KR101482165B1

KR101482165B1 - Ｒｎａ에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 선별방법

Info

Publication number: KR101482165B1
Application number: KR20120155487A
Authority: KR
Inventors: 이영훈; 정의한; 박인수; 홍효정; 이정민
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2015-01-15
Anticipated expiration: 2032-12-27
Also published as: KR20140085815A

Abstract

본 발명은 RNA에 결합하는 항체의 선별방법 및 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 선별방법은 기능성 RNA의 구조를 인식하는 인간 항체의 제조에 유용하게 사용되며, BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체는 BC200 RNA를 인지하거나 그 작용을 조절할 수 있어 관련 의약분야에 다양하게 적용될 수 있다.

Description

ＲＮＡ에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 선별방법{RNA-SPECIFIC BINDING ANTIBODY AND SELECTING METHOD FOR THE SAME}

본 발명은 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 선별방법에 관한 것이다. 본 발명의 선별방법은 기능성 RNA의 구조를 인식하는 인간 항체의 제조에 유용하게 사용되며, RNA에 특이적으로 결합하는 항체는 표적 RNA를 인지하거나 그 작용을 조절할 수 있어 관련 의약분야에 다양하게 적용될 수 있다.

RNA가 단순히 유전정보로의 전달자로서의 역할 뿐만 아니라, 2차 혹은 3차 구조를 가짐으로써 다양한 세포내 기능을 하는 것으로 밝혀지고 있다. 즉, RNA가 세포 내에서 기능을 하기 위해서는 이에 필요한 2차 또는 3차 구조를 가지고 있어야만 한다. 그러므로 세포에는 같은 염기서열을 가지고 있지만 2차 또는 3차 구조가 다른 RNA가 존재한다. 그러나 현재까지 RNA를 분석하기 위해서 기본적으로 사용하는 방법은 혼성체화(hybridization)인데, 혼성체화 조건에서는 RNA의 2차 또는 3차 구조가 유지 되기 어렵기 때문에 이 방법으로 염기서열은 같으나 구조가 다른 RNA를 구별할 수 없었다.

BC200 RNA(brain cytoplasmic 200)를 비롯하여 여러 기능성 RNA의 중요성이 확대되고, 그 이해가 절대적으로 요구되고 있다. 새로운 기능성 생체 분자로 대두되고 있는 RNA의 구조를 인지할 수 있는 항체가 개발된다면, 학문적으로는 세포에서 일어나는 RNA-단백질 상호작용 원리의 기본적인 개념을 도입할 수 있고, 세포 내 RNA 기능을 구조적인 측면에서 조사할 수 있을 뿐만 아니라, 분자 인지의 새로운 기술로서 바이오칩(biochip)이나 바이오센서(biosensor)는 물론 진단 및 치료제의 개발 등에 효과적인 활용을 기대할 수 있다.

RNA를 인식하는 항체의 중요성이 알려진 후, RNA와 결합하는 항체를 찾으려는 노력이 계속되고 있다.

그러나, 항체는 항원(antigen)과의 반응에서 고도의 친화성과 특이성을 나타내므로, 항체를 RNA 구조를 인지하는 분자로 개발할 수 있지만 동물을 이용하는 기존의 방법으로 항체를 제조할 수 없다. 그 이유는 RNA가 매우 불안정하여 동물에 주입하는 순간 분해되기 때문이다. 이러한 이유에서 RNA 구조를 인지하는 항체 제조 연구는 거의 시도되지 않았다. 하지만 최근 개발되고 있는 인간 항체 라이브러리를 이용하면 시험관내에서 특정 분자의 구조를 인지하는 항체를 창출할 수 있기 때문에, 인간 항체 라이브러리는 RNA의 불안정성 문제점을 극복하고 RNA의 구조를 인지하는 인간 항체의 창출에 이용될 수 있다.

RNA와 결합하는 항체를 찾는 방법으로는, 예를 들어, Jing-Dong Y., et al.(PNAS, 2007)에는 자성 비드(magnetic bead)를 사용하여 패닝하는 방법이 개시되어 있으나, 상기 선행논문은 자성 비드가 가지고 있는 유동성 때문에 용액 분리 과정에서 비특이성의 문제점을 가지고 있으며, 더구나 패닝 차수(round)가 늘어남에도 동일한 횟수로 세척할 경우 항원에 대한 친화력이 강하고 특이적인 항체 선별에 있어 단점이 있다. 또한 합성 라이브러리를 사용하고 있기에 상기 언급한 활용에 있어 큰 제한이 있을 수 있으며, 현재까지 상기 문제점들을 보완한 선별 방법은 개발되고 있지 않은 실정이다.

이에, 본 발명은 RNA 인지의 새로운 기술로서 바이오칩(biochip)이나 바이오센서(biosensor)는 물론 진단 및 치료제의 개발 등에 효과적으로 사용하기 위해, RNA에 결합하는 항체의 선별방법, 상기 방법에 의해 선별된 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 포함하는 BC200 RNA의 탐지용 조성물, 또는 BC200 RNA 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 구현예는 (a) 고정상 지지체에 표적 RNA를 고정하는 단계; (b) 상기 고정화된 표적 RNA에 파지 디스플레이-인간 항체 라이브러리를 결합시키는 단계; (c) 상기 표적 RNA에 결합되지 않은 항체를 발현하는 파아지를 제거하는 단계 및 (d) 상기 표적 RNA에 결합한 항체 발현 파이지를 분리하고 항체를 얻는 단계를 포함하는, RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 선별방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구현예는 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명의 추가 구현예는 상기 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 탐지용 조성물 또는 BC200 RNA 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 파아지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파아지만을 선택해 내는 과정을 "패닝(panning)"이라고 한다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편일 수 있다. 용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 구조를 가진 기능성 RNA를 인식하는 인간항체의 선별 방법을 개발하였고, 표적항원으로서 BC200 RNA에 인식하는 인간 항체를 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.

