KR101453190B1

KR101453190B1 - 아마로젠틴을 포함하는 피부주름 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101453190B1
Application number: KR1020130005520A
Authority: KR
Inventors: 송혜진; 김미선; 이상화
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2033-01-17
Also published as: KR20140093119A

Abstract

본 발명은 아마로젠틴을 포함하는 피부주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피부세포의 콜라겐 타입 I의 합성 및 TIMP-1의 합성을 촉진할 뿐만 아니라, 라미닌 5의 발현을 증가시키고 PAI-1의 합성을 촉진시키는 효과를 가지는 아마로젠틴을 유효성분으로 포함하는 피부주름 억제 및 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

아마로젠틴을 포함하는 피부주름 개선용 조성물{Composition for improving skin wrinkle containing amarogentin}

본 발명은 아마로젠틴을 포함하는 피부주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아마로젠틴을 유효성분으로 포함하는 피부주름 억제 및 개선용 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경으로부터 인체를 보호하고, 내부의 수분 및 유용 성분이 밖으로 유출되는 것을 막아주는 장벽기능, 체온조절, 배설 등 다양한 생리적 기능을 담당하고 있는 중요한 기관이다. 일반적으로 피부 노화의 주요 원인은 나이의 증가와 외부 인자들인 것으로 알려져 있다.

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로써 세포 외 간질에 존재하고, 중요한 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 및 세포 접착의 지탱 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선과 같은 외부 자극에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 노화가 되면 콜라겐 자체의 합성이 줄어들 뿐 아니라 콜라겐을 포함한 결합조직을 분해하는 MMPs(기질 금속 단백질 분해 효소, matrix metalloproteinase)의 활성이 증가하여 피부조직 내의 콜라겐 분해를 촉진시켜 콜라겐의 함량이 저하되는 원인이 되기도 한다고 알려져 있다. 이러한 MMPs를 억제하는 내재성 억제제인 TIMP(Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinase)가 존재하는데 MMPs와 TIMP의 활성이 균형을 이루어 적절히 조절이 될 때에 생리적인 조직의 재구성과 항상성이 잘 유지되게 된다.

TIMP는 TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, 및 TIMP-4의 4종이 알려져 있는데, 이 중에서 특히 TIMP-1는 MMP-1 및 젤라티나아제(MMP-2, MMP-9) 등의 MMPs의 활성부위에 결합하여 그들의 분해능을 거의 비가역적으로 저해한다.

즉, 노화에 따른 피부 주름 발생의 중요한 원인이 되는 피부 속 콜라겐은 합성력이 저하되는 것뿐 아니라 분해가 촉진되는데 이 항상성의 주요 기능을 MMPs 및 TIMP가 담당하고 있으며 MMPs는 콜라겐을 포함한 결합조직을 분해함으로써 피부 노화를 촉진시키며 TIMP-1이 이를 저해하는 작용을 수행하게 되는 것이다.

피부 기저막(skin basement membrane)은 표피세포의 지지 및 부착, 영양물질의 이동, 표피분화의 조절 등에 있어 중요한 역할을 담당하는데 노화에 따라 피부 기저막이 손상되면 기저막의 평평화, 다중화, 단열 등이 일어나서 주름이 발생되며 피부가 쉽게 늘어지거나, 본연의 장벽 기능이 상실되면 외부 환경의 오염물질을 걸려주지 못해 유해물질이 진피까지 침투할 가능성이 높아져 피부가 쉽게 손상될 수 있다. 따라서 손상된 피부 기저막을 회복시키거나 건강한 상태로 유지하려면 먼저 그 구성 성분들이 제대로 유지될 수 있게 해야한다. 피부 기저막을 이루는 단백질은 다양하게 존재하고 있는데 이 중에서도 콜라겐 타입 IV와 라미닌 5(Laminin 5) 등이 피부 노화와 밀접한 관련이 있다는 보고가 있다.

