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KR101451415B1 - 불비누화 물질 함량을 저감시킨 미생물 유지의 제조 방법 및 그 유지 - Google Patents

불비누화 물질 함량을 저감시킨 미생물 유지의 제조 방법 및 그 유지 Download PDF

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KR101451415B1
KR101451415B1 KR1020147017753A KR20147017753A KR101451415B1 KR 101451415 B1 KR101451415 B1 KR 101451415B1 KR 1020147017753 A KR1020147017753 A KR 1020147017753A KR 20147017753 A KR20147017753 A KR 20147017753A KR 101451415 B1 KR101451415 B1 KR 101451415B1
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케니치 히가시야마
히로시 카와시마
모투 수미다
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닛폰 스이산 가부시키가이샤
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Abstract

불포화 지방산을 구성 지방산으로서 포함하는 유지를 생산할 수 있는 미생물을, 배양조의 내경(= D)에 대한 교반 날개 직경(= d)의 비율 d/D = 0.30 내지 0.6인 조건을 만족하는 교반 날개가 장치된 배양조 내에서 농도 2 내지 15%의 질소 공급원을 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된, 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유의 제조 방법.

Description

불비누화 물질 함량을 저감시킨 미생물 유지의 제조 방법 및 그 유지{PROCESS FOR PRODUCING MICROBIAL FAT OR OIL HAVING LOWERED UNSAPONIFIABLE MATTER CONTENT AND SAID FAT OR OIL}
불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량을 저감시킨 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 조유 및 정제 유지의 제조 방법 및 상기 유지(조유 또는 정제 유지)와, 상기 유지(조유 또는 정제 유지)가 배합된 식품, 음료, 치료용 영양 식품, 사료 및 의약품에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 "불비누화 물질"과 "에스테르형 스테롤"은 미생물로부터 추출되는 것을 나타내는 것이다. 따라서, 본 발명에 있어서 상기 "불비누화 물질"과 "에스테르형 스테롤"은 추출 후에 조유에 첨가되는 불비누화 물질과 에스테르형 스테롤은 포함하지 않는다.
인간의 고도 불포화 지방산(이하, "PUFA"라 한다)의 생합성에는 대표적인 2 가지 계열로서 ω3계와 ω6계가 있다. ω(오메가)는 지방산의 메틸기 말단으로부터 첫번째 이중 결합이 있는 탄소 원자까지의 탄소수를 나타낸다. 예를 들면, ω6계의 경우, 리놀레산(18:2 ω6)은 불포화와 탄소 사슬 길이 연장을 반복하여, γ-리놀렌산(18:3 ω6), 디호모-γ-리놀렌산(20:3 ω6), 아라키돈산(20:4 ω6) 및 4,7,10,13,16-도코사펜타엔산(22:5 ω6)으로 변환된다.
유사하게, ω3계의 경우, α-리놀렌산(18:3 ω3)은 불포화와 탄소 사슬 길이 연장을 반복하여, 에이코사펜타엔산(20:5 ω3), 7,10,13,16,19-도코사펜타엔산(22:5 ω3) 및 4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산(22: 6ω3)으로 변환된다.
ω3계 PUFA로서의 에이코사펜타엔산(이하, "EPA"라 한다)과 도코사헥사엔산(이하, "DHA"라 한다)은 특히 동맥 경화증 및 혈전증과 같은 성인병에 대한 예방 효과와, 항암 작용 및 학습 능력 증강 작용 등 많은 생리적 기능을 갖는 것으로 알려져 있어서, 이들 PUFA를 의약품 및 건강 식품에 이용하려는 다양한 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 최근에는 ω3계 이외의 PUFA(ω6 및 ω9계)의 생리적 기능에도 관심이 집중되고 있다.
아라키돈산은 혈액이나 간 등의 중요 기관을 구성하는 지방산의 약 10%를 차지한다. 예를 들면, 인간 혈액의 인지질 중의 지방산은 아라키돈산 11%, 에이코사펜타엔산 1% 및 도코사헥사엔산 3%의 조성을 갖는다. 아라키돈산은 세포막의 주요 구성 성분으로서, 막의 유동성 조절에 관여하여 체내 대사에서 다양한 기능을 나타내는 한편, 프로스타글란딘의 직접적인 전구체로서 중요한 역할을 한다.
특히 아라키돈산은 최근에는 유아용 영양 성분으로서 및 신경 활성 작용을 나타내는 내인성 카나비노이드(2-아라키도닐 모노글리세롤, 아난다미드)의 구성 지방산으로서 주목되고 있다. 일반적으로, 리놀레산이 풍분한 식품을 섭취하는 경우, 리놀레산은 아라키돈산으로 변환된다. 그러나, 성인병 환자 및 성인병 예비군, 유아 및 노인에 있어서는 생합성과 관련된 효소의 기능이 저하된다. 따라서, 아라키돈산의 양은 부족하기 쉽다. 그러므로, 아라키돈산을 유지(트리글리세라이드의 구성 지방산)로서 직접 섭취하는 것이 바람직하다.
ω3계 PUFA로서의 EPA와 DHA의 경우에는 어유라는 풍부한 공급원이 존재한다. 한편, ω6계 PUFA로서의 γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산 및 4,7,10,13,16-도코사펜타엔산(22:5 ω6)을 종래의 유지 공급원으로부터 얻는 것은 어렵고, 현재 미생물 발효로 생산되는 PUFA를 구성 지방산으로서 포함하는 유지(트리글리세라이드)가 일반적으로 사용된다. 예를 들면, 구성 지방산으로서 아라키돈산을 포함하는 유지(트리글리세라이드)를 생산할 수 있는 다양한 미생물을 배양함으로써 구성 지방산으로서 아라키돈산을 포함하는 유지(트리글리세라이드)를 생산하는 방법이 제안되었다.
그 중에서도, 특히 모르티에렐라(Mortierella)속에 속하는 미생물을 이용하는 것에 의하여 고함량의 아라키돈산(트리글리세라이드)을 함유하는 유지를 생산하는 방법이 알려져 있다(특개소63-44891 및 63-12290). 이들 유지는 다양한 시험 결과로부터 안전성이 높다고 말하여진다. 그러나, 이 유지는 미생물로부터 유래된 것이기 때문에 충분한 섭취 경험이 없다. 따라서, 현시점에서는 문제의 유지를 일반 사회에 만족스러울만큼 침투시키는 정도에 이르지 못하고 있다. 한편, 발효법으로 생산되는 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 유지(트리글리세라이드)는 아라키돈산이 사용되어야 하는 응용 분야, 예를 들면, 유아용 영양 분야, 특히 유아용 분유에 사용되기 시작하였다.
동식물과 같은 천연물로부터 생산되는 유지는 탈검, 탈산, 탈취, 탈색, 분자 증류 및 윈터링(wintering)과 같은 정제 공정을 거쳐 식용 유지로서 시판된다. 예를 들면, 유량성 식물(oil plants)로부터 압착에 의하여 얻어지는 유지는 다량의 불순물을 함유하고 있어서 식용 유지로서 사용되지 못한다. 전통적으로 먹어온 참기름과 올리브유를 제외하고는, 이들 유지는 일반적으로 정제 후에 식용 유지로 사용된다.
예를 들면, 탈검 공정에서는 미정제유에 함유되어 있는 인지질, 탄수화물, 수지, 단백질 화합물, 미량 금속 및 색소(coloring matter)가 제거된다. 탈산(알칼리 정제) 공정에서는 지방산, 색소, 인지질, 미량 금속, 황화합물, 유불용물(oil insolubles) 및 산화 생성물이 제거된다. 탈색 공정에서는 색소, 고무질, 미량 금속, 비누 성분(soap components), 산화 생성물 및 인지질이 제거된다. 탈취 공정에서는 지방산, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 알데히드, 알코올, 케톤, 탄화수소, 색소, 황화합물, 과산화물, 산화 분해물 및 기타의 냄새 성분들이 제거된다.
유지는 오일에 용해성이고 알칼리로 잘 분해되지 않는 "불비누화 물질"로 불리우는 유기 화합물들을 함유한다. 예를 들면, 고급 알코올, 스테롤, 탄화수소, 토코페롤 및 카로테노이드와 같은 화합물이 불비누화 물질의 구성 성분인 것으로 알려져 있다. 유지 정제 공정에 있어서, 불비누화 물질 함량을 저감시킬 수는 있지만, 완전히 제거할 수는 없다. 스테롤은 미생물에 의하여 생산되는 유지의 불비누화 물질의 주요 성분으로 존재하는 것으로 알려져 있다.
유지에 존재하는 스테롤은 유리형과 에스테르형으로 구분된다. 정제 공정에서 유리형은 제거될 수 있지만, 에스테르형은 제거되기 어렵다. 예를 들면, 탈검, 탈산, 탈색 및 탈취 공정 이후에 대두유의 스테롤 함량(mg/g)은 유리형의 경우 각각 3.4, 3.0, 2.0 및 1.6으로 되고, 에스테르형의 경우 각각 0.6, 0.6, 0.6 및 0.6으로 된다(「食用油脂의科學」, pp. 20-21, SAIWAISHOBO).
제거되지 않는 스테롤 등은 불비누화 물질의 일부로서 함유되어 있기 때문에, 일반적으로 불비누화 물질의 함량은 정제 유지의 품질 지표로서 또는 정제 공정의 관리 지표로서 광범위하게 사용되고 있다. 예를 들면, 일본국 농림 규격에 따르면, 불비누화 물질의 함량은, 예를 들면, 식용 잇꽃유(safflower oils), 식용 대두유 및 식용 야자유의 경우에 1.0% 이하이어야 한다(1969. 3. 31, 일본국 농림성고시 제523호).
유아에게는 콜레스테롤이 필수적이고, 콜레스테롤 함량이 강화된 유아용 분유가 시판되고 있다. 식물성 식용 유지에는 식물 유래 스테롤이 함유되어 있는데, 식물 유래 스테롤의 존재는 유아에 있어서 콜레스테롤 흡수를 억제하는 문제가 있다(「食品의開發」, Vol. 33, No. 2, pp. 42-45(1998)). 따라서, 식용 유지를 유아용 분유에 배합하는 용도를 고려하는 경우, 스테롤 함량이 낮은, 즉 불비누화 물질의 함량이 낮은 유지가 매우 바람직하다.
모르티에렐라(Mortierella)속 미생물을 배양하여 얻어지는 유지는 대부분 트리글리세라이드(약 70 중량% 이상) 및 인지질이고, 기타의 불비누화 물질이 포함되어 있다. 불비누화 물질은 데스모스테롤과 같은 스테롤 및 스테롤 에스테르를 주요 구성 성분으로서 포함한다. 식용 유지는 트리글리세라이드 형태를 갖는다. 미생물 배양으로 생산된 오리지날(original) 유지(세포의 추출에 의하여 얻어진 유지로서 「조유」라고 한다)를 식용 유지 정제 공정(탈검, 탈산, 탈취 및 탈색)을 거치도록 하여 인지질이 제거된 정제 유지를 얻을 수 있다. 그러나, 정제 공정에 의하여 불비누화 물질을 완전히 제거하는 것은 어렵다.
