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KR101476271B1 - 초고감도 및 높은 선택성을 갖는 구리이온 검출용 조성물 및 형광화학센서 - Google Patents

초고감도 및 높은 선택성을 갖는 구리이온 검출용 조성물 및 형광화학센서 Download PDF

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KR101476271B1
KR101476271B1 KR1020130066459A KR20130066459A KR101476271B1 KR 101476271 B1 KR101476271 B1 KR 101476271B1 KR 1020130066459 A KR1020130066459 A KR 1020130066459A KR 20130066459 A KR20130066459 A KR 20130066459A KR 101476271 B1 KR101476271 B1 KR 101476271B1
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Abstract

본 발명은 초고감도 및 높은 선택성을 갖는 구리이온 검출용 조성물, 이를 포함하는 형광화학센서, 이들의 제조방법, 구리이온의 선택적 검출방법, 구리이온 킬레이트제의 스크리닝 방법 및 구리이온 킬레이트제의 킬레이트 효과 확인 방법에 관한 것이다. 본 발명은 강가, 호수, 바다 등의 수질과 혈장, 혈청 및 소변 등의 생체 샘플에서도 구리이온을 검출하는데 응용 가능하며, 기존의 구리이온 킬레이트제의 효능 평가와 새로운 구리이온 킬레이트제 개발을 위한 고속대량 스크리닝(high throughput screening)에도 응용가능하다. 또한, 세포내 및 체내 혈청에서의 구리이온의 정성 및 정량적인 검출이 가능하며, 질환의 진단 키트로 응용이 가능하다.

Description

초고감도 및 높은 선택성을 갖는 구리이온 검출용 조성물 및 형광화학센서{Ultra sensitive and high selective composition or fluorescence chemosensor for sensing copper ion}
본 발명은 초고감도 및 높은 선택성을 갖는 구리이온 검출용 조성물, 이를 포함하는 형광화학센서, 이들의 제조방법, 구리이온의 선택적 검출방법 및 정량방법, 구리이온 킬레이트제의 스크리닝 방법 및 구리이온 킬레이트제의 킬레이트 효과 확인 방법에 관한 것이다.
구리는 인체에 존재하는 필수 중금속 중에서 세 번째로 풍부한 금속으로서, 다양한 생리학적 과정에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 살아있는 세포에서 구리이온은 산소분자를 활성산소종으로 변환시켜 단백질, 핵산 및 지질의 손상을 유발시킨다. 실제로, 구리의 과도한 양은 독성을 나타내며, 과도한 산화성 스트레스로 인하여 다양한 질환을 유발시킨다. 비정상적인 구리이온의 섭취로 유발되는 질병으로는 암, 심혈관 장애, 멘케스병, 윌슨병, 알츠하이머, 위장질환, 저혈당증, 난독증 및 유아 간질환 등이 있으며, 이러한 질환들은 특히 여러 기관들 중에서도 주로 간과 신장에서의 구리이온의 축적에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 생체 시스템 및 환경 분야에서 잔류 구리이온을 검출하는 것은 매우 중요하다.
지금까지 구리이온을 검출하기 위해 다양한 화학센서, 금속 나노클러스터, 양자점(quantum dot), 나노로드(nanorod), 비색법(colorimetric method), 분광법 (spectroscopy) 및 전압-전류법(voltammetry) 등이 개발되어져 왔다. 그러나, 유기형광체, 화학센서 및 나노클러스터는 다른 금속 이온에 대한 교차활성도(cross-activity), 수용액에서의 낮은 용해도 및 느린 반응성 때문에 실제 응용에는 한계가 있다.
또한, 구리이온 검출을 위한 대부분의 형광화학센서는 가시광선 영역대의 빛을 내기 때문에 세포, 생체분자 및 조직에 의한 간섭 또는 자가 형광으로 인해 민감도가 떨어진다. 나아가, 그동안 개발되었던 구리이온을 검출하기 위한 형광화학센서 대부분은 소수성을 띄기 때문에 유기용매의 사용이 필요하며, 감도도 상대적으로 좋지 않아 실제 응용에는 적합하지 않았다.
또한, 구리이온을 검출하기 위한 분광법과 전압-전류법은 분석하기 전에 복잡한 전처리 과정과 노동력을 필요로 한다.