라미닌 5는 피부 기적막에 다량으로 존재하고, 피부의 구조 및 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데 라미닌 5가 녹아웃된 마우스는 표피와 진피가 분리되고, 수포를 형성하는 인간 유전성 질환인 표피 수포증과 같은 현상이 나타난다. 이러한 현상으로 보아 라미닌 5는 표피와 진피 접착에 필수적인 것으로 보인다. 표피세포에서 생성되는 활성화 단백질 분해효소인 플라스민(Plasmin)은 유로카이네이즈 플라스미노겐 활성화제(uPA, urokinase-type plasminogen activator)에 의해 활성화되면서 라미닌 5의 분해에 관여한다. 따라서, 프라스민으로 분해된 라미닌 5는 각질세포와의 접착 능력 및 콜라겐과의 친화성이 감소하게 된다. 이 uPA 및 플라스민은 자외선 등에 의해 활성이 증가하게 되는데, 이 때문에 자외선 노출에 의한 피부 노화에는 uPA 및 플라스민 활성 증가에 의한 라미닌 5의 분해와 이것에 의한 기적막의 기능 저하가 관여하는 것으로 보고되고 있다. 세린 프로테아제 억제제인 플라스미노겐 활성화제 억제제 타입-1(PAI-1, Plasminogen activator inhibitor)은 섬유소 분해 시스템의 주요 억제제 중의 하나이다. PAI-1은 플라스미노겐을 플라스민으로 전환하는 효소인 uPA의 주요 생리학적 억제제이다. 따라서, 라미닌 5의 분해를 억제하기 위해서는 분해효소인 플라스민의 활성을 억제하거나 플라스민의 활성을 억제하는 효소인 PAI-1의 합성을 촉진시키는 것이 효과적이다.

따라서, 종래에는 피부 노화와 주름을 개선시키기 위하여 표피-진피의 경계면인 피부 기저막(skin basement membrane)의 구성성분의 생합성을 높이거나 분해를 억제하는 활성 촉진에 초점을 두는 연구가 진행되고 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 아마로젠틴이 피부세포의 콜라겐 타입 I의 합성 및 TIMP-1의 합성을 촉진할 뿐만 아니라, 라미닌 5의 발현을 증가시키고 PAI-1의 합성을 촉진시키는 효과가 뛰어남을 확인하고 인체에 적용시 뛰어난 주름 개선 효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아마로젠틴의 피부세포의 콜라겐 타입 I의 합성 촉진, TIMP-1의 합성 촉진, 라미닌 5의 발현 증가, 및 PAI-1의 합성 촉진 용도를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아마로젠틴을 포함하여 다양한 제형으로 응용 가능한 피부 주름, 피부 탄력, 또는 피부 노화의 개선 및 예방용 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아마로젠틴을 포함하여 다양한 제형으로 응용 가능한 피부 주름, 피부 탄력, 또는 피부 노화의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 아마로젠틴(amarogentin)을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 아마로젠틴은 콜라겐의 합성, TIMP-1의 합성, 라미닌 5의 발현, 및 PAI-1의 합성을 촉진하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 아마로젠틴의 함량은 전체 조성물 중 1×10^-5 내지 10 중량%일 수 있다.

본 발명에서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업 제거제 및 세정제로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 아마로젠틴을 유효성분으로 포함하는 피부주름 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 약학적 조성물은 연고, 크림, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 수용액, 비수성용제, 현탁제 및 유제로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "아마로젠틴(amarogentin)"은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 세코이리도이드 글리코시드(secoiridoid glycoside)이다.

[화학식 1]

아마로젠틴은 약용 식물인 용담(gentian lutea) 뿌리나 스 웨르티아 키라타(Swertia chirata)에 존재한다. 용담 뿌리는 오랫동안 소화기 장애 치료에 쓰인 역사를 지니고 있으며 여러 의약품의 성분으로 사용되고 있다. 아마로젠틴은 사람에서 쓴맛의 수용체인 hTAS2R50을 활성화하며, 알려진 천연 성분 중에서 가장 쓴맛을 보이는 것으로 알려져 있다. 아마로젠틴은 항기생충 성분으로 내장리슈만편모원충(Leishmania donovani)에서 토포이소머레이즈I(topoisomeraseI)의 활성을 저해하는 것으로 보고되고 있다. 또한 간세포에서 항암 작용을 하는 것으로 보고되어 있으며 마우스 피부에서도 항암 작용을 하는 것으로 보고되고 있다. 하지만 인간 피부에 대한 활성 연구는 전무하며 충분히 연구되고 있지 않다.