구제적으로 본 발명자들은 인간 항체 라이브러리를 이용하여 파아지 디스플레이 기법(phage display technology)에 따라 파아지에 디스플레이된 Fab 형태의 항체(Fab form monoclonal antibody)를 수득하였다. 염기서열 분석을 통해 최종적으로 선별된 Fab 형태의 단일 클론 항체를 인간 IgG1의 불변영역과 카파(kappa) 경쇄의 불변영역을 가지고 있는 벡터의 위쪽에 각각 클로닝하여 전체 IgG1 형태의 인간 항체로 전환하고 HEK293T 세포에서 발현시킨 후 protein G 를 이용하여 정제한 다음 BC200 RNA에 특이적으로 결합함을 확인하였다.

종래 고정상 지지체가 아닌 유동상 지지체를 사용하는 경우 집합(aggregation)이 쉽게 일어나는 단점을 보였다. 보다 구체적으로 유동상 지지체의 한 예인 자성비드는 유동성을 가져 비드끼리 집합이 쉽게 일어나며, 세척과정에서 스트렙트아비딘에 결합한 파아지가 효과적으로 제거되지 않으며, 또한 용출단계에서도 RNA에 결합한 파아지를 모두 용출할 수 없었다. 이에 본 발명자들은 고정상 지지체를 사용하여 상기 문제점을 극복하였다.

본 발명의 일 구현예는 (a) 고정상 지지체에 표적 RNA를 고정하는 단계; (b) 상기 고정화된 표적 RNA에 파지 디스플레이-인간 항체 라이브러리를 결합시키는 단계; (c) 상기 표적 RNA에 결합되지 않은 항체를 발현하는 파아지를 제거하는 단계 및 (d) 상기 표적 RNA에 결합한 항체 발현 파이지를 분리하고 항체를 얻는 단계를 포함하는, RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 선별방법에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 고정하는 단계는 표적 RNA를 바이오틴화 하고 스트렙트아비딘이 코팅된 고정상 지지체에 RNA를 고정할 수 있다.

상기 (b), (c) 및 (d)단계에서, 고정상 지지체에 표적 RNA에 고정하는 단계 후에, 파아지에 디스플레이-인간 항체 라이브러리를 고정된 RNA와 반응시키는 결합단계; 상기 결합단계 후 결합하지 않은 항체를 제거하는 세척단계; 상기 세척단계 후 RNA에 결합된 파아지에 디스플레이된 항체를 용출(Elution)시키고, 항체를 얻는 단계를 수행한다. 상기 용출단계에서 용출과정은 효모 전체 RNA(yeast total RNA)를 넣어 용출시킬 수 있으나 특별히 이에 한정되지는 않는다.

RNA와 강한 특이성을 갖는 항체를 선별하기 위해 상기 상기 (b), (c) 및 (d)단계를 1 내지 5회 반복할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 반복할 수 있다.

상기 RNA는 2차 또는 3차 구조를 가진 RNA를 모두 포함하며, 바람직하게는 BC200 RNA일 수 있다.

BC200(brain cytoplasmic 200) RNA는 본래 영장류의 뇌에서 발현되는 신경세포 특이적 ncRNA(non-coding RNA)로서 처음 발견되었으며(Tiedge, H., et al., J Neurosci, 1993 및 Watson, J.B. and Sutcliffe, J.G., Mol Cell Biol, 1987), 신경세포의 수상돌기에서 국부적으로 단백질 합성을 조절하는 인자로 여겨지고 있다(Lin, D., et al., Mol Cell Biol, 2008). 또한 BC200 RNA가 신경 조직 외에 다양한 유래의 종양 조직에서도 발현되며 특히, 유방암의 경우에는 양성 종양에 비해서 전이성 유방암에서 더 높은 발현을 보인다는 것이 보고되었다(Chen, W., et al., J Pathol, 1997 및 Iacoangeli, A., et al., Carcinogenesis, 2004). 더불어 알츠하이머병과 같은 신경관련 질환에서도 많은 BC200 RNA가 발견되는 것으로 알려지고 있다(Lukiw, W.J., et al., Neurochem Res, 1992 및 Mus, E., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2007).

따라서, 본 발명의 일 구현예는 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.

상기 BC200 RNA은 서열번호 13(ggccgggcgc gguggcucac gccuguaauc ccagcucuca gggaggcuaa gaggcgggag gauagcuuga gcccaggagu ucgagaccug ccugggcaau auagcgagac cccguucucc agaaaaagga aaaaaaaaaa caaaagacaa aaaaaaaaua agcguaacuu cccucaaagc aacaaccccc cccccccuuu)의 염기서열을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 13으로 이루어진 염기서열일 수 있다.

바람직한 일례로 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1(Gly Tyr Thr Leu Ser Ala Tyr Tyr)의 아미노산 서열을 갖는 상보성결정영역 1 (CDR1), 서열번호 2(Ile Asn Pro Arg Gly Gly Arg Thr)의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 3(Cys Ala Ala Arg Gly Ser Pro Arg Ser Arg Phe Tyr Tyr Gly Met Gly Val Trp)의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 중쇄 가변영역(V_H); 및,

서열번호 4(Gln Ser Ile Asn Asn Tyr)의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 5(Ala Thr Ser)의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 6(Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe)의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

다른 바람직한 일례로 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 7(Gly Tyr Thr Leu Ser Thr Tyr Tyr)의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 8 (Ile Asn Ser Arg Gly Gly Arg Thr)의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 9(Cys Ala Arg Gly Ser Pro Arg Leu Arg Arg Asp Pro Arg Arg Ala Phe Asp Ile Trp)의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 중쇄 가변영역(V_H); 및,

서열번호 10(Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr)의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 11(Arg Asn Asn)의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 12(Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Arg Asn Gly)의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

상기 항체는 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.

