KR101453982B1 - 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유효성분으로서 락토바실루스 아시도필루스 LA1(Lactobacillus acidophilus LA1(KCTC 11906BP)), 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5(KCTC 12202BP), 비피도박테리움 비피둠 BF3(Bifidobacterium bifidum BF3(KCTC 12199BP)), 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3(Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)), 비피도박테리움 롱굼 BG7(Bifidobacterium longum BG7(KCTC 12200BP)), 및 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3(KCTC 11870BP)) 또는 이들의 배양물을 포함하는, 장내 미생물총의 안정성을 유지하여 과민성 대장 증후군의 예방 또는 치료에 효과적인 조성물에 관한 것이다.

Description

과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING IRRITABLE BOWEL SYNDROME}

본 발명은 과민성 대장 증후군(Irritable Bowel Syndrome, 이하, "IBS"라 칭함)의 예방이나 치료에 유용한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 총 6종의 유산균 균주들을 포함하여 과민성 대장 증후군의 예방 및 치료에 유용한 복합 유산균 함유 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

과민성 대장 증후군(Irritable Bowel Syndrome: “IBS”)은 기질적 원인 없이 반복되는 복부 불편감 및 복통과 더불어 설사, 변비 등의 배변습관의 변화를 동반하는 만성적 질환이다. 과민성 대장 증후군은 성인의 약 10-20%에서 나타나며 복통, 변비, 설사, 그리고 복부 팽만감 등을 주 증상으로 한다. 과민성 대장 증후군은 생명을 위협하는 질환은 아니지만 환자의 사회적 및 개인적 생활을 손상시켜 삶의 질을 떨어뜨리고, 증상이 심할수록 삶의 질을 더 떨어뜨리며, 이에 따르는 사회적 비용도 매우 큰 질환이다. 이러한 과민성 장 증후군의 병태생리를 밝히고자 많은 연구가 이루어졌으며, 그 증상 발현의 기전으로서 운동이상(dysmotility), 내장감각의 변화(Visceral hypersensitivity), 비정상적인 뇌-장 상호작용(abnormal brain-gut interaction), 그리고 자율신경 이상 (autonomic dysfunction)이 제시되었다. 최근에는 장 내 세균총의 변화나 장의 염증이 과민성 장 증후군의 병태생리에 관여할 것이라는 근거들이 제시되고 있다.

IBS의 개념은 수십년 전에 확립되기는 하였으나, 아직까지도 IBS의 근본적인 치료약은 존재하지 않고, 각각의 타입의 IBS의 증상 경감을 목적으로 한 대증요법만이 행해지고 있다.

최근 프로바이오틱스(probiotics)를 이용하여 IBS의 자연사(natural history)를 변화시키는 방법이 시도되고 있는데, 미국특허 제7,125,708호는 락토바실루스 펜토수스 NCIMB 41114 균주를 포함하는 과민성 대장 증후군의 치료에 유용한 조성물을 개시하고 있다.

미국특허 제7,507,572호는 (a) 하나 이상의 분리된 락토바실루스 플란타 룸의 탄나제-생산 균주, 및 (b) 탄닌을 포함하고, 상기 하나 이상의 분리된 탄나제-생산 락토바실루스 플란타룸 균주가 락토바실루스 플란타룸 균주 HEAL 9(DSM 15312), 락토바실루스 플란타룸 균주 HEAL 19(DSM 15313); 락토바실루스 플란타룸 균주 HEAL 99(DSM 15316) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 균주인 과민성 대장 후군의 치료에 유용한 조성물을 개시하고 있다.

그러나 상기 조성물들의 과민성 대장 증후군 개선 효과는 충분하지 아니하므로, 보다 효과가 우수한 프로바이오틱스를 포함하는 과민성 대장 증후군의 치료에 유용한 조성물의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상술한 본 발명이 속하는 기술 분야의 기술적 요구에 부응하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 IBS의 예방 및 치료에 유용한 효능을 제공하는 신규한 유산균 균주들을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 다양한 종의 유산균 균주들을 포함하여 IBS의 예방 및 치료에 유용한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 다양한 종의 유산균 또는 그 배양물을 유효성분으로 하는 설사-우세형 과민성 대장 증후군, 변비-우세형 과민성 대장 증후군 또는 설사-변비 혼합형 과민성 대장 증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12202BP로서 국제기탁된 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5) 유산균에 관한 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12199BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 비피둠 BF3 (Bifidobacterium bifidum BF3) 유산균에 관한 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 11904BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3(Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3) 유산균에 관한 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12200BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 롱굼 BG7 (Bifidobacterium longum BG7) 유산균에 관한 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 락토바실루스 아시도필루스 LA1(Lactobacillus acidophilus LA1(KCTC 11906BP)), 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5(KCTC 12202BP), 비피도박테리움 비피둠 BF3(Bifidobacterium bifidum BF3(KCTC 12199BP)), 비피도박테리움 애니말리스 락티스 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)), 비피도박테리움 롱굼 BG7(Bifidobacterium longum BG7(KCTC 12200BP)), 및 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3(KCTC 11870BP)) 또는 이들의 배양물을 포함하는 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 복합 유산균을 포함하는 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물은 기타 유산균 또는 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 장내 미생물총의 안정성을 유지하는 6종의 프로바이오틱 유산균 또는 그 배양물을 포함하므로, 본 발명에 따르면, 과민성 대장 증후군의 우수한 치료제 또는 설사-우세형 과민성 대장 증후군, 변비-우세형 과민성 대장 증후군 또는 설사-변비 혼합형 과민성 대장 증후군의 치료에 유용한 조성물이 제공될 수 있다. 특히 본 발명의 조성물은 장내 세균총의 변화를 유도하여, 복통 및 배변 횟수 등의 장 증상을 개선시키며, 일상 생활 개선율도 증가시킨다.

더욱이 본 발명의 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물은 환자의 장내 미생물총의 안정성을 유지함으로써 다양한 장내 병원성 세균들의 감염을 억제할 수 있음은 물론, 부가적으로 정장작용, 지사작용, 소화촉진 작용을 나타내므로, 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물로서 의약품, 식품, 또는 건강 기능성 식품으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5) KCTC 12202BP 균주의 16S rRNA 서열, 및 본 발명의 락토바실루스 람노수스 LR5와 락토바실루스 람노수스 ^T (ATCC 7469)의 16S rRNA 서열의 상동성 및 계통발생적 관계(phylogenetic relationship)를 비교 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 락토바실루스 람노수스 LR5 균주의 지놈 DNA의 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5) KCTC 12202BP 균주의 지놈 DNA의 PFGE(Pulse Field Gel Electrophoresis) 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5) KCTC 12202BP 균주의 효소 활성 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 BF3 (Bifidobacterium bifidum BF3)KCTC 12199BP 균주의 16S rRNA 서열 및 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 BF3 균주와 비피도박테리움 비피둠 ^T(DSM 20456) 균주의 16S rRNA 서열의 상동성 및 계통발생적 관계를 비교 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 BF3 균주의 지놈 DNA의 RAPD 분석 결과이다.
도 7은 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 BF3 균주의 지놈 DNA의 PFGE 분석 결과이다.
도 8은 본 발명의 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3(Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3) KCTC 11904BP 균주의 16S rRNA 서열 및 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3과 비피도박테리움 락티스 ^T (DSM 10140)의 16S rRNA 서열의 상동성 및 계통발생적 관계를 비교 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 균주의 지놈 DNA의 RAPD 분석 결과이다.
도 10은 본 발명의 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 균주의 지놈 DNA의 PFGE 분석 결과이다.
도 11은 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 BG7 (Bifidobacterium longum BG7) KCTC 12200BP 균주의 16S rRNA 서열 및 비피도박테리움 롱굼 BG7 균주와 비피도박테리움 롱굼 ^T(ATCC 15707) 균주의 16S rRNA 서열의 상동성 및 계통발생적 관계를 비교 도시한 것이다.
도 12는 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 BG7 균주의 지놈 DNA의 RAPD 분석 결과이다.
도 13은 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 BG7 균주의 지놈 DNA의 PFGE 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 BG7 균주의 효소 활성 분석 결과이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 의한 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물의 효과를 실험하기 위한 환자의 스크리닝 및 무작위 추출 과정을 설명하기 위한 모식도이다.
도 16은 일상생활 및 장증상 개선에 대한 본 발명의 유산균 조성물(실시예) 및 위약(비교예)의 효과를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 17은 복부 불쾌감 및 복부 팽만감 개선에 대한 실시예 및 비교예의 효과를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 18은 배변 빈도 및 복부 통증 빈도 개선에 대한 실시예 및 비교예의 효과를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 19는 본 발명의 유산균 조성물(실시예) 및 위약(비교예)에 의한 복통 증상 호전 여부를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 20은 본 발명의 유산균 조성물(실시예) 및 위약(비교예)에 의한 배변 습관 변화 여부를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 21은 본 발명의 유산균 조성물(실시예) 및 위약(비교예)에 의한 전반적인 소화기 증상 개선 효과를 비교하여 도시한 그래프이다.