본 발명에서는 아마로젠틴이 콜라겐 타입 I의 합성을 촉진할 뿐 아니라 TIMP-1의 생합성 촉진을 통해 콜라겐 타입 I과 피부의 진피와 표피의 경계면에 있는 피부 기저막(Skin Basement Membrane)에 존재하는 타입 IV의 분해도 억제해주며, 역시 피부 기저막을 이루는 주요 구성성분인 라미닌 5의 생합성을 촉진시켜 PAI-1의 생합성 촉진을 통해 라미닌 5의 분해를 억제해줄 수 있음을 확인하였다.

구체적으로, 본 발명의 실시예에서는 아마로젠틴이 인체 유래 섬유아세포에서의 콜라겐 합성 촉진 효과 확인 실험에서 일반적으로 콜라겐 합성 능력이 있는 것으로 알려진 비타민 C를 적용한 경우보다 더 적은 농도로 더 우수한 콜라겐 합성 효과를 나타내고(실시예 1), 인체 유래 각질형성세포에서의 TIMP-1 합성 촉진 효과 확인 실험에서 1㎍/ml와 10㎍/ml에서 우수한 TIMP-1 합성 효과를 나타내고(실시예 2), 인체 유래의 각질형성세포에서의 라미닌 5의 발현 증가 평가 실험에서 1㎍/ml와 10㎍/ml에서 우수한 라미닌 5의 발현 증가 효과를 나타내며(실시예 3), 인체 유래의 각질형성세포에서의 PAI-I의 합성 촉진 효과 확인 실험에서 1㎍/ml와 10㎍/ml에서 우수한 PAI-I의 합성 촉진 효과를 나타내는 것을 확인하였다(실시예 4).

또한, 본 발명에서는 아마로젠틴을 외용연고 또는 에센스 제형으로 제조하고, 이를 인간의 피부에 도포하였을 때 우수한 피부주름 개선 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 본 발명에서 아마로젠틴은 낮은 농도 수준으로 즉, 소량으로 적용할 경우에도 우수한 주름 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.

그러므로, 아마로젠틴은 콜라겐 감소 및 탄력 저하에 관련된 주름 발생이나 피부 기저막의 주요 성분인 콜라겐 타입 IV와 라마닌의 합성 저하 및 분해 촉진에 의한 주름 발생의 억제, 치료 및 개선을 위한 유효성분으로서 이용될 수 있으며 피부 등에 발생한 상처의 치유 효능도 우수하여 상처 치료를 위한 유효성분으로서 이용될 수도 있다. 또한, 아마로젠틴은 소량으로 포함되어도 우수한 효능이 유지되기 때문에, 의약품 또는 화장품에서 피부 주름, 피부 탄력 저하 또는 피부 노화를 개선 또는 예방하는 유효성분으로서 다양한 제형으로 이용될 수 있어 응용 범위가 넓은 장점을 갖는다.

따라서, 본 발명은 또한 피부주름 개선용 화장료 조성물 또는 피부주름 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 아마로젠틴의 용도 및 유효량의 아마로젠틴을 피부에 적용하는 것을 포함하는 주름 개선 방법을 제공한다.

아마로젠틴은 당 분야에서 공지된 각종의 유기 화학적 방법 등을 통하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 또한 식물 등으로부터 용이하게 수득할 수 있다. 본 발명에서 사용된 아마로젠틴은 유안시 바이오테크놀로지 코. 엘티디.(Yuanshi Biothechnology Co. Ltd., 중국)로부터 구입하여 사용하였다.

본 발명에서 사용하는 용어 "주름 개선"은, 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 의미한다.

