KR101496805B1

KR101496805B1 - 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소(ｇｐａｔ) 호몰로그와 그 이용

Info

Publication number: KR101496805B1
Application number: KR1020097021912A
Authority: KR
Inventors: 미사 오치아이; 히사노리 토쿠다
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2007-06-18
Filing date: 2008-06-12
Publication date: 2015-03-02
Anticipated expiration: 2028-06-12
Also published as: RU2485179C2; EP2157179B1; KR20100024383A; CN101578366A; CA2685713C; BRPI0809911A2; RU2010101208A; WO2008156026A1; CN101578366B; AU2008264603A8; US8247209B2; US20100159110A1; DK2157179T3; AU2008264603B2; CA2685713A1; JP5451387B2; EP2157179A1; JPWO2008156026A1; EP2157179A4; AU2008264603A1

Abstract

본 발명은 신규 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

서열 번호 1 혹은 4로 표시되는 염기 서열 또는 그 단편을 포함하는 핵산이다.

Description

글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소(ＧＰＡＴ) 호몰로그와 그 이용{GLYCEROL-3-PHOSPHATE ACYLTRANSFERASE (GPAT) HOMOLOGUE AND USE THEREOF}

본 출원은 2007년 6월 18일에 출원된 일본국 특허 출원 제2007-160042호에 기초하는 우선권을 주장한다.

본 발명은 신규 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 유전자에 관한 것이다.

지방산은 인지질이나 트리아실글리세롤 등, 지질을 구성하는 중요한 성분이다. 불포화 결합을 2개소 이상 함유하는 지방산은, 고도 불포화 지방산(PUFA)으로 총칭되고, 아라키돈산이나 디호모γ리놀렌산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 등이 알려져 있고, 여러가지 생리 활성이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 이 고도 불포화 지방산은 여러가지 분야에서의 이용이 기대되고 있지만, 동물 체내에서 합성할 수 없는 것도 포함되어 있다. 그래서, 여러가지 미생물을 배양하여 고도 불포화 지방산을 획득하는 방법이 개발되어 왔다. 또한, 식물에서 고도 불포화 지방산을 생산시키는 시도도 이루어져 있다. 이러한 경우, 고도 불포화 지방산은, 예컨대 트리아실글리세롤 등의 저장 지질의 구성 성분으로서, 미생물의 균체 내 혹은 식물 종자 중에 축적되는 것이 알려져 있다.

보다 상세하게는, 트리아실글리세롤은, 생체 내에서 이하와 같이 생성된다. 즉, 글리세롤-3-인산이 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소에 의해 아실화되어 리소포스파티드산이 되고, 이 리소포스파티드산이 리소포스파티드산 아실기 전이 효소에 의해 아실화되어 포스파티드산이 되며, 이 포스파티드산이 포스파티드산 포스파타아제에 의해 탈인산화되어 디아실글리세롤이 되고, 이 디아실글리세롤이 디아실글리세롤 아실기 전이 효소에 의해 아실화되어 트리아실글리세롤이 된다. 또한, 아실 CoA:콜레스테롤 아실기 전이 효소나 리소포스파티딜콜린 아실기 전이 효소 등이 간접적으로 트리아실글리세롤의 생합성에 관여하는 것이 알려져 있다.

전술한 트리아실글리세롤 생합성 경로나 인지질 생합성 경로에 있어서, 글리세롤-3-인산의 아실화에 의해 리소포스파티드산(lysophosphatidic acid)이 생성되는 반응에는, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소(이하, 「GPAT」라고 기재하는 경우도 있음: EC 2.3.1.15)가 개재되는 것이 알려져 있다.

GPAT 유전자는 지금까지 몇 개의 생물에서 보고되어 있다. 포유 동물 유래의 GPAT 유전자로서, 소포체형(막결합형)과 미토콘드리아형(막결합형)의 두 가지가 클론화되어 있다(비특허문헌 2). 또한, 식물 유래의 GPAT 유전자로서 소포체형(막결합형), 미토콘드리아형(막결합형) 및 엽록체형(유리형)의 3종류가 클론화되어 있다(비특허문헌 3). 기타, 진균인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 GPAT 유전자로서, 소포체형(막결합형)의 GPT2(GAT1) 및 SCT1(GAT2)의 두 가지가 클론화되어 있다(비특허문헌 4). 여기서, GPT2는 팔미트산(16:0)으로부터 올레산(18:1)에 이르기까지, 폭넓은 범위의 지방산을 기질로서 이용할 수 있는 활성을 갖는 데 대하여, SCT1은 팔미트산(16:0), 팔미톨레산(16:1) 이라고 하는 탄소수 16의 지방산을 기질로 하는 것에 강한 선택성을 갖는 것으로 기재되어 있다(비특허문헌 4). 또한, 기타 많은 생물로부터 GPAT 유전자는 클론화되어 있다.

지질 생산균인 모르티에렐라(Mortierella)속 미생물 유래의 GPAT도 보고되어 있다. 모르티에렐라 라만니아나(Mortierella ramanniana) 유래의 GPAT에 대해서는, 소포체형 GPAT가 단리되고, 이것이 팔미트산(16:0)보다 올레산(18:1)을 5.4배 많게 선택적으로 아실기 공여체로서 이용하는 것이 나타나 있다(비특허문헌 5). 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)(이하, 「M. 알피나」라고 기재하는 경우도 있음) 유래의 GPAT에 대해서는, 마이크로솜 획분에 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성이 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 6). 또한, M. 알피나의 마이크로솜에 존재하는 GPAT(막에 결합되어 있는 상태)와 여러가지 아실 CoA를 인 비트로로 반응시키면 높은 활성을 유지한 채, 올레산(18:1), 리놀레산(18:2), 디호모γ리놀렌산(DGLA)(20:3), 아라키돈산(20:4)이라고 하는 PUFA를 넓게 기질로서 이용하는 것이 나타나 있다(특허문헌 1). 또한, M. 알피나(ATCC#16266)로부터 클로닝된 GPAT를, 에이코사펜타엔산(EPA)까지 생합성할 수 있도록 형질 전환된 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에서 발현시킨 바, 총 지방산 내, 디호모γ리놀렌산(DGLA)(20:3)의 조성이 커지고, 올레산(18:1)의 조성이 작아지는 것이 나타났다. 이 결과는, 보다 장쇄이고 불포화도가 높은 PUFA가 선택적으로 혼입되고 있는 것을 나타내는 것이다(특허문헌 2).

[특허문헌 1] 국제 공개 제 WO2004/087902호 공보

[특허문헌 2] 미국 특허 출원 공개 제2006/0094091호 명세서

[비특허문헌 1] Lipids, 39, 1147(2004)

[비특허문헌 2] Biochimica et Biophysica Acta, 1348, 17-26, 1997

[비특허문헌 3] Biochimica et Biophysica Acta, 1348, 10-16, 1997

[비특허문헌 4] The Journal of Biological Chemistry, 276(45), 41710-41716, 2001

[비특허문헌 5] The Biochemical Journal, 355, 315-322, 2001

[비특허문헌 6] Biochemical Society Transactions, 28, 707-709, 2000

(발명의 개시)

(발명이 해결하고자 하는 과제)

그러나, 지금까지 보고되어 있는 GPAT 유전자는, 숙주 세포에 도입하여 발현시키더라도, 그 기질 특이성에 의해, 숙주가 산생하는 지방산 조성물은 한정되어 있었다. 그래서, 지금까지와는 다른 조성의 지방산 조성물을 산생할 수 있는, 신규 유전자를 동정(同定)하는 것이 요구되고 있다.

(과제를 해결하기 위한 수단)

본 발명의 목적은, 숙주 세포에서 발현 또는 도입함으로써, 목적으로 하는 지방산 조성의 유지를 제조시키거나, 목적으로 하는 지방산의 함유량을 증가시킬 수 있는 단백질 및 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행했다. 우선, 지질 생산균 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)의 EST 해석을 행하여, 그 중에서 기지의 GPAT 유전자와 동일성이 높은 서열을 추출했다. 또한, GPAT를 코드하는 오픈 리딩 프레임(ORF) 전체 길이를 취득하기 위해, cDNA 라이브러리의 스크리닝 혹은 PCR에 의해 유전자를 클로닝했다. 그것을 효모 등의 고증식능을 갖는 숙주 세포에 도입하여 원하는 지방산 조성물의 산생을 시도한 발명자는, 종래의 GPAT가 발현된 숙주가 산생하는 지방산 조성물과 비교하여, 다른 지방산 조성물을 생성시킬 수 있는, 기질 특이성이 다른 신규 GPAT에 관한 유전자의 클로닝에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 이하의 (a)~(e) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산.

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(b) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(c) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(d) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(2) 이하의 (a)~(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 (1)에 기재한 핵산.

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1~10개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(b) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(c) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

(3) 이하의 (a)~(c) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열 또는 그 단편을 포함하는 핵산.

(a) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열

(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열

(c) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열

(4) 이하의 (a)~(e) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산.

(a) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)~v) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율

iv) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한, 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율, 및

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

(b) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)~v) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

(c) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 또한, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

(d) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)~v) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

(5) 이하의 (a)~(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 (4)에 기재한 핵산.

(a) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1~10개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)~v) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

(b) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

(c) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열

서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)~v) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

(6) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재한 단백질.

(a) 서열 번호 2에서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질

(b) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이고, 또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질

(7) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재한 단백질.

(a) 서열 번호 2에서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)~v) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

(b) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)~v) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

(8) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.

(9) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재한 핵산을 함유하는 재조합 벡터.

(10) (9)에 기재한 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체.

(11) (10)에 기재한 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)~v) 중 적어도 하나 이상이, 제9항의 재조합 벡터로 형질 전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물의 상기 비율보다 높은 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물:

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

(12) (10)에 기재한 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터, (11)에 기재한 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물의 제조 방법.

(13) (11)에 기재한 지방산 조성물을 포함하는 식품.

(발명의 효과)

본 발명의 GPAT는, 종래의 GPAT와는 기질 특이성이 달라, 종래의 GPAT가 발현된 숙주가 산생하는 지방산 조성물과는 조성이 다른 지방산 조성물을 숙주 중에 산생시킬 수 있다. 이에 따라, 원하는 특성이나 효과를 갖는 지질을 제공할 수 있기 때문에, 식품, 화장료, 의약품, 비누 등에 적용할 수 있는 것으로서 유용하다.

또한, 본 발명의 GPAT는 지방산이나 저장 지질의 생산능의 향상을 도모할 수 있기 때문에, 미생물이나 식물 중에서의 고도 불포화 지방산의 생산성을 향상시키는 것으로서, 바람직하다.

도 1은 본 발명의 GPAT2의 cDNA 서열(서열 번호 1)과 추정 아미노산 서열(서열 번호 2)을 나타낸다. 도면 중, *은 GPAT 활성에 중요하다고 생각되는 아미노산 잔기를 나타내고, +는 글리세롤-3-인산과의 결합에 중요하다고 생각되는 아미노산 잔기를 나타낸다.

(발명을 실시하기 위한 최량의 형태)

본 발명은 글리세롤-3-인산을 아실화하여, 리소포스파티드산을 생성시키는 것을 특징으로 하는 모르티에렐라속 유래의 신규 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 유전자에 관한 것이다.

본 발명의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소(GPAT)는, 글리세롤-3-인산을 아실화하여, 리소포스파티드산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 아실기 공여체는, 통상 아실 CoA이지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 단백질이 작용함에 의한 아실기 전이 반응의 아실기 수용체는, 글리세롤-3-인산이지만, 이것에 한정되지 않는다.

본 발명의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소를 코드하는 핵산

본 발명의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소(GPAT)에는, GPAT2가 포함된다. GPAT2를 코드하는 핵산의 cDNA, CDS, ORF 및 아미노산 서열의 대응 관계를 이하의 표 1에 정리하여 기재했다.

[표 1]

	GPAT2
	서열 번호	서열 번호 1의 해당영역
cDNA	서열 번호 1	*****
CDS	서열 번호 3	제113-1891번째
ORF	서열 번호 4	제113-1888번째
아미노산서열	서열 번호 2	*****

즉, 본 발명의 GPAT2에 관련되는 서열로서는, GPAT2의 아미노산 서열인 서열 번호 2, GPAT2의 ORF의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 4, 그리고, 그 CDS의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 3 및 그 cDNA의 염기 서열인 서열 번호 1을 들 수 있다. 이 중, 서열 번호 3은 서열 번호 1의 제113-1891번째의 염기 서열에 상당하 고, 서열 번호 4는 서열 번호 1의 제113-1888번째의 염기 서열 및 서열 번호 3의 제1-1776번째의 염기 서열에 상당한다.

본 발명의 핵산이란, 단일쇄 및 이중쇄의 DNA 외에, 그 RNA 상보체도 포함하고, 천연 유래인 것이나 인공적으로 제작한 것이라도 좋다. DNA에는, 예컨대 게놈 DNA나, 상기 게놈 DNA에 대응하는 cDNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA 및 이들의 조합이나, DNA와 RNA의 하이브리드를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 핵산의 바람직한 양태로서는, (a) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열, (b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열, (c) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열 등을 들 수 있다.

서열 번호 4로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열, 및, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열은, 표 1에 기재한 바와 같다.

상기 염기 서열을 얻기 위해서는, GPAT 활성을 갖는 생물의 EST나 게놈 DNA의 염기 서열 데이터로부터, 기지의 GPAT 활성을 갖는 단백질과 동일성이 높은 단백질을 코드하는 염기 서열을 탐색할 수도 있다. GPAT 활성을 갖는 생물로서는, 지질 생산균이 바람직하고, 지질 생산균으로서는 M. 알피나를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

EST 해석을 행하는 경우에는, 우선, cDNA 라이브러리를 제작한다. cDNA 라이브러리의 제작 방법에 대해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』[Cold Spring Harbor Press (2001)]를 참조할 수 있다. 또한, 시판의 cDNA 라이브러리 제작 키트를 이용하더라도 좋다. 본 발명에 알맞는 cDNA 라이브러리의 제작 방법으로서는, 예컨대 이하와 같은 방법을 들 수 있다. 즉, 지질 생산균인 M. 알피나의 적당한 주(株)를 적당한 배지에 식균하고, 적당한 기간 전(前)배양한다. 이 전배양에 알맞는 배양 조건으로서는, 예컨대 배지 조성으로서는, 1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0을 들 수 있고, 배양 기간은 3일간, 배양 온도는 28℃인 조건을 들 수 있다. 그 후, 전배양물을 적당한 조건으로 본 배양하도록 한다. 본 배양에 알맞는 배지 조성으로서는, 예컨대 1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데카놀, 0.3% KH₂PO₄, 0.1% Na₂SO₄, 0.05% CaCl₂·2H₂O, 0.05% MgCl₂·6H₂O, pH 6.0을 들 수 있다. 본 배양에 알맞는 배양 조건으로서는, 예컨대 300 rpm, 1 vvm, 26℃로 8일간 통기 교반 배양하는 조건을 들 수 있다. 배양 기간 중에 적당량의 글루코오스를 첨가하더라도 좋다. 본 배양 중에 적시에 배양물을 채취하고, 거기에서 균체를 회수하여, 전체 RNA를 조제한다. 전체 RNA의 조제에는, 염산 구아니딘/CsCl법 등의 공지의 방법을 이용할 수 있다. 얻어진 전체 RNA로부터 시판의 키트를 이용하여 poly(A)⁺RNA를 정제할 수 있다. 또한, 시판의 키트를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작할 수 있다. 그 후, 제작한 cDNA 라이브러리의 임의의 클론의 염기 서열을, 벡터 상에 인서트 부분의 염기 서열을 결정할 수 있도록 설계된 프라이머를 이용하여 결정하여, EST를 얻을 수 있다. 예컨대, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)로 cDNA 라이브러리를 제작한 경우는, 디렉셔널 클로닝을 행할 수 있다.

ORF의 염기 서열로 비교하면, 본 발명의 GPAT2 유전자와 공지의 M. 알피나(ATCC#16266) 유래의 GPAT1 유전자와의 동일성은 42.0%이다. 또, 본 발명의 GPAT2 유전자를 BLASTX 해석한 결과, 가장 E-value가 낮았던, 즉 동일성이 높았던 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans) 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소와 같은 추정 단백질 서열[GB 액세션(accession) No. EAA62242], 및 기능이 밝혀져 있는 단백질에서 가장 동일성이 높았던 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소인 Sct1p(GB 액세션 No. CAC85390)를 코드하는 염기 서열과의 동일성은, 각각 36.9%와 36.6%이다.

마찬가지로, 본 발명의 GPAT2와 공지의 M. 알피나(ATCC#16266) 유래의 GPAT1과의 사이의 아미노산 서열의 동일성은 15.7%이다. 또, 본 발명의 GPAT2 유전자를 BLASTX 해석한 결과, 가장 E-value가 낮았던, 즉 동일성이 높았던 아스퍼질러스 니듈란스 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소와 같은 추정 단백질 서열(GB 액세션 No. EAA62242), 및 기능이 밝혀져 있는 단백질에서 가장 동일성이 높았던 사카로마이세스 세레비지애 유래의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소인 Sct1p(GB 액세션 No. CAC85390)와의 동일성은, 각각 17.0%와 15.0%이다.

본 발명은 또한, 상기 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열(「본 발명의 염기 서열」이라고 기재하는 경우도 있음), 및, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열(「본 발명의 아미노산 서열」이라고 기재하는 경우도 있음)로 이루어지는 단백질 을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산을 포함한다. 「동등한 기능을 갖는」이란, 본 발명의 염기 서열이 코드하는 단백질 및 본 발명의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이, GPAT 활성을 갖는 것을 의미한다. 또한, 이 GPAT 활성에 더하여, 본 발명의 염기 서열이 코드하는 단백질, 또는, 본 발명의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

v) 아라키돈산 및/또는 디호모γ리놀렌산의 함유량의 비율

중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질(이하, 「본 발명의 GPAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질」이라고 하는 경우도 있음)인 경우도 포함된다.