상기 항체들은 BC200 RNA에 특이적으로 결합할 수 있으므로 BC200 RNA를 인지하거나 그 작용을 조절하는데 활용할 수 있다. 따라서 BC200 RNA에 특이적으로 결합할 수 있는 특성으로 인해 BC200 RNA 관련 질환의 진단 또는 치료에 크게 응용될 수 있으며, 본 발명의 다른 일례로 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 BC200 RNA 관련 질환으로 이에 한정되지 않지만, BC200 RNA 관련 질환으로 알려진 질환들을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 유방암, 알츠하이머병(신경퇴행성질환), 자궁경부암, 식도암, 폐암, 난소암, 귀밑샘암 및 혀암(설암)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 약학 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 치료용 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 또한 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, BC200 RNA의 탐지용 조성물, 또는 BC200 RNA 관련 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.

상기 탐지용 조성물은 단백질에 특이적인 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.

또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신,이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

한편, 상기 탐지용 조성물은 탐지의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다 (Antibodies: A Labotory Manual, Harlow＆Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

바람직하게는, 상기 탐지용 또는 진단용 조성물은 탐지용 또는 진단용 키트, 마이크로어레이, 단백질 칩의 형태로 제공될 수 있다. 상기 진단용 키트로는 예를 들면, 샘플 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 샘플에 적용되는 샘플패드 (sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 샘플이 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막 (예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어져 있다.

본 발명에 따른 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 BC200 RNA를 인지하거나 그 작용을 조절할 수 있어 BC200 RNA 관련 질환의 진단 및 치료에 유용하게 응용될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 RNA에 결합하는 항체의 선별방법은, 종래에 자성 비드를 이용한 항체의 선별방법에 있어서 자성비드의 유동성 때문에 발생하는 용액 분리 과정의 비특이성 문제점을 극복할 수 있으며, 또한 패닝 차수(round)가 늘어남에도 동일한 횟수로 세척할 경우 항원에 대한 친화력이 강하고 특이적인 항체 선별에 있어 어려운 점을 해결하였다. 따라서 본 발명의 RNA에 결합하는 항체의 선별방법은 기능성 RNA의 구조를 인식하는 인간 항체의 제조에 유용하게 사용될 수 있으며, RNA 인지의 새로운 기술로서 바이오칩(biochip)이나 바이오센서(biosensor)는 물론 진단 및 치료제의 개발 등에 효과적인 활용될 수 있다.

도 1은 시험관 내 전사반응을 통해 BC200RNA를 제작할 수 있는 RNA 발현 플라스미드를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 패닝법을 이용하여 항체 라이브러리부터 항체를 선별하는 방법을 도식화한 것이다.
도 3은 패닝법을 이용하여 선별한 파아지에 디스플레이된 다클론 Fab 항체 (polyclonal Fab antibody)의 RNA에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 패닝법을 이용하여 선별한 파아지에 디스플레이된 Fab 형태의 단일 클론 항체의 RNA에 대한 결합력을 닷 블랏으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 동물 세포주에서 발현된 항체를 정제한 후 SDS-PAGE로 분석할 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 동물 세포주에서 발현된 항체를 정제한 후 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 단일 클론 항체와 RNA와의 필터 결합법을 도식화한 것이다.
도 8은 전체 IgG 항체의 RNA에 대한 결합력을 필터 결합법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 바이오틴화 RNA 제작

1.1 어댑터 RNA 의 서열을 포함한 BC200 RNA 발현 벡터 제작

어댑터 RNA(서열번호 14, ggaucgcauu uggacuucug cccgcaaggg caccacgguc ggaucc)의 서열을 포함한 BC200 RNA(서열번호 13)를 시험관 내 전사반응을 통해 제작하기 위하여, RNA 발현 플라스미드를 구축하였다(도 1). 사람 지노믹 DNA(human genomic DNA, Roche사, 독일)를 주형으로 하여 정방향 프라이머(forward primer)로서 T7 프로모터(T7 promoter) 서열과 BC200 5’ 말단의 일부 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드(서열번호 16, gaattctaat acgactcact ataggccggg cgcggtg), 및 역방향 프라이머(reverse primer)로서 BC200 3’말단의 일부 서열, 어댑터 RNA의 서열 및 StuI 부위의 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드(서열번호 17, cttccggatc cgaccgtggt gcccttgcgg gcagaagtcc aaatgcgatc caaagggggg gggggg)를 이용하여 2X TOPSimple PreMix-Forte(Enzynomics사, 대한민국)로 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 95℃ 에서 3분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 35회 반응시킨 후, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 반응시킴으로써 이루어졌다.

합성된 DNA를 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하고, DNA를 MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction kit(Intron사, 대한민국)로 정제하였다. 정제된 DNA를 T-blunt vector(Solgent사, 대한민국)와 반응시키고, 대장균 DH5α에 열충격(Heat shock)으로 형질전환시켜 LB 암피실린(100μg/ml, ampicillin, Amp) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하고, 나타난 단일 콜로니를 LB 암피실린(100μg/ml) 액체배지 3㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(Intron사, 대한민국)를 이용하여 DNA를 추출하여, 염기서열 분석을 의뢰하였다(Solgent사, 대한민국). 그 결과, T7 프로모터, BC200 RNA, 어댑터 RNA, 그리고 StuI 부위의 서열들과 일치됨을 확인하였다.

