KR101468055B1 - 비스-ｍｅｔ 히스톤 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩타이드 결합을 통해 성숙한 진핵생물 히스톤에 연결된 제 1 및 제 2 N-말단 아미노산 잔기들로서 2개의 메티오닌 잔기로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 상기 핵산 분자를 함유하는 벡터, 벡터에 의해 변형된 숙주, 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드 및 약학적 및 진단 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 질환의 치료용 조성물의 제조를 위한 핵산 분자, 벡터, 숙주 및 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 샘플에서 핵산 또는 폴리펩타이드의 존재를 검사하는 방법 또는 키트에 관한 것이다.

비스-met 히스톤, 진핵생물, 핵산 분자, 폴리펩타이드

Description

비스-ｍｅｔ 히스톤{Bis-met histones}

본 발명은 펩타이드 결합을 통해 성숙한 진핵생물 히스톤에 연결된 제 1 및 제 2 N-말단 아미노산 잔기로서 2개의 메티오닌 잔기로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 상기 핵산 분자를 함유하는 벡터, 벡터에 의해 변형된 숙주, 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드 및 약학적 및 진단 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 질환의 치료용 조성물의 제조를 위한 핵산 분자, 벡터, 숙주 및 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 샘플에서 핵산 또는 폴리펩타이드의 존재를 검사하는 방법 또는 키트에 관한 것이다.

다양한 문헌이 본 명세서 전체에서 인용된다. 제조자의 매뉴얼을 포함하는 상기 문헌의 개시된 내용은 전문이 참조를 위해 본 발명에 포함된다.

현재, 히스톤과 같은 재조합 단백질의 대량 생산에 막대한 경제적 이익이 있다. 다량의 재조합 단백질의 생산은 특성과 기능에 대한 연구를 위한 충분한 양의 단백질을 제공하기 위한 목적뿐만 아니라 치료 용도로 다량의 단백질의 공급에 이익이 있다.

재조합 단백질의 성공적인 대량 생산과 정제를 위해 광범위한 변수들이 고려되었다. 중요한 변수들은 발현 조건, 번역 제어 및 mRNA 안정성, 단백질 표적화 및 분해를 포함한다(Makrides, S., Microbiological Reviews, 1996: 512).

재조합 단백질의 생산, 탐지 및 정제를 개량하기 위한 한 방법은 매우 다양한 융합 파트너를 사용하는 것이다(Makrides, S.,Microbiological Reviews, 1996: 512). 재조합 단백질의 정제와 탐지를 위한 친화성-태그를 포함하는 정교한 기술들이 개발되었다. 이런 친화성 태그는 더욱 효과적인 정제를 가능하게 하며 태그를 기초로 한 재조합 단백질의 쉬운 탐지를 가능하게 하는 유익한 특징들을 결합한다. 그러나, 많은 경우에, 다소 큰 친화성 태그의 첨가는 단백질 번역, 접힘 및 활성에 대한 원치 않는 효과 때문에 불리할 수 있다. 특히 치료 분야에서 사용하는 경우, 친화성 태그의 연속적인 제거가 종종 필요하여, 친화성 태그가 단백질에 제공하는 긍정적인 효과(예를 들어, 쉬운 탐지)의 일부를 감소시킨다(Gellissen, G. "Production of Recombinant Proteins", 2005, WILEY-VCH Verlag GmbH&Co., KgaA, Weinheim).

각 발생기의 폴리펩타이드의 N 말단에 메티오닌 잔기를 합체하는 것은 원핵생물뿐만 아니라 진핵생물에 의해 사용된 범용 번역 개시 신호의 일부를 구성한다. 대장균에서, 이 N-말단 메티오닌 잔기의 제거는 세포질 효소 메티오닌 아미노펩티다아제(map)에 의해 이루어진다(Hirel et al., Biochemistry, 1989, 86:8247).

원핵생물, 예를 들어, 대장균에서 생산된 재조합 진핵 단백질의 N-말단 메티오닌 잔기의 효과적인 가공은 메티오닌에 인접한 아미노산에 의존하는 것으로 나타났다. 비록 아미노산 중 일부에 대해 상반된 데이터가 있지만 분열 가능성은 작고 대전되지 않은 아미노산 잔기 Ala, GIy, Pro, Ser, Val, Cys 및 Thr에 대해 최고라는 것에는 일치하는 것 같다. 대형 측면 사슬은 메티오닌 가공에 불리한 것 같다(Hirel et al., Biochemistry, 1989, 86:8247; Frottin et al., MoI. & Cell. Proteomics, 2006, 12:2336; Gellissen, G. "Production of Recombinant Proteins", 2005, WILEY-VCH Verlag GmbH&Co., KgaA, Weinheim).

N-말단 메티오닌의 가공은 단백질 안정성에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되나(Giglione et al., EMBO J., 2003, 1 :13) 예를 들어, MEF-2C 인간 헤모글로빈, 인터루킨-2, RNase A 동족체 또는 개구리 리보뉴클레아제에 대해 보여준 것 같이 단백질의 정확한 기능에도 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다(Meierhans and Allemann, J. Biol. Chem., 1998, 273:26052; Adachi, K. et al., Protein Expr. PuMf., 2000, 20:37; Endo, S. et al., Biochemistry, 2001 , 40:914; Boix, E. et al., J. MoI. Biol., 1996, 257 :992 ; Liao, Y.D. et al., Nucleic Acids Res., 2003, 31 :5247; Varshavsky, A., Proc, Natl. Acad. Sci., 1996, 93:12142). 왜 자연이 메티오닌 잔기를 제거하는 특별한 효소 시스템을 보유하는 지에 대한 다른 이론은 이런 필수 아미노산을 절약하기 위해 세포 메티오닌 풀을 재활용하는 것이다(Hirel et al., Biochemistry, 1989, 86:8247).

EP1254166은 대장균에서 히스톤 단백질의 재조합 생산을 개시한다. 인간 단백질의 이런 재조합 생산은 치료분야에 유익한 것으로 생각될 뿐만 아니라 인간 또는 소 흉선 제조와 비교해서 더욱 효과적이고 비용 효율적이다. 또한, 단백질의 재조합 생산은 생산 공정 동안 우수한 품질 제어를 가능하게 한다.

Pyo 등(Pyo, S.H. et al., Protein Expr. Purif., 2001 , 1 :38)은 재조합 단백질의 대용량 정제를 위한 효과적인 방법을 개발하기 위해 히스톤의 강 염기성 특성을 사용하여 대장균에서 재조합 히스톤 H1.5의 생산을 기술한다.

비록 재조합 단백질의 대량 생산이 종래 기술에도 있었지만 그럼에도 불구하고 최종 재조합 단백질을 탐지하는 적절한 방법을 찾을 상당한 요구가 존재한다. 상기한 대로, His-태그와 같은 친화성 태그의 사용은 당업계에 널리 퍼져 있으나 치료적 사용을 위한 단백질의 생산은 문제가 될 수 있다.

따라서, 본 발명을 기초로 하는 기술적 문제는 생산과 탐지를 간단하게 하는 개량된 재조합 진핵생물 폴리펩타이드를 제공하는 것이었다. 이런 기술적 문제에 대한 해결책은 청구항들에서 특징을 나타낸 실시예들에 의해 성취된다.

따라서, 본 발명은 펩타이드 결합을 통해 (ab) 성숙한 진핵생물 히스톤에 연결된 제 1 및 제 2 N-말단 아미노산 잔기로서 (aa) 2개의 메티오닌 잔기로 이루어진 (a) 폴리펩타이드를 암호화하고 펩타이드 결합을 통해 (a)의 성숙한 진핵생물 히스톤과 적어도 80% 서열 동일성을 가지며 필수적으로 이의 생물학적 활성을 보유한 (bb) 성숙한 진핵생물 폴리펩타이드에 연결된 제 1 및 제 2 N-말단 아미노산 잔기로서 (ba) 2개의 메티오닌 잔기로 이루어진 (b) 폴리펩타이드를 암호화하거나 엄격한 조건하에서 (a) 또는 (b)의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 상보적 가닥으로 (c) 혼성화하는 핵산 분자에 대한 제 1 실시예에 관한 것으로, 상기 핵산 분자는 적어도 2개의 N-말단 메티오닌 잔기를 가지며 필수적으로 (a) 또는 (b)의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 암호화한다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 합성 또는 반합성 형태인 cDNA 또는 게놈 DNA, RNA(예를 들어, mRNA)와 같은 DNA, DNA 또는 RNA의 합성 또는 반합성 유도체(예를 들어, PNA 또는 포스포로티오에이트) 및 센스 및 안티센스 가닥인 혼합 폴리머를 포함한다. 핵산 분자는 당업자가 쉽게 알 수 있듯이, 추가의 비-천연 또는 유도 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 한 바람직한 실시예에, 핵산 분자는 게놈 DNA를 포함하는 DNA이다.

본 발명의 목적을 위해서, 펩타이드 핵산(PNA)는 DNA 유사체의 폴리아마이드 형태이고, 아데닌, 구아닌, 티민 및 사이토신에 대한 모노머 단위는 구입할 수 있다(Perceptive Biosystems). 인, 인 산화물 또는 데옥시리보오스 유도체와 같은 DNA의 특정 성분은 PNAs에 존재하지 않는다. Nielsen et al., Science 254:1497 (1991); and Egholm et al., Nature 365:666 (1993)에 개시된 대로, PNAs는 상보적 DNA 가닥에 특이적이고 단단하게 결합되며 뉴클레아제에 의해 분해되지 않는다. 사실, PNA는 DNA 자체가 결합하는 것보다 더욱 강하게 DNA에 결합한다. 이것은 두 가닥 사이에 정전기 반발이 없으며 폴리아마이드 주쇄가 더욱 유연하기 때문이다. 이것 때문에, PNA/DNA 이합체는 DNA/DNA 이합체보다 더 다양한 엄한 조건하에서 결합하여, PNA/DNA 이합체의 다중 혼성화를 더 쉽게 수행하게 한다. 강한 결합 때문에 더 작은 프로브가 DNA에 사용될 수 있다. 또 한, 단일 염기 불일치(sing base mismatches)는 PNA/DNA 혼성화로 측정될 수 있는데 이는 PNA/DNA 15-mer에서 단일 불일치는 DNA/DNA 15-mer 이합체에 대해 8°-20℃ vs. 4°-16℃ 만큼 용융점(T.sub.m) 낮추기 때문인 것 같다. 또한, PNA에 전하 그룹의 부존재는 혼성화는 낮은 이온 강도에서 수행될 수 있고 분석하는 동안 염에 의한 간섭을 줄인다는 것을 의미한다.

본 발명에 사용된 "폴리펩타이드"라는 용어는 30개 이상의 아미노산으로 이루어진 분자들을 그룹을 나타낸다. 본 발명에 따라, 폴리펩타이드의 그룹은 "단백질"을 포함한다. 폴리펩타이드는 즉, 하나 이상의 폴리펩타이드 분자로 이루어진 다이머, 트라이머 및 더 큰 올리고머를 더 형성할 수 있다. 이런 다이머, 트라이머 등을 형성하는 폴리펩타이드 분자는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 상응하는 더 높은 등급 구조는 결과적으로, 호모- 또는 헤테로다이머, 호모- 또는 헤테로트라이머 등으로 불린다. 호모- 또는 헤테로다이머 등은 "단백질"이란 용어의 정의에 해당된다. 폴리펩타이드는 융합 단백질일 수 있으며, 여기서 융합 파트너는 본 발명의 폴리펩타이드의 C-말단에 결합된다. 위에서 정의한 대로 히스톤 서열 또는 단편 또는 이의 변형물이 아닌 상기 융합 단백질의 이런 성분들은 하나 이상의 특정 세포 형태를 표적화하는 변형된/강화된 안정성, 변형된/강화된 용해도 및/또는 능력과 같은 원하는 특성을 제공하거나 다른 생물학적 활성을 제공하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 세포 표면 마커에 특이적인 항체를 갖거나 상기 항체의 항원-인식 단편을 가진 융합 단백질이 고려된다. 게다가, 아미노산(들) 및 /또는 폴리펩타이드 결합(들)이 기능성 유사체로 대체되는 폴리펩타이드의 펩타이드 모방체가 본 발명에 포함된다. 이런 기능성 유사체는 셀레노시스테인과 같은 20개 유전자-암호화 아미노산 이외의 모든 공지된 아미노산을 포함한다. "폴리펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 자연적으로 변형된 폴리펩타이드/단백질을 의미하고 여기서 변형은, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등에 의해 일어난다. 이런 변형은 당업계에 주지되어 있다.

본 발명에 따라 "메티오닌"이란 용어는 당업자에게 주지되어 있다. 메티오닌은 표준 유전자 코드에서 코돈 AUG에 의해 암호화된 필수 아미노산이다. 상기 메티오닌은, 진핵생물에서 발견된 대로, 본 발명의 한 바람직한 실시예에 기여하고 있다. 또한 메티오닌이란 용어의 의미에 포함되고 본 발명의 다른 실시예에 기여하고 있는 것은 원핵생물의 N-포밀메티오닌이다.

본 발명에서 사용된 "제 1 및 제 2 N-말단 아미노산 잔기"라는 용어는 본 발명의 폴리펩타이드의 1 및 2 위치에서 발견된 아미노산 잔기를 의미한다. 이런 잔기는 또한 N 말단에서 최종 및 끝에서 두 번째 잔기로 당업계에서 불린다. 다시 말하면, 제 1 메티오닌 잔기는 N-말단에 메티오닌을 포함하는 폴리펩타이드의 최초 번역 생성물의 N-말단에 위치한다.

본 발명에서 사용된 "펩타이드 결합"이라는 용어는 당업자에게 주지되어 있고 두 아미노산 분자들 사이에 형성된 화학적 결합을 의미하며 여기서 한 아미노산의 카복실기는 다른 아미노산의 아미노기와 반응한다.

본 발명에 따라 "성숙한 진핵생물 히스톤"이란 용어는 이의 최초 N-말단 메티오닌이 없는 히스톤을 의미한다. 당업자에게 주지된 것과 같이, 폴리펩타이드는 번역된 폴리펩타이드의 N 말단의 최초 아미노산 잔기로서 메티오닌의 포함을 유도하는 범용 번역 개시 신호를 사용하여 번역된다. 진핵생물 및 부분적으로 원핵생물에서, 이 N-말단 메티오닌은 분열되어 폴리펩타이드의 "성숙"을 일으킨다.

본 발명에 따라, "히스톤"이란 용어는 코어 히스톤 H2A(인간 H2A에 대한 Swiss-Prot 넘버는 P02261이다), H2B(인간 H2B에 대한 Swiss-Prot 넘버는 P02278이다), H3(인간 H3.1에 대한 Swiss-Prot 넘버는 P16106이다) 및 H4(인간 H4에 대한 Swiss-Prot 넘버는 P02304이다) 및 H1 링커 히스톤 집단(이하 Swiss-Prot 넘버 참조)을 포함하는 단백질들의 그룹을 의미한다. 히스톤은 세포 핵의 구조 성분으로서 관행적으로 알려져 있고 DNA가 감기는 "스풀"로 작용하며 유전자 제어에 중요한 역할을 한다. 그러나, 히스톤은 광범위한 다 기능성을 나타낸다(Reichhart, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1985, 82:4871 ; Reichhart, R. et ai, FEBS 1985, 188: 63). 예를 들어, 히스톤은 호르몬과 제어 인자로서 전신에 작용하는 것으로 밝혀졌고 중요한 보호 기능의 운반체이다.