불비누화 물질을 완전히 제거하는 것은 어렵지만 불비누화 물질 함량이 낮은는 식용 유지가 바람직하기 때문에 불비누화 물질을 제거하는 방법에 대하여 연구가 이루어져 왔다. 그 결과, 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제법이 개발되었다(특개평10-191886). 그러나, 이 기술에서는 불비누화 물질을 구성하는 성분들에 대한 상세한 연구가 이루어지지 았았다. 즉, 정제 전후에 불비누화 물질의 성분 변화, 즉 정제에 의하여 제거된 성분이 어떤 것인지 명확하지 않다.
모르티에렐라(Mortierella)속 미생물 배양으로 생산되는 유지는 균사(mycelia) 내에 축적된다. 따라서, 고도 불포화 지방산 함유 유지 생산의 경제성 향상의 관점에서 볼 때, 높은 균체(cells) 농도를 나타내도록 배양이 수행되어야 한다. 높은 균체 농도를 이루기 위하여, 균체 성분으로 변환되는 배지의 질소 공급원 농도를 증가시켜야 한다. 이전의 보고(특개평 10-191886호 및 10-70992호)에는 불비누화 물질 또는 스테롤의 총량이 보고되어 있지만, 미생물 배양에 사용된 배지의 질소 공급원의 농도는 가장 높은 것이 약 1.5% 정도이다.
1% 이하의 스테롤 함량을 갖는 고도 불포화 지방산 함유 유지가 보고된 적은 있다(국제출원의 일본 국내단계 출원 제2000-510513호). 그러나, 이 경우, 그 제조에 사용된 배지의 질소 공급원 농도가 낮고, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)에 의한 아라키돈산 함유 유지를 생산에서는 질소 공급원 농도 1%(효모 추출물 0.5% + NaN03 0.5%)라는 낮은 농도에서 배양한다(국제출원의 일본 국내단계 출원 제2000-508888호). 이와 같이, 불비누화 물질 및 스테롤 함량이 낮은 식용 유지가 광범위하게 필요하기 때문에 불비누화 물질 및/또는 스테롤을 저감시키려는 연구가 수행되고 있다. 그러나, 미생물의 고농도 배양에 의하여 생산되는 미생물 유지의 불비누화 물질 및 스테롤류에 대하여 보고된 적은 없다.
전술한 바와 같이, 불비누화 물질의 주요 성분으로서의 스테롤은 유리형 스테롤과 에스테르형 스테롤로 구분된다. 유리형 스테롤은 정제 공정에 의하여 제거되는 반면에, 에스테르형 스테롤은 정제 공정에서 제거되기 어렵다.
따라서, 불비누화 물질 함량, 특히 스테롤 함량이 낮은 정제 유지를 제공하기 위해서는, 정제 공정에 의하여 제거하는 것이 어려운 에스테르형 스테롤의 함량이 낮은 정제용 원료, 즉 에스테르형 스테롤 함량이 낮은 조유의 개발이 중요하다고 생각된다.
따라서, 본 발명은 유지 중의 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 조유의 제조 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 조유로부터 정제유를 제조하는 방법을 제공한다.
*또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조될 수 있는, 조유 중의 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 조유 및 이 유지로부터 얻어지는 정제유를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유지의 다양한 사용 방법을 제공한다.
불비누화 물질 함량 및 스테롤 함량을 저감시킨 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 포함하는 유지는 이미 보고되어 있다(특개평10-191886호 및 10-70992호, 국제출원의 일본국 국내단계 출원 제2000-510513호). 그러나, 이들 제조 방법은 배지의 질소 공급원 농도가 낮기 때문에 유지의 경제적인 생산에 적합하지 않다. 따라서, 경제성을 높이기 위하여, 배지의 질소 공급원 농도를 증가시켜 배양함으로써 배양 1회당 회수되는 고도 불포화 지방산의 양을 증가시켰다. 그러나, 이 경우, 유지 중의 불비누화 물질 함량 및 스테롤 함량 역시 상승되는 것을 알게 되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 고농도 배양에 의한 경제성 향상과, 불비누화 물질 함량 및 스테롤 함량의 저감에 의한 품질 향상을 모두 만족시킬 수 있는 제조 방법을 개발하는 것이다.
본 발명자들은 고농도 배양에 의하여 얻어지는 유지 중, 구체적으로는 조유 중의 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하여 이루어지는 유지(조유)를 제공할 목적으로, 고농도의 질소 공급원을 함유하는 배지에서 얻어지는 유지의 화학적 조성과 배양 조건에 대하여 부단히 연구하였다. 그 결과, 놀랍게도, 배양조의 교반 날개 형상의 개선 및 배지 질소 공급원의 살균 pH 조건의 개선에 의하여, 불비누화 물질 함량이 2.2 중량% 이하 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 1.0 중량% 이하인 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하여 이루어진 유지(조유)를 제조하는 방법을 정립하게 되었다.
액체 배양법에 의하여 미생물을 이용하여 고도 불포화 지방산을 제조함에 있어서는 충분한 양의 산소의 공급이 중요한 것으로 알려져 있다(특개평 6-153970호). 산소 이동 용량 계수[volumetric oxygen transfer coefficient (kLa)]가 미생물의 액체 배양에서 산소 공급 지표로서 광범위하게 이용된다. 리차드(Richard)는 kLa가 단위 액량당 교반 소요 동력(Pg/V), 통기 선속도(Vs), 교반 속도(N)와 수학식 (1)로 표시되는 관계를 갖는 것으로 보고하였다(J. W. Richard; Prog. Ind. Microbiol., vol. 3, p. 141, (1961)).
Figure 112014060284302-pat00001
후쿠다(Fukuda) 등은 부피가 0.2 내지 60㎥인 배양조에서의 측정값에 기초하여, 수학식 (1)에 비하여 수학식 (2) 쪽이 더 우수한 상관 관계를 제공한다고 보고하였다(Fukuda 등, 醱酵工學會誌, vol. 46, p. 829 (1968)).
Figure 112014060284302-pat00002
마쯔시마(Matsushima) 등은 수학식 (1)과 (2)의 보편성을 검증하여, 수학식 (3)과 같이 일반화하는 것이 보다 광범위하게 성립하는 것으로 보고하였다(Matsushima 등, 醱酵工學會誌, vol. 50, p. 105 (1972)).
Figure 112014060284302-pat00003
이들 상관 관계 식으로부터, 동일 교반 소요 동력(Pg/V) 및 동일 통기 선속도(Vs) 조건 하에서는 보다 높은 교반 속도(N)에서 조작하는 것이 높은 산소 이동 용량 계수(kLa)를 제공하는 것으로 생각된다.
단위 액량당 교반 소요 동력은 수학식 (4)로 표시된다.
Figure 112014060284302-pat00004
식 중, ρ는 액체 밀도를, Np는 동력수를, d는 교반 날개의 직경을 나타낸다.
주어진 일, 즉 동일 교반 소요 동력에서 보다 높은 교반 속도(N)를 제공하기 위해서는, 보다 작은 동력수(Np) 및 보다 작은 교반 날개 직경(d)을 갖는 배양조를 사용하는 것이 유리한 것으로 생각된다.
다구치(Taguchi) 등(微生物學基礎講座7-微生物培養工學, Hisaharu Taguchi 및 Shiro Nagai 편집, 共立出版社, 1985년 p. 175)은 통기 교반 배양조의 표준 조건으로서 d/D 비율의 표준 범위는 1/4 내지 1/3이고, 전형적으로는 1/3이라고 설명하고 있다.
그러나, 이는 단지 물 또는 균체 농도가 낮은 배양액에서 정립된 것이다. 제조의 경제성을 향상시키기 위해서는 배지의 질소 공급원 농도를 상승시켜 보다 높은 균체 농도가 되도록 하여야 한다. 따라서, 본 발명자들은 균체 농도가 높은 배양액에 있어서는 산소 이동 용량 계수(kLa) 뿐 아니라, 배양액의 전체 혼합 역시 고려하여야 한다고 생각하였다.
또한, 질소 공급원 농도를 상승시켜 보다 높은 균체 농도에서 배양하는 경우, 미생물로부터 추출된 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 유지(조유)에 포함된 불비누화 물질 함량 및 에스테르형 스테롤 함량이 증가하는 결과가 초래되고, 이는 상승된 질소 공급원 농도를 갖는 배양에 기인하는 바람직하지 않은 화학 조성을 갖는 유지가 되는 것을 알게 되었다. 이와모토(Iwamoto)는 전체 지질 중의 불비누화 물질의 함량은 균체의 유지 함량의 증가에 따라 감소한다고 보고하였다("미생물에 의한 유지의 생산" Hiroaki Iwamoto,(출전 불명)). 본 발명자들이 수행한 연구에 의하면, 고농도에서 배양하는 경우, 균체당 유지 함량을 감소시키는 경향이 있는 것으로 인식되었다. 본 발명자들은 균체당 유지 함량이 저하된 것은 불비누화 물질 함량 및 에스테르형 스테롤 함량의 증가에 기인한 것이라고 생각하였다.
따라서, 본 발명자들은 배지의 질소 공급원 농도가 높은 고농도 배양에 있어서 산소 이동 용량 계수(kLa) 뿐 아니라, 배양액의 전체 혼합 역시 개선하여, 균체당 유지 함량을 상승시키는 것이 중요하다고 생각하였다. 본 발명자들은 이와 같은 목적을 달성하는 수단으로서 교반 날개의 모양(형상)을 개량하는 것에 착안하여, 부단히 연구하였다. 그 결과, 본 발명자들은 교반 날개 직경(d), 배양조 내경(D)의 비율 d/D = 0.34 내지 0.6인 배양조를 이용하여 미생물을 배양함으로써, 균체당 유지 함량의 상승 및 고도 불포화 지방산의 생산성 향상에 성공하였다. 또한, 놀랍게도, 이 경우에 미생물로부터 추출되는 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로하는 유지의 에스테르형 스테롤 함량이 상당히 낮아지는 것을 알게 되었다.
또한, d/D가 0.34 미만인 배양조에서 배양하는 경우에도, 배지의 질소 공급원을 pH 5.0 이하에서 살균함으로써, 미생물에 의한 고도 불포화 지방산의 생산성을 향상시키고, 에스테르형 스테롤 함량을 저감시킬 수 있다는 것을 알게 되었다.