본 발명의 주름 개선용 조성물은 유효량의 아마로젠틴을 포함할 때 바람직한 주름 개선 효과를 제공할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어 "유효량"은, 피부의 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시킬 수 있는 아마로젠틴의 양을 의미한다. 본 발명의 주름 개선용 조성물에 포함되는 상기 아마로젠틴의 유효량은 주름 개선용 조성물이 제품화되는 형태, 상기 아마로젠틴이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 상기 주름 개선용 조성물이 피부의 주름 생성에 따른 피부과적 치료를 위한 의약품으로 제품화되는 경우에는 일상적으로 피부에 적용하게 되는 화장품으로 제품화되는 경우에 비해 높은 농도로 아마로젠틴을 포함할 수 있을 것이다. 화장품으로 제품화되는 경우에 있어서도 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제, 세정제 등과 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 아마로젠틴을 포함할 수 있을 것이다. 반면 유효성분이 장기간 동안 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림, 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 아마로젠틴을 포함해도 무방할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 주름 개선용 조성물은 아마로젠틴을 전체 조성물 중 1×10^-5내지 10 중량%의 양으로 포함할 수 있다. 상기 함량이 1×10^-5중량% 미만이면 피부 세포에서 콜라겐 타입 I의 생성, TIMP-1의 합성, 라미닌 5의 발현 및 PAI-1의 합성을 촉진하는 효과가 저하될 우려가 있고, 10 중량%를 초과하면 용제로의 용해성 등 조성물의 전체적인 가공성이 떨어져, 후술하는 화장품 제형 등 각종 용도로의 사용이 제한될 우려가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 주름 개선용 조성물은 화장료 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다. 주름 개선용 조성물을 의약 또는 화장품으로 제형화할 경우, 활성 성분에 대한 담체로서 작용하는 피부적으로 허용가능한 공지의 부형제를 포함할 수 있다. 의약으로의 제형화시에는 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있으며, 화장품으로 제형화시에는 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있을 것이다. 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

구체적으로, 본 발명에 따른 아마로젠틴을 함유하는 화장료 조성물은 사용 및 취급이 용이하도록 화장학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 화장학적으로 허용가능한 부형제로는 계면활성제, 유화제, 비누산, 용매, 결합제, 희석제, 활택제, 안정제, 향료, 물, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 착색제, 보존제, 항생제, 항산화제, 소포제, 항균제, 항재침착제, 효소, 식물 또는 미네랄 오일, 지방, 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 보존제, 단백질, 실리콘, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 또는 왁스 등을 예로 들 수 있으며, 이들을 단독 또는 2종 이상 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업 제거제 및 세정제로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 외피에 적용될 수 있는 어떠한 제형으로도 이용 가능하다.

또한, 본 별명의 아마로젠틴을 함유하는 조성물은 화장료 뿐만 아니라 동일한 효과를 가지는 의약품 또는 의약부외품으로도 사용될 수 있다. 이 경우 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 0.01 내지 1000 mg/일로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 할 수도 있고, 수회 나누어 할 수도 있다. 또한, 그 투여량은 연령, 성별, 체중, 질병의 정도, 투여경로 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 아마로젠틴은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 아마로젠틴을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 조성물에 관한 것으로 아마로젠틴은 피부세포에서 콜라겐 타입 I 및 라미닌 5의 생합성을 촉진시키며 이들의 분해 효소의 생체 내 억제제인 TIMP-1 및 PAI-1의 생합성을 촉진하는 효능을 나타냄으로 주름 개선에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 인체 유래의 섬유아세포에서의 콜라겐 타입 I의 합성 촉진 효과 확인

아마로젠틴을 인간 유래 섬유아세포의 배양액에 첨가하여 세포수준에서 콜라겐 합성 촉진 효과를 확인하였다. 사용된 아마로젠틴은 유안시 바이오테크놀로지 코. 엘티디.(Yuanshi Biothechnology Co. Ltd., 중국)로부터 구입하여 사용하였다. 합성된 콜라겐의 측정은 PICP EIA kit(Procollagen Type I C-Peptide Enzyme Immuno Assay KIT)를 이용하여 정량하였다.