이들의 광범위한 다기능성 때문에 히스톤은 여러 치료 방법에서 중요하게 되었다. 예를 들어, 히스톤 H1, H2A 및 H2B는 말초 건강한 림프구를 자극하는 것으로 밝혀졌다(Cebecauer, L. et al. Rheumatologia 1991 , 5:107). 히스톤 H1는 근아세포의 확산을 자극함으로써 근육재생을 촉진하고(Duce, J.A. et al. J. MoI. Biol. 2006, 361 :493), 아밀로이드 유사 섬유체로 질환의 상태를 조절하고(Semina et al. Radiation Biology and Oncology, 1994,34:544) 줄기세포를 자극하는 것으로 밝혀졌다. 히스톤 H1은 궤양성 대장염 및 이의 임상적 아종의 진단, 예방 및 치료에 사용될 수 있다(Braun, J. et al., US patent 6,074,835). 히스톤 H1뿐만 아니라 코어 히스톤은 뇌혈장벽을 통해 생물학적 활성 물질들을 운반할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Pardridge.W.M. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1989, 251 :821). 또한, 유럽특허 0392315는 히스톤 H1 및 이의 아종의 호르몬 또는 호르몬 유사 활성을 증명한다. 전신성 홍반성 낭창을 포함하는 자가면역질환에서 히스톤의 역할은 유럽특허 0532979 또는 특허출원 WO 03/044054에 증명되었다. 히스톤의 다른 기능은 항생제 기능(미국특허 6565854 및 6884423) 및 항바이러스 기능(WO 2005/112975)을 포함하는 것으로 알려졌다. 또한, 혈소판 응집의 예방(WO 02/067907) 또는 혈소판감소증(thrombocytopenia)의 치료(WO/2006/119912)에서 히스톤의 용도가 알려졌다.

히스톤은 암의 치료에 중추적 역학을 하는 것으로 밝혀졌다. 바니 등(Vani, G. et al., Chemotherapy 2003, 49:252)은, 예를 들어, 히스톤 H1은 실험용 유방암을 가진 동물들에서 면역 상태와 면역 반응을 향상시키는 것을 증명한다. 또한 암을 앓고 있는 개인들에서 항산화 상태는 히스톤 H1에 의해 강화되는 것으로 증명되었다(Vani, G. et al., Chemotherapy 2005, 51 : 57). 히스톤 H1에 의한 인간 에스트로겐 민감성 유방암 세포들의 치료는 에스트로겐 수용체들의 수를 감소시키는 것으로 증명되었다(Vani, G. and Devi, CS. , Mol. Cell Biochem. 2005, 272:151). 히스톤 H1 또는 H2A:H2B에 의한 방사능-유도 백혈병 또는 암의 치료는 미국특허 5812257에 도시된다. 히스톤은 병원성 세포외 DNA 및 전신 순환 병원성 뉴클레오좀을 제거함으로써 암의 치료에 잠정적으로 효과가 있을 수 있다(Le Lann-Terhsse et al. (1997) Cancer Immunol Immunother, 43:337).

본 발명에 따라 핵산 분자는 펩타이드 결합을 통해 (a)의 성숙한 진핵생물 히스톤과 적어도 80% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90% 서열 동일성을 가지며 필수적으로 이의 생물학적 활성을 보유하는 성숙한 진핵생물 폴리펩타이드에 연결된 제 1 및 제 2 N-말단 아미노산으로서 2개의 메티오닌 잔기로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 더욱 더 바람직하게는 핵산 분자는 펩타이드 결합을 통해 (a)의 성숙한 진핵생물 히스톤과 적어도 95% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성을 가지며 필수적으로 이의 생물학적 활성을 보유하는 성숙한 진핵생물 폴리펩타이드에 연결된 제 1 및 제 2 N-말단 아미노산으로서 2개의 메티오닌 잔기로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.

본 발명에 따라, "백분율 서열 동일성"이란 용어는 핵산 또는 아미노산 서열의 전체 길이(또는 이의 전체 비교 부분)를 구성하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 수와 비교해서 둘 이상이 정렬된 핵산 또는 아미노산 서열의 동일한 뉴클레오티드/아미노산의 일치("hits")의 수를 기술한다. 다른 용어로, 배열을 사용하여, 둘 이상의 서열 또는 하부서열들의 경우, (하부)서열들은 비교 창 위에서 또는 당업계에 공지된 대로 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정된 대로 지정된 영역 위에서 최대 유사성을 위해 비교되고 배열되거나 수동으로 배열되고 시각으로 검사될 때, 동일한(예를 들어, 80% 또는 85% 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율은 측정될 수 있다. 이 정의는 검사 서열의 보체에 적용된다. 본 발명에 따른 바람직한 핵산 분자/폴리펩타이드는 기술된 동일성이 길이가 적어도 약 15 내지 25개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역 위에, 더욱 바람직하게는 길이가 약 50 내지 100 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역 위에 존재하는 것들이다. 당업자는, 당업계에 공지된 대로, 예를 들어, CLUSTALW 컴퓨터 프로그램(Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) 또는 FASTA(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. ScL, 1988, 85; 2444)를 사용하여 서열들 사이의 백분율 서열 동일성을 어떻게 측정하는지 알 것이다.

비록 FASTDB 알고리즘은 계산에서 통상적으로 서열들의 내부 불일치 결실 또는 첨가, 즉,갭을 고려하지 않으나, % 서열 동일성의 과대평가를 피하기 위해 수동으로 수정될 수 있다. 그러나, CLUSTALW는 동일성 계산에서 서열 갭을 고려한다. BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘은 당업자가 사용할 수 있다(Altschul, Nucl. Acids Res., 1977, 25:3389). 핵산 서열에 대한 BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 10의 수학적 기대치(E), M=5, N=4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTN 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이(W), 10의 수학적 기대치(E)를 사용한다. BLOSUM62 스코어링 매트릭스(Henikoff, Proc. Natl. Acad. ScL, 1989, 89:10915)는 50의 배열(B), 10의 수학적 기대치(E), M=5, N=4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 모든 이런 프로그램이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 상기 프로그램의 전부는 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

본 발명에 따라, 활성은 상기 항목(a)에 인용된 상응하는 성숙한 진핵생물 히스톤의 생물학적 활성의 적어도 20%을 얻는 경우에 필수적으로 보유된다. 바람직하게는, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75% 또는 적어도 80%의 활성을 보유한다. 가장 바람직하게는 생물학적 활성은 충분하게, 즉, 100% 보유하는 것이다. (a)에 인용된 상응하는 성숙한 진핵생물 히스톤과 비교되어 증가된 생물학적 활성, 즉, 기준 히스톤의 100% 이상의 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 본 발명에 따른다. (폴리)펩타이드의 생물학적 활성을 측정하는 방법은 당업자에게 주지되어 있고 측정된 효소 활성, 세포독성, 사이토카인 방출, 용혈 또는 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히, 세포독성 검사는, 예를 들어, (폴리)펩타이드, 예를 들어, 히스톤에 의해 처리된 인비트로 또는 인비보 세포 배양액에 의한 검사이고 여기서 세포들의 사망률 기울기는 처리 후 세포 탐지 방법에 의해 측정된다. 생물학적 활성은 특히 항체의 경우에 ELISA 검사로 측정될 수 있다.

본 발명에서 사용된 "혼성하다/혼성화"라는 용어는 핵산 분자의 (부분) 상보적 가닥에 대한 핵산 분자에 쌍을 이루어 합성물을 형성하는 것을 의미한다.

어떻게 핵산 분자들로 혼성화 실험을 수행하는 지는 당업계에 주지되어 있다. 결과적으로, 당업자는 성공적인 혼성화를 가능하도록 사용해야 하는 혼성화 조건이 무엇인지 안다. 적절한 혼성화 조건의 설정은 Sambrook and Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), or Higgins and Hames (Eds.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985)과 같은 표준 교과서를 참조한다. 한 바람직한 실시예에서, 혼성화는 엄격한 조건하에서 이루어진다.

"엄격한 혼성화 조건"은 예를 들어, 4x SSC(600mM NaCl, 60mM 시트르산 나트륨)속에서 65℃에서 밤새 배양하고 1시간 동안 0.1x SSC 속에서 65℃에서 세척하는 것을 포함하는 조건을 의미한다. 선택적으로, 혼성화 조건은 50% 포름아마이드, 5x SSC(750mM NaCl, 75mM 시트르산 나트륨), 50mM 인산 나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 황산 덱스트란 및 20㎍/ml 변성되고 분열된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 속에서 42℃에서 밤새 배양하고 약 65℃에서 0.1 x SSC 속에서 필터를 세척하는 것을 포함한다. 상기 혼성화 조건은 당업자에게 "매우 엄격한 혼성화 조건"으로 공지되어 있다. 낮은 엄격한 혼성화 조건("혼성화를 위한 낮은 엄격한 조건")에서 본 발명의 핵산 분자에 혼성화하는 핵산 분자도 고려한다. 혼성화의 엄격함의 변화 및 신호 탐지는 포름아마이드 농도(낮은 백분율의 포름아마이드는 낮은 엄격함을 발생시킨다), 염 조건 또는 온도의 조작을 통해 주로 이루어진다. 예를 들어, 낮은 엄격한 조건은 4x SSC속에서 50℃에서 밤새 배양 또는 6X SSPE (2OX SSPE = 3M NaCl; 0.2M NaH₂PO4; 0.02M EDTA, pH 7.4), 0.5% SDS, 30% 포름아마이드, 100㎍/ml 연어 정자 차단 DNA를 포함하는 용액 속에서 37℃에서 밤새 배양하고 1x SSPE, 0.1% SDS로 50℃에서 세척하는 것을 포함한다. 또한, 더 낮은 엄격함을 얻기 위해서, 엄격한 혼성화 이후 수행되는 세척은 높은 염 농도(예를 들어, 5x SSC)에서 수행될 수 있다. 상기 조건의 변화는 혼성화 실험에서 백그라운드를 억제하는데 사용된 다른 차단제의 삽입 및/또는 치환을 통해 이루어질 수 있다. 통상적인 차단제는 덴하르트 시약, BLOTTO, 헤파린, 변성된 연어 정자 DNA 및 구입할 수 있는 전매 제제를 포함한다. 특정 차단제의 삽입은 이는 혼용성과 관련된 문제 때문에 상기한 대로 혼성화 조건의 변형을 필요로 할 수 있다. 이런 변형은 일반적으로 추가 노력 없이 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 혼성화 착물은 용액에(예를 들어, Cot 또는 Rot 분석) 또는 용액에 존재하는 한 핵산 서열과 고체 지지체(예를 들어, 세포들이 고정된 막, 필터, 칩, 핀 또는 유리 슬라이드) 상에 고정된 다른 핵산 서열 사이에 형성될 수 있다. 본 발명에서 인용한 실시예는 바람직하게는 높은 엄격한 조건 및 선택적으로 낮은 엄격한 조건을 의미한다.

상기에 덧붙여, 항목(c)에서 인용한 대로 "(a) 또는 (b)의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 상보적 가닥으로 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산 분자"라는 용어는 항목 (a) 또는 (b)에서 상기한 대로 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 의미한다.

상기한 대로, 뉴클레오티드 서열에서 연관되지 않은 핵산 분자들에 교자 혼성화하지 않는 (매우) 엄격한 혼성화 조건하에서, 본 발명의 핵산 분자 또는 이의 일부에 혼성화할 수 있는 핵산 분자들이 본 발명에 따라 바람직하다. 항목(c)에 따라, 상기, 항목(a) 및 (b)의 핵산 분자들과 연관이 있으나 서열이 동일하지 않은 핵산 분자들은 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명은 (a) 및 (b)의 핵산 분자의 항목(c)에 따른 단편들을 포함한다. 항목(c)에 해당하는 모든 실시예들의 경우, 이런 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드는 적어도 2개의 N-말단 메티오닌 잔기를 가지며 (a) 또는 (b)의 히스톤의 생물학적 활성을 보유하거나 필수적으로 보유하는 것은 본 발명에 따라 필수적이다.

또한, 한 바람직한 실시예에서, 본 발명은 핵산 분자에 관한 것으로 이의 서열은 항목(a) 또는 (b)의 상기 핵산 분자의 서열과 비교해서 퇴화된다. 본 발명에 따라 사용될 때, 용어 "유전자 코트에 의해 퇴화되는"이라는 의미는 유전자 코드의 중복성 때문에 다른 뉴클레오티드 서열이 동일한 아미노산에 대해 유전정보를 제공한다.

더 쉬운 생산과 탐지를 가능하게 하기 위해 폴리펩타이드에 융합되는 당업계에 공지된 여러 친화성 태그가 존재하지만, 이런 태그는 종종 치료 분야에서 사용하기 위해 제거되어야 한다. 이런 친화성 태그와 반대로, 본 발명자들은 이들의 천연 모사체와 동일한 생물학적 특성을 나타내는 비스-met 폴리펩타이드를 놀랍게도 발견하였고, 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 치료 목적에 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 기능성은, 적어도 본 발명자들이 사용된 검사들에 의해 간파할 수 있게 변하지 않기 때문에, 메티오닌 잔기들의 제거는 필요하지 않다. 게다가, 메티오닌 잔기들의 제거는 생산하는 동안 일어나지 않는다. 약술한 대로, N-말단 메티오닌 잔기의 분열은 제 2 아미노산 잔기의 크기에 크게 의존한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 제 2 아미노산 잔기로서 추가 메티오닌을 포함하기 때문에, 관찰된 한 효과는 단지 낮은 퍼센트, 즉, 약 20%의 2개 N-말단 메티오닌 잔기들은 대장균에서 분열되는 것이다. 이 경우의 나머지 약 80%에서, 2개 N-말단 메티오닌 잔기들은 분열되지 않는다. 대장균과 같은 원핵생물에서 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 동안, 최종 N-말단 메티오닌은 포르밀화될 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 질량분석기에 의해 검사하여 어떠한 포르밀화된 생성물을 얻지 못했다. 또한, 단지 하나의 메티오닌 잔기의 분열은 관찰되지 않았다. 이론에 한정되기를 바라지 않으며, 제 1 N-말단 메티오닌 잔기들의 분열은 제 2 N-말단 메티오닌의 빠른 제거뿐만 아니라 두 메티오닌 잔기의 분열을 유도한다.

이와 관련하여, 본 발명의 비스-met 히스톤는 내인성 히스톤의 존재하에서 쉽게 탐지될 수 있는 장점을 제공한다. 예를 들어, 비록 비스-met 히스톤은 다른 형태의 HPLC(RPC;SEC;IEX) 또는 전기영동(SDS-PAGE, CE)에 의해 이들의 내인성 모사체로부터 분리되지 않을지라도, 비스-met 히스톤은 전기 분무 이온화(또는 텐덤) 질량 분석기(ESI-MS), 예를 들어 동일한 RP-HPLC 분획(실시예 참조)에 의해 쉽게 구별될 수 있다. 이것이 약물 검사에 대해 동위원소-레이블링 또는 특별 항체를 사용할 필요없이 임상 실험하는 동안 치료 히스톤의 약동학의 관찰을 가능하게 한다.

