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KR101499929B1 - 세포의 무균 증식 장치 - Google Patents

세포의 무균 증식 장치 Download PDF

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KR101499929B1
KR101499929B1 KR1020147013014A KR20147013014A KR101499929B1 KR 101499929 B1 KR101499929 B1 KR 101499929B1 KR 1020147013014 A KR1020147013014 A KR 1020147013014A KR 20147013014 A KR20147013014 A KR 20147013014A KR 101499929 B1 KR101499929 B1 KR 101499929B1
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케이티 레베카 뉴톤
티나 레슬리 크롬비
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셀 메디카 리미티드
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Abstract

치료용 세포의 무균 배양에 적절한 밀폐형 시스템은 세포 성장을 지원하고 배양 중에 가스가 세포로 전달되도록 하기에 적절한 가스 투과성 부분을 포함하는 용기와; 외부 오리피스와 이로부터 이격되는 내부 오리피스를 한정하는 도관을 포함하되, 시스템의 외부로부터 용기의 내부 체적 내로 연장되어 내부 오리피스와 함께 내부 체적 내에서 종결되며, 내부 오리피스는 액체 매체의 충전 및 비움 중에 액체에 의한 막힘에 민감하지 않도록 배열되며, 외부 오리피스는 무균 필터에 연결되도록 적합화됨으로써, 필요에 따라 가스가 필터를 통해 용기 내외로 전달되도록 하여 유체와 세포의 용기 내외로의 진출입을 실현하는 배출구와; 유체와 세포가 용기 내로 무균 도입되도록 적합화되고, 시스템을 외부 환경에 노출시키지 않은 상태에서 유체가 시스템에서 배출되도록 적합화되고, 세포를 유출구와 유체 연통된 상태에 두도록 시스템이 배향되고 유출구가 개방될 때 내부에서 성장한 세포가 중력에 의해 시스템에서 배출될 수 있도록 적합화되는 출입구 또는 출입구들을 포함한다. 본 시스템은 개방형 처리 단계가 필요하지 않기 때문에 청정실 환경을 갖출 필요 없이 치료에 사용하기 위한 세포의 무균 배양을 용이하게 한다.

Description

세포의 무균 증식 장치{DEVICE FOR THE ASEPTIC EXPANSION OF CELLS}
본 명세서에 개시된 발명은 상업적으로 실행 가능한 규모로 치료용 세포를 무균 배향하기 위한 최적 시스템과, 상기 시스템의 제조 방법과, 세포 치료제를 제조하기 위해 상기 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다.
WO 2005/035728은 세포 배양을 위한 가스 투과성 부분을 갖춘 시스템을 설명한다. 이 장치는 상표명 지-렉스 테크놀로지(G-Rex Technology)로 웰슨 울프(Wilson Wolf)에서 구입 가능하다(웹사이트 www.wilsonwolf.com/page/show/67596 참조). 본 시스템의 주된 편익은 어떤 추가적인 개입이 없는 상태에서 세포가 14일에 이르는 기간 동안 계속해서 성장할 수 있는 방식으로 영양분과 가스가 성장하는 세포에 공급될 수 있다는 것인데, 특히, 가스 투과성 멤브레인으로 인해 CO2와 O2의 교환이 가능해지고, 장치로 인해 성장에 필요한 모든 영양분을 제공하는 다량의 매체가 사용될 수 있다. 본 장치는 도 1에 도시되어 있다.
지-렉스 테크놀로지(G-Rex Technology)의 주된 한계는 외부 환경에 노출되지 않고서는 세포의 주입 및 수확과 영양분의 첨가가 가능하지 않은 개방형 제조 시스템이라는 것이다. 세포 치료제는 생산 후에는 살균될 수 없기 때문에, 그 제조는 무균 상태에서 이루어져야 한다. 따라서, 생성물이 외부 환경에 노출되는 "개방형" 처리 단계는 미생물과 미진에 의한 생성물의 오염을 방지하기 위해 EU-GMP 분류 등급 B(미국연방규격 209e 등급 10,000, ISO 14644-1 등급 IS07)에 따라 분류된 청정실에서 운용되는 층상 기류 캐비닛 하에서 수행되어야 한다. 개방형 처리를 위해 이런 청정실 기술을 갖춘 시설은 건설, 운용, 유지 및 감시에 많은 비용이 든다.
개방형 운용 단계에서는 교차 오염의 위험을 최소화하기 위해 동일한 청정실 공간에서 한 번에 하나의 생성물만을 취급할 수 있고, 따라서 생성물 처리량이 제한되고 높은 생성물 산출량을 달성하기 위해서는 다수의 청정실과 생산 팀을 병행 운용하는 본 제조 시스템에 필요하다는 사실도 중요하다. 중소형 기업과 병원에 있어, 자본 투자와 인건비는 생산 단위 기준으로 대단히 중요하다.
이 문제를 해결하기 위해, 본 발명자는 개방형 처리 단계가 필요하지 않기 때문에 청정실 환경을 갖추지 않고서도 치료용 세포의 무균 제조를 가능하게 하는 개선된 세포 배양 시스템을 마련하였다.
