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KR101451733B1 - 아플라톡신 ｂ1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 ｂ1 검출용 키트 - Google Patents

아플라톡신 ｂ1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 ｂ1 검출용 키트 Download PDF

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KR101451733B1
KR101451733B1 KR1020120100703A KR20120100703A KR101451733B1 KR 101451733 B1 KR101451733 B1 KR 101451733B1 KR 1020120100703 A KR1020120100703 A KR 1020120100703A KR 20120100703 A KR20120100703 A KR 20120100703A KR 101451733 B1 KR101451733 B1 KR 101451733B1
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Abstract

본 발명은 신규한 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 B1 검출용 키트에 관한 것으로, 더 자세하게는 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 단일 검출선으로 구성된 아플라톡신 B1 검출 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체의 검출용 표지물질 및 이를 포함하는 아플라톡신 B1 검출용 키트는 검출선에 고정된 항체와의 경쟁적 결합 반응을 유도함으로써 항체의 변형을 최소화하여 항체의 활성 효율을 극대화하는 효과가 있으며, 정량적 및 정성적인 아플라톡신 B1 검출에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

아플라톡신 Ｂ1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 Ｂ1 검출용 키트{Labeling agent for aflatoxin B1 detection and the kit for detecting aflatoxin B1 comprising thereof}
본 발명은 신규한 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 B1 검출용 키트에 관한 것으로, 더 자세하게는 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 단일 검출선으로 구성된 아플라톡신 B1 검출 키트에 관한 것이다.
아플라톡신 B1(Aflatoxin B1, AFB1)은 곰팡이독소(Aspergillus flavus) 및 Aspergillus parasiticus로부터 생성되는 세계에서 가장 유독한 독소물질 중 하나로, 수많은 농산물이 저장되는 동안 생성될 수 있으며, 땅콩, 옥수수 및 동물 사료와 같은 농산물에서 자연적으로 생성되는 것으로 알려져 있다.
또한, 아플라톡신 B1은 사람 및 동물에게 유독하고, 높은 간암 발병 위험을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 국제암연구소(IARC)는 아플라톡신 B1을 class 1의 발암물질로 분류하고 있으며, 유럽연합은 땅콩 및 건조과일에 대한 최대 아플라톡신 B1 허용 정도(MRLs)를 2 ㎍/kg로 한정하고 있다. 또한, 곡류에 대해서는 4 ㎍/kg으로 제한하고 있다. 반면, 한국의 경우 식품 및 동물사료에 대한 아플라톡신 B1 허용 정도를 각각 10 ㎍/kg 및 50 ㎍/kg으로 제한하고 있다. 특히, 아플라톡신 B1은 열에 안정하여 초기 오염 정도는 최종 생산물까지 지속된다.
아플라톡신 B1을 검출하기 위하여 박층크로마토그래피(Thin-layer chromatography, TLC), 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 이상고압층 크로마토그래피(OPLC) 및 효소결합 면역흡착검사(ELISA) 등이 사용되고 있으며, 이는 아플라톡신 B1의 time-delay assay를 기반으로 수행된다. 상기와 같은 분석기는 분석을 위한 공간(실험실)이 필요하며, 1 ng/ℓ 내지 6 ng/ℓ 검출 제한 범위가 있음에도 불구하고 검출시간이 1시간 내지 몇 시간이 소요된다. 따라서, 아플라톡신 B1을 신속하고 편리하게 검출할 수 있는 기술이 필요하다.
최근에는 아플라톡신 B1을 현장 검출하기 위한 분석 방법 중 하나로 측방 유동 분석(lateral flow assay)이 연구되고 있다. 측방 유동 스트립 분석(lateral flow strip assay) 타입의 키트는 시료가 적용되는 샘플패드, 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드, 시료가 이동하여 분리되고 항체 항원 반응이 일어나는 전개용 멤브레인 또는 스트립 및 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수패드로 되어 있다. 이 분석은 액체 시료 속에 들어 있는 분석물이 전개용 멤브레인의 표준선 및 검출선을 통과하는 동안 정체 및 시각적 색 표지 항체 검출을 기반으로 수행된다.