구체적으로는, 상기 본 발명의 염기 서열 등을 발현 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)에 삽입한 것을, 효모 사카로마이세스 세레비지애 EH13-15주(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)를 숙주로서 형질 전환시키고, 얻어진 형질 전환체를 배양하여 회수한 균체를, 이하의 실시 예 6 등에 기재한 방법으로 지방산 해석을 한 경우의 상기 본 발명의 GPAT의 지방산 조성이, 구체적으로, 이하의

i) 올레산 함유량이 47% 이상, 바람직하게는 48% 이상, 49% 이상, 50% 이상, 51% 이상;

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율이 8.0 이상, 바람직하게는 9.0 이상, 10.0 이상, 10.5 이상;

iii) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 함유량의 비율이 8.5 이상, 바람직하게는 9.0 이상, 10.0 이상, 11.0 이상, 11.5 이상; 및

iv) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한, 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율이 1.2 이상, 바람직하게는 1.3 이상, 1.4 이상; 및

v) 아라키돈산의 함유율이, 0.47 이상, 바람직하게는 0.50 이상, 0.55 이상, 0.60 이상, 및/또는, 디호모γ리놀렌산의 함유율이, 0.34 이상, 바람직하게는 0.40 이상, 0.50 이상, 0.55 이상

중 적어도 하나 이상의 수치를 만족하는 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하고 있는 염기 서열을 포함하는 핵산이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 염기 서열 등은, GPAT 활성 및 상기 본 발명의 GPAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산이다.

본 발명의 지방산 조성물의 특징 중 하나로서, 아라키돈산 함유율이 높은 것 을 들 수 있다. 아라키돈산은, 화학식 C₂₀H₃₂O₂로 표시되는 분자량 304.47의 물질로, 4개의 이중 결합을 포함하는 20개의 탄소쇄로 이루어지는 카르복실산(〔20:4(n-6)〕)이며, (n-6)계에 분류된다. 아라키돈산은, 동물의 세포막 중의 중요한 인지질(특히 포스파티딜에탄올아민·포스파티딜콜린·포스파티딜이노시톨)로서 존재하고, 뇌에 많이 포함된다. 또한 아라키돈산은, 아라키돈산 캐스케이드에 의해 생성하는 프로스타글란딘·트롬복산·류코트리엔 등 일련의 에이코사노이드의 출발 물질이고, 세포 간의 신호 전달에 있어서의 제2메신저로서도 중요하다. 한편, 아라키돈산은, 동물에서는 리놀레산을 원료로서 체내에서 합성된다. 그러나, 동물의 종 혹은 연령 등에 따라서는, 이 기능이 충분하지 않기 때문에 필요한 양을 생산할 수 없거나, 혹은 전혀 생산하는 기능이 없기 때문에, 음식물로부터 아라키돈산을 섭취하지 않으면 안되므로, 아라키돈산은 필수 지방산이라고 할 수 있다.

본 발명의 지방산 조성물 중의 아라키돈산 함유율은, 예컨대 이하와 같이 측정할 수 있다. 즉, 본 발명의 GPAT2의 플라스미드를, 예컨대 실시예 8에 기재한 방법에 의해 pDuraSC나 pDura5MCS 등의 벡터에 삽입하고, M. 알피나 주로 형질 전환하여 얻어진 형질 전환체를 발현시켜, 실시예 8에 기재한 배양 방법 등에 따라 얻어진 배양균체를 이용하여 균체 내의 지방산 함유율이나 배지 당의 아라키돈산의 함유량 등을 측정하는 방법이다. 아라키돈산의 함유량 등의 분석 방법으로서는, 예컨대 얻어진 배양균체의 지방산을 염산메탄올법에 의해 지방산 메틸에스테르로 유도한 후, 헥산으로 추출하여, 헥산을 증류 제거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 행하는 방법을 들 수 있다. 이것에 의하면, 본 발명의 GPAT2를 M. 알피나로 형질 전환시킨 경우는, 균체 내의 지방산 함유율도 배지 당의 아라키돈산 생산량도 높은 것이 나타나 있다. 이와 같이, 아라키돈산 함유율이 높은 본 발명의 지방산 조성물은, 아라키돈산을 효율적으로 섭취할 수 있기 때문에, 바람직하다.

또한, 본 발명의 지방산 조성물의 특징 중 하나로서, 디호모γ리놀렌산 함유율이 높은 것을 들 수 있다. 디호모γ리놀렌산(DGLA)은, 화학식 C₂₀H₃₄O₂로 표시되는 분자량 306.48의 물질로, 3개의 이중 결합을 포함하는 20개의 탄소쇄로 이루어지는 카르복실산(〔20:3(n-6)〕)이며, (n-6)계에 분류된다. DGLA는, γ-리놀렌산(18:3(n-6))이 신장함으로써 얻어진다. DGLA의 이중 결합이 하나 증가하면 아라키돈산이 생성된다.

이러한 본 발명의 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산으로서는, 이하의 (a)~(e) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다. 또, 이하에 예를 드는 염기 서열의 기재에 있어서, 「본 발명의 상기 활성」이란, 상기한 「GPAT 활성 및/또는 상기 본 발명의 GPAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성」을 의미한다.

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

구체적으로는,

(i) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 1개 또는 복수 개[바람직하게는 1개 또는 수 개(예컨대, 1~180개, 1~150개, 1~100개, 1~50개, 1~30개, 1~25개, 1~20개, 1~15개, 1~10개, 더욱 바람직하게는 1~5개)]의 아미노산이 결실된 아미노산 서열,

(ii) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 1개 또는 복수 개[바람직하게는 1개 또는 수 개(예컨대 1~180개, 1~150개, 1~100개, 1~50개, 1~30개, 1~25개, 1~20개, 1~15개, 1~10개, 더욱 바람직하게는 1~5개)]의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열,

(iii) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1개 또는 복수 개[바람직하게는 1개 또는 수 개(예컨대 1~180개, 1~150개, 1~100개, 1~50개, 1~30개, 1~25개, 1~20개, 1~15개, 1~10개, 더욱 바람직하게는 1~5개)]의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 서열, 또는

(iv) 상기 (i)~(iii)를 조합한 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다.

상기 중, 치환은, 바람직하게는 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 특정한 아미노산 잔기를 유사한 물리 화학적 특징을 갖는 잔기로 치환하는 것이지만, 원래 의 서열 구조에 관한 특징을 실질적으로 변화시키지 않으면 어떠한 치환이라도 좋고, 예컨대 치환 아미노산이, 원래의 서열에 존재하는 나선를 파괴하거나, 원래의 서열을 특징짓는 다른 종류의 2차 구조를 파괴하지 않으면 어떠한 치환이라도 좋다.

보존적 치환은, 일반적으로는, 생물학적 합성계나 화학적 펩티드 합성으로 도입되지만, 바람직하게는, 화학적 펩티드 합성에 의한다. 이 경우, 치환기에는, 비천연 아미노산 잔기가 포함되어 있더라도 좋고, 펩티드 모방체나, 아미노산 서열 중, 치환되지 않은 영역이 역전하고 있는 역전형 또는 동영역이 반전하고 있는 반전형도 포함된다.

이하에, 아미노산 잔기를 치환 가능한 잔기별로 분류하여 예시하지만, 치환 가능한 아미노산 잔기는 이하에 기재되어 있는 것에 한정되는 것이 아니다.

A군: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌 및 시클로헥실알라닌

B군: 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산 및 2-아미노수베르산

C군: 아스파라긴 및 글루타민

D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산 및 2,3-디아미노프로피온산

E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린 및 4-히드록시프롤린

F군: 세린, 트레오닌 및 호모세린

G군: 페닐알라닌 및 티로신

비보존적 치환인 경우는, 상기 종류 중, 어느 하나의 멤버와 다른 종류의 멤버를 교환할 수 있지만, 이 경우는, 본 발명의 단백질의 생물학적 기능을 유지하기 위해, 아미노산의 히드로파시(hydropathy) 지수(히드로파시아미노산 지수)를 고려하는 것이 바람직하다[Kyte 등, J. Mol. Biol., 157:105-131(1982)].

또한, 비보존적 치환인 경우는, 친수성에 기초하여 아미노산의 치환을 행할 수 있다.

본 명세서 및 도면에 있어서, 염기나 아미노산 및 그 약어는, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature에 따르거나, 또는, 예컨대 Immunology--A Synthesis[제2판, E.S. Golub 및 D.R. Gren 감수, Sinauer Associates, 메사추세츠주 선더랜드(1991)] 등에 기재되어 있는 것과 같은, 당업계에서 관용되고 있는 약어에 기초한다. 또한 아미노산에 관하여 광학 이성체가 있을 수 있는 경우는, 특별히 명시하지 않으면 L체를 나타낸다.

D-아미노산 등의 상기한 아미노산의 입체 이성체, α,α-이치환 아미노산 등의 비천연 아미노산, N-알킬아미노산, 젖산 및 그 밖의 비관용적인 아미노산도 또한, 본 발명의 단백질을 구성하는 요소가 될 수 있다.

또, 본 명세서에서 이용하는 단백질의 표기법은, 표준적 용법 및 당업계에서 관용되고 있는 표기법에 기초하여, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카르복시 말단 방향이다.

마찬가지로, 일반적으로는, 특별히 언급하지 않는 한, 단일쇄 폴리뉴클레오 티드 서열의 좌단은 5'단이고, 이중쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향을 5' 방향으로 한다.

당업자라면, 당업계에서 공지의 기술을 이용하여, 본 명세서에 기재한 단백질의 적당한 변이체를 설계하여 제작할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 그다지 중요하지 않다고 생각되는 영역을 타겟으로 함으로써, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성을 손상시키지 않고 그 구조를 변화시킬 수 있는 단백질 분자 중의 적절한 영역을 동정할 수 있다. 또한, 유사한 단백질 간에 보존되어 있는 분자의 잔기 및 영역을 동정할 수도 있다. 또한, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하다고 생각되는 영역 중에, 생물학적 활성을 손상시키지 않고, 또한, 단백질의 폴리펩티드 구조에 악영향을 부여하지 않고서, 보존적 아미노산 치환을 도입할 수도 있다. 특히, 본 발명에서는, 도 1 중에 이중 하선으로 나타낸 바와 같이, 본 발명의 GPAT의 아미노산 서열 중의 제87~93잔기에, 글리세로인지질 아실기 전이 효소(Glycerolipid acyltransferase)에 필수적인 보존 모티브인 「HXXXXD(HX₄D)」(J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998)와 유사한 모티브가 존재한다(보존되는 히스티딘 및 아스파라긴산을 *로 나타냄). 또, 상기 보존 모티브 중에서, X는 어떠한 아미노산 잔기라도 좋은 것을 나타내고 있다. 이 모티브는 본 발명의 GPAT에 있어서도, GPAT 활성을 유지하기 위해서 중요하다고 생각된다. 또한, 도 1 중에 있어서 *로 나타낸, 본 발명의 GPAT의 아미노산 서열 중의 제87잔기, 제93잔기 및 제172잔기는, 본 발명의 GPAT의 활성에 중요하다고 생각된다. 또한, 제138 잔기 및 제174잔기는, 본 발명의 GPAT와 글리세롤-3-인산과의 결합에 중요하다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 변이체는, 상기 보존 모티브 및 상기에 나타낸 잔기가 보존되어 있는 한, 어떠한 변이체라도 좋다.

당업자라면, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하고, 동단백질의 펩티드와 유사한 펩티드의 잔기를 동정하며, 이 2개의 펩티드의 아미노산 잔기를 비교하여, 본 발명의 단백질과 유사한 단백질의 어느 잔기가, 생물학적 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기인지를 예측하는, 소위, 구조-기능 연구를 행할 수 있다. 또한, 이와 같이 예측한 아미노산 잔기의 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택함으로써, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성이 유지되어 있는 변이체를 선택할 수도 있다. 또한, 당업자라면, 본 단백질의 변이체의 3차원 구조 및 아미노산 서열을 해석할 수도 있다. 또한, 얻어진 해석 결과로부터, 단백질의 3차원 구조에 관한 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수도 있다. 단백질 표면 상에 있다고 예측되는 아미노산 잔기는, 다른 분자와의 중요한 상호 작용에 관여할 가능성이 있지만, 당업자라면, 상기한 바와 같은 해석 결과에 기초하여, 이러한 단백질 표면 상에 있다고 예측되는 아미노산 잔기를 변화시키지 않는 것과 같은 변이체를 제작할 수 있다. 또한, 당업자라면, 본 발명의 단백질을 구성하는 각각의 아미노산 잔기 중, 하나의 아미노산 잔기만을 치환하는 변이체를 제작할 수도 있다. 이러한 변이체를 공지의 분석 방법에 의해 스크리닝하여, 개개의 변이체 정보를 수집할 수 있다. 이에 따라, 어느 특정한 아미노산 잔기가 치환된 변이체의 생물학적 활성이, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 비해 저하되는 경 우, 그와 같은 생물학적 활성을 나타내지 않는 경우, 또는, 본 단백질의 생물학적 활성을 저해하는 부적절한 활성을 발생시키는 경우를 비교함으로써, 본 발명의 단백질을 구성하는 개개의 아미노산 잔기의 유용성을 평가할 수 있다. 또한, 당업자라면, 이러한 일상적인 실험에서 수집한 정보에 기초하여, 단독으로, 또는 다른 돌연변이와 조합하여, 본 발명의 단백질의 변이체로서는 바람직하지 않은 아미노산 치환을 용이하게 해석할 수 있다.

상기한 바와 같이, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질은, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』[Cold Spring Harbor Press(2001)], 『Current Protocols in Molecular Biology』[John Wiley & Sons(1987-1997), Kunkel(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92, Kunkel(1988) Method. Enzymol. 85:2763-6] 등에 기재한 부위 특이적 변이 유발법 등의 방법에 따라 조제할 수 있다. 이러한 아미노산의 결실, 치환 혹은 부가 등의 변이가 이루어진 변이체의 제작은, 예컨대 Kunkel법이나 Gapped duplex법 등의 공지 수법에 의해, 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예컨대 QuikChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit[스트라타진사 제조), GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System(인비트로겐사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등: 타카라바이오사 제조) 등을 이용하여 행할 수 있다.

또, 단백질의 아미노산 서열에, 그 활성을 유지하면서 1 또는 복수 개의 아미노산의 결실, 치환, 혹은 부가를 도입하는 방법으로서는, 상기한 부위 특이적 변이 유발 외에도, 유전자를 변이원으로 처리하는 방법, 및 유전자를 선택적으로 개열하여 선택된 뉴클레오티드를 제거, 치환 혹은 부가한 후에 연결하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 바람직하게는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1~10개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, GPAT 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다.

또한, 본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열에는, 서열 번호 2에서 1~10개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열도 포함된다.

본 발명의 단백질에 있어서의 아미노산의 변이 또는 수식의 수, 혹은 변이 또는 수식의 부위는, GPAT 활성, 또는 본 발명의 GPAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성이 유지되는 한 제한은 없다.

본 발명의 GPAT 활성, 또는 본 발명의 GPAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성은, 공지의 방법을 이용하여 측정하는 것이 가능하다. 예컨대, 이하의 문헌: Biochem. J., 355, 315-322, 2001을 참조할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 「GPAT 활성」은 이하와 같이 측정하더라도 좋다. 본 발명의 GPAT를 발현시킨 효모로부터, J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)에 기재한 방법 등에 의해 마이크로솜 획분을 조제한다. 그리고, 반응액인 0.44 mM 글리세 롤-3-인산, 0.36 mM 아실-CoA, 0.5 mM DTT, 1 mg/ml BSA, 2 mM MgCl₂, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5)에 상기 마이크로솜 획분을 첨가하고, 28℃에서 적당한 시간 반응시키며, 클로로포름:메탄올을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 지질의 추출을 행하고, 얻어진 지질을 박층 크로마토그래피 등에 의해 분획하여, 생성된 리소포스파티드산의 양을 정량할 수 있다.

또한, 본 발명의 「GPAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성」은, 예컨대 이하와 같이 측정하더라도 좋다. 본 발명의 지방산 조성물의 제조 방법에 의해 얻어진 동결 건조한 균체에, 적당한 비율로 조정한 클로로포름:메탄올을 첨가하여 교반한 후, 적당한 시간, 가열 처리를 한다. 또한 원심 분리에 의해 균체를 분리하고, 용매를 회수하는 것을 수 회 반복한다. 그 후, 적당한 방법을 이용하여 지질을 건고시키고 나서, 클로로포름 등의 용매를 첨가하여 지질을 용해한다. 이 시료를 적당량 분취하고, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르에 유도한 후에, 헥산으로 추출하여, 헥산을 증류 제거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 분석을 행한다.

(b) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 하이브 리다이즈하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 서열 번호 4 및 GPAT 활성에 대해서는 상기한 바와 같다.

상기 염기 서열은, 당업자에게 공지인 방법으로 적당한 단편을 이용하여 프로브를 제작하고, 이 프로브를 이용하여 균주 복제(colony hybridization), 플라크 잡종(plaque hybridization), 서던 블롯(Southern blot) 등의 공지의 하이브리다이제이션법에 의해, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리 등으로부터 얻을 수 있다.

하이브리다이제이션법의 상세한 순서에 대해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』[Cold Spring Harbor Press(2001); 특히 Section 6-7], 『Current Protocols in Molecular Biology』[John Wiley & Sons(1987-1997); 특히 Section 6.3-6.4], 『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』[Oxford University(1995); 하이브리다이제이션 조건에 대해서는 특히 Section 2.10] 등을 참조할 수 있다.

하이브리다이제이션 조건의 장점은, 주로 하이브리다이제이션 조건, 보다 바람직하게는, 하이브리다이제이션 조건 및 세정 조건에 의해 결정된다. 본 명세서에 있어서의 「엄격한 조건」에는, 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건이 포함된다.