따라서, 본 발명은 치료용 세포의 무균 배양에 적절한 밀폐형 세포 배양 시스템으로서,
(ⅰ) 세포 성장을 지원하고 배양 중에 가스가 세포로 전달되도록 하기에 적절한 가스 투과성 부분과, 기저부(base)에 접하는 적어도 하나의 벽을 포함하되, 내부 체적을 한정하고, 배양 중에 세포를 지원하기 위한 필수 매체량을 수용하도록 적합화 된 용기(vessel)와,
(ⅱ) 서로 유체 연통되는 내부 오리피스와 이로부터 이격되는(distal therefrom) 외부 오리피스를 한정하는 도관을 포함하되, 도관은 시스템의 구조 특징부를 통해 밀폐형 시스템의 외부로부터 연장되고 선택적으로 용기의 내부 체적 내로 연장되고 내부 오리피스와 함께 내부 체적 내에서 종결되며, 내부 오리피스는 액체 매체 및/또는 세포의 충전 및 비움 중에 액체나 세포에 의한 막힘에 민감하지 않도록 내부 체적 내에 배열되며, 외부 오리피스는 무균 필터에 연결되도록 적합화됨으로써, 필요에 따라 가스가 필터를 통해 용기 내외로 전달되도록 하는 배출구(vent)와,
(ⅲ) 유체와 세포가 상기 용기 내로 무균 도입되도록 적합화되고, 시스템을 외부 환경에 노출시키지 않고 유체와 세포가 시스템에서 배출되도록 적합화되고, 세포를 유출구(exit port)와 유체 연통된 상태에 두도록 시스템이 배향되고 유출구가 개방될 때 내부에서 성장한 세포가 중력에 의해 시스템에서 배출될 수 있도록 적합화되는 출입구(port)를 포함하는 밀폐형 세포 배양 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 시스템은 치료에 사용되는 세포의 상업적 제조에 상당한 편익을 가진다. 특히, 본 시스템은 융통성과 적응성을 가지고, 제조 공간 관련 자본 투자가 많이 필요하지 않고, 강인하며, 제조가 용이하다. 또한, 본 시스템은 개방형 처리 단계를 제거하며, 따라서 병원균과 미진에 의한 생성물의 오염 위염을 한층 더 저감한다. 또한, 본 시스템은 현재의 미충족 요구를 충족하는 것으로 여겨지며, 치료용 세포의 제조를 위해 값비싼 청정실 시설에 대한 필요를 줄이는 데 있어 진정한 진전을 보여준다.
유리하게는, 본 발명은 외부 환경에 노출되지 않은 상태에서 세포의 주입 및 수확과 영양분의 공급을 가능하게 하는 밀폐형 시스템을 제공하기 위해 G-Rex 시스템과 같은 기존의 개방형 시스템 기술을 변형할 수 있도록 한다.
대안으로서, 예컨대 도 7 또는 도 8에 도시된 시스템과 같은, 개시된 본 발명에 따른 맞춤형 시스템이 세포 치료제의 배양을 위해 특수 제작될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 설명하는 시스템을 제조하는 방법과, 세포를 배양하기 위한 시스템의 사용에 관한 것이다.
도 1은 Wilson Wolf에서 구입 가능한 세포 배양용 상용 G-Rex 시스템의 개략도를 도시한다.
도 2는 배출구와 출입구가 공동 배치된 뚜껑을 포함하는 용기의 개략도이다.
도 3은 유닛의 벽에 공동 배치되는 배출구와 출입구를 포함하는 본 발명에 따른 일체형 용기의 개략도이다.
도 4는 서로 대향하여 배치되는 배출구와 출입구를 포함하는 본 발명에 따른 일체형 용기의 개략도이다.
도 5는 배출구와 출입구가 서로에 대해 수직하게 배열되는 본 발명에 따른 일체형 용기의 개략도이다.
도 6은 배출구와 출입구가 공동 배치된 뚜껑을 포함하는 용기의 개략도로, 배출구는 가스 투과성 층을 향해 매체 내로 하향 연장된다. 내부 오리피스는 매체가 배출구에 진입하는 것을 방지하기 위해 가스 투과성 멤브레인과 같은 액체 불투과성 멤브레인으로 피복된다.
도 7은 유닛의 벽에 공동 배치되는 배출구와 출입구를 포함하는, 본 발명에 따른 종(bell) 형상의 일체형 용기의 개략도이다.
도 8은 유닛의 벽에 공동 배치되고 매체와 세포가 유출구에 접근할 수 있도록 배향되는 배출구와 출입구를 포함하는 본 발명에 따른 종 형상 일체형 용기의 개략도이다.
도 9는 본 발명에 따른 시스템이 어떻게 충전되고 수확되는 지를 보여주는 개략도이다.
도 10은 본 발명에 따른 시스템의 개략도이다.
도 11은 도 10에 도시된 시스템의 상세도이다.
도 12는 내부에 배양된 세포를 수확하기 위해 시스템을 배향하는 방법을 보여주는 개략도이다.
본 명세서에서 사용되는 밀폐형 시스템은 외부 환경에 노출되지 않은 상태에서 액체, 세포 및 가스를 포함하는 물질의 진출입을 가능하게 한다.
그럼에도, 본 발명에 따른 밀폐형 시스템은 본 시스템에 물질을 도입하거나 추출할 때 최종 사용자가 전용 프로토콜을 따르지 않기로 결정할 경우 개방형 시스템으로 사용될 수도 있다. 그러나, 본 명세서에서 개시되는 시스템은 밀폐형 시스템으로 사용하기에 적절하도록 배열되고 적합화되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 "세포 배양"은 체외에서 세포를 증식하고/하거나 분화하는 것을 언급하고자 한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "세포 증식"은 세포군 내의 표적 세포의 수를 증가시키는 것을 가리킨다.
본 명세서에 원용되는 WO 2005/035728은 가스 투과성 용기를 제조하는 방법을 설명한다. 일 실시예에서는, 가스 투과성 실리콘 재료가 사용된다.
일 실시예에서, 기저부 지지체(base supports)는 가스 투과성 재료를 포함한다.
일 실시예에서, 기저부는 실질적으로 가스 투과성 재료로 구성되는데, 즉 가스 투과성 재료층과 기저부는 사실상 동일한 존재물이다.
일 실시예에서, 가스 투과성 층은 용기의 벽 또는 다른 구조적 특징부에 배치된다.
일 실시예에서, 실질적으로 용기의 전부는 예컨대 배양 중에 내용물을 보유하기에 충분한 구조적 강도를 갖는 가스 투과성 재료로 제조된다.
일 실시예에서, 가스 투과성 멤브레인은 5 cm2 내지 200 cm2, 예컨대 5 cm2 내지 100 cm2, 특히 10 cm2, 30 cm2 또는 50 cm2, 예컨대 10 cm2의 표면적을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 기저부는 용기의 구조적 요소이다.
세포가 배양 중일 때, 일반적으로 시스템은 기저부 상에 배향되며(또는 기저부 상에 위치하며), 예컨대 기저부는 편평하거나 실질적으로 편평하다. 공기의 순환이 가능하도록 시스템이 기저부 상에 위치하지 않더라도, 배양 중에 기저부는 시스템의 최하부에 해당할 수 있다.
일반적으로, 배양 공정 중에, 세포는 가스 투과성 층의 내면, 예컨대 기저부의 면에 평행한 면에 내려앉아 해당 면에 의해 지지되는 경향이 있다.
