KR101446238B1

KR101446238B1 - 단백질 매트릭스 백신 및 그의 제조방법 및 백신 투여방법

Info

Publication number: KR101446238B1
Application number: KR1020097004799A
Authority: KR
Inventors: 존 제이. 메칼라노스
Original assignee: 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
Priority date: 2006-08-07
Filing date: 2007-08-07
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2027-08-07
Also published as: CA2660022A1; EP2056871B1; MX2009001412A; TW200823230A; US8642042B2; BRPI0715396A2; WO2008021076A3; BRPI0715396B8; US9533032B2; US9216223B2; JP2010500354A; EP2056871A2; BRPI0715396B1; JP2014058530A; US20160136257A1; EP2056871A4; US20140186399A1; US20080095803A1; ES2658851T3; WO2008021076A2

Abstract

본 발명은 수송단백질 및 복합체에 포획된 항원을 포함하는 백신 조성물, 이의 제조 방법 및 상기 백신의 투여방법에 관한 것이다.

접합백신(conjugate antigen), 수송단백질(carrier protein), 항체, 항원, 면역원성

Description

단백질 매트릭스 백신 및 그의 제조방법 및 백신 투여방법{Protein Matrix Vaccines and Methods of Making and Administering Such Vaccines}

본 출원은 2006년 8월 7일자 출원된 미국 가출원 60/835,944, 2007년 6월 8일자 출원된 60/933,764에 대하여 우선권을 주장하며, 이들 출원의 명세서는 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 NIH(National Institutes of Health)에서 허여된 U54AI057159 하에서의 정부 지원으로 이루어진 것이다. 정부는 본 발명에 대하여 권리를 갖는다.

본 발명은 백신 조성물, 백신의 제조방법 및 백신 투여방법에 관한 것이다.

많은 항원들, 특히 병원균의 캡슐 레이어와 연관된 항원들은 면역반응을 거의 또는 전혀 촉진시키지 않음으로써 이러한 항원들에 대한 효과적인 항체 개발은 어려움을 겪었다. 캡슐은 전형적으로 탄수화물, 아미노산 또는 알콜 등의 유기물 중합체로 구성된 미생물의 표면 성분을 말한다. 캡슐은 화학적으로 매우 다양하다. 캡슐을 이루는 단일 유니트(예 : 탄수화물)는 다양한 분자 배열속에서 연결될 수 있고, 인, 질소, 황 및 다른 화학적 변형물들로 치환될 수 있다. 이러한 화학적 다양성으로 인해 캡슐은 미생물 표면의 수많은 항원 타겟을 제공함으로써 이러한 타겟에 대한 숙주의 면역체계를 피해갈 수 있다. 캡슐은 또한 미생물이 숙주의 대식세포(macrophage)나 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leukocyte)의 식균 작용에 의해 죽는 것을 막는 독성 요소일 수도 있다. 캡슐에 대한 항체는 캡슐로 둘러싸인 유기체를 그 표면에 보체를 고정시켜 숙주 면역세포가 라이시스, 옵소닌 작용, 흡수, 식세포작용을 하게 함으로써 강력한 방어를 한다. 캡슐에 대한 가장 강력한 항체는 Ig G 항체이다. 유효 수준의 Ig G 를 유도하지 못하는 캡슐을 T-비의존성 항원(T-independent antigen)이라 한다. 단백질과 캡슐간의 공유결합이 이들 항원을 T-비의존성으로 만들며, 이러한 항원은 Ig G의 반응을 이끌어낼 수 있다.

따라서 Ig G의 강력한 면역반응을 유도하지 않는 캡슐이나 다른 T-비의존성 항원에 대한 안전하고 합성이 쉬우며 저렴한 백신에 대한 요구가 절실하다. 이러한 백신은 탄저열, 폐렴쌍구균, B형 독감, 수막염 및 연쇄구균과 같은 다양한 감염성 질병에 대한 보호를 위해 필요하다.