게다가, 제 1 및 제 2 N-말단 아미노산 잔기로서 2개의 메티오닌 잔기를 포함하는 히스톤은 재조합 생산에서 유리한 특성들을 나타낸다는 것을 놀랍게 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 2개의 메티오닌 잔기를 주입한 후 상당한 많은 양의 히스톤을 얻을 수 있다는 것을 발견하였다. 비록 비스-met 히스톤의 박테리아 세포 후발효의 수율은 현저하게 높지는 않았지만, 놀랍게도 비스-met 히스톤의 행동은 하부 가공의 제 1 주요 단계에서 현저하게 다르다는 것을 발견하였다. 비스-met 히스톤은 예상 염도에서 용출될 수 있지만, 추가 메티오닌 잔기가 없는 재조합 히스톤은 매우 높은 염도를 제외하고 매크로프렙 하이 S 컬럼(Macro prep High S column)으로부터 용출될 수 없었고 효과적인 방식으로 더 정제될 수 없었다. 결과적으로 비스-met 히스톤은 매크로프렙 하이 S 컬럼에 대해 최상의 작용을 나타내어 효과적이고 높은 수율의 정제 가공을 가능하게 한다.

따라서, 본 발명은 히스톤의 N-말단에 있는 2개의 메티오닌 잔기의 존재는 내인성 히스톤의 존재하에서 간단한 탐지의 가능성을 제공하고 효과적인 재조합 단백질 생산을 가능하게 하는 비스-met 히스톤을 제공한다는 새로운 발견을 기초로 한다.

한 바람직한 실시예에서 히스톤은 히스톤 H1.0, H1.1, H1.2 H1.3, H1.4, H1.5 및 H1t Testis으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

인간 히스톤 H1 아형에 대한 Swiss-Prot 접근 넘버는 H1.0 - P07305, H1.1 - Q02539, H1.2 - P16403, H1.3 - P16402, H1.4 - P10412, H1.5 - Q14529 및 H1t - P22492이다. 인간 히스톤 H1.2에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 SEQ ID NOs:6 및 7에 나타난다. 인간 히스톤 H1.3에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 SEQ ID NOs:8 및 9에 나타난다. 인간 히스톤 H1.4에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 SEQ ID NOs:10 및 11에 나타난다. 인간 히스톤 H1.5에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 SEQ ID NOs:12 및 13에 나타난다.

다른 실시예에서 본 발명은 본 발명의 핵산 분자와 상보적인 핵산 분자를 제공한다.

핵산 분자들은 염기쌍에 의해 허용된 염과 온도 조건하에서 서로 자연적으로 결합하는 경우 "상보적이다". 예를 들어, 서열 "A-G-T"가 상보적 서열 "T-C-A"와 결합한다. 본 발명에서 "상보적인"은 본 발명의 핵산 분자의 전체 길이에 걸쳐 뉴클레오티드의 완벽한 염기쌍을 의미한다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자에 정확하게 상보적이지 않은 탐지가능한 표지로 식별화된 핵산 분자는 만일 적절한 혼성화 및 세척 조건이 선택되면 탐지가능한 신호를 발생시키지 않을 것이다. 이런 상보적 핵산 분자는, 예를 들어, RNA 또는 DNA 제조의 노던 또는 써던 블럿 분석에서 프로브로 사용될 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자의 안티-센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 히스톤의 2개 N-말단 메티오닌 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 트리플렛에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하고 10 뉴클레오티드의 최소 길이를 가진다.

예를 들어, 상기 안디-센스 올리고뉴클레오티드는 시퀸싱 분석을 위한 프라이머 또는 RNA 또는 DNA 제조의 노던 또는 써던 블럿 분석에서 프로브로서 사용될 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 15개, 적어도 25개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발며의 안티-센스 폴리뉴클레오티드는 적어도 100개, 더욱 바람직하게는 적어도 200개 및 가장 바람직하게는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 이런 핵산 분자는, 예를 들어, RNase 보호 분석에서 프로브로서 또는 본 발명의 히스톤의 발현을 억제하기 위한 안티-센스 프로브로서 사용될 수 있다. 당업자는 상기 프로브들의 제조와 사용에 익숙하다(예를 들어, Sambrook and Russel "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001) 참조).

다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 벡테리아파지 또는 유전자공학에서 통상적으로 사용된 다른 벡터이다. 또 다른 실시예에서 본 발명은 본 발명의 상보적 핵산 분자 또는 안티-센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 핵산 분자는 여러 구입할 수 있는 벡터 속에 삽입될 수 있다. 비 제한적인 예들은 pUC-series, pBluescript(Stratagene), pETduet-vectors(Novagen) 또는 pCRTOPO(Invitrogen)를 포함하는 발현 벡터의 pET-series 및 pREP(Invitrogen), pcDNA3(Invitrogen), pCEP4(Invitrogen), pMCIneo (Stratagene), pXT1(Stratagene), pSG5(Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1 , pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, plZD35, pLXIN, pSIR(Clontech), plRES-EGFP(Clontech), pEAK-10(Edge Biosystems) pTriEx-Hygro(Novagen) 및 pCINeo(Promega)와 같은 포유류 세포에서 발현과 양립할 수 있는 벡터와 같은 원핵생물 플라스미드 벡터를 포함한다. 효모(Pichia pastoris)에 적합한 플라스미드 벡터에 대한 예는 플라스미드 pAO815, pPIC9K 및 pPIC3.5K(모두 Invitrogen)를 포함한다.

상기한 본 발명의 핵산 분자는 벡터 속에 삽입되어 다른 핵산 분자와의 번역 융합(translational fusion)이 발생하게 된다. 다른 핵산 분자는 융합 단백질의 용해도를 증가 및/또는 정제를 촉진할 수 있는 단백질을 암호화할 수 있다. 비 제한적인 예들은 pET32, pET41 , pET43를 포함한다. 벡터들은 또한 샤페론이 정확한 단백질 접힘을 촉진하도록 암호화하는 다른 발현성 핵산 분자를 포함할 수 있다. 적절한 박테리아 발현 숙주들은, 예를 들어, BL21(예를 들어, BL21(DE3), BL21 (DE3)PlysS, BL21(DE3)RIL, BL21(DE3)PRARE) 또는 Rosetta®로부터 유도된 균주를 포함한다.

벡터 변형 기술의 경우, 상기 샘브룩 등 참조. 일반적으로, 벡터는 복제와 발현을 위한 복제(ori) 및 유전 시스템의 하나 이상의 기원, 예를 들어, 항생제 내성과 같은 숙주에서 선택을 위한 하나 이상의 마커 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 복제(ori)의 적절한 기원은, 예를 들어, 복제의 Col E1, SV40 바이러스 및 M13 기원을 포함한다. 벡터에 삽입된 암호화 서열은, 예를 들어, 표준 방법에 의해 합성되거나 천연 원료로부터 분리될 수 있다. 전사 제어 요소 및/또는 다른 아미노산 암호화 서열에 대한 암호화 서열의 결찰은 정립된 방법들을 사용하여 수행될 수 있다. 원핵생물 또는 진핵생물에서 발현을 보장하는 전사 제어 요소(발현 카세트의 일부)들은 당업자에게 주지되어 있다. 이런 요소들은 전사의 개시를 보장하는 제어 서열들(예를 들어, 전사 개시 코돈, 프로모터, 인핸서 및/또는 절연체), 내부 리보솜 부착 부위(IRES)(Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476) 및 선택적으로 전사의 종결 및 전사물의 안정화를 보장하는 poly-A 신호를 포함한다. 추가 제어 요소들은 전사 인핸서뿐만 아니라 번역 인핸서 및/또는 자연적으로 결합되거나 이종인 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 이런 발현 제어 신호들에 작동가능하게 연결되어 원핵생물 또는 진핵생물에서 발현을 일으킨다. 벡터는 추가 제어 요소들로서 분비 신호들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들을 더 포함할 수 있다. 이런 서열들은 당업자에게 주지되어 있다. 또한, 사용된 발현 시스템에 따라, 발현된 폴리펩타이드를 세포 분획으로 유도할 수 있는 리더 서열들은 본 발명의 핵산 분자의 암호화 서열에 첨가될 수 있다. 이런 리더 서열들은 당업계에 주지되어 있다.

전사의 개시를 보장하는 제어 원소들의 가능한 예들은 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40-프로모터, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), lacZ 프로모터, gai10 프로모터, 인간 연장 인자 1α-프로모터, CMV 인핸서, CaM-키나제 프로모터, 오토그라파 칼리포니카 다중 핵다각체병 바이러스(AcMNPV) 폴리히드론 프로모터(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus polyhedral promoter) 또는 SV40-인핸서를 포함한다. 원핵생물에서 발현을 위해서, tac-lac 프로모터, lacUV5 또는 trp 프로모터를 포함하는 여러 프로모터는 SV40-poly-A-부위 또는 tk-poly-A 부위 또는 SV40, lacZ 및 AcNMPV 폴리히드론 폴리아데닐화 신호, 핵산 분자의 하부와 같은 전사 종결 신호들을 포함한다.

게다가, 본 발명의 벡터는 선택가능한 마커를 포함한다. 선택가능한 마커의 예들은 네오미신, 앰피실린 및 하이그로미신 내성 등을 포함한다. 특이적으로 설계된 벡터들은 박테리아-곰팡이 세포 또는 박테리아-동물 세포(Invitrogen에서 구입할 수 있는 Gateway® system)와 같은 다른 숙주들 사이의 DNA의 왕복을 허용한다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 본 발명의 핵산 분자 및 암호화된 폴리펩타이드의 복제 및 발현을 유도할 수 있다. 개시된 제어 요소들을 포함하는 적절한 발현 벡터는 Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1(Pharmacia), pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3(In-Vitrogene, 특히 첨부된 실시예에서 사용), pSPORTI(GIBCO BRL) 또는 pGEMHE (Promega), 또는 lambda gt11 , pJOE, the pBBR1-MCS -series, pJB861 , pBSMuL, pBC2, pUCPKS, pTACTI 또는 바람직하게는 pET 벡터(Novagen)와 같은 원핵생물 발현 벡터와 같이 당업계에 공지되어 있다. 상기한 대로 본 발명의 핵산 분자는 세포 속으로 직접 주입 또는 리포솜, 파지 벡터 또는 바이러스성 벡터(예를 들어, 아데노, 레트로)를 통해 세포 속으로 주입하기 위해 설계될 수 있다. 또한, 바큘로시스템 또는 백신 바이러스 또는 세밀키 포레스트 바이러스를 기초로 한 시스템은 본 발명의 핵산 분자를 위한 진핵생물 발현 시스템으로 사용될 수 있다.

전형적인 포유류 발현 벡터는 mRNA의 전사 개시를 매개하는 프로모터 요소, 단백질 암호화 서열 및 전사물의 전사 및 폴리아데닐화의 종결을 위해 필요한 신호들을 포함한다. 또한, 복제의 기원, 약물 내성 유전자, (유도가능한 프로모터의 일부로서) 조절자와 같은 요소들이 포함될 수 있다. lac 프로모터는 락토스 유사체 아이소프로필티오-b-D-갈락토시드("IPTG")를 사용하여 유도될 수 있는, 진핵생물에 유용한 통상적인 유도성 프로모터이다. 재조합 발현과 분비를 위해서, 관심 핵산 분자는 주변세포질에서 재조합 단백질을 유도하는 PelB 리더 신호와 pHEN4로 불리는 파아지미드의 유전자 III 사이를 연결할 수 있다(Ghahroudi et al, 1997, FEBS Letters 414:521-526에 개시). 추가 요소들은 인핸서, Kozak 서열 및 RNA 스플라이싱을 위한 도너 및 억셉터 부위 측면에 위치한 개재 서열을 포함한다. 높은 효율의 전사는 SV40의 전기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스, 예를 들어, RSV, HTLVI, HIVI의 긴 터미널 반복체(LTRs) 및 사이토메갈로바이러스(CMV)의 전기 프로모터에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, 세포 요소들이 사용될 수 있다(예를 들어, 인간 액틴 프로모터). 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 적절한 발현 벡터는, 예를 들어, pSVL and pMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) 및 pBC12MI (ATCC 67109)과 같은 벡터를 포함한다. 사용될 수 있는 포유류 숙주 세포들은 인간 Hela, 293, H9 및 Jurkat 세포, 생쥐 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos7 및 CV1, quail QC1-3 세포, 생쥐 L 세포 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다. 또한 재조합 폴리펩타이드는 염색체 속에 통합된 유전자 구조체를 포함하는 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오미신, 하이드로미신과 같은 선택성 마커에 의한 공동전이감염(Cotransfection)은 전이감염된 세포들의 동정과 분리를 가능하게 한다. 전이감염된 핵산은 다량의 암호화된 폴리펩타이드를 발현하도록 증폭될 수 있다. DHFR(이수소엽산 환원효소) 마커는 관심 유전자의 수백 또는 심지어 수천 복제물을 운반하는 세포주를 개발하는데 효과적이다. 다른 효과적인 선택 마커는 효소 글루타민 합성효소(GS)이다(Murphy et al.1991 , Biochem J. 227:277-279; Bebbington et al. 1992, Bio/Technology 70:169-175). 이런 마커들을 사용하면, 포유류 세포들은 선택성 매질에서 성장되고 최고의 내성을 가진 세포들이 선택된다. 상기한 대로, 발현 벡터는 적어도 하나의 선택성 마커를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 이런 마커들은 이수소엽산 환원효소, G418 또는 진핵생물 배양을 위한 네오미신 내성 유전자 및 대장균 및 다른 박테리아에서 배양하기 위한 테트라사이클린, 카나미신 또는 앰피실린 내성 유전자를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 벡터에 의해 유전적으로 가공된 숙주에 관한 것이다. 상기 숙주는 상기 핵산 분자 또는 벡터(들)를 숙주 속에 주입함으로써 생산될 수 있고 주입에 의해 이들이 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 매개한다.

숙주는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 적절한 원핵생물/박테리아는 일반적으로 E. coli(예를 들어, E coli strains BL21(DE3), HB101, DH5α, XL1 Blue, Y1090 and JM 101), Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Streptomyces lividans, Lactococcus lactis, Mycobacterium smegmatis 또는 Bacillus subtilis와 같이 복제를 위해 사용된 것들이다. 적절한 진핵생물 숙주는 CHO, COS, 293 및 보위 악종 세포(Bowes melanoma cells)와 같은 동물 세포, 양서류 세포, 물고기 세포, 초파리 S2 및 나비 Sf9과 같은 곤충 세포, 곰팡이 세포, 식물 세포, 형질전환 비-인간 동물 또는 형질전환 식물일 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에서, 숙주는 박테리아, 효모 세포, 곤충 세포, 곰팡이 세포, 포유류 세포 또는 식물 세포이다. 상기한 숙주 세포에 대한 적절한 배지 및 조건은 당업계에 주지되어 있다.

한 바람직한 실시예에서 본 발명의 핵산 또는 벡터에 의해 유전적으로 가공될 숙주는 대장균, 예를 들어, BL21(예를 들어, BL21(DE3), BL21 (DE3)PlysS, BL21(DE3)RIL, BL21(DE3)PRARE) 또는 Rosetta®로부터 유도된 균주이다.