따라서, 생체 시스템 및 환경 분야의 실제 적용을 위해서는, 높은 민감도와 선택성으로 신속 및 간편하게 구리이온을 검출할 수 있는 구리이온 검출법의 개발이 요구된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 높은 민감도와 선택성으로 신속 간편하게 구리이온을 검출할 수 있는 센서를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 아자이드/알킨화합물의 클릭 케미스트리(click chemistry)와 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)를 이용하여 구리이온 검출 센서를 개발하였으며, 이 센서를 사용하여 여러 종류의 금속이온이 혼재된 시료에서 구리이온을 높은 민감도(펨토몰 수준)로 선택적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 구리이온 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 구리이온 검출용 형광화학센서를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 구리이온 검출용 조성물 또는 형광화학센서의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 시료 내 구리이온의 선택적 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포내 또는 혈청에서의 구리이온 검출 및 정량분석 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 구리이온 킬레이트제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 구리이온 킬레이트제의 킬레이트 효과 확인 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 형광체; 및 상기 형광체의 발광효과를 흡수하여 소광효과를 나타내는 소광체를 포함하고, 상기 형광체 및 소광체는 각각 아자이드(azide) 그룹 또는 알킨(alkyne) 그룹을 포함하되, 형광체가 아자이드 그룹을 포함하는 경우 소광체는 알킨 그룹을 포함하고, 형광체가 알킨 그룹을 포함하는 경우 소광체는 아자이드 그룹을 포함하는 것을 특징으로 하는 구리이온 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 구리이온 검출용 조성물을 포함하는 구리이온 검출용 형광화학센서를 제공한다.
본 발명자들은 높은 민감도와 선택성으로 신속 간편하게 구리이온을 검출할 수 있는 센서를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 아자이드/알킨화합물의 클릭 케미스트리(click chemistry)와 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)를 이용하여 구리이온 검출 센서를 개발하였으며, 이 센서를 사용하여 여러 종류의 금속이온이 혼재된 시료에서 구리이온을 높은 민감도(펨토몰 수준)로 선택적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 특징은 아자이드/알킨 화합물의 클릭 케미스트리와 형광 공명 에너지 전이를 이용한 형광체-소광체 소광 시스템을 활용하여 높은 민감도로 구리이온을 선택적으로 검출한다는 점이다. 하기 실시예에서 확인한 바와 같이, 본 발명에 의하면 구리이온을 선택적으로 검출할 수 있으며(도 2 참조), 이러한 구리이온의 검출을 빠른 시간 안에 달성할 수 있으며(도 3 참조), 다양한 금속이온의 존재 하에서도 구리이온을 특이적으로 검출할 수 있으며(도 4 참조), 펨토몰 수준의 높은 민감도로 구리이온을 검출할 수 있다(도 5 참조). 나아가, 본 발명에 의하면 구리이온 킬레이트제의 효과를 평가할 수 있으며(도 6 참조), 세포 내 존재하는 구리이온의 검출(도 7 참조)과 혈청에 존재하는 구리이온의 정량이 가능하다(도 8 참조).
상기 형광체는 아자이드 그룹 또는 알킨 그룹을 포함하며, 상기 아자이드 또는 알킨 그룹은 구리이온(Cu1+)의 존재 시 소광체에 결합되어 있는 알킨 또는 아자이드 화합물과 사이클로에디션(cycloaddition) 반응을 한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 형광체에는, 예를 들어 Tavi's "FluoroTable": Common fluorophores(출처: Zeiss Corporation 웹사이트 및 http://info.med.yale.edu/ genetics/ward/tavi/FISHdyes2.html)에 개시된 형광체가 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 형광체는 시아닌(Cyanine), 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODIPY), 테트라메틸로드아민(Trtramethylrhodamine), 알렉사(Alexa), 알로피코시아닌(allopicocyanine) 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 형광체는 적색 또는 근적외선의 형광을 발광한다. 적색 또는 근적외선의 형광을 발광하는 형광체로는 시아닌과 알렉사가 있으며, 이들 형광체는 근적외선의 빛을 방출 및 흡수하므로 세포, 혈액 및 생체 조직 등과의 간섭 또는 흡수를 최소화할 수 있다.
본 발명에서 상기 소광체는 형광체에서 나오는 빛의 파장을 흡수하여 소광시키는 기능을 한다. 형광체의 발광 파장의 범위에 따라 적절한 소광체를 선택하여 사용할 수 있으며, 형광체의 발광 파장과 동일하거나 유사한 파장대의 소광체를 사용함이 바람직하다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 소광체는 블랙홀 소광체(blackhole quencher, BHQ), 블랙베리 소광체(blackberry quencher, BBQ) 또는 이들의 유도체이다.
본 발명에서 사용가능한 예시적인 형광체와 소광체의 짝을 하기 표 1 및 2에 나타내었다.
