccgcgacgc gccacgcgtg cgcctcggct cgaccaggtg gcgtgccgtg 360 tcgcgtcgcg ccgcgggtgc ggtaaatcgt cgtgatcttc attttggttt tgcctgcgtc 420 tcgtgtccag gtgccgttcg cgtggggggt tccggggggc gcgtggccgt gcgcgcggcg 480 ggcgcgtcag gggaggtgat gatccccgag ggcgagagcg acgggatgcc ggtttcagca 540 ggttcagacg atctgcaggt gcgtgatcat gattcatcct gccttgacaa tactattgct 600 acatatctaa cagcattttg catgtcatgt ttgaaaatgg agacatgttc ttgtgcagtg 660 ctaccttacg agatcatata catttcacgc agtccacgtc ttgagacgtg ttgatttctg 720 tttgtgacgg gattatgata tattcagtga ttcagtcctt ttttatgtac ttagtccata 780 ctagttgtct gcgtgcataa tgataatatg atctaggtct agagcaccct atatgaggcc 840 tcaaagggca caccatatgc gtaggattga tctagagtct tgcttgttgt cgctcattcc 900 gttcagttgt cattatgttt tacttctgaa cattttatct cttgtacatt gttgtagttg 960 ccagccttag atgatgaatt aagcacggag gttggagctg aagttgagat tgagtcatct 1020 ggagcaagtg acgttgaagg cgtgaagaga gtggttgaag aattagctgc tgagcagaaa 1080 ccacgagttg tcccaccaac aggagatggg caaaaaatat tccagatgga ctctatgctt 1140 aatggctata agtaccatct tgaatatcgg tatggctttc cgcccttctt tatagatcac 1200 atagtttcat taggttatgt ttttattatt ctccatctgt tcagtctttc acaagatgta 1260 tgcaaataac tacttacgtg tcacagctga tgagactctt gaagttttat ctttagtcct 1320 gcatatatac tctgatctgt tctcaaatgg aagttgtttt agaaatcatt cagtcatgct 1380 ttaaaattta acaagagtcc taaactacta atgtgcgaaa aaaaaataga tttaccatta 1440 taagaatttt taagtcaaca tatagttaga aaaaaaaagt taatggtcaa atgagtatat 1500 tggacataca tagtaaatag tactaataat acatagatag tactcttcac agtggttctg 1560 ggttggggcg gtactgcaaa ccaaacaaaa gagtgatagg atggcgtcag aactaagaaa 1620 tgcaatatta attttgcaaa tatttaatct gaaagttatc tatgatgtaa aatacataat 1680 gggttttaga ccttgctgac gtctgtcaac tggacaacaa ctttatttcc tttcttttat 1740 atcattgtta tactccctct gtcctagaaa aaacaacttt cgtacgtgaa cttggaaagt 1800 tgatttattt tatgatggag ggagcataga tgaagtcaat atgcccatgc taactctact 1860 agaaacctga ttatgcttta attgattgaa tacagatata gcctatatag gagactgcgt 1920 tcagacattg atcagtatga aggaggactg gaaacatttt ctcgcggtta tgagaagttt 1980 ggatttaatc acaggtatag tttcttttac attgtaaccg cacatcactt ctctgggtgt 2040 aacaaaataa ctcagtgata ttcatccttc ttcccatgta gtgctgaagg tgtcacttat 2100 cgagaatggg ctcccggggc acatgtatgt tcttttgata gtctcaccat ttacctaaaa 2160 tgctacatta ttagttccat atttctagta catgtagata taattaccat gccatatatt 2220 ctgagatatt ccagattgta tggaatttat aattctcaga tgaacaactt gtcaatgtac 2280 ttgactagac gttgttaaga actaattttt gcttccaatt gcagtctgca gcattagtag 2340 gtgacttcaa caattggaat ccaaatgcag accgcatgag caaagtaagc ccacaggctc 2400 acaaatatgc ccttcctttc ttcaaaaata ttttgtttac atttctttaa ctaatttatt 2460 tggttatagc attggtttca tctatactct agagttgagc tagtgatata tcatgcgaac 2520 gcatgtatag cgcagtggta aacctgactc gaacctggat tttcgcacaa aaaaaattaa 2580 atccctcctt gcaaatgctg gcagaagcgt gctccccatg tgaggttgag caatcccggt 2640 tgtgcgatgc gttcaggggt ggggttctca acttagcttc atgctgcggg ccatcttaac 2700 ccgccgattg agtttttata tatatatatc atgcacactc ttatatgtta ttgactgttg 2760 ccatgagtta actgttagtt atcggttttg atgctactgt agtggtagta cattaatgtt 2820 gtgtatgtta catgtacatt