이와 같은, 측방 유동 분석법은 암진단, 혈액 감염 진단, 도핑 또는 임신 진단용 의료분야 및 미생물탐지 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 있으나, 색을 띠는 입자와 항체 결합물을 표지물질로 이용하고 있어 항체가 변형되어 활성이 떨어지는 단점이 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 종래의 측방 유동 스트립 분석 한계를 극복하는 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 이용한 아플라톡신 B1 검출용 키트를 개발하였으며, 상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 이용한 아플라톡신 B1 검출용 키트를 시료에 적용하여 효과적인 검출 특성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신속하게 정량적 및 정성적으로 아플라톡신 B1을 검출할 수 있는 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 나노입자-아플라톡신 B1 -담체단백질 중합체의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질을 이용한 아플라톡신 B1 검출용 키트를 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 아플라톡신 B1, 담체단백질 및 나노입자의 복합체를 포함하는 아플라톡신 B1 검출용 표지물질을 제공한다.
본 발명의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질은 아플라톡신 B1-담체담백질 및 나노입자를 1.0 ㎍:100 ㎕ 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.
상기 담체단백질은 소혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)인 것이 바람직하다.
상기 나노입자는 콜로이드성 금 입자인 것이 바람직하며, 40 nm의 입자 크기인 것이 바람직하다.
상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질은, 아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 완충용액으로 2.0 ㎎/㎖ 수준으로 희석하는 단계(단계 1); 상기 희석된 아플라톡신 B1-담체단백질 용액에 나노입자 현탁액을 1.0 ㎍:100 ㎕ 비율로 혼합하는 단계(단계 2); 및 상기 혼합액을 상온에서 400 rpm 내지 600 rpm으로 회전 배양하는 단계(단계 3)로 결합되는 것이 바람직하다.
상기 단계 1은, 아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 완충용액을 사용하여 희석하는 단계로, 상기 완충용액은 인산완충식염수를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계 2는, 상기 단계 1의 아플라톡신 B1-담체단백질 중합체 희석액에 나노입자 현탁액을 혼합하는 단계이다. 상기 나노입자 현탁액은 완충용액을 사용하여 pH 7.3으로 제조한 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 3은, 상기의 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 얻기위해 상기 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체 용액을 상온에서 배양하는 단계이다. 상기 배양시간은 20분 내지 40분인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질을 포함하는 아플라톡신 B1 검출용 키트를 제공한다.
상기 아플라톡신 B1 검출용 키트는, 시료의 유동 순서에 따라 시료가 주입되는 시료패드(1); 상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질이 코팅된 결합패드(2); 아플라톡신 B1 다클론 항체가 고정된 니트로셀룰로스 멤브레인 검출패드(3); 및 흡수패드(4)를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 시료패드(1)는, 민감도 향상을 위하여 borate 완충용액을 사용하여 전처리하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질이 코팅된 결합패드(2)는, 민감도 향상을 위하여 borate 완충용액으로 전처리하는 것이 바람직하나, 이제 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 결합패드(2)는 일정 함량의 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 함유하는 것이 바람직하다.
상기 니트로셀룰로스 멤브레인 검출패드(3)는, 민감도 향상을 위하여 인산완충식염수에 침지시켜 전처리하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 검출패드(3)는 아플라톡신 B1-다클론 항체로 코팅된 단일 검출선을 포함하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 B1 검출용 키트는 효과적인 곰팡이독소 검출 키트에 적용될 수 있다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 아플라톡신 B1 검출용 표지물질은 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 검출용 표지물질로 이용하여 검출선에 고정된 항체와의 경쟁적 결합 반응을 유도함으로써 항체의 변형을 최소화 함으로써 항체의 활성 효율을 극대화하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 아플라톡신 B1 검출용 키트는 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 검출용 표지물질로 사용함과 동시에 표준선이 없는 단일 검출선으로 일원화하여 신속하게 정량적 및 정성적으로 아플라톡신 B1을 검출할 수 있는 효과가 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체의 표지물질을 함유한 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) pH에 따른 흡광도 변화 및 (b) pH에 따른 콜로이드성 금 나노입자의 색 변화를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 아플라톡신 B1-소혈청 알부민(AFB1-BSA) 농도에 따른 (a) 흡광도 변화 및 (b) 색변화를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트의 아플라톡신 B1 검출 성능을 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트의 오크라톡신(OTA)에 대한 교차반응성을 나타낸 것이다.
이하, 하기 제조예 및 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 콜로이드성 금 나노입자- 아플라톡신 B1- 소혈청 알부민 중합체의 제조
콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체를 제조하기 위하여, 아플라톡신 B1-소혈청 알부민은 시그마(Sigma ST. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 콜로이드성 금 나노입자는 BioAssay Works(Ijamsville, MD, USA)로부터 구입하였다.