본 명세서에 사용되는 경우에, "치료하다(treat)", 및 "치료(treatment)"라는 용어는 과민성 대장 증후군, 특히 설사 우세형 과민성 대장 증후군(d-IBS), 변비 우세형 과민성 대장 증후군, 또는 설사-변비 혼합형 과민성 대장 증후군의 증상의 예방, 감소, 경감 또는 제거를 의미한다.

본 발명의 하나의 양상은 신규한 유산균 균주에 관한 것으로, 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12202BP로서 국제기탁된 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5) 유산균과 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12199BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 비피둠 BF3 (Bifidobacterium bifidum BF3) 유산균이다.

본 발명의 다른 양상은 신규한 유산균 균주에 관한 것으로, 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 11904BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 유산균과 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12200BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 롱굼 BG7 (Bifidobacterium longum BG7) 유산균이다.

본 발명의 또 다른 양상은 과민성 대장 증후군의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 이러한 조성물에는 아래와 같은 유산균 균종들이 포함되는데, 이러한 유산균 균주들은 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 아래와 같이 기탁되었다.

1) 락토바실루스 아시도필루 스 LA1 (Lactobacillus acidophilus LA1), KCTC 11906BP,

2) 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5), KCTC 12202BP,

3) 비피도박테리움 비피둠 BF3 (Bifidobacterium bifidum BF3), KCTC 12199BP,

4) 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3), KCTC 11904BP,

5) 비피도박테리움 롱굼 BG7 (Bifidobacterium longum BG7), KCTC 12200BP, 및

6) 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 (Streptococcus thermophilus ST3), KCTC 11870BP

락토바실루스 아시도필루스 LA1(L. acidophilus LA1)는 호기성 유산균으로 사람 및 모든 포유류와 그 밖의 동물의 장에 존재하며, 장내 자가중독의 치료에 사용된다. 락토바실루스 람노수스 LR5(L. rhamnosus)는 장에서 대부분의 유해 세균의 성장을 억제한다.

스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)는 유산균 중 가장 빠른 생장을 하는 균종으로서 빠른 생장을 통해 젖산과 같은 유기산을 다량 생산하여 주위의 산도를 낮춤으로써 병원성세균을 저해하는 효과를 나타내는 한편 다른 유산균들이 비교우위적으로 생장할 수 있는 조건을 만들어 준다. 일반적으로 락토바실루스는 소장(small intestine)이 최적 서식지이고, 비피도박테리움에 속하는 유산균종들은 대장 (colon)이 최적 서식지이기 때문에, 락토바실루스와 비피도박테리움에 속하는 유산균들로 이루어진 혼합유산균의 섭취는 단일종 혹은 소수의 서로 다른 종으로 이루어진 유산균 혼합물에 비해 높은 정장기능성을 제공할 수 있다. 본 조성물에 포함된 락토바실루스와 비피도박테리움 유산균들을 단독 혹은 혼합된 형태로 사용하였을 때 유해균의 생장을 억제하는 반면 장내 유익균의 증식을 유도하는 효능을 제공한다. 또한 이들 균주들을 아토피 (atopic dermatitis) 혹은 염증성장염 (inflammatory bowel disease) 모델 마우스에 단독 혹은 혼합된 형태로 사용하였을 때 염증성 싸이토카인 (cytokine)을 억제하는 반면 항염증성 싸이토카인의 합성을 유도하는 효능을 가지고 있다. 이와 같은 특성들은 과민성대장증후군이 장내 미생물총의 불균형과 저준위 염증반응 (low-grade inflammation)에 의해 발병한다는 점에 비추어 병증을 개선하는데 도움을 줄 수 있다.

상기 조성물은 6종의 유산균을 동일한 비율로 포함하거나, 락토바실루스 속 유산균, 비피도박테리움속 유산균 및 스트렙토코쿠스속 유산균을 1:1:1 내지 2:3:1의 비율로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 유산균 균주의 혼합물을 10⁸ 내지 10¹² cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함한다.

본 발명의 조성물은 상술한 유산균 이외에 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 써모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 및 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균을 추가로 포함할 수 있다.

상기 유산균 균주들은 유산균을 위한 일반적인 배양 방법으로 성장되고, 원심분리와 같은 분리 과정으로 회수되며, 건조, 예컨대, 동결건조에 의해 생균제 형태로 제조하여 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유효 성분 이외에 통상적인 제약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제 등과 같은 제약학적으로 통상적으로 사용되는 다양한 첨가제와 함께 제형화되어 조제될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유산균들과 적절한 담체, 부형제, 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의하여 분말제, 과립제, 정제, 캡슐 또는 액상의 형태로 제형화 될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 공지의 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 소장에 도달하여 활성 성분인 미생물이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복되어 제품화될 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 부형제는 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 글루코오스 등과 같은 설탕 및 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분, 부분적으로 전젤란틴화된 전분 등의 전분을 포함한다. 바인더는 덱스트린, 소듐알지네이트, 카라지난, 구아검, 아카시아, 아가 등의 폴라사카라이드, 트라가칸트, 젤라틴, 글루텐 등의 천연-발생 거대분자 물질, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스소듐 등의 셀룰로오스 유도체 및 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 비닐아세테이트 수지 등의 고분자를 포함한다.

분해제로는 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 저치환 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체 및 소듐카복시메틸 전분, 히드록시프로필 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분 및 부분적으로 전젤라틴화된 전분 등의 전분을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 윤활제의 예들은 활석, 스테아르산, 칼슘스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 콜로이드성 실리카, 히드로스실리콘다이옥사이드, 다양한 종류의 왁스 및 히드로게네이티드 오일 등을 포함한다.

코팅제로는 디메틸아미노에틸메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트-클로로트리메틸암모늄에틸메타크릴레이트 공중합체, 에틸셀룰로오스 등의 수불용성 중합체, 메타크릴산-에틸아크릴레이트 공중합체, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스아세테이트석시네이트 등의 장성 중합체 및 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 중합체를 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물에서 유효성분인 상기 유산균 균주들의 투여량은 치료나 예방의 목적, 치료 또는 예방하려는 환자의 종류, 환자의 증상, 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 성인 환자의 경우, 1× 10⁶ 이상의 생균, 바람직하게는 1× 10⁸ 내지 1 × 10¹²의 생균이 필요에 따라 한번 또는 나눠서 투여될 수 있다.

본 발명의 유산균 함유 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물은 사람 또는 동물에 약 또는 식품으로 투여 또는 섭취될 수 있다. 본 발명의 유산균 함유 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물을 함유하는 약품은 본 발명의 하나의 실시형태이고, 본 발명의 유산균 함유 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물을 함유하는 식품 또한 본 발명의 실시형태이다. 이러한 식품의 예로는 요구르트 및 발효된 유제품을 들 수 있지만, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 락토바실루스 람노수스 LR5 ( Lactobacillus rhamnosus LR5 ) KCTC 12202 BP 균주의 분리 및 동정화

1-1. 균주의 선발

사람 분변 1g을 멸균 혐기수에 연속 희석(serial dilution)한 후 각 희석액 1㎖을 Man-Rogosa-Sharpe(MRS. BD. USA) 고체 배지에 부어서 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니를 MRS에 BCP(Bromocresol purple, 0.17g/L)가 첨가된 락토바실루스 선택배지(BL 고체배지)에 옮긴 후 같은 조건에서 3일간 배양하였다. BCP 지시약은 유산균이 젖산을 형성하여 주변 pH가 낮아지면 보라색에서 노란색으로 변하게 된다. 콜로니 주변의 색이 노란 색으로 변한 유산균 콜로니를 선택한 후 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이 후 균주의 기능성 및 안전성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.

1-2. 선발된 균주의 동정

1) 당 이용성 분석

선발된 균주의 당 이용성을 알아보기 위하여 API 50 CHL Carbohydrate Test Kit(bioMerieux Co., France)를 이용하였다. 10 ㎖의 MRS(Man-Rogosa-Sharpe) 액체배지에서 37℃에서 16시간 배양한 후, 1 ㎖의 배양액을 회수하여 CHL 용액으로 2회 세정하였다. 이어서 원심분리(MICRO-17, Hanil, KR)에 의해 균체를 모아 9 ㎖의 CHL 용액에 재현탁시켰다. 150 ㎕의 균주 현탁액을 API 50 CHL 키트의 각 웰에 넣은 후, 오토클레이브한 파라핀 오일을 웰 내의 균주 현탁액 위에 분주하였다. 37℃에서 3일간 배양한 후 각각의 당 이용성을 비교하였다. 49가지 탄소원에 대하여 미생물 증식에 의한 색의 변화 여부를 관찰하여 각 탄소원의 이용 여부를 관찰하였고, 최종 동정 결과는 동정용 프로그램 API web을 이용하여 해석하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 동정 결과, L. rhamnosus와 99.9% 동일한 생화학적 특성을 보였다.