본 발명은 수송단백질에 포획된 항원을 포함하는 백신 조성물, 상기 백신의 제조방법 및 백신의 투여방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 항원과 수송단백질을 포함하는 백신조성물을 제공한다. 상기 백신조성물은 (i) 50 % 이하의 항원만이 수송단백질과 크로스링크되며, (ii) 항원은 수송단백질에 포획되어 복합체를 이룬다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 복합체는 10 nm 내지 100 μm 사이의 직경을 가진다. 본 발명의 보다 바람직한 구현P에 따르면, 상기 복합체는 100 nm 내지 100 μm 사이의 직경을 가진다. 본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면, 상기 복합체는 10 nm 내지 10 μm 사이의 직경을 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 복합체는 포유류에 투여되었을 때 T-세포 의존성 면역반응을 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 항원과 수송단백질의 몰 비율은 1:10 내지 10:1 이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 수송단백질은 멀티머, 예를 들어 최소 5개의 서브유닛을 가지는 구현예에 따르면, 항원과 수송단백질의 몰 비율은 상기 복합체는 10 nm 내지 100 μm 사이의 직경을 가진다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 멀티머는 호모 멀티머이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면 상기 수송단백질은 적어도 한 개 의 다른 수송단백질을과 공유 결합을 한다. 보다 더 바람직하게는 상기 공유결합은 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 또는 글루타민산 측쇄의 카르복실기 사이에서의 펩타이드 결합을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 공유결합은 화학식

를 가지는 물질을 포함하고, Rn은 탄소 1개 내지 12개로 구성된 선형 또는 분쇄형 알킬, 1개 내지 12개의 원자로 구성된 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 2개 내지 12개의 탄소원자로 구성된 선형 또는 분쇄형 알켄, 2개 내지 12개의 탄소원자로 구성된 선형 또는 분쇄형 알킨, 5개 내지 10개의 탄소로 구성된 방향족 잔기, 3개 내지 10개의 원자로 구성된 고리형 잔기, -(CH₂CH₂O)qCH₂CH₂- (q는 1내지 4의 정수), 또는 두 개의 알데히드기를 연결하는 화학결합이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 공유 결합은 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르, 카보디이미드 또는 비스-비아조타이즈드 벤지딘을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 공유결합은 이중작용기성 크로스링커를 포함한다.

보다 바람직하게는 상기 이중작용기성 크로스링커는 글루타르알데히드, 비스[설포닐숙시니미딜]수베레이트 또는 디메틸아디피미데이트이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 비공유 결합으로 링크된 것이다.

보다 바람직하게는 상기 비공유 결합은 소수성 상호작용, 이온 상호작용 반데르발스 상호작용 또는 수소결합을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡신(diphtheria toxin) 또는 그 변이체, 데타누스 톡신(tetanus toxin)또는 그 변이체, 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid) 또는 그 변이체, 녹농균 엑소톡신 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A) 또는 그 변이체, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 테타누스 톡신 C절편, 박테리아 편모, 뉴몰리신(Pneumolysin), 리스테리올리신O (listeriolysin O) 나이세리아 수막염균(Neisseria menningitidi)의 외막단백질, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Hcp1 단백질, 대장균의 내열성 엔테로톡신(enterotoxin), 쉬가 유사 톡신(shiga-like toxin), 인간 LTB 단백질, 전체 박테리아 세포에서 추출한 단백질, 탄저균(Bacillus anthracis)의 방어적 항원에 대한 DNI(dominant negative mutant) 또는 대장균 베타-갈락토시다아제이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 뉴몰리신, 리스테리오신 O, 디프테리아 톡신, 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡신, 또는 테타누스 톡소이드이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항원은 다당류, 폴리알콜 또는 폴리 아미노산이다.

보다 바람직하게는 상기 다당류는 적어도 18개 이상의 잔기를 포함한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면 상기 다당류는 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)의 다당류, 야토균(Francisella tularensis) 다당류, 탄저균(Bacillus anthracis) 다당류, 인플루엔자간균(Haemophilus influenzae) 다당류, (Salmonella typhi) 다당류, 살모넬라 종 다당류, 쉬겔라(Shigella) 다당류 또는 나이세리아 수막염균(Neisseria meningitidis) 다당류이다.

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면 상기 폐렴연쇄상구균의 다당류는 타입 1-48, 예를 들어 캡슐 3, 4, 6B, 7A, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 또는 46 타입이다.

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면 상기 야토균(Francisella tularensis) 다당류는 O 항원이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 항원은 미생물 캡슐 중합체이다.

보다 바람직하게는 상기 미생물 캡슐 단량체는 탄저균(Bacillus anthracis)의 폴리-감마-D-글루타민산이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면 상기 항원은 탄소, 산소, 수소, 질소, 인 및 황산으로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 적어도 3개 이상의 원자를 가지는 단량체들로 구성된 유기 중합체이다.

보다 바람직하게는 상기 유기 중합체는 미생물로부터 유래한 것이다.

보다 바람직하게는 상기 유기 중합체는 자연계에 존재하지 않는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 백신 조성물은 제 2 항원을 추가적으로 포함한다.