ctttagtacc tagatgtatt ttgcagtttt tgtggacttg 2880 ataggagaag atgagtagct tgaggttgta actaataatg catggaccta gtgttgtaat 2940 tccatatgat tggtaagttg gtagttaccg atgctcatat ctaatgcaac tgtttccaga 3000 atgagtttgg tgtttgggag atttttctgc ctaacaatgc tgatggctca tctcctattc 3060 cacatggctc acgtgtaaag gtaattcctt atcctgcttg gccagtgttt tagctctggg 3120 cctgtgagca tctccctgta tcaagcatgc cttttgtcat ctaggtgcga atggaaactc 3180 catctggtat aaaggattct attcctgcct ggatcaagta ctctgtgcag gccgcaggag 3240 aaatcccata caatggaata tattatgatc ctcctgaaga ggtacctccc cccccccccc 3300 ccaacacgtg cacacgccat ttgaatatgt tcttgttcct tgaaaaaagt gcttcatttg 3360 tacttgtgaa tacttctgta atgtccttgg actcttggaa atttctcttt ttgttggcat 3420 ctttagattg ttctttttat ctagttatta aaatgtttta tatgactatg caggagaagt 3480 acatattcaa gcatcctcaa cctaaaagac caaagtcatt gcggatatac gaaactcatg 3540 ttggaatgag tagcacggta atgcatcttt tcttttaatt actagccata tacagttcaa 3600 gttaacttac attctagaat tatattaaag tgctgttagc cttaattttt ataactgtct 3660 acttctaagc agtgataagt tgttacaagt ttcctctgta ataatatatt aatacaatca 3720 gcacattttt tgcacattcg tcaacaatta gccgtttata taacctttgc tggatggttg 3780 attcaaatat gatgttttga aacaaattac tgatatttac actgatataa tttttgattt 3840 atgttttctg ctaacatagg gtatatttaa ttaatctatg tttgtatttc ttacaaacgg 3900 gtacggttat tattacataa taaaaaatag cgaataacac catgcctacc atttgtatac 3960 attttttttt gggcgtctgt tggtaattta tgattttcct gtactatgct ggctggtatt 4020 aattttaata ttgcaatcag gagccaaaga tcaacacgta tgcaaacttt agggatgagg 4080 tgcttccaag aatcaaaaag cttggataca atgcagtgca aataatggca attcaagagc 4140 atgcatatta tggaagcttt gggtgatcaa attacatatt gctggattta tttcttgtct 4200 ttgcagttta catatatatg cttttagact ttatctttca tcttccttgt tccctttgta 4260 taatgtgata aactgcttca tctttcttat catctttatc ttccttttat actcatgaaa 4320 caatgctgtt actgacccct tttgtttccc cttttgtttt ggtacaattg aactgtaaca 4380 aatgacattc gccacctttt gaatgaatgg ctattgagat aattttcaat tgtcaattaa 4440 gacttttatt atgggtgagc aatgcagatt ttttactttt gtttcaggta ccatgtcacc 4500 aatttctttg caccaagtag tcgtttcggg accccagaag atttaaagtc attgattgat 4560 aaagctcatg agcttggttt agttgtgctc atggatgttg ttcacaggta attaattact 4620 ccctctgctc atttttataa ggcatatttt aattttagaa agtatttatg actgaaattt 4680 gacaattaat ttctcataaa atatatttat catagctata aaaccaatat aatgtgaaaa 4740 tactttgagg tatgaatcta gtggtatatg ttttatactc taaatatact tgtatatcaa 4800 ctaattattg gtcaaaatct ttcgagtttg actttctgaa atcaaaatat gcgttataaa 4860 agtgaacaga atgagtattt gttaactggt ctttcatatc taagttagta aggcgtggcc 4920 acagagataa aagaaagtcc ttataatata gaagaaggct gtggtggtaa gtctgccatt 4980 ataccaccac ctcttgagtt tgtgggatct tctgtggata aatagatcat ttatgcatgt 5040 ggctaggctg tttgtggatt aatgtttggt tccaaattgc ttacaaatta caattttttt 5100 cctgagaagt tcatgcatag ttcatttcat ttttatgata ttttttaaaa aaaatccact 5160 tctactcatg ggtatttagc taacggtatg attctctgtt ctataaaaaa aaagtacatc 5220 tagccctcat gttggtgaac cctaattatg actaatctac aaccgtagat cttctctctt 5280 ttatgcaaca tgtttaactt gaattattgc agtataagag ttttcacaat ttaaattggc 5340 tagcattcga gtttatctta