이에 기초하여, 본 발명자들은 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 d/D가 0.34 이상인 교반 날개를 장치한 배양조를 사용하여 배양하거나, 또는 d/D가 0.34 미만인 배양조의 경우 pH 5.0 이하에서 살균된 질소 공급원을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하여 이루어진 유지(조유)를 안정적으로 제조하는 데에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 유지를 생산할 수 있는 미생물을, 2 내지 15% 농도의 질소 공급원을 함유하는 배지에서, 배양조 내경(D)에 대한 교반 날개 직경(d)의 비율 d/D = 0.30 내지 0.6이라는 조건을 만족하는 교반 날개가 장치된 배양조에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 조유 중의 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 조유의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조되는, 불비누화 물질 함량이 2.2 중량% 이하인 것을 특징으로 하는 조유를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 조유를 정제하여 얻어지는 정제 유지를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조유 및/또는 정제 유지가 배합되어 이루어지는 일반 식품 및 음료, 기능성 식품, 영양 보조 식품, 미숙아용 조제 분유, 성숙아용 조제 분유, 유아용 식품, 임산부 또는 수유부용 식품, 또는 노인용 식품을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조유 및/또는 정제 유지를, 임의로 경구, 장내 또는 비경구 투여에 적합한 중성 담체와 함께 배합한, 치료용 영양 식품을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조유 및/또는 정제 유지가 배합되어 이루어지는 동물용 또는 양어용 사료를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조유 및/또는 정제 유지가 배합되어 이루어지는 의약 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 조유 및/또는 정제 유지를 원료로 사용하여 제조되는 의약 조성물을 제공한다.
발명의 실시 형태
본 발명은 불비누화 물질 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하여 이루어지는 유지(조유)의 제조 방법, 상기 유지(조유)의 정제에 의하여 얻어지는 정제 유지(트리글리세라이드)가 배합되어 이루어지는 식품 및 음료, 치료용 영양 식품, 사료 및 의약품에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유지(조유)는 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하여 이루어지는 유지를 생산할 수 있는 미생물을 2 내지 15% 농도의 질소 공급원을 함유하는 배지에서 배양하여 제조되는 배양물로부터 얻어지는 미생물 유지이다. 상기 유지(조유)는 d/D = 0.34 내지 0.6의 교반 날개가 장치된 배양조에서 배양하거나, 또는 d/D가 0.34 미만인 배양조를 사용하는 경우 pH 5 이하에서 살균한 질소 공급원을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 조유 중의 불비누화 물질 및/또는 에스테르형 스테롤 함량을 저감시킨 것이다.
구체적으로는, 상기 유지(조유)는 불비누화 물질 함량 2.2 중량% 이하, 바람직하게는 2.0 중량% 이하, 보다 바람직하게는 1.8 중량% 이하 및/또는 에스테르형 스테롤 함량 1.0 중량% 이하, 바람직하게는 0.8 중량% 이하, 보다 바람직하게는 0.6 중량% 이하, 유지(조유) 중의 전체 지방산에 대하여 고도 불포화 지방산 함량 10 중량% 이상, 바람직하게는 20 중량% 이상, 보다 바람직하게는 30 중량% 이상, 가장 바람직하게는 40 중량% 이상 함유한다. 따라서, 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하여 이루어지는 유지(트리글리세라이드)를 생산할 수 있는 미생물을 배양하는 것이 필수적이다.
본 발명에서 언급되는 미생물은 탄소수가 18개 이상이고 이중 결합이 3개 이상인 ω6계 고도 불포화 지방산, 탄소수가 18개 이상이고 이중 결합이 2개 이상인 ω9계 고도 불포화 지방산 및 탄소수가 18개 이상이고 이중 결합이 3개 이상인 ω3계 고도 불포화 지방산 중 1종 이상의 고도 불포화 지방산을 주로 트리글리세라이드의 구성 지방산으로서 생산하는 미생물인 것이 바람직하다.
탄소수가 18개 이상이고 이중 결합이 3개 이상인 ω6계 고도 불포화 지방산으로는 γ-리놀렌산(6,9,12-옥타데카트리엔산), 디호모-γ-리놀렌산(8,11,14-에이코사트리엔산), 아라키돈산(5,8,11,14-에이코사테트라엔산), 7,10,13,16-도코사테트라엔산(22: 46) 및 DPA ω6(4,7,10,13,16-도코사펜타엔산)을 들 수 있다. 탄소수가 18개 이상이고 이중 결합이 2개 이상인 ω9계 고도 불포화 지방산으로는 6,9-옥타데카디엔산, 8,11-에이코사디엔산 및 미드산(Mead acid: 5,8,11-에이코사트리엔산)을 들 수 있고, 탄소수가 18개 이상이고 이중 결합이 3개 이상인 ω3계 고도 불포화 지방산은 α-리놀렌산(9,12,15-옥타데카트리엔산), 6,9,12,15-옥타데카테트라엔산(18:4 ω3), 8,11,14,17-에이코사테트라엔산(20:4 ω3), EPA (5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산), DPA ω3(7,10,13,16,19-도코사펜타엔산) 및 DHA(4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산을 들 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서는 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 포함하는 유지(트리글리세라이드)를 생산할 수 있는 미생물이라면 어떤 것이라도 사용될 수 있다. 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 유지(트리글리세라이드)를 생산할 수 있는 미생물로는, 예를 들면 모르티에렐라(Mortierella)속, 코니디오볼루스(Conidiobolus)속, 피튬(Pythium)속, 피토프토라(Phytophthora)속, 페니실리움(Penicillium)속, 클라도스포리움(Cladosporium)속, 무코(Mucor)속, 후사리움(Fusarium)속, 아스퍼길루스(Aspergillus)속, 로도토루라(Rhodotorula)속, 엔토몹토라(Entomophthora)속, 에키노스포란기움(Echinosporangium)속 및 사프로레그니아(Saprolegnia)속에 속하는 미생물을 들 수 있다.
모르티에렐라(Mortierella)속 모르티에렐라(Mortierella) 아속에 속하는 미생물로는, 예를 들면 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata), 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua), 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila) 및 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)를 들 수 있다. 이들의 구체적인 예로는 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata) (IFO 8570), 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) (IFO 8571), 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila) (IFO5941), 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) (IFO8568), ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250. 53, CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70 및 CBS754.68 균주를 들 수 있다.
예를 들면, DHA를 생산할 수 있는 미생물로는 크립토코데니움(Crypthecodenium)속, 트라우토키트리움(Thrautochytrium)속, 스키조키트리움(Schizochytrium)속, 울케니아(Ulkenia)속, 자포노키트리움(Japonochytrium)속 또는 할리프토로스(Haliphthoros)속에 속하는 미생물을 들 수 있다.
이들 균주는 모두 오사카 발효연구소(IFO), 아메리칸 컬쳐 콜렉션(ATCC) 및 센트랄 뷰로 부어 시멜컬쳐(Centrralbureau voor Schimmelcultures, CBS)로부터 아무런 제한 없이 입수 가능하다. 또한, 본 발명의 연구 그룹에 의하여 토양으로부터 분리된 균주, 즉 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata) SAM 0219(FERM P-8703) (FERM BP-1239) 역시 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 균주를 배양하기 위해서는 포자, 균사, 또는 예비 배양에 의하여 얻어지는 종자 배양액 또는 종자 배양으로부터 회수된 균체를 액체 배지에 접종하여 본 배양을 한다. 액체 배지의 경우에, 본 발명에서 사용 가능한 탄소 공급원으로는 본 발명 분야에서 통상 사용되는 것들, 예를 들면, 글루코오스, 프락토오스, 크실로스, 사카로오스, 말토오스, 가용성 전분, 당밀, 글리세롤, 마니톨 및 당화 전분을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
질소 공급원은 펩톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 고기 추출물, 카사미노산, 옥수수 스티프 리쿼(corn steep liquors), 대두 단백질, 탈지 대두 및 면실 밀(cotton seed meals)과 같은 천연 질소 공급원, 우레아와 같은 유기 질소 공급원 및 질산나트륨, 질산암모늄, 황산암모늄과 같은 무기 질소 공급원을 포함한다. 특히, 대두로부터, 구체적으로는 대두로부터 얻어지는 질소 공급원, 구체적으로는 탈지 대두, 대두 플레이크, 식용 대두 단백질, 두부 찌꺼기(bean-curd refuse), 두유 및 대두 분말 등을 들 수 있다. 특히 열변성 탈지 대두, 보다 바람직하게는 탈지 대두를 약 70 내지 90℃에서 열처리하고, 이어서 에탄올 용해성 성분을 제거한 것을 단독으로 또는 2종 이상 조합하여, 또는 전술한 질소 공급원과 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 필요한 경우, 인산 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온과, 철, 구리, 아연, 망간, 니켈, 코발트 등과 같은 금속 이온 및 비타민 등을 미량 영양 성분으로서 사용할 수 있다.
이들 배지 성분의 농도는 미생물의 성장을 억제하지 않는 한 특별히 제한되지 않는다. 실용상, 첨가되는 탄소 공급원의 총량은 일반적으로 0.1 내지 40 중량%, 바람직하게는 1 내지 25 중량%이고, 첨가되는 질소 공급원의 총량은 바람직하게는 2 내지 15 중량%, 보다 바람직하게는 2 내지 10 중량%이다. 보다 바람직하게는, 초기 탄소 공급원의 첨가량은 1 내지 5 중량%, 초기 질소 공급원의 첨가량은 3 내지 8 중량%로 하고, 배양 도중에 탄소 공급원과 질소 공급원을, 보다 바람직하게는, 탄소 공급원만을 공급(유가)할 수 있다.
불포화 지방산의 수율을 증가시키기 위하여, 불포화 지방산의 전구체로서, 예를 들면, 헥사데칸 또는 옥타데칸과 같은 탄화수소; 올레산 또는 리놀레산과 같은 지방산 또는 이들의 염; 예를 들면, 에틸 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르 또는 소르비탄 지방산 에스테르와 같은 지방산 에스테르; 올리브유, 대두유, 평지 종자유(rapeseed oils), 면실유 또는 야자유와 같은 유지류를 단독으로 또는 조합으로 사용할 수 있다. 기질의 첨가량은 배지에 대하여 0.001 내지 10%, 바람직하게는 0.5 내지 10%이다. 이들 기질을 유일한 탄소 공급원으로 하여 배양할 수도 있다.
고도 불포화 지방산을 생산하는 미생물 배양 온도는 사용되는 미생물에 따라 다르다. 그러나, 배양 온도는 5 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 30℃이다. 20 내지 30℃에서 배양하여 균체를 증식시키고, 이어서 5 내지 20℃에서 배양을 계속하여 불포화 지방산을 생산하도록 하는 방법을 사용할 수도 있다. 온도를 조절함으로써, 생산되는 지방산 중의 고도 불포화 지방산의 비율을 상승시킬 수 있다. 종자 배양은 통기 교반 배양, 진탕 배양, 고체 배양 또는 정치 액체 배양으로, 본 배양은 통기 교반 배양으로 수행한다. 본 배양 개시 시점(종자 배양액의 접종 시점)의 배지 pH는 5 내지 7, 바람직하게는 5.5 내지 6.5로 조절한다. 본 배양은 통상 2 내지 30일, 바람직하게는 5 내지 20일, 보다 바람직하게는 5 내지 15일 동안 수행한다.