1.2 시험관 내 전사반응을 통한 RNA 제작

상기 실시예 1.1에서 준비된 DNA는 제한효소 StuI을 사용하여 절단하였고, 상기 제한효소로 절단한 절편을 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하고, DNA를 MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction kit로 정제하였다. 정제된 DNA를 RiboMAX™ Large Scale RNA Production Systems for T7 kit(Promega사, 미국)로 반응시켜 7M 요소가 포함된 5% PAGE를 이용하여 RNA 밴드를 분리하고, RNA 용출 용액(Tris-Cl, pH7.5, 0.3M NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS)에 넣어 4℃에서 16시간 동안 용출하였다.

상기 용출액을 15,000 xg으로 1분 동안 원심분리하고, 상층액만 0.4μm 필터로 걸러주고, 페놀을 동일양으로 넣고 15,000 xg으로 10분 동안 원심분리하고, 상층액만 새 튜브에 옮겼다. 여기에 클로로포름을 동일 양으로 넣고 15,000 xg으로 10분 동안 원심분리하고, 상층액만 새 튜브에 옮기고, 상층액 양의 2.5배에 해당하는 에탄올을 넣고, -70℃에서 보관하였다. 상기 용액을 2 내지 8℃에서 15,000 xg으로 5분 동안 원심분리하여 에탄올을 제거하였고, 70% 에탄올과 100% 에탄올을 차례로 넣고 동일한 방식으로 원심분리하고 상층액을 제거한 후, RNA 펠렛을 진공펌프를 이용하여 상온에서 3분 동안 건조시켰다.

1.3 RNA 바이오틴화

상기 실시예 1.2에서 준비된 RNA와 어댑터 RNA에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴화 올리고뉴클레오티드(서열번호 15, aggatccgac cgtggtgccc t)를 1:2.5의 비율로 혼합하고 85℃에서 5분간 반응한 뒤, 상온까지 서서히 온도를 내림으로써 바이오틴화 RNA를 얻었다.

실시예 2. Fab 형태의 인간 항체 라이브러리를 파아지에 디스플레이된 형태로 전환

Fab 형태의 대형 인간 항체 라이브러리로, kappa 경쇄와 lambda 경쇄가 인간 생체에 존재하는 비율과 동일한 6:4로 존재하는 라이브러리 세포 1.5 X 10¹¹을 2YT 및 암피실린 100μg/ml를 포함하는 배지(2.1L)에서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후(OD₆₀₀=0.7~0.8), 헬퍼 파아지(helper phage) VCSM13을 MOI값이 1:20이 되도록 감염시켜 37℃에서 30분 동안 정치한 후 37℃에서 30분 동안 흔들어 키웠다. 여기에 카나마이신(70μg/ml, kanamycin, Kan)을 넣고 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.

배양한 세포를 4℃에서 5,000 rpm(Supra 22K, A500s-6 No.11, 한일과학사업사, 대한민국)으로 15분 동안 원심분리한 후, 상층액에 5mM PEG(polyethylene glycol) 8000과 500mM NaCl을 첨가하여 얼음에서 2시간 동안 반응하였다. 다시 4℃에서 10,000 rpm(Supra 22K, A500s-8 Rotor No.7, 한일과학사업사, 대한민국)으로 1시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 완벽히 제거하고 펠렛에 10 ml PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(13,000 xg, 10분)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 용액을 새 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다.

실시예 3. RNA 에 대한 패닝과정

3.1 스트렙트아비딘 코팅

이뮤노튜브에 스트렙트아비딘 100ng을 1 ml 코팅 완충용액(15 mM Na₂CO₃, 34.84 mM NaHCO₃, pH 9.6)에 녹여서 넣고 4℃에서 16시간 동안 코팅하였고, 0.05% PBST(Tween20 를 0.05% 함유한 PBS)로 1회 세척하였다. 여기에 3% BSA 2 ml를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켜 차단(blocking)하고, 0.05% PBST로 2회 세척하였다.

3.2 바이오틴화 올리고뉴클레오티드 및 스트렙트아비딘과 반응하는 음성군 항체를 제거

상기 실시예 3.1에서 제작한 이뮤노튜브에 상기 실시예 2에서 제조한 파아지에 디스플레이된 라이브러리 항체 1 ml(1.2 X 10¹³/ml)와 바이오틴화 올리고뉴클레오티드 100 pmol을 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시키고, 항원에 결합하지 않은 파아지(음성군)를 상기 실시예 3.1에서 제작한 이뮤노튜브에 넣고 실온에서 30분동안 반응시켰으며, 이 과정을 2회 반복하여 음성군에 결합하는 파아지를 제거하였다.

3.3 RNA 와 결합하는 항체 선별

상기 실시예 3.2의 음성군에 결합하는 항체를 제거한 라이브러리 파아지 항체를 실시예 1.3에서 제작한 바이오틴화 RNA 10 pmol과 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 상기 실시예 3.1의 이뮤노튜브에 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다.

3.4 RNA 와 결합력이 약한 항체를 세척하여 제거

상기 실시예 3.3의 이뮤노튜브를 0.05% PBST로 10회 세척하였다. 이 때, 패닝 회차가 증가할수록 세척 횟수를 10회씩 늘렸다. 즉, 2차 패닝에서는 20회, 3차 패닝에서는 30회, 4차 패닝에서는 40회를 세척하였다.

3.5 RNA 와 결합하고 있는 파아지의 용출

상기 실시예 3.4의 이뮤노튜브에 PBS 1 ml에 녹인 효모 전체 RNA(yeast total RNA) (구입처: 라이프 테크놀로지스) 5mg을 넣고 상온에서 10분간 반응시켜, RNA에 결합한 항체만을 떼어내었다.