ggatgggaag aaaatgaatt aaacagtttc attcatattt 5400 tctattcaat tattgaattt gagaattcaa attaatattt tattcgtgac atcttttgtt 5460 ggctttctgg tggacaacaa ctagaactaa tttacatgcc aaaatttgtc aatcaccatg 5520 gcccaaagtt tagctcattg gcctctgggt tctaagccct tttggtttca aatattaacc 5580 tttgtgttga tttactaagt ccccttttag ctgcatacct aatagcttta cctttgcccc 5640 ttttttttcc ttttgcagcc atgcgtcaaa taatacccta gatgggttga acggttttga 5700 tggtacagat acgcattact ttcatagtgg ttcacgcggc catcattgga tgtgggattc 5760 tcgccttttc aactatggga attgggaagt aaggaacacg ttaatcgcta cttcccttta 5820 caaagtatca ttattcatat gcattaatct ctattgtgtt tgccaacatt tttatcctta 5880 tacaggttct aagatttcta ctatccaatg caagatggtg gctcgaggag tataagtttg 5940 atggtttcag atttgacggt gtaacctcaa tgatgtacac tcatcatgga ttacaagtat 6000 attgcttcgt tttcattact ttatcttcac taccttctta attatgatgg ggtcaaacct 6060 agcagttgct atctgttaca atttcatatt tatttgcgtc ataaccttta tcttatgatt 6120 ccaccctcta ttttaggtag catttacggg gaactacagt gaatactttg gatttgccac 6180 tgatgctgat gcagtagttt acttgatgct ggtaaatgat ttaattcatg gactttatcc 6240 tgaggccata accatcggtg aagatgtaag tgctgactat atttgtcttt atgtactcat 6300 ttctttagca tgcatttata gcaatatttt ggcatctaga catgcttaag taagaagttg 6360 aaagcttgca ctgcatatta cgctaatgtc agttttgcct tctctagttc ataatgttgt 6420 atacccaaag cttagctttc caatcttagt gttacatatt tactattaac cccatcttga 6480 tagttgatca aattatgtcg ctggttcaag aaattgtttt ccttgggctt agaaaacagc 6540 aaggagtaat gatagttacc aaagattagt gaccacctgg tctctagtac agaagttgac 6600 catcaatgtt atacgagtat gttagtaaag aattatacaa atgtattgtt atgaaaaaaa 6660 ttcgtgacga atataatggc accatttgca tgtgaataac ctgattgttt ttatatatta 6720 ttctgagtta gagaagtttg aaatatgaac gcgtgcattc taaaaattta catatttctg 6780 aacaaaaaga gtacattttt tctgtaaaaa aagagagtat aattgtgtcc tcaaaaacag 6840 ctgtgcatgt tccatggtgc catactgtca taaccttttc ttctcttggg aaatccagcc 6900 tccctggaag tttgtgaagt acaaaaagca agttatacagag tagctctgta tggtctacat 6960 ttttttttgg gaatacgcaa aatgcgtatc ttttgtatta agatcgggaa aagttgttag 7020 aacaggcaca gcaactatgt acagggagaa aggaagaaaa atgggtgtgg gaaacatata 7080 gt; ccctccaggg cgcggcctcc gatgccacta gctccgctat ctcctgcatg gtcttgcatt 7200 gaccattgaa aacccggttt ttccactcct tttgtatcgt ccaggccacc aggatatgat 7260 gatggtgtca aaccctcatc tttgggccgc tatgattttg tctcggctgt cgcaccacca 7320 tacgaggaag ggctgctcat ttgatgggaa gcaatgggat tggccaatgc cgcatagaac 7380 tgtccaccat agctgtagtg tttctggaca ttggattaga aggtggtcaa ttgactccac 7440 actttgatca cagaagacac acttctgcag accacttgct cagcctgtcg cctgtatggt 7500 ctagagttgc aatagtagta acaatactct aaatcccata cgtaaaccta actctattgc 7560 aaaagataac ttaatttcaa ctgttctgtg gttaaatggc atataactac ttcaggtcag 7620 tggaatgcct acatttgccc ttcctgttca agatggtggg gttggttttg attatcgcct 7680 tcatatggct gttcctgaca aatggattga actcctcaag taagtgtttc aaattttggt 7740 taatagaaat actaattaca tatctaatga acataaactg ttttcttgtg ttaaattctt 7800 ttttgtatac attggtttcc ttgaccatga tatctctatt tctcttctga agttaattgg 7860 cataactcct gcccttgatt tttttttaaa aaaaaaaaag atcactcata tatagggtta 7920 taggcattta ccaatgtgat