No.	Carbohydrate	Utilized	No.	Carbohydrate	Utilized
0	Control	-	25	Esculine	+
1	Glycerol	+	26	Salicine	+
2	Erythritol	-	27	Cellobiose	+
3	D-Arabinose	+	28	Maltose	+
4	L-Arabinose	-	29	Lactose	+
5	Ribose	+	30	Melibiose	-
6	D-Xylose	-	31	Saccharose	+
7	L-Xylose	-	32	Trehalose	+
8	Adonitol	-	33	Inuline	-
9	β-Methyl-xyloside	-	34	Melezitose	+
10	Galactose	+	35	D-Raffinose	-
11	D-Glucose	+	36	Amidon	-
12	D-Fructose	+	37	Glycogene	-
13	D-Mannose	+	38	Xylitol	-
14	L-Sorbose	+	39	β-Gentiobiose	+
15	Rhamnose	+	40	D-Turanose	-
16	Dulcitol	-	41	D-Lyxose	-
17	Inositol	+	42	D-Tagatose	+
18	Mannitol	+	43	D-Fucose	-
19	Sorbitol	+	44	L-Fucose	+
20	a-Methyl-D-mannoside	-	45	D-Arabitol	-
21	a-Methyl-D-glucoside	-	46	L-Arabitol	-
22	N-Acetyl glucosamine	+	47	Gluconate	+
23	Amygdaline	+	48	2-Ceto-gluconate	-
24	Arbutine	+	49	5-Ceto-gluconate	-

2) 16s rRNA 동정

분리된 균주로부터 지놈 DNA를 추출하여 16s rRNA 염기서열을 분석하였다.

분변에서 분리한 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)와 프라이머 R (5‘-AAGGAGGTGATCCAGCC 3’)을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다.

PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터(Promega, USA)에 연결하여 E. coli 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/ampplate에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 염기서열 분석을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V method를 이용하여 락토바실루스 람노수스^T (ATCC 7469)와 상동성을 비교하였다. 분리된 균주의 16s rRNA 염기서열은, 도 1에 도시된 바와 같이, 락토바실루스 람노수스 ^T (ATCC 7469)와 99.5%의 상동성을 보였다.

3) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) 분석

RAPD 분석은 분변에서 분리한 균주로부터 지놈 DNA를 추출하였으며, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)₅ (5’- GTGGTGGTGGTGGTG 3’) 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였다. 최종 산물인 PCR 산물은 EtBr (ethidium bromide)에 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하였다. RAPD 결과에서 분리한 균주는, 도 2에 도시된 바와 같이, 락토바실루스 람노수스^T (ATCC 7469)와 다른 밴드 패턴을 보이고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 위 결과로부터 분변에서 분리한 균주는 락토바실루스 람노수스^T (ATCC 7469)와 다른 신규 균주임을 확인하였다. 도 2에서 레인 2는 락토바실루스 람노수스^T (ATCC 7469)의 결과이고, 레인 1은 시험 균주의 결과를 나타낸다.

4) PFGE ( Pulse Field Gel Electrophoresis ) 분석

MRS broth에서 순수 배양된 락토바실루스 람노수스 LR5, L. rhamnosus ^T(ATCC 7469) 및 L. rhamnosus GG(ATCC 53103)의 O.D.를 측정한 후 2% Low Melting Agarose를 이용하여 최종 O.D=4에 맞춰 플러그(plug)를 제작하였다. 제작된 플러그를 1㎖ 라이소자임 완충액(2mg/㎖ Lysozyme (Sigma), 0.05% N-lauorylsarcosine (Sigma))에 넣고 4mg/㎖ Lysostaphin(sigma) 10 ㎕을 가한 후 37℃에서 밤새 반응시켰다. 플러그를 조심스럽게 꺼내 NDS 완충액(1 ㎖ 1M Tris-HCl(pH=8.0), 10 ㎖ 100% SDS, 89 ㎖ 0.5M EDTA(pH=8.5) 4 ㎖에 넣고 50℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 가볍게 진탕하면서 50mM EDTA(pH 8.5) 10 ㎖에서 플러그를 6번 세정한 후 처리하고자 하는 효소 완충액 400 ㎕에 플러그를 조심스럽게 옮기고 상온에서 30분 방치한다. 플러그를 새로운 효소 완충액 400㎕에 옮긴 후 제한효소(20U)를 넣고 37℃에서 밤새 반응시켰다. 이 때 제한효소는 NotI을 사용하였다. 전기영동은 CHEF 시스템(BIO-RAD, USA)을 이용하여 0.5X TBE에서 5.3cm/V, 1s~15s 펄스 타임, 20 시간 동안으로 실시하였다.

전기영동이 완료된 후, EtBr 용액으로 염색한 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 밴드 패턴을 관찰하였다. NotI을 이용한 PFGE 결과, 분변에서 분리한 락토바실루스 람노수스 LR5는 L. rhamnosus ^T(ATCC 7469) 및 L. rhamnosus GG(ATCC 53103)와 상이한 밴드패턴을 보이는 새로운 균주임을 확인하였다. 도 3에서 레인 1은 시험 균주의 결과이고, 레인 2는 락토바실루스 람노수스^T (ATCC 7469)의 결과이며, 레인 3은 L. rhamnosus GG(ATCC 53103)의 결과이다.

5) 효소활성 시험 ( API ZYM kit )

락토바실루스 람노수스 LR5의 효소활성을 측정하기 위해 API ZYM 키트를 사용하여 생성 효소의 차이를 확인하였다. API ZYM 측정 결과, 락토바실루스 람노수스 LR5(L. rhamnosus LR5), L. rhamnosus ^T (ATCC 7469) 및 L. rhamnosus GG(ATCC 53103)의 효소 활성 여부를 확인하였을 때 락토바실루스 람노수스 LR5와 L. rhamnosus GG(ATCC 53103)는 20개의 효소 지표 중 Naphol-AS-BI-포스포하이드롤라제, β-갈락토시다제 및 β-글루코시다제의 효소 활성이 동일하였다. Naphol-AS-BI-포스포하이드롤라제의 역할은 백혈구의 호중구가 식균 작용을 활성화하고 β-갈락토시다제의 역할은 대두와 같은 곡류에 많이 존재하여 대장 내 가스 발생을 유발하는 raffinose나 stachyose와 같은 당류를 분해시키는 효소이므로, 사람이나 동물에 있어서 정장효과를 내는 효소이다. β-글루코시다제의 역할은 그람 음성 병원체 균주 세포벽의 펩티도글리칸에 포함되어 있는 글루코스를 분해하여 병원성 균주의 성장을 저해시키는 효소이다.

위와 같이 분변에서 분리된 락토바실루스 람노수스 LR5는 L. rhamnosus GG(ATCC 53103)와 거의 유사한 효소활성을 보이며, L. rhamnosus ^T (ATCC 7469) 보다는 더 우수한 균주라고 여겨진다.

6) 항생제 내성 실험

분리된 락토바실루스 람노수스 LR5(L. rhamnosus LR5)의 안전성을 검증하기 위해 항생제 내성을 분석하였다. 항생제 내성실험은 European Food Safety Authority (EFSA)에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 수행하였으며, 실험에 사용된 항생제는 10종으로 암피실린(AMP), 반코마이신(VAN), 젠타미신(GEN), 카나마이신(KAN), 스트렙토마이신(STM), 에리트로마이신(ERM), 시너시드(Q/D), 클린다마이신(CLM), 테트라사이클린(TET) 및 클로람페니콜(CP)이다.

클린다마이신을 제외한 항생제에 대해서는 ISO-sensitest broth 10%와 MRS broth 90%를 혼합한 broth에 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 클린다마이신은 락토바실루스 그룹의 EFSA 브레이크 포인트 값이 0.25 ㎍/㎖ 이하이기 때문에 항생제의 농도는 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 ㎍/㎖의 농도로 첨가해 사용하였다. 또한, 시너시드는 BioMeriux 사의 E-테스트 스트립을 이용하여 진행하였다.

마이크로플레이트를 37℃하 혐기성 조건하에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 MIC를 가시적인 성장이 관찰되지 않는 최저 항생제 농도로 측정하였다. EFSA 브레이크포인트에 기초하여, 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5)가 각각의 항생제에 대해서 내성이 있는지 여부를 확인하여 하기 표 2에 나타내었다.

분리된 락토바실루스 람노수스 LR5은 실험에 사용된 모든 항생제에 대한 내성이 EFSA 항생제 내성기준 보다 낮게 나타났기 때문에 EFSA의 항생제에 대한 안전성 기준에 적합한 것으로 확인되었다.

이상의 결과를 토대로 상기 균주를 “락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5)”균주로 명명하고, 2012년 5월 7일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 12202BP를 부여받았다.