구체적으로는, 중간 정도로 엄격한 조건으로서는, 예컨대 하이브리다이제이션 조건으로서, 1×SSC~6×SSC, 42℃~55℃의 조건, 보다 바람직하게는, 1×SSC~3×SSC, 45℃~50℃의 조건, 가장 바람직하게는, 2×SSC, 50℃의 조건을 들 수 있다. 하이브리다이제이션 용액 중에, 예컨대 약 50%의 포름아미드를 포함하는 경우에는, 상기 온도보다 5 내지 15℃ 낮은 온도를 채용한다. 세정 조건으로서는, 0.5×SSC~6 ×SSC, 40℃~60℃를 들 수 있다. 하이브리다이제이션 및 세정시에는, 일반적으로, 0.05%~0.2%, 바람직하게는 약 0.1% SDS를 첨가하더라도 좋다.

고도로 엄격(high stringent)한 조건으로서는, 중간 정도로 엄격한 조건보다 높은 온도 및/또는 낮은 염 농도에서의 하이브리다이제이션 및/또는 세정을 포함한다. 예컨대, 하이브리다이제이션 조건으로서, 0.1×SSC~2×SSC, 55℃~65℃의 조건, 보다 바람직하게는, 0.1×SSC~1×SSC, 60℃~65℃의 조건, 가장 바람직하게는, 0.2×SSC, 63℃의 조건을 들 수 있다. 세정 조건으로서, 0.2×SSC~2×SSC, 50℃~68℃, 보다 바람직하게는, 0.2×SSC, 60~65℃를 들 수 있다.

특히 본 발명에 이용되는 하이브리다이제이션 조건으로서는, 예컨대 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 50% 포름아미드 중 42℃의 조건으로 프리 하이브리다이제이션을 행한 후, 프로브를 첨가하고 밤새 42℃로 유지하여 하이브리드를 형성시키며, 그 후, 0.2×SSC, 0.1% SDS 중, 65℃로 20분간의 세정을 3회 행한다고 하는 조건을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또한, 프로브에 방사성 물질을 사용하지 않는 시판의 하이브리다이제이션 키트를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, DIG 핵산 검출 키트(로슈 진단사), ECL direct labeling & detection system(Amersham사 제조)을 사용한 하이브리다이제이션 등을 들 수 있다.

본 발명에 포함되는 염기 서열로서는, 바람직하게는, 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한, GPAT 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

(c) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 4에 표시되는 핵산 서열에 대하여 70% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

바람직하게는, 서열 번호 4에 표시되는 핵산 서열에 대하여 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 80%(예컨대, 85% 이상, 한층 더 바람직하게는 90% 이상, 나아가서는 95%, 98% 또는 99%)의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

2개의 핵산 서열의 동일성 %는, 시각적 검사나 수학적 계산에 의해 결정할 수 있지만, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2개의 핵산의 서열 정보를 비교함으로써 결정하는 것이 바람직하다. 서열 비교 컴퓨터 프로그램으로서는, 예컨대 미국 국립 의학 도서관의 웹 사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html에서 이용할 수 있는 BLASTN 프로그램[Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]: 버전 2.2.7, 또는 WU-BLAST2.0 알고리즘 등을 들 수 있다. WU-BLAST2.0에 대한 표준 디폴트 파라미터의 설정은, 이하의 인터넷 사이트: http://blast.wustl.edu에 기재되어 있는 것을 이용할 수 있다.

(d) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산이 코드하는 단백질은, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질과 동등한 기능을 갖는 한, GPAT2의 아미노산 서열과 동일성이 있는 단백질이라도 좋다.

구체적으로는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%(예컨대, 95%, 나아가서는, 98%) 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 바람직하게는, 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다. 더욱 바람직하게는, 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다.

2개의 아미노산 서열의 동일성 퍼센트는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정할 수 있다. 또한, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 동일성 퍼센트를 결정할 수도 있다. 그와 같은 컴퓨터 프로그램으로서는, 예컨대 BLAST, FASTA[Altschul 등, J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)], 및 ClustalW 등을 들 수 있다. 특히, BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색의 각종 조건(파라미터)은, Altschul 등(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)에 기재된 것으로, 미국 생물 공학 정보 센터(NCBI) 나 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹 사이트에서 공적으로 입수할 수 있다(BLAST 메뉴얼, Altschul 등 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul 등). 또한, 유전 정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스), DINASIS Pro(히다치 소프트), Vector NTI(Infomax) 등의 프로그램을 이용하여 결정할 수도 있다.

복수의 아미노산 서열을 병렬시키는 특정한 정렬 스킴(alignment scheme)은, 서열 중, 특정한 짧은 영역의 매칭도 나타낼 수 있기 때문에, 이용한 서열의 전체 길이 서열 간에 유의한 관계가 없는 경우라도, 그와 같은 영역에 있어서, 특정한 서열 동일성이 매우 높은 영역을 검출할 수도 있다. 또한, BLAST 알고리즘은, BLOSUM62 아미노산 스코어를 붙이는 매트릭스를 이용할 수 있지만, 선택 파라미터로서는, 이하의 것을 이용할 수 있다: (A) 낮은 조성 복잡성을 갖는 쿼리 서열(query sequence)의 세그먼트[Wootton 및 Federhen의 SEG 프로그램(Computers and Chemistry, 1993)에 의해 결정됨; Wootton 및 Federhen, 1996 「서열 데이터 베이스에 있어서의 조성 편중 영역의 해석(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」 Methods Enzymol., 266:544-71도 참조하기를 바람], 또는, 단주기성의 내부 반복으로 이루어지는 세그먼트[Claverie 및 States(Computers and Chemistry, 1993)의 XNU 프로그램에 의해 결정됨]를 마스크하기 위한 필터를 포함하는 것, 및 (B) 데이터 베이스 서열에 대한 적합을 보고하기 위한 통계학적 유의성(有意性)의 임계치, 또는 E-스코어(Karlin 및 Altschul, 1990)의 통계학적 모델에 따라, 단순히 우연에 의해 발견되는 적합의 기대 확률; 어떤 적합에 기인하는 통계학적 유의차(有意差)가 E-스코어 임계치보다 큰 경우, 이 적합은 보고되지 않는다.

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 하이브리다이즈의 조건은 상기한 바와 같다. 본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열로서는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산에는, 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에서 1 혹은 복수 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산도 포함된다. 구체적으로는,

(i) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열 중 1개 또는 복수 개[바람직하게는 1 개 또는 수 개(예컨대, 1~540개, 1~500개, 1~400개, 1~300개, 1~200개, 1~150개, 1~100개, 1~50개, 1~30개, 1~25개, 1~20개, 1~15개, 1~10개, 더욱 바람직하게는 1~5개)]의 염기가 결실된 염기 서열,

(ii) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열 중 1개 또는 복수 개[바람직하게는 1개 또는 수 개(예컨대 1~540개, 1~500개, 1~400개, 1~300개, 1~200개, 1~150개, 1~100개, 1~50개, 1~30개, 1~25개, 1~20개, 1~15개, 1~10개, 더욱 바람직하게는 1~5개)]의 염기가 다른 염기로 치환된 염기 서열,

(iii) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열에서 1개 또는 복수 개[바람직하게는 1개 또는 수 개(예컨대 1~540개, 1~500개, 1~400개, 1~300개, 1~200개, 1~150개, 1~100개, 1~50개, 1~30개, 1~25개, 1~20개, 1~15개, 1~10개, 더욱 바람직하게는 1~5개)]의 다른 염기가 부가된 염기 서열, 또는

(iv) 상기 (i)~(iii)를 조합한 염기 서열로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하고 있는 염기 서열을 포함하는 핵산을 이용할 수도 있다.

본 발명의 핵산의 바람직한 양태로서는, 이하의 (a)~(c) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열의 단편을 포함하는 핵산도 포함된다.

(a) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열

(c) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열

(a) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열, (b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노 산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열, (c) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 대해서는, 표 1에 기재한 바와 같다. 상기 서열의 프래그먼트란, 상기 염기 서열에 포함되는 ORF, CDS, 생물학적 활성을 갖는 영역, 이하에 기재하는 것과 같은 프라이머로서 이용한 영역, 프로브가 될 수 있는 영역이 포함되고, 천연 유래인 것이나 인공적으로 제작한 것이라도 좋다.

본 발명의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 단백질

본 발명의 단백질은, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 상기 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 포함하고, 천연 유래인 것이나 인공적으로 제작한 것이라도 좋다. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질에 대해서는, 상기한 바와 같다. 「동등한 기능을 갖는 단백질」이란, 상기 『본 발명의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소를 코드하는 핵산』의 항에서 설명한 대로, 「본 발명의 상기 활성」을 갖는 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질로서는, 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재한 단백질을 들 수 있다.

(a) 서열 번호 2에서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질

(b) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질

상기 중, 서열 번호 2에서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부 가된 아미노산 서열, 또는, 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열에 대해서는, 상기 『본 발명의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소를 코드하는 핵산』의 항에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 「본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질」은, 서열 번호 4의 염기 서열을 포함하는 핵산에 의해 코드되는 단백질의 변이체, 또는, 서열 번호 2에 표시되는 아미노산 서열에서 1개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가 등의 많은 종류의 수식에 의해 변이된 단백질, 혹은 아미노산 측쇄 등이 수식되어 있는 수식 단백질, 다른 단백질과의 융합 단백질로서, 또한, GPAT 활성을 갖는 단백질이거나, 및/또는, 본 발명의 GPAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질도 포함된다.

또한, 본 발명의 단백질은, 인공적으로 제작한 것이라도 좋고, 그 경우는, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드밴스드캠테크사 제조, 퍼킨 엘머사 제조, 파르마시아사 제조, 프로테인 테크놀로지 인스트루먼트사 제조, 신세셀베가사 제조, 퍼셉티브사 제조, 시마즈 제작소사 제조 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

GPAT의 핵산의 클로닝

본 발명의 GPAT의 핵산은, 예컨대 적절한 프로브를 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝함으로써, 클로닝할 수 있다. 또한, 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 반응에 의해 증폭하고, 적절한 벡터에 연결함으로써 클로닝할 수 있다. 또한, 별도의 벡터에 서브클로닝할 수도 있다.

예컨대, pBlue-Script^TM SK(+)(Stratagene), pGEM-T(Promega), pAmp(TM: Gibco-BRL), p-Direct(Clontech), pCR2.1-TOPO(Invitrogen) 등의 시판의 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다. 또한, PCR 반응으로 증폭하는 경우, 프라이머는, 상기한 서열 번호 1 등에 표시되는 염기 서열 중 어느 부분도 이용할 수 있지만, 예컨대 서열 번호 1에 대해서는,

상류측용 프라이머로서 E-1:5'-CTGACTACCAAAACCAGCTGGACTTC-3'(서열 번호 6)를,

하류측 프라이머로서, E-2:5'-GGCAATTTCATCCAAGTTGTCCTCC-3'(서열 번호 7) 등을 이용할 수 있다. 그리고, M. 알피나 균체로부터 조제한 cDNA에, 상기 프라이머 및 DNA폴리머라아제 등을 작용시켜 PCR 반응을 행한다. 상기 방법은, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』[Cold Spring Harbor Press(2001)] 등에 따라, 당업자라면 용이하게 행할 수 있지만, 본 발명의 PCR 반응의 조건으로서는, 예컨대 이하의 조건을 들 수 있다.

변성 온도: 90~95℃

어닐링 온도: 40~60℃

신장 온도: 60~75℃

사이클 수: 10회 이상

얻어진 PCR 산물의 정제에는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, GENECLEAN(후나코시), QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN), ExoSAP-IT(GE 헬 스 케어 바이오 사이언스) 등의 키트를 이용하는 방법, DEAE-셀룰로오스 여과지를 이용하는 방법, 투석 튜브를 이용하는 방법 등이 있다. 아가로스겔을 이용하는 경우에는, 아가로스겔 전기 영동을 행하고, 핵산 단편을 아가로스겔로부터 추출하여, GENECLEAN(후나코시), QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN), 프리즈 & 스퀴즈법 등에 의해 정제할 수 있다.

클로닝한 핵산의 염기 서열은, 염기 서열 시퀀서를 이용하여 염기 서열을 결정할 수 있다.

GPAT 발현용 벡터 구축 및 형질 전환체의 제작

본 발명은 또한, 본 발명의 GPAT2를 코드하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명은, 또한, 상기 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체도 제공한다.

이러한 재조합 벡터 및 형질 전환체는 이하와 같이 하여 얻을 수 있다. 즉, 본 발명의 GPAT를 코드하는 핵산을 갖는 플라스미드를 제한 효소를 이용하여 소화한다. 이용하는 제한 효소로서는, 예컨대 EcoRI, KpnI, BamHI 및 SalI 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 말단을 T4폴리머라아제 처리함으로써 평활화하더라도 좋다. 소화 후의 염기 서열 단편을 아가로스겔 전기 영동에 의해 정제한다. 이 염기 서열 단편을, 발현용 벡터에 공지의 방법을 이용하여 삽입함으로써, GPAT 발현용 벡터를 얻을 수 있다. 이 발현 벡터를 숙주에 도입하여 형질 전환체를 제작하여, 목적으로 하는 단백질의 발현을 하도록 한다.

이 때, 발현 벡터 및 숙주은, 목적으로 하는 단백질을 발현할 수 있는 것이 면 특별히 한정되지 않고, 예컨대 숙주로서, 진균이나 세균, 식물, 동물 혹은 그들의 세포 등을 들 수 있다. 진균으로서, 지질 생산균인 M. 알피나 등의 실형 균, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모 등을 들 수 있다. 또한 세균으로서, 대장균(Escherichia coli)이나 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 또한 식물로서는, 유채씨, 콩, 목화, 홍화, 아마 등의 유량(油糧) 식물을 들 수 있다.

지질 생산균으로서는, 예컨대 MYCOTAXON, Vol.XLIV, NO.2, pp.257-265(1992)에 기재되어 있는 균주를 사용할 수 있고, 구체적으로는, 모르티에렐라(Mortierella)속에 속하는 미생물, 예컨대 모르티에렐라·엘론가타(Mortierella elongata) IFO8570, 모르티에렐라·엑시구아(Mortierella exigua) IFO8571, 모르티에렐라·하이그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941, 모르티에렐라·알피나(Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS 219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등의 모르티에렐라 아속(subgenus Mortierella)에 속하는 미생물, 또는 모르티에렐라·이사벨리나(Mortierella isabellina) CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, 모르티에렐라·나나(Mortierella nana) IFO8190, 모르티에렐라·라만니아나(Mortierella ramanniana) IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287, 모르티에렐라·비나세아(Mortierella vinacea) CBS236.82 등의 마이크로뮤코 아속(subgenus Micromucor)에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 특히, 모르티에렐라·알피 나(Mortierella alpina)가 바람직하다.

진균류를 숙주로서 이용하는 경우는, 본 발명의 핵산이 숙주 중에서 자립 복제 가능하거나, 혹은 해당 균의 염색체 상에 삽입될 수 있는 구조인 것이 바람직하다. 그와 동시에, 프로모터, 터미네이터를 포함하는 구성인 것이 바람직하다. 숙주로서 M. 알피나를 사용하는 경우, 발현 벡터로서, 예컨대 pD4, pDuraSC, pDura5 등을 들 수 있다. 프로모터로서는, 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 프로모터를 이용하더라도 좋고, 예컨대 histonH4.1 유전자 프로모터, GAPDH(글리세르알데히드3-인산 데히드로게나아제) 유전자 프로모터, TEF(Translation elongation factor) 유전자 프로모터라고 하는 M. 알피나에 유래하는 프로모터가 이용된다.

M. 알피나 등의 실형 균으로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예컨대 전기 천공법, 스페로플라스트법, 파티클 딜리버리법 및 핵 내로의 DNA의 직접 마이크로 인젝션 등을 들 수 있다. 영양 요구성의 호스트주를 이용하는 경우는, 그 영양소를 결핍한 선택 배지 상에서 생육하는 주를 선택함으로써, 형질 전환주를 취득할 수 있다. 또한, 형질 전환에 약제 내성 마커 유전자를 이용하는 경우에는, 그 약제를 포함하는 선택 배지로 배양을 행하여, 약제 내성을 나타내는 세포 콜로니를 얻을 수 있다.

효모를 숙주로서 이용하는 경우는, 발현 벡터로서, 예컨대 pYE22m 등을 들 수 있다. 또한, pYES(Invitrogen), pESC(STRATAGENE) 등의 시판의 효모 발현용 벡터를 이용하더라도 좋다. 또한 본 발명에 알맞는 숙주로서는, 사카로마이세스 세레비지애 EH13-15주(trp1, MATα) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 프로 모터로서는, 예컨대 GAPDH 프로모터, gal1 프로모터, gal10 프로모터 등의 효모 등에 유래하는 프로모터가 이용된다.

효모로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예컨대 초산리튬법, 전기 천공법, 스페로플라스트법, 덱스트란 중개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 중개 트랜스펙션, 프로토 플라스트 융합, 리포좀 중의 폴리뉴클레오티드(단수 또는 복수)의 피포(被包), 및 핵 내로의 DNA의 직접 마이크로 인젝션 등을 들 수 있다.

대장균 등의 세균을 숙주로서 이용하는 경우는, 발현 벡터로서는, 예컨대 파르마시아사의 pGEX, pUC18 등을 들 수 있다. 프로모터로서는, 예컨대 trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등의 대장균이나 파지(phage) 등에 유래하는 프로모터가 이용된다. 세균으로의 재조직 벡터의 도입 방법으로서는, 예컨대 전기 천공법이나 염화칼슘법을 이용할 수 있다.

본 발명의 지방산 조성물의 제조 방법

본 발명은 상기 형질 전환체로부터 지방산 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 즉, 상기 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 지방산 조성물을 제조하는 방법이다. 구체적으로는, 이하의 방법으로 제조할 수 있다. 그러나, 본 제조 방법에 관해서는, 해당 방법에 한정되지 않고, 일반적인 공지의 다른 방법을 이용하여 행할 수도 있다.

GPAT를 발현시킨 생물의 배양에 이용하는 배지는, 적당한 pH 및 침투압을 가지고, 각 숙주의 증식에 필요한 영양소, 미량 성분, 혈청이나 항생 물질 등의 생물 재료를 포함하고 있는 배양액(배지)이면, 어떠한 배양액도 이용할 수 있다. 예컨 대, 효모를 형질 전환하여 GPAT를 발현시킨 경우는, SC-Trp 배지, YPD 배지, YPD5 배지 등을 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적인 배지의 조성으로서 SC-Trp 배지를 예시한다: [1 l 당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 류신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 우라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g].