다른 실시예에서 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 박테리아 또는 진핵생물을 생산하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 박테리아 또는 진핵생물을 본 발명의 벡터로 유전적으로 가공하는 단계를 포함한다. "유전 공학"이란 용어는 세포 유전 정보를 가져오는 공정 또는 세포의 유전 정보를 변형시키는 공정을 의미한다. 이것은 일반적으로 숙주 세포를 핵산 분자로 전이감염(transfecting) 또는 형질전환(transforming)함으로써 성취될 수 있다. 구조체를 숙주 세포 속으로 주입하는 것은 인산칼슘 전이감염, DEAE-덱스트란 매개 전이감염, 양이온 지질-매개 전이감염, 전기천공법, 형질도입, 감염 또는 다른 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이런 방법은 상기 Sambrook et al., loc. cit과 같은 여러 표준 실험 매뉴얼에 개시된다. 숙주 세포 속에 주입된 상기 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.

다른 실시예에서, 본 발명은 적절한 조건하에서 본 발명의 숙주를 배양하는 단계 및 생산된 본 발명의 폴리펩타이드를 상기 숙주 또는 배양액으로부터 분리하는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드 생산 방법에 관한 것이다.

많은 적절한 방법이 적절한 숙주에서 폴리펩타이드를 생산하기 위해 당업계에 존재한다. 만일 숙주가 원핵생물과 같은 단세포 유기체, 포유류 또는 곤충 세포인 경우, 당업자는 다양한 배양 조건을 사용할 수 있다. 편리하게는, 생산된 단백질은 정립된 기술들에 의해 배양액, 배양된 유기체의 용해물 또는 분리된(생물학적) 막으로부터 수집된다. 다세포 유기체의 경우, 숙주는 유기체의 일부이거나 유기체의 일부로부터 유도되는 세포일 수 있고, 상기 숙주 세포는 식물의 수집가능한 부분일 수 있다. 바람직한 방법은 상기한 대로 숙주들에서 단백질의 재조합 생산을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 서열들은 PCR에 의해 합성되어 발현 벡터 속에 삽입될 수 있다. 뒤이어 적절한 숙주는 발현 벡터에 의해 형질전환될 수 있다. 그런 후에, 숙주는 배양되어 원하는 폴리펩타이드를 생산하고 폴리펩타이드는 분리되고 정제된다. 이런 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 상기 Sambrook et al 참조).

본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 다른 방법은 mRNA의 인비트로 번역이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 적절한 세포-제거 발현 시스템은 토끼 망상적혈구 용해물, 맥아 추출물, 개 췌장 미세소체 막, 대장균 S30 추출물 및 TNT-시스템(Promega)과 같은 결합된 전사/번역 시스템을 포함한다. 이런 시스템은 클로닝 벡터들, DNA 단편들, 또는 암호화 영역을 포함하는 RNA 서열 및 적절한 프로모터 요소를의 첨가에 의해 재조합 폴리펩타이드의 발현을 일으킨다.

재조합 생산 이외에, 본 발명의 폴리펩타이드(단백질), 단백질 또는 융합 단백질의 단편들은 고체상 기술들을 사용하는 직접 펩타이드 합성에 의해 합성적으로 생산될 수 있다(Stewart et al. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis; Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154).

합성 단백질 합성은 수동 기술을 사용하여 또는 자동으로 수행될 수 있다. 자동 합성은, 예를 들어, 제조사에 의해 제공된 지시에 따라 Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer, Foster City CA)를 사용하여 이루어질 수 있다. 여러 단편들이 개별적으로 화학적으로 합성될 수 있고 전장 분자를 생산하기 위해 화학적 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 상기한 대로, 하우톤(Proc. Natl. Acad. ScL, 1985, 82: 5131)에 의해 기술된 고체상 절차와 같은 화학적 합성이 사용될 수 있다. 게다가, 본 발명의 폴리펩타이드(단백질), 단백질의 단편 또는 융합 단백질은, 예를 들어, 재조합 및 합성 생산의 조합에 의해 반-합성적으로 생산될 수 있다. 펩타이드 결합을 통해 (a) 성숙한 진핵생물 히스톤; 성숙한 진핵생물 히스톤과 적어도 80% 서열 동일성을 가지며 필수적으로 이의 생물학적 활성을 보유한 (b) 성숙한 진핵생물 폴리펩타이드; 또는 (c) 상기한 대로 본 발명의 임의의 다른 폴리펩타이드뿐만 아니라 폴리펩타이드(단백질) 및 융합 단백질의 단편에 연결된 제1 및 제 2 N-말단 아미노산 잔기로서 2개의 메티오닌 잔기를 가진 모든 폴리펩타이드(단백질)는 이들을 얻기 위해 사용된 생산 방법과 무관하게 본 발명의 범위 내에 해당한다. 이것은 모든 이런 단백질의 아미노산 서열이 본 발명의 핵산 분자에 의해 (또한) 암호화되기 때문이다.

단백질 분리와 정제는 여러 공지 기술들: 제한되지 않는 예로서, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 역상 HPLC, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 분취용 불연속 겔 전기영동 중 임의의 하나에 의해 이루어질 수 있다. 단백질 분리/정제 기술은 통상적인 방법을 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 변형시킬 필요가 있다. 예를 들어, 히스티딘 태그는 니켈 컬럼 상에서 정제되도록 단백질에 추가로 첨가될 수 있다. 다른 변형들은 더 높거나 더 낮은 활성을 일으키고, 다량의 단백질 생산을 g용하거나 단백질의 정제를 간단하게 할 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화되거나 본 발명의 방법에 의해 생산된 폴리펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터 또는 숙주 또는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 선택적으로, 이하에서 기술된 본 발명의 항체, 앱타머 또는 파지는 상기 조성물에 포함된다.

본 발명에서 따라 사용된 대로, "조성물"이란 용어는 인용된 화합물들 중 적어도 하나를 포함하는 조성물이다. 조성물은, 예를 들어, 이의 기능을 억제, 안정화, 차단, 조절 및/또는 활성화함으로써 본 발명의 화합물들의 특성을 변화시킬 수 있는 추가 분자들을 선택적으로 포함할 수 있다. 조성물은 고체, 액체 또는 기체 형태일 수 있고, 특히 분말(들), 정제(들), 용액(들) 또는 에어로졸(들 형태일 수 있다.

한 바람직한 실시예에서 본 발명의 조성물은 성숙한 진핵생물 히스톤을 더 포함할 수 있다.

바람직하게는, 이런 조성물은 성숙한 진핵생물 히스톤과 혼합된 본 발명의 폴리펩타이드(비스-met 히스톤)를 포함한다. 따라서, 조성물은 N 말단에 있는 2개의 메티오닌 잔기를 포함하는 히스톤 및 메티오닌 잔기가 제거된 히스톤의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이 혼합물은 90%의 본 발명의 폴리펩타이드 내지 10% 성숙한 진핵생물 히스톤의 범위에 있다. 더욱 바람직하게는 80% 내지 20%, 더욱 바람직하게는 70% 내지 30%의 범위에 있다. 50% 내지 50%, 30% 내지 70% 또는 20% 내지 80%의 범위의 혼합물이 더욱 바람직하다. 가장 바람직하게는 혼합물은 10%의 본 발명의 폴리펩타이드 내지 90%의 성숙한 진핵생물 히스톤의 범위에 있다. 이런 혼합물은 숙주 유기체의 메티오닌 아미노펩타이드의 불충분한 활성 때문에 비스-met 히스톤으로부터 메티오닌의 부분 절단에 의해 발생할 수 있다. 선택적으로, 성숙한 진핵생물 히스톤은 상기 혼합물을 얻기 위해서 본 발명의 비스-met 히스톤에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 혼합물에서 히스톤은 H1 또는 H2A와 같은 동일한 아형이다.

다른 바람직한 실시예에서 조성물은 약학적으로 허용가능한 운반체 및/또는 희석제를 선택적으로 더 포함하는 약학적 조성물이다

본 발명에 따라, "약학적 조성물"이란 용어는 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물이다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 화합물들을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은, 선택적으로 및 부가적으로, 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 운반체"는 임의의 형태의 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화제 또는 제제 보조제를 의미한다. 적절한 약학적 운반체의 예들은 당업계에 주지되어 있고 염화나트륨 용액, 인산염 버퍼 염화나트륨 용액, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 형태의 습윤제, 살균액, DMSO 등을 포함하는 유기 용매를 포함한다. 바람직하게는 운반체는 비경구 운반체, 더욱 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성인 용액이다. 운반체는 등장성과 화학적 안정성을 강화하는 물질들과 같은 최소량의 첨가제를 적절하게 포함한다. 이런 물질은 사용된 복용량과 농도로 수용자에게 독성이 없고 인산염, 시트르산염, 숙신산염, 아세트산 및 다른 유기산 또는 이들의 염; 아스코르브산과 같은 항산화제; 폴리아르기닌 또는 트라이펩타이드와 같은 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린과 같은 단백질; 폴리바이닐파이롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루탐산, 아스파르트산, 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 셀룰로스 또는 이의 유도체를 포함하는 다른 탄수화물, 글루코스, 만노스 또는 덱스트란; EDTA와 같은 킬레이제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 반대이온; 및/또는 폴리소르베이트, 폴록사머 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 본 발명에서 사용된 "비경구"라는 용어는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 형태를 의미한다.

이런 운반체를 포함하는 조성물은 주지된 통상적인 방법에 의해 제제화될 수 있다. 일반적으로, 제제는 약학적 조성물의 성분들을 액체 운반체 또는 정교하게 나뉜 고체 운반체 또는 둘 다와 균일하고 밀접하게 접촉시킴으로써 제조된다. 그런 후에, 필요한 경우, 생성물은 원하는 제제로 만들어진다.

이런 약학적 조성물은 적절한 양으로 피험자에게 투여될 수 있다. 복용 요법은 주치의와 임상요인에 의해 결정될 것이다. 의료계에 주지된 대로, 임의의 한 환자에 대한 복용량은 환자의 나이, 신체 표면적, 나이, 투여될 특정 화합물, 성별, 시간 및 투여 경로, 일반적 건강 및 동시에 투여될 다른 약제를 포함하는 여러 인자에 의존한다. 소정의 상황에 대한 치료적 유효량은 일상적인 실험에 의해 쉽게 결정될 것이고 보통의 임상의사 또는 내과의사의 기술과 판단 내에 있다. 일반적으로, 약학적 조성물의 규칙적인 투여로서 복용법은 하루당 1㎍ 내지 20g 단위의 범위이어야 한다. 그러나, 더 바람직한 복용량은 하루당 0.01mg 내지 100mg, 더욱 바람직하게는 0.01mg 내지 50mg 및 가장 바람직하게는 0.01mg 내지 10mg의 범위일 것이다.

치료 투여를 위해 사용된 약학적 조성물의 성분들은 살균되어야 한다. 살균은 살균 여과막(예를 들어, 0.2 마이크론 막)을 통과시켜 여과함으로써 쉽게 이루어진다.

약학적 조성물의 성분들은 1회 복용 또는 수회 복용 용기, 예를 들어, 재구성을 위해 수용액으로 또는 동결건조 제제로 밀봉된 앰풀 또는 작은 병에 저장될 것이다. 동결건조 제제의 예로서, 10ml 작은 병에 5ml의 살균 여과 1%(w/v) 수용액을 채우고 결과로 얻은 혼합물을 동결건조한다. 주입 용액은 정균처리 주사용수를 사용하여 동결건조 화합물(들)을 재구성함으로써 제조된다. 방부제 및 다른 첨가제는, 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등으로 존재할 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 약학적 조성물의 의도된 용도에 따라 다른 물질을 포함할 수 있다.

약학적 조성물은 질환, 바람직하게는 암, 혈소판감소증, 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이 감염과 같은 감염, 전신홍반성루프스(SLE) 또는 류마티스 관절염과 같은 자가면역질환, 궤양성 대장염 또는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)과 같은 아밀로이드 유사 섬유를 가진 질환, 리슈만편모충증, 소정 형태의 근육병 또는 혈전증과 관련된 심혈관 질환을 포함하는 상기한 것들로부터 선택된 질환의 치료에 특히 효과적일 수 있다.

본 발명에 따라 암은 세포의 제어할 수 없는 분할 및 이들의 확산 능력, 침투를 통한 인접 조직 속으로 직접 침투 또는 전이에 의한 먼 부위로의 이식(암 세포들은 혈류 또는 림프계를 통해 운반된다)을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 종류를 의미한다.

본 발명에 따라 혈소판감소증은 혈액에 매우 적은 혈소판이 존재하는 것을 의미하는데, 정상 혈소판 수는 일반적으로 mm³ 당 140,000 내지 400,000이다.

본 발명에 따라 감염은 외래 종들에 의한 숙주 유기체의 해로운 군체 형성이다. 감염에서, 감염 유기체는 증식하기 위해(주로 숙주를 이용) 숙주 자원을 이용한다. 감염에 대한 숙주의 반응은 염증이다.

본 발명에 따라 박테리아 감염은 뇌수막염, 콜레라, 디프테리아, 선회병, 백일해, 폐렴구균성 폐렴, 살모넬라증, 파상풍, 티푸스, 결핵, 요로 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따라 바이러스 감염은 단핵구증, AIDS, 수두, 보통 감기, 사이토메갈로바이러스 감염, 뎅기열, 에볼라출혈열, 수족구, 간염, 인플루엔자, 유행성 이하선염, 소아마비, 광견병, 천연두, 바이러스 뇌염, 바이러스 위장염, 바이러스 뇌수막염, 바이러스 폐렴 또는 황열병을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따라 곰팡이 감염은 아스페르길루스증, 분야균증, 캔디다증, 콕시디오이데스 진균증, 효모균증, 히스토플라스마증, 무좀을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따라 자가면역질환은 정상적으로 신체에 존재하는 물질들 및 조직들에 대한 신체의 과도한 면역반응으로부터 기인하는 질환이다. 자가면역질환은 당업자에게 주지되어 있고 홍반성루프스, 급성 파종성 뇌척수염, 재생불량성빈혈, 자가면역성 간염, 당뇨병, 다발성 경화증, 시각 신경염, 또는 류마티스 관절염을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따라 홍반성루프스는 만성(장기간 지속)자가면역질환이며, 면역시스템은 과민하여 정상 조직을 공격한다. 이런 공격은 염증을 일으키고 증상을 나타낸다. 홍반성루프스는 "비-기관-특이적" 형태의 자가면역질환이다.

본 발명에 따라 류마티스 관절염은 신체 면역 시스템이 관절을 공격하게 하는 자가면역질환이다.

본 발명에 따라 궤양성 대장염은 염증성 장 질환(IBD)의 한 형태이다. 궤양성 대장염은 대장염의 한 형태, 결장, 특히 대장 또는 결장에서 특징적인 궤양(ulcer 또는 open sores)을 포함하는 장의 질환이다. 그러나, 진행중인 질환의 주요 증상은 주로 점진적으로 발생하는 혈액이 섞인 설사이다.

본 발명에 따라 아밀로이드 유사 섬유를 가진 질환은 정상적인 가용성 아밀로이드-베타 또는 단백질 알파-시누클레인이 정렬된 섬유 구조로 응집되어 과도한 산화성 손상, 흥분세포독성, 변형된 세포 주기를 일으키는 공통적인 특징을 공유하는 질환이다. 아밀로이드 유사 섬유를 가진 질환은 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

알츠하이머병은 일상 생활의 활력의 감소 및 신경정신증상 또는 행동변화를 동반한 진행성 인식 퇴화를 특징으로 하는 퇴행성 신경질환이다. 이것은 가장 흔한 형태의 치매이다.