실험에서 아마로젠틴의 최종 농도는 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml가 되도록 하였다. 아마로젠틴을 인간 유래의 섬유아세포(human fibroblast)의 배양배지(DMEM 배지)에 첨가하여 48 시간 배양한 후 배양액을 취하여 PICP EIA 키트로 각 농도에서 콜라겐 합성 정도를 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.

효과의 비교를 위하여 아무것도 첨가하지 않은 섬유아세포의 배양배지(대조군)와 비타민 C를 최종농도 52.85 ㎍/ml가 되도록 첨가한 시료에 대하여 동일한 방법으로 콜라겐 합성 정도를 측정하였다.

콜라겐 생성 증가율은 대조군에 대한 상대적인 콜라겐 생성량의 비율로 계산하고 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료(㎍/ml)	콜라겐 생성량 (ng/ml))	증가율(%)
아마로젠틴	콜라겐 생성량 (ng/ml))	증가율(%)
대조군	302	-
비타민 C 52.8 ㎍/ml	393	30
1 ㎍/ml	762	152
10 ㎍/ml	601	99
(반복횟수=4)

상기 표 1의 결과에서 볼 수 있듯이, 아마로젠틴은 일반적으로 콜라겐 합성 능력이 있는 것으로 알려진 비타민 C를 적용한 경우보다 더 적은 농도로 더 우수한 콜라겐 합성 효과를 발휘하였다.

실시예 2: 인체 유래의 각질형성세포에서의 TIMP -I의 합성 촉진 효과 확인

아마로젠틴을 인간 유래 각질형성세포(human HaCaT) 배양액에 첨가하여 세포수준에서 TIMP-1의 합성 촉진 효과를 확인하였다. 합성된 TIMP-1의 측정은 human TIMP-1 ELISA kit(R&D Systems, 미국)를 이용하여 정량하였다.

실험에서 아마로젠틴의 최종 농도는 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml가 되도록 하였다. 아마로젠틴은 인간 유래의 각질형성세포(human HaCaT)의 배양배지(DMEM 배지)에 첨가하여 24시간 배양한 후 배양액을 취하여 TIMP-1 ELISA 키트로 각 농도에서 TIMP-1의 합성 정도를 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.

TIMP-1의 생성 증가율은 아무것도 첨가하지 않은 각질형성세포의 배양배지(대조군)에 대한 상대적인 TIMP-1 생성량의 비율로 계산하고 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시료(㎍/ml)	TIMP-1생성량(ng/ml)	증가율(%)
아마로젠틴	TIMP-1생성량(ng/ml)	증가율(%)
대조군	948	-
0.1 ㎍/ml	990	5
1 ㎍/ml	1129	19
10 ㎍/ml	1116	18
(반복횟수=4)

상기 표 2의 결과에서 볼 수 있듯이, 아마로젠틴은 아마로젠틴을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 각각 1 ㎍/ml와 10㎍/ml에서 우수한 TIMP-1 합성 효과를 발휘하였다.

실시예 3: 인체 유래의 각질형성세포에서의 라미닌 5의 발현 증가 평가

아마로젠틴을 인간 유래 각질형성세포(human HaCaT) 배양액에 첨가하여 세포수준에서 라미닌 5의 발현 촉진 효과를 확인하였다.

인체 유래의 각질형성세포를 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후에 배양된 세포를 인산완충용액(PBS)로 세척하였다. 그 후에 그 세포에 다시 우혈청(Fetal Bovine Serum)이 포함되지 않은 배지에 첨가된 아마로젠틴을 12시간 동안 각각 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml의 농도로 교체하여 처리하였다.