본 발명에 따른 유지(조유)는 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하여 이루어지는 유지(트리글리세라이드)를 생산할 수 있는 미생물을 배양하는 것으로부터 제조되는 배양물로부터 얻어지는 미생물 유지로서, 본 발명의 가장 큰 특징은 d/D = 0.34 내지 0.6인 교반 날개가 장치된 배양조에서 본 배양을 하거나, 또는 d/D가 0.34 미만인 배양조를 사용하는 경우 pH 5 이하에서 살균한 질소 공급원을 함유하는 배지에서 본 배양함으로써, 조유 중의 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량을 저감시키는 점이다. 따라서, 본 발명은 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 포함하는 유지(트리글리세라이드)를 생산할 수 있는 미생물을 이용하여, 조유 중의 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량을 저감시키는 방법을 개발한 것이다.
*본 발명에 따른 배양법의 가장 큰 특징은 d/D(배양조의 내경(D)에 대한 교반 날개의 직경(d)의 비율)이 0.30 내지 0.6, 바람직하게는 d/D = 0.34 내지 0.55, 보다 바람직하게는 d/D = 0.37 내지 0.55, 가장 바람직하게는 d/D = 0.42 내지 0.55인 배양조에서 배양하는 것에 의하여, 조유 중의 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량을 저감시킨 점이다. 비율 d/D에 의하여 보다 우수한 효과를 얻기 위해서는 부피 1㎥ 이상, 바람직하게는 5㎥ 이상, 보다 바람직하게는 10㎥ 이상의 배양조를 사용하는 것이 바람직하다. 교반 날개로는 터빈 날개를 갖는 교반 날개를 1단으로 또는 복수의 단으로 하여 제한 없이 사용할 수 있다.
살균 후에 배지의 pH를 조절하는 경우에 그 조절은 불필요한 미생물에 의한 오염이 일어나지 않도록 주의하면서 무균적으로 수행되어야 한다. 따라서, 배지 살균 이전에 pH를 조절하는 것이 일반적이다. 예를 들면, 살균 전후에 pH 변화가 일어나지 않는 배지를 배양 개시 시점에서 pH 6.0으로 조절하는 경우에, 살균 전에 비무균적 방법으로 배지의 pH를 6.0으로 조절하면, 살균 이후에 무균적으로 pH를 조절하는 것이 필요하지 않게 된다. d/D가 0.34 미만인 배양조에 있어서도 에스테르형 스테롤을 저감시키기 위하여, 본 발명자들은 살균 공정의 pH 조건이 배양의 생산성 및 생성물의 조성에 영향을 미칠 가능성에 착안하여 이에 대하여 연구하였다. 그 결과, 본 발명자들은 배지 살균 전에 pH 5 이하로 조절하고, 살균 후에 배양 개시에 적합한 값으로 pH를 재조절하는 것이 좋다는 것을 발견하였다.
구체적으로는, 질소 공급원을 함유하는 용액을 pH 4 내지 5, 바람직하게는 pH 4.2 내지 4.7로 조절한 다음에 살균한다. 이와 같은 방법으로 살균된 배지를 그대로, 또는 별도의 살균 배지가 있는 경우 이를 임의로 첨가하여 배양 개시 배지로 조제한 다음, pH 5 내지 7, 바람직하게는 pH 5.5 내지 6.5으로 조절한다. 종자 배양액을 배지에 접종하여 본 배양을 개시한다. 살균 전에 질소 공급원 함유 용액의 pH 조절에 사용할 수 있는 pH 조절 수단은 황산, 염산, 인산, 질산 및 탄산 또는 이들의 염을 포함하지만, 이에 한정되지는 않으며, 이들을 단독으로 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다. 살균 이후 배지의 pH 재조절에 사용되는 수단은 수산화나트륨 및 수산화칼륨과 같은 수산화 화합물, 암모니아 및 암모늄염을 포함하지만, 이에 한정되지는 않으며, 이들을 단독으로 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다.
모르티에렐라(Mortierella)속 모르티에렐라(Mortierella) 아속에 속하는 미생물은 아라키돈산을 주요 구성 지방산으로서 포함하는 유지(트리글리세라이드)를 생산할 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 상기 균주에 변이 처리를 실시하여, 디호모-γ-리놀렌산을 주요 구성 지방산으로서 포함하는 유지(트리글리세라이드)를 생산할 수 있는 미생물(특개평 5-91887호) 및 ω9계 고도 불포화 지방산을 주요 구성 지방산(트리글리세라이드)으로 포함하는 유지를 생산할 수 있는 미생물(특개평 5-91888호)를 얻었다.
또한, 본 발명자들은 고농도의 탄소 공급원에 대하여 내성이 있는 미생물을 얻었다(국제공개공보 제98/39468호). 상기 미생물들은 모르티에렐라(Mortierella)속 모르티에렐라(Mortierella) 아속에 속하는 미생물로서, d/D = 0.34 내지 0.6의 교반 날개가 장치된 배양조를 사용하여 본 배양하거나, 또는 d/D가 0.34 미만인 배양조를 이용하는 경우에는 pH 5 이하에서 살균된 질소 공급원 함유하고 질소 공급원의 농도가 2 내지 15%인 배지에서 본 배양함으로써, 조유 중의 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량을 용이하게 저감시킬 수 있다.
그러나, 본 발명에 사용되는 미생물은 모르티에렐라(Mortierella)속 모르티에렐라(Mortierella) 아속에 속하는 미생물에 한정되는 것은 아니며, 목적하는 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 조유는, 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 포함하는 유지(트리글리세라이드)를 생산할 수 있는 미생물을 본 발명에 따른 배양법에 적용하는 것에 의하여, 구체적으로는, d/D = 0.34 내지 0.6의 교반 날개가 장치된 배양조에서 본 배양하거나, 또는 d/D가 0.34 미만인 배양조를 이용하는 경우에는 pH 5 이하에서 살균된 질소 공급원 함유하고 질소 공급원의 농도가 2 내지 15%인 배지에서 본 배양하는 것에 의하여 생산될 수 있다.
d/D = 0.34 내지 0.6의 교반 날개가 장치된 배양조에서 본 배양하거나, 또는 d/D가 0.34 미만인 배양조를 이용하는 경우에는 pH 5 이하에서 살균된 질소 공급원 함유하고 질소 공급원의 농도가 2 내지 15%인 배지에서 본 배양하는 것에 의하여, 불비누화 물질 함량및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 포함하는 유지를 축적하는 미생물로부터 조유를 얻는 방법은, 배양 종료 후에, 배양액을 그대로 또는 살균, 농축 또는 산성화 처리 후에, 자연 침강, 원심 분리 및/또는 여과 등의 통상적인 고체-액체 분리 수단을 실시하여 배양 균체를 회수하는 방법을 포함한다.
고체-액체 분리를 돕기 위하여 응집 보조제 또는 여과 보조제를 첨가할 수 있다. 응집 보조제는, 예를 들면, 염화알루미늄, 염화칼슘, 알긴(algin) 및 키토산을 포함한다. 여과 보조제는, 예를 들면, 규조토를 포함한다. 배양 균체를 바람직하게는 수세, 파쇄 및 건조한다. 건조는 예를 들면 동결 건조, 공기 건조 또는 유동층 건조를 실시할 수 있다. 건조 균체로부터 조유를 얻는 수단으로는 유기 용매에 의한 추출법 또는 압착법이 이용될 수 있다. 그러나, 질소 기류 하에서의 유기 용매에 의한 추출법이 바람직하다.
유기 용매로는 에탄올, 헥산, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 석유 에테르 및 아세톤을 들 수 있다. 메탄올과 석유 에테르을 이용하는 교대 추출법과, 클로로포름-메탄올-물로 이루어진 단일상을 이용하는 추출법 역시 이용될 수 있다. 그러나, 조유를 얻기 위한 추출법은 상기 방법에 한정되지 않으며, 균체 내에 축적되는 유지를 효율적으로 추출할 수 있는 방법이라면 어떤 것이라도 이용될 수 있다. 예를 들면, 초임계 추출법도 유효한 수단으로 이용될 수 있다. 유기 용매 또는 초임계 유체로 추출하여 얻은 추출물로부터 감압 또는 다른 조건 하에서 상기 유기 용매 또는 초임계 유체를 제거함으로써 목적하는 조유를 얻을 수 있다. 대안으로서, 습윤 균체(wet cells)를 이용하여 추출할 수 있다. 이 경우, 메탄올, 에탄올 및 아세톤과 같이 물과 상용성인 용매, 또는 상기 용매와 물 및/또는 다른 용매로 이루어진, 물과 상용성인 혼합 용매가 사용될 수 있다. 기타의 절차는 앞에서 설명한 것과 같다.
본 발명에 따라 제조되는, 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유는 동물 사료에 배합되어 직접 사용될 수 있다. 그러나, 식품에 적용하는 것을 고려하는 경우에는 조유를 일반적인 유지 정제 공정을 거쳐 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 유지 정제 공정은 탈검, 탈산, 탈취, 탈색, 칼럼 처리, 분자 증류 및 윈터링과 같은 통상의 공정을 포함한다. 따라서, 통상의 유지 정제 공정에 의하여 얻어질 수 없었던 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 본 발명에 따른 조유를 유지 정제 공정에 제공함으로써, 이제까지는 없었던 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 정제 유지를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른, 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 조유를 유지 정제 공정에 제공하는 것에 의하여 정제 공정에 있어서 공정 부하를 낮출 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 정제 공정에 있어서 처리 시간의 단축 및 에너지 비용을 낮추면서도 종래 기술에서와 동등한 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량을 갖는 정제 유지를 얻을 수 있다. 또한, 종래 기술에서와 동등한 처리 시간 및 에너지 비용으로, 종래 기술에 비하여 불비누화 물질 함량 및/또는 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 정제 유지를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 정제 유지(트리글리세라이드)의 용도는 무한한데, 예를 들면, 식품, 음료, 화장품, 의약품의 원료 및 첨가제로 사용될 수 있고, 그 사용 목적과 사용량에는 제한이 없다.
예를 들면, 정제 유지가 사용될 수 있는 식품 조성물로는 일반 식품 이외에도, 기능성 식품, 영양 보조 식품, 미숙아용 조제유, 성숙아용 조제유, 유아용 조제유, 유아용 식품, 임산부 및 수유부용 식품 또는 노인용 식품 등을 들 수 있다.