파킨슨병은 주로 환자의 운동 기능과 언어를 손상시키는 중추신경계의 퇴행성장애이다.

리슈만편모충증은 트리파노좀 원생동물의 속의 기생충인 리슈만편모충의 종들에 의해 발생하는 트리파노좀 질환이다. 리슈만편모충증은 모래 파리의 특정 종들의 물림에 의해 전염되며 증상은 피부 통증뿐만 아니라 열, 비장 및 간에 대한 손상 및 빈혈이다.

근병증은 신경근육질환이며, 근섬유가 기능하지 않아서, 근육 약화를 일으킨다. 근병증의 여러 종류는 공지되어 있고 근육퇴행위축, 선천성 근병증, 미토콘드리아 근병증 또는 염증성 근병증을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따라, 혈전증과 관련된 심혈관 질환은 심부정맥혈전증 또는 심근경색을 포함하나 이에 제한되지 않는다. γ-트롬빈에 의해 매개된 혈전증과 관련된 심혈관 질환이 특히 바람직하다.

다른 바람직한 실시예에서 본 발명의 조성물은 진단 조성물이다.

본 발명에 따라, "진단 조성물"이란 용어는 본 발명의 약학적 조성물에 의한 잠재적 반응 또는 치료력에 대한 개별 환자들을 진단하기 위한 조성물을 의미한다. 본 발명의 진단 조성물은 상기 화합물들을 포함한다. 진단 조성물은 적절한 버퍼(들) 및 역전사효소, 내열성 중합효소 등과 같은 효소를 더 포함할 수 있다. 진단 조성물은 한 용기 또는 복수의 용기에 포장될 수 있다.

또한 본 발명은 필요한 피험자에게 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 암, 혈소판감소증, 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이 감염과 같은 감염, 전신홍반성루프스(SLE) 또는 류마티스 관절염과 같은 자가면역질환, 궤양성 대장염 또는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)과 같은 아밀로이드 유사 섬유를 가진 질환, 근육병 또는 혈전증과 관련된 심혈관 질환으로부터 선택된 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 치료용 및/또는 진단용 조성물의 제조를 위한 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터 또는 비-인간 숙주 또는 폴리펩타이드의 용도를 제공한다.

한 바람직한 실시에예서, 치료 목적은 암, 혈소판감소증, 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이 감염과 같은 감염, 전신홍반성루프스(SLE) 또는 류마티스 관절염과 같은 자가면역질환, 궤양성 대장염 또는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)과 같은 아밀로이드 유사 섬유를 가진 질환, 근육병 또는 혈전증과 관련된 심혈관 질환의 치료이다.

다른 한 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하나 상응하는 성숙한 진핵생물 히스톤에는 결합하지 않는 항체 또는 앱타머 또는 파지를 제공한다. 상기 항체는 단클론 또는 다클론 항체일 수 있다.

"항체"라는 용어는 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 다클론 항체, 단사슬 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 이중특이성항체, 합성 항체, Fab, F(ab2)', a Fv 또는 scFv 단편 등과 같은 항체 단편, 또는 이들의 임의의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다. 단클론 항체는, 예를 들어, Kohler and Milstein, Nature 256 (1975), 495, and Galfre, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3에 최초로 기술된 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이 기술은 생쥐 암 세포를 당업계에서 개발한 변형에 의한 면역화된 포유류로부터 유도된 비장 세포에 융합하는 단계를 포함한다. 게다가, 상기한 펩타이드에 대한 항체 또는 이의 단편은 Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988에 기술된 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 상기 항체들의 유도체가 파지 디스플레이 기술에 의해 얻은 경우, BIAcore 시스템에서 사용된 대로 표면 플라즈몬 공명이 본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 에피토프에 결합하는 파지 항체들의 효능을 증가시키는데 사용될 수 있다(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). 키메릭 항체들의 생산은, 예를 들어, WO 89/09622에 기술된다. 본 발명에 따라 사용될 항체들의 다른 원료는 소위 이종 항체들이다. 생쥐 속의 인간 항체들과 같은 이종 항체들의 생산을 위한 일반적인 원리는 WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 및 WO 96/33735에 기술된다. 본 발명에 따라 사용될 항체들 또는 이들의 상응하는 면역글로불린 사슬(들)은, 예를 들어, 단독으로 또는 조합으로 당업계에 공지된 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 첨가(들) 및/또는 재조합(들) 및/또는 임의의 다른 변형(들)을 사용하는 것과 같이 당업계에 공지된 통상적인 기술들을 사용하여 추가로 변형될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열을 기초로 하는 DNA 서열에 이런 변형을 도입하기 위한 방법은 당업자에게 주지되어 있다; 예를 들어, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 참조.

"단클론" 또는 "다클론 항체"(Harlow and Lane, (1988), loc. cit. 참조)라는 용어는 항체들의 결합 특이성을 보유하거나 필수적으로 보유하는 상기 항체들의 유도체들을 의미한다. 상기 유도체들의 특히 바람직한 예는 이하에서 추가로 명시되며, 이런 항체들의 다른 유도체들은, 예를 들어, 생쥐 또는 쥐 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메릭 항체들이다.

"scFv 단편"(단일-사슬 Fv 단편)이란 용어는 당업계에 주지되어 있고 작은 크기와 이런 단편들을 재조합으로 생산하는 능력 때문에 선호된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 앱타머, 단편 또는 이의 유도체는 이들의 존재 또는 부존재가 관찰될 표적 단백질, 폴리펩타이드 또는 단편 또는 이의 에피토프에 특이적으로 결합된다.

본 발명에 따라 "특이적으로 결합한다"라는 용어는 항체 등은 유사 구조들의 폴리펩타이드 또는 N-말단 2개의 메티오닌 잔기를 갖지 않는 성숙한 원핵생물 폴리펩타이드와 가교 반응하지 않거나 반드시 반응하지 않는다는 것을 의미한다. 실험중인 항체들 등의 패널의 가교 반응성은 통상적인 조건(예를 들어, Harlow and Lane, (1988), loc. cit. 참조)하에서 항체들 등의 상기 패널이 관심 폴리펩타이드뿐만 아니라 여러 개의 다소(구조적으로 및/또는 기능적으로) 밀접하게 관련된 폴리펩타이드에 결합하는 지를 분석함으로써 검사될 수 있다. 관심 폴리펩타이드/단백질에 결합하나 관심 폴리펩타이드와 동일한 조직에 의해 발현되는 다른 폴리펩타이드들 중 임의의 것과 결합하지 않거나 반드시 결합하지 않는 이런 항체들만이 관심 폴리펩타이드/단백질에 특이적인 것으로 생각되고 본 발명의 방법에 따른 추가 연구를 위해 선택된다.

본 발명의 특히 바람직한 실시에에서, 상기 항체 또는 항체 결합 단백질은 인간 항체 또는 인간화된 항체이거나 이로부터 유도된다. 본 발명에 따라, "인간화된 항체"라는 용어는 비-인간 기원의 항체를 의미하고 CDR3 및 바람직하게는 모든 6개 CDRs와 같은 가변 영역에서 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)이 원하는 특이성을 가진 인간 기원의 항체의 CDRs에 의해 대체되었다. 선택적으로, 항체의 비-인간 불변 영역(들)은 인간 항체의 불변 영역(들)에 의해 대체되었다. 인간화된 항체들의 생산 방법은 EP-A1 - 0 239 400 및 WO 90/07861에 기술된다.

앱타머는 다른 분자들에 결합하는 능력을 기초로 랜덤 풀로부터 선택되어진 DNA 또는 RNA 분자들이다. 핵산, 단백질, 소형 유기 화합물 및 전체 유기체에 결합하는 앱타머가 선택되었다. 앱타머의 데이터베이스는 http://aptamer.icmb.utexas. edu/에 보관되어 있다. 더욱 구체적으로, 앱타머는 DNA 또는 RNA 앱타머 또는 펩타이드 앱타머로 분류될 수 있다. 전자는 (주로 짧은) 가닥의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 반면에, 후자는 양 말단에서 단백질 골격에 결합된 짧은 가변 펩타이드 도메인으로 구성된다.

핵산 앱타머는 소형 분자, 단백질, 핵산, 및 세포, 조직 및 유기체와 같은 다양한 분자 표적에 결합하기 위해 인비트로 선택 또는 동일하게, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)의 반복을 통해 가공된 핵산 종들이다. 펩타이드 앱타머는 다른 단백질 상호작용 내부 세포들을 간섭하도록 설계된 단백질이다. 이들은 양 말단에서 단백질 골격에 결합된 가변성 펩타이드 루프로 구성된다. 이런 이중 구조적 제약은 펩타이드 앱타머의 결합 에너지를 항체의 결합 에너지(나노몰 범위)에 필적할 수준으로 크게 증가시킨다. 가변성 루프 길이는 통상적으로 10 내지 20개 아미노산으로 이루어지고, 골격은 우수한 용해성을 가진 임의의 단백질일 수 있다. 현재, 박테리아 단백질 티오레독신-A는 가장 많이 사용되는 골격 단백질이고, 가변성 루프는 야생형 단백질에서 -Cys-Gly-Pro-Cys- 루프인 환원 활성 부위 내에 삽입되며, 2개의 시스테인 측면 사슬은 이황화물 다리를 형성할 수 있다. 펩타이드 앱타머 선택은 다른 시스템을 사용하여 이루어질 수 있으나, 현재 가장 많이 사용되는 것은 효모 이중-혼성 시스템(yeast two-hybrid system)이다.

앱타머는 통상적으로 사용된 생체 분자들, 특히 항체들의 분자인식특성에 필적하는 분자인식특성을 제공하기 때문에 생물공학 및 치료 응용분야에 사용된다. 이들의 식별력 있는 인식 이외에, 앱타머는 실험 튜브에서 완전히 가공될 수 있고, 화학적 합성에 의해 쉽게 생산되며, 바람직한 저장 특성을 소유하며 치료 응용분야에서 적거나 면역원성을 나타내지 않기 때문에 항체들에 비해 장점을 제공한다. 비-변형 앱타머는 혈류로부터 빠르게 제거되는데, 이는 수분 내지 수 시간의 반감기를 가지며, 특히 핵산 가수분해효소 분해 및 신장에 의한 신체로부터의 배출, 앱탐의 고유하게 낮은 분자량 때문이다. 비 변형된 앱타머 응용분야는 혈액 응고와 같은 일시적 이상을 치료하거나 국소적 전달이 가능한 눈과 같은 기관의 치료에 현재 집중된다. 이런 빠른 제거는 인비보 진단 이미징과 같은 응용분야에서 장점이 될 수 있다. 2'-플루오린-치환 파이리미딘, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 연관 등과 같은 여러 변형은 앱타머의 반감기를 일 또는 주 크기로 쉽게 증가시킬 수 있는 과학자들이 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 파지는 재조합 파지이며 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들어, Griffiths, A.D. et air. EMBO J. 1994, 13:3245에 기술된다. 파지는 융합 단백질로서 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 원하는 결합 특이성을 가진 면역글로불린 단편 또는 유도체를 이들의 표면에 운반할 수 있으며, 여기서 융합 파트너는 파지의 표면 분자이다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에서, 상기 항체 또는 앱타머 또는 파지는 탐지가능하게 표지화된다. 앱타머는 상기한 대로 ³H 또는 ³²P 또는 상기한 대로 형광 마커로 방사성으로 표지화되는 것이 바람직하며, 파지 또는 항체는 상응하는 방식(바람직한 방사능 표지로서 ¹³¹I로) 표지화되거나 His-태그, FLAG-태그 또는 myc-태그와 같은 태그로 표지화될 수 있다.

다른 실시예에서 본 발명은 상기 항체, 앱타머 및/또는 파지를 포함하는 진단 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 적절한 버퍼(들) 및 역전사효소, 내열성 중합효소 등과 같은 효소를 더 포함할 수 있다.

상기 진단 조성물은 본 발명의 항체를 사용하는 면역분석법에서 본 발명의 폴리펩타이드의 존재를 검사하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 대로, "면역분석법"이란 용어는, 예를 들어, 면역-침전, 면역-블로팅, ELISA, RIA, 간접 면역형광 실험 등과 같은 방법을 포함한다. 이런 기술들은 당업계에 주지되어 있고 상기 Harlow and Lane에 기술되어 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 상기 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 존재를 위해 피험자로부터 얻은 샘플을 검사하는 단계를 포함하여 본 발명의 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 존재를 분석하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 핵산 분자의 존재를 위해 샘플을 검사하는 방법은 핵산 증폭, 시퀀싱 또는 혼성화 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

핵산 증폭 분석 및 수행하기 위한 수단의 예들은 PCR(네스티드 PCR, RT-PCR, PCR 확장 분석, 핵산 서열 염기 증폭(NASBA), 단일 가닥 확인 다형체(SSCP)PCR), 증폭 내화성 돌연변이 시스템(ARMSTM) 및 증폭 내화성 돌연변이 시스템 선형 확장(ALEXTM) 분석법을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이런 방법들의 상세내용은 ,예를 들어, Newton et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 2503-2516; Agrawal (Ed.), "Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties (Methods in Molecular Biology, 20)", Humana Press, 1993; Haque et al., Diagn. MoI. Pathol. 7 (1998) 248-252;lnnis et al.(Ed.), "PCR Applications: Protocols for Functional Genomics", Academic Press, 1999; Chen and Janes (Ed.), "PCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning to Genetic", 2nd edition, Humana Press, 2002; Pissardet al., Clin. Chem. 48 (2002) 769-772; Steemers et al., Nature Meth. 3 (2006) 31-33; Kakavas et al., J. Clin. Lab. Anal. 20 (2006) 1-7 참조.

시퀸싱 분석법에 대한 예들은 직접 시퀀싱, 자동 DNA 시퀀서에서 형광 SSCP 및 파이로시퀀싱에 의한 서열 분석의 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이런 절차는 당업계에서 일반적이며, 예를 들어, Adams et al. (Ed.), "Automated DNA Sequencing and Analysis", Academic Press, 1994; Alphey, "DNA Sequencing: From Experimental Methods to Bioinformatics", Springer Verlag Publishing, 1997; Ramon et al., J. Transl. Med. 1 (2003) 9; Meng et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 90 (2005) 3419-3422 참조.

혼성화 분석법에 대한 예들은 노던 및 써던 블롯 분석법, 이형접합자분석, 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화에 의한 돌연변이의 탐지, DNA 칩 상에서 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화, Illunina's^® 기술을 기초로 한 분석법, BeadArray^® 기술을 기초로 한 분석법을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 예를 들어, Barnes et al., Nucleic Acids Res. 33 (2005) 5914-5923; Fan et al., Biotechniques 39 (2005) 583-588; Shen et al., Mutat. Res.-Fund. MoI. M. 573 (2005) 70-82; Steemers and Gunderson, Pharmacogenomics, 6 (2005) 777-782 참조.