3.6 패닝 결과물을 콜로니 형태로 변환 후 저장 및 다음 패닝을 위하여 파아지에 디스플레이된 형태로 변환

대장균 TG1(F' [traD36 proAB ⁺ lacI ^q lacZ Δ M15]supE thi -1 Δ( lac - proAB ) Δ( mcrB - hsdSM )5, ( rK ^- mK ^- ))의 단일 콜로니를 2YT배지(10 ml)에서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 키운 배양액(OD₆₀₀=0.7~0.8)에 상기 실시예 3.5에서 용출된 파아지를 감염시키고, 37℃에서 30분 동안 정치한 후 37℃에서 30분 동안 흔들어 키웠다. 상기 배양액을 4℃에서 3,500rpm(Supra 22K, Rotor A500s-8 No.7, 한일과학사업사, 대한민국)으로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 1 ml의 2YT배지에 녹여 SOB, 10mM Mg Cl₂, 100mM glucose 및 암피실린 100μg/ml을 포함한 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 고체배지에서 자란 콜로니들은 2YT, 100mM Glucose, 5mM MgCl₂ 및 암피실린 100μg/ml을 포함한 배지 10 ml에 녹이고, 새 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다.

이를 파아지로 다시 전환하기 위하여 상기 세포를 녹여 2YT 및 암피실린 100μg/ml를 포함하는 배지에 OD₆₀₀=0.1~0.15가 되도록 넣은 후 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후(OD₆₀₀=0.7~0.8), 헬퍼 파아지(helper phage) VCSM13을 MOI값이 1:20이 되도록 감염시켜 37℃에서 30분 동안 정치한 후 37℃에서 30분 동안 흔들어 키웠다. 여기에 카나마이신(70μg/ml, kanamycin, Kan)을 넣고 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 4℃에서 5,000 rpm(Supra 22K, A500s-6 Rotor No.11, 한일과학사업사, 대한민국)으로 15분 동안 원심분리한 후, 상층액에 5mM PEG(polyethylene glycol) 8000과 500mM NaCl을 첨가하여 얼음에서 2시간 동안 반응하였다. 다시 4℃에서 10,000 rpm(Supra 22K, Rotor A500s-8 No.7, 한일과학사업사, 대한민국)으로 1시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 완벽히 제거하고 펠렛에 10 ml PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(13,000 xg, 10분)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 용액을 새 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다.

상기 실시예 3.1 내지 3.6의 과정을 총 4번 반복하였으며, 항체 선별 과정의 모식도를 도 2에 나타내었으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

패닝 횟수	초기 파아지수	결합한 파아지수
1차	1.2 X 10¹³	6.1 X 10⁶
2차	3.0 X 10¹³	9.9 X 10⁶
3차	1.8 X 10¹³	9.7 X 10⁷
4차	1.2 X 10¹³	2.2 X 10⁸

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 3차 패닝부터 BC200 RNA를 인식하는 항체를 가지고 있는 콜로니 역가가 10배 정도 증폭됨을 확인하였다.

실시예 4. RNA ELISA 및 닷 블랏(dot blot)을 통한 패닝 결과 확인

4.1 RNA ELISA 를 통한 패닝 결과 확인

상기 실시예 3에 따라 1차부터 4차까지 패닝하여, 얼려두었던 세포 스톡(stock)을 상기 실시예 3.6과 동일한 방법으로 파아지 형태로 전환하였다. 96 웰 면역 플레이트(NUNC 439454)에 스트렙트아비딘을 웰 당 100 ng씩 4℃에서 16시간 정도 코팅 완충용액으로 처리하여 코팅한 후, 0.05% PBST 200 μl로 1번 세척하고, 0.05% PBST에 녹인 3% BSA를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 동시에 새 튜브에서 1차 내지 4차 패닝 결과 BC200 RNA를 인식하는 항체를 디스플레이하고 있는 파아지 100 μl와 바이오틴화 BC200 RNA 4pmol을 상온에서 반응시켰다. 차단된 각 웰을 0.05% PBST 200 μl로 2번 세척한 다음 상기 항체를 디스플레이하고 있는 파아지와 바이오틴화 BC200 RNA 반응물을 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 0.05% PBST 200 μl로 3번 세척한 후 이차 항체인 항-인간IgGF(ab)₂’-HRP(Pierce사, 미국)를 1:2000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-트윈20(0.05%) 0.05% PBST 200 μl로 4번 세척한 후에 BD OptEIA TMB Substrate Reagent Set(BD사, 미국)로 기질 용액을 만들어, 웰 당 100 μl씩 넣어 5분 동안 발색시키고, 2.5M 황산수용액 50 μl를 넣어 반응을 종료시킨 뒤 분광광도계(Spectrophotometer)(MolecularDevice사, 미국)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, BC200 항원에 있어서 3차 패닝 단계부터 역가가 증가하는 것을 확인하였다.