본 발명의 맥락에서 기저부는 예컨대 기저부(1)를 도시하는 도 5 내지 도 8에 도시된 장치를 참조하여 이해할 수 있다. 명백히, 시스템이 기능하기 위해서는 기저부의 가스 투과성 층이 환경 가스에 접근할 수 있어야 한다. 따라서, 외부 가스 환경에 대한 접근을 보장하기 위해 기저부는 시스템이 위치해 있거나 배치되는 표면 위로 상승될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "접하는(adjoined)"은 어느 한 요소가 다른 요소에 부착된다는 사실을 언급하고자 한 것이다.
사용되는 용기는 일반적으로 강성 또는 실질적 강성이거나 탄력적으로 변형 가능하지만 영구적으로 변형 가능하지는 않다. 그러나, 용기는 신축성 또는 변형가능 재료로 이루어진 부분을 포함할 수 있다. 이들 신축성 재료는 수액 백(infusion bag)의 제조에 사용되는 유형의 재료를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 용기와 용기의 실질적으로 모든 구조적 요소는 강성이다. 본 발명의 용기와 시스템은 정육면체, 박스, 원통, 원추 또는 피라미드로부터 파생하는 다양한 형상과 크기로 마련될 수 있다. 그러나, 대개 그 형상의 적어도 하나의 영역 또는 면은 배출구, 출입구 또는 출입구들 및/또는 시스템의 다른 요소를 수용하기 위해 적합화된다. 순수 형상(pure shape)도 사용될 수 있지만, 의도된 목적에 맞는 맞춤형 용기를 제공하도록 대개 형상을 적합화하기 때문에 일반적으로는 사용되지 않을 것이다. 예컨대 원추 형상은 기저부와 만곡형 벽과 최상부 벽 또는 뚜껑을 포함하는 절두 원추형 형상을 제공하도록 적합화될 수 있다. 최상부 벽 또는 뚜껑은 출입구(들) 및/또는 배출구를 수용할 수 있다.
일 실시예에서, 용기는 재밀폐식(re-sealable) 뚜껑과 연계되거나 이를 포함하며, 용기와 뚜껑은 함께 밀폐형 시스템을 형성한다. 재밀폐식 뚜껑은 재밀폐식 뚜껑의 일 유형인 나사형 뚜껑을 포함하는 장치를 도시하는 도 1을 참조하여 예시될 수 있다.
일 실시예에서, 뚜껑은 용기에 식각된 나사산을 통해 뚜껑을 돌려 조임으로써 용기에 부착되며, 이로써 외부 환경의 미생물과 미진으로 인한 오염으로부터 내용물을 보호하는 밀봉부가 생성될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 시스템은 기존 시스템을 변경함으로써 마련될 수 있는데, 예컨대 제조 시스템의 다른 구성요소가 무균적으로 연결될 수 있는 배출구와 하나 또는 두 개의 출입구를 통합함으로써 G-Rex 유닛을 변경하여 제공될 수 있다. 일 실시예에서, 배출구와 출입구 또는 출입구들은 G-Rex 시스템의 뚜껑에 통합된다. 이는 세포 치료제를 배양하기 위한 밀폐형 시스템을 제조하는 비용 효율적인 방식을 제공하는데, 본 시스템은 생성물이 외부 환경에 결코 노출되지 않기 때문에 EU-GMP 등급 D(미국연방규격 209e 등급 100,000, ISO 14644-1 등급 IS08)에 따라 분류되는 청정실의 층상 기류 캐비닛 외부에서 운용될 수 있다. 이로써 규제 요건을 준수하는 세포 치료제의 무균 제조가 현저히 용이해진다.
일 실시예에서는, G-Rex 시스템과 같이 개시된 장치에 따른 제조 시스템 또는 용기에 본 발명에 따른 뚜껑이 마련되는데, 특히 상기 뚜껑은 본 명세서에서 검토하는 바와 같은 배출구 및/또는 출입구를 포함하거나, 해당 배출구 및/또는 출입구를 수용하기에 적합하다.
일 실시예에서, 뚜껑, 배출구 및/또는 출입구는 일체형으로, 예컨대 성형된다.
일 실시예에서, 뚜껑, 배출구 및/또는 출입구는 동일한 재료이다.
일 실시예에서, 뚜껑, 배출구 및/또는 출입구는 별개의 재료이다.
일 실시예에서, 뚜껑, 배출구 및/또는 출입구는 하나의 재료이고 뚜껑이 장착되도록 적합한 용기는 동일한 재료이다.
일 실시예에서, 뚜껑, 배출구 및/또는 출입구는 하나의 재료이고 뚜껑이 장착되도록 적합한 용기는 별개의 재료이다.
일 실시예에서, 뚜껑, 배출구 및/또는 출입구는 별개의 재료이고 뚜껑이 장착되도록 적합한 용기는 뚜껑 또는 배출구/출입구에 사용되는 재료이다.
일 실시예에서, 뚜껑, 배출구 및/또는 출입구는 별개의 재료이고 뚜껑이 장착되도록 적합한 용기는 추가적인 별개의 재료이다.
일 실시예에서는, 폴리카보네이트와 같은, 본 명세서에서 설명하는 무균 제조에 사용하기에 적절한 경질 합성재가 상기 구성요소 중 하나 이상을 제조하기 위해 사용된다.
GLP 및 규제 관점에서 볼 때, 용기, 뚜껑, 배출구 및 출입구는 동일한 재료인 것이 유리할 수 있다.
일 실시예에서, 용기가 뚜껑과 같은 착탈식 또는 재밀폐식 요소를 갖지 않는 완비형(complete) 유닛을 한정한다는 점에서 용기는 사실상 일체형이다. 일체형 용기는 예컨대 일체로 성형될 수 있지만, 본 명세서에서 사용되는 "일체형"은 용기의 제조 방법을 가리킨다기보다는 용기의 기능에 대한 설명으로, 특히 용기를 밀폐하기 위해 뚜껑과 같은 어떤 추가적인 구조적 요소도 필요하지 않다는 것을 가리킨다.