12시간 경과 후 세포를 회수하여 인산완충용액(PBS)로 세척하고, RNA 분리 시약(Tri-reagen, Bibco BRL)을 1ml 첨가하여 총 RNA를 추출한 후 하기의 방법으로 정량적인 역전사 PCR을 수행하였다. 먼저, 1 ㎍의 총 RNA를 역전사 시스템(Promega사, 미국)을 이용하여 역전사하여 cDNA를 얻었다. 이후 역전사 반응 용액 2 ㎕를 50mM KCl, 10mM tri-HCl(pH 8.3), 5mM MgCl₂ 및 0.16 mM dNTP의 PCR 반응 완충액 50 ㎕에 섞고, 10 pmol의 프라이머와 1.25 U의 Taq DNA 중합효소를 첨가하여 94℃에서 60초, 60℃에서 120초, 72℃에서 120초의 28 사이클을 수행하였다. 라미닌 5의 서브유닛인 β3 및 GAPDH의 PCR 수행을 위한 프라이머 서열은 하기 표 3과 같았다.

프라이머 이름	서열
Laminin5beta3 Forward	5'-TACCCATACGACGTACCAGATTACGCTCAAACAAACTTGAGAGTCAATTTCACCAG-3'(서열번호 1)
Laminin5beta3 Reverse	5'-CGGGTGGAATTCACTGGCCTCCATGGCCAAGGTCCGGTCTGGACACTG-3'(서열번호 2)
GAPDHforward primer	5'-CTGATGCCCCCATGTTCGT-3'(서열번호 3)
GAPDHreverse primer	5'-TGTGAGGAGGGGAGATTCA-3'(서열번호 4)

PCR 산물을 아가로스 젤에 전기영동하고 이를 Fluoro-S MultiImager(BioRad)로 분석하였다.

분석 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 아마로젠틴을 각각 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml의 농도로 처리하였을 때 농도에 따른 라미닌5 서브유닛β3 유전자의 발현정도(Laminin5β3 mRNA의 양)를 대조군에 대한 상대적인 값(%)으로 하여 표 4에 나타내었다. GAPDH는 유전자 발현변화를 정량적 역전사 PCR 방법으로 확인할 때 내부 지표 유전자(internal control)로 사용하는 유전자로서, GAPDH의 변화에 대한 특정 유전자, 여기에서는 Laminin5β3의 상대적 양을 나타냄으로써 시료간의 표준화를 이룰 수 있다.

시료(㎍/ml)	Laminin5β3의 발현증가율(%)
아마로젠틴	Laminin5β3의 발현증가율(%)
대조군	-
1 ㎍/ml	59
10 ㎍/ml	89
(반복 횟수=3)

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml의 농도에서 각각 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 59%, 89% 합성능이 증가함을 알 수 있었다.

실시예 4: 인체 유래의 각질형성세포에서의 PAI -1의 합성 촉진 효과 확인

아마로젠틴을 인간 유래 각질형성세포(human HaCaT) 배양액에 첨가하여 세포수준에서 PAI-1의 합성 촉진 효과를 실험하였다. 합성된 PAI-1의 측정은 human PAI-1 ELISA kit(R&D Systems, 미국)를 이용하여 정량하였다.

실험에서 아마로젠틴의 최종 농도는 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml가 되도록 하였다. 아마로젠틴은 인간 유래의 각질형성세포(human HaCaT)의 배양배지(DMEM 배지)에 첨가하여 24시간 배양한 후 배양액을 취하여 PAI-1 ELISA 키트로 각 농도에서 PAI-1의 합성 정도를 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.

PAI-1의 생성 증가율은 대조군에 대한 상대적인 PAI-1 생성량의 비율로 계산하고 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

시료(㎍/ml)	PAI-1생성량(ng/ml)	증가율(%)
아마로젠틴	PAI-1생성량(ng/ml)	증가율(%)
대조군	1011	-
0.1 ㎍/ml	1034	2
1 ㎍/ml	1366	35
10 ㎍/ml	2377	135
(반복횟수=4)

상기 표 5의 결과에서 볼 수 있듯이, 아마로젠틴은 아마로젠틴을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 각각 1 ㎍/ml와 10 ㎍/ml에서 우수한 PAI-1 합성 효과를 발휘하였다.

제조예 1 및 비교예 1: 피부 외용연고의 제조

하기 표 6의 조성과 같이 아마로젠틴을 유효성분으로 포함하는 피부 외용연고를 통상의 방법에 따라 제조하였다. 또한, 유효성분을 제외한 나머지 성분으로 제조한 피부 외용연고를 비교예 1로 제조하였다.