단백질 탐지를 기초로 한 분석법에 대한 예들은 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 HPLC, 불연속 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 웨스턴 블럿 분석, 면역침전, 아미노산 시퀀싱, 분광법(UV, CD; IR, Fluoreszenz) 및 질량분석법(예를 들어, MS-QTOF)와 같은 방법 단계를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 예를 들어, Soejima and Koda, Transfusion 45 (2005) 1934-1939; Yeh et al., Anesth. Analg. 101 (2005) 1401- 1406; Chou et al., Am. J. Clin. Pathol.. 124 (2005) 330-338 참조.

상기한 분석법은, 예를 들어, Lottspeich, Engel "Bioanalytik" Spektrum Akademischer Verlag (2006); Sambrook,, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989); Higgins and Hames (Eds.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985); Nollau et al, Clin. Chem. 43 (1997), 1114-1128과 같은 표준 교과서에 의해 당업계에 공지되었으며; 인용된 분석법의 일부의 용도는 첨부된 실시예에 기술된다.

본 발명의 다른 바람직한 실시예에서 상기 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 태아 조직, 타액, 소변, 점막 조직, 점액이다.

또한 본 발명은 하나 이상의 용기에 본 발명의 핵산 분자, 벡터, 비-인간 숙주, 폴리펩타이드 또는 항체, 앱타머 및/또는 파지를 포함하는 키트에 관한 것이다.

도 1은 정제 절차의 전체적인 개관이다.

도 2는 B1, M-H1A-P02 임상 배치의 QTOF 질량 스펙트럼이다.

도 3은 B1, M-H1A-Pool01 임상 배치의 QTOF 질량 스펙트럼이다.

본 발명은 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니고 단지 설명하기 위한 다음 실시예들을 참조하여 기술될 것이다.

실시예 1: hH1.3 구조체의 복제

플라스미드 벡터 pEGT1 - rH1 .3 S1 의 제조

SEQ ID NO:1에 도시된 대로, 강한 양성 전하를 나타내는 히스톤은 리신 잔기의 고용량으로부터 기인한다. 리신에 대한 코돈 사용은 대장균과 인간 사이에 크게 다르기 때문에, 코돈 최적화는 인간 히스톤 H1.3 서열을 대장균의 코돈 용도에 적합하도록 하기 위해 수행하였다. 합성 유전자를 생산하였고 서열이 SED ID NO: 2로 제공된다. 인공 서열은 2개 제한 효소, 즉 BspH1 및 BamH1에 의해 측면 공격 되어 pEGT1 발현 벡터 속으로 연속해서 주입되게 한다. 번역 개시 코돈 ATG를 Nco1 제한 부위 CCATGG 속에 포함시켰다. BspH1 부위 TCATGA를 제공하는 개시 ATG를 배가하였고 이의 부착단(cohesive end) CATG는 Nco1와 혼용된다. 따라서, 제 2 메티오닌 잔기를 제 1 메티오닌 잔기 이후 포함시켰다. 다른 BamH1 부위 GGATCC를 종결 코돈 TAA 이후 주입하였다. 이런 인공 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열은 SED ID NO:3로 주어진다.

최적화된 유전자는 플라스미드 pEGT1-rH13S1을 생산하기 위해서 BspH1 및 BamH1에 의해 분해되어 이의 플라스미드로부터 절단되어 표준 프로토콜에 따라 NOC1 및 BamH1에 의해 직선형태가 된 pEGT1 발현 벡터 속에 삽입되었다.

결찰된 벡터 pEGT1-rH13S1을 표준 프로토콜을 사용하는 전기영동에 의해 전 기충격용 대장균 BL21[DE3] 속으로 주입하였고 형질전환된 세포들을 카나미신으로 채운 LB 평판에서 선택하였다. 한 클론을 선택하고 히스톤을 암호화하는 삽입물의 서열을 SEQ ID NO:2와 완전한 일치에 대해 확인하였다.

플라스미드 벡터 pEGT1 - rH1 .3 S2 의 제조

rH13S1 구조체에 제 2 메티오닌의 삽입을 억제하기 위해서, 제 2 합성 유전자를 사용하였다. 세린을 암호화하는 제 2 최초 코돈 TCC를 BspH1 부위와의 혼용성을 보장하기 위해서 세린을 암호화하는 AGC로 변화시켰다. DNA 서열은 SED ID NO:4로 제공되며 이런 인공 유전자에 의해 암호화되는 재조합 단백질은 SED ID NO:5로 제공된다. pEGT1-rH13S1에 대해 상기한 것과 동일한 복제 전략을 사용하였는데 이는 SED ID NO:4의 인공 유전자는 개시 코돈에서 BspH1 제한 부위 TCATGA 및 한 염기쌍 후 종결자 코돈에서 BamH1 CCATGG에 의해 측면 공격되었다.

최적화된 유전자는 플라스미드 pEGT1-rH13S2을 생산하기 위해서 BspH1 및 BamH1에 의해 분해되어 이의 플라스미드로부터 절단되어 표준 프로토콜에 따라 NOC1 및 BamH1에 의해 직선형태가 된 pEGT1 발현 벡터 속에 삽입되었다.

결찰된 벡터 pEGT1-rH13S2를 표준 프로토콜을 사용하는 전기영동에 의해 전기충격용 대장균 BL21[DE3] 속으로 주입하였고 형질전환된 세포들을 카나미신으로 채운 LB 평판에서 선택하였다. 한 클론을 선택하고 히스톤을 암호화하는 삽입물의 서열을 SEQ ID NO:4와 완전한 일치에 대해 확인하였다.

실시예 2: 히스톤 H1 .3의 재조합 생산

균주

rh1.3S의 제조에서 사용된 박테리아는 대장균 Bl21(DE3)/pEGT1/H1.3S의 재조합 균주이다. 제조는 대장균의 Bl21(DE3) 균주를 형질전환시키기 위해 사용하였다. 3개 클론을 선택하여 발현 스크리닝을 수행하였고 한 클론을 선택하여 프리-마스터 시드(pre-Master Seed)(Pre-MS-05L23-H1 B)하였다. 마스터 시드(MS-06D05-H1B)는 Pre-MS-05L23-H1 B를 사용하여 생산되었고 워킹 시드(WS-06D06-H1 B)는 마스터 시드를 사용하여 생산되었다.

시드 배양액

각각 500ml의 YES 배지(30g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl)를 포함하는 두 개의 2-리터 플라스크에 각각 100㎕의 워킹 시드(WS-06D06-H1 B)를 주입하였다. 배양액을 1,5 이상의 O.D(600nm)에 도달하도록 5h00(+/- 0,5시간) 동안 27rpm으로 교반하면서 37℃에서 배양한다.

발효

100리터 발효기를 100리터의 NRJ 18 배지로 제조한다. 발효기를 30분 동안 123℃에서 살균한다. 살균 후 및 주입 전, 50ml의 SAG471(소포제)를 무균으로 첨가한다. 8.75 10^{- 7}의600nm에서 이론적 개시 광 밀도에 도달하기 위해서 발효기에 시트 배양액을 첨가한다. 계산된 주입량을 500ml의 YES 배지를 포함하는 운반 병에 첨가한다.

발효는 37℃에서 밤새 실시한다. 발효 공정 동안에, pH는 NaOH 4M 및 HNO₃ 2,24M의 주기적 첨가에 의해 pH 70 ± 0.2로 유지된다. 용해된 산소는 교반에 의해 30%로 자동제어된다.

배양액이 15 내지 20 사이의 OD₆₀₀에 도달한 경우, 배양액에 1mM IPTG(500ml의 고순도 물에 용해된 23,8g)의 용액을 주입한다.

1시간 30분의 주입 후, OD₆₀₀은 25시간 이상이고 발효기는 16℃이하로 냉각한다. pH 제어는 7.0±0.2로 유지한다. 다른 변수들은 압력이 300m bar로 감소하고 교반이 200rpm으로 낮아지는 것을 제외하고 냉각하는 동안 일정하게 유지된다.

배지 온도가 16℃이하일 때, 배양액 부피를 측정한다. 완전한 배양액은 JLA 8.1000 rotor(±6L/원심분리기) : 5200 RPM - 4℃ - 20 분이 장착된 2 베크만 원심분리기로 원심분리한다. 세포 펠렛을 수집하고 원심분리 단계 동안 -20℃에서 점진적으로 저장한다.

고압 균질기에서 세포 파열

세포 파열 전 날에, 100리터의 배양액에 해당하는 농축된 세포를 실온에서 냉동한다.

파열하는 날, 세포 펠렛을 250 g/l in 20 mM Na₂HPO₄·12H₂O pH 7.0으로 희석하고 현탁액의 온도를 30℃로 증가시킨다. 그런 후에 현탁액을 헤이돌프 R2R2100 프로펠러에서 균질화한다. 그런 후에 세포를 고압 균질기 PONY(800bar)에서 용해시킨다. 세포 현탁액을 세포 균질기를 통해 2회 처리한다.

실시예 3: 단백질 정제

정제의 모든 단계는 총 부피의 발효기(즉, 1OOl)에서 수행된다.

1. 2,5% 과염산 및 8M 요소 추출에 의한 침전화

수집된 세포에 HClO4 20%(최종 농도; 2,5%)의 부피의 질량 1/7을 첨가한다. 현탁액을 250 bar에서 Pony 균질기에서 3차 주기 이전에 균질화한다. 용액을 실온에서 1시간 30분 동안 약하게 교반한다. 그런 후에, 현탁액을 14분 동안 원심분리한다(12,200g - 7,000 rpm, 4℃). 상청액을 수집하고, pH를 10M NaOH로 4.0±0.1로 조절하고 살균 가방 속의 0.45/0.22㎛ 사르토포어 2 막(2000cm²)을 통과시킨다.

요소를 첨가하여 2배의 최종 부피로 8M 농도를 얻고, 부피는 20 mM Na₂HPO₄ pH 7,0 버퍼로 조절된다. 이 용액을 실온에서 약하게 교반하면서 밤새 유지한다. 그런 후에, pH를 37% HCl 또는 10M NaOH로 4.0±0.1로 조절한다.

2. Q 세파로스 빠른 흐름 이온 교환 크로마토그래피( QSFF ) - 음성 모드

이 단계의 목적은 내독소 및 DNA 함량의 감소이다. 음이온 교환 크로마토그래피는 모듈린 350/500 컬럼(Millipore BioProcess Division cat n°86351211)에 채워진 Q 세파로스 빠른 흐름(Amersham Biosciences cat. n°17-0510-05)으로 수행한다.

컬럼은 120cm/h(115.4l/h)의 용출액 유속으로 고순도 물에 채운다. 채워진 컬럼 층의 치수는 지름 25cm, 단면적 961cm², 층 18cm, 채워진 부피 17.314±0.9621이다. 컬럼은 1.5 내지 2.5 컬럼 부피(CV)의 1M NaOH + 2M NaCl에 의해 96.2l/h(100cm/h - 1603ml/min)의 유속으로 2시간의 접촉 시간 동안 살균한다. 모든 크로마토그래피 단계는 대략 100cm/h(+ 96.2 l/h)의 직선 유속으로 수행한다. pH는 1 내지 2 CV의 50mM 아세트산 암모늄 + 1M NaCl pH 4.0으로 안정화된다. 그런 후에 컬럼은 3,5 내지 5 CV의 50mM 아세트산 암모늄 + 8M 요소 pH 4.0으로 평형화된다.

요소 추출에 의한 용액(섹션 1 참조)을 10mS/cm 미만의 전도도를 얻기 위해 50mM 아세트산 암모늄 + 8M 요소 pH 4.0으로 약 1.5배 희석한다. 단지 8CV의 요소 추출 용액(희석 이전)을 동일한 시간에 채운다. H1 단백질은 플로우 스루에서 수집하고, 평형-용출은 1,5 내지 2,5 CV의 50mM 아세트산 암모늄 + 8M 요소 pH 4.0으로 수행한다.

용출 후, 컬럼을 1,5 내지 2,5 CV의 50mM 아세트산 암모늄 + 1M NaCl pH 4.0로 세척한다. 1M NaCl에서 이 용출은 DNA와 내독소를 제거한다. 그런 후에, 컬럼을 1.5 내지 2.5 CV 1M NaOH + 2M NaCl(2h)로 살균하고 20mM NaOH에서 실온으로 저장한다.

3. 매크로프렙 하이 S 양이온 교환 크로마토그래피( MHS -E)- 양성 모드

양이온 교환 크로마토그래피는 밴티지 180/500 컬럼(Millipore BioProcess Division cat n°87018001)에 채워진 매크로프렙 하이 S(Bio-Rad Laboratories cat. n°156-0033)로 수행된다. 채워진 컬럼 층의 치수는 지름 18cm, 단면적 254.4cm², 층 36cm, 채워진 부피 9.16±0.251이다. 컬럼은 1.5 내지 2.5 컬럼 부피(CV)의 1M NaOH + 2M NaCl에 의해 40 l/h(157cm/h)의 유속으로 2시간의 접촉 시간 동안 살균한다. 최대 유속은 250cm/h일 수 있다. pH는 1.5 내지 2.5 CV의 50mM 아세트산 암모늄 + 2M NaCl pH 2.0으로 안정화된다. 그런 후에 컬럼은 4 내지 5.5 CV의 50mM 아세트산 암모늄 pH 2.0으로 평형화된다.

QSFF-FT 분획의 pH(섹션 2 참조)는 37% HCl로 조절된다. 이 용액을 희석하기 전에 125cm/h(±31.8l/h)의 유속으로 채운다. 겔의 결합 능력은 5 내지 15mg/ml 매트릭스이다. 채운 후, 컬럼은 157cm/h(40l/h)의 유속에서 2 내지 3 CV의 50mM 아세트산 암모늄 pH 2.0으로 평형화된다. 최대 유속은 200cm/h이다.

용출은 50mM 아세트산 암모늄 pH 2.0 및 50mM 아세트산 암모늄 + 2M NaCl pH 2.0으로 25%(0.5M NaCl) 내지 75%(1.5M NaCl)의 10CV에 대한 전도도 직선 구배로 수행한다. 용출은 157cm/h(40l/h)의 유속으로 수행한다. 최대 유속은 200cm/h이다. 용출 피크는 풀링하기 전에 SDS-PAGE에 의해 분석되는 2리터 분획에 수집된다. 풀링후, MHS-E 풀은 다음 정제 단계까지 -20℃에서 또는 24시간 내로 사용된 경우 2-8℃로 저장된다.

그런 후에, 컬럼을 1.5 내지 2.5 CV 1M NaOH + 2M NaCl(2h)으로 살균하고 20mM NaOH에 실온으로 저장한다.

4. 농축 - 정용여과

농축을 2개 사르토콘 카세트(0.6m², 컷-오프 5kDa) 하이드로사르트 사르토리우스 막(Sartopore cat n°302 144 2906 E-SG)으로 수행한다. 막은 Proflux M12 시스템(Millipore Bioprocess Division)에 연결된 홀더에 장착된다. 막을 주사용 멸균수(WFI)로 세척한다. 살균은 60분 동안 0.5M NaOH를 연속적으로 재순환하면서 수 행한다. 그런 후에, 막을 Na₂HPO₄·12H₂O 20mM pH 7.0, 투과할 때까지 pH = 7.0±0.1로 세척한다. 그런 후에, 막을 PBS pH 7.4(NaCl 8 g/l, KH₂PO₄ 0,19 g/l, Na₂HPO₄ 2,38 g/l), 투과할 때까지 pH 7.4±0.1로 평형화한다.