일 실시예에서는, 기저부에 대향하는 구조적 특징부(structural feature)가 내부 체적의 오목한 면을 제공하는 종(bell)형 배열(도 7, 도 8)이 제시된다. 벨과 같은 형상은 내부 체적 내의 내측 모서리의 수가 최소화되어 가능한 세포의 회수를 최대화할 수 있기 때문에 유리하다. 본 발명은 또한 이 기능을 수행하기에 적절한 대안적인 형상으로, 특히 세포를 포획할 수 있는 장소가 "만곡면(rounded surfaces)"을 사용함으로써 최소화되는 형상을 포함한다.
따라서, 일 실시예에서, 용기는 시스템이 적절한 배향으로 배치될 때 세포를 유출구(exit port)로 보내도록(funnel) 배열된다. 일 실시예에서, 내부 형상은 적절히 배향될 때 유출구를 통한 배출을 용이하게 하도록 적합화된다.
본 발명에 따른 시스템은 요구되는 배향으로 배열될 때 중력에 의해 액체와 세포를 수거할 수 있도록 배열된다. 중력에 의한 세포 수거는 간단하고 능률적이고 비용-효율적이기 때문에 유리하다. 그럼에도 본 공정은 진공을 이용하거나, 시스템의 내부 압력을 증가시키거나(본 명세서에서는 "과압"이라 칭함), (예컨대 연동 펌프에 의한) 펌핑을 수행함으로써 강화될 수 있다. 이들 기술은 널리 공지되어 있는 것으로, 적절할 경우, 과압을 창출하기 위한 가스 입력부, 펌프 또는 진공실을 관련 출입구 또는 배출구에 부착함으로써 본 시스템과 조합하여 사용될 수 있다.
필요하다면, 시스템이 중력에 의해 액체나 세포를 수거하기에 적절하도록 구성되어 있더라도, 중력의 도움 없이 펌핑, 진공 또는 과압에 의해 액체와 세포를 수거할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "구조적 요소(structural element)"는 지지나, 형상 및 체적의 보유나, 유지 등과 같은 기능을 수행하는 용기의 기저부, 벽, 뚜껑 또는 다른 구조적 특징부를 언급하고자 한 것이다. 구조적 요소는 부대물, 특히 출입구, 배출구, 개스킷 등과 같은 용기의 부속물을 가리키지 않는다.
본문에서 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 내측과 내부는 호환하여 사용된다.
본문에서 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 외측과 외부는 호환하여 사용된다.
본 명세서에서 내측 체적과 내부 체적은 호환하여 사용된다.
일 실시예에서, 용기가 수용할 수 있도록 적합화된 필수 매체량은 세포의 배양과 액체 및 세포의 수거 중에 배출구의 막힘을 초래하지 않는 양이다.
일 실시예에서, 매체량은 내부 체적의 50% 이하, 예컨대 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 이하이다. 용기가 이 수위까지 충전되면 중력에 의해 내용물을 수거하는 것이 적절할 수 있다.
일 실시예에서, 최대 필수 매체량은 15 ㎖ 내지 30 ㎖, 예컨대 약 20 ㎖, 21 ㎖, 22 ㎖, 23 ㎖, 24 ㎖, 25 ㎖ 또는 26 ㎖이다.
본 명세서에서 사용되는 "매체와 세포에 의한 막힘에 민감하지 않음"은 구조적 요소가 세포 및/또는 매체의 특징부에 대한 접근을 최소화되도록 배열되어, 제 기능을 수행하지 못하도록 막히는 경향을 감소시켰다는 사실을 언급하고자 한 것이다.
일 실시예에서, 매체량은 내부 체적의 50% 이상, 예컨대 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 이 실시예에서, G-Rex와 같은 시스템의 최대 필수 매체량은 30 ㎖ 내지 40 ㎖, 예컨대 약 31 ㎖, 32 ㎖, 33 ㎖, 34 ㎖, 35 ㎖, 36 ㎖, 37 ㎖, 38 ㎖ 또는 39 ㎖이다.
용기가 이 수위까지 충전되면, 내용물의 수거를 지원하기 위해 위에서 상기에서 설명한 "펌프"나 다른 시스템을 사용하는 것이 적절할 수 있다. "펌핑"/강제 추출 공정에 의해 배출구 내에 있는 어떤 매체나 세포도 제거될 수 있는데, 만약 본 시스템이 중력에 의해서만 비워진다면 배출구가 "막힐" 수 있다.
일 실시예에서, 가스 투과성 면적의 수치값 대 시스템에 사용되는 매체량의 비는 1:1 내지 1:5, 예컨대 1:2, 1:3 또는 1:4로서, 예컨대 가스 투과성 면적은 10 cm2이고 매체량은 20 ㎖로서 1:2의 비를 이룬다.
내부 오리피스와 외부 오리피스를 한정하는 도관을 포함하는 배출구는 실질적으로 시스템의 내부와 외부를 연결하는 파이프이다. 이 배출구는 가스가 배출되도록 함으로써 용기를 충전하는 동안 압력의 밸런싱을 가능하게 한다. 세포 비움 공정 중에, 배출구는 가스가 내부 체적으로 진입하여 액체와 세포의 수거에 의해 생성될 수 있는 빈 공간을 충전할 수 있도록 하고, 이로써 중력이나 가압 시스템을 사용하여 액체와 세포가 외부 출입구로 자유롭게 유체 연통되도록 한다.
배출구가 내부 체적 내로 종결된다 함은, 배출구가 내부 체적과 유체 연통되고 매체 및 세포가 용기 체적의 50% 미만일 때 세포를 수확하는 동안 대체로 막힘에 민감하지 않도록 배열된다는 전제 하에서, 배출구가 내부 체적에 접근할 수 있고 내부 오리피스가 벽과 같은 용기의 구조적 특징부에 배치될 수 있다는 사실을 언급하고자 한 것이다.
내부 체적 내로 연장된다 함은 배출구 도관의 일부가 내부 공간으로 돌출된다는 것을 언급하고자 한 것이다.
바람직한 실시예에서, 배출구의 적어도 일부는 구조적 특징부에 고정되는 부속물과 같이 내부 체적 내로 물리적으로 연장되고 돌출된다.
일 실시예에서, 내부 오리피스에서 종결되는 배출구의 부분은 해당 부분을 지지하는 구조적 요소와 동일 평면에서 종결되지 않는다. 즉, 도관은 일반적으로 도관을 지지하는 구조적 요소를 통과하여 내부 체적에 의해 한정되는 공간으로 연장되는데, 예컨대 도 2, 도 3, 도 5, 도 6, 도 7 및 도 10 내지 도 12 중 어느 하나에 도시된 바와 같이 체적의 중심부에서 종결된다.