배양 조건은, 숙주의 증식에 적합하고, 또한 생성된 효소가 안정하게 유지되는 데 적당한 조건이면 어떠한 조건이라도 좋지만, 구체적으로는, 혐기도(嫌氣度), 배양 시간, 온도, 습도, 정치 배양 또는 진탕 배양 등의 개개의 조건을 조절할 수 있다. 배양 방법은, 동일 조건에서의 배양(1단계 배양)이라도 좋고, 2 이상의 다른 배양 조건을 이용하는, 소위 2단계 배양 혹은 3단계 배양이라도 좋지만, 대량 배양을 행하는 경우에는, 배양 효율이 좋은 2단계 배양 등이 바람직하다.

이하에, 본 발명의 지방산 조성물의 구체적인 제조 방법으로서, 숙주로서 효모를 이용하여 2단계 배양을 행한 경우를 예시하여 설명한다. 즉, 전배양으로서, 상기에서 얻어진 콜로니를, 예컨대 상기한 SC-Trp 배지 등에 식균하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행한다. 그 후, 본 배양으로서, YPD5(2% 효모 엑기스, 1% 폴리펩톤, 5% 글루코오스) 배지 10 ml에 전배양액을 500 ㎕ 첨가하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행하는 방법이다.

본 발명의 지방산 조성물

본 발명은 또한, 본 발명의 GPAT2가 발현되고 있는 세포에 있어서의 1 또는 그 이상의 지방산의 집합체인 지방산 조성물을 제공한다. 지방산은, 유리 지방산이라도 좋고, 트리글리세리드, 인지질 등이라도 좋다. 특히, 본 발명의 지방산 조성물은, 그 지방산 조성에 있어서, 이하의

i) 올레산 함유량

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율

iii) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율, 및

iv) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한, 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율

중 적어도 하나 이상이, 본 발명의 재조합 벡터로 형질 전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물의 상기 비율보다 높은 것을 특징으로 한다. 여기서, 「본 발명의 재조합 벡터로 형질 전환되지 않은 숙주」란, 예컨대 본 명세서 중의 「본 발명의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소를 코드하는 핵산」의 항목에서 기재한 핵산이 삽입되어 있지 않은 벡터(빈 벡터)로 형질 전환된 숙주이다.

본 발명의 지방산 조성물에 포함되는 지방산으로서는, 장쇄 탄수화물의 쇄형 혹은 분기형의 모노카르복실산을 말하고, 예컨대 미리스트산(테트라데칸산)(14:0), 미리스톨레산(테트라데센산)(14:1), 팔미트산(헥사데칸산)(16:0), 팔미톨레산(9-헥사데센산)(16:1), 스테아르산(옥타데칸산)(18:0), 올레산(cis-9-옥타데센산)(18:1(9)), 박센산(11-옥타데센산)(18:1(11)), 리놀레산(cis,cis-9,12 옥타데카디엔산)(18:2(9,12)), α-리놀렌산(9,12,15-옥타데칸트리엔산)(18:3(9,12,15)), γ-리놀렌산(6,9,12-옥타데칸트리엔산)(18:3(6,9,12)), 스테아리돈산(6,9,12,15-옥타데칸테트라엔산)(18:4(6,9,12,15)), 아라키드산(이코산산)(20:0), (8,11-이코사디엔산)(20:2(8,11)), 미드산(5,8,11-이코사트리엔산)(20:3(5,8,11)), 디호모γ-리놀렌산(8,11,14-이코사트리엔산)(20:3(8,11,14)), 아라키돈산(5,8,11,14-이코사테트라엔산)(20:4(5,8,11,14)), 에이코사테트라엔산(8,11,14,17-이코사테트라엔산)(20:4(8,11,14,17), 에이코사펜타엔산(5,8,11,14,17-이코사펜타엔산)(20:5(5,8,11,14,17)), 베헨산(도코산산)(22:0), (7,10,13,16-도코사테트라엔산)(22:4(7,10,13,16)), (7,10,13,16,19-도코사펜타엔산)(22:5(7,10,13,16,19)), (4,7,10,13,16-도코사펜타엔산)(22:5(4,7,10,13,16)), (4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산)(22:6(4,7,10,13,16,19)), 리그노세르산(테트라도코산산)(24:0), 네르본산(cis-15-테트라도코산산)(24:1), 세로트산(헥사도코산산)(26:0) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 상기 물질명은 IUPAC 생화학 명명법으로 정의된 관용명이고, 조직명 및, 탄소수와 이중 결합의 위치를 나타내는 수치를 괄호 내에 기재했다.

본 발명의 지방산 조성물은, 상기한 지방산 중, 1 또는 그 이상의 지방산의 조합이면, 어떠한 수의 어떠한 종류의 지방산으로 이루어지는 조성물이라도 좋다.

이러한 본 발명의 지방산 조성물이 얻어진 것, 즉, 본 발명의 GPAT2가 발현된 것의 확인은, 공지의 일반적인 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예컨대, 효모에서 GPAT를 발현시킨 경우는, 지방산 조성의 변화로서 확인할 수 있다. 즉, 상기 본 발명의 지방산 조성물의 제조 방법에 의해 얻어진 동결 건조한 균체에, 적당한 비율로 조정한 클로로포름:메탄올을 첨가하여 교반한 후, 적당한 시간, 가열 처리를 한다. 또한 원심 분리에 의해 균체를 분리하여, 용매를 회수하는 것을 수 회 반복한다. 그 후, 적당한 방법을 이용하여 지질을 건고시키고 나서, 클로로포름 등의 용매를 첨가하여 지질을 용해한다. 이 시료를 적당량 분취하고, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르에 유도한 후에, 헥산으로 추출하여, 헥산을 증류 제거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 분석을 행한다.

그 결과, 상기한 지방산 조성을 갖는 지방산 조성물이 얻어진 경우는, 본 발명의 지방산 조성물이 얻어졌다고 판단할 수 있다. 또, 본 발명의 GPAT는, 공지의 GPAT 지방산 조성물의 지방산 조성과는 지방산 조성이 다르기 때문에, 본 발명의 GPAT는 공지의 GPAT와 기질 특이성이 다른 것이 나타난다.

본 발명의 지방산 조성물을 포함하는 식품 등

또한, 본 발명은, 상기 지방산 조성물을 포함하는 식품을 제공한다. 본 발명의 지방산 조성물은, 통상법에 따라, 예컨대 유지를 포함하는 식품, 공업 원료[화장료, 의약(예컨대, 피부 외용약), 비누 등의 원료]의 제조 등의 용도에 사용할 수 있다. 화장료(조성물) 또는 의약(조성물)의 제형으로서는, 용액형, 페이스트형, 겔형, 고체형, 분말형 등 임의의 제형을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 식품의 형태로서는, 캡슐 등의 의약 제제의 형태, 또는 단백질, 당류, 지방, 미량 원소, 비타민류, 유화제, 향료 등에 본 발명의 지방산 조성물이 배합된 자연 유동식, 반소화 상태 영양식 및 성분 영양식, 드링크제, 경장(經腸) 영양제 등의 가공 형태를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 식품의 예로서는, 영양 보조 식품, 건강 식품, 기능성 식품, 유아용 식품, 유아용 조제유, 미숙아용 조제유, 노인용 식품 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서는, 식품이란, 고체, 유동체 및 액체 및 이들의 혼합물로서, 섭식 가능한 것의 총칭을 말한다.

영양 보조 식품이란, 특정한 영양 성분이 강화되어 있는 식품을 말한다. 건강 식품이란, 건강적이거나 건강에 좋다고 하는 식품을 말하며, 영양 보조 식품, 자연 식품, 다이어트 식품 등이 포함된다. 기능성 식품이란, 몸의 조절 기능을 담당하는 영양 성분을 보급하기 위한 식품을 말하며, 특정 보건용 식품과 같은 뜻이다. 유아용 식품이란, 약 6세까지의 아이에게 주기 위한 식품을 말한다. 노인용 식품이란, 무처리의 식품과 비교하여 소화 및 흡수가 용이하도록 처리된 식품을 말한다. 유아용 조제유란, 약 1세까지의 아이에게 주기 위한 조제유를 말한다. 미숙아용 조제유란, 미숙아가 생후 약 6개월이 될 때까지 주기 위한 조제유를 말한다.

이들 식품으로서는, 고기, 생선, 견과류 등의 천연 식품(유지로 처리한 것); 중화 요리, 라면, 스프 등의 조리시에 유지를 첨가하는 식품; 튀김, 프라이, 유부, 볶음밥, 도넛, 카린토(karinto, 일본식 튀김 과자) 등의 열 매체로서 유지를 이용한 식품; 버터, 마가린, 마요네즈, 드레싱, 초콜릿, 즉석 라면, 카라멜, 비스킷, 쿠키, 케이크, 아이스크림 등의 유지 식품 또는 가공시에 유지를 첨가한 가공 식품; 쌀과자, 하드 비스킷, 팥앙금빵 등의 가공 마무리시에 유지를 분무 또는 도포한 식품 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 식품은, 유지를 포함하는 식품에 한 정되는 것은 아니고, 예컨대 빵, 국수류, 밥, 과자류[캔디, 츄잉 껌, 구미(gummies), 정과(錠菓), 일본식 과자], 두부 및 그 가공품 등의 농산 식품; 청주, 약용주, 미림, 식초, 간장, 된장 등의 발효 식품; 요구르트, 햄, 베이컨, 소시지 등의 축산 식품; 어묵, 아게텐(ageten, 일본 튀김 요리), 한펜(hanpen, 생선을 갈아 찐 것) 등의 수산 식품; 과즙 음료, 청량 음료, 스포츠 음료, 알콜 음료, 차 등을 들 수 있다.

본 발명의 GPAT를 코드하는 핵산 또는 GPAT 단백질을 이용한 균주의 평가·선택 방법

본 발명은 또한, 본 발명의 GPAT를 코드하는 핵산 또는 GPAT 단백질을 이용하여, 지질 생산균의 평가나 선택을 행하는 방법을 제공한다. 구체적으로는 이하와 같다.

(1) 평가 방법

본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 GPAT를 코드하는 핵산 또는 GPAT 단백질을 이용하여, 지질 생산균의 평가를 행하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 상기 평가 방법으로서는, 우선, 본 발명의 염기 서열에 기초하여 설계한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 피검 균주인 지질 산생 균주의 본 발명의 상기 활성에 대해 평가하는 방법을 들 수 있다. 이러한 평가 방법의 일반적 수법은 공지이며, 예컨대 국제 특허 출원 공보 제WO01/040514호, 일본 특허 공개 평성 제8-205900호 공보 등에 기재되어 있다. 이하, 이 평가 방법에 대해 간단히 설명한다.

우선, 피검 균주의 게놈을 조제한다. 조제 방법은, 헤리퍼드법(hereford method)이나 초산칼륨법 등, 어떠한 공지의 방법도 이용할 수 있다[예컨대, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130(1990) 참조].

본 발명의 염기 서열, 바람직하게는, 서열 번호 4에 기초하여 프라이머 또는 프로브를 설계한다. 상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 염기 서열의 어느 부분도 이용할 수 있고, 또한 그 설계는 공지의 수법을 이용하여 행할 수 있다. 프라이머로서 이용하는 폴리뉴클레오티드의 염기 수는, 통상 10 염기 이상이고, 15~25 염기인 것이 바람직하다. 또한, 끼워 넣는 부분의 염기 수는, 통상 300~2000 염기가 적당하다.

상기에서 제작한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 상기 피검 균주의 게놈 중에 본 발명의 염기 서열과 특이적인 서열이 존재하는지 여부를 조사한다. 본 발명의 염기 서열과 특이적인 서열의 검출은, 공지의 수법을 이용하여 행할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 염기 서열에 특이적 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로서 이용하고, 다른 한 쪽의 프라이머로서 이 서열보다 상류 혹은 하류의 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용하고, 예컨대 PCR법 등에 의해 피검 균주의 핵산을 증폭하여, 증폭물의 유무, 증폭물의 분자량 크기 등을 측정할 수 있다.

본 발명의 방법에 알맞는 PCR법의 반응 조건은, 특별히 한정되지 않지만, 예 컨대 이하의 조건을 들 수 있다.

변성 온도: 90~95℃

어닐링 온도: 40~60℃

신장 온도: 60~75℃,

사이클 수: 10회 이상

등의 조건이다. 얻어진 반응 생성물은 아가로스겔 등을 이용한 전기 영동법 등에 의해 분리하여, 증폭 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 이에 따라, 증폭 산물의 분자량이 본 발명의 염기 서열과 특이적인 영역에 상당하는 핵산 분자를 포함하는 크기인지 여부를 확인함으로써, 피검 균주의 본 발명의 상기 활성을 예측 또는 평가할 수 있다. 또한, 상기 증폭 산물의 염기 서열을 상기 방법 등으로 해석함으로써, 본 발명의 상기 활성을 보다 더 정확히 예측 또는 평가할 수 있다. 또, 본 발명의 상기 활성의 평가 방법은, 상기한 바와 같다.

또한, 본 발명의 상기 평가 방법으로서는, 피검 균주를 배양하고, 서열 번호 4 등의 본 발명의 염기 서열이 코드하는 GPAT의 발현량을 측정함으로써, 피검 균주의 본 발명의 상기 활성을 평가할 수도 있다. 또, GPAT의 발현량은, 피검 균주를 적당한 조건으로 배양하고, GPAT의 mRNA 또는 단백질을 정량함으로써 측정할 수 있다. mRNA 또는 단백질의 정량은, 공지의 수법을 이용하여 행할 수 있다. mRNA의 정량은, 예컨대 노던 하이브리다이제이션이나 정량적 RT-PCR에 의해, 단백질의 정량은, 예컨대 웨스턴 블로팅에 의해 행할 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003). 또한, 상기 활성의 평가 방법으로서, 본 발명의 GPAT가 산생하는 지방산 조성물의 조성을 측정하는 방법을 들 수도 있다. 지방산 조성물의 조성의 측정 방법은 상기한 바와 같다.

(2) 선택 방법

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명의 GPAT를 코드하는 핵산 또는 GPAT 단백질을 이용하여, 지질 생산균의 선택을 행하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 상기 선택 방법으로서는, 피검 균주를 배양하고, 서열 번호 4 등의 본 발명의 염기 서열이 코드하는 GPAT의 발현량을 측정하여, 목적으로 하는 발현량의 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 또한, 기준이 되는 균주를 설정하고, 이 기준 균주와 피검 균주를 각각 배양하며, 각 균주의 상기 발현량을 측정하고, 기준 균주와 피검 균주의 발현량을 비교하여, 원하는 균주를 선택할 수도 있다. 구체적으로는, 예컨대 기준 균주 및 피검 균주를 적당한 조건으로 배양하고, 각 균주의 발현량을 측정하여, 기준 균주보다 피검 균주 쪽이 고발현, 또는 저발현인 피검 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 원하는 활성에는, 상기한 바와 같이, GPAT의 발현량 및 GPAT가 산생하는 지방산 조성물의 조성을 측정하는 방법을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 선택 방법으로서는, 피검 균주를 배양하여, 본 발명의 상기 활성이 높거나 혹은 낮은 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 피검 균주를 선택할 수도 있다. 원하는 활성에는, 상기한 바와 같이, GPAT의 발현량 및 GPAT가 산생하는 지방산 조성물의 조성을 측정하는 방법을 들 수 있다.

피검 균주 또는 기준 균주로서는, 예컨대 상기한 본 발명의 벡터를 도입한 균주, 상기 본 발명의 핵산의 발현이 억제된 균주, 돌연변이 처리가 실시된 균주, 자연변이된 균주 등을 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 본 발명의 GPAT 활성 및 GPAT의 지방산 조성물을 형성할 수 있는 활성은, 예컨대 본 명세서 중의 「본 발명의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소를 코드하는 핵산」, 「본 발명의 지방산 조성물」의 항목에서 기재한 방법에 의해 측정하는 것이 가능하다. 돌연변이 처리로서는, 예컨대 자외선 조사나 방사선 조사 등의 물리적 방법, EMS(에틸메탄술포네이트), N-메틸-N-니트로소구아니딘 등의 약제 처리에 의한 화학적 방법 등을 들 수 있지만(예컨대, 오시마 야스지 편저, 생물 화학 실험법39 효모 분자 유전학 실험법, p.67-75, 학회 출판 센터 등 참조), 이들에 한정되지 않는다.

또, 본 발명의 기준 균주, 피검 균주로서 이용하는 균주로서는, 상기한 지질 생산균 또는 효모 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 기준 균주, 피검 균주는, 다른 속이나 종이나 속하는 어떠한 균주를 조합하여 이용하더라도 좋고, 피검 균주는 1 또는 그 이상의 균주를 동시에 이용하더라도 좋다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 실시예에 한정되는 것이 아니다.

실시예 1

(1) EST 해석

M. 알피나 1S-4주를 100 ml의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0)에 식균하여, 3일간 28℃에서 전배양했다. 10 l 배양조(Able Co., 도쿄)에 5 l의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데카놀, 0.3% KH₂PO₄, 0.1% Na₂SO₄, 0.05% CaCl₂·2H₂O, 0.05% MgCl₂·6H₂O, pH 6.0)를 넣고, 전배양물을 전량 식균하여, 300 rpm, 1 vvm, 26℃의 조건으로 8일간 통기 교반 배양했다. 배양 1, 2 및 3일째에 각각 2%, 2% 및 1.5% 상당의 글루코오스를 첨가했다. 배양 1, 2, 3, 6 및 8일째의 각 스테이지에 균체를 회수하여, 염산구아니딘/CsCl법으로 전체 RNA를 조제했다. Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(다카라바이오)를 이용하여, 전체 RNA로부터 poly(A)⁺RNA의 정제를 행했다. 각 스테이지의 cDNA 라이브러리를, ZAP-cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE)를 이용하여 제작하여, cDNA의 5'측으로부터의 원 패스 시퀀스 해석(8000 클론×5 스테이지)을 행했다. 얻어진 서열을 클러스터링했다. 그 결과, 약 5000의 서열을 얻었다.