입구 압력과 출구 압력은 각각 1.5±0.1 bar 및 1.2±0.1 bar로 정한다.

여러 매크로프렙 하이 S 용출액은 서로 연결되고 단백질의 전체량에 따라, 30mg/ml의 이론 농도에 해당하는 부피로 농축된다. 농축 후, 보유액을 10 부피의 PBS pH 7.4(NaCl 8 g/l, KH₂PO₄ 0,19 g/l, Na₂HPO₄ 2,38 g/l)에 대해 정용여과한다. 보유액을 수집하고 각각 150ml의 PBS pH 7.4(NaCl 8 g/l, KH₂PO₄ 0,19 g/l, Na₂HPO₄ 2,38 g/l)로 3분 동안 동일한 공정 변수로 막을 7회 세척한다. 투과 라인은 세척하는 동안 밀폐된다.

BCA 단백질 분석법을 보유액과 각각의 분리된 세척 분획(wash fractions)에 대해 수행한다. 보유액은 선택된 세척 분획과 연결하여 가능하면 90%를 초과하는 수율로 12mg/mlf를 초과하는 전체 농도를 얻는다.

막을 WFI로 세척된다. 살균은 60분 동안 0.5M NaOH의 연속적인 재순환에 의해 수행된다. 그런 후에 막은 NaOH 1.0M에 저장한다.

5. 살균 여과

보유액 + 선택된 세척 분획의 살균 여과는 실온에서 1000cm² 0.45/0.22 사르토포어 2 필터(Sartorius cat n°544-1307-H8-00)상에서 수행된다. 막은 사용하기 전에 500ml의 PBS pH 7.4(NaCl 8 g/l, KH₂PO₄ 0,19 g/l, Na₂HPO₄ 2,38 g/l)로 세척한다.

여과는 약 100ml/min의 유속으로 정량펌프로 수행하고 여과물은 살균되고 발열원 제거된 5L 또는 10L 1회용 병에 수집한다.

여과된 벌크(bulk)에 대해 수행된 BCA 분석법에 따라, he 농도는 여과에 의해 첨가된 PBS pH 7.4(NaCl 8 g/l, KH₂PO₄ 0,19 g/l, Na₂HPO₄ 2,38 g/l)에 의해 10mg/ml로 조절된다. 샘플 채취 후, 살균된 벌크는 -20℃로 저장한다. 생산 단계의 전체적인 요약은 도 1에 제공된다.

실시예 4: hH1.3 및 비스-met hH1.3 정제 효과

50L 균질기 속 BL21[DE3]-비스-met rH1.3의 배양액은 전체 용해된 세포의 연속 희석에 대한 SDS 페이지 분석에 의해 분석된 것과 같이, 수집 시간에, 적어도 500mg/L의 배양액의 수율을 나타내었다. 완전한 정제 공정 후 최종 수율은 50mg/L의 정제된 비스-met rH13를 초과하였다.

50L 균질기 속 BL21[DE3]-hH1.3의 배양액은 전체 용해된 세포의 연속 희석에 대한 SDS 페이지 분석에 의해 분석된 것과 같이, 수집 시간에, 적어도 600mg/L의 배양액의 수율을 나타낸다. 세포들을 표준 프로토콜에 따라 균질화 및 HClO₄에 의한 침전화를 통해 가공하였다. 얻은 결과는 예상대로였다. 매크로프펩 하이-S에 대한 적재는 통상적으로 수행되었으나, rhH1.3 단백질은 10mM NaCH₃COO pH 2.0 및 10mM NaCH₃COO + 2M NaCl pH 2.0으로 30%(0.6M NaCl) 내지 75%(1.5M NaCl)의 10CV에 대한 전도도 직선 구배로 수행한다. 비록 rhH1.3 단백질은 2M NaCl에서 용출되었으나, 이 단계는 충분한 정제를 허용하지 않았고 단백질은 추가로 가공되지 않았다. 따라서, 정제는 실패한 것으로 생각된다. 이 실패는 2개의 다른 발효에 의해 제조된 2개의 독립된 정제 실험에서 확인하였다.

실시예 5: 비스-met 히스톤 H1.3 인비트로의 효과

억제 지역 분석(Inhibition Zone Assay)

항균제 및 항바이러스제로서 재조합 히스톤의 효과를 측정하기 위해서 억제 지역 분석을 표준 방법에 따라 수행하였다. 또한, 항진균제로서 재조합 히스톤의 효과를 검사하였다. 박테리아 및 곰팡이는 상기한 방법에 따라 생산한 비스-met 히스톤 H1.3의 존재하에서 성장되었고 평균 억제 지역 지름을 측정하였다(표 1 참조).

두 그람-양성 및 그람-음성 박테리아와 곰팡이는 표 1에 나타낸 것과 같이 효과적으로 제거된다.

[표 1]

검사 유기체 약물 농도 평균 억제 지역 지름 [㎍/㎕] [mm]

5 11.4 2.50 10.5 인산가용화균 1.25 9.7 0.625 8.6 0.31 7.9 양성 대조군 LL-37 9.8 20.00 7.4 10.00 6.3 5.00 4.8 대장균 D21 2.50 0 1.25 0 양성 대조군 LL-37 5 20.00 11.8 5.00 8.1 2.50 6.1 1.25 4.4 칸디다균 양성 대조군: 니스타틴 20.9

세포독성 분석법:

이 세포 검사는 히스톤 - 민감성 백혈병 세포주(예를 들어, U-937)의 독성 효과를 탐지하는 것이다. 다른 히스톤 농도에서 배양한 후 백혈병 암세포의 생명력은 세포의 생명력에 반응하여 변하는 산화환원 지시자의 발광을 관찰하는 것을 기초로 한 AlamarBlue 분석법에 의해 관찰된다. 히스톤 항암 활성은 50% 암 세포 생명력이 관찰되는 히스톤 농도에 해당하는 IC₅₀에 의해 특징을 나타낸다. 세포독성 분석법뿐만 아니라 임상 실험에 사용된 배치들은 표 2에 요약되어 있다. 표 1에 나타낸 대로, 모든 검사 샘플은 다른 함량의 H1.3 및 비스-Met와 무관하게, 세포주 U-937에 대해 유사하고 높은 세포독성을 나타낸다(표 3 비교).

[표 2]

임상 실험에 사용된 배치들의 세포독성

샘플(약품) IC50[μM]

배치 1: M-H1A-P02 3.2±0.5 배치 2: M-H1A-Pool01 3.1±0.5 배치 3: M-H1A-Pool02 3.1±0.5 배치 4: M-H1A-Pool03 2.2±0.5

표 1에 나타낸 박테리아 및 곰팡이 이외에, 다른 박테리아, 곰팡이 및 바이러스는 본 발명에서 설명한 방법들 중 임의의 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 편리하게 검사할 수 있다. 비 제한적인 예는 Epstein-Barr-Virus, Staphylococcus aureus, Aspergillus niger, Enterococcus, Pseudomonas, Haemophilus influenzae 및 Salmonella를 포함한다.

실시예 6: 임상 데이터

재발되거나 치료불응성 AML을 가진 환자 또는 화학요법이 거부되거나 화학요법에 적합하지 않은 환자에서 재조합 인간 히스톤 H1.3(rhH1.3)의 최대 섭취 허용량(MTD)을 평가하기 위한 단계 I/II 복용량-증가-실험을 수행하였다. 환자의 포함 기준은 서명한 동의서, 임의의 혈통, 남성 여성, 적어도 18세의 나이, 골수에서 적어도 20% 공격에 의해 세포학적으로 증명된 AML, 실패 이후, 표준 화학요법의 부적합 또는 거부, 적절한 수행 상태(카모스와키 지수 >60%) 및 적어도 30일의 수명이었다. 환자를 배제하는 기준은 심각한 기관 이상, 공지된 HIV 감염, 공지된 C형 간염 바이러스 또는 B형 간염 바이러스, 임신 또는 보육, 다른 종양, 순환성 안티-H1 항체, 첫 번째 방문 전 2주 동안 또는 연구 참가 동안 헤파린 치료, 류마티스 관절염 또는 전신홍반성루프스(SLE)과 같은 rhH1.3 치료를 잠재적으로 방해하는 심각한 의학적 상태뿐만 아니라 알콜 및/또는 약물 남용이었다.

연구의 설계

환자는 3주 연속으로 주당 3회 주입되었다. 최초 복용량은 38mg/m²이었다. 사용된 복용량 증가 계획은 표 3에 나타난다.

[표 3]

복용량 증가 계획:

복용 단계 복용량(mg/m2) 계획된 환자수 검사 치료

1 38 3 7 완료 2 60 3 7 완료 3 96 3 3 완료 4 153 3 3 완료 새로운 복용량 증가 5,5,6 245,245,392 1(주기 1) 1 완료 6,6,7 392,392,628 (주기 2, 상기한 완료 동일한 환자) 6,6,7 392,392,628 1 1 완료

임상 실험 단계 I/II는 AML(급성 악성 백혈병) 환자에 대해 홈부르크에 있는 살랜드 대학 병원에서 이루어졌다. 이 실험에 사용된 약품 배치는 B1, B2, B3 및 B4이었다. 독물학 연구에 사용된 이 4 배치 및 한 GLP 배치의 특징은 아래 표4에 제공된다.

[표 4]

배치 설명 내독소 평가 세포 검사 IC50 [EU/mg] 내독소 레벨 rhH1.3MS 피크[Da] 에서 항암 활성 [μM]

L-H1A-03B07" 5 AL 이하 H1.3+비스Met 1.7-2.7 M-H1A-P02 B1 12 AL 이상 H1.3+비스Met 3.2 M-H1A-Pool01 B2 95 AL 이상 주로 비스 Met 3.1 M-H1A-Pool02 B3 0.8 AL 이하 주로 비스 Met 3.1 M-H1A-Pool03 B4 1.7 AL 이하 주로 비스 Met 2.2

" 임상 실험이 아닌 독물학 연구에서 사용

AL: 허용한계

MS 피크: 22221 Da H1.3 Met 없음

22481 Da 비스 Met N-말단 Met-Met

6.1 사전 평가

표 5는 증가하는 복용량(소위 피보나치 계획)으로 재조합 인간 히스톤 H1.3(rhH1.3 "Oncohist")로 치료한 첫 번째 22 AML 환자의 사전 임상 결과를 요약한다.

환자 WW13 및 WW27은 각각 2회 치료 주기를 받았다(한 주기는 3주 동안 주당 3회 주입하는 것으로 구성, 모두 9회). WW27은 각 주기에서 증가하는 복용량이 투입되었다. 즉, 5-5-6: 2주 복용량 5, 2주 복용량 6 및 제 2 주기 복용 수준에서 유사하게: 6-6-7.

[표 5]

사전 평가에서 얻은 재조합 인간 히스톤 H1.3(rhH1.3 "Oncohist")로 치료한 AML 환자들의 임상 결과

사전 분석:

PR: 부분 회복

TTI: 일시적 혈소판 증가

TN: 정상 수준의 혈소판

TLI: 일시적 백혈구 증가

NSE: 부작용 없음

H1.3: 성숙한 재조합 인간 히스톤 H1.3;
bis(비스) Met: N-Met-Met-H1.3

표 5에서 명백하듯이, 약물 부작용은 내독소 오염의 결과로서만 발생한다(예를 들어, 표 3 참조). 자연적으로 발생한 히스톤 H1.3 및 "비스 Met" 유도체는 효능의 임상 신호에 관한 한 유사한 특성을 보여준다.

면역원성

모든 환자들은 치료 이전, 동안 및 이후 안티-히스톤 H1.3 자기항체의 존재에 대해 검사하였다. 치료된 환자의 아무도 치료하는 동안 자가항체를 생산하지 않았고, 한 치료 주기 또는 두 주기를 받은 환자들도 자기항체를 생산하지 않았다. 히스톤 H1은 진화적으로 매우 보존적인 단백질이고 면역원성이 있는 것으로 예상되거나 증명되지 않는다. 임상 데이터는 면역원성 활성은 자연적으로 발생한 히스톤 H1.3 또는 "비스 Met" 유도체를 사용하여 관찰되지 않았다는 것을 증명한다.

치료 효과

환자들의 약 50%는 혈소판의 증가를 나타내고 일부는 백혈구의 증가를 나타내었고, 모두 AML에 대한 매우 중요한 생체마커이다. 세 환자는 부분 회복을 나타내었다(최초 값의 50% 미만으로 종양 세포의 감소). 환자 WW13은 18개월 동안 지속된 정상 수준(210 x 10⁹/l)으로 혈소판의 증가를 나타내었다. 재조합 인간 히스톤 H1.3으로 치료하기 이전의 그의 혈소판 수는 47 x 10⁹/l이었다.

6.2 임상 결과의 최종 평가

표 6은 증가하는 복용량(피보나치 계획)으로 재조합 인간 히스톤 H1.3(rhH1.3, "Oncohist")으로 치료한 22 AML 환자의 상세한 분석 이후 얻은 임상 결과를 요약한다.

상기한 대로, 환자 WW13 및 WW27은 각각 2회 치료 주기를 받았다(한 주기는 3주 동안 주당 3회 주입하는 것으로 구성, 모두 9회). WW27은 각 주기에서 증가하는 복용량이 투입되었다. 즉, 5-5-6: 2주 복용량 5, 2주 복용량 6 및 제 2 주기 복용 수준에서 유사하게: 6-6-7.

[표 6]

최종 평가에서 재조합 인간 히스톤 H1.3(rhH1.3, "Oncohist")으로 치료한 AML 환자들의 임상 결과

^*사전 분석:

^**9회 주입 AE 중 하나 후, 재발견

^*** 최종 주입 SAE 동안, 74세 환자에서 심방세동, 관계 의심스러움

PR: 부분 회복

TI: 혈소판 증가

TN: 정상 수준의 혈소판

LI: 백혈구 증가

AE: 부작용, SAE: 심각한 부작용

H1.3: 성숙한 재조합 인간 히스톤 H1.3;
비스 Met: N-Met-Met-H1.3

치료 효과

최종 평가에 따라, 22명 환자 중 7명이 환자들의 혈소판의 증가를 나타내고 일부는 백혈구의 증가를 나타내었고, 모두 AML에 대한 매우 중요한 생체마커이다. 세 환자는 부분 회복을 나타내었다(다른 혈액 값의 증가와 동시에 6-25% 미만으로 종양 세포의 감소). 환자 WW13은 18개월 동안 지속된 정상 수준(210 x 10⁹/l)으로 혈소판의 증가를 나타내었다. 재조합 인간 히스톤 H1.3으로 치료하기 이전의 그의 혈소판 수는 47 x 10⁹/l이었다.

안정성 평가

임상 연구 보고서는 rhH1.3(Oncohist)는 지금까지 치료한 복용량에서 안전하 다는 것을 나타내었다. 연구 약물과 관련된 것으로 생각되는 rhH1.3의 주입 중 한 번의 심방세동을 제외하고 심각한 부작용은 발견되지 않았다. 17명 환자는 한 코스의 치료(8-9회 투여)를 완료했고, 2명의 반응 환자는 부작용없이 제 2 코스를 받았다. 비 복용량-제한 독성이 발견되지 않았고 최대 허용 복용량은 628mg/m²에 도달하지 않았다.