본 명세서에서 사용되는 "중심부에 배치되는"은 배출구의 일부가 배출구가 내장된 용기의 구조적 특징부로부터 내부 체적의 공간으로 연장된다는 사실을 언급하고자 한 것이며, 그 자체가 공간의 중심에 대한 절대 기준이 되도록 의도한 것은 아니다. 이런 특징부는 매체로 용기를 충전하거나 세포를 수확하는 동안 (특히 배출구가 유입구/유출구와 공동 배치되는 경우에) 내부 오리피스가 액체에 노출되는 것을 최소화한다는 편익이 있다.
일 실시예에서, 배출구는 용기의 내부 체적의 체적 중심(volumetric center)에서 종결되도록 배열된다.
본 명세서에서 사용되는 "체적 중심"은 내부 체적에 의해 한정되는 3차원 공간의 중심을 대략적으로 언급하고자 한 것이다.
일 실시예에서, 배출구의 도관은 뚜껑의 밑면이나 용기의 다른 구조적 특징부로부터, 또는 대안으로서 기저부로부터 5 mm 내지 35 mm 사이, 예컨대 약 30 mm에 걸쳐 연장된다.
일 실시예에서는, 오리피스와 배출구가 액체나 세포에 의한 막힘에 민감하지 않도록 배출구의 내부 오리피스는 특히 매체와 세포가 용기 체적의 50% 미만일 때 용기에 들어있는 매체와 사용 중에 접촉하지 않도록 배열된다.
그러나, 배출구는 사용 중에 용기에 들어있는 매체 내로 연장되도록 배열될 수 있다. 내부 오리피스에 덮인 가스 투과성 멤브레인과 같은 액체 불투과성 멤브레인을 사용하고/하거나 배출구에 액체 역류 방지 밸브를 사용함으로써 배출구의 기능이 원활해질 수 있다.
일 실시예에서, 배출구는 액체 역류 방지 밸브를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 내부 오리피스는 가스 투과성 멤브레인과 같은 액체 불투과성 멤브레인에 의해 보호될 수 있다.
선택적으로, 배출구는 필요할 경우 가스의 유동을 제어하는 밸브를 포함할 수 있다.
배출구는 공기 유래 미생물과 미진이 용기의 내부 체적으로 진입하여 시스템을 오염시키는 것을 방지하는 0.2 미크론 필터와 같은 살균 필터에 부착될 수 있도록 배열된다. 일반적으로 여과 장치 또는 요소는 도 2 내지 도 6과 도 9에 도시된 바와 같이 배출구를 형성하는 도관의 외부 오리피스에 부착된다.
부착은 직접 또는 배관과 같은 커플링 수단을 통해 이루어질 수 있다.
일 실시예에서, 살균 필터는 루어록(luer lock)과 같은 고정 수단에 의해 배출구에 고정될 수 있다.
배출구는 임의의 적절한 재료로 제조될 수 있고, 배출구를 지지하는 구조적 특징부에 성형될 수 있다. 즉 해당 구조적 특징부와 일체화될 수 있다.
일 실시예에서, 배출구는 단지 배출구를 지지하는 구조적 특징부를 통해 연장되는 신축성 배관을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 배출구는 신축성 배관에 연결하기에 적절한 것으로, 밀폐형 시스템 외부에 연장되는 외측 부분을 포함한다.
적절한 신축성 배관은 예컨대, 다음과 같은 다양한 형태로 입수할 수 있다.
- 가소화제, 라텍스 및 비닐아세테이트를 함유하지 않고 동물성 생성물도 없는 반투명 배관이나,
- 수액 배관(transfusion tubing), 예컨대 4 mm OD PVC 수액 등급 배관과 같은 PVC 수액 등급 배관.
일 실시예에서, 배관은 실리콘이다.
사용되는 배관은 구성요소에 무균적으로 연결될 수 있고, 예컨대 데루모 메디칼사(Terumo Medical Corporation)에서 구입 가능한 살균 튜브 용접기를 사용하여 튜브를 포함할 수도 있다.
배출구는 예컨대 벽, 기저부, 뚜껑과 같은 구조적 특징부 내를 포함하여 용기의 임의의 적절한 위치에 배치될 수 있는데, 예컨대 일 실시예에서, 배출구는 위에서 상세히 설명한 바와 같이 가스 투과성 층을 통해 연장되어 용기의 기저부에 배치될 수 있다.
일 실시예에서, 배출구는 용기의 구조적 특징부의 중심부에, 즉 벽, 기저부 또는 뚜껑의 가장자리에 가깝지 않게 배치될 수 있다.
일 실시예에서, 배출구는 예컨대 뚜껑의 중심부 또는 벽을 통해 대략 용기의 중심축을 따라 배치되고 내부 체적의 중심부까지 연장될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "중심부"는 대략 공간 또는 특징부의 중점을 언급하고자 한 것이다.
성형시 출입구 또는 출입구들용으로 적절한 재료는 예컨대 용기와 동일한 재료(예컨대 열가소성 플라스틱, 특히 폴리카보네이트)를 포함한다. 일 실시예에서, 성형된 출입구 또는 출입구들은, 예컨대 배관이 성형되는 배출구 또는 출입구 부분 상으로 미끄러지는 도 6에 도시된 바와 같이, 배관에 연결하기에 적절하도록 구성된다.
일 실시예에서, 출입구 또는 출입구들은 용기 및/또는 시스템의 구조적 특징부를 통해 연장되는 신축성 배관과 같은 배관으로서 마련된다. 이 실시예에서, 신축성 배관은 개스킷에 의해 구조적 특징부에 대해 밀봉될 필요가 있을 수 있다.
출입구와 함께 사용하거나 출입구로서 사용하기 위한 배관은 예컨대 살균 수액 백과 같은 외부 구성요소의 무균적으로 연결을 위한 살균 연결 장치에 사용될 수 있는 상술한 배관을 포함한다.
출입구 또는 출입구들은 예컨대 벽, 기저부, 뚜껑과 같은 구조적 특징부를 포함하여 용기의 임의의 적절한 위치에 배치될 수 있다.