(2) GPAT 유전자 호몰로그의 탐색

EST 해석으로 얻어진 염기 서열을 GENBANK에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 상동성 검색 프로그램인 BLASTX로 검색하여, GPAT 유전자의 호몰로그를 추출했다. 그 결과, 하나의 GPAT의 호몰로그의 서열(서열 번호 5)을 발견했다.

상기 검색에서 가장 동일성이 높았던 것은, S. 세레비지애(S. cerevisiae) 유래의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소인 Sct1p(YBL011w로 코드되는 단백질)였다.

M. 알피나의 GPAT 호몰로그에 대해서는, 미국 특허 출원 공개 제 US2006/0094091호 명세서에 이미 기재되어 있다. 이 기지의 M. 알피나 유래의 서열(GPAT1이라고 칭함)과, 여기서 얻어진 서열을 비교하면, 서열 번호 5와는 유의한 동일성을 나타내지 않았다. 따라서, 서열 번호 5는 M. 알피나의 공지의 GPAT와는 별도의 호몰로그의 EST라고 생각되어, 해당 GPAT 호몰로그를 GPAT2라고 칭하기로 했다.

실시예 2

(1) GPAT 호몰로그의 클로닝

서열 번호 5에는, GPAT 호몰로그를 코드한다고 생각되는 CDS가 존재하지 않았기 때문에, 이 유전자의 전체 길이를 코드하는 cDNA를 클론화하기 위해 서열 번호 5의 서열에 기초하여, 이하와 같이 프라이머를 제작했다.

서열 번호 5에 기초하여 설계한 프라이머:

프라이머 E-1:CTGACTACCAAAACCAGCTGGACTTC(서열 번호 6)

프라이머 E-2:GGCAATTTCATCCAAGTTGTCCTCC(서열 번호 7)

이 프라이머쌍을 이용하여, 서열 번호 5를 구성하는 EST를 포함하는 8일째 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서, ExTaq(다카라바이오)를 이용하여 PCR 반응을 행했다. 얻어진 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit(INVITROGEN CORPORATION)를 이용하여 TA-클로닝을 행하여, 인서트 부분의 염기 서열을 결정했다.

그 결과, 서열 번호 5의 5번째로부터 243번째의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편이 클론화된 것을 확인하여, 이 플라스미드를 pCR-E-P로 했다. 다음에, 이 플라스미드를 주형으로 해서, 상기 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 행했다. 반응에는, ExTaq(다카라바이오)를 이용했지만, 첨부의 dNTP 믹스 대신에 PCR 라벨링 믹스(로슈 진단사)를 이용하고, 증폭되는 DNA를 다이곡시제닌(DIG) 라벨하여, cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 데 이용하는 프로브를 제작했다. 이 프로브를 이용하여, EST 해석으로 서열 번호 5를 구성하는 EST를 얻은 cDNA 라이브러리를 스크리닝했다.

하이브리다이제이션의 조건은, 다음과 같다.

버퍼: 5x SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50% 포름아미드;

온도: 42℃(하룻밤);

세정: 0.2x SSC, 0.1% SDS 용액 중(65℃)에서 20분간×3회;

검출은, DIG 핵산 검출 키트(로슈 진단사)에 의해 행했다. 스크리닝에 의해 얻어진 파지(phage) 클론으로부터, 인 비보 제거(excision)에 의해, 플라스미드를 추출하여, 플라스미드 DNA를 얻었다.

서열 번호 5를 포함하는 cDNA를 스크리닝하여 얻어진 클론의 인서트의 염기 서열을 서열 번호 1에 나타낸다. 서열 번호 1에는, 제113번째로부터 제1891번째까지의 1779bp로 이루어지는 CDS가 포함되어 있어, GPAT 호몰로그(GPAT2)의 전체 길이를 코드하고 있는 서열이 얻어졌다고 생각되었다. 이 유전자에 의해 코드되는 단백질의 추정 아미노산 서열을 서열 번호 2에 나타냈다. 서열 번호 1을 포함하는 플라스미드를 pB-GPAT2로 했다.

한편, M. 알피나 1S-4주 유래의 GPAT1을 클론화하기 위해, 미국 특허 출원 공개 제2006/0094091호 명세서의 서열 번호 1로 나타나 있는 GPAT 호몰로그의 ORF 서열을 바탕으로, 이하의 프라이머를 제작했다.

프라이머 GPAT1-1 ggatccatggcccttcagatctacga(서열 번호 8)

프라이머 GPAT1-2 gtcgacctaaatgtcttttgacttggc(서열 번호 9)

상기 프라이머의 하선 부분은, 부가한 제한 효소 인식 부위이다.

이들 프라이머를 이용하여 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서, KOD-Plus-(도요보세키)에 의해 PCR을 행했다. 증폭된 단편을 pCR4 Blunt-TOPO(Invitrogen)에 서브클로닝하고, 염기 서열을 확인하여, 이 유전자의 옳은 염기 서열이라고 생각되는 클론을 pCR4-GPAT1로 했다. 이와 같이 하여 클로닝된 M. 알피나 1S-4주 유래의 GPAT1의 cDNA의 염기 서열을 서열 번호 10에, 그리고 그 cDNA에 의해 코드되는 GPAT1의 추정 아미노산 서열을 서열 번호 11에 나타냈다.

(2) 서열 해석

상기한 바와 같이 하여 얻어진 M. 알피나 유래의 GPAT 호몰로그(GPAT2)의 cDNA 서열을 GENEBANK에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 BLASTX로 상동성 해석을 행했다. 그 결과, 해당 호몰로그의 서열에 대하여 가장 E-value가 낮았던, 즉 동일성이 높았던 아미노산 서열은 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans) 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소와 같은 추정 단백질 서열(GB 액세션 No. EAA62242)이었다. 기능이 밝혀져 있는 단백질에서 가장 동일성이 높았던 것은, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소인 Sct1p(GB 액세션 No. CAC85390)였다. 해당 호몰로그 서열의 ORF와, 상기한 동일성이 높았던 서열에 따른 염기 서열의 동일성, 및 아미노산 서열의 동일성을 clustalW로 구했다. 그 결과, ORF의 염기 서열의 동일성은 각각 36.9%와 36.6%, 아미노산 서열의 동일성은 각각 17.0%와 15.0%였다.

클로닝한 서열 번호 1의 염기 서열 및 그 추정 아미노산 서열인 서열 번호 2는, 기지의 염기 서열 및 아미노산 서열과 비교하더라도 동일성이 현저하게 높은 것은 없어, M. 알피나 유래의 신규 GPAT인 것이라고 생각되었다.

한편, 전술한 바와 같이 클론화된 M. 알피나 1S-4주 유래의 GPAT1(cDNA 서열은 서열 번호 10에, 그 추정 아미노산 서열은 서열 번호 11에 나타남)과 M. 알피나(ATCC#16266) 유래의 GPAT1(미국 특허 출원 공개 제2006/0094091호 명세서)을 비교한 바, 염기 서열로 90.4%, 아미노산 서열로 97.9%의 동일성인 것이 확인되었다.

실시예 3

효모 발현 벡터의 구축

GPAT2를 효모에서 발현시키기 위해, 이하와 같이 효모 발현용 벡터를 구축했다. 즉, 플라스미드 pB-GPAT2를 제한 효소 KpnI로 소화한 후, 제한 효소 SacI로 부분 소화하여 얻어진 약 2 kb의 DNA 단편을 효모용 발현 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)의 SacI-KpnI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pYE-MAGPAT2를 구축했다.

한편, GPAT1을 효모에서 발현시키기 위해 이하와 같이 효모 발현 벡터를 구축했다. 플라스미드 pCR4-GPAT1을 제한 효소 BamHI와 SalI로 소화하여 얻어진 약 2.2 kb의 DNA 단편을 효모용 발현 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)의 BamHI-SalI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pYE-MAGPAT1을 구축했다.

실시예 4

효모의 형질 전환

플라스미드 pYE22m, pYE-MAGPAT1 또는 pYE-MAGPAT2를 이용하여 초산리튬법에 의해, 효모 사카로마이세스 세레비지애 EH13-15주(trp1, MATα)(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)로 형질 전환했다. 형질 전환주는, SC-Trp[1 l 당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 류신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 우라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g], 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다.

실시예 5

효모의 배양

효모 발현 벡터에서의 형질 전환주 중 임의의 2주씩(c-1주 및 c-2주, GPAT1-1주 및 GPAT1-2주, 및, GPAT2-1주 및 GPAT2-2주)을 선택하여, 이하의 조건으로 배양했다.

즉, 전배양으로서, SC-Trp 배지 10 ml에 효모를 플레이트로부터 1 백금귀(白金耳, 루프형 식균 도구) 식균하여, 30℃로 2일간 진탕 배양을 행했다. 본 배양은, YPD5(효모 엑기스 2%, 폴리펩톤 1%, 글루코오스 5%) 배지 10 ml에 전배양액을 500 ㎕ 첨가하여, 30℃로 2일간 진탕 배양을 행했다.

실시예 6

효모의 지방산 분석

효모의 배양액을 원심 분리함으로써, 균체를 회수했다. 10 ml의 멸균수로 세정하고, 원심 분리에 의해 다시 균체를 회수하여, 동결 건조했다. 동결 건조 균체에 클로로포름:메탄올(2:1)을 4 ml 첨가하고, 강하게 교반한 후, 70℃로 1시간 처리했다. 원심 분리에 의해 균체를 분리하여, 용매를 회수했다. 남은 균체에 재차 클로로포름:메탄올(2:1)을 4 ml 첨가하여, 마찬가지로 용매를 회수했다. 스피드 백(SpeedVac)으로 지질을 건고한 후, 2 ml의 클로로포름을 첨가하여 지질을 용해했다. 이 시료 중, 200 ㎕를 분취하고, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르에 유도한 후, 헥산으로 추출하고, 헥산을 증류 제거하며, 가스 크로마토그래피에 의해 분석을 행했다.

그 결과를 표 2에 나타낸다.

[표 2]

형질 전환주의 지방산 조성(호스트 EH13-15)

M. 알피나 유래의 2개의 GPAT 호몰로그를 도입한 효모와, 컨트롤의 효모의 지방산 조성을 비교했다. GPAT1을 도입한 효모의 지방산 조성은, 팔미트산의 비율이 컨트롤주에 비해 상승하는 한편, 팔미톨레산 함량의 비율은 감소했다. 또한, 스 테아르산 및 올레산의 비율은 컨트롤주와 동일한 정도였다. 따라서, 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율, 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및, 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율은, 컨트롤주에 비해 낮아졌다.

한편, GPAT2를 도입한 효모에서는 올레산의 비율이 컨트롤주에 비해 1할 이상 상승했다. 팔미트산, 팔미톨레산의 비율은 컨트롤주에 비해 모두 감소하는 한편, 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율은 컨트롤주에 비해 약간 상승했다. 또한, GPAT2를 도입한 효모에 있어서의, 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및, 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율은, 컨트롤주에 비해 상승했다. 또한, GPAT2를 도입한 효모에서는 탄소수 16의 지방산에 대한 탄소수 18의 지방산의 비가 상승하고 있어, 보다 장쇄인 지방산을 생성했다.

이상의 결과로부터, M. 알피나 유래의 2개의 GPAT 호몰로그는, 그 기질의 아실기의 특이성이 다르기 때문에 이들 유전자를 도입한 효모에서는 각각의 호몰로그에서 지방산 조성이 다른 것이 나타났다. 또한, 상기 호몰로그를 적절히 구별하여 사용함으로써, 목적으로 하는 지방산 조성의 생물을 육종할 수 있는 것이 나타났다.

실시예 7

아라키돈산 생산 효모에서의 발현 해석

(1) 아라키돈산 생산 효모의 육종

아라키돈산 생산 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 육종하기 위해, 이하의 플라스미드를 구축했다.

우선, M. 알피나 1S-4주로부터 조제한 cDNA를 주형으로 해서, Δ12-f와 Δ12-r, Δ6-f와 Δ6-r, GLELO-f와 GLELO-r 또는 Δ5-f와 Δ5-r이라고 하는 프라이머의 조합으로 ExTaq를 이용해서 PCR을 행하여, M. 알피나 1S-4주의 Δ12지방산 불포화화 효소 유전자, Δ6지방산 불포화화 효소 유전자, GLELO 지방산 쇄 길이 연장 효소 유전자 및 Δ5지방산 불포화화 유전자를 증폭했다.

Δ12-f:TCTAGAatggcacctcccaacactattg(서열 번호 12)

Δ12-r:AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC서열 번호 13)

Δ6-f:TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag(서열 번호 14)

Δ6-r:AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG(서열 번호 15)

GLELO-f:TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc(서열 번호 16)

GLELO-r:GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(서열 번호 17)

Δ5-f:TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc(서열 번호 18)

Δ5-r:AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC(서열 번호 19)

이들을 TOPO-TA-cloning Kit에 의해 클론화했다. 염기 서열을 확인하여, 서열 번호 20-23의 염기 서열을 포함하는 클론을 각각 플라스미드 pCR-MAΔ12DS(서열 번호 20의 염기 서열을 포함함), pCR-MAΔ6DS(서열 번호 21의 염기 서열을 포함함), pCR-MAGLELO(서열 번호 22의 염기 서열을 포함함), pCR-MAΔ5DS(서열 번호 23의 염기 서열을 포함함)로 했다.

한편, 플라스미드 pURA34(일본 특허 공개 제2001-120276호)를 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.2 kb의 DNA 단편을, 벡터 pUC18을 제한 효소 EcoRI와 SphI로 소화한 후 말단을 평활화하고, 셀프 라이게이션(self-ligation)하여 얻어진 벡터의 HindIII 사이트에 삽입하여, 벡터의 EcoRI 사이트측이 URA3의 5'측인 클론을 pUC-URA3로 했다. 또한, YEp13을 제한 효소 SalI와 XhoI로 소화하여 얻어진 약 2.2 kb의 DNA 단편을 벡터 pUC18의 SalI 사이트에 삽입하여, 벡터의 EcoRI 측이 LUE2의 5'측인 클론을 pUC-LEU2로 했다.

다음에, 플라스미드 pCR-MAΔ12DS를 제한 효소 HindIII로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한 효소 XbaI로 소화하여 얻어진 약 1.2 kbp의 DNA 단편과, 벡터 pESC-URA(STRATAGENE)를 제한 효소 SacI로 소화한 후, 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 SpeI로 소화한 약 6.6 kbp의 DNA 단편을 연결하여, 플라스미드 pESC-U-Δ12를 얻었다. 플라스미드 pCR-MAΔ6DS를 제한 효소 XbaI로 소화한 후, 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.6 kbp의 DNA 단편과, 플라스미드 pESC-U-Δ12를 제한 효소 SalI로 소화한 후, 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII로 소화한 약 8 kbp의 DNA 단편과 연결하여, 플라스미드 pESC-U-Δ12:Δ6을 얻었다. 이것을 제한 효소 PvuII로 부분 소화하여 얻어진 약 4.2 kb의 단편을 pUC-URA3의 SmaI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6을 얻었다.

또한, 플라스미드 pCR-MAGLELO를 제한 효소 XbaI와 SacI로 소화하여 얻어진 약 0.95 kbp의 DNA 단편과, 벡터 pESC-LEU(STRATAGENE)를 제한 효소 XbaI와 SacI로 소화하여 얻어진 약 7.7 kbp의 DNA 단편과 연결하여, 플라스미드 pESC-L-GLELO를 얻었다. 플라스미드 pCR-MAΔ5DS를 제한 효소 XbaI로 소화한 후, 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.3 kbp의 DNA 단편과, 플라스미드 pESC-L-GLELO를 제한 효소 ApaI로 소화한 후, 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 8.7 kbp의 DNA 단편을 연결하여, 플라스미드 pESC-L-GLELO:Δ5를 얻었다. 이것을 제한 효소 PvuII로 소화하여 얻어진 약 3.2 kb 단편을 pUC-LEU2의 SmaI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5를 얻었다. S. 세레비지애(S. cerevisiae) YPH499주(STRATAGENE)를 플라스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6과 플라스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5로 동시 형질 전환(co-transformation)했다. 형질 전환주는, SC-Leu,Ura[1 l 당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 트립토판 1.2 g을 혼합한 것) 1.3 g] 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다. 이렇게 해서 얻어진 주 중, 임의의 한 주를 ARA3-1주로 했다.

(2) 아라키돈산 생산 효모의 형질 전환주의 취득과 해석

ARA3-1주를 플라스미드 pYE22m, pYE-MAGPAT1, pYE-MAGPAT2로 각각 형질 전환했다. 형질 전환주는, SC-Trp,Leu,Ura[1 l 당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트 레오닌 6 g을 혼합한 것) 1.3 g] 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다. 각 플라스미드를 도입한 주로부터, 각각 임의의 4주를 선택했다.

이들 주를 상기 SC-Trp,Leu,Ura 액체 배지 10 ml에서 30℃, 1일간 배양하고, 그 중 1 ml를 SG-Trp,Leu,Ura[1 l 당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 갈락토오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g을 혼합한 것) 1.3 g] 액체 배지 10 ml에서 15℃, 7일간 배양하여, 균체의 지방산 분석을 행했다. 균체의 지방산 조성을 표 3에, 균체 내의 유지 함유율을 표 4에 나타냈다.

[표 3]

균체 내 지방산 함유률(%)

[표 4]

총 지방산에 차지하는 DGLA와 ARA의 비율(%)

아라키돈산 생산 효모에서, M. 알피나 유래의 GPAT2를 발현시킨 경우, 컨트롤과 비교하여, DGLA, 아라키돈산이라고 하는 PUFA의 비율이 높아졌다. 또한, 균체 내의 지방산 함유율이 높아졌다.