Figure 112013051641599-pat00001
Figure 112013051641599-pat00002
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 구리이온 검출용 조성물은 환원제를 추가적으로 포함한다. 상기 환원제는 구리이온(II)을 구리이온(I)으로 환원시키는 기능을 한다. 본 발명에서는 이러한 기능을 하는 환원제라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 사용가능한 환원제의 예로는 소듐 아스코빅(sodium ascorbate)을 들 수 있다.
본 발명에서 구리이온 검출용 형광화학센서의 형태는 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 조성물을 포함하는 형태라면 제한 없이 가능하다. 상기 형광화학센서의 구체적인 예로는, 상기 형광체 및 소광체(추가적으로 환원제)가 용매와 함께 용기에 담겨있는 형태를 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 구리이온 검출용 조성물 또는 형광화학센서의 제조방법을 제공한다:
(a) 아자이드 그룹 또는 알킨 그룹이 도입된 형광체를 얻는 단계;
(b) 알킨 그룹 또는 아자이드 그룹이 도입된 소광체를 얻는 단계; 및
(c) 단계 (a)에서 얻은 아자이드 그룹이 도입된 형광체와 단계 (b)에서 얻은 알킨 그룹이 도입된 소광체, 또는 단계 (a)에서 얻은 알킨 그룹이 도입된 형광체와 단계 (b)에서 얻은 아자이드 그룹이 도입된 소광체를 혼합하는 단계.
상기 단계 (a) 및 (b)에서는 아자이드 또는 알킨 그룹이 도입된 형광체와 소광체를 얻는다. 이러한 형광체와 소광체는 직접 제조하거나, 구매 등의 방법으로 수득할 수도 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 형광체 및 소광체에 아자이드 그룹을 도입하는 방법은 하기 반응식 1 또는 2에 따라 실시할 수 있다. 반응식에서 A는 형광체 또는 소광체를 나타낸다.
반응식 1
Figure 112013051641599-pat00003
반응식 2
Figure 112013051641599-pat00004

상기 반응식 1은 하이드록시숙신이미드(Hydroxysuccinimide)로 활성화된 형광체(또는 소광체)와 아민 그룹과 아자이드 그룹을 모두 포함하는 화합물과의 반응을 통하여 형광체(또는 소광체)에 아자이드 그룹을 도입하는 방법을 보여주며, 반응식 2는 카르복시 그룹을 갖는 형광체(또는 소광체)와 아민(NH2)그룹과 아자이드 그룹을 모두 포함하는 화합물을 가교제인 디-사이클로헥실디이미드(DCC)와 하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)를 통하여 형광체(또는 소광체)에 아자이드 그룹을 도입하는 방법을 보여준다.
상기 반응식 1에서, 하이드록시숙신이미드로 활성화된 형광체(또는 소광체)에 아자이드 그룹을 도입하기 위해 사용할 수 있는 화합물로는, 4-아지도아닐린 염산염(4-azidoaniline hydrochloride), 11-아지도-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민(11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amine), 아지도-PEG6-아민(azido-PEG6-amine), 아지도-PEG8-아민(azido-PEG8-amine) 및 아지도-PEG10-아민(azido-PEG10-amine) 등이 있으며, 이 외 아자이드 그룹과 아민 그룹을 모두 포함하는 화합물이면 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 반응식 2에서, 카르복시 그룹을 갖는 형광체(또는 소광체)에 가교제인 DCC와 하이드록시숙신이미드를 이용하여 아자이드 그룹을 도입하기 위해 사용할 수 있는 화합물로는, 4-아지도아닐린 염산염, 11-아지도-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민, 아지도-PEG6-아민, 아지도-PEG8-아민 및 아지도-PEG10-아민 등이 있으며, 이 외 아자이드 그룹과 아민 그룹을 모두 포함하는 화합물이면 제한 없이 사용할 수 있다.
또한, 상기 형광체 및 소광체에 알킨 그룹을 도입하는 방법은 하기 반응식 3 또는 4에 따라 실시할 수 있다. 반응식에서 A는 형광체 또는 소광체를 나타낸다.