일 실시예에서는, 별도의 유입구(entrance port)와 별도의 유출구(exit port)가 마련된다.
일 실시예에서는, 유입구 및 유출구로서 기능하는 하나의 출입구가 마련된다. 일 실시예에서, 배출구는 예컨대 벽이나 뚜껑에 출입구 또는 출입구들과 공동 배치된다.
기저부 대향측의 구조적 요소, 예컨대 뚜껑 또는 벽에 배출구와 출입구 또는 출입구들을 공동 배치하는 것의 편익은 용기의 측벽을 변경할 필요가 없다는 것이다. 이는 측벽에 구조적 특징부가 없는 용기들이 서로 매우 근접하게 배치될 수 있어서 차지하는 공간이 최소가 된다는 점에서 유리하다. 이는 또한 용기의 단일 구성요소 내부에 배출구와 출입구 또는 출입구들을 효율적으로 제조할 수 있도록 한다.
뚜껑에 배출구와 출입구 또는 출입구들을 공동 배치하는 것의 편익은 개방형 시스템에서 밀폐형 시스템으로 변환하기 위해 상업적으로 입수 가능한 용기를 추가로 변경할 필요가 없다는 데 있다.
일 실시예에서, 세포의 배출을 위해 사용되는 출입구는 벽, 뚜껑의 가장자리 등과 같은 구조적 요소에 근접하게 배치된다. 본 발명자는 용기의 벽이나 구조적 요소의 가장자리 옆에 유출구를 배치함으로써 보다 효율적인 세포 회수가 이루어진다는 것을 발견하였다. 구조적 특징부에 근접하게 배치되는 출입구의 예는 도 2 내지 도 12에 도시되어 있다.
뚜껑이나 다른 구조적 특징부의 측면에 출입구 또는 출입구들을 마련하는 것은 액체와 세포를 최대한으로 회수할 수 있도록 보장한다. 초기의 원형은 뚜껑의 중심부에 출입구를 마련하였는데, 이 경우에는 액체의 표면장력으로 인해 0.5 ㎖ 내지 0.8 ㎖의 액체가 용기 내에 잔류하는 것으로 판명되었다. 출입구를 측면으로 옮기고 캐스켓과 동일 평면으로 하면 잔류량은 0.1 ㎖까지 줄어들었다.
또한, 출입구 또는 출입구들을 중심에서 벗어나게 배치함으로써 배출구가 중심에 배치될 수 있는데, 이는 적어도 몇몇 실시예에서는 배출구가 액체에 의한 막힘에 노출되는 것을 최소화할 수 있다.
따라서, 일 실시예에서, 출입구 또는 출입구들, 특히 유출구는 용기의 내부 체적의 중심축과 동축이 아니다.
본 명세서에 도시된 단면도에서, 이중선은 벽이나 방벽, 또는 밀폐되어 있는 유사물을 나타낸다. 그러나, 단일선은 밀폐되어 있음을 나타내는 것이 아니라 특징부의 형상을 보여주기 위해 존재하는 것이다. 따라서, 단일선이 배출구나 출입구의 단부에 도시되어 있을 경우에 해당 배출구나 출입구는 개방되어 있다.
도 2는 배출구(6)와 출입구(5)가 공동 배치된 뚜껑(8)을 포함하는 용기(4)의 기저부(1)를 형성하는 가스 투과성 층(2)을 도시하는데, 상기 배출구는 살균 필터를 지지할 수 있는 외부 오리피스를 한정하는 도관을 포함하며, 상기 도관은 뚜껑을 통해 연장되고 용기에 의해 한정되는 내부 체적 내로 중심부에 연장되어 내부 오리피스에서 종결된다. 사용시, 용기는 가스 투과성 층의 내면에 내려앉는 세포와 매체를 포함한다.
도 3은 도 2의 배열과 유사한 배열을 도시하지만, 용기가 재밀폐식 뚜껑이 없는 일체형이라는 것을 특징으로 한다. 출입구(5)와 배출구(6)는 용기의 벽(구조적 요소)에 공동 배치된다. 배출구의 도관은 용기의 내부 체적 내로 돌출부로서 연장된다.
도 4는 도 3과 유사한 배열을 도시하지만 출입구(5)와 배출구(6)가 서로 대향하여 배열된다.
도 5는 도 3 및 도 4와 유사한 배열을 도시하지만 출입구(5)와 배출구(6)가 서로 수직하게 배열된다.
도 6은 배출구(6)와 출입구(5)가 공동 배치되는 뚜껑(8)을 포함하는 용기(4)의 기저부(1)를 형성하는 가스 투과성 층(2)을 도시하는데, 상기 배출구는 살균 필터를 지지할 수 있는 외부 오리피스를 한정하는 도관을 포함하며, 상기 도관은 뚜껑을 통해 연장되고, 용기에 의해 한정되는 내부 체적 내로 중심부에 연장되어 기저부를 향해 매체(3) 내에 이르게 된다. 내부 오리피스는 액체에 의한 배출구의 막힘을 방지하는 가스 투과성 멤브레인(9)에 의해 보호된다.
도 7은 가스 투과성 층을 포함하는 기저부에 대향하는 용기의 구조 특징부에 공동 배치되는 출입구(5)(유입구 및 유출구의 이중 기능을 가짐)와 배출구(6)가 마련된 일체형 종 형상 용기(4)를 도시한다. 이 도면에서, 배출구(6)와 출입구(5)는 외측 부분이 신축성 배관에 연결된 상태로 도시되어 있다.
도 8은 액체 매체와 세포를 유출구(5)와 연통된 상태로 두도록 배향되는 도 7의 시스템을 도시하며, 세포는 중력에 의해 출입구에서 배출될 수 있다.
본 명세서에서 도면의 치수는 단지 예로서 제시된 것으로 제한적인 의도를 갖지는 않는다.
매체 및/또는 세포와 같은 물질이 들어있는 수액 백(infusion bags)과 같은 살균 컨테이너는 매체를 시스템에 무균 도입하기 위한 공지된 기술을 사용하여 유입구나 이에 연결된 배관에 용접될 수 있다. 이는 도 9에 개략적으로 도시되어 있다. 살균 용접 기법 및 기술은 업계에 널리 공지되어 있어서 본 명세서에서는 추가로 설명하지 않는다.