조성(중량%)	제조예 1	비교예 1
아마로젠틴	0.2	0
디에틸 세바케이트	8	8
경납	5	5
폴리옥시에틸렌올레일에테르 포스페이트	6	6
벤조산 나트륨	1	1
바셀린	to 100	to 100

제조예 2 및 비교예 2: 에센스의 제조

아마로젠틴을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지 및 주름 개선 화장료 에센스의 제형을 제조예 2로, 유효성분을 포함하지 않는 것을 제외하고는 제조예 2와 동일하게 화장료 에센스를 제조한 것을 비교예 2로 하였다. 상세한 조성은 하기 표 7에 나타내었다.

조성(중량%)	제조예 2	비교예 2
아마로젠틴	0.5	0
글리세린	10.0	10.0
히아루론산나트륨수용액(1%)	5.0	5.0
폴리옥시에틸렌경화피마자유	1.0	1.0
파라옥시안식향산메틸	0.1	0.1
향료	0.05	0.05
정제수	to 100	to 100

실시예 5: 패널 테스트를 통한 피부 주름 개선 효과 확인

상기 제조예 2와 비교예 2의 에센스에 대해서 건강한 35세에서 50세의 여성을 대상으로 피부 주름 개선 효과를 다음과 같이 시험하였다.

35세에서 50세까지의 여성 30명을 15명씩 2개의 군으로 구분하고 1군은 아마로젠틴을 0.5% 포함하는 제조예 2의 에센스를, 2군은 비교예 2의 에센스를 안면부에 1일 1회 3개월간 도포하였다. 3개월 후 피부 주름의 개선 정도를 피험자의 설문을 통해 평가하였다. 피험자의 설문은 피부 주름 개선 및 탄력 증진에 관하여 사용전과 비교하여 개선 없음, 약간의 개선, 상당한 개선의 3단계로 판정하였으며, 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다.

구분(명)	개선없음	약간의 개선	상당한 개선
제조예 2	1	6	8
비교예 2	10	3	2

상기 표 8에서 볼 수 있듯이, 아마로젠틴 0.5%를 포함한 제조예 2의 에센스를 사용한 경우, 사용하지 않은 비교예 2의 에센스를 사용한 경우보다 피부 주름 개선 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 영상분석을 통한 화장료 에센스의 주름개선효과 시험

영상분석을 통하여 상기 제조예 2 및 비교예 2의 에센스에 대해서 주름 개선 효과를 평가하였다.

구체적으로, 실험이 시작되기 전, 눈 밑의 레플리카(replica)를 채취하고(Xantopren, Bayer), 실험이 종료된 직후 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 피부 주름의 2차원적 분석으로 피부 주름의 밀도를 측정하였다. 영상 분석에 의한 피부 주름 밀도의 감소율은 에센스의 사용전 피부 주름 밀도에 대한 사용 후 피부 주름 밀도의 비를 평균한 값이며, 상기 측정 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

	피부 주름 밀도 감소율 (%)
비교예 2	12
제조예 2	53

상기 표 9에서 알 수 있듯이, 아마로젠틴을 포함한 제조예 2의 에센스를 사용한 경우, 아마로젠틴을 포함하지 않은 비교예 2의 에센스를 사용한 경우보다 피부 주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있다. 또한 상기 시험 과정에서 제조예 2의 에센스에 의한 피부 자극이나 부작용은 발견되지 않았다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 콜라겐의 합성, TIMP-1(Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinase-1)의 합성, 라미닌 5의 발현, 및 PAI-1(Plasminogen activator inhibitor-1)의 합성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 함량은 전체 조성물 중 1×10^-5 내지 10 중량%인 피부주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업 제거제 및 세정제로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부주름 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제5항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 콜라겐의 합성, TIMP-1의 합성, 라미닌 5의 발현, 및 PAI-1의 합성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 피부주름 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 연고, 크림, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 수용액, 비수성용제, 현탁제 및 유제로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 피부주름 예방 및 치료용 약학적 조성물.