gtgctggatt tggtcatatg aacagtggtc gtgtgagttc 7980 cattattagt ataaaataag atgcaactac caacttatag agtttgactt ggcaacgtta 8040 catttttaat gctcctttat tatgtggtat aaaaatgccc atgctcatcg tatctcactt 8100 ttttgtcagc tgtttagctt ttatttagaa actgggaaag attgttattt tgtatccttt 8160 aattgaaaga tgtggtgcca gagtttcaat ttttatttta cacaggcaaa gtgatgaatc 8220 ttggaagatg ggtgatattg tgcacacact gactaacaga aggtggtcag agaagtgtgt 8280 tacttatgct gaaagtcatg atcaagcact agttggtgac aaaactattg cattctggtt 8340 gatggacaag gttaccacac atcaatctct aggttttagt gttttactga ttaggactgt 8400 aactaatggc tctttaatat atccttgata attatttgta ctgattttac tcaaatatac 8460 tcaatgcatt cattgtggat agtaagaacg gtatgaaaac cacagctaga tcagtgtttt 8520 aagttggata gctttaggct ttctgcagtc tacacccagt ttttcttgta ttagttgcaa 8580 catgtattta tgaattttct attctttact agttctttgg aaaatgttat ttccttgttt 8640 taatacttaa aacatat 8657 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 ctgcattctg ttcagaaact gac 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 3 catatcgtgc aagtgtgtct tgt 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 4 ccacaaccaa tcggagacgg ccat 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 5 gcttcgcaac ggcaggtttc acgt 24 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 6 tccacagtgg ggaaaatg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 7 cacccatgac aggcactt 18 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 8 ctaaggcagg ttcgtgtggg ttcac 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 9 gagcgcaaga atccattgtt ggaga 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 10 tttctcagtt cctgcgactg cgcg 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 11 tccaccccca tgcctaaagc gaaa 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 12 tacacttcca tccacactgg ttta 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 13 tggagaaggg aagtactctc agat 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 14 ctaagcatca agattcaagc atcac 25 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 15 agacgaactg gatgtgttgg t 21 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 16 ctcactatct taccaggatg aacttctg 28 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 17 caatctacaa taaattcacg gaccacagga 30 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 18 cccaccacca caccataaat g 21 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 19 tattaaccaa ccaagccagc at 22 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 20 gaactaactg gcggcttcaa c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 21 gatgcgtgac agaatcggat g 21
Claims (6)
유전자좌가 LOC_Os02g32660(gene locus LOC_Os02g32660; 서열번호 1)인 벼 유래 OsBEIIb 유전자의 3'유티알(3'UTR)의 63번째 뉴클레오타이드(유전자좌 LOC_Os02g32660의 8491번째 염기)인 G가 C로 치환된 단일염기다형을 포함하는 변이된 OsBEⅡb 유전자.It is involved in amylose formation of rice,
A single base polymorphism in which G, the 63rd nucleotide (8491th base of locus LOC_Os02g32660) of 3'-utyl (3'UTR) of rice-derived OsBEIIb gene, whose locus is LOC_Os02g32660 (SEQ ID NO: 1) A mutated OsBElb gene containing.