유지를 함유하는 식품의 예로는 육류, 어류 또는 견과류 등과 같이 본래 유지를 함유하는 천연 식품; 스프와 같이 조리 시에 유지가 첨가되는 식품; 도넛과 같이 유지를 가열 매질로서 사용하는 식품; 버터와 같은 유지 식품; 쿠키 또는 비스켓과 같이 가공 시에 유지가 첨가되는 가공 식품; 또는 하드 비스켓(hard biscuits)과 같이 마무리 가공 시에 유지를 분무 또는 도포하는 식품을 들 수 있다. 또한, 정제 유지는 유지를 포함하지 않는 농산 식품, 발효 식품, 축산 식품, 수산 식품 또는 음료에 첨가될 수도 있다. 정제 유지는 기능성 식품 및 의약품 형태로, 예를 들면, 강장 영양제, 분말, 과립, 트로치(troches), 내복액, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 가공 형태로 사용될 수 있다.
이하에서는 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1 아라키돈산의 생산, d/D = 0.34, 배지 중 대두 분말 농도 = 6%
모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) (CBS 754.68)를 아라키돈산 생산균으로 이용하였다. 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)의 표준 균주를 배지(1% 효모 추출물, 2% 글루코오스, pH 6.3)에 접종하였다. 왕복 진탕 100 rpm, 온도 28℃의 조건에서 종자 배양(제1단계)을 개시하여, 3일 동안 배양하였다. 그 다음, 30L의 배지(1% 효모 추출물, 2% 글루코오스, 0.1% 대두유, pH 6.3)을 50L 부피 통기 교반 배양조에 제조하였다. 종자 배양(제1단계)액을 배지에 접종하였다. 왕복 진탕 200 rpm, 온도 28℃, 배양조 내부 압력 150 kPa의 조건에서 종자 배양(제2단계)을 개시하여, 2일 동안 배양하였다.
그 다음, 4500L의 배지(배지 A: 대두 분말 336 kg, KH2PO4 16.8 kg, MgCl2 ·6H2O 2.8 kg, CaCl2·2H2O 2.8 kg, 대두유 5.6 kg)을 제조하였다. 배지를 조건 (1-1)에서는 pH 6.3으로, 조건 (1-2)에서는 pH 4.5로 조절하였다. 조건 (1-1)의 배지와 조건 (1-2)의 배지 양쪽 모두를 121℃, 20분의 조건에서 살균하였다. 1000 L의 배지(배지 B: 글루코오스 모노하이드레이트 112 kg)를 140℃, 40초의 조건에서 살균하고, 상기 배지 A에 첨가하여 별도의 배지로서 배지 C를 제조하였다. 배지 C를 조건 (1-1)에서는 그대로 사용하고, 조건 (1-2)에서는 배지 C를 pH 6.3으로 조절하였다. 그 다음, 이와 같이 제조한 배지에 종자 배양(제2단계)액을 접종하고, 초기 배양액의 총량이 5600 L(배양조의 부피: 10 kL)가 되도록 부피를 조정하였다.
온도 26℃, 통기량 49N㎥/시간 및 내압 200 kPa의 조건에서 배양을 개시하였다. 배양조의 형상으로는 6날 터빈(six-blades turbines)이 3단으로 장치되어 있고, 배양조 내경(= D)에 대한 교반 날개 직경(= d)의 비율 d/D = 0.34인 것을 사용하였다. 표 1에 제시된 것과 같은 배지를 공급하면서 본 배양을 306 시간 동안 실시하였다. 배양 종료 시에, 배지에 공급된 용액량의 증가분과 증발에 의한 감소분의 영향으로 배양액의 양은 7750L이 되었다. 배양 종료 시에, 배양액 1 리터당 생산되는 아라키돈산의 농도는 조건 (1-1)에서 18.2 gL, 조건 (1-2)에서 18.4 g/L이었다.
실시예 1의 공급 배지
본 배양 시간 공급 배지
19시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 280 kg/460 L
43시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 280 kg/450 L
67시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 252 kg/390 L
91시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 252 kg/410 L
120시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 224 kg/370 L
140시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 168 kg/280 L
163시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 168 kg/270 L
배양 종료 후에, 배양액을 120℃에서 20분 동안 살균하였다. 그 다음, 습윤 균체를 연속식 탈수기로 회수하였다. 회수된 습윤 균체를 진동 유동층 건조기에서 수분 함량이 1 중량%가 될 때까지 건조하였다. 건조된 균체를 공기 운송기를 이용하여 충전 장소로 운송하고, 부피 약 1㎥의 알루미늄 파우치 용기 백(aluminum pouch container bag)에 질소 기체와 함께 충전하였다. 백의 입구 부분을 가열 밀봉한 다음, 용기 백을 10℃ 이하의 냉장실에 보관하였다.
건조 균체를 용기 백으로부터 꺼내어 헥산으로 추출하였다. 여과하여 고형분을 헥산 용액으로부터 제거하였다. 그 다음, 여액을 감압하에서 가열하여 헥산을 제거하여 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유를 얻었다. 조유를 분석하였다. 그 결과, 표 2에 제시된 것과 같이, 조유의 에스테르형 스테롤 함량이 낮았다.
아라키돈산 함유 조유에 대한 분석값
실시예 실시예 1
조건 1-1		 실시예 1
조건 1-2
배양조 형상, d/D 0.34 0.34
배지 A의 pH 조절값(멸균 이전)
배지 C의 pH (멸균 이후, 종자 배양액의 접종 이전)		 6.3
6.3		 4.5
6.3
각 분획의 중량 %
트리글리세라이드
불비누화 물질
에스테르형 스테롤
94.0%
2.0%
0.8%
94.2%
1.8%
0.6%
조유내 전체 지방산 중 아라키돈산, % 42.0% 42.1%
실시예 2 아라키돈산의 생산, d/D = 0.42, 배지 중의 대두 분말 농도 = 6%
실시예 1에서와 동일한 방법으로 종자 배양을 실시하였다. 배양조의 형상으로는 d/D = 0.42인 6날 터빈이 3단으로 장치된 것을 사용하고, 배지 제조 시의 pH 조건을 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1의 조건 (1-1)에서와 동일한 조건하에서 본 배양을 실시하였다. 조건 (2-1)에서는 배지 A(살균전)를 pH 6.1로 조절하고, 배지 C(종자 배양액 접종전)에서는 pH를 조절하지 않았다. 조건 (2-2)에서는 배지 A를 pH 4.5로, 배지 C를 pH 6.1로 조절하였다. 배양 결과, 배양 종료 시에 배양액 1 리터당 생산되는 아라키돈산의 농도는 조건 (2-1)에서 19.0 g/L, 조건 (2-2)에서 19.7 g/L이었다. 배양 종료 후에, 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 얻었다. 조유를 분석하였다. 그 결과, 표 3에 제시된 것과 같이, 조유의 에스테르형 스테롤 함량이 낮았다.
아라키돈산 함유 조유에 대한 분석값
실시예 실시예 2
조건 2-1		 실시예 2
조건 2-2
배양조 형상, d/D 0.42 0.42
배지 A의 pH 조절값 (멸균 이전)
배지 C의 pH (멸균 이후, 종자 배양액의 접종 이전)		 6.1
6.1		 4.5
6.1
각 분획의 중량 %
트리글리세라이드
불비누화 물질
에스테르형 스테롤
94.2%
1.8%
0.6%
93.5%
1.6%
0.5%
조유내 전체 지방산 중 아라키돈산, % 42.2% 41.3%
실시예 3 아라키돈산의 생산, d/D = 0.3, 0.25 및 0.2, 배지 중의 대두 분말 농도 6%
종자 배양을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하였다. 배양조 형상으로는 d/D = 0.3인 6날 터빈이 2단으로 장치된 배양조, d/D = 0.25인 6날 터빈이 2단으로 장치된 배양조 및 d/D = 0.2인 6날 터빈이 2단으로 장치된 배양조를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1의 조건 (1-1)에서와 동일한 조건에서 본 배양을 실시하였다. 배양 결과, 배양 종료 시에 배양액 1 리터당 생산되는 아라키돈산의 농도는 d/D = 0.30인 배양조에서 17.0 g/L, d/D = 0.25인 배양조에서 16.5 g/L, d/D = 0.2인 배양조에서 13.5 g/L이었다. 배양 종료 후에, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 조작하여 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유를 얻었다. 조유를 분석하였다. 그 결과, 표 4에 제시된 것과 같이, 모든 경우에 에스테르형 스테롤 함량이 1%를 초과하였다. 실시예 3의 결과를 실시예 1 및 2의 결과와 비교하여 보면, d/D 비가 작은 배양조에서 배양하였기 때문인 것으로 생각된다.
아라키돈산 함유 조유에 대한 분석값
실시예 또는 대조예 실시예 3
대조예		 실시예 3
대조예 		실시예 3
대조예
배양조 형상, d/D 0.30 0.25 0.20
배지 A의 pH 조절값 (멸균 이전)
배지 C의 pH (멸균 이후, 종자 배양액의 접종 이전)		 6.3
6.3		 6.3
6.3		 6.3
6.3
각 분획의 중량 %
트리글리세라이드
불비누화 물질
에스테르형 스테롤
93.8%
2.9%
1.2%
93.1%
2.9%
1.2%
93.0%
2.9%
1.2%
조유내 전체 지방산 중 아라키돈산, % 42.0% 41.6% 41.5%
실시예 4 아라키돈산의 생산, d/D = 0.3, 0.25 및 0. 2, 배지 중의 대두 분말 농도= 6%, 낮은 pH 살균
종자 배양을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하였다. 본 배양에서는 배지의 pH를 실시예 1의 조건 (1-2)에서와 같이 조절하였다(배지 A(pH 4. 5) → 살균 → 배지 C(pH 6.3)). 그 다음, 총 3 가지 조건, 즉 d/D = 0.3인 6날 터빈이 2단으로 장치된 배양조인 조건 4-1, d/D = 0.25인 6날 터빈 2단으로 장치된 배양조인 조건 4-2 및 d/D = 0.2 인 6날 터빈 2단으로 장치된 배양조인 조건 4-3에서, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 본 배양을 실시하였다. 위와 같은 실험 이외에도, d/D = 0.3인 배양조를 사용하여, 배지 A를 조건 4-4에서 pH 4.0으로, 조건 4-5에서 pH 4.9로 조절한 2 가지 조건에서 추가 배양을 실시하였다.
본 배양 결과, 배양 종료 시에 배양액 1 리터당 생산되는 아라키돈산의 농도는 조건 (4-1) [pH 4.5에서 살균, d/D = 0.30]에서 17.2 g/L, 조건 (4-2) [pH 4.5에서 살균, d/D = 0.25]에서 16.8 g/L, 조건 (4-3) [pH 4.5에서 살균, d/D = 0.20]에서 14.0 g/L, 조건 (4-4) [pH 4.0에서 살균, d/D = 0.30]에서 17.1 g/L, 조건 (4-5) [pH 4.9에서 살균, d/D = 0.30]에서 17.2 g/L이었다. 배양 종료 후에, 실시예 1에서와 동일한 조작에 의하여, 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유를 얻었다.