마찬가지로, 도 9에 도시된 바와 같이, 용기에서 세포를 무균 수거하기 위해, 멸균 수액 백과 같은 비어있는 컨테이너가 유출구나 이에 연결된 배관에 용접될 수 있다.
시스템에 물질을 무균적으로 도입 및 수거하는 이들 방법은 둘 다 매우 편리하고 강력하며 실용적이다.
용기의 배향을 10도 내지 350도만큼, 예컨대 90도나 180도처럼 45도 이상 변경하여 중력에 의해 세포를 수거(수확)하도록 하는 방식은 특수 장비가 필요 없고 최소한의 공간과 전문 지식만 있으면 되기 때문에 매우 간단하고 효율적이다.
일 실시예에서, 유출구는 해당 유출구가 배치되는 구조 특징부 위로 0.15 mm를 초과하여 내부 체적 내로 연장되지 않는다. 이는 최대 세포 회수를 보장한다.
출입구 또는 출입구들에는 이를 통과하는 물질의 흐름을 제어하기 위해 밸브 및/또는 멤브레인 등이 장착될 수 있다.
시스템의 엄밀한 구조에 따라, 적절한 개스킷과 밀봉이 필요할 수 있다.
용기 및 그 구조적 요소의 제조에 적절한 재료는 일반적으로 하나 이상의 규격에 부합될 필요가 있으며, 이런 규격으로는 EU 식품안전규격; EU 지침 2002/72/EC; USP<88>, 생체내 생물학적 반응성 시험, 등급 Ⅵ; USP<87>, 시험관내 생물학적 반응성 시험; USP<661>, 물리 화학적 시험-플라스틱; EP 논문 3.2.2, 약학적 용도의 플라스틱 컨테이너 & 밀폐; ISO 10993(외부 연통 장치, 장기간의 간접 혈액 접촉)에 따른 생물학적 시험이 있다.
일 실시예에서, 용기 및/또는 시스템의 구조적 요소는 폴리카보네이트와 같은 적절한 열가소성 플라스틱으로 제조된다.
특히 밀폐형 시스템이 G-ex와 같은 상용 제품으로부터 생성될 경우, 출입구와 배출구는 열 솔더링(soldering)에 의해 시스템에 통합될 수 있다.
일 실시예에서, 변경된 뚜껑은 차후 부착될 튜브 및/또는 필터를 위한 적절한 연결부와 일체로 성형된다.
일 실시예에서, 출입구 또는 배출구와 같은 특징부와 구조적 기능부는 용기의 성형시 생성된다.
본 명세서에서 사용되는 "구조적 기능부"는 예컨대 배출구 또는 출입구로서의 기능을 수행하고 배관 등과 같은 부속물을 부착하기에 적절한 특징부를 언급하고자 한 것이다.
본 발명에 따른 시스템은 살균을 위해 감마선 조사를 받는다.
일반적으로, 본 시스템은 예컨대 살균 증명서를 첨부하여 살균 상태로 밀봉 백에 담겨 최종 소비자에게 배송된다. 이 형태의 시스템은 일반적으로 약 1년 이상의 유통 기한을 가진다.
또한, 본 발명에 따른 시스템을 제조하는 방법으로서, 용기를 성형하는 단계와, 선택적으로 출입구와 배출구를 용기에 설치하는 단계를 포함하는 방법이 제시된다.
일 실시예에서, 배출구 및/또는 출입구를 수용하기 위한 구멍(holes)은 드릴링이 아니라 열전 탐침(thermal probe)에 의해 생성되며, 이로써 오염의 발생량을 최소화하고 최종 제품이 치료용 생성물의 제조에 사용하기에 적절하도록 보장한다.
일 실시예에서는, 개스킷 및/또는 밸브 및/또는 필터와 같은 추가 구성요소가 제조 공정에서 설치된다.
일 실시예에서, 제조 방법은 예컨대 감마선 조사를 사용하여 시스템을 살균처리하고 하나 또는 복수의 백 또는 컨테이너에 유닛을 무균 밀봉하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시예에서, 제조 방법의 하나 이상의 단계는 EU-GMP 등급 D(미국연방규격 209e 등급 100,000, ISO 14644-1 등급 IS08) 규격에 부합하는 청정실에서 수행된다. 일 실시예에서, 각각의 시스템은 필터, 개스킷, 튜브, 연결부와 함께 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 따라 압축 공기를 사용하는 압력 유지 시험을 받고, 조립된 시스템이 살균 전에 해당 시험을 받게 되는데, 압력 시험은 예컨대 2분을 넘는 시간 동안 0.5 bar±0.05 bar의 압력으로 실시된다. 이 시간 동안, 압력은 기록된 출발 값으로부터 0.05 bar 미만만큼 강하하지 않을 것이다.
일 실시예에서는, 본 발명에 따른 밀폐형 시스템을 마련하기 위해 기존의 세포 배양 시스템을 변경하는 방법이 제시된다. 변경은 위에서 설명한 제조 단계 중 하나 이상을 사용할 수 있다.
일 실시예에서, 변경된 G-ex 용기 및/또는 약 10 cm2의 가스 투과성 멤브레인을 갖춘 용기와 같은 본 발명에 따른 용기는 세포와 배양 매체로 통상 10 ㎖ 내지 25 ㎖의 최종 체적까지 충전되며, 세포를 수확할 준비가 될 때까지 배양된다. 위에서 설명한 바와 같이, 이 경우 용기는 40 ㎖까지 충전될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 밀폐형 시스템에 세포를 무균 도입하는 방법으로서, 적절한 온도에서 적정한 기간 동안 세포를 배양하는 후속 단계를 포함하는 방법이 제시된다.
추가 양태에서는, 시스템의 유출구에 수집기(receptacle)를 무균 접합하고 중력에 의해 수집기 내로 세포를 수확함으로써, 본 발명에 따른 밀폐형 시스템으로부터 치료용 세포를 무균 수확하는 방법이 제시된다.
추가 양태에서는, 시스템의 유출구에 수집기를 무균 접합하고 펌프를 사용하여 수집기 내로 세포를 수확함으로써, 본 발명에 따른 밀폐형 시스템으로부터 치료용 세포를 무균 수확하는 방법이 제시된다.