상기 1단계에서 분리한 핵산분자에서 단일염기다형(SNP)의 염기타입을 확인하는 2 단계; 를 포함하고,
상기 단일염기다형은 유전자좌가 LOC_Os02g32660(gene locus LOC_Os02g32660; 서열번호 1)인 벼 유래 OsBEIIb 유전자의 3'유티알(3'UTR)의 63번째 뉴클레오타이드(유전자좌 LOC_Os02g32660의 8491번째 염기)인 G가 C로 치환된 단일염기다형을 포함하는 벼 유전자원 판별방법.A step 1 for separating the nucleic acid molecule from the rice sample; And
(2) confirming the base type of single nucleotide polymorphism (SNP) in the nucleic acid molecule isolated in step 1; Lt; / RTI >
The single nucleotide polymorphism is a nucleotide polymorphism in which G, the 63rd nucleotide (8491th base of the locus LOC_Os02g32660) of the 3'-utyl (3'UTR) of the OsBEIIb gene derived from rice, whose locus is LOC_Os02g32660 (SEQ ID NO: A method for discriminating rice genetic origin comprising single nucleotide polymorphisms.
상기 폴리뉴클레오타이드는 유전자좌가 LOC_Os02g32660(gene locus LOC_Os02g32660; 서열번호 1)인 벼 유래 OsBEIIb 유전자의 3'유티알(3'UTR)의 63번째 뉴클레오타이드(유전자좌 LOC_Os02g32660의 8491번째 염기)를 포함하는 벼 유전자원 판별방법.4. The method according to claim 3, wherein the step (2) is performed by amplifying the separated nucleic acid molecule using a pair of primers designed to amplify the polynucleotide,
The polynucleotide was identified as a rice genetic origin containing the 63rd nucleotide (locus LOC_Os02g32660, locus LOC_Os02g32660) of 3'-utyl (3'UTR) of rice-derived OsBEIIb gene whose locus was LOC_Os02g32660 (SEQ ID NO: Way.
1단계에서 분리한 핵산분자와 유전자좌가 LOC_Os02g32660인 벼 유래 OsBEIIb 유전자의 3'유티알의 63번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일염기다형가 G/C인 이형유전자형;
을 확인하는 것인 벼 유전자원 판별방법.4. The method according to claim 3, wherein in step 2, the base type identification of the single base polymorphism
A heterozygous genotype having a single nucleotide polymorphism G / C corresponding to the 63rd nucleotide of 3 'utila of the rice-derived OsBEllb gene having the nucleic acid molecule isolated in step 1 and the locus LOC_Os02g32660;
Of the rice genome.
염기서열 분석을 통해 3'유티알(3'UTR)의 63번째 뉴클레오타이드에 존재하는 단일염기다형을 검출하는 것을 특징으로 하는 벼 유전자원 판별방법.4. The method according to claim 3, wherein in step 2, the OsBEIIb gene is amplified using primer pairs of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15,
Wherein the single nucleotide polymorphism present in the 63rd nucleotide of 3'-util (3'UTR) is detected through sequencing analysis.
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| KR20220150634A (en) * | 2021-05-04 | 2022-11-11 | 충남대학교산학협력단 | Molecular marker for discriminating genotype of ESP2 gene regulating amylose content in rice and uses thereof |
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2013
- 2013-07-05 KR KR1020130079160A patent/KR101500613B1/en not_active Expired - Fee Related
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| KR102505574B1 (en) | 2021-05-04 | 2023-03-03 | 충남대학교 산학협력단 | Molecular marker for discriminating genotype of ESP2 gene regulating amylose content in rice and uses thereof |
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