조유 분석 결과를 표 5에 제시하였다. d/D = 0.30인 배양조에서 배양한 경우에, 배지의 질소 공급원을 pH 4.5에서 살균하는 것에 의하여 에스테르형 스테롤 함량을 1% 이하로 저감시킬 수 있다는 것을, 실시예 4의 결과를 실시예 3의 결과와 비교하는 것으로부터 알 수 있다. 그러나, d/D = 0.25인 배양조와 d/D = 0.20인 배양조에서는 배지의 질소 공급원을 pH 4.5에서 살균하였음에도 불구하고, 에스테르형 스테롤 함량을 1% 이하로 저감시킬 수 없었다. 또한, 조건 (4-1), (4-4) 및 (4-5)의 결과를 비교하여 보면, 4.0 내지 4.9의 pH 범위에서 질소 공급원을 살균하는 경우에는 에스테르형 스테롤 함량 저감 결과가 동등한 것으로 생각되었다.
아라키돈산 함유 조유에 대한 분석값
실시예 또는 대조예 실시예 4
조건 4-1		 실시예 4
조건 4-2
(대조예) 		실시예 4
조건 4-3
(대조예) 		실시예 4
조건 4-4
 실시예 4
조건 4-5
배양조 형상, d/D 0.30 0.25 0.20 0.30 0.30
배지 A의 pH 조절값 (멸균 이전)
배지 C의 pH
(멸균 이후, 종자 배양액의 접종 이전)		 4.5

6.3		 4.5

6.3		 4.5

6.3		 4.0

6.3		 4.9

6.3
각 분획의 중량 %
트리글리세라이드
불비누화 물질
에스테르형 스테롤
93.8%
2.2%
1.0%
93.1%
2.5%
1.1%
93.0%
2.7%
1.1%
93.5%
2.1%
1.0%
93.4%
2.1%
1.0%
조유내 전체 지방산 중 아라키돈산, % 42.0% 40.8% 40.8% 41.5% 41.7%
실시예 5 조유를 정제하여 얻은 정제 유지 분석 결과
실시예 1의 조건 (1-1) 및 실시예 2의 조건 (2-1)에서 제조한 아라키돈산 함유 조유를 통상의 탈산 및 탈검법에 따라 정제하여 정제 유지 5-A 및 5-B를 얻었다. 실시예 3의 조건 d/D = 0.25에서 제조한 아라키돈산 함유 조유를 위와 동일한 방법으로 정제하여 정제 유지 5-C를 얻었다. 아라키돈산 함유 정제 유지에 대한 분석값을 표 6에 제시하였다.
실시예 5의 분석 결과 (아라키돈산 함유 정제 유지 A, B 및 C에 대한 분석값)
실시예 또는 대조예 실시예 1
(조건 1-1)		 실시예 2
(조건 2-1)		 실시예 3
(d/D = 0.25)
(대조예)
정제 유지 5-A 5-B 5-C
각 분획의 중량 %
트리글리세라이드
불비누화 물질
에스테르형 스테롤
96.0%
1.4%
0.8%
96.4%
1.2%
0.6%
95.0%
2.0%
1.2%
정제 유지내 전체 지방산 중 아라키돈산, % 42.4% 42.8% 41.7%
실시예 6 대두 분말 1.5% 조건에서의 아라키돈산 생산
모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) (CBS 754.68)를 사용하여, 종자 배양(제1단계 및 제2단계)을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하였다. 그 다음, 4500L의 배지(배지 A: 대두 분말 84 kg, KH2PO4 16.8 kg, MgCl2·6H2O 2.8 kg, CaCl2·2H2O 2.8 kg, 대두유 5.6 kg)를 121℃, 20분 조건에서 살균하였다. 1000L의 배지(배지 B: 글루코오스 모노하이드레이트 112 kg)를 140℃에서 40초 동안 살균한 다음, 상기 배지 A에 첨가하여 별도의 배지 C를 제조하였다.
배지 C를 pH 6.1로 조절하였다. 종자 배양(제2단계)액을 위와 같이 제조한 배지에 접종하고, 초기 배양액의 총량이 5600 L가 되도록 부피를 조절하였다(배양조 부피: 10 kL). 온도 26℃, 통기량 49N㎥/시간 및 내압 200 kPa 조건에서 본 배양을 개시하였다. 본 배양조의 형상으로는 d/D(배양조 내경(=D)에 대한 교반 날개 직경(= d)의 비율) = 0. 34의 6날 터빈이 2단으로 장치된 배양조 및 d/D = 0.25인 6날 터빈이 2단으로 장치된 배양조를 사용하여, 각 배양조에서 본 배양을 실시하였다. 표 7에 제시된 것과 같은 배지를 공급하면서 본 배양을 162 시간 동안 수행하였다. 배양 종료 시에, 배양액 1 리터당 생산되는 아라키돈산의 농도는 d/D = 0.34인 배양조에서 5.0 g/L이고, d/D = 0.25인 배양조에서 4.7 g/L이었다.
실시예 6의 공급 배지
본 배양 시간 공급 배지
19시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 84 kg/200 L
43시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 84 kg/200 L
67시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 56 kg/120 L
91시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 56 kg/125 L
배양 종료 후에, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 건조 균체를 회수하고, 헥산으로 추출하여 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유를 얻었다. 조유에 대한 분석값을 표 8에 제시하였다. 배지의 질소 공급원의 농도가 1.5%인 경우에, d/D = 0.25 및 d/D = 0.34 양쪽 모두에서 조유의 에스테르형 스테롤 함량이 1% 이하이었다.
실시예 6의 결과 (아라키돈산 함유 조유에 대한 분석값)
배양조 형상, d/D 0.25 0.34
각 분획의 중량 %
트리글리세라이드
불비누화 물질
에스테르형 스테롤
94.1%
1.2%
0.4%
93.0%
1.2%
0.4%
조유내 전체 지방산 중 아라키돈산, % 40.8% 41.5%
실시예 7 디호모 -γ-리놀렌산의 생산: d/D = 0.30, 0.34 및 0.25인 것의 영향, 배지 중의 대두 분말 농도 4% 및 질소 공급원 살균 pH 4.5
본 발명자들은 디호모-γ-리놀렌산을 구성 지방산으로서 포함하는 유지(트리글리세라이드)의 생산 공정을 확립하였다. 상기 유지는 아라키돈산 생산 능력을 갖고, Δ5 불포화화 활성이 낮은 미생물, 예를 들면, 변이 균주 모르티에렐라 알피나(Moltierella alpina) SAM 1860 (FERM P-3589)를 특개평 5-91887에 기술된 방법에 따라 배양하는 것에 의하여 생산될 수 있다.
모르티에렐라 알피나(Moltierella alpina) (SAM 1860)을 디호모-γ-리놀렌산 생산균으로 사용하였다. 모르티에렐라 알피나(Moltierella alpina) 표준 균주를 500 mL 삼각 플라스크에 담긴 100 mL의 배지(1% 효모 추출물, 2% 글루코오스, pH 6.3)에 접종하였다. 종자 배양(제1단계)을 100 rpm, 온도 28℃에서 왕복 진탕 조건으로 개시하여, 3일 동안 배양하였다. 그 다음, 30L의 배지(1% 효모 추출물, 2% 글루코오스, 0.1% 대두유, pH 6.3)를 50L 부피 통기 교반 배양조에 제조하였다. 종자 배양(제1단계)액을 배지에 접종하였다. 속도 200 rpm, 온도 28℃ 및 내압 150 kPa 조건에서 종자 배양(제2단계)을 개시하여, 2일 동안 배양하였다. 본 배양을 조건 (7-1) 내지 (7-4)의 4 가지 수준에서 실시하였다.
조건 (7-1)에서는, 4500L의 배지(배지 A: 대두 분말 224 kg, KH2PO4 16.8 kg, MgCl2·6H2O 2.8 kg, CaCl2·2H2O 2.8 kg, 대두유 5.6 kg)에 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 pH 6.1로 조절한 다음, 121℃에서 20분 동안 살균하였다. 1000L의 배지(배지 B: 글루코오스 모노하이드레이트 112 kg)를 140℃에서 40초 동안 살균한 다음 상기 배지 A에 첨가하여, 별도의 배지 C를 제조하였다. 배지 C의 pH를 측정하였더니 pH 6.1이었다. 그 다음, 종자 배양(제2단계)액을 배지 C에 접종하고, 초기 배양액의 총량이 5600 L가 되도록 부피를 조정하였다(배양조 부피: 10 kL). 온도 26℃, 통기량 49N㎥/시간 및 내압 200 kPa의 조건에서 배양을 개시하였다.
배양조의 형상으로는 6날 터빈이 2단으로 장치되어 있고, 배양조 내경(= D)에 대한 교반 날개 직경(= d)의 비율 d/D = 0.34인 것을 사용하였다. 배양 중의 기포 발생을 소포 센서(antifoaming sensor)로 감지하고, 대두유가 자동으로 첨가되도록 하여, 기포 발생에 의하여 배양액이 배양조로부터 배출되는 것을 방지하였다. 표 9에 제시된 것과 같이 배지를 공급하면서 본 배양을 288 시간 동안 실시하였다. 배양 종료 시에, 배양액의 양은 배지에 공급되는 액량의 증가분 및 용액의 증발에 기인하는 액량의 감소분의 영향으로 7600L가 되었다.
조건 (7-2)에서는 배지 A에 황산을 비무균적으로 첨가하여 pH 4.5로 조절하고, 배지 C에 수산화나트륨 수용액을 무균적으로 첨가하여 pH 6.1로 조절하고, d/D = 0.3인 배양조를 사용한 것을 제외하고는, 조건 (7-1)에서와 동일한 방법으로 본 배양을 실시하였다. 조건 (7-3)에서는 d/D = 0.30인 배양조를 사용한 것 이외에는 조건 (7-1)에서와 동일한 방법으로 배양하였다, 조건 (7-4)에서는 d/D = 0.25인 배양조를 사용한 것 이외에는 조건 (7-1)에서와 동일한 방법으로 배양하였다, 배양 종료 시에 배양액 1 리터당 생산된 디호모-γ-리놀렌산의 농도는 조건 (7-1) 및 조건 (7-2) 양쪽 모두에서 12.3 g/L이었고, 조건 (7-3)에서는 11.0 g/L, 조건 (7-4)에서는 10.0 g/L이었다.
실시예 7의 공급 배지
본 배양 시간 공급 배지
19시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 280 kg/460 L
43시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 280 kg/450 L
67시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 280 kg/450 L
120시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 336 kg/530 L
배양 종료 후에, 배양액을 120℃에서 20분 동안 살균하였다. 그 다음, 습윤 균체를 연속식 탈수기로 회수하였다. 회수된 습윤 균체를 진동 유동층 건조기로 수분 함량이 1 중량%로 될 때까지 건조하였다. 건조 균체를 공기 운송기를 사용하여 충전 장소로 운송하고, 부피 약 1㎥의 알루미늄 파우치 용기 백에 질소 기체와 함께 충전하였다. 용기 백의 입구 부분을 가열 밀봉하고, 10℃ 이하의 냉장실에 보관하였다.