실시예 8

M. 알피나 발현용 벡터의 구축

M. 알피나 발현용 벡터로서, GAPDH 프로모터로부터 목적 유전자를 발현시키는 pDuraSC와 히스톤 프로모터로부터 목적 유전자를 발현시키는 pDuraMCS를 이용했다.

GPAT2를 M. 알피나에서 발현시키기 위해, 이하와 같이 벡터를 구축했다. 플라스미드 pB-GPAT2를 제한 효소 PstI로 소화하고, 계속해서, 제한 효소 XhoI로 부분 분해했다. 얻어진 DNA 단편 중 약 1.7 kb의 것을 추출하고, 벡터 pDuraSC 또는 벡터 pDura5MCS의 멀티 클로닝 사이트의 PstI 사이트, XhoI 사이트에 삽입하여, 각각 플라스미드 pDuraSC-GPAT2, 플라스미드 pDura5MCS-GPAT2로 했다.

M. 알피나 형질 전환주의 취득

이들 플라스미드로, M. 알피나로부터 특허 문헌(제WO2005019437호 「지질 생산균의 육종 방법」)의 방법에 따라 유도한 우라실 요구성 주 Δura-3를 숙주로서 파티클 딜리버리법으로 형질 전환을 행했다. 형질 전환주의 선택에는, SC 한천 배지[Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco) 0.5%, 황산암모늄 0.17%, 글루코오스 2%, 아데닌 0.002%, 티로신 0.003%, 메티오닌 0.0001%, 아르기닌 0.0002%, 히스티딘 0.0002%, 리신 0.0004%, 트립토판 0.0004%, 트레오닌 0.0005%, 이소류신 0.0006%, 류신 0.0006%, 페닐알라닌 0.0006%, 한천 2%]를 이용했다.

형질 전환 M. 알피나의 평가

얻어진 형질 전환주를, GY 배지(글루코오스 2%, 효모 엑기스 1%) 4 ml에 식균하여, 28℃로 3일간 혹은 4일간 진탕 배양을 행했다. 균체를 여과에 의해 회수하고, RNeasy plant kit(QIAGEN)를 이용하여 RNA를 추출했다. 수퍼 스크립트 제1 스트랜드 시스템(SuperScript First-Strand system) for RT-PCR(인비트로겐)에 의해 cDNA를 합성했다. 도입한 컨스트럭트로부터의 각 유전자의 발현과, 토탈의 각 유전자의 발현을 확인하기 위해, 이하의 프라이머의 조합으로 RT-PCR을 행했다.

○ 플라스미드 pDuraSC-GPAT2 도입주

도입 컨스트럭트로부터의 발현 확인에 사용한 프라이머

MaGAPDHpfw:CACACCACACATTCAACATC(서열 번호 24)

E2:GGCAATTTCATCCAAGTTGTCCTCC(서열 번호 25)

토탈의 GPAT2의 발현 확인에 사용한 프라이머

E1:CTGACTACCAAAACCAGCTGGACTTC(서열 번호 26)

E2

○ 플라스미드 pDura5MCS-GPAT2 도입주

도입 컨스트럭트로부터의 발현 확인에 사용한 프라이머

PD4P:CGCATCCCGCAAACACACAC(서열 번호 27)와 프라이머 E2,

토탈의 GPAT2의 발현 확인에 사용한 프라이머

프라이머 E1과 프라이머 E2

상기 RT-PCR의 결과로부터, 각 유전자의 도입 컨스트럭트로부터의 발현 및 토탈의 발현이 높았던 것으로서, 플라스미드 pDuraSC-GPAT2 도입주로부터 Gp-GPAT2-30주를, 플라스미드 pDura5MCS-GPAT2 도입주로부터 Hp-GPAT2-9주를 각각 선발했다.

이들 주를, GY 배지 4 ml에 식균하여, 28℃, 125 rpm으로 진탕 배양했다. 배양 3일째에, 20% 글루코오스 400 ㎕를 첨가하고, 배양을 더 계속했다. 또는 배양 6일째에 균체의 전량을 여과에 의해 회수하여, 동결 건조했다. 건조 균체의 일부(약 10-20 mg 정도)를 취하고, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르에 유도한 후, 헥산으로 추출하고, 헥산을 증류 제거하며, 가스 크로마토그래피에 의해 분석을 행했다. 균체 내의 지방산 함유율과, 배지 당의 아라키돈산 생산량을 이하의 표 5-6에 정리했다.

[표 5]

균체 내의 지방산 함유율(%)

[표 6]

배지 당의 아라키돈산 생산량(g/L)

이와 같이, GPAT2 유전자를 M. 알피나에서 고발현시킴으로써, 균체 내의 지방산 함유율이 상승하여, 배지 당의 아라키돈산 생산량도 증가시킬 수 있었다.