2. 비피도박테리움 비피둠 BF3 ( Bifidobacterium bifidum BF3 ) KCTC 12199 BP 의 분리 및 동정

2-1. 신규 균주의 선발

사람 분변 1g을 멸균 혐기수에 연속 희석한 후 각 희석액 1㎖을 Glucose Blood Liver (BL BD, USA)에 부어서 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니를 다시 BL에 BCP(Bromocresol purple, 0.17g/L)를 첨가한 유산균 선택 배지에 골라낸 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. 콜로니 주변의 색이 노란 색으로 변한 유산균 콜로니를 선택한 후 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이후 균주의 물리적 특성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.

2-2. 신규 균주의 동정

1) 당 이용성 분석

사람 분변에서 분리한 균주에 대해 API CHL50 키트를 이용하여 당 이용성을 확인하였다. 당 이용성 확인 결과는 API 웹(https://apiweb.biomerieux.com)에 입력하여 확인하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

No	Carbohydrates	Utilized	No	Carbohydrates	Utilized
0	Control	-	25	Esculine	-
1	Glycerol	-	26	Salicine	-
2	Erythritol	-	27	Cellobiose	-
3	D-Arabinose	-	28	Maltose	-
4	L-Arabinose	-	29	Lactose	+
5	Ribose	-	30	Melibiose	-
6	D-Xylose	-	31	Saccharose	-
7	L-Xylose	-	32	Trehalose	-
8	Adonitol	-	33	Inuline	-
9	β-Methyl-xyloside	-	34	Melezitose	-
10	Galactose	+	35	D-Raffinose	-
11	D-Glucose	+	36	Amidon	-
12	D-Fructose	+	37	Glycogene	-
13	D-Mannose	-	38	Xylitol	-
14	L-Sorbose	-	39	β-Gentiobiose	+
15	Rhamnose	-	40	D-Turanose	-
16	Dulcitol	-	41	D-Lyxose	-
17	Inositol	-	42	D-Tagatose	-
18	Mannitol	-	43	D-Fucose	-
19	Sorbitol	-	44	L-Fucose	-
20	a-Methyl-D-mannoside	-	45	D-Arabitol	-
21	a-Methyl-D-glucoside	-	46	L-Arabitol	-
22	N-Acetyl glucosamine	+	47	Gluconate	-
23	Amygdaline	-	48	2-Ceto-gluconate	-
24	Arbutine	-	49	5-Ceto-gluconate	+

2) 16s rRNA 동정

선발된 균주를 분자생물학적 방법을 이용하여 동정하기 위해서 16s rRNA 염기서열을 분석하였다. 분변에서 분리한 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)와 프라이머 R (5‘-AAGGAGGTGATCCAGCC 3’)을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다. PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터(Promega, USA)에 연결하여 E.coli 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/ampplate에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 염기서열 분석을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V method를 이용하여 B. bifidum ^T (DSM 20456)를 비롯한 비피도박테리움속 여러 균주와 상동성을 비교하였다. 분리 균주의 16s rRNA 염기서열은, 도 5에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 비피둠 ^T(DSM 20456)와 98.7%의 상동성(percentage identity scores)을 보였다.

3) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) 분석

RAPD 분석은 분변에서 분리한 비피도박테리움 비피둠 BF3로부터 지놈 DNA를 추출하였으며, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)₅ (5’-GTGGTGGTGGTGGTG 3’) 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였다. 최종 산물인 PCR 산물은 EtBr에 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하였다.

RAPD 결과에서는 분리한 균주는, 도 6에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 비피둠 BF3이 B. bifidum ^T (DSM 20456)와 상이한 밴드 패턴을 보였다. 도 6에서 레인 1은 B. bifidum ^T (DSM 20456)의 결과이고, 레인 2는 비피도박테리움 비피둠 BF3 (KCTC 12199BP)의 결과이다. 위의 결과를 토대로 분변에서 분리한 미생물인 비피도박테리움 비피둠 BF3은 B. bifidum ^T (DSM 20456)와 다른 신규 균주임을 확인하였다.

4) PFGE ( Pulse Field Gel Electrophoresis ) 분석

BL broth에서 순수 배양된 비피도박테리움 비피둠 BF3의 O.D.를 측정한 후 2% Low Melting Agarose를 이용하여 최종 OD₆₀₀=4로 맞춰 플러그(plug)를 제작한 후 여러 가지 효소를 이용해 지놈 DNA를 자른 후 전기영동을 행하고 대조군인 , B. bifidum ^T (DSM 20456)와 비교 분석하였다.

제작된 플러그를 1㎖ 라이소자임 완충액(2mg/㎖ Lysozyme (Sigma), 0.05% N-lauorylsarcosine (Sigma))에 넣고 4mg/㎖ Lysostaphin(sigma) 10㎕을 가한 후 37℃에서 밤새 반응시켰다. 플러그를 조심스럽게 꺼내 NDS 완충액(1㎖ 1M Tris-HCl(pH=8.0), 10㎖ 100% SDS, 89㎖ 0.5M EDTA(pH=8.5) 4㎖에 넣고 50℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 가볍게 진탕하면서 50mM EDTA(pH 8.5) 10㎖에서 플러그를 6번 세정한 후 처리하고자 하는 효소 완충액 400 ㎕에 플러그를 조심스럽게 옮기고 상온에서 30분 방치한다. 플러그를 새로운 효소 완충액 400㎕에 옮긴 후 제한효소(20U)를 넣고 37℃에서 밤새 반응시켰다. 이 때 제한효소는 XbaI을 사용하였다. 전기영동은 CHEF 시스템(BIO-RAD, USA)을 이용하여 0.5X TBE에서 6 cm/V, 1s~15s 펄스 타임, 20 시간 동안으로 실시하였다.

전기영동이 완료된 후, EtBr 용액으로 염색한 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 밴드 패턴을 관찰하였다. XbaI을 이용한 PFGE 결과, 분변에서 분리한 비피도박테리움 비피둠 BF3는 B. bifidum ^T (DSM 20456)와 상이한 밴드패턴을 보이는 새로운 균주임을 확인하였다. 도 7에서 레인 1은 , B. bifidum ^T (DSM 20456)의 결과이고, 레인 2는 비피도박테리움 비피둠 BF3 (ATCC 12199BP)의 결과이다.

5) 항생제 내성 평가

분리된 비피도박테리움 비피둠 BF3(B. bifidum BF3)의 안전성을 검증하기 위해 European Food Safety Authority (EFSA)에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 항생제 내성을 분석하였다. 항생제 내성 실험에 사용된 항생제는 암피실린(AMP), 반코마이신(VAN), 젠타미신(GEN), 카나마이신(KAN), 스트렙토마이신(STM), 에리트로마이신(ERM), 클린다마이신(CLM), 테트라사이클린(TET), 시너시드(Q/D) 및 클로람페니콜(CP)이다.

클린다마이신을 제외한 항생제에 대해서는 ISO-sensitest broth 10%와 MRS broth 90%를 혼합한 broth에 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 클린다마이신은 락토바실루스 그룹의 EFSA 브레이크 포인트 값이 0.25 ㎍/㎖ 이하이기 때문에 항생제의 농도는 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 사용하였다. 또한, 시너시드는 BioMeriux 사의 E-테스트 스트립을 이용하여 진행하였다.

분리된 비피도박테리움 비피둠 BF3는 실험에 사용된 모든 항생제에 대한 내성이 EFSA 항생제 내성기준 보다 낮게 나타났기 때문에 EFSA의 항생제에 대한 안전성 기준에 적합한 것으로 판단된다 (표 4 참조).

Antibiotics	MIC of BF3	EFSA breakpoint (mg/L)
Ampicilin (AMP)	<0.5	<2
Vancomycin (VAN)	<0.5	<2
Gentamycin (GEN)	<8	<64
Kanamycin (KAN)	<64	n.r.
Streptomycin (ST)	<32	<128
Erythromycin (ERM)	<0.5	<0.5
Clindamycin (CM)	<0.03	<0.25
synercid (Q/D)	<0.50	<1
Tetracycline (TET)	<8	<8
Chloramphenicol (CP)	<2	<4

위 결과를 토대로 분변에서 분리한 신규한 미생물을 비피도박테리움 비피둠 BF3 (Bifidobacterium bifidum BF3)로 명명하였으며, 2012년 5월 7 일자에 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 12199BP를 부여받았다.

3. 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 ( Bifidobacterium animali s subsp . lactis BL3 ) KCTC 11904BP의 분리 및 동정

3-1. 신규 균주의 선발

사람 분변 1g을 멸균 혐기수에 연속 희석한 후 각 희석액 1㎖을 Glucose Blood Liver (BL BD, USA) 고체 배지에 부어서 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니를 다시 BL에 BCP(Bromocresol purple, 0.17g/L)를 첨가한 유산균 선택 배지에 골라낸 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. 콜로니 주변의 색이 노란 색으로 변한 유산균 콜로니를 선택한 후 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이후 균주의 물리적 특성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.