가장 중요하게는, 순수한, 내독소-제거 연구 약물은 환자가 잘 견디었는데,즉, 증식세포억제제와 반대로 부작용이 없었다. 이 결과는 임상전 연구와 일치하며, 재조합 인간 히스톤 H1.3 유도체는 건강한 혈액 세포를 손상시키지 않으며 내성을 일으키지 않는다.

실시예 7: 한 샘플에서 비스-met hH1.3의 존재의 평가

"비스-met" 히스톤 hH1.3은 내인성 히스톤 H1과 MS에 의해 쉽게 구별된다. 이것은 원래의 가공되지 않은 rhH1.3 약품 용액의 ESI-QTOF 탐지로 직접 분석될 수 있거나 RP-HPLC 크로마토그래피 분리 및 뒤이은 ESI-MS 탐지에 의한 RP-HPLC-ESI-MS 공정에 의해 분석될 수 있다. 도 2에 도시된 대로, 배치 B1은 히스톤 H1.3 및 N-Met-Met-유도체를 포함한다. 도 3은 주로 N-Met-Met-H1.3으로 이루어진 3개의 배치(B2) 중 하나를 도시한다. 조성물과 무관하게, 다른 배치는 백혈구 세포에 대해 필적할 만한 세포독성 활성을 나타낸다(표 3).

다음 스펙트럼은 연속된 질량 분석기(QTOF, 한 장치에서 4배 및 비행시간 분광장치의 조합)에 의해 얻었다. 도 2에 도시된 대로, 배치 B1은 히스톤 H1.3 및 N- Met-Met-유도체를 포함한다.

도 3은 주로 N-Met-Met-H1.3으로 이루어진 3개의 배치(B2) 중 하나를 도시한다. 조성물과 무관하게, 다른 배치는 백혈구 세포에 대해 필적할 만한 세포독성 활성을 나타낸다(표 3).

본 발명의 내용 중에 포함되어 있음

SEQUENCE LISTING <110> SymbioTec Gesellschaft zur Forschung und Entwicklung auf dem Gebiet der Biotechnologie mbH Thiry, Michel <120> Bis-met histones <130> N1720 PCT <150> EP 07 00 7200.4 <151> 2007-04-05 <150> EP 07 01 8956.8 <151> 2007-09-26 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Ser Glu Thr Ala Pro Leu Ala Pro Thr Ile Pro Ala Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Thr Ala Gly Lys 20 25 30 Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala Val 35 40 45 Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys Lys 50 55 60 Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg Ile 65 70 75 80 Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln Thr 85 90 95 Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala Ala 100 105 110 Ser Gly Glu Gly Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala Lys Pro 115 120 125 Arg Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly Ala 130 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Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln 85 90 95 Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala 100 105 110 Ala Ser Gly Glu Gly Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala Lys 115 120 125 Pro Arg Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly 130 135 140 Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Ala Thr Ala Ala Gly Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Ala Lys 165 170 175 Lys Val Lys Thr Pro Gln Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys 180 185 190 Ala Lys Ala Pro Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ser Gly Lys Pro 195 200 205 Lys Val Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys Lys 210 215 220 <210> 6 <211> 642 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 6 atgtccgaga ctgctcctgc cgctcccgct gccgcgcctc ctgcggagaa ggcccctgta 60 aagaagaagg cggccaaaaa ggctgggggt acgcctcgta aggcgtccgg tcccccggtg 120 tcagagctca tcaccaaggc tgtggccgcc tctaaagagc gtagcggagt ttctctggct 180 gctctgaaaa aagcgttggc tgccgccggc tatgatgtgg agaaaaacaa cagccgtatc 240 aaacttggtc 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Asn Lys Lys Ala Ala 100 105 110 Ser Gly Glu Ala Lys Pro Lys Val Lys Lys Ala Gly Gly Thr Lys Pro 115 120 125 Lys Lys Pro Val Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Ala Ala Gly Gly 130 135 140 Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ala Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys 145 150 155 160 Pro Ala Ala Ala Thr Val Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Pro Lys Lys 165 170 175 Ala Lys Val Ala Lys Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Ala Ala Lys Ala 180 185 190 Val Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Val Val Lys Pro Lys Lys Ala 195 200 205 Ala Pro Lys Lys Lys 210 <210> 8 <211> 666 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 8 atgtcggaga ctgctccact tgctcctacc attcctgcac ccgcagaaaa aacacctgtg 60 aagaaaaagg cgaagaaggc aggcgcaact gctgggaaac gcaaagcatc cggaccccca 120 gtatctgagc ttatcaccaa ggcagtggca gcttctaagg agcgcagcgg cgtttctctg 180 gccgcgctta agaaagcgct tgcggctgct ggctacgatg tagaaaaaaa caacagccgt 240 atcaagcttg gcctcaagag cttggtgagc aaaggtactc tggtgcagac caaaggtacc 300 ggtgcttctg gctccttcaa actcaacaag aaagcggctt ccggggaagg caaacccaag 360 gccaaaaagg 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Pro Arg Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly 130 135 140 Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Ala Thr Ala Ala Gly Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Ala Lys 165 170 175 Lys Val Lys Thr Pro Gln Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys 180 185 190 Ala Lys Ala Pro Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ser Gly Lys Pro 195 200 205 Lys Val Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys 210 215 220 <210> 10 <211> 660 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 10 atgtccgaga ctgcgcctgc cgcgcccgct gctccggccc ctgccgagaa gactcccgtg 60 aagaagaagg cccgcaagtc tgcaggtgcg gccaagcgca aagcgtctgg gcccccggtg 120 tccgagctca ttactaaagc tgttgccgcc tccaaggagc gcagcggcgt atctttggcc 180 gctctcaaga aagcgctggc agccgctggc tatgacgtgg agaaaaacaa cagccgcatc 240 aagctgggtc tcaagagcct ggtgagcaag ggcaccctgg tgcagaccaa gggcaccggc 300 gcgtcgggtt ccttcaaact caacaagaag gcggcctctg gggaagccaa gcctaaggct 360 aaaaaggcag gcgcggccaa ggccaagaag ccagcaggag cggcgaagaa gcccaagaag 420 gcgacggggg cggccacccc caagaagagc gccaagaaga ccccaaagaa ggcgaagaag 480 ccggctgcag ctgctggagc caaaaaagcg aaaagcccga aaaaggcgaa agcagccaag 540 ccaaaaaagg cgcccaagag cccagcgaag gccaaagcag ttaaacccaa ggcggctaaa 600 ccaaagaccg ccaagcccaa ggcagccaag ccaaagaagg cggcagccaa gaaaaagtag 660 <210> 11 <211> 219 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 11 Met Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Glu 1 5 10 15 Lys Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Arg Lys Ser Ala Gly Ala Ala Lys 20 25 30 Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala Val 35 40 45 Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys Lys 50 55 60 Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg Ile 65 70 75 80 Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln Thr 85 90 95 Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala Ala 100 105 110 Ser Gly Glu Ala Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala Lys Ala 115 120 125 Lys Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Ala Thr Gly Ala 130 135 140 Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ala Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys 145 150 155 160 Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ala Lys Lys Ala Lys Ser Pro Lys Lys Ala 165 170 175 Lys Ala Ala Lys Pro Lys Lys Ala Pro Lys Ser Pro Ala Lys Ala Lys 180 185 190 Ala Val Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Thr Ala Lys Pro Lys Ala 195 200 205 Ala Lys Pro Lys Lys Ala Ala Ala Lys Lys Lys 210 215 <210> 12 <211> 681 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 12 atgtcggaaa ccgctcctgc cgagacagcc accccagcgc cggtggagaa atccccggct 60 aagaagaagg caactaagaa ggctgccggc gccggcgctg ctaagcgcaa agcgacgggg 120 cccccagtct cagagctgat caccaaggct gtggctgctt ctaaggagcg caatggcctt 180 tctttggcag cccttaagaa ggccttagcg gccggtggct acgacgtgga gaagaataac 240 agccgcatta agctgggcct caagagcttg gtgagcaagg gcaccctggt gcagaccaag 300 ggcactggtg cttctggctc ctttaaactc aacaagaagg cggcctccgg ggaagccaag 360 cccaaagcca agaaggcagg cgccgctaaa gctaagaagc ccgcgggggc cacgcctaag 420 aaggccaaga aggctgcagg ggcgaaaaag gcagtgaaga agactccgaa gaaggcgaag 480 aagcccgcgg cggctggcgt caaaaaggtg gcgaagagcc ctaagaaggc caaggccgct 540 gccaaaccga aaaaggcaac caagagtcct gccaagccca aggcagttaa gccgaaggcg 600 gcaaagccca aagccgctaa gcccaaagca gcaaaaccta aagctgcaaa ggccaagaag 660 gcggctgcca aaaagaagta g 681 <210> 13 <211> 226 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 13 Met Ser Glu Thr Ala Pro Ala Glu Thr Ala Thr Pro Ala Pro Val Glu 1 5 10 15 Lys Ser Pro Ala Lys Lys Lys Ala Thr Lys Lys Ala Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Ala Ala Lys Arg Lys Ala Thr Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr 35 40 45 Lys Ala Val Ala Ala Ser Lys Glu Arg Asn Gly Leu Ser Leu Ala Ala 50 55 60 Leu Lys Lys Ala Leu Ala Ala Gly Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn 65 70 75 80 Ser Arg Ile Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu 85 90 95 Val Gln Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys 100 105 110 Lys Ala Ala Ser Gly Glu Ala Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala 115 120 125 Ala Lys Ala Lys Lys Pro Ala Gly Ala Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys 130 135 140 Ala Ala Gly Ala Lys Lys Ala Val Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys 145 150 155 160 Lys Pro Ala Ala Ala Gly Val Lys Lys Val Ala Lys Ser Pro Lys Lys 165 170 175 Ala Lys Ala Ala Ala Lys Pro Lys Lys Ala Thr Lys Ser Pro Ala Lys 180 185 190 Pro Lys Ala Val Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro 195 200 205 Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ala Ala Lys Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys 210 215 220 Lys Lys 225

Claims (64)

1. (aa) 하기 (ab)의 히스톤에 펩타이드 결합을 통해 연결되는 제 1 및 제 2 N-말단 아미노산 잔기로서 2개의 메티오닌 잔기; 및

   (ab) 성숙한 진핵생물 히스톤

   으로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 히스톤은 히스톤 H1.O, H1.1, H1.2, H1.3, H1.4, H1.5 및 H1t로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
3. 제 1 항의 핵산 분자에 대해 상보적인 핵산 분자.
4. 제 1 항에 따른 핵산 분자의 안티-센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드로서,

   상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 제 1 항의 (aa)의 2개의 N-말단 메티오닌 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 트리플렛에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하고, 최소 10개의 뉴클레오티드를 갖는 것인 제 1 항에 따른 핵산 분자의 안티-센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드.
5. 제 1 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
6. 제 5 항의 벡터에 의해 형질전환된 숙주로서,

   상기 숙주는 인간이 아니고 인간의 태아가 아닌 것인 숙주.
7. 제 6 항에 있어서,

   상기 숙주는 박테리아, 효소 세포, 곤충 세포, 곰팡이 세포, 포유류 세포 또는 식물 세포인 것인 숙주.
8. 제 6 항의 숙주를 배양하는 단계, 및 핵산 분자로부터 생산된 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하며,

   상기 핵산 분자는

   (aa) 하기 (ab)의 히스톤에 펩타이드 결합을 통해 연결되는 제 1 및 제 2 N-말단 아미노산 잔기로서 2개의 메티오닌 잔기; 및

   (ab) 성숙한 진핵생물 히스톤

   으로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자인 폴리펩타이드 생산 방법.
9. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드.
10. 제 9 항의 폴리펩타이드를 포함하는 암, 혈소판감소증, 감염, 자가면역질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 리슈만편모충증, 근육병, 심부정맥혈전증 또는 심근경색 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
11. 제 10 항에 있어서,

    성숙한 진핵생물 히스톤을 더 포함하는 약학적 조성물.
12. 제 10 항에 있어서,

    상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 운반체, 희석제 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
13. 제 9 항의 폴리펩타이드를 포함하는 암, 혈소판감소증, 감염, 자가면역질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 리슈만편모충증, 근육병, 심부정맥혈전증 또는 심근경색 탐지에 사용하기 위한 진단용 조성물.
14. 핵산 분자 검출 분석을 이용하여 제 1 항 또는 제 2 항의 핵산 분자의 존재의 확인을 위해 피험자로부터 얻은 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 제 1 항 또는 제 2 항의 핵산 분자의 존재를 검사하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서,

    상기 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 점막 조직 또는 점액인 방법.
16. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 하나 이상의 용기에 포함하는 키트.
17. 제 8 항의 방법에 의해 생산된 폴리펩타이드.
18. 제 17 항의 폴리펩타이드를 포함하는 암, 혈소판감소증, 감염, 자가면역질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 리슈만편모충증, 근육병, 심부정맥혈전증 또는 심근경색 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
19. 제 18 항에 있어서,

    성숙한 진핵생물 히스톤을 더 포함하는 약학적 조성물.
20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,

    상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 운반체, 희석제 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
21. 제 17 항의 폴리펩타이드를 포함하는 암, 혈소판감소증, 감염, 자가면역질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 리슈만편모충증, 근육병, 심부정맥혈전증 또는 심근경색 탐지에 사용하기 위한 진단용 조성물.
22. 단백질 검출 분석을 이용하여 제 9 항의 폴리펩타이드의 존재의 확인을 위해 피험자로부터 얻은 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 제 9 항의 폴리펩타이드의 존재를 검사하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서,

    상기 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 점막 조직 또는 점액인 방법.
24. 제 4 항의 안티-센스 올리고뉴클레오티드를 하나 이상의 용기에 포함하는 키트.
25. 제 5 항의 벡터를 하나 이상의 용기에 포함하는 키트.
26. 제 6 항 또는 제 7 항의 숙주를 하나 이상의 용기에 포함하는 키트.
27. 제 9 항의 폴리펩타이드를 하나 이상의 용기에 포함하는 키트.
28. 제 17 항의 폴리펩타이드를 하나 이상의 용기에 포함하는 키트.
29. 제 12 항의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
30. 제 13 항의 진단용 조성물을 포함하는 키트.
31. 제 20 항의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
32. 제 21 항의 진단용 조성물을 포함하는 키트.
33. 제 14 항에 있어서,

    핵산 분자 검출 분석은 핵산 증폭 분석, 시퀀싱 분석 또는 혼성화 분석인 방법.
34. 제 22 항에 있어서,

    단백질 검출 분석은 크로마토그래피 분석, 전기영동 분석, 웨스턴 블럿 분석, 면역침전 분석, 아미노산 시퀀싱 분석, 또는 분광 분석인 방법.
35. 제 10 항에 있어서,

    감염은 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 곰팡이 감염인 약학적 조성물.
36. 제 10 항에 있어서,

    자가면역질환은 전신홍반성루프스, 류마티스 관절염, 또는 궤양성 대장염인 약학적 조성물.
37. 제 18 항에 있어서,

    감염은 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 곰팡이 감염인 약학적 조성물.
38. 제 18 항에 있어서,

    자가면역질환은 전신홍반성루프스, 류마티스 관절염, 또는 궤양성 대장염인 약학적 조성물.
39. 제 1 항에 있어서,

    성숙한 진핵생물 히스톤은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 13에 적어도 80% 서열 동일성을 가지며 이의 생물학적 활성의 적어도 50%를 보유하는 것인 핵산 분자.
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