반응식 3
Figure 112013051641599-pat00005
반응식 4
Figure 112013051641599-pat00006

상기 반응식 3에서, 하이드록시숙신이미드로 활성화된 소광체(또는 형광체)에 알킨 그룹을 도입하기 위해 사용할 수 있는 화합물로는, 프로파질아민(propargylamine), 2-메틸-3-부틴-2-아민(2-methyl-3-butyn-2-amine), 4-펜틴-1-아민(4-pentyn-1-amine), 3-메틸-1-펜틴-3-아민 염산염(3-methyl-1-pentyn-3-amine hydrochloride), 1-아민-4-클로로-2-부틴 염산염(1-amino-4-chloro-2-butyne hydrochloride), 3-에티닐아닐린(3-ethynylaniline) 및 4-에티닐아닐린(4-ethynylaniline) 등이 있으며, 이 외 알킨 그룹과 아민 그룹을 모두 포함하는 화합물이면 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 반응식 4에서, 카르복시 그룹을 갖는 소광체(또는 형광체)에 가교제인 DCC와 촉매인 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 이용하여 알킨 그룹을 도입하기 위해 사용할 수 있는 화합물로는, 2-부틴-1-올(2-butyn-1-ol), 3-부틴-1-올(3-butyn-1-ol), 3-부틴-2-올(3-butyn-2-ol), 4-펜틴-2-올(4-pentyn-2-ol), 5-헥센-2-인-1-올(5-hexen-2-yn-1-ol), 2-헥신-1-올(2-hexyn-1-ol), 3-헥신-1-올(3-hexyn-1-ol), 3-헥신-2-올(3-hexyn-2-ol), 4-헥신-3-올(4-hexyn-3-ol), 5-헥신-3-올(5-hexyn-3-ol), 9-운데신-1-올(9-undecyn-1-ol) 및 10-운데신-1-올(10-undecyn-1-ol) 등이 있으며, 이 외 알킨 그룹과 하이드록시 그룹을 모두 포함하는 화합물이면 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 단계 (c)에서는 단계 (a)에서 얻은 아자이드 그룹(또는 알킨 그룹)이 도입된 형광체 및 단계 (b)에서 얻은 알킨 그룹(또는 아자이드 그룹)이 도입된 소광체(추가적으로 환원제)를 적절한 용매에서 혼합한다. 사용가능한 용매로는 수용액, 유기용매 및 완충용액(예컨대, PBS) 등이 있다. 여기서 얻어진 혼합물 자체를 구리이온 검출용 센서로 사용할 수 있으며, 추가적으로 상기 혼합물을 센서 기판에 적절히 구비시킴으로써 센서장치로 구현할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시료 내 구리이온의 선택적 검출방법을 제공한다:
(a) 상기 구리이온 검출용 조성물 또는 형광화학센서에 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 형광체의 소광을 확인하는 단계.
본 명세서에서 사용된, 용어 "검출"은 시료 내에 구리이온이 존재하는지 여부를 확인하는 것뿐만 아니라(정성적 분석), 구리이온의 양을 알아내는 것(정량적 분석)도 포함한다. 시료에 존재하는 구리이온의 양은, 단계 (b)에서 확인한 형광체의 소광 정도(형광 세기)를 구리이온 표준곡선에 대입해봄으로써 알아낼 수 있다(하기 시험예 7 참조).
따라서, 본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명에 의한 구리이온의 선택적 검출방법은, 단계 (b) 이후에 단계 (b)에서 확인한 형광체의 소광(형광 세기)을 구리이온 표준곡선에 대입하여 구리이온의 농도를 알아내는 단계(단계 c)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 검출방법에 의하면 시료 내에 매우 낮은 농도(예컨대, 펨토몰 수준)로 존재하는 구리이온의 검출도 가능하다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 시료에 존재하는 구리이온의 농도는 1 펨토몰(femtomol, fM) 이상이다.
본 발명의 검출방법은 생체 시료 및 환경 시료(예컨대, 하천, 강, 바다 등의 물)에 존재하는 구리이온의 검출에 적용될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 시료는 수용액, 유기용액, 세포, 세포 용해물(cell lysate), 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 타액, 뇨, 정액 및 복수로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 특정예에 따르면, 상기 시료는 세포이며, 이에 따라 본 발명에 의하여 세포내 구리이온의 정성 및 정량분석이 가능하다. 다른 특정예에 따르면, 상기 시료는 혈청이며, 이에 따라 본 발명에 의하여 혈청 내 구리이온의 정성 및 정량분석이 가능하다.
본 발명의 검출방법에 의하면, 구리이온(I)의 검출이 가능하다. 즉, 시료에 1가의 구리이온 또는 1가와 2가의 구리이온이 존재하면, 1가의 구리이온에 의하여 형광체의 아자이드 그룹(또는 알킨 그룹)과 소광체의 알킨 그룹(또는 아자이드 그룹) 사이에 사이클로에디션 반응이 일어나고, 이에 의하여 형광체와 소광체의 거리가 매우 가까워짐에 따라 형광체-소광체 소광 메커니즘에 의해 형광체의 형광세기가 급격히 감소하게 되고, 이러한 소광 정도를 확인함으로써 구리이온(I)을 검출할 수 있는 것이다. 이 경우, 상기 구리이온 검출용 조성물 또는 형광화학센서에는 환원제가 포함되지 않을 수 있다.