배열표 프리 텍스트

서열 번호 6: 프라이머

서열 번호 7: 프라이머

서열 번호 8: 프라이머

서열 번호 9: 프라이머

서열 번호 12: 프라이머

서열 번호 13: 프라이머

서열 번호 14: 프라이머

서열 번호 15: 프라이머

서열 번호 16: 프라이머

서열 번호 17: 프라이머

서열 번호 18: 프라이머

서열 번호 19: 프라이머

서열 번호 24: 프라이머

서열 번호 25: 프라이머

서열 번호 26: 프라이머

서열 번호 27: 프라이머

SEQUENCE LISTING <110> Suntory Ltd. <120> GLYCEROL-3-PHOSPHATE ACYLTRANSFERASE (GPAT) HOMOLOGS AND USE THEREOF <130> FA0038-08046 <150> JP 2007-160042 <151> 2007-06-18 <160> 27 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1942 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> CDS <222> (113)..(1891) <223> <400> 1 gcttccctcc acacttccct ttccttcaac accaaaccct atccgaaccc tctgtctcat 60 ttttctctct ctctccctat ctctctctct ctctatcctc acatatatcc tc atg gcc 118 Met Ala 1 aaa ctt cgg aag cgg acc tcc cag tca aag gag ggc gcc gct gac acc 166 Lys Leu Arg Lys Arg Thr Ser Gln Ser Lys Glu Gly Ala Ala Asp Thr 5 10 15 aac ggc aca agg cga gac agc gtc gat gac acg aac agc gtc ggc agc 214 Asn Gly Thr Arg Arg Asp Ser Val Asp Asp Thr Asn Ser Val Gly Ser 20 25 30 tac gat cca cgc gcc ctc tcc aac gat cca cca aag atg tac agg gcg 262 Tyr Asp Pro Arg Ala Leu Ser Asn Asp Pro Pro Lys Met Tyr Arg Ala 35 40 45 50 atc cgg ttc ttc ttc aag atg tgc ctg cac tcc ttc tat ggc cat gtg 310 Ile Arg Phe Phe Phe Lys Met Cys Leu His Ser Phe Tyr Gly His Val 55 60 65 gag gtc gag ggc acc gag aat att gca cca aac aac tac cct gct atc 358 Glu Val Glu Gly Thr Glu Asn Ile Ala Pro Asn Asn Tyr Pro Ala Ile 70 75 80 ctt gtt gcg aac cac agc aac agt ttg acg gat gcg att gcc att atg 406 Leu Val Ala Asn His Ser Asn Ser Leu Thr Asp Ala Ile Ala Ile Met 85 90 95 tcg act gtt cct ccc aag agc agg agc atg att agg atg acc gca aag 454 Ser Thr Val Pro Pro Lys Ser Arg Ser Met Ile Arg Met Thr Ala Lys 100 105 110 gac acg ttt tgg cat aag cca ggc gtc ttc aat tat gtc atc aaa aac 502 Asp Thr Phe Trp His Lys Pro Gly Val Phe Asn Tyr Val Ile Lys Asn 115 120 125 130 gct ggc act gtc ccg atc aaa aga cgc aag gat tat gag aac caa aag 550 Ala Gly Thr Val Pro Ile Lys Arg Arg Lys Asp Tyr Glu Asn Gln Lys 135 140 145 gtc gac aac act gac gcg atg ggt gca ttg atc gat acc ctt gga gca 598 Val Asp Asn Thr Asp Ala Met Gly Ala Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ala 150 155 160 gga agt tgt gta tgc atg ttc ccg gag ggc atc tcg cgc tat cac cca 646 Gly Ser Cys Val Cys Met Phe Pro Glu Gly Ile Ser Arg Tyr His Pro 165 170 175 caa ctt gct ccg ttc aag gcc ggt gtc gcc atg att gcc agc gat acg 694 Gln Leu Ala Pro Phe Lys Ala Gly Val Ala Met Ile Ala Ser Asp Thr 180 185 190 ctc tcc cgg ttt caa gac acg ccc gat ttt tct ctc acg ctc atg aca 742 Leu Ser Arg Phe Gln Asp Thr Pro Asp Phe Ser Leu Thr Leu Met Thr 195 200 205 210 gcg tcg atc aac tat ctt cac cgt gaa aag ttc cga tct gat gtt ctc 790 Ala Ser Ile Asn Tyr Leu His Arg Glu Lys Phe Arg Ser Asp Val Leu 215 220 225 gtc acg ttc cat gca ccc att gtg cta acc ccg caa caa gac tcg aag 838 Val Thr Phe His Ala Pro Ile Val Leu Thr Pro Gln Gln Asp Ser Lys 230 235 240 ctg ttt tcg act gac ctg gaa gtc aag aag gaa gcg atc cga aaa ctg 886 Leu Phe Ser Thr Asp Leu Glu Val Lys Lys Glu Ala Ile Arg Lys Leu 245 250 255 aca gag ttg ctc gag ggc acc gtc cga tca act cta ctg gat gcc gag 934 Thr Glu Leu Leu Glu Gly Thr Val Arg Ser Thr Leu Leu Asp Ala Glu 260 265 270 gac tgg caa aca gtc cga gtg ggt cat gtt gcc agg aag ctc tat gct 982 Asp Trp Gln Thr Val Arg Val Gly His Val Ala Arg Lys Leu Tyr Ala 275 280 285 290 ggc gat ctg gga act cgg att tcg ctg gga cag tac gtg cgt ttg acc 1030 Gly Asp Leu Gly Thr Arg Ile Ser Leu Gly Gln Tyr Val Arg Leu Thr 295 300 305 agg aag ttt gtc acg gcg ttc agt cag cac aag cag gag gag gag gca 1078 Arg Lys Phe Val Thr Ala Phe Ser Gln His Lys Gln Glu Glu Glu Ala 310 315 320 gcg gtc gat gac gag cgt tat ggt cag gag aag cac ggg ggc ggt gcc 1126 Ala Val Asp Asp Glu Arg Tyr Gly Gln Glu Lys His Gly Gly Gly Ala 325 330 335 gag agg aat ggt gat tct ttg gag atg agg cat cct gag cgc atg gat 1174 Glu Arg Asn Gly Asp Ser Leu Glu Met Arg His Pro Glu Arg Met Asp 340 345 350 aag gcg act aga aag aaa atc gac gag ctc gcc agg gat ttg gct gac 1222 Lys Ala Thr Arg Lys Lys Ile Asp Glu Leu Ala Arg Asp Leu Ala Asp 355 360 365 370 tac caa aac cag ctg gac ttc tat cac ctc aag gac tat cgt atc aag 1270 Tyr Gln Asn Gln Leu Asp Phe Tyr His Leu Lys Asp Tyr Arg Ile Lys 375 380 385 caa ggc aag cca agt gca aag att ctt atc gga cgt ctt ttc caa aga 1318 Gln Gly Lys Pro Ser Ala Lys Ile Leu Ile Gly Arg Leu Phe Gln Arg 390 395 400 ttc ttg ctt gct tgc ctt ttg tcg acc att tgc att cct gga ctg ttc 1366 Phe Leu Leu Ala Cys Leu Leu Ser Thr Ile Cys Ile Pro Gly Leu Phe 405 410 415 ctt tgg gca cct gtg ttt atc gcc gtg aag tac aaa gag agt cag ctt 1414 Leu Trp Ala Pro Val Phe Ile Ala Val Lys Tyr Lys Glu Ser Gln Leu 420 425 430 agg cgc aag gga ccc ttg gag gac aac ttg gat gaa att gcc cag tac 1462 Arg Arg Lys Gly Pro Leu Glu Asp Asn Leu Asp Glu Ile Ala Gln Tyr 435 440 445 450 aag ttg atg atc tcg act ttc ttc ttg ccg atc atc tgg ggg ttc tgg 1510 Lys Leu Met Ile Ser Thr Phe Phe Leu Pro Ile Ile Trp Gly Phe Trp 455 460 465 atc gta atg acc ttg cca att gcg ctc ttt agc gcg ccg ggc atc gtt 1558 Ile Val Met Thr Leu Pro Ile Ala Leu Phe Ser Ala Pro Gly Ile Val 470 475 480 gtt ctg atg tgg ctt acg atc cgc tgg ctt gag gac ttg atc cac aac 1606 Val Leu Met Trp Leu Thr Ile Arg Trp Leu Glu Asp Leu Ile His Asn 485 490 495 gcg aaa tcg atg ttg tcc ctt ttg cga ttg ctg ttt atg acg gag gat 1654 Ala Lys Ser Met Leu Ser Leu Leu Arg Leu Leu Phe Met Thr Glu Asp 500 505 510 acc atg tac tcg ttg aga gac tac cgt cag ggg ctg gcg cat cgt gtg 1702 Thr Met Tyr Ser Leu Arg Asp Tyr Arg Gln Gly Leu Ala His Arg Val 515 520 525 530 cac gat ttt gcg gtc gat cat ctg aag ttg cct gag gac cct gag gtt 1750 His Asp Phe Ala Val Asp His Leu Lys Leu Pro Glu Asp Pro Glu Val 535 540 545 ctg gtc aag gag aac aag acc aag aag gtc gac agt ggc tgg atg ggc 1798 Leu Val Lys Glu Asn Lys Thr Lys Lys Val Asp Ser Gly Trp Met Gly 550 555 560 aag ttg tcg ggc agc tac ttc tcg atc aag agg aga aga aga aag gac 1846 Lys Leu Ser Gly Ser Tyr Phe Ser Ile Lys Arg Arg Arg Arg Lys Asp 565 570 575 tgg aac gag gtt atg cga ttg cac gat gtt tct cac tat gac tga 1891 Trp Asn Glu Val Met Arg Leu His Asp Val Ser His Tyr Asp 580 585 590 agctgagatc gtccttgaat aaaagcagat aacgcgtgga gtaactgagg g 1942 <210> 2 <211> 592 <212> PRT <213> Mortierella alpina <400> 2 Met Ala Lys Leu Arg Lys Arg Thr Ser Gln Ser Lys Glu Gly Ala Ala 1 5 10 15 Asp Thr Asn Gly Thr Arg Arg Asp Ser Val Asp Asp Thr Asn Ser Val 20 25 30 Gly Ser Tyr Asp Pro Arg Ala Leu Ser Asn Asp Pro Pro Lys Met Tyr 35 40 45 Arg Ala Ile Arg Phe Phe Phe Lys Met Cys Leu His Ser Phe Tyr Gly 50 55 60 His Val Glu Val Glu Gly Thr Glu Asn Ile Ala Pro Asn Asn Tyr Pro 65 70 75 80 Ala Ile Leu Val Ala Asn His Ser Asn Ser Leu Thr Asp Ala Ile Ala 85 90 95 Ile Met Ser Thr Val Pro Pro Lys Ser Arg Ser Met Ile Arg Met Thr 100 105 110 Ala Lys Asp Thr Phe Trp His Lys Pro Gly Val Phe Asn Tyr Val Ile 115 120 125 Lys Asn Ala Gly Thr Val Pro Ile Lys Arg Arg Lys Asp Tyr Glu Asn 130 135 140 Gln Lys Val Asp Asn Thr Asp Ala Met Gly Ala Leu Ile Asp Thr Leu 145 150 155 160 Gly Ala Gly Ser Cys Val Cys Met Phe Pro Glu Gly Ile Ser Arg Tyr 165 170 175 His Pro Gln Leu Ala Pro Phe Lys Ala Gly Val Ala Met Ile Ala Ser 180 185 190 Asp Thr Leu Ser Arg Phe Gln Asp Thr Pro Asp Phe Ser Leu Thr Leu 195 200 205 Met Thr Ala Ser Ile Asn Tyr Leu His Arg Glu Lys Phe Arg Ser Asp 210 215 220 Val Leu Val Thr Phe His Ala Pro Ile Val Leu Thr Pro Gln Gln Asp 225 230 235 240 Ser Lys Leu Phe Ser Thr Asp Leu Glu Val Lys Lys Glu Ala Ile Arg 245 250 255 Lys Leu Thr Glu Leu Leu Glu Gly Thr Val Arg Ser Thr Leu Leu Asp 260 265 270 Ala Glu Asp Trp Gln Thr Val Arg Val Gly His Val Ala Arg Lys Leu 275 280 285 Tyr Ala Gly Asp Leu Gly Thr Arg Ile Ser Leu Gly Gln Tyr Val Arg 290 295 300 Leu Thr Arg Lys Phe Val Thr Ala Phe Ser Gln His Lys Gln Glu Glu 305 310 315 320 Glu Ala Ala Val Asp Asp Glu Arg Tyr Gly Gln Glu Lys His Gly Gly 325 330 335 Gly Ala Glu Arg Asn Gly Asp Ser Leu Glu Met Arg His Pro Glu Arg 340 345 350 Met Asp Lys Ala Thr Arg Lys Lys Ile Asp Glu Leu Ala Arg Asp Leu 355 360 365 Ala Asp Tyr Gln Asn Gln Leu Asp Phe Tyr His Leu Lys Asp Tyr Arg 370 375 380 Ile Lys Gln Gly Lys Pro Ser Ala Lys Ile Leu Ile Gly Arg Leu Phe 385 390 395 400 Gln Arg Phe Leu Leu Ala Cys Leu Leu Ser Thr Ile Cys Ile Pro Gly 405 410 415 Leu Phe Leu Trp Ala Pro Val Phe Ile Ala Val Lys Tyr Lys Glu Ser 420 425 430 Gln Leu Arg Arg Lys Gly Pro Leu Glu Asp Asn Leu Asp Glu Ile Ala 435 440 445 Gln Tyr Lys Leu Met Ile Ser Thr Phe Phe Leu Pro Ile Ile Trp Gly 450 455 460 Phe Trp Ile Val Met Thr Leu Pro Ile Ala Leu Phe Ser Ala Pro Gly 465 470 475 480 Ile Val Val Leu Met Trp Leu Thr Ile Arg Trp Leu Glu Asp Leu Ile 485 490 495 His Asn Ala Lys Ser Met Leu Ser Leu Leu Arg Leu Leu Phe Met Thr 500 505 510 Glu Asp Thr Met Tyr Ser Leu Arg Asp Tyr Arg Gln Gly Leu Ala His 515 520 525 Arg Val His Asp Phe Ala Val Asp His Leu Lys Leu Pro Glu Asp Pro 530 535 540 Glu Val Leu Val Lys Glu Asn Lys Thr Lys Lys Val Asp Ser Gly Trp 545 550 555 560 Met Gly Lys Leu Ser Gly Ser Tyr Phe Ser Ile Lys Arg Arg Arg Arg 565 570 575 Lys Asp Trp Asn Glu Val Met Arg Leu His Asp Val Ser His Tyr Asp 580 585 590 <210> 3 <211> 1779 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 3 atggccaaac ttcggaagcg gacctcccag tcaaaggagg gcgccgctga caccaacggc 60 acaaggcgag acagcgtcga tgacacgaac agcgtcggca gctacgatcc acgcgccctc 120 tccaacgatc caccaaagat gtacagggcg atccggttct tcttcaagat gtgcctgcac 180 tccttctatg gccatgtgga ggtcgagggc accgagaata ttgcaccaaa caactaccct 240 gctatccttg ttgcgaacca cagcaacagt ttgacggatg cgattgccat tatgtcgact 300 gttcctccca agagcaggag catgattagg atgaccgcaa aggacacgtt ttggcataag 360 ccaggcgtct tcaattatgt catcaaaaac gctggcactg tcccgatcaa aagacgcaag 420 gattatgaga accaaaaggt cgacaacact gacgcgatgg gtgcattgat cgataccctt 480 ggagcaggaa gttgtgtatg catgttcccg gagggcatct cgcgctatca cccacaactt 540 gctccgttca aggccggtgt cgccatgatt gccagcgata cgctctcccg gtttcaagac 600 acgcccgatt tttctctcac gctcatgaca gcgtcgatca actatcttca ccgtgaaaag 660 ttccgatctg atgttctcgt cacgttccat gcacccattg tgctaacccc gcaacaagac 720 tcgaagctgt tttcgactga cctggaagtc aagaaggaag cgatccgaaa actgacagag 780 ttgctcgagg gcaccgtccg atcaactcta ctggatgccg aggactggca aacagtccga 840 gtgggtcatg ttgccaggaa gctctatgct ggcgatctgg gaactcggat ttcgctggga 900 cagtacgtgc gtttgaccag gaagtttgtc acggcgttca gtcagcacaa gcaggaggag 960 gaggcagcgg tcgatgacga gcgttatggt caggagaagc acgggggcgg tgccgagagg 1020 aatggtgatt ctttggagat gaggcatcct gagcgcatgg ataaggcgac tagaaagaaa 1080 atcgacgagc tcgccaggga tttggctgac taccaaaacc agctggactt ctatcacctc 1140 aaggactatc gtatcaagca aggcaagcca agtgcaaaga ttcttatcgg acgtcttttc 1200 caaagattct tgcttgcttg ccttttgtcg accatttgca ttcctggact gttcctttgg 1260 gcacctgtgt ttatcgccgt gaagtacaaa gagagtcagc ttaggcgcaa gggacccttg 1320 gaggacaact tggatgaaat tgcccagtac aagttgatga tctcgacttt cttcttgccg 1380 atcatctggg ggttctggat cgtaatgacc ttgccaattg cgctctttag cgcgccgggc 1440 atcgttgttc tgatgtggct tacgatccgc tggcttgagg acttgatcca caacgcgaaa 1500 tcgatgttgt cccttttgcg attgctgttt atgacggagg ataccatgta ctcgttgaga 1560 gactaccgtc aggggctggc gcatcgtgtg cacgattttg cggtcgatca tctgaagttg 1620 cctgaggacc ctgaggttct ggtcaaggag aacaagacca agaaggtcga cagtggctgg 1680 atgggcaagt tgtcgggcag ctacttctcg atcaagagga gaagaagaaa ggactggaac 1740 gaggttatgc gattgcacga tgtttctcac tatgactga 1779 <210> 4 <211> 1776 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 4 atggccaaac ttcggaagcg gacctcccag tcaaaggagg gcgccgctga caccaacggc 60 acaaggcgag acagcgtcga tgacacgaac agcgtcggca gctacgatcc acgcgccctc 120 tccaacgatc caccaaagat gtacagggcg atccggttct tcttcaagat gtgcctgcac 180 tccttctatg gccatgtgga ggtcgagggc accgagaata ttgcaccaaa caactaccct 240 gctatccttg ttgcgaacca cagcaacagt ttgacggatg cgattgccat tatgtcgact 300 gttcctccca agagcaggag catgattagg atgaccgcaa aggacacgtt ttggcataag 360 ccaggcgtct tcaattatgt catcaaaaac gctggcactg tcccgatcaa aagacgcaag 420 gattatgaga accaaaaggt cgacaacact gacgcgatgg gtgcattgat cgataccctt 480 ggagcaggaa gttgtgtatg catgttcccg gagggcatct cgcgctatca cccacaactt 540 gctccgttca aggccggtgt cgccatgatt gccagcgata cgctctcccg gtttcaagac 600 acgcccgatt tttctctcac gctcatgaca gcgtcgatca actatcttca ccgtgaaaag 660 ttccgatctg atgttctcgt cacgttccat gcacccattg tgctaacccc gcaacaagac 720 tcgaagctgt tttcgactga cctggaagtc aagaaggaag cgatccgaaa actgacagag 780 ttgctcgagg gcaccgtccg atcaactcta ctggatgccg aggactggca aacagtccga 840 gtgggtcatg ttgccaggaa gctctatgct ggcgatctgg gaactcggat ttcgctggga 900 cagtacgtgc gtttgaccag gaagtttgtc acggcgttca gtcagcacaa gcaggaggag 960 gaggcagcgg tcgatgacga gcgttatggt caggagaagc acgggggcgg tgccgagagg 1020 aatggtgatt ctttggagat gaggcatcct gagcgcatgg ataaggcgac tagaaagaaa 1080 atcgacgagc tcgccaggga tttggctgac taccaaaacc agctggactt ctatcacctc 1140 aaggactatc gtatcaagca aggcaagcca agtgcaaaga ttcttatcgg acgtcttttc 1200 caaagattct tgcttgcttg ccttttgtcg accatttgca ttcctggact gttcctttgg 1260 gcacctgtgt ttatcgccgt gaagtacaaa gagagtcagc ttaggcgcaa gggacccttg 1320 gaggacaact tggatgaaat tgcccagtac aagttgatga tctcgacttt cttcttgccg 1380 atcatctggg ggttctggat cgtaatgacc ttgccaattg cgctctttag cgcgccgggc 1440 atcgttgttc tgatgtggct tacgatccgc tggcttgagg acttgatcca caacgcgaaa 1500 tcgatgttgt cccttttgcg attgctgttt atgacggagg ataccatgta ctcgttgaga 1560 gactaccgtc aggggctggc gcatcgtgtg cacgattttg cggtcgatca tctgaagttg 1620 cctgaggacc ctgaggttct ggtcaaggag aacaagacca agaaggtcga cagtggctgg 1680 atgggcaagt tgtcgggcag ctacttctcg atcaagagga gaagaagaaa ggactggaac 1740 gaggttatgc gattgcacga tgtttctcac tatgac 1776 <210> 5 <211> 485 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 5 ttggctgact accaaaacca gctggacttc tatcacctca aggactatcg tatcaagcaa 60 ggcaagccaa gtgcaaagat tcttatcgga cgtcttttcc aaagattctt gcttgcttgc 120 cttttgtcga ccatttgcat tcctggactg ttcctttggg cacctgtgtt tatcgccgtg 180 aagtacaaag agagtcagct taggcgcaag ggacccttgg aggacaactt ggatgaaatt 240 gcccagtaca agttgatgat ctcgactttc ttcttgccga tcatctgggg gttctggatc 300 gtaatgacct tgccaattgc gctctttagc gcgccgggca tcgttgttct gatgtggctt 360 acgatccgct ggcttgagga cttgatccac aacgcgaaat cgatgttgtc ccttttgcga 420 ttgctgtata tgacggagga taccatgtac tcgttgagag actaccgtca ggggctggag 480 catcg 485 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer E-1 <400> 6 ctgactacca aaaccagctg gacttc 26 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer E-2 <400> 7 ggcaatttca tccaagttgt cctcc 25 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GPAT1-1 <400> 8 ggatccatgg cccttcagat ctacga 26 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GPAT1-2 <400> 9 gtcgacctaa atgtcttttg acttggc 27 <210> 10 <211> 2154 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> CDS <222> (1)..(2154) <223> <400> 10 atg gcc ctt cag atc tac gac ttc gtg tcg ttc ttc ttc act atc ctg 48 Met Ala Leu Gln Ile Tyr Asp Phe Val Ser Phe Phe Phe Thr Ile Leu 1 5 10 15 ctc gac atc ttc ttc agg gag att cgt ccc aga ggc gca cac aaa att 96 Leu Asp Ile Phe Phe Arg Glu Ile Arg Pro Arg Gly Ala His Lys Ile 20 25 30 cca caa aaa gga ccc gtg atc ttt gtt gcc gct cct cat gcc aat cag 144 Pro Gln Lys Gly Pro Val Ile Phe Val Ala Ala Pro His Ala Asn Gln 35 40 45 ttt gtc gat cct ctc gtc ttg atg cgt gag tgt ggc cgt aga gtc tca 192 Phe Val Asp Pro Leu Val Leu Met Arg Glu Cys Gly Arg Arg Val Ser 50 55 60 ttc ctt gcg gcc aaa aag tct atg gac cgc cgg tgg att ggt gct atg 240 Phe Leu Ala Ala Lys Lys Ser Met Asp Arg Arg Trp Ile Gly Ala Met 65 70 75 80 gca cgc tcg atg aat gcg att cct gtt gaa cgc ccg cag gat ctt gct 288 Ala Arg Ser Met Asn Ala Ile Pro Val Glu Arg Pro Gln Asp Leu Ala 85 90 95 aaa gcg ggt tcg gga gtc atc aaa ctt ttg gat cgc tat ggt gat cct 336 Lys Ala Gly Ser Gly Val Ile Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Gly Asp Pro 100 105 110 ctt cga gtg aca ggt gtc ggc act aaa ttc aca aag gag cta ctt gtg 384 Leu Arg Val Thr Gly Val Gly Thr Lys Phe Thr Lys Glu Leu Leu Val 115 120 125 gga gat cag ata tct ctc cca aag gac gtt ggc tcc tca gcc gtg gtc 432 Gly Asp Gln Ile Ser Leu Pro Lys Asp Val Gly Ser Ser Ala Val Val 130 135 140 gag atc ata tct gat acc gag ctg att gtc aag aag gaa ttc aag gag 480 Glu Ile Ile Ser Asp Thr Glu Leu Ile Val Lys Lys Glu Phe Lys Glu 145 150 155 160 ctc aag gcc ctc gaa tta ttg acc agc cct gat gga acc aag tat aaa 528 Leu Lys Ala Leu Glu Leu Leu Thr Ser Pro Asp Gly Thr Lys Tyr Lys 165 170 175 tgc cta cct cac atg gac cag acg aat gta tac aaa act gtc ttt gag 576 Cys Leu Pro His Met Asp Gln Thr Asn Val Tyr Lys Thr Val Phe Glu 180 185 190 cgc ctc aac gct gga cat tgc gtt ggc att ttc ccc gaa ggt gga tcc 624 Arg Leu Asn Ala Gly His Cys Val Gly Ile Phe Pro Glu Gly Gly Ser 195 200 205 cac gat cgc gct gag atg ctg cca ttg aaa gct gga gtc acc atc atg 672 His Asp Arg Ala Glu Met Leu Pro Leu Lys Ala Gly Val Thr Ile Met 210 215 220 gct ctg ggc gcg ttg gcc gcc aac cct tcg ttg gac ctc aag att gtc 720 Ala Leu Gly Ala Leu Ala Ala Asn Pro Ser Leu Asp Leu Lys Ile Val 225 230 235 240 acc tgc ggc ctc aac tac ttt cat cct cat cgc ttc cgc tcg cgt gca 768 Thr Cys Gly Leu Asn Tyr Phe His Pro His Arg Phe Arg Ser Arg Ala 245 250 255 gtg gtc gag ttt ggc gag cca ctg acg gtc cct cct gag ctg gtc gaa 816 Val Val Glu Phe Gly Glu Pro Leu Thr Val Pro Pro Glu Leu Val Glu 260 265 270 atg tac aag cga ggc ggg gct gag aag cgt gaa gcg tgc gga aag ttg 864 Met Tyr Lys Arg Gly Gly Ala Glu Lys Arg Glu Ala Cys Gly Lys Leu 275 280 285 ctg gat aca atc tat gag gct ctt cgc ggt gtc act ctc aat gca cct 912 Leu Asp Thr Ile Tyr Glu Ala Leu Arg Gly Val Thr Leu Asn Ala Pro 290 295 300 gat tac gaa acg ttg atg gtc att caa gcg gcc cgt cgc ctt tac aag 960 Asp Tyr Glu Thr Leu Met Val Ile Gln Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Lys 305 310 315 320 ccc act cat cgc aag ctg cag atc tca caa gtc gtg gag ttg aac cgc 1008 Pro Thr His Arg Lys Leu Gln Ile Ser Gln Val Val Glu Leu Asn Arg 325 330 335 agg ttc gtc gca gga tac atg cac ttc aag gac aac cct aaa gtc att 1056 Arg Phe Val Ala Gly Tyr Met His Phe Lys Asp Asn Pro Lys Val Ile 340 345 350 gaa gcc aag gac aag gtc atg cat tac aac act caa ctt cga tac cat 1104 Glu Ala Lys Asp Lys Val Met His Tyr Asn Thr Gln Leu Arg Tyr His 355 360 365 gga ctg cgc gat cat cag gtg aac att cgc aca acc agg aaa cac gct 1152 Gly Leu Arg Asp His Gln Val Asn Ile Arg Thr Thr Arg Lys His Ala 370 375 380 atc ggc atg ctc atc tca cgg ctc att cag atg atc ttt ttg agt tgt 1200 Ile Gly Met Leu Ile Ser Arg Leu Ile Gln Met Ile Phe Leu Ser Cys 385 390 395 400 ctg gct cta cct gga acc ctg atg aat ctt ccg gtc gct att gtc gct 1248 Leu Ala Leu Pro Gly Thr Leu Met Asn Leu Pro Val Ala Ile Val Ala 405 410 415 cgt gtc atc agc aac aag aag gcc aaa gag gcg ctg gct gcc tcg aca 1296 Arg Val Ile Ser Asn Lys Lys Ala Lys Glu Ala Leu Ala Ala Ser Thr 420 425 430 gtc aag att gct gga agg gat gtc ctg gct aca tgg aag ctg ctg gtc 1344 Val Lys Ile Ala Gly Arg Asp Val Leu Ala Thr Trp Lys Leu Leu Val 435 440 445 gct cta gga ttg atg cct gtc ctc tac ttc aca tat tcc gtc atg gtc 1392 Ala Leu Gly Leu Met Pro Val Leu Tyr Phe Thr Tyr Ser Val Met Val 450 455 460 ttt atc tat tgt ggc cgc ttc gac ata tcg ttc aag tcg cgt ctc ttg 1440 Phe Ile Tyr Cys Gly Arg Phe Asp Ile Ser Phe Lys Ser Arg Leu Leu 465 470 475 480 atc gct tgg gca gca tgg gcg cta att cct ttc gta acg tat gca agc 1488 Ile Ala Trp Ala Ala Trp Ala Leu Ile Pro Phe Val Thr Tyr Ala Ser 485 490 495 ata cgc ttc ggt gaa gtt ggt atc gat att ttc aaa tct atc cgc cca 1536 Ile Arg Phe Gly Glu Val Gly Ile Asp Ile Phe Lys Ser Ile Arg Pro 500 505 510 ttg ttc ttg tcc atc atc cca ggt gaa gag agc acg atc aac gac ttg 1584 Leu Phe Leu Ser Ile Ile Pro Gly Glu Glu Ser Thr Ile Asn Asp Leu 515 520 525 cgc aaa gcc cga gcg gaa ctc cag aag act atc acc aat ctt atc aat 1632 Arg Lys Ala Arg Ala Glu Leu Gln Lys Thr Ile Thr Asn Leu Ile Asn 530 535 540 gag ctg gcg ccg cag att tat ccc gac ttt gat tcg aag cgc atc ctc 1680 Glu Leu Ala Pro Gln Ile Tyr Pro Asp Phe Asp Ser Lys Arg Ile Leu 545 550 555 560 gat ccg tct cct gca gat cgc ccc agc cgc tcg gca tca ggt acc aac 1728 Asp Pro Ser Pro Ala Asp Arg Pro Ser Arg Ser Ala Ser Gly Thr Asn 565 570 575 ctt gca cag aca atc ttc aac acg gcc gct cag cct ttg aac caa tgg 1776 Leu Ala Gln Thr Ile Phe Asn Thr Ala Ala Gln Pro Leu Asn Gln Trp 580 585 590 cta ggc aag gac ggc cgc ttt gaa tgg gag cgc acc gag gat tcg gat 1824 Leu Gly Lys Asp Gly Arg Phe Glu Trp Glu Arg Thr Glu Asp Ser Asp 595 600 605 gca gat gat gtg ttc ttc ttt ttg gac cca gca aga gga att ctt gga 1872 Ala Asp Asp Val Phe Phe Phe Leu Asp Pro Ala Arg Gly Ile Leu Gly 610 615 620 cgg tcg agg gcg tcg tcc tgg gga gga ggg gca ttt aca cct gcc gcc 1920 Arg Ser Arg Ala Ser Ser Trp Gly Gly Gly Ala Phe Thr Pro Ala Ala 625 630 635 640 gat ggg tcg cga tcc cgg aat cgg agc agg aca agc agc ttc acg tcg 1968 Asp Gly Ser Arg Ser Arg Asn Arg Ser Arg Thr Ser Ser Phe Thr Ser 645 650 655 gga cag atc cag ctt ggc gag ggc ttc aaa ctc gag gca ttg acg gaa 2016 Gly Gln Ile Gln Leu Gly Glu Gly Phe Lys Leu Glu Ala Leu Thr Glu 660 665 670 ctg ccg agg gac aag cct ttt gca gag gtg acg agg cgg ctg agt gtg 2064 Leu Pro Arg Asp Lys Pro Phe Ala Glu Val Thr Arg Arg Leu Ser Val 675 680 685 agc cgc atg cag aga tac ggg ttg gag ggt atg acg cgc tcg gac acg 2112 Ser Arg Met Gln Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Met Thr Arg Ser Asp Thr 690 695 700 gac gaa aac gaa ggc tct aca gcc aag tca aaa gac att tag 2154 Asp Glu Asn Glu Gly Ser Thr Ala Lys Ser Lys Asp Ile 705 710 715 <210> 11 <211> 717 <212> PRT <213> Mortierella alpina <400> 11 Met Ala Leu Gln Ile Tyr Asp Phe Val Ser Phe Phe Phe Thr Ile Leu 1 5 10 15 Leu Asp Ile Phe Phe Arg Glu Ile Arg Pro Arg Gly Ala His Lys Ile 20 25 30 Pro Gln Lys Gly Pro Val Ile Phe Val Ala Ala Pro His Ala Asn Gln 35 40 45 Phe Val Asp Pro Leu Val Leu Met Arg Glu Cys Gly Arg Arg Val Ser 50 55 60 Phe Leu Ala Ala Lys Lys Ser Met Asp Arg Arg Trp Ile Gly Ala Met 65 70 75 80 Ala Arg Ser Met Asn Ala Ile Pro Val Glu Arg Pro Gln Asp Leu Ala 85 90 95 Lys Ala Gly Ser Gly Val Ile Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Gly Asp Pro 100 105 110 Leu Arg Val Thr Gly Val Gly Thr Lys Phe Thr Lys Glu Leu Leu Val 115 120 125 Gly Asp Gln Ile Ser Leu Pro Lys Asp Val Gly Ser Ser Ala Val Val 130 135 140 Glu Ile Ile Ser Asp Thr Glu Leu Ile Val Lys Lys Glu Phe Lys Glu 145 150 155 160 Leu Lys Ala Leu Glu Leu Leu Thr Ser Pro Asp Gly Thr Lys Tyr Lys 165 170 175 Cys Leu Pro His Met Asp Gln Thr Asn Val Tyr Lys Thr Val Phe Glu 180 185 190 Arg Leu Asn Ala Gly His Cys Val Gly Ile Phe Pro Glu Gly Gly Ser 195 200 205 His Asp Arg Ala Glu Met Leu Pro Leu Lys Ala Gly Val Thr Ile Met 210 215 220 Ala Leu Gly Ala Leu Ala Ala Asn Pro Ser Leu Asp Leu Lys Ile Val 225 230 235 240 Thr Cys Gly Leu Asn Tyr Phe His Pro His Arg Phe Arg Ser Arg Ala 245 250 255 Val Val Glu Phe Gly Glu Pro Leu Thr Val Pro Pro Glu Leu Val Glu 260 265 270 Met Tyr Lys Arg Gly Gly Ala Glu Lys Arg Glu Ala Cys Gly Lys Leu 275 280 285 Leu Asp Thr Ile Tyr Glu Ala Leu Arg Gly Val Thr Leu Asn Ala Pro 290 295 300 Asp Tyr Glu Thr Leu Met Val Ile Gln Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Lys 305 310 315 320 Pro Thr His Arg Lys Leu Gln Ile Ser Gln Val Val Glu Leu Asn Arg 325 330 335 Arg Phe Val Ala Gly Tyr Met His Phe Lys Asp Asn Pro Lys Val Ile 340 345 350 Glu Ala Lys Asp Lys Val Met His Tyr Asn Thr Gln Leu Arg Tyr His 355 360 365 Gly Leu Arg Asp His Gln Val Asn Ile Arg Thr Thr Arg Lys His Ala 370 375 380 Ile Gly Met Leu Ile Ser Arg Leu Ile Gln Met Ile Phe Leu Ser Cys 385 390 395 400 Leu Ala Leu Pro Gly Thr Leu Met Asn Leu Pro Val Ala Ile Val Ala 405 410 415 Arg Val Ile Ser Asn Lys Lys Ala Lys Glu Ala Leu Ala Ala Ser Thr 420 425 430 Val Lys Ile Ala Gly Arg Asp Val Leu Ala Thr Trp Lys Leu Leu Val 435 440 445 Ala Leu Gly Leu Met Pro Val Leu Tyr Phe Thr Tyr Ser Val Met Val 450 455 460 Phe Ile Tyr Cys Gly Arg Phe Asp Ile Ser Phe Lys Ser Arg Leu Leu 465 470 475 480 Ile Ala Trp Ala Ala Trp Ala Leu Ile Pro Phe Val Thr Tyr Ala Ser 485 490 495 Ile Arg Phe Gly Glu Val Gly Ile Asp Ile Phe Lys Ser Ile Arg Pro 500 505 510 Leu Phe Leu Ser Ile Ile Pro Gly Glu Glu Ser Thr Ile Asn Asp Leu 515 520 525 Arg Lys Ala Arg Ala Glu Leu Gln Lys Thr Ile Thr Asn Leu Ile Asn 530 535 540 Glu Leu Ala Pro Gln Ile Tyr Pro Asp Phe Asp Ser Lys Arg Ile Leu 545 550 555 560 Asp Pro Ser Pro Ala Asp Arg Pro Ser Arg Ser Ala Ser Gly Thr Asn 565 570 575 Leu Ala Gln Thr Ile Phe Asn Thr Ala Ala Gln Pro Leu Asn Gln Trp 580 585 590 Leu Gly Lys Asp Gly Arg Phe Glu Trp Glu Arg Thr Glu Asp Ser Asp 595 600 605 Ala Asp Asp Val Phe Phe Phe Leu Asp Pro Ala Arg Gly Ile Leu Gly 610 615 620 Arg Ser Arg Ala Ser Ser Trp Gly Gly Gly Ala Phe Thr Pro Ala Ala 625 630 635 640 Asp Gly Ser Arg Ser Arg Asn Arg Ser Arg Thr Ser Ser Phe Thr Ser 645 650 655 Gly Gln Ile Gln Leu Gly Glu Gly Phe Lys Leu Glu Ala Leu Thr Glu 660 665 670 Leu Pro Arg Asp Lys Pro Phe Ala Glu Val Thr Arg Arg Leu Ser Val 675 680 685 Ser Arg Met Gln Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Met Thr Arg Ser Asp Thr 690 695 700 Asp Glu Asn Glu Gly Ser Thr Ala Lys Ser Lys Asp Ile 705 710 715 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 12-f <400> 12 tctagaatgg cacctcccaa cactattg 28 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 12-r <400> 13 aagcttttac ttcttgaaaa agaccacgtc 30 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 6-f <400> 14 tctagaatgg ctgctgctcc cagtgtgag 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 6-r <400> 15 aagcttttac tgtgccttgc ccatcttgg 29 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GLELO-f <400> 16 tctagaatgg agtcgattgc gcaattcc 28 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GLELO-r <400> 17 gagctcttac tgcaacttcc ttgccttctc 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5-f <400> 18 tctagaatgg gtgcggacac aggaaaaacc 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5-r <400> 19 aagcttttac tcttccttgg gacgaagacc 30 <210> 20 <211> 1203 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 20 atggcacctc ccaacactat tgatgccggt ttgacccagc gccatatcag cacctcggcc 60 gccccaacct ctgccaagcc cgccttcgag cgcaactacc agctccctga gttcaccatc 120 aaggagatcc gtgagtgcat ccctgcacac tgctttgagc gctccggtct ccgtggtctt 180 tgccacgttg ctattgatct gacctgggcc tcgctcttgt tcctggctgc gacccagatc 240 gacaagttcg agaacccttt gatccgctac ttggcctggc ctgcgtattg gatcatgcag 300 ggtattgttt gcaccggtat ctgggtattg gcacacgaat gtggtcatca gtccttctcg 360 acctccaaga cccttaacaa cactgtcggc tggatcttgc actcgatgct cttggtccct 420 taccactcct ggagaatctc gcactcgaag caccacaagg ccactggcca catgaccaag 480 gaccaggtct ttgttcccaa gacccgctct caggttggct tgccccccaa ggagaatgtt 540 gcagttgccg ttcaggagga ggatatgtcc gtgcacctgg atgaggaggc ccccattgtg 600 actttgttct ggatggtgat tcagttcctg ttcggatggc ctgcgtacct tattatgaac 660 gcctctggtc aagactatgg ccgctggacc tcgcacttcc acacctactc tcctatcttt 720 gagccccgca actttttcga cattatcatt tcggatctcg gtgtgttggc tgctcttggt 780 accttgatct acgcctccat gcagctctcg ctcttgaccg tgaccaagta ctacattgtc 840 ccctacttgt ttgtcaactt ctggttggtc ctgatcacct tcttgcagca caccgaccct 900 aagctgcccc attaccgtga gggtgcctgg aacttccagc gtggagccct ctgcaccgtt 960 gaccgctcgt tcggcaagtt cttggaccat atgttccacg gcattgtcca tacccatgta 1020 gcccatcact tgttctcgca gatgccgttc taccatgctg aggaagccac ccatcatctc 1080 aagaaactgc tgggagagta ctacgtctat gacccatcgc cgattgttgt tgcggtctgg 1140 aggtcgttcc gtgaatgccg attcgtggaa gaccatggag acgtggtctt tttcaagaag 1200 taa 1203 <210> 21 <211> 1374 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 21 atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg agattttgaa tgccgaggcc 60 ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca ccctttctga tgatcattga caacaaggtg 120 tacgatgtcc gcgagtttgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct cacgcacgtt 180 ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact ttccaccccg aggctgcttg ggagactctt 240 gccaactttt acgttggtga tattgatgag agcgatcgtg ccatcaagaa tgatgacttt 300 gcggccgagg ttcgcaagct gcgcaccttg ttccagtccc ttggctacta cgactcgtcc 360 aaggcatact atgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggctt gtcgactttc 420 attgttgcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc tgcgctcttg 480 ggtctcttct ggcagcagtg cggatggttg gcgcacgact ttttgcacca ccaggtcttc 540 caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc gccttcttgg gaggtgtctg ccagggtttc 600 tcgtcctcct ggtggaagga caagcacaac actcaccacg ctgctcccaa cgtccacggc 660 gaggatcccg acattgacac tcaccctctg ttgacctgga gtgagcatgc tctggagatg 720 ttctcggatg ttcctgacga ggagctgacc cgtatgtggt cgcgcttcat ggtcctcaac 780 cagacctggt tctacttccc cattctctcg tttgcccgtc tgtcctggtg cctccagtcc 840 attatgcttg ttctgcccaa cggtcaggcc cacaagccct ctggagcgcg tgtgcccatt 900 tcgttggtcg agcagctgtc tctggctatg cactggacct ggtacctcgc caccatgttc 960 ctgttcatta aggatcccgt caacatgatt gtgtactttt tggtgtcgca ggctgtttgc 1020 ggcaacttgt tggcgattgt gttctcgctc aaccacaacg gcatgcctgt gatctccaag 1080 gaggaagcgg tcgatatgga cttcttcacc aagcagatca tcacgggtcg tgatgttcac 1140 cctggtctgt ttgccaactg gttcacgggt ggattgaact accagattga gcaccacttg 1200 ttcccttcga tgccccgcca caacttttca aagatccagc ctgctgtcga gactttgtgc 1260 aaaaagtacg gtgtccgata ccataccact ggtatgatcg agggaactgc agaggtcttt 1320 agccgtttga acgaggtctc caaggcggcc tccaagatgg gcaaggcaca gtaa 1374 <210> 22 <211> 957 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 22 atggagtcga ttgcgcaatt cctcccctca aagatgccgc aagatctgtt tattgacctt 60 gcaagggcca tcggtgtcca ggccgcaccc tatgtcgacc ctctcgaggc agcgcttgtg 120 gcccaggccg agaagttctt ccccacggtc gttcatcaca cgcgcggctt tttggtcgcg 180 gtcgagtcac ccttggcccg tgagctgccc ttgatgaacc ccttccacgt gctgttgatc 240 gcgctcgctt acttggtcac ggtctttgtg ggcatgcaga tcatgaagaa ctttgaacgg 300 ttcgaggtca agacgttctc gctcttccac aacttttgtc tggtctcgat cagtgcctac 360 atgtgcggcg ggatcttgta cgaggcttac caggccaact atggactgtt tgagaacgcg 420 gccgatcata ccgtccaggg tcttcctatg gccaagatga tctggctctt ctacttctcc 480 aagatcatgg agtttgtcga caccatgatc atggtcctta agaagaacaa ccgccagatc 540 tcgttcttgc acgtctacca ccacagctcc atcttcacca tctggtggtt ggtcaccttt 600 gttgcaccca atggtgaagc ctacttctcg gctgcgttga actcgttcat ccacgtgatc 660 atgtacggct actacttcct gtccgccttg ggcttcaagc aggtgtcgtt catcaagttc 720 tacatcacgc gttcgcagat gacgcagttc tgcatgatgt cgatccagtc ctcctgggac 780 atgtatgcca tgaaggtgct tggccgcccc ggatacccct tcttcatcac cgccctgctt 840 tggttctaca tgtggaccat gctcggactc ttctacaact tctacagaaa gaacgccaag 900 ttggccaagc aggccaagat cgatgctgcc aaggagaagg caaggaagtt gcagtaa 957 <210> 23 <211> 1341 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 23 atgggtgcgg acacaggaaa aaccttcacc tggcaagaac tcgcggcgca taacaccgag 60 gacagcctcc ttttggctat ccgtggcaat gtatacgatg tcacaaagtt cttgagccgt 120 catcctggtg gaacggatac tctcttgctc ggagctggcc gagatgtcac tccggttttt 180 gagatgtacc acgagtttgg agctgcagag gctatcatga agaagtacta tgttggcaca 240 ctggtctcaa atgagttgcc catcttccca gagccaacgg tgttccataa gaccatcaag 300 ggcagagttg aggcatactt taaggaccgg aacatggatt ccaagaacag accagagatc 360 tggggacgat atgctctcat ctttggatcc ttgatcgcct cttactacgc gcagctcttt 420 gtaccgttcg tggtcgaacg tacatggctc caggtggtgt ttgctatcat catgggattt 480 gcgtgcgcgc aagtcggatt gaaccctctt cacgatgcct cccacttttc agtgacccac 540 aaccccaccg tttggaagat tctcggagcc acgcacgact ttttcaacgg agcatcgtat 600 ctcgtgtgga tgtaccaaca tatgctcggc catcatccct ataccaacat tgctggagct 660 gatcccgatg tgtcgacctc tgagcccgat gttcgtcgta tcaagcccaa ccaaaagtgg 720 ttcgtcaacc acatcaacca gcacatgttt gttcctttcc tgtacggact gctggcgttc 780 aaggtgcgca tccaggacat caacatcttg tactttgtca agaccaatga cgccattcgt 840 gtcaacccca tctcgacttg gcacaccgtc atgttctggg gcggaaaggc cttctttgtc 900 tggtaccgct tgatcgttcc tatgcagtat ctgcccctga gcaaggtgtt gctcttgttt 960 accgtcgcag acatggtctc ttcttactgg ctggcgctga ccttccaggc gaaccacgtt 1020 gttgaggagg ttcagtggcc attgcctgat gagaatggaa tcatccaaaa ggattgggca 1080 gccatgcagg tcgagactac tcaggattac gcccacgatt cgcacctctg gaccagcatc 1140 acgggcagct tgaactacca agccgttcat catctgttcc cgaacgtttc ccagcatcac 1200 taccctgata tcctggctat catcaaggac acctgcagcg agtacaaggt gccatacctc 1260 gtcaaggata ccttttggca agcgtttgct tcacatttgg agcacttgcg tgtgcttggt 1320 cttcgtccca aggaagagta a 1341 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer MaGAPDHpfw <400> 24 cacaccacac attcaacatc 20 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer E2 <400> 25 ggcaatttca tccaagttgt cctcc 25 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer E1 <400> 26 ctgactacca aaaccagctg gacttc 26 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer PD4P <400> 27 cgcatcccgc aaacacacac 20