보다 바람직하게는 상기 백신 조성물은 제 2 항원을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.

(a) 항원을 수송단백질과 혼합하여 혼합물을 만드는 단계 및;

(b) 상기 항원을 수송 단백질에 포획시키는 단계로써 상기 항원의 50 % 이하가 백신 조성물내에서 수송단백질과 크로스링크되는 것을 특징으로 하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 포획 단계는 상기 항원과 상기 수송단백질을 상기 혼합물로부터 침전시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 침전단계는 상기 혼합물내에서 pH가 변화하거나, 상기 혼합물에 TCA(trichloroacetic acid) 또는 황산암모늄을 첨가하거나, 혼합물 내의 무기염의 농도를 증가시키거나 감소시킴으로써 혼합물의 이온세기를 변화시키거나, 혼합물을 가열함으로써 수송단백질 또는 항원을 응고시키거나, 크로스링크를 유발시키기 위해 혼합물에 충분한 양의 이온화 방사선을 조사하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물 내에서 상기 항원과 상기 수송단백질의 몰 비율은 1:10 내지는 9:10 사이이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 멀티머이다.

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면, 상기 멀티머는 적어도 5개의 서브유닛을 가진다.

보다 바람직하게는 상기 멀티머는 호모 멀티머이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 비공유 결합으로 연결된 것이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 비공유 결합은 소수성 상호작용, 이온 상호작용, 반데르발스 상호작용 또는 수소결합을 포함한다.

보다 바람직하게는 상기 수송단백질은 뉴몰리신, 리스테리오신 O, 디프테리아 톡신, 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡신, 또는 테타누스 톡소이드이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 단계(i)에서의 혼합과정은 제 2 항원 추가적으로, 나아가 제 3 항원을 추가적으로 포함한다.

(b) 상기 수송 단백질과 크로스 링크하는 링커를 첨가하는 단계로써 상기 항원의 50 % 이하가 백신 조성물 내에서 수송단백질과 크로스링크되는 것을 특징으로 하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 백신 조성물 내에서 상기 항원과 상기 수송단백질의 몰 비율은 1:10 에서 9:10 사이이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 수송단백질은 멀티머이다.

보다 바람직하게는, 상기 멀티머는 적어도 5개의 서브유닛을 가진다.

보다 바람직하게는, 상기 멀티머는 호모 멀티머이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 방법은 상기 수송단백질 내에서 쉬프 염기의 환원단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 적어도 1개 이상의 다른 수송단백질과 공유결합 되어있다.

보다 바람직하게는, 상기 공유결합은 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 또는 글루타메이트 측쇄의 카르복실기간의 펩타이드 결합을 포함한다.

보다 바람직하게는, 상기 공유결합은 이중작용기성 크로스링커를 포함한다.

보다 더 바람직하게는제 상기 이중작용기성 크로스링커는 글루타르알데히드, 비스[설포닐숙시니미딜]수베레이트 또는 디메틸아디피미데이트이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 링커는 화학식

를 가지는 물질을 포함하고; R_n은 탄소 1개 내지 12개로 구성된 선형 또는 분쇄형 알킬, 1개 내지 12개의 원자로 구성된 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 2개 내지 12개의 탄소원자로 구성된 선형 또는 분쇄형 알켄, 2개 내지 12개의 탄소원자로 구성된 선형 또는 분쇄형 알킨, 5개 내지 10개의 탄소로 구성된 방향족 잔기, 3개 내지 10개의 원자로 구성된 고리형 잔기, -(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂- (q는 1-4), 또는 두 개의 알데히드기를 연결하는 화학결합이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 링커는 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르, 카보디이미드 또는 비스-비아조타이즈드 벤지딘을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 단계(i)에서의 혼합과정은 제 2 항원 또는 추가적으로 나아가 제 3 항원을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 백신 조성물을 대상체의 항체생산을 유도하기에 충분한 양만큼 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 감염된 시료에 대한 백신화 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 백신화 방법은 백신조성물을 상기 대상체가 항체생산을 부스팅시키기에 충분한 양만큼 제 2 투여를 하는 단계를 포함한다.

보다 바람직하게는 상기 항체의 생산은 T-세포 의존성이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체의 생산은 상기 대상체의 감염성 물질에 의한 감염을 막거나 감소시키기에 충분한 양의 항체의 생산이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 감염물질은 페렴연쇄구균(pneumococcus), B형 인플루엔자간균(Haemophilus influenzae type B), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa),야토균(Francisella tularensis), 시겔라(Shigella)종, 살모넬라 종(Salmonella species), 아시네토박터 종(Acinetobacter species), 버크홀데리아 종 (Burkholderia species) 또는 대장균이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 백신화 방법은 제 2 백신조성물을 상기 대상체가 항체생산을 부스팅시키기에 충분한 양만큼 제 2 투여를 하는 단계를 포함한다.