한편, 본 발명의 검출방법을 실시한 결과, 형광체의 소광이 일어나지 않는 경우는 다음의 두 가지 경우가 있을 수 있다: (i) 구리이온이 존재하지 않거나, (ii) 구리이온(II)이 존재하는 경우. 이러한 경우에는, 형광체, 소광체 및 시료의 혼합물에 환원제를 추가적으로 처리하여 준 후 형광체의 소광을 확인함으로써 구리이온의 존재를 알아낼 수 있다. 구체적으로, (i) 환원제 처리에 의하여 형광체의 소광이 일어나지 않는다면 시료에 구이이온이 존재하지 않는 것이고, (ii) 반대로 환원제 처리에 의하여 형광체의 소광이 일어난다면 시료에 구리이온(II)이 존재하는 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 본 발명의 검출방법에 의하면 구리이온(II)의 검출도 가능하다.
도 1은 본 발명의 구리이온(II) 검출방법의 검출원리를 예시적으로 보여준다. 도 1을 참조하여 본 발명의 구리이온 검출방법을 구체적으로 설명한다. 아자이드 그룹을 포함하는 형광체(azide-functionalized fluorophore), 알킨 그룹을 포함하는 소광체(alkyne-functionalized quencher) 및 환원제가 존재하는 조건에서 구리이온(Cu2+)을 함유하는 시료가 첨가되면, 환원제에 의하여 Cu2+가 Cu1+로 환원되고, 환원된 Cu1+에 의한 촉매반응을 통하여 형광체의 아자이드 그룹과 소광체의 알킨 그룹 사이에 사이클로에디션 반응이 일어난다. 이에 의하여 형광체와 소광체의 거리가 매우 가까워짐에 따라 형광체-소광체 소광 메커니즘에 의해 형광체의 형광세기가 급격히 감소하게 되고, 이러한 소광 정도를 확인함으로써 구리이온을 검출하게 된다. 아자이드 그룹과 알킨 그룹은 Cu(I)이온에 의해 선택적으로 반응되므로, 다른 금속이온이 혼합되어 있더라도 구리이온만을 선택적으로 검출할 수 있으며, 구리이온의 정성 및 정량적 분석이 가능하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 구리이온 킬레이트제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 환원제를 포함하는 상기 구리이온 검출용 조성물 또는 환원제를 포함하는 상기 형광화학센서에 시험물질과 구리이온(Cu2+)을 동시에 또는 순차적으로 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 형광체의 소광을 확인하는 단계.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 구리이온 킬레이트제의 킬레이트 효과 확인 방법을 제공한다:
(a) 환원제를 포함하는 상기 구리이온 검출용 조성물 또는 환원제를 포함하는 상기 형광화학센서에 구리이온 킬레이트제와 구리이온(Cu2+)을 동시에 또는 순차적으로 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 형광체의 소광을 확인하는 단계.
본 발명에 따르면, 시험물질이 구리이온 킬레이팅 효과를 보이지 않으면 형광체의 소광이 일어나게 되며, 반대로 시험물질이 구리이온 킬레이팅 효과를 보인다면 형광체의 형광세기에 변화가 없거나, 실질적으로 감소하지 않게 된다. 본 명세서에서 사용된 용어, "실질적으로 감소하지 않는다"의 의미는 시험물질에 의하여 형광체의 형광세기가 감소되긴 하나 감소 정도가 비-구리이온 킬레이트제에 의한 형광감소 정도에 비하여 작은 경우를 의미한다.
따라서, 시험물질 또는 구리이온 킬레이트제 처리 후, 형광체의 소광을 정성적 또는 정량적으로 확인 및 분석함으로써 구리이온 킬레이트제를 고속대량 스크리닝(high throughput screening) 하거나, 기존의 구리이온 킬레이트제의 킬레이팅 효과를 평가할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 구리이온(I)의 존재 하에서 선택적으로 결합하는 클릭케미스트리를 기반으로 높은 민감도로 간편하고 신속하게 구리이온을 검출할 수 있으며, 형광체-소광체 소광 시스템(fluorophore dye-quehcer quenching system)을 사용하여 신호 대 잡음 비율(signal-to-noise ratio)과 민감도가 우수하다.
(ii) 본 발명은 수용액과 유기용매에 모두 용해되기 때문에 모든 용매에서 구리이온을 검출할 수 있으며, 강가, 호수, 바다 등의 수질과 혈장, 혈청 및 소변 등의 생체 샘플에서도 구리이온을 검출하는데 응용이 가능하다.