일 실시예에서, 수확된 세포가 이송되는 수집기는 600 ㎖ 백으로, 때때로 업계에서는 "이송 백(transfer pack)"이라 지칭된다.
일 실시예에서는, 수확 후에 인간 혈청 알부민, 염분 등을 포함하는 용액을 사용하여 세포를 세척한다.
일 실시예에서, 세포는 수동으로 세척된다.
일 실시예에서, 세포는 자동화 시스템, 예컨대 바이오세이프(Biosafe)에서 구입 가능한 세팍스(등록상표)(Sepax®) 시스템을 사용하여 세척된다.
일 실시예에서는, 예컨대 세척 후에 셀이 계수된다.
일 실시예에서는, 예컨대 계수 후에 세포의 치료량(즉, 1회 이상의 세포 투여량)이 선택된다.
일 양태에서, 수확된 세포는 보관을 위해 선택적으로 하나 이상의 약학적 허용가능 방부제나 첨가제와 함께 적절한 컨테이너, 예컨대 수액 백에 봉해진다.
적절한 첨가제로는 DMSO, 예컨대 10% DMSO가 있다.
일 실시예에서, 컨테이너는 환자가 있는 장소까지 수송된다.
일 실시예에서, 컨테이너의 내용물은 비경구적으로, 특히 정맥 주사로 환자에게 투여된다.
일 실시예에서, 본 발명은 본 명세서에서 규정된 바와 같은 실질적으로 이콰인 트레이닝 장비(equine training equipment)에 관한 것이다.
본 명세서의 맥락에서, "포함하는(comprising)" 의미는 "포함하는(including)" 의미로 해석되기도 한다.
특정 요소를 포함하는 본 발명의 양태는 또한 해당 요소로 "구성"되거나 "기본적으로 구성"되는 대안적인 실시예까지 포괄하는 의도로 사용된다.
1: 기저부 2: 가스 투과층
3: 매체 4: 용기
5: 출입구 6: 배출구
8: 뚜껑 9: 가스 투과성 멤브레인

Claims (14)

  1. 치료용 세포의 무균 배양을 위한 밀폐형 세포 배양 시스템으로서,
    (ⅰ) 세포 성장을 지원하고 배양 중에 가스가 세포로 전달되도록 하기에 적절한 가스 투과성 부분과, 기저부(base)에 접하는 적어도 하나의 벽을 포함하는 용기(vessel)로서, 세포 배양을 지원하기 위한 필수 매체량을 수용하기 위한 내부 체적을 한정하는 용기와,
    (ⅱ) 서로 유체 연통되는 내부 오리피스와 이로부터 이격되는(distal therefrom) 외부 오리피스를 한정하는 도관(conduit)을 포함함으로써 가스가 배출될 수 있도록 상기 용기를 채우는 동안에 압력의 균형을 허용하면서 세포-비움 과정 동안에 가스가 상기 내부 체적내로 유입되도록 허용하는 배출구(vent)로서,
    상기 도관은 상기 용기의 벽, 기저부 또는 뚜껑을 통해 밀폐형 시스템의 외부로부터 연장되고 상기 용기의 내부 체적 내로 연장되어 상기 내부 오리피스와 함께 내부 체적 내에서 종결됨으로써, 상기 내부 오리피스의 액체와의 노출은 액체 매체의 충전 및 비움 중에 최소화되도록 배열되며, 상기 외부 오리피스는 무균 필터에 부착될 수 있도록 배열된 배출구와,
    (ⅲ) 유체와 세포가 상기 용기 내로 무균 도입을 위한 출입구(port) 또는 출입구들(ports)로서, 상기 시스템을 외부 환경에 노출시키지 않은 상태에서 유체가 상기 시스템에서 배출되도록 하기 위하여, 상기 시스템이 세포를 유출구(exit port)와 유체 연통된 상태에 두도록 배향될 때 내부에서 성장한 세포가 중력에 의해 상기 시스템에서 배출될 수 있도록 한 출입구(port) 또는 출입구들
    을 포함하는 밀폐형 세포 배양 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용기는 일체형인 밀폐형 세포 배양 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 상기 도관이 연장되는 상기 용기의 벽, 기저부 또는 뚜껑은 상기 용기의 벽인 밀폐형 세포 배양 시스템.
  4. 제2항에 있어서, 상기 용기의 일부는 상기 용기가 적절히 배향될 때 상기 유출구로 세포를 보내도록 배열되는 밀폐형 세포 배양 시스템.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배출구와 상기 출입구들은 상기 용기의 동일한 벽, 기저부 또는 뚜껑에 배치되는 밀폐형 세포 배양 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배출구와 상기 출입구들은 상기 기저부의 대향측에 배치되는 밀폐형 세포 배양 시스템.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유출구는 상기 용기의 내부 체적의 중심축과 동축이 아닌 밀폐형 세포 배양 시스템.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유출구는 상기 용기의 벽, 기저부 또는 뚜껑에 위치하면서 상기 출입구는 상기 내부 체적내로 0.15mm 이하로 연장되는 밀폐형 세포 배양 시스템.
  9. 치료용 세포의 무균 배양 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 청구된 밀폐형 시스템에 배양용 세포군을 무균 첨가하는 단계와,
    (b) 상기 세포 배양을 위한 영양분을 상기 시스템에 무균 첨가하는 단계와,
    (c) 표적(T) 세포군을 증식시키기 위해 상기 세포를 배양하는 단계와,
    (d) 상기 세포를 적절한 컨테이너 내로 무균 수확하는 단계를 포함하면서,
    단계(a)는 단계(b) 이전이나 이후, 또는 단계(b)와 동시에 수행될 수 있는 치료용 세포의 무균 배양 방법.
  10. 제9항에 있어서, 수확 후에, 상기 증식된 세포군을 세척하는 추가 단계를 포함하는 치료용 세포의 무균 배양 방법.
  11. 제9항에 있어서, 수확 후에, 상기 증식된 세포군을 계수하는 추가 단계를 포함하는 치료용 세포의 무균 배양 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포의 치료 투여량을 적절한 컨테이너 내로 분리하는 추가 단계를 포함하는 치료용 세포의 무균 배양 방법.
  13. 제9항에 있어서, DMSO와 같은 첨가제가 수확된 세포에 첨가되는 치료용 세포의 무균 배양 방법.
  14. 삭제
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