4.2 닷 블랏을 통한 단일 클론 항체의 결합력 확인

상기 실시예 3에 따라 얻은 4차 패닝 세포 스톡을 녹인 후, 2YT 암피실린(100μg/ml) 고체배지에 단일 콜로니로 분별될 수 있도록 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니 항체를 파아지로 다시 전환하기 위하여 녹여 2YT, 100mM Glucose 및 암피실린 100μg/ml를 포함하는 배지에 접종하여 상기 실시예 3.6과 동일한 방법으로 파아지 형태로 전환하였다. 이때, 인간 항체 라이브러리에서 무작위로 뽑아 제작한 단일 클론 항체를 대조군으로 이용하였다. Dot blot kit(schleicher and schuell사, 독일)에 제작한 항체를 디스플레이하고 있는 파아지 100 μl를 넣고 상온에서 1시간 동안 Hybond-ECL막(GE사, 미국)에 결합시켰다. 상기 막은 PBS에 녹인 2% 탈지유(skim milk)로 상온에서 1시간동안 차단하고, 85℃오븐에서 1시간 동안 교차 결합(cross linking)시켰다. 교차 결합된 막은 탐침(probe)으로써 α-³²p[CTP]를 사용하여 내부 표지된 BC200 RNA를 포함하는 Rapid-hyb buffer(GE사, 미국)와 회전기(rotator)에서 16시간 동안 반응시켰다. 이 때 BC200 RNA는 2차 구조를 이루도록 65℃에서 5분 반응시키고, 4℃에서 10분 반응시킨 것을 사용하였다. 마지막으로 세척 용액 I(2X SSC, 0.1% SDS)과 세척 용액 II(0.2X SSC와 0.1% SDS)로 세척한 뒤에, imaging plate(Fujifilm사, 일본)에 감광시키고, 그 신호를 BAS7000(Fujifilm사, 일본)로 관찰하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, BC200 항원에 있어서 강력하게 결합하는 단일 클론 파아지 항체 들을 확인할 수 있었으며 이를 FabBC200-A와 FabBC200-B로 명명하였다.

실시예 5. 단일 클론 Fab 항체 분석

상기 실시예 4에서 확인된, BC200 RNA을 특이적으로 인식하는 단일 클론 항체들을 2YT 암피실린(100μg/ml)에 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 단일 클론으로부터 DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(Intron사, 대한민국)를 이용하여 DNA를 수득한 후, 프라이머H(서열번호 18, gcgaagtcac ccatcagg)와 프라이머L(서열번호 19, tagctcactc attaggca)을 이용하여 중쇄와 경쇄의 염기서열을 ABI-3730xl 자동서열분석기 (automatic sequencer) (Solgent사, 대한민국) 로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다.

클론이름	구분	유사 대립형질(allele)	상동성
FabBC200-A	중쇄 가변 영역	IGHV1-4601 F, 혹은 IGHV1-4602 F, 혹은 IGHV1-46*03 F	92,01% (265/288 nt)
FabBC200-A	경쇄 가변 영역	Homsap IGKV1-3901 F, 혹은 Homsap_IGKV1D-3901 F	92,83% (259/279 nt)
FabBC200-B	중쇄 가변 영역	IGHV1-4601 F, 혹은 IGHV1-4602 F, 혹은 IGHV1-46*03 F	91,32% (263/288 nt)
FabBC200-B	경쇄 가변 영역	Homsap IGLV1-44*01 F	95,79% (273/285 nt)

Fab BC200 RNA에 결합하는 항체의 CDR 아미노산 서열

		CDR1	CDR2	CDR3
FabBC200-A	중쇄 가변 영역	GYTLSAYY (서열번호 1)	INPRGGRT (서열번호 2)	CAARGSPRSRFYYGMGVW (서열번호 3)
FabBC200-A	경쇄 가변 영역	QSINNY (서열번호 4)	ATS (서열번호 5)	CQQSYSFPWTF (서열번호 6)
FabBC200-B	중쇄 가변 영역	GYTLSTYY (서열번호 7)	INSRGGRT (서열번호 8)	CARGSPRLRRDPRRAFDIW (서열번호 9)
FabBC200-B	경쇄 가변 영역	SSNIGSNT (서열번호 10)	RNN (서열번호 11)	CATWDDSRNG (서열번호 12)

상기 표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이 선별된 항체의 중쇄(V_H) 및 경쇄(V_L)의 CDR영역을 확인하였다. 상기 항체와 생식세포계열의 대립형질(germline allele) 항체군의 유사성을 IMGT(www.imgt.org) 의 Internet software IMGT/V-QUEST(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanIg) 프로그램을 이용하여 확인한 결과, 항체 FabBC200-A의 중쇄의 경우 인간 생식세포계열 서열과 대략 92%까지의 상동성을 보여주었으며, 경쇄의 경우 대략 92%의 상동성을 보여주었다. 항체 FabBC200-B의 중쇄의 경우 인간 생식세포계열 서열과 대략 91%까지의 상동성을 보여주었으며, 경쇄의 경우 대략 95%의 상동성을 보여주었다. 또한, 각각의 인간 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR1,2 및 3에서 사용되고 있는 아미노산 잔기(residue)를 분석하였으며, 서로 서열이 다른 것을 확인하였다. 이 때 항체의 서열번호는 IMGT 에서 정한 인간 항체의 염기서열 번호 명명법에 따랐고, 항체의 HCDR1, HCDR2, HCDR3와 LCDR1, LCDR2, LCDR3 영역 결정은 IMGT의 CDR표시 방법에 따랐다.

실시예 6. 동물세포 전체 IgG 발현벡터 제조

6.1 전체 IgG1 변환 분석

BC200 RNA에 결합하는 인간 단일 클론 항체를 Fab 형태에서 IgG1 전체 형태의 항체로 전환하기 위해, 단일 클론 DNA 1fmol과 15pmole의 중쇄 또는 경쇄 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 20 내지 서열번호 31), 2X TOPSimple PreMix-Forte(Enzynomics사, 대한민국)를 혼합하여 SOEing PCR법을 사용하여 반응을 실시하였다. 합성된 DNA를 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 예상되는 사이즈의 DNA 밴드를 자른 후, MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction kit(Intron사, 대한민국)로 정제하였다. 정제된 DNA를 제한효소로 처리한 pdCMV-dhfrC-chimeric 벡터(Eung Suk, L., et al., Exp. And Mol. Med., 2012) 1 μl(10ng), 중쇄(100~200 ng) 15 μl, 10X 완충용액 2 μl, 리가아제(Ligase, Promega사, 미국) 1 U 및 증류수를 혼합하여 17℃에서 16시간 방치하여 상기 벡터와 연결하였다. 상기 벡터를 대장균 DH5α에 열충격(Heat shock)으로 형질전환시켜 LB 암피실린(100μg/ml, ampicillin, Amp) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하고, 나타난 단일 콜로니를 LB 암피실린(100μg/ml) 액체배지 3㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(Intron사, 대한민국)를 이용하여 DNA를 추출하여, 염기서열을 ABI-3730xl automatic sequencer 로 분석하였다(Solgent사, 대한민국).