(iii) 본 발명은 기존의 구리이온 킬레이트제의 효능 평가와 새로운 구리이온 킬레이트제 개발을 위한 고속대량 스크리닝(high throughput screening)에 응용가능하다.
(iv) 본 발명은 세포내 또는 체내 혈청에 존재하는 구리이온을 정성 및 정량적으로 검출이 가능하며, 질환의 진단키트로 응용가능하다.
도 1은 본 발명의 검출원리의 일예를 보여준다.
도 2는 본 발명의 센서가 다양한 금속이온 중 구리이온에만 선택적으로 반응함을 보여준다.
도 3은 본 발명의 센서의 구리이온 검출에 소요되는 시간을 보여준다.
도 4는 본 발명의 센서가 금속 혼합물에서 구리이온에만 선택적으로 반응함을 보여준다. 빨강 막대: Li+, Ca2+, Ni+ 및 Hg2+의 혼합물; 녹색 막대: Mg2+, K+, Pd2+ 및 Co2+의 혼합물; 파랑 막대: Mn2+, Cd2+, Fe2+ 및 Ag+의 혼합물.
도 5는 본 발명의 센서의 검출한계를 보여준다.
도 6은 본 발명의 센서로 구리 킬레이트제의 효능을 평가할 수 있음을 보여준다.
도 7은 본 발명의 센서로 세포 내 구리이온을 검출할 수 있음을 보여준다.
도 8은 본 발명의 센서로 혈청 내 구리이온의 양을 정량할 수 있음을 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 아자이드 그룹을 포함하는 형광체 합성
아자이드 그룹을 포함하는 형광체의 합성을 반응식 3과 같이 실시하였다. 구체적으로, 11 mg의 Cy5.5 NHS 에스터와 40 mg의 아지도-PEG10-아민(Azido-PEG10-amine)을 2 ㎖의 디클로로메탄(dichloromethane)에 녹여 12시간 동안 반응시킨 후, 유기용매를 회전증발기로 제거한 다음 얻어진 물질을 반분취 HPLC(semipreparative HPLC)를 통하여 정제하고, 합성된 화합물을 질량분석기로 확인하였다. 측정된 분자량은 1133.7이었으며, 순도는 98% 이상이었다.
반응식 5
Figure 112013051641599-pat00007

실시예 2. 알킨 그룹을 포함하는 소광체 합성
알킨 그룹을 포함하는 소광체의 합성을 반응식 4와 같이 실시하였다. 구체적으로, 11 mg의 BHQ3 NHS 에스터와 8.9 ㎕의 프로파질아민(propargylamine)을 1.5 ㎖의 디클로로메탄에 녹여 12시간 동안 반응시킨 후, 유기용매를 회전증발기로 제거한 다음 얻어진 물질을 반분취 HPLC(semipreparative HPLC)를 통하여 정제하고, 합성된 화합물을 질량분석기로 확인하였다. 측정된 분자량은 584.3이었으며, 순도는 98% 이상이었다.
반응식 6
Figure 112013051641599-pat00008

시험예 1. 구리이온 검출의 선택성 평가
구리이온을 선택적으로 검출할 수 있는지를 평가하기 위하여, 아지도-PEG10-Cy5.5(25 μM)와 알킨-BHQ3(25 μM), 소듐 아스코빅(sodium ascorbate, 1 μM)이 함유된 PBS(pH 7.0) 용액에 Li+, Ca2+, Ni+, Hg2+, Mg2+, K+, Na+, Pd2+, Co2+, Mn2+, Cd2+, Fe2+, Ag+ 또는 Cu2+ 이온을 첨가하여 2시간 동안 반응시킨 후, 형광을 측정하였다. 이때, 구리이온 농도는 50 nM 이었으며, 다른 금속이온 농도는 0.5 mM이었다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 다른 금속이온의 첨가에 의해서는 형광이 감소되지 않았으나, 구리이온의 첨가에 의해서는 형광세기가 현저히 감소하였다. 이러한 결과는, 본 발명의 센서가 구리이온만을 선택적으로 검출할 수 있음을 보여준다.
시험예 2. 구리이온 검출의 반응성 평가
구리이온을 얼마나 빠르게 검출할 수 있는지를 평가하기 위하여, 아지도-PEG10-Cy5.5(25 μM)와 알킨-BHQ3(25 μM), 소듐 아스코빅(1 μM)이 함유된 PBS (pH 7.0) 용액에 Cu2+ 이온(50 nM)을 첨가하여 5, 10, 20, 30, 60 및 120분에 각각 의 형광세기를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 반응시간이 지남에 따라 형광의 세기가 현저히 감소하였으며, 반응시간 30분 이후에는 형광의 감소가 더 이상 큰 차이가 없었다. 이러한 결과는, 본 발명의 센서는 구리이온을 30분 정도에 빠르게 검출할 수 있음을 보여준다.