아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체는 최상의 조건을 확인하기 위하여, 다양한 pH 및 아플라톡신 B1-소혈청 알부민 농도 조건 하에서 콜로이드성 금 나노입자와 중합화 하였다. 아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체는 0.5 mM 인산완충식염수(pH 7.2)를 첨가하여 2.0 ㎎/㎖로 희석하였다. 희석된 아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체 용액 1.0 ㎕는 96-well microplate에서 다른 완충 용액으로 pH 5.4 내지 pH 10.1로 적정된 콜로이드성 금 나노입자 100 ㎕와 다양한 pH로 혼합하였다. 혼합된 용액은 3초 동안 흔들어 준 후 상온에서 30분 동안 배양하였으며, 배양된 용액은 콜로이드성 금 나노입자 잔여 표면의 차단을 위해 Blocker 소혈청 알부민 용액 10 ㎕를 첨가하여 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체 용액을 수득하였다.
실시예 2: 아플라톡신 B1 검출용 one - dot strip 키트
본 발명의 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체를 표지물질로 함유한 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트를 이루는 각 구성요소들은 필요에 따라 일체형으로 제조되거나 각각 분리되어 제조될 수 있다. 또한, 사용 형태에 따라 일부 구성요소를 생략하여 사용이 가능하다.
이하, 첨부된 도 1을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체를 함유한 아플로톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트를 상세히 설명하기로 한다.
콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체를 함유한 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트는 시료의 유동 순서에 따라 시료가 주입되는 시료패드(1), 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질이 코팅된 결합패드(2), 아플라톡신 B1 다클론 항체가 고정된 니트로셀룰로스 멤브레인 검출패드(3) 및 흡수패드로 구성된다.
시료패드(1)는, 민감성의 향상을 위하여 1% 소혈청 알부민 및 0.05% Tween-20을 함유하는 pH 7.4의 50 nM borate 완충 용액으로 처리한 후 37℃에서 하룻밤 동안 건조하였다.
결합패드(2)는 전처리 용액으로 처리 한 후 37℃에서 하룻밤 동안 건조하였다. 그 후, 상기 실시예 1에서 제조된 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체 용액 1.0 ㎕를 주입한 후 37℃에서 3시간 동안 완벽하게 건조하였다. 결합패드(2)의 전처리 용액은 10% 자당(sucrose), 0.05% Tween-20을 pH 7.4의 50 nM borate 완충용액에 혼합한 후 100℃ 이상의 고온에서 15분간 가열하여 자당과 Tween-20이 완전하게 용해되도록 한 후, 2% 소혈청 알부민(단백질 용액으로 열에 매우 민감)이 응고되지 않도록 상온으로 식힌 완충용액에 혼합하여 제조하였다.
검출패드(3)는, 인산완충식염수에 침지시킨 후 37℃에서 하룻밤 동안 건조하였다. 그 후 검출선을 형성시키기 위하여, 인산완충식염수로 2.0 ㎎/㎖로 희석된 아플라톡신 B1-다클론 항체(AFB1-PAb) 1.0 ㎕를 미세 피펫을 이용하여 원형의 형태로 주입한 후 37℃에서 3시간 동안 건조하였다. 실험에 사용된 아플라톡신 B1-다클론 항체(AFB1-PAb)는 시그마(Sigma ST. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
상기와 같이 처리된, 시료패드(1), 결합패드(2), 검출패드(3) 및 흡수패드는 도 1에 나타난 바와 같이 측방유동분석 strip 형태로 조립하였다.