그 결과, 전체 IgG1으로 전환한 BC200 RNA에 결합하는 항체의 중쇄 및 경쇄 서열이 Fab 형태로 얻은 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다.

6.2 전체 IgG 의 검증

293T 세포에 Noble enhancer 36 μl, Noble factor 40 μl(Noble Bioscience사, 대한민국)와 전체 형태(whole form) 항체 DNA 10 μg을 넣어 형질감염하여 얻은 상등액을 recombinant protein G agarose(Invitrogen사, 미국)로 정제한 후 용출액을 SDS-PAGE와 ELISA로 확인하였고, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5 및 도 6에서 나타난 바와 같이, 성공적으로 전체 IgG1 형태로 전환되었음을 확인하였다.

실시예 7. 전체 IgG1 형태 단일 클론 항체의 결합력 확인

7.1 필터 결합법(filter binding assay)를 통한 단일 클론 항체의 결합력 확인

상기 실시예 6에 따라 얻은 단일 클론 항체를 희석하여 농도별로 65℃에서 5분 반응시키고, 4℃에서 10분 반응시킨 BC200 RNA 동일양과 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이때, pdCMV-dhfrC-chimeric-A10A3 벡터(Eung Suk, L., et al., Exp. And Mol. Med., 2012)에서 만들어지는 항체를 항체 대조군으로, 대장균 유래 6S RNA를 RNA 대조군으로 이용하였다.

Dot blot kit(schleicher and schuell사, 독일)에 상기 반응물을 넣고 Hybond-ECL막(GE사, 미국)과 Hybond-XL막(GE사, 미국)에 차례로 통과시켰다. 이때 결합하지 않은 BC200 RNA양을 분석하기 위해 BC200 RNA만을 통과시키는 실험도 동시에 수행하였다. 필터 결합법의 실험 모식도는 도 7에 나타내었다. 상기 Hybond-XL막은 85℃의 오븐에서 1시간 동안 교차 결합(cross linking)시켰다. 여기에 탐침(probe)으로써 α-³²p[CTP]를 사용하여 내부 표지된 BC20 RNA를 포함하는 Rapid-hyb buffer(GE사, 미국)와 회전기(rotator)에서 16시간 동안 반응시켰다.

마지막으로 세척 용액 I(2X SSC, 0.1% SDS)과 세척 용액 II(0.2X SSC와 0.1% SDS)로 세척한 뒤에, imaging plate(Fujifilm사, 일본)에 감광시키고, 그 신호를 BAS7000(Fujifilm사, 일본)로 관찰하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명진이 선벌한 FabBC200-A 및 B가 BC200 RNA에만 특이적으로 결합함을 확인하였다.

7.2 BC200 RNA 와 전체 IgG 형태 단일 클론 항체의 결합 친화도 분석

상기 실시예 7.1에서 얻은 결과를 하기 수학식 1을 바탕으로 분석하여 해리상수 K_d값을 산출하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

하기 표 4에 나타난 바와 같이, FabBC200-A와 FabBC200-B의 해리상수 Kd값이 각각 9.4 X 10^-9M과, 44.4 X 10^-9 M인 것으로 산출되었다.

	FabBC200-A	FabBC200-B
해리상수 값 (K_d) (M)	9.4 X 10^-9	4.4 X 10^-8

실시예 8. FACS 및 실시간( real time ) PCR 을 통한 각 세포주에서의 BC200 RNA 정량 분석

8.1 FACS 분석

HeLa, MCF7 및 HaCaT 세포를 3 X 10⁶/ml이 되도록 10% FBS/PBS에 희석하였다. 희석한 세포에 각각 FabBC200-A 및 음성 항체 1ug을 별도로 처리하였고, 처리한 각 세포를 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, PBS로 두 번 세척하였다. 각각 FabBC200-A 및 음성 항체를 처리한 세포에 항-인간IgGF(ab)₂’-DyLight488(Bethyl사, 미국)를 1:50으로 희석하여 실온에서 30분 동안 반응시키고 다시 PBS로 두 번 세척하였다. 상기 세포는 BD LSRII(BD사, 미국)를 통해 FACS 측정하여 형광값(평균값)을 분석하였으며 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

세포주	FabBC200-A	음성 항체	FabBC200-A/음성항체	상대적 비율 값
MCF7	2777.82	254.68	10.91	4.99
HeLa	470.16	114.57	4.10	1.88
HaCaT	350.03	160.02	2.19	1

8.2 real - time PCR 분석

HeLa, MCF7 및 HaCaT 세포주의 전체 RNA(total RNA)는 easy-BLUE Total RNA Extraction Kit(Intron사, 대한민국)를 이용하여 추출하였다. 추출된 전체 RNA는 6개의 임의의 뉴클레오티드로 이루어진 프라이머(random hexamer)와 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 역전사 반응을 시켜 cDNA를 제작하였다. 제작된 cDNA는 BC200 RNA와 GAPDH mRNA를 선택적으로 증폭할 수 있는 프라미어를 사용하여 real-time PCR반응을 수행하여, 각 RNA의 Ct(threshold cycle)를 얻어 각 세포주에 따른 BC200 RNA의 상대적인 양을 분석하였으며 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