시험예 3. 구리이온 검출의 특이성 확인
구리이온 검출 센서가 다양한 종류의 금속이온의 혼합물에서도 구리이온을 특이적으로 검출할 수 있는지를 평가하였다. 아지도-PEG10-Cy5.5(25 μM)와 알킨-BHQ3(25 μM), 소듐 아스코빅(1 μM)이 함유된 PBS(pH 7.0) 용액에 4종류의 금속혼합물 3 그룹(그룹 1: Li+, Ca2+, Ni+, Hg2+; 그룹 2: Mg2+, K+, Pd2+, Co2+; 그룹 3: Mn2+, Cd2+, Fe2+, Ag+)에 각각 Cu2+ 이온(50 nM)을 첨가한 경우와 무첨가한 경우로 나누어 30분 동안 반응시킨 다음 형광을 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 구리이온이 혼합되지 않은 4종류의 금속혼합물에서는 형광이 감소하지 않았으나, 구리이온을 첨가한 경우에는 형광의 세기가 현저히 감소하였다. 이러한 결과는, 본 발명의 구리이온 검출 센서는 다양한 금속이온이 혼합되어 있더라도 Cu2+ 이온이 존재하지 않는 경우에는 반응을 나타내지 않으며, 구리이온에만 특이적으로 반응할 수 있음을 보여준다.
시험예 4. 구리이온 검출의 검출한계 평가
구리이온 검출 센서의 구리이온 검출한계를 평가하기 위하여, 아지도-PEG10-Cy5.5(25 μM)와 알킨-BHQ3(25 μM), 소듐 아스코빅(1 μM)이 함유된 PBS(pH 7.0) 용액에 서로 다른 농도의 Cu2+ 이온을 첨가한 후 30분간 반응시킨 후 형광의 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 구리이온을 1 nM에서 5 fM로 처리하였을 때 형광의 감소가 분명히 관찰되었다. 이러한 결과는, 본 발명의 구리이온 검출 센서는 fM 농도범위까지도 구리이온을 검출할 수 있음을 보여준다.
시험예 5. 구리 킬레이트제의 효능 평가
구리이온 검출 센서를 이용하여 구리이온 킬레이트제의 효능을 평가하기 위하여, 아지도-PEG10-Cy5.5(25 μM)와 알킨-BHQ3(25 μM), 소듐 아스코빅(1 μM)과 구리이온(50 nM)이 함유된 PBS(pH 7.0) 용액에 구리이온 킬레이팅 효과가 없는 시약인 시스테인(Cysteine), 아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 또는 카페익산(caffeic acid)과 구리이온 킬레이트제인 테트라에틸렌펜타민(tetraethylenepentamine, TEPA), 트리에틸렌테트라민(triethylenetetramine, TETA), 에틸렌디아민테트라아세틱산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 또는 페니실아민(penicillamine, PA)을 각각 0.5 nM 첨가한 후 30분간 반응시킨 다음 형광을 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 구리이온 킬레이팅 효과가 없는 세 가지 화합물인 시스테인, 아세틸시스테인 및 카페익산을 첨가하였을 경우에는 형광이 현저히 감소하였으나, 구리 킬레이트제인 TEPA, TETA, EDTA 및 PA를 첨가하였을 때에는 형광이 전혀 감소되지 않거나 조금 감소되었다. 이러한 결과는, 본 발명의 구리이온 검출 센서를 이용하여 구리 킬레이트제를 스크리닝 하거나, 구리이온 킬레이트제의 효능을 정성 또는 정략적으로 평가할 수 있음을 보여한다.
시험예 6. 세포 내 구리이온 검출
세포 내 존재하는 구리이온에 대한 검출효능을 평가하기 위하여, 배양된 HEK 293T에 100 μM의 CuSO4를 처리한 후 Cu2+이온이 Cu1+로 환원되는 충분한 시간인 12시간 동안 배양한 다음, 세포를 배양액으로 세척한 후 아지도-PEG10-Cy5.5(25 μM)와 알킨-BHQ3(25 μM)를 20분간 처리하고, 다시 세포 배양액으로 세척한 뒤 4시간동안 더 배양하였다. 세포 내 구리이온 검출은 공초점 주사 레이저 현미경을 통하여 관찰하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 구리이온 검출용 센서만 처리된 그룹에서는 강한 형광이 관찰되었으나, 구리이온과 센서가 모두 처리된 그룹에서는 형광의 세기가 감소하였다. 이는, 세포 내로 흡수된 아지도-PEG10-Cy5.5와 알킨-BHQ3가 세포 내에 존재하는 구리이온의 촉매역할을 통해 화학적 결합이 되어 형광의 세기가 감소한 것이며, 이러한 결과는 본 발명의 구리이온 검출용 센서가 세포 내 존재하는 구리이온을 검출할 수 있음을 보여준다.