실험예 1: 적정 pH 분석
콜로이드성 금 나노입자 와 아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체 간의 최상의 결합 이루기 위한 최적의 pH 농도를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체 용액에 1.0 M 염화나트륨 용액 100 ㎕를 첨가하여 혼합하고 상온에서 10분 동안 둔 후 색변화를 관찰하였다. 이는, 높은 농도의 염이 금 나노입자 결합을 유도하여 불충분한 양의 항원이 나노입자의 표면에 흡착되는 것을 이용한 것으로, 금 나노입자의 결합은 붉은색에서 파랑-회색으로 변화된 것을 통해 확인할 수 있다. 따라서, 최적 pH는 용액의 색 변화 및 520 nm 흡광도를 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 520 nm에서 pH의 변화의 최고 수치는 pH 5.4에서 나타났으며, pH 7.3에서 pH 8.2까지는 특별한 변화를 보이지 않았다. 반면에, pH 8.2 이상에서는, 붉은색에서 레드퍼플(red-purple)로 색변화를 나타내었다. 퍼플색은 나노입자가 결합된 것으로 볼 수 있다. 따라서, 다른 완충용액 및 blocking 용액의 pH가 7.4인 것을 감안하여, 금 나노입자와 아플라톡신 B1-소혈청 알부민의 중합 효율을 위한 중합 반응은 pH 7.3이 적절한 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 적정 아플라톡신 B1- 소혈청 알부민 농도 분석
콜로이드성 금 나노입자의 표면 코팅을 위해 필요한 담체단백질의 최적 양을 측정하기 위하여 콜로이드성 금 나노입자와 다양한 부피의 아플라톡신 B1-소혈청 알부민을 중합하였다. 콜로이드성 금 나노입자는 상기의 실험예 1에서 확인한 결과에 따라 pH 7.3의 콜로이드성 금 나노입자 현탁액 100 ㎕를 사용하였다. 0, 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0 ㎕의 2.0 ㎎/㎖ 아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합 용액을 상기 콜로이드성 금 나노입자 현탁액이 처리된 96-well microplate에 각각 첨가하여 혼합한 후 상온에서 30분 동안 두었다. 그 후 10% 염화나트륨 100 ㎕를 각 well에 첨가하고 상온에서 10분 동안 두었다. 520 nm 흡광도 및 색변화를 통해 아플라톡신 B1-소혈청 알부민의 적정 농도를 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 0.5 ㎕ 내지 2.0 ㎕ 아플라톡신 B1-소혈청 알부민이 콜로이드성 금 나노입자 100 ㎕에서 안정화되는 결과를 보였다.
실험예 3: 아플라톡신 검출용 one - dot strip 키트의 검출 한계 분석
상기 실시예 2에서 제조된 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체의 아플라톡신 B1 표지물질을 함유한 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트의 검출 성능을 확인하기 위하여, 10% 메탄올을 함유한 인산완충식염수을 이용하여 0 ppb 내지 1000 ppb의 아플라톡신 B1(AFB1) 시료액을 준비하였다. 각 아플라톡신 B1(AFB1) 시료에 대한 분석은 대부분 10분 내에 완료되었으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 아플라톡신 B1(AFB1)이 없는 경우(오직 인산완충식염수) 음성반응(붉은색의 점이 검출선에 나타나는 것)을 확인하였다. 반면, 10 ppb 내지 1000 ppb의 아플라톡신 B1(AFB1) 시료액에서는 양성반응을 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 실시예 2에서 제조된 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip kit의 아플라톡신 B1(AFB1) 검출한계는 10 ppb인 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 곰팡이독소와의 교차 반응 분석
상기 실시예 2에서 제조된 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체의 아플라톡신 B1 표지물질을 함유한 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트에 대한 아플라톡신 B1 이외의 다른 곰팡이독소와의 교차 반응성을 확인하기 위하여, 10, 100 및 1000 ㎍/㎖의 오크라톡신(OTA)를 함유하는 시료를 주입하여 검출분석을 시행하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 오크라톡신에 대한 상기 실시예 2에서 제조된 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트는 모두 음성반응을 나타내었다. 이는, 상기의 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트가 동물사료 또는 식품에 들어있는 아플라톡신 B1의 검출용으로 유용하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.
1: 시료패드
2: 결합패드
3: 검출패드
4: 흡수패드

Claims (7)

  1. 아플라톡신 B1, 소혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA) 및 콜로이드성 금 나노입자의 복합체를 포함하는, 아플라톡신 B1 검출용 표지물질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질은,
    아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체를 2.0 ㎎/㎖ 수준까지 완충용액으로 희석하는 단계;
    상기 희석된 아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합 용액에 콜로이드성 금 나노입자 현탁액을 1:100(v/v) 비율로 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합액을 20분 내지 40분 동안 상온에서 400 rpm 내지 600 rpm으로 회전 배양하는 단계로 결합되는 것을 특징으로 하는 아플라톡신 B1 검출용 표지물질.
  6. 제1항 및 제5항 중 어느 한 항의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질을 포함하는 아플라톡신 B1 검출용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 아플라톡신 B1 검출용 키트는, 시료의 유동 순서에 따라 시료가 주입되는 시료패드;
    상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질이 코팅된 결합패드;
    아플라톡신 B1 다클론 항체가 고정된 니트로세룰로스 멤브레인 검출패드; 및
    흡수패드를 포함하는 것을 특징으로 하는 아플라톡신 B1 검출용 키트.
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