Claims

하기 (a)에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산:

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열.
삭제
하기 (a)~(c) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산:

(a) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열;

(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열;

(c) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열.
하기 (a)에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산:

(a) 이하의 단백질을 코드하는 염기 서열;

서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)~v) 중 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:

i) 올레산 함유량;

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율;

iii) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율;

iv) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한, 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율; 및

v) 아라키돈산 또는 디호모γ리놀렌산 또는 둘다의 함유량의 비율.
삭제
하기 (a)에 기재한 단백질:

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질.
하기 (a)에 기재한 단백질:

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)~v) 중 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질:

i) 올레산 함유량;

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율;

iii) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율;

iv) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한, 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율; 및

v) 아라키돈산 또는 디호모γ리놀렌산 또는 둘다의 함유량의 비율.
서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 기재한 핵산을 함유하는 재조합 벡터.
제9항에 기재한 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체.
제9항에 기재한 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)~v) 중 하나 이상이, 제9항의 재조합 벡터로 형질 전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물의 비율보다 높은 것을 특징으로 하는 지방산 조성물:

i) 올레산 함유량;

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율;

iii) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율;

iv) 탄소수 16의 지방산의 함유량에 대한, 탄소수 18의 지방산의 함유량의 비율; 및

v) 아라키돈산 또는 디호모γ리놀렌산 또는 둘다의 함유량의 비율.
제11항에 기재한 지방산 조성물을, 상기 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터, 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물의 제조 방법.
제11항에 기재한 지방산 조성물을 포함하는 식품.