시험예 7. 혈청에서 구리이온의 정량
혈청에서 구이이온을 검출할 수 있는지를 평가하기 위하여, BALB/C 마우스에 5 mg/kg 용량으로 꼬리정맥을 통하여 CuSO4를 투여한 후, Cu2+ 이온이 Cu1+로 환원되는 충분한 시간인 2시간 후에 마우스의 대정맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청에서 구리이온을 정량하기 위하여, 50배 희석된 혈청과 아지도-PEG10-Cy5.5(25 μM)와 알킨-BHQ3(25 μM)를 30분 동안 반응시킨 후 형광세기를 측정하였다. 혈청에서의 구리이온 농도는 10 nM 에서 60 nM 범위에서 얻어진 구리이온 표준곡선(standard curve)으로부터 정량하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 정상 마우스와 구리이온이 투여된 마우스의 혈청에서 검출된 구리이온의 양은 0.85 ㅁ 0.32 μM 및 1.74 ㅁ 0.29 μM로 측정되었다. 이러한 결과는, 본 발명의 구리이온 검출 센서를 이용하여 혈청의 구리이온 농도를 알아낼 수 있음을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 형광체; 및 상기 형광체의 발광효과를 흡수하여 소광효과를 나타내는 소광체를 포함하고, 상기 형광체 및 소광체는 각각 아자이드(azide) 그룹 또는 알킨(alkyne) 그룹을 포함하되, 형광체가 아자이드 그룹을 포함하는 경우 소광체는 알킨 그룹을 포함하고, 형광체가 알킨 그룹을 포함하는 경우 소광체는 아자이드 그룹을 포함하는 것을 특징으로 하는 구리이온 검출용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 형광체는 적색 또는 근적외선의 형광을 발광하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 형광체는 시아닌(Cyanine), 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODIPY), 테트라메틸로드아민(Trtramethylrhodamine), 알렉사(Alexa) 및 알로피코시아닌(allopicocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 소광체는 블랙홀 소광체(blackhole quencher, BHQ) 또는 블랙베리 소광체(blackberry quencher, BBQ)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 구리이온 검출용 조성물을 포함하는 구리이온 검출용 형광화학센서.
  6. 다음의 단계를 포함하는 구리이온 검출용 조성물의 제조방법:
    (a) 아자이드 그룹 또는 알킨 그룹이 도입된 형광체를 얻는 단계;
    (b) 알킨 그룹 또는 아자이드 그룹이 도입된 소광체를 얻는 단계; 및
    (c) 단계 (a)에서 얻은 아자이드 그룹이 도입된 형광체와 단계 (b)에서 얻은 알킨 그룹이 도입된 소광체, 또는 단계 (a)에서 얻은 알킨 그룹이 도입된 형광체와 단계 (b)에서 얻은 아자이드 그룹이 도입된 소광체를 혼합하는 단계.
  7. 다음의 단계를 포함하는 시료 내 구리이온의 선택적 검출방법:
    (a) 제 1 항의 구리이온 검출용 조성물 또는 제 5 항의 구리이온 검출용 형광화학센서에 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 형광체의 소광을 확인하는 단계.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 형광체의 소광은 시료 내에 구리이온이 존재하는 경우에 발생하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 시료는 수용액, 유기용액, 세포, 세포 용해물(cell lysate), 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 타액, 뇨, 정액 및 복수로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  10. 다음의 단계를 포함하는 구리이온 킬레이트제의 스크리닝 방법:
    (a) 환원제를 포함하는 제 1 항의 구리이온 검출용 조성물 또는 환원제를 포함하는 제 5 항의 구리이온 검출용 형광화학센서에 시험물질과 구리이온(Cu2+)을 동시에 또는 순차적으로 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 형광체의 소광을 확인하는 단계.
  11. 다음의 단계를 포함하는 구리이온 킬레이트제의 킬레이트 효과 확인 방법:
    (a) 환원제를 포함하는 제 1 항의 구리이온 검출용 조성물 또는 환원제를 포함하는 제 5 항의 구리이온 검출용 형광화학센서에 구리이온 킬레이트제와 구리이온(Cu2+)을 동시에 또는 순차적으로 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 형광체의 소광을 확인하는 단계.
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