세포주	RNA	Ct	BC200 RNA 상대적 비율 값(2^(-Δ△ ^Ct ⁾)
MCF7	BC200 RNA	12.04	4.72
MCF7	GAPDH mRNA	12.72	4.72
HeLa	BC200 RNA	13.16	2.63
HeLa	GAPDH mRNA	12.99	2.63
HaCaT	BC200 RNA	14.18	1
HaCaT	GAPDH mRNA	12.62	1

표 5 및 표 6에 나타난 바와 같이, 유방암 세포주인 MCF7 세포에서 BC200 RNA의 상대적 비율 값이 높은 것으로 확인하였다. 이러한 결과는 FabBC200-A가 BC200 RNA의 탐지용으로 사용될 수 있음을 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> RNA-SPECIFIC BINDING ANTIBODY AND SELECTING METHOD FOR THE SAME <130> DPP20126861KR <160> 31 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Heavy Chain CDR1 <400> 1 Gly Tyr Thr Leu Ser Ala Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Heavy Chain CDR2 <400> 2 Ile Asn Pro Arg Gly Gly Arg Thr 1 5 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Heavy Chain CDR3 <400> 3 Cys Ala Ala Arg Gly Ser Pro Arg Ser Arg Phe Tyr Tyr Gly Met Gly 1 5 10 15 Val Trp <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Light Chain CDR1 <400> 4 Gln Ser Ile Asn Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Light Chain CDR2 <400> 5 Ala Thr Ser 1 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Light Chain CDR3 <400> 6 Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Heavy Chain CDR1 <400> 7 Gly Tyr Thr Leu Ser Thr Tyr Tyr 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Heavy Chain CDR2 <400> 8 Ile Asn Ser Arg Gly Gly Arg Thr 1 5 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Heavy Chain CDR3 <400> 9 Cys Ala Arg Gly Ser Pro Arg Leu Arg Arg Asp Pro Arg Arg Ala Phe 1 5 10 15 Asp Ile Trp <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Light Chain CDR1 <400> 10 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 11 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Light Chain CDR2 <400> 11 Arg Asn Asn 1 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Light Chain CDR3 <400> 12 Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Arg Asn Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 200 <212> RNA <213> Human <400> 13 ggccgggcgc gguggcucac gccuguaauc ccagcucuca gggaggcuaa gaggcgggag 60 gauagcuuga gcccaggagu ucgagaccug ccugggcaau auagcgagac cccguucucc 120 agaaaaagga aaaaaaaaaa caaaagacaa aaaaaaaaua agcguaacuu cccucaaagc 180 aacaaccccc cccccccuuu 200 <210> 14 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor RNA <400> 14 ggaucgcauu uggacuucug cccgcaaggg caccacgguc ggaucc 46 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin oligonucleotide <400> 15 aggatccgac cgtggtgccc t 21 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-BC200-Fwd <400> 16 gaattctaat acgactcact ataggccggg cgcggtg 37 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-StuI-Rev <400> 17 cttccggatc cgaccgtggt gcccttgcgg gcagaagtcc aaatgcgatc caaagggggg 60 gggggg 66 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PrimerH <400> 18 gcgaagtcac ccatcagg 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PrimerL <400> 19 tagctcactc attaggca 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uni-HC_PCR1-Up <400> 20 ccggaattca ctctaacc 18 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-HC_PCR1-Dn <400> 21 gaacctggga gaggacacct gtag 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-HC_PCR2-Up <400> 22 cctctcccag gttcagctgg tgc 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uni-HC_PCR2-Dn <400> 23 cgatgggccc ttggccgtgc 20 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-HC_PCR1-Dn <400> 24 gcatttggga gaggacacct gtag 24 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-HC_PCR2-Up <400> 25 cctctcccaa atgcagctgg tgc 23 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-LC_PCR1_Up <400> 26 gaaggagata ttgtgatgac cc 22 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-LC_PCR2_Up <400> 27 cacaatatct ccttc 15 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uni-LC_PCR2_Dn <400> 28 cccaagcttc ggcacg 16 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-LC_PCR1_Dn <400> 29 agccaccgta cgtaggacgg tcagcttgg 29 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-LC_PCR1_Up <400> 30 gaaggacagt ctgtgctgac gc 22 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-LC_PCR2_Up <400> 31 gcacagactg tccttcaaca ccagac 26

Claims

(a) 고정상 지지체에 표적 RNA를 고정하는 단계;
(b) 상기 고정화된 표적 RNA에 파지 디스플레이-인간 항체 라이브러리를 결합시키는 단계;
(c) 상기 표적 RNA에 결합되지 않은 항체를 발현하는 파아지를 제거하는 단계 및
(d) 효모 전체 RNA(yeast total RNA)를 넣어 상기 표적 RNA에 결합한 항체 발현 파아지를 분리하고 항체를 얻는 단계를 포함하고,
상기 (b) 결합단계, (c) 제거단계 및 (d) 항체를 얻는 단계를 반복하는,
RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 선별방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 결합단계, (c) 제거단계 및 (d) 항체를 얻는 단계를 1 내지 5회 반복하는 것인 선별방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 RNA는 BC200 RNA인 선별방법.
BC200 RNA에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 상보성결정영역 1 (CDR1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 중쇄 가변영역(V_H) 및,
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는;
상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 중쇄 가변영역(V_H) 및,
서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
삭제
삭제
제4항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 항원 결합 단편.
서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성결정영역 (CDR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 포함하고, BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 상보성결정영역(CDR)을 코딩하는 핵산분자.
서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성결정영역 (CDR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 포함하고, BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 상보성결정영역(CDR)을 코딩하는 핵산분자.
서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성결정영역 (CDR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 포함하고, BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 상보성결정영역(CDR)을 코딩하는 핵산분자.
서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성결정영역 (CDR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 포함하고, BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 상보성결정영역(CDR)을 코딩하는 핵산분자.
제4항 및 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 탐지용 조성물.