바람직하게는 상기 항체의 생산은 상기 대상체가 제 2 감염성 물질에 의한 감염을 막거나 감소시키기에 충분한 양의 항체의 생산이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 항체는 면멱글로불린 G 항체이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 대상체는 인간이다.

본 발명의 모든 양태에 대한 바람직한 구현예에 따르면, 폐렴연쇄상구균 다당류는 Kong 등이 서술한 캡슐 타입 중의 하나이다(J. Med. Microbiol. 54:35-356 (2005)). 예를 들면, 폐렴연쇄상구균 다당류는 바람직하게는 타입 1 (예를 들어, 1-g or 1-q), 2 (예를 들어, 2-g, 2-q, 또는 2-41 A), 3 (예를 들어, 3-g, 3-q, 3-c, 또는 3-nz), 4, 5 (예를 들어, 5-q, 5-c, 5-qap, 또는 5-g), 6A (예를 들어, 6A-g, 6A-cl, 6A-c2, 6A-n, 6A-qap, 6A-6B-g, 6A-6B-q, 또는 6A-6B-s), 6B (예를 들어, 6B-c, 6A-6B-g, 6A-6B- q, 또는 6A-6B-s), 7F (예를 들어, 7F-7A), 7A (예를 들어, 7A-cn 또는 7F-7A), 7B (예를 들어, 7B-40), 7C (예를 들어, 7C-19C-24B), 8 (예를 들어, 8-g 또는 8-s), 9A (예를 들어, 9A-9V), 9L, 9N, 9V (예를 들어, 9A-9V), 9V and 14, 1OF (예를 들어, 10F-q, lOF-ca, 또는 lOF-lOC), 1OA (예를 들어, 10A-17A 또는 10A-23F), 1OB (예를 들어, lOB-lOC), HF, l lA (예를 들어, l lA-nz 또는 11A-11D-18F), HB (예를 들어, 1 IB-11C), HC (예를 들어, 1 IB-11C 또는 HC-cn), HD (예를 들어, 11A-11D-18F), 12F (예를 들어, 12F-q 또는 12F-12A-12B), 12A (예를 들어, 12A-cn, 12A-46, 또는 12F-12A-12B), 12B (예를 들어, 12F-12A-12B), 13 (예를 들어, 13-20), 14(예를 들어, 14-g, 14-q, 14-v, 또는 14-c), 15F (예를 들어, 15F-cnl 또는 15F-cn2), 15A (예를 들어, 15A-cal, 15A-ca2, 또는 l5A-chw), 15B (예를 들어, 15B-C, 15B-15C, 15B-15C-22F-22A), 15C (예를 들어, 15C- ca, 15C-ql, 15C-q2, 15C-q3, 15C-S, 15B-15C, 또는 15B-15C-22F-22A), 16F (예를 들어, 16F-q 또는 16F-nz), 16A, 17F (예를 들어, 17F-n and 17F-35B-35C-42), 17A (예를 들어, 17A-ca 또는 10A-17A), 18F (예를 들어, 18F-ca, 18F-W, 또는 1 IA-I ID- 18F), 18A (예를 들어, 18A-nz 또는 18A-q), 18B (예를 들어, 18B-18C), 18C (예를 들어, 18B-18C), 19F (예를 들어, 19F-gl, 19F-g2, 19F-g3, 19F-q, 19F-n, 또는 19F-C), 19A (예를 들어, 19A-g, 19A-, 또는 19A-ca), 19B, 19C (예를 들어, 19C-cnl, 19C-cn2, 또는 7C- 19C-24B), 20 (예를 들어, 13-20), 21 (예를 들어, 21-ca 또는 21-cn), 22F (예를 들어, 15B-15C-22F-22A), 23F (예를 들어, 23F-C, 10A-23F, 또는 23F-23A), 23B (예를 들어, 23B-C 또는 23B-q), 24F (예를 들어, 24F-cnl, 24F- cn2, 또는 24F-cn3), 24A, 24B (예를 들어, 7C-19C-24B), 25F (예를 들어, 25F-38), 25A, 27, 28F (예를 들어, 28F-28A 또는 28F-cn), 28A (예를 들어, 28F-28A), 29 (예를 들어, 29-ca 또는 29-q), 31, 32F (예를 들어, 32F- 32A), 32A (예를 들어, 32A-cn 또는 32F-32A), 33F (예를 들어, 33F-g, 33F-q, 33F-chw, 33F-33B, 또는 33F-33A-35A), 33A (예를 들어, 33F-33A-35A), 33B (예를 들어, 33B-q, 33B-s, 또는 33F-33B), 33D, 34 (예를 들어, 34-ca 또는 34s), 35F (예를 들어, 35F-47F), 35A (예를 들어, 33F-33A-35A), 35B (예를 들어, 17F- 35B-35C-42), 36, 37 (예를 들어, 37-g 또는 37-ca), 38 (예를 들어, 25F-38), 39 (예를 들어, 39-cnl 또는 39-cn2), 40 (예를 들어, 7B-40), 41F (예를 들어, 41F-cn 또는 41F-s), 41A (예를 들어, 2-41A), 42 (예를 들어, 17B-35B-35C- 42), 43, 44, 45, 46 (예를 들어, 46-s 또는 12A-46), 47F (예를 들어, 35F-47F), 47 A, 48 (예를 들어, 48-cnl 또는 48-cn2), 또는 Genebank 접근번호 AF532714 또는 AF532715이다.