3-2. 선발된 균주의 동정

1) 당 이용성 분석

사람 분변에서 분리한 균주에 대해 API CHL50 키트를 이용하여 당 이용성을 확인하였다. 당 이용성 확인 결과는 API 웹(https://apiweb.biomerieux.com)에 입력하여 확인하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

No	Carbohydrates	Utilized	No	Carbohydrates	Utilized
0	Control	-	25	Esculine	+
1	Glycerol	-	26	Salicine	-
2	Erythritol	-	27	Cellobiose	-
3	D-Arabinose	-	28	Maltose	+
4	L-Arabinose	w	29	Lactose	+
5	Ribose	+	30	Melibiose	+
6	D-Xylose	w	31	Saccharose	+
7	L-Xylose	-	32	Trehalose	-
8	Adonitol	-	33	Inuline	-
9	β-Methyl-xylosid e	-	34	Melezitose	-
10	Galactose	-	35	D-Raffinose	+
11	D-Glucose	+	36	Amidon	-
12	D-Fructose	-	37	Glycogene	-
13	D-Mannose	-	38	Xylitol	-
14	L-Sorbose	-	39	β-Gentiobiose	+
15	Rhamnose	-	40	D-Turanose	-
16	Dulcitol	-	41	D-Lyxose	-
17	Inositol	-	42	D-Tagatose	-
18	Mannitol	+	43	D-Fucose	-
19	Sorbitol	-	44	L-Fucose	-
20	a-Methyl-D-mannoside	-	45	D-Arabitol	-
21	a-Methyl-D-glucoside	-	46	L-Arabitol	-
22	N-Acetyl glucosamine	-	47	Gluconate	-
23	Amygdaline	+	48	2-Ceto-gluconate	-
24	Arbutine	-	49	5-Ceto-gluconate	-
w: weak change

2) 16s rRNA 동정

선발된 균주를 분자생물학적 방법을 이용하여 동정하기 위해서 16s rRNA 염기서열을 분석하였다. 분변에서 분리한 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 프라이머 R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다. PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터(Promega, USA)에 연결하여 E.coli 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/ampplate에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 염기서열 분석을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V method를 이용하여 B. lactis ^T(DSM 10140)를 비롯한 비피도박테리움속 여러 균주와 상동성을 비교하였다. 분리 균주의 16s rRNA 염기서열은, 도 8에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 락티스 ^T(DSM 10140)와 99.9%의 상동성을 보였다.

3) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) 분석

RAPD 분석은 분변에서 분리한 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3로부터 지놈 DNA를 추출하였으며, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)₅ (5'-GTGGTGGTGGTGGTG-3') 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였다. 최종 산물인 PCR 산물은 EtBr에 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하였다. 또한, PFGE 분석은 순수 배양한 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3을 최종 OD를 OD₆₀₀=4로 해서 플러그(plug)를 제작한 후 여러 가지 효소를 이용해 지놈 DNA를 잘라서 전기영동을 행한 후 대조군인 B. animalis subsp. lactis ^T (DSM 10140)와 비교 분석하였다.

RAPD 결과에서는 분리한 균주는, 도 9에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3이 B. animalis subsp. lactis ^T (DSM 10140)와 동일하게 나타났으나, B. animalis subsp. animalis ^T (ATCC 25527)과 상이한 밴드 패턴을 보였다. 도 9에서 레인 1은 B. animalis subsp. animalis ^T (ATCC 25527)의 결과이고, 레인 2는 B. animalis subsp. lactis ^T (DSM 10140)의 결과이고, 레인 3은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3의 결과이다. 위의 결과를 토대로 분변에서 분리한 미생물인 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3은 B. animalis subsp. animalis ^T (ATCC 25527)와 다른 신규 균주임을 확인하였다.

4) PFGE ( Pulse Field Gel Electrophoresis ) 분석

BL broth에서 순수 배양된 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3의 O.D.를 측정한 후 2% Low Melting Agarose를 이용하여 최종 OD₆₀₀=4로 맞춰 플러그(plug)를 제작한 후 여러 가지 효소를 이용해 지놈 DNA를 자른 후 전기영동을 행하고 대조군인 B. animalis subsp. lactis ^T (DSM 10140) 및 B. animalis subsp. animalis ^T (ATCC 25527)와 비교 분석하였다.

제작된 플러그를 1㎖ 라이소자임 완충액(2mg/㎖ Lysozyme (Sigma), 0.05% N-lauorylsarcosine (Sigma))에 넣고 4mg/㎖ Lysostaphin(sigma) 10㎕을 가한 후 37℃에서 밤새 반응시켰다. 플러그를 조심스럽게 꺼내 NDS 완충액(1㎖ 1M Tris-HCl(pH=8.0), 10 ㎖ 100% SDS, 89 ㎖ 0.5M EDTA(pH=8.5) 4㎖에 넣고 50℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 가볍게 진탕하면서 50mM EDTA(pH 8.5) 10㎖에서 플러그를 6번 세정한 후 처리하고자 하는 효소 완충액 400 ㎕에 플러그를 조심스럽게 옮기고 상온에서 30분 방치한다. 플러그를 새로운 효소 완충액 400㎕에 옮긴 후 제한효소(20U)를 넣고 37℃에서 밤새 반응시켰다. 이 때 제한효소는 SpeI과 XbaI을 사용하였다. 전기영동은 CHEF 시스템(BIO-RAD, USA)을 이용하여 0.5X TBE에서 6 cm/V, 10s~20s 펄스 타임, 20 시간 동안으로 실시하였다.

전기영동이 완료된 후, EtBr 용액으로 염색한 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 밴드 패턴을 관찰하였다. SpeI과 XbaI을 이용한 PFGE 결과, 분변에서 분리한 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3은 B. animalis subsp. lactis ^T (DSM 10140)와 동일하게 나타났으며, B. animalis subsp. animalis ^T (ATCC 25527)와 상이한 밴드패턴을 보이는 새로운 균주임을 확인하였다. 도 10에서 레인 1은 B. animalis subsp. animalis ^T (ATCC 25527)의 결과이고, 레인 2는 B. animalis subsp. lactis ^T (DSM 10140)의 결과이며, 레인 3은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3의 결과이다.

5) 항생제 내성 평가

분리된 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3의 안전성을 검증하기 위해 항생제 내성을 분석하였다. 항생제 내성실험은 European Food Safety Authority (EFSA)에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 수행하였으며, 실험에 사용된 항생제는 10종으로 암피실린(AMP), 반코마이신(VAN), 젠타미신(GEN), 카나마이신(KAN), 스트렙토마이신(STM), 에리트로마이신(ERM), 시너시드(Q/D), 클린다마이신(CLM), 테트라사이클린(TET) 및 클로람페니콜(CP)이다.

클린다마이신을 제외한 항생제에 대해서는 ISO-sensitest broth 10%와 MRS broth 90%를 혼합한 broth에 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 클린다마이신은 락토바실루스 그룹의 EFSA 브레이크 포인트 값이 0.25㎍/㎖ 이하이기 때문에 항생제의 농도는 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125㎍/㎖의 농도로 첨가하여 사용하였다. 또한, 시너시드는 BioMeriux 사의 E-테스트 스트립을 이용하여 진행하였다.

마이크로플레이트를 37℃하 혐기성 조건하에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 MIC를 가시적인 성장이 관찰되지 않는 최저 항생제 농도로 측정하였다. EFSA 브레이크포인트에 기초하여, 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3이 각각의 항생제에 대해서 내성이 있는지 여부를 확인하여 하기 표 6에 나타내었다.

Antibiotics	MIC of BL3	EFSA breakpoint (mg/L)
Ampicilin (AMP)	<0.5	<2
Vancomycin (VAN)	<0.5	<2
Gentamycin (GEN)	<16	<64
Kanamycin (KAN)	<256	n.r.
Streptomycin (ST)	<16	<128
Erythromycin (ERM)	<0.5	<0.5
Clindamycin (CM)	<0.03	<0.25
synercid (Q/D)	<0.19	<1
Tetracycline (TET)	<8	<8
Chloramphenicol (CP)	<2	<4

분리된 비피도박테리움 비피둠 BF3는 실험에 사용된 모든 항생제에 대한 내성이 EFSA 항생제 내성기준 보다 낮게 나타났기 때문에 EFSA의 항생제에 대한 안전성 기준에 적합한 것으로 판단된다.

위 결과를 토대로 분변에서 분리한 신규한 미생물을 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3(Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3)로 명명하였으며, 2012년 5월 7일자에 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 11904를 부여받았다.

4. 비피도박테리움 롱굼 BG7 ( Bifidobacterium longum BG7 ) ( KCTC 12200 BP )의 분리 및 동정

4-1. 신규 균주의 선발

사람 분변 1g을 멸균 혐기수에 연속 희석한 후 각 희석액 1㎖을 Glucose Blood Liver (BL BD, USA) 고체 배지에 부어서 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니를 다시 BL에 BCP(Bromocresol purple, 0.17g/L)를 첨가한 유산균 선택 배지에 골라낸 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. 콜로니 주변의 색이 노란 색으로 변한 유산균 콜로니를 선택한 후 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이후 균주의 물리적 특성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.