건조 균체를 용기 백에서 꺼내어 헥산으로 추출하였다. 여과하여 헥산 용액으로부터 고형분을 제거하였다. 그 다음, 여액을 감압하에서 가열하여 헥산을 제거하여 디호모-γ-리놀렌산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유를 얻었다. 조유를 분석하고, 그 결과를 표 10에 제시하였다. d/D = 0.34인 배양조에서는 조유의 에스테르형 스테롤 함량이 1% 이하이었다. d/D = 0.3인 배양조에서는 조건 (7-3)에서와 같이 통상의 방법에 따라 pH를 조절한 경우, 에스테르형 스테롤 함량이 높은 조유가 얻어졌다. 조건 (7-2)에서와 같이 배지 질소 공급원을 pH 4.5에서 살균한 경우, 에스테르형 스테롤 함량이 1% 이하로 저하되었다. d/D = 0.25인 배양조에서는 에스테르형 스테롤 함량이 1%를 초과하였다.
Figure 112014060284302-pat00005
실시예 8 디호모 -γ-리놀렌산의 생산: 대두 분말 1.5% 농도 조건에서의 배양
모르티에렐라 알피나(Moltierella alpina) (SAM 1860)를 사용하여, 실시예 7에서와 동일한 방법으로 종자 배양을 수행하였다. 그 다음, 4500L의 배지(배지 A: 대두 분말 84 kg, KH2PO4 16.8 kg, MgCl2·6H2O 2.8 kg, CaCl2·2H2O 2.8 kg, 대두유 5.6 kg)를 121℃에서 20분 동안 살균하였다. 1000L의 배지(배지 B: 글루코오스 모노하이드레이트 112 kg)를 140℃에서 40초 동안 살균한 다음 상기 배지 A에 첨가하여 별도의 배지 C를 제조하였다. 배지 C를 pH 6.1로 조절한 다음, 종자 배양액을 배지 C에 접종하고, 초기 배양액의 총량이 5600 L가 되도록 부피를 조정하였다(배양조 부피: 10 kL).
*온도 26℃, 통기량 49N㎥/시간 및 내압 200 kPa에서 배양을 개시하였다. 배양조의 형상으로는 배양조 내경(=D))에 대한 교반 날개 직경(= d)의 비율 d/D = 0.34인 6날 터빈을 2단으로 장치한 배양조와, d/D = 0.25인 터빈을 2단으로 장치한 배양조를 사용하였다. 배양 중의 기포 발생을 소포 센서(antifoaming sensor)로 감지하고, 대두유가 자동으로 첨가되도록 하여 기포 발생에 의하여 배양액이 배양조로부터 배출되는 것을 방지하였다. 표 11에 제시된 것과 같이 배지를 공급하면서 162 시간 동안 본 배양을 실시하였다. 배양 종료 시에, 배양액 1 리터당 생산되는 디호모-γ-리놀렌산의 농도는 d/D = 0.34인 배양조에서 4.8 g/L, d/D = 0.25인 배양조에서 4.7 g/L이었다.
실시예 8의 공급 배지
본 배양 시간 공급 배지
19시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 84 kg/200 L
43시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 84 kg/200 L
67시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 84 kg/120 L
91시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 84 kg/125 L
배양 종료 후에, 실시예 7에서와 동일한 방법으로 건조 균체를 회수하고, 헥산으로 추출하여 디호모-γ-리놀렌산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유를 얻었다. 조유를 분석하여 그 분석값을 표 12에 제시하였다.
실시예 8의 결과 (디호모-
Figure 112014060284302-pat00006
-리놀렌산 함유 조유에 대한 분석값)
배양조 형상, d/D 0.25 0.34
각 분획의 중량 %
트리글리세라이드
불비누화 물질
에스테르형 스테롤
93.5%
1.2%
0.4%
93.0%
1.2%
0.4%
조유내 전체 지방산 중 디호모-
Figure 112014060284302-pat00007
-리놀레산, %		 40.5% 41.3%
실시예 9 미드산의 생산: d/D = 0. 5, 배지 중의 대두 분말 농도 4%
본 발명자들은 ω9계 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 포함하는 유지(트리글리세라이드)의 제조 방법을 확립하였다. 상기 유지는 ω9계 고도 불포화 지방산 생산 능력이 있는 미생물, 예를 들면, 변이 균주 모르티에렐라 알피나(Moltierella alpina) (SAM 1861) (FERM P-3590)를 특개평 5-91888호에 기술된 방법에 배양하는 것에 의하여 생산될 수 있다.
또한 본 발명자들은 미드산을 구성 지방산으로서 포함하는 유지(트리글리세라이드)의 제조 방법을 확립하였다. 상기 유지는 특개평 10-57085에 기술된 방법에 따라 아라키돈산 생산 능력이 있는 미생물을 변이 처리하여 제조할 수 있다. Δ12 불포화화 효소를 저하 또는 제거시키고, Δ5 불포화화 활성, Δ6 불포화화 활성 및/또는 사슬 연장 활성 중의 어느 하나를 향상시킨 변이 균주, 예를 들면, 모르티에렐라 알피나(Moltierella alpina) (SAM 2086) (FERM P-15766)를 배양하는 것에 의하여 제조할 수 있다.
모르티에렐라 알피나(Moltierella alpina)를 미드산 생산 균주로 사용하였다. 모르티에렐라 알피나(Moltierella alpina) 표준 균주를 2000 mL 삼각 플라스크에 담긴 500 mL의 배지(1% 효모 추출물, 2% 글루코오스, pH 6.3)에 접종하였다. 100 rpm, 온도 28℃에서 왕복 진탕 조건으로 종자 배양(제1단계)을 개시하여, 3 일 동안 배양하였다. 그 다음, 30L의 배지(1% 효모 추출물, 2% 글루코오스, 0.1% 올리브유, pH 6.3)를 50 L 부피의 통기 교반 배양조에 제조하였다. 종자 배양(제1단계)액을 배지에 접종하였다. 교반 속도 300 rpm, 온도 28℃ 및 내압 200 kPa의 배양조에서 종자 배양(제2단계)을 개시하여, 2일 동안 배양하였다. 그 다음, 3200L의 배지(배지 A: 대두 분말 160 kg, 올리브유 4 kg)을 121℃에서 20분 동안 살균하였다.
700L의 배지(배지 B: 글루코오스 모노하이드레이트 80 kg)를 140℃에서 90초 동안 살균한 다음, 상기 배지 A에 첨가하여 별도의 배지 C를 제조하였다. 배지 C를 pH 6.1로 조절한 다음, 종자 배양(제2단계)액을 배지 C에 접종하고, 초기 배양액의 총량이 4000 L가 되도록 부피를 조정하였다(배양조 부피: 10 kL). 온도 24℃, 통기량 49N㎥/시간, 내압 200 kPa 및 교반 소요 동력 2 kw에서 본 배양을 개시하였다. 배양 4일 째에 온도를 20℃로 변화시켰다. 배양조의 형상으로는 배양조 내경(=D)에 대한 교반 날개 직경(= d)의 비율 d/D = 0.5인 6날 터빈을 2단으로 장치한 배양조를 사용하였다 표 13에 제시된 것과 같이 배지를 공급하면서 456 시간 동안 본 배양을 실시하였다. 배양 종료 시에, 배양액 1 리터당 미드산의 농도는 10.1 g/L이었다.
실시예 9의 공급 배지
본 배양 시간 공급 배지
19시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 160 kg/280 L
43시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 160 kg/280 L
67시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 120 kg/210 L
91시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 120 kg/210 L
144시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 80 kg/140 L
배양 종료 후에, 120℃에서 20분 동안 배양액을 살균하였다. 그 다음, 습윤 균체를 연속식 탈수기로 회수하였다. 회수된 습윤 균체를 진동 유동층 건조기에서 수분 함량이 1 중량%로 될 때까지 건조하였다. 건조 균체를 공기 운송기를 사용하여, 충전형 용기 백에 질소 기체와 함께 충전하였다. 용기 백의 입구 부분을 가열 밀봉하고, 10℃ 이하의 냉장실에 보관하였다.
건조 균체를 용기에서 꺼내어 헥산으로 추출하였다. 여과하여 헥산 용액으로부터 고형분을 제거하였다. 그 다음, 여액을 감압하에서 가열하여 헥산을 제거하여 미드산 함유 조유를 얻었다. 조유를 분석하여 그 결과를 표 14에 제시하였다.
실시예 10 미드산의 생산, d/D = 0.25. 배지 중의 대두 분말 농도 = 4%
종자 배양을 실시예 9에서와 동일한 방법으로 실시하였다. 배양조의 형상으로 d/D = 0.25인 6날 터빈을 2단으로 장치한 배양조를 사용한 것 이외에는, 실시예 9에서와 동일한 조건에서 본 배양을 실시하였다. 그 결과, 배양 종료 시에, 배양액 1 리터당 생산되는 미드산의 농도는 8.0 g/L이었다. 배양 종료 후에, 실시예 9에서와 동일한 방법으로 조작하여, 미드산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유를 얻었다. 미드산 함유 조유를 분석하여, 그 분석값을 표 14에 제시하였다.
미드산 함유 조유에 대한 분석값
실시예 또는 대조예 실시예 9 실시예 10
(대조예)
배양조 형상, d/D 0.5 0.25
각 분획의 중량 %
트리글리세라이드
불비누화 물질
에스테르형 스테롤
94.6%
1.8%
0.6%
93.0%
2.8%
1.2%
조유내 전체 지방산 중 미드산, % 35.0% 30.6%
실시예 11 미드산의 생산, 대두 분말 농도 = 1.5%인 조건에서의 배양
모르티에렐라 알피나( Moltierella alpina) (SAM 2086)를 사용하여, 실시예 9에서와 동일한 방법으로 종자 배양을 실시하였다. 그 다음, 3200L의 배지(배지 A: 대두 분말 60 kg, 올리브유 4 kg)를 121℃에서 20분 동안 살균하였다. 700L의 배지(배지 B: 글루코오스 모노하이드레이트 80 kg)를 140℃에서 90초 동안 살균하고, 상기 배지 A에 첨가하여 별도의 배지 C를 제조하였다. 배지 C를 pH 6.1로 조절하고, 종자 배양액을 배지 C에 접종한 다음, 초기 배양액의 총량이 4000 L가 되도록 부피를 조정하였다(배양조 부피: 10 kL). 온도 24℃, 통기량 49N㎥/시간, 내압 200 kPa 및 교반 소요 동력 2 kW에서 본 배양을 개시하였다. 배양 4일 째에 온도를 20℃로 변화시켰다. 배양조의 형상으로는 배양조 내경(=D)에 대한 교반 날개 직경(= d)의 비율 d/D = 0.34인 6날 터빈을 2단으로 장치한 배양조 및 d/D = 0.25인 6날 터빈을 2단으로 장치한 배양조를 사용하였다. 표 15에 제시된 것과 같이 배지를 공급하면서 300 시간 동안 본 배양을 실시하였다. 배양 종료 시에, 배양액 1 리터당 미드산의 농도는 d/D = 0.34인 배양조에서 3.9 g/L, d/D = 0.25인 배양조에서 3.8 g/L이었다.