4-2. 선발된 균주의 동정

1) 당 이용성 분석

사람 분변에서 분리한 균주에 대해 API CHL50 키트를 이용하여 당 이용성을 확인하였다. 당 이용성 확인 결과는 API 웹 (https://apiweb.biomerieux.com)에 입력하여 확인하여, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

2) 16s rRNA 동정

선발된 균주를 분자생물학적 방법을 이용하여 동정하기 위해서 16s rRNA 염기서열을 분석하였다. 분변에서 분리한 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)와 프라이머 R (5‘-AAGGAGGTGATCCAGCC 3’)을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다. PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터(Promega, USA)에 연결하여 E.coli 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/ampplate에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 염기서열 분석을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V method를 이용하여 B. longum ^T(ATCC 15707)를 비롯한 비피도박테리움속 여러 균주와 상동성을 비교하였다. 분리 균주의 16s rRNA 염기서열은, 도 11에 도시된 바와 같이, B. longum ^T(ATCC 15707)와 99.1%의 상동성을 보였다.

3) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) 분석

RAPD 분석은 분변에서 분리한 비피도박테리움 롱굼 BG7로부터 지놈 DNA를 추출하였으며, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)₅ (5’-GTGGTGGTGGTGGTG 3’) 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였다. 최종 산물인 PCR 산물은 EtBr에 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하였다. 또한, PFGE 분석은 순수 배양한 비피도박테리움 롱굼 BG7를 최종 OD를 OD₆₀₀=4로 해서 플러그를 제작한 후 여러 가지 효소를 이용해 지놈 DNA를 잘라서 전기영동을 행한 후 대조군인 B. longum ^T (ATCC 15707)와 비교 분석하였다.

RAPD 결과에서는 분리한 균주는, 도 12에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 롱굼 BG7가 B. longum ^T (ATCC 15707)와 상이한 밴드 패턴을 보였다. 도 12에서 레인 1은 B. longum ^T (ATCC 15707)의 결과이고, 레인 2는 비피도박테리움 롱굼 BG7의 결과이다. 위의 결과를 토대로 분변에서 분리한 미생물인 비피도박테리움 롱굼 BG7는 B. longum ^T (ATCC 15707)와 다른 신규 균주임을 확인하였다.

4) PFGE ( Pulse Field Gel Electrophoresis ) 분석

BL broth에서 순수 배양된 비피도박테리움 롱굼 BG7의 O.D.를 측정한 후 2% ow Melting Agarose를 이용하여 최종 OD₆₀₀=4로 맞춰 플러그(plug)를 제작한 후 여러 가지 효소를 이용해 지놈 DNA를 자른 후 전기영동을 행하고 대조군인 B. longum ^T (ATCC 15707)와 비교 분석하였다.

제작된 플러그를 1㎖ 라이소자임 완충액(2mg/㎖ Lysozyme (Sigma), 0.05% N-lauorylsarcosine (Sigma))에 넣고 4mg/㎖ Lysostaphin(sigma) 10㎕을 가한 후 37℃에서 밤새 반응시켰다. 플러그를 조심스럽게 꺼내 NDS 완충액(1㎖ 1M Tris-HCl(pH=8.0), 10 ㎖ 100% SDS, 89 ㎖ 0.5M EDTA(pH=8.5) 4㎖에 넣고 50℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 가볍게 진탕하면서 50mM EDTA(pH 8.5) 10㎖에서 플러그를 6번 세정한 후 처리하고자 하는 효소 완충액 400 ㎕에 플러그를 조심스럽게 옮기고 상온에서 30분 방치한다. 플러그를 새로운 효소 완충액 400㎕에 옮긴 후 제한효소(20U)를 넣고 37℃에서 밤새 반응시켰다. 이 때 제한효소는 XbaI과 ApaI을 사용하였다. 전기영동은 CHEF 시스템(BIO-RAD, USA)을 이용하여 0.5X TBE에서 5.3cm/V, 1s~15s 펄스 타임, 18 시간 동안으로 실시하였다.

전기영동이 완료된 후, EtBr 용액으로 염색한 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 밴드 패턴을 관찰하였다. XbaI과 ApaI을 이용한 PFGE 결과, 분변에서 분리한 비피도박테리움 롱굼 BG7은 B. longum ^T (ATCC 15707)와 상이한 밴드패턴을 보이는 새로운 균주임을 확인하였다. 도 13에서 레인 1은 B. longum ^T (ATCC 15707)의 결과이고, 레인 2는 비피도박테리움 롱굼 BG7의 결과이다.

5) 효소 활성 시험

비피도박테리움 롱굼 BG7(B. longum BG7)의 효소활성을 측정하기 위해 API ZYM 키트를 사용하여 생성 효소의 차이를 확인하였다. 비피도박테리움 롱굼 BG7과 B. longum ^T (ATCC 15707)의 효소활성 여부를 비교하였을 때 비피도박테리움 롱굼 BG7는 B. longum ^T (ATCC 15707)와 거의 유사한 효소 활성을 나타내었다. 특히, 비피도박테리움 롱굼 BG7은 B. longum ^T (ATCC 15707)에서 효소 활성을 나타내지 않는 β-글루코시다제 활성을 보이며, 이러한 효소는 그람 음성 병원체 균주 세포벽의 펩티도글리칸에 포함되어 있는 글루코스를 분해하여 병원성 균주의 성장을 저해시키는 역할을 한다. 또한, 발암성 효소인 β-Glucuronidase의 활성을 보이지 않았다.

6) 항생제 내성 평가

분리된 비피도박테리움 롱굼 BG7의 안전성을 검증하기 위해 항생제 내성을 분석하였다. 항생제 내성실험은 European Food Safety Authority (EFSA)에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 수행하였으며, 실험에 사용된 항생제는 10종으로 암피실린(AMP), 반코마이신(VAN), 젠타미신(GEN), 카나마이신(KAN), 스트렙토마이신(STM), 에리트로마이신(ERM), 시너시드(Q/D), 클린다마이신(CLM), 테트라사이클린(TET) 및 클로람페니콜(CP)이다. 클린다마이신을 제외한 항생제에 대해서는 ISO-sensitest broth 10%와 MRS broth 90%를 혼합한 broth에 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 ㎍/㎖의 농도로 첨가, 클린다마이신은 락토바실루스 그룹의 EFSA 브레이크 포인트 값이 0.25 ㎍/㎖ 이하이기 때문에 항생제의 농도는 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 ㎍/㎖의 농도로 첨가해 사용하였다. 또한, 시너시드는 BioMeriux 사의 E-테스트 스트립을 이용하여 진행하였다.

마이크로플레이트를 37℃하 혐기성 조건하에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 MIC를 가시적인 성장이 관찰되지 않는 최저 항생제 농도로 측정하였다. EFSA 브레이크포인트에 기초하여, 비피도박테리움 롱굼 BG7이 각각의 항생제에 대해서 내성이 있는지 여부를 확인하여 하기 표 9에 나타내었다.

분리된 비피도박테리움 롱굼 BG7은 실험에 사용된 모든 항생제에 대한 내성이 EFSA 항생제 내성기준 보다 낮게 나타났기 때문에 EFSA의 항생제에 대한 안전성 기준에 적합한 것으로 판단된다.

위 결과를 토대로 분변에서 분리한 신규한 미생물을 비피도박테리움 롱굼 BG7 (Bifidobacterium longum BG7)으로 명명하였으며, 2012년 5월 7일자에 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 12200BP를 부여받았다.

5. 과민성 대장 증후군 예방/치료용 조성물 제조

(1) 유산균 발효 배지

본 발명의 조성물에 포함되는 유산균 균주의 배양을 위한 발효 배지는 탈지분유와 대두 분리 단백질을 각각 단독 혹은 혼합하여 1%-10% (w/v) 수용액으로 만든 후 유산균종에 따라 단백질 대비 0.01%-1% (w/w) 범위의 단백분해 효소 (Delvolase; DSM, 네덜란드) 용액을 가하여 효소처리한다. 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 롱굼의 유산균종에 대해서는 효소처리 단계를 생략하였다.

효소처리 후 상기 효소처리 반응액에 0.1%-5% (w/v) 범위의 포도당, 유당, 과당, 혹은 자당 등의 당류, 0.1%-5% (w/v) 범위의 효모추출물, 0.1%-5% (w/v) 범위의 소이펩톤, 0.01%-0.1% (w/v) 범위의 암모니움 시트레이트, 소디움 아세테이트, 디포타시움 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 망간 설페이트, 소디움 클로라이드의 이온성분을 첨가하고 용해시켜 유산균 배양배지를 준비하였다. 준비된 유산균 배양배지는 열교환기 (Heat exchanger)를 이용하여 살균하였다.

(2) 유산균 배양 및 유산균 원말 제조

상기 (1) 단계에서 준비된 유산균 발효 배지에 전배양한 유산균 종균을 0.1%-1% (v/v) 수준으로 접종하고 37℃, pH 5.0-6.0 범위에서 유지되도록 하여 유산균종에 따라 8시간-18시간 동안 발효배양하였다. 유산균 배양이 종료된 후 유산균체를 연속식 원심분리기(Separator)를 이용하여 분리 및 농축하였다. 분리된 유산균체는 동결보호제 등을 첨가하여 동결건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 유산균체를 분쇄하여 일정한 입도를 가지게 한 후 유산균 원말로 제조하였다.

(3) 유산균 조성물의 제조

상기 단계(2)에서 제조된 유산균 원말은 다음과 같은 생균수를 가지는 것으로 측정되었다;

락토바실루스 아시도필루스 LA1 유산균 (1X10⁹ CFU/g 이상),

락토바실루스 람노수스 LR5 유산균 (1X10⁹ CFU/g 이상),

비피도박테리움 비피둠 BF3 비피더스균(1X10⁹ CFU/g 이상),

비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 비피더스균(1X10⁹ CFU/g 이상),

비피도박테리움 롱굼 BG7 비피더스균 (5X10⁹ CFU/g 이상),

스트렙토코쿠스 써모필루스 ST3 유산균 (1X10⁹ CFU/g 이상).

본 실시예에서는 각 유산균종을 하기 표 10의 조성으로 부형제와 함께 혼합하여 캡슐당 500mg이 되도록 혼합하였으며, 총 생균수는 5 X 10⁹ CFU/g이 되도록 히드록시프로필메틸셀룰로오스 캡슐로 제조하였다. 이렇게 하여 제조된 본 발명의 조성물을 4주간 IBS 환자에게 매일 경구로 1회 1 캡슐씩 2회에 걸쳐 투여하였다(1.0× 10¹⁰ CFU/day).

원료명	비율 (%)
스트렙토코쿠스 써모필루스 ST3 유산균	2.3
락토바실루스 람노수스 LR5 유산균	2.1
락토바실루스 아시도필루스 LA1 유산균	2.3
비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3	2.3
비피도박테리움 비피둠 BF3 비피더스균	2.0
비피도박테리움 롱굼 BG7 비피더스균	2.1
말토덱스트린	50.0
옥수수전분	35.9
이산화규소	1.0
합계	100.0

비교예

비교예는 유효성분인 유산균 균종들을 포함하지 않고 상기 표 10의 부형제만을 포함하는 외관, 색 및 크기가 동일한 위약(placebo)으로 제조하였다.

실험예

1. 실험 대상 스크리닝

설사-우세형 또는 변비-우세형 과민성 대장 증후군(IBS)을 앓고 있는 환자를 이용하여 임상 연구를 아래 조건 하에서 실시하였다.

대상: 로마 III 진단 기준(문헌[Longstreth GF, Thompson WG, Chey WD, Houghton LA, Mearin F, Spiller RC. Functional bowel disorders. Gastroenterology 2006; 130: 1480-91])에 따른 IBS를 앓고 있는 환자

대상 환자 수: 50명

시험 기간: 1주의 스크리닝 기간 및 4주의 치료기간

도 1을 참조하면, 전체 60명의 IBS를 앓고 있는 환자 가운데 49명을 스크리닝하여, 이들 49명을 실시예 25명과 비교예 24명의 두 그룹으로 무작위 추출하였다. 50명 중 17명은 남성이었고, 32명은 여성이었다. 실시예의 조성물 투여군(실시예) 및 비교예의 위약 투여군(비교예)에서 실험을 완료하지 못한 환자는 없어, 총 49명의 환자에 대하여 실험을 완료하였다. 치료 시작 전 기준 시점에서의 환자의 특징을 아래 표 11에 정리하였다. 모든 값은 평균값±표준편차(SD)로 나타내었다.

특징	실시예 (n=25)	비교예 (n=24)	P 값
연령	45.9 ± 13.9	43.3± 15.3	0.53
성별, 남성:여성	11:14	6:18	0.385
IBS 타입: 설사형	17	15	0.77
IBS 타입: 변비형	9	8	1
	VAS 평균 스코어±SD
증상	실시예	비교예	P 값
정상 활동 곤란	2.28±1.24	4.83±2.30	0.17
GI 증상 곤란	4.64±2.18	4.96±1.90	0.59
복부 통증의 중증도	2.32±0.75	2.17±0.76	0.48
복부 불쾌감의 중증도	2.64±0.81	2.42±0.78	0.33
설사의 중증도	2.24±0.93	2.21±0.83	0.90
변비의 중증도	1.92±0.91	1.96±1.27	0.90
복부팽만감 중증도	2.72±0.79	2.50±1.25	0.47
가스 통과 중증도	3.12±0.93	2.79±1.18	0.28
배변 빈도	6.88±4.72	6.25±4.58	0.63
복부통증 빈도	2.28±1.24	2.50±1.69	0.61

2. IBS 증상 및 대변 파리미터 임상 평가

본 발명의 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물의 유효성은, 치료기간(4주) 동안 환자가 매일 자가 설문의 형식으로 IBS 증상의 호전 여부를 평가 및 기록하도록 하여 평가하였다. 1차 평가항목은 전반적인 IBS 증상에 대한 적절한 증상 완화(appropriate relief, AR) 효과로, 투여 후 4주 동안 전반적인 IBS 증상에 대한 적절한 증상 완화 효과를 체크하였다.

스크리닝 및 치료기간 동안에 환자들의 다음의 IBS와 관련된 10 가지 증상에 대하여 매일 기록하였고, 이러한 10 가지 증상에 대한 반응률을 평가하였다: 정상 활동 곤란, 장증상 곤란, 복부 통증, 복부 불쾌감, 설사, 변비, 복부 팽만감, 가스 통과, 배변 빈도, 및 복부 통증 빈도. 각각의 증상을 최대 점수 10점으로 하여 10-cm 시각 아날로그 척도(visual analogue scale, “VAS”)로 평가하였다. 배변 빈도는 하루 중 배변 횟수로 평가하였다. 개시 시점 및 4주 후의 IBS와 관련된 6 가지 증상의 개선 정도를 도 16 내지 도 18에 나타내었고, 복통 증상 호전 여부, 배변습관 변화 여부 및 전반적 소화기 증상 개선 여부를 도 19 내지 도 21에 각각 나타내었다.

도 16 내지 도 18의 결과를 참조하면, 실시예 및 비교예의 경우 모두 설사와 변비의 중증도는 유의한 개선을 보였으나, 복통의 중증도와 복통의 빈도 및 배변 횟수는 실시예의 경우에만 유의한 개선을 보임을 확인하였다.

한편, 도 19 내지 도 21을 참조하면, 4주 치료 후 본 발명의 조성물을 투여한 군과 위약을 투여한 군 사이의 비교에서 복통 호전율(96.0% vs 70.8%), 배변습관 만족율(96% vs 75%), 일상 생활 개선율(96% vs 75%)은 본 발명의 조성물을 투여한 군이 더 높게 나타났다(p<0.05). 이상의 결과로부터, 본 발명의 조성물이 과민성 대장 증후군 과민성 대장 증후군의 치료에 효과적이며, 특히 복통 및 배변 횟수 등의 장 증상을 개선시킨다는 것을 확인할 수 있다.

3. 장내 미생물총 검사

(1) 세균 균주 및 배양 조건 ( Bacterial Strain and Growth Conditions )

모든 유산균 균주들을 육즙 배지에서 혐기적 조건하의 37℃ 조건에서 13-18시간 동안 배양하였다. 비피도박테리움 비피둠 BF3, 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3, 비피도박테리움 롱굼 BG7 균주를 glucose blood liver broth(BL,Difco USA)에서 배양하였고, 락토바실루스 아시도필루스 LA1, 락토바실루스 람노수스 LR5, 및 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 균주는 ManRogosaSharpe broth (MRS, Difco)에서 배양하였다.

(2) 대변 시료로부터 게놈성 DNA 의 준비

49명의 환자 중 33명의 환자(실시예: 18명, 비교예: 15명)로부터 대변 시료를 접수하여 냉동보관하였다. 각 환자의 대변 시료에서 게놈성 DNA를 추출하기 위해서, 환자로부터 채취하여 냉동 보관했던 대변을 4℃에서 밤새 해동한 후, 각 시료로부터 200 mg씩 취하여 9 ㎖의 C-버퍼 (0.6% KH₂PO₄, 0.45% Na₂HPO₄, 0.05% Tween 80, 및 0.05% 시스테인)에 현탁시키고, 균질화한 후 1회용 10 ㎖ 주사기 내에 패킹된 유리솜을 통과시켰다.