실시예 11의 공급 배지
본 배양 시간 공급 배지
19시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 60 kg/120 L
43시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 60 kg/120 L
67시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 40 kg/80 L
91시간 후 글루코오스 모노하이드레이트 40 kg/80 L
배양 종료 후에, 실시예 9에서와 동일한 방법으로 건조 균체를 회수하고, 헥산으로 추출하여 미드산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유를 얻었다. 조유를 분석하여, 분석값을 표 16에 제시하였다.
실시예 11의 결과 (미드산 함유 조유에 대한 분석값)
배양조 형상, d/D 0.25 0.34
각 분획의 중량 %
트리글리세라이드
불비누화 물질
에스테르형 스테롤
95.0%
1.3%
0.5%
95.1%
1.3%
0.5%
조유내 전체 지방산 중 미드산, % 34.5% 34.2%
실시예 12 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 아라키돈산을 구성 지방산으로 하는 정제 유지( 트리글리세라이드 ) 배합 캡슐의 제조
젤라틴 100 중량부와 식용 글리세린 35 중량부에 물을 첨가하고, 혼합물을 50 내지 60℃에서 가열 용해하여 젤라틴 피막을 제조하였다. 그 다음, 실시예 5에서 제조한 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 정제 유지 5-A(트리글리세라이드)에 비타민 E 오일 0.05%를 혼합하여 캡슐의 내용물로 사용하였다. 캡슐당 180 mg의 내용물을 함유하는 연질 캡슐을 통상의 방법에 따라 제조하여 건조시켰다. 실시예 5에서 제조한 정제 유지 5-B를 원료로 사용하여, 정제 유지 5-A를 사용하여 캡슐을 제조하는 것과 동일한 방법으로, 연질 캡슐을 제조하였다.
실시예 13 지방 주입( transfusion ) 제제에의 사용
실시예 5에서 제조한, 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 정제 유지 5-A(트리글리세라이드) 400 g, 정제 난황 레시틴 48 g, 올레산 20 g, 글리세린 100 g 및 0.1 N 가성 소다 40 ml를 가하고, 균질화기에서 분산시켰다. 그 다음, 주사용 증류수를 상기 분산액에 첨가하여 분산액의 부피를 4 리터로 만든 다음, 고압 분무식 유화기로 유화하여 액체 에멀젼을 제조하였다. 액체 에멀젼을 200 ml씩 플라스틱 백에 나누어 담고, 121℃에서 20분 동안 고압 증기 멸균 처리하여 지방 주입 제제를 제조하였다. 또한, 실시예 5에서 제조한 정제 유지 5-B를 원료로 사용하여, 정제 유지 5-A를 사용하여 지방 주입 제제를 제조하는 것과 동일한 방법으로 지방 주입 제제를 제조하였다.
실시예 14 주스에 대한 사용
β-시클로덱스트린 2 g을 20% 에탄올 수용액 20 ml에 첨가하였다. 교반 수단으로 교반하면서, 실시예 5에서 제조한, 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 정제 유지 5-A(트리글리세라이드) (비타민 E 0.05% 배합) 100 mg을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 2 시간 동안 숙성(incubation)시켰다. 실온에서 (약 1 시간) 냉각시킨 다음, 교반을 계속하면서 혼합물을 10 시간 동안 더 숙성시켰다.
생성된 침전을 원심 분리하여 회수하고, n-헥산으로 세정한 다음, 동결 건조하여 아라키돈산 함유 트리글리세라이드를 함유하는 시클로덱스트린 포접 화합물 1.8 g을 얻었다. 이 분말 1 g을 10 L의 주스에 균일하게 혼합하여, 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 정제 유지(트리글리세라이드)를 함유하는 주스를 제조하였다. 실시예 5에서 제조한 정제 유지 5-B를 원료로 사용하여, 정제 유지 5-A를 사용하여 주스를 제조하는 것과 동일한 방법으로 주스를 제조하였다.
실시예 15 분유에 대한 사용
실시예 5에서 제조한, 에스테르형 스테롤 함량이 저감된 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 정제 유지 5-A(트리글리세라이드) 0.3 g을 분유 100 g에 혼합하여 조제 분유를 제조하였다. 또한, 실시예 5에서 제조한 정제 유지 5-B를 원료로 사용하여, 정제 유지 5-A를 사용하여 조제 분유를 제조한 것과 동일한 방법으로 조제 분유를 제조하였다.
실시예 16 다양한 균주를 이용한 배양법
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata) (IFO 8570), 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila) (IFO 5941), 에키노스포라기움 트랜스버살레(Echinosporangium transversale) (NRRL 3116), 코니디오볼루스 나노데스(Conidiobolus nanodes) (CBS 154.56) 및 사프로레그니아 라포니카(Saprolegnia lapponica) (CBS 284.38)를 사용하였다. 이들 아라키돈산 생산균의 표준 균주를 배지(효모 추출물 1%, 글루코오스 2%, pH 6.3)에 접종하고, 왕복 진탕 100 rpm, 온도 28℃의 조건에서 3일 동안 종자 배양을 실시하였다.
그 다음, 25 L의 배지(글루코오스 500 g, 대두 분말 775 g, KH2PO4 50 g, MgCl2·6H20 7.5 g, CaCl2·2H2O 7.5 g 및 대두유 25 g, pH 6.3)을 50 L 부피의 통기 교반 배양조에 제조하였다. 종자 배양액을 배지에 접종하고, 교반 속도 200 rpm, 온도 28℃ 및 배양조 내압 150 kPa의 조건에서 본 배양을 개시하였다. 배양조의 형상으로는 d/D = 0.42인 6날 터빈을 2단으로 장치한 것을 배양조로서 사용하였다. 약 24 시간 간격으로 50% 글루코오스 용액을 첨가하여 글루코오스 농도를 약 1 내지 2%로 되도록 하면서 186 시간 동안 배양하였다.
배양 종료 후에, 배양액을 120℃에서 20분 동안 살균하였다. 습윤 균체를 감압하에서 여과하여 회수하고, 수분 함량이 1 중량%로 될 때까지 건조하였다. 건조 균체를 헥산으로 추출하였다. 여과하여 헥산 용액으로부터 고형분을 제거하였다. 여액을 감압하에서 가열하여 헥산을 제거하여 아라키돈산을 구성 지방산으로서 포함하는 조유를 얻었다. 아라키돈산 함유 조유를 분석하였다. 조유에 대한 분석값을 표 17에 제시하였다.
실시예 16의 결과 (아라키돈산 함유 조유에 대한 분석값
균주 M. elongata
IFO 8570		 M. hygrophila
IFO 5941		 E.transversale
NRRL 3116 		C. nanodes
CBS 154.56		 S. lapponica
CBS 284.38
각 분획의 중량 %
트리글리세라이드
불비누화 물질
에스테르형 스테롤
90.0%
1.9%
0.8%
88.1%
1.9%
0.7%
86.0%
2.0%
0.7%
83.4%
2.0%
0.8%
82.6%
2.0%
0.8%
조유내 전체 지방산 중 아라키돈산, % 30.8% 31.7% 28.6% 26.3% 20.7%

Claims (11)

  1. 질소원 농도 2-15%의 배지에서 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 유지를 생산할 수 있는 미생물로서, 모르티에렐라(Mortierella) 속, 코니디오볼루스(Conidiobolus) 속, 피튬속 (Pythium) 속, 피토프토라(Phytophthora) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 클라도스포리움(Cladosporium) 속, 무코(Mucor) 속, 후사리움(Fusarium) 속, 아스퍼길루스(Aspergillus) 속, 로도토루라(Rhodotorula) 속, 엔토몹토라(Entomophthora) 속, 에키노스포란기움(Echinosporangium) 속 또는 사프로레그니아(Saprolegnia) 속에 속하는 미생물을 배양하고, 균체로부터 고도 불포화 지방산 함유 유지를 채취하는 방법에 있어서, 배양액의 혼합 효율을 높임으로써 배양액 당의 고도 불포화 지방산 생성 농도를 높이고, 또한 조유 중의 에스테르형 스테롤을 저하시킨 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 조유를 제조하는 방법으로서, 상기 배양액의 혼합 효율을 높이는 방법은 교반 날개 지름 (=d)과 교반조 내경 (D)과의 비율을 d/D = 0.30 ~ 0.6으로 하여 교반 날개의 형상을 개량하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 질소원이 pH 5 이하의 조건에서 살균한 질소원을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 기재된 방법에 의해 얻어진 조유를 정제하는 것을 특징으로 하는 정제 유지의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 유지의 조성이 트리글리세리드 70% 이상인 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유지를 구성하는 고도 불포화 지방산은 γ-리놀렌산(18:3 ω6), 디호모-γ-리놀렌산(20:3 ω6), 아라키돈산(20:4 ω6), 7,10,13,16-도코사테트라엔산(22:4 ω6), 4,7,10,13,16-도코사펜타엔산(22:5 ω6), α-리놀렌산(18:3 ω3), 6,9,12,15-옥타데카테트라엔산(18:4 ω3), 8,11,14,17-에이코사테트라엔산(20:4 ω3), 에이코사펜타엔산(20:5 ω3), 7,10,13,16,19-도코사펜타엔산(22:5 ω3), 4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산(22:6 ω3), 6,9-옥타데카디엔산(18:2 ω9), 8,11-에이코사디엔산(20:2 ω9) 또는 5,8,11-에이코사트리엔산(미드산: 20:3 ω9) 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 모르티에렐라 속의 모르티에렐라 아속에 속하는 미생물인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 모르티에렐라 아속에 속하는 미생물은 모르티에렐라 속 알피나 종인 것인 방법.
  8. 제1항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 에스테르형 스테롤 함유량이 0.8 중량% 이하인 것인 조유.
  9. 제8항에 기재된 조유 또는 그 정제 유지를 배합하여 이루어지는 일반 음식물, 기능성 식품, 영양보조식품, 미숙아용 조제유, 성숙아용 조제유, 영유아식품, 임산부용 식품 또는 노인용 식품.
  10. 제8항에 기재된 조유 또는 그 정제 유지를, 경구, 장내 또는 비경구 투여에 사용될 수 있는 중성 담체와 함께 배합한 치료용 영양식품.
  11. 제8항에 기재된 조유 또는 그 정제유지를 배합한, 동물용 사료 또는 양어용 사료.
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