통과된 결과물을 4℃에서 10분간 12,000 rpm으로 원심분리(MICRO 17R)하였다. 동일한 버퍼로 펠렛을 3회 세정하고, 10 mg의 최종 펠렛을 200㎕의 리소자임 용액 (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 2 mM EDTA, 1.2% Triton X-100, 및 20 mg/㎖ lysozyme (Sigma))에 재현탁시킨 후, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 제조자의 설명에 따라서 AcuuPrep 게놈 추출 키트 (Bioneer, Seoul, Korea)를 이용하여 전체 게놈 DNA를 추출하였다.

(3) 대변 미생물총의 정량분석

본 실시예에서는 실시간 PCR 정량분석법에 의해서 IBS에서 대변 미생물총의 조성의 변화를 분석하였다.

가. 프라이머( Primers )

qPCR에 이용된 프라이머를 하기 표 3에 나타내었다. qPCR 수행하는 동안에 분변 내의 타겟 균주의 교차-증폭(cross-amplification)을 배제하기 위해서, 프라이머 세트의 특이성을 상기 실시예에서 조성물에 포함된 각 균주로부터 추출된 DNA를 이용하여 평가하였다.

나. 실시간 정량 PCR( Real time quantitative PCR )

1 ㎕의 템플릿 DNA, 0.5 ㎕의 각각의 프라이머(10 pm), 10 ㎕의 SYBR Green I 매스터(Roche, Germany), 및 8 ㎕의 H₂O를 포함하는 20 ㎕의 총 용적으로 정량 PCR 분석을 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 4 분간 예비-인큐베이션하고, 94℃에서 15초간 변성, 54℃에서 15초간 어닐링, 및 72℃에서 20초간 신장의 55 사이클로 수행하였다. 사이클 마다 88℃에서 5초간 형광 검출하고, 55℃부터 95℃까지 0.5℃씩 올리면서 용해 곡선(melting curve)을 그렸다.

다. 표준곡선( standard curve )

표준 곡선은 실시예의 조성물의 각 균주의 순수 배양물을 이용하여 작성하였다. 1 ㎖의 세포 배양물 중의 총 세포수를 헤마토싸이토미터(MARIENFELD, 0.0025 ㎟, Germany)를 이용하여 측정하였다. 상술한 바와 같이 하여, 1 ㎖의 세포 배양물로부터 게놈 DNA를 준비하였다. DNA의 농도는 e-spect (Malcom,Japan)를 이용하여 측정하고, 연속적으로 10배 희석하였다. 하기 표 12에 나타낸 종-특이성 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭후, 대응하는 희석액의 총 세포수에 대하여 Cp (Cross point) 값을 플로팅하였다. 각각의 표준 균주로부터의 DNA를 신뢰성을 높이기 위해 3회 반복하여 실시간 PCR에 의해 증폭하고, R²>0.99인 곡선을 수득하였다. 각 균주에 대한 PCR에 의해서 구한 Cp 값을 표준 곡선을 이용하여 1g의 분변 내의 총 세포수에 대한 값으로 변환하였다.

Targeted species	Primer	Sequence ( 5'-3')	Reference
B. longum	F	CAGTTGATCGCATGGTCTT	1,5
	R	TAC CCG TCG AAG CCAC
B. bifidum	BiBIF-1	CCACATGATCGCATGTGATTG	2,5
	BiBIF-2	CCGAAGGCTTGCTCCCAAA
B. lactis	F	CCCTTTCCACGGGTCCC	1
	R	AAGGGAAACCGTGTCTCCAC
L. acidophilus	F acid IS	GAAGAGCCCAAACCAAGTGATT	3
	R acid IS	CTTCCCAGATAATTCAACTATCGCTTA
L. rhamnosus	LU-5	CTAGCGGGTGCGACTTTGTT	4
	RhaII	GCGATGCGAATTTCTATTAT
S. thermophilus	ThI	ACG GAA TGT ACT TGA GTT TC	6
	ThII	TTT GGC CTT TCG ACC TAA C

본 발명의 조성물(실시예)과 위약(비교예)의 투약 전후에 따른 장내 미생물총의 변화를 하기 표 13에 나타내었다.

상기 표 13에 나타나는 바와 같이, 락토바실루스 람노수스 LR5 , 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 및 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3가 유의하게 증가하여 장내 세균총의 변화를 유도함을 확인할 수 있다.

또한 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3가 10배 증가한 그룹에서 복부 통증 및 복통 빈도의 개선효과 사이의 연관 관계를 조사하였다. 하기 표 14에 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 증가 군과 복통 빈도 호전과의 연관성을 표로 나타내었고, 표 6에 락토바실루스 람노수스 LR5 증가 군과 복통빈도 호전 사이의 연광성을 나타내었다.

	전체 (N=33)			설사 그룹(N=23)
복통 빈도 호전	변화 없음 (N=22)	10배 이상 증가* (N=12)	P value	변화 없음 (N=14)	10배 이상 증가* (N=9)	P value
	45.5% (10/22)	91.9% (11/12)	0.011	57.1% (8/14)	100.0% (9/9)	0.048

10배 이상 증가^*; N log10 cells/g feces로 계산

*, P < 0.05

	전체(N=33)			설사 그룹 (N=23)
복통 빈도 호전	변화 없음 (N=19)	10배 이상 증가* (N=15)	P value	변화 없음 (N=11)	10배 이상 증가* (N=12)	P value
	47.4% (9/19)	80.0% (12/15)	0.079	54.5% (6/11)	91.7% (11/12)	0.069

10배 이상 증가^*; N log10 cells/g feces로 계산

*, P < 0.05

상기 표 14의 결과를 통해서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 조성물의 투약 전 대비 투약 이후에 개체수가 증가한 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3, 락토바실루스 람노수스 LR5 및 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 중 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 균이 증가한 군에서 복통 빈도가 유의하게 호전되었고, 이는 설사형 IBS에서 더 뚜렷하였다. 또한 상기 표 15의 결과를 참고하면, 락토바실루스 람노수스 LR5 균의 증가한 군에서도 이와 유사하게 복통 빈도가 호전되는 결과를 확인할 수 있다.

이상과 같이 본 발명의 6종의 유산균 균종을 포함하는 조성물은 IBS 증상의 적절한 완화를 제공하고, 특히 복통 및 배변 횟수와 같은 장 증상을 개선하며 일상 생활도 향상시킨다는 것을 확인하였고, 또한 본 발명의 조성물의 치료 효과는 장내 미생물총의 변화와 연관된 것임을 확인하였다.

본 발명은 그 사상 및 범위로부터 벗어남 없이 다양하게 변형 및 변화되어 실시될 수 있고, 이러한 사실은 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에 기재된 구체적 실시예는 단지 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서 정해져야 하며, 상기의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 보호범위에 포함되는 것으로 의도된다.

한국생명공학연구원 KCTC11906BP 20120428 한국생명공학연구원 KCTC12202BP 20120507 한국생명공학연구원 KCTC12199BP 20120507 한국생명공학연구원 KCTC11904BP 20120507 한국생명공학연구원 KCTC12200BP 20120507 한국생명공학연구원 KCTC11870BP 20110302

Claims (14)

1. 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12202BP로서 국제기탁된 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5) 유산균.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 락토바실루스 아시도필루스 LA1(Lactobacillus acidophilus LA1(KCTC 11906BP)), 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5(KCTC 12202BP), 비피도박테리움 비피둠 BF3(Bifidobacterium bifidum BF3 (KCTC 12199BP)), 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)), 비피도박테리움 롱굼 BG7 (Bifidobacterium longum BG7(KCTC 12200BP)), 및 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3(KCTC 11870BP)) 또는 이들의 배양물을 포함하는 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 조성물이 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 유산균 혼합물을 10⁸ 내지 10¹² cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 조성물이 설사-우세형 과민성 대장 증후군, 변비-우세형 과민성 대장 증후군, 또는 설사-변비 혼합형 과민성 대장 증후군의 예방 또는 치료에 유용한 것임을 특징으로 하는 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물.
   
8. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 써모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 및 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균을 추가로 포함하는 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물.
   
9. 제5항에 있어서, 상기 조성물이 제약학적 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물.
   
10. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실루스 속 유산균, 비피도박테리움속 유산균 및 스트렙토코쿠스속 유산균을 1:1:1 내지 2:3:1의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물.
    
11. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 6종의 유산균을 동일한 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물.
    
12. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 유산균 균주들을 동결건조하여 생균제 형태로 제조된 것임을 특징으로 하는 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물.
    
13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 유산균 함유 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물로 이루어진 것을 특징으로 하는 약품.
    
14. 락토바실루스 아시도필루스 LA1(Lactobacillus acidophilus LA1(KCTC 11906BP)), 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5(KCTC 12202BP), 비피도박테리움 비피둠 BF3(Bifidobacterium bifidum BF3 (KCTC 12199BP)), 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)), 비피도박테리움 롱굼 BG7 (Bifidobacterium longum BG7(KCTC 12200BP)), 및 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3(KCTC 11870BP)) 또는 이들의 배양물을 포함하는 식품.

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