본 명세서에서 "투여(administering)"는 대상체에 면역반응을 유발시키는데 충분한 양의 백신을 제공하는 것을 말하며, 면역반응이란 백신에 포함된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 것을 말한다. 투여는 바람직하게는 적합한 면역 보조제와 함께 근육내 주사, 피내 주사, 경피성 주사를 포함하고, 바람직하게는적합한 면역 보조제의 투여도 포함한다. 투여는 백신의 단일 투여 또는 다중투여를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 대상체에서 항체의 부스팅을 유발하여 감염성 물질에 의한 감염을 막기 위해 2차 투여가 계획된다.

백신 투여의 빈도 및 양은 백신의 고유의 활성에 의해 좌우되며, 관례적인 실험에 의해 쉽게 결정된다.

본 명세서에서 "크로스링크(cross-link)"는 두개의 분자, 고분자, 분자들의 조합 간의 공유결합의 형성을 의미한다. 예를 들어 각각 1개 또는 2개의 다른 분자와 공유결합을 형성할 수 있는 작용기가 동일 분자 내에 2개가 존재하는 수송단백질- "zero-length" 링커를 사용하여 직접 결합하거나, 제3의 분자, 즉 화학적 링커를 사용하는- (이는 중합체 주위를 감싸는 루프(loop)를 형성할 수 있다). 예시적인 링커는 두 개의 수송단백질을 크로스링크 시킬 수 있는 이중작용기성 링커가 포함된다. 크로스링킹은 항원과 수송단백질 사이에서 일어날 수도 있다.

본 명세서에서 "항원(antigen)"은 항체나 항체 절편에 의해 특이적으로 결합되는 여하한 분자 또는 분자들의 조합을 말한다.

본 명세서에서 "이중작용기성 링커(bifunctional linker)" 는 각각 분리된 두 분자, 원자, 분자들의 집합 간의 공유결합을 형성할 수 있는 작용기를 2개 가진 물질을 말한다. 예시적인 이중작용기성 링커는 G. T. Hermanson (Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996)와 Dick 과 Beurret (Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol. Immunol. Karger, Basal 10:48-114 (1989))에 의해 기술되었다. 바람직하게는 이중작용기성 링커는 그루타르알데히드, 비스[설포숙시니미딜]수베레이트 (bis[sulfosuccinimidyl]suberate) 또는 디메틸 아디피미데이트(dimethyl adipimidate)이다.

본 명세서에서 "링커(linker)"는 두 개 이상의 분자들을 공유 결합시키는 화합물 또는 화학결합을 말한다. 바람직하게는 링커는 글루타르알데히드 또는 화학식

의 화합물로서, 상기 화학식에서 R_n은 탄소수 1 내지 12의 선형 또는 분쇄형 알킬, 1 내지 12개 원자의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2 내지 12의 선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2 내지 12의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5 내지 10의 방향족 잔기, 3 내지 10개의 원자의 고리형 시스템, -(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂-, 상기 q는 1 내지 4 또는 두 개의 알데히드기를 연결하는 화학결합이다. 링킹은 링킹 분자 없이 직접적으로 일어날 수 있다. 예를 들면, 단백질의 카르복시기는 카보디이미드를 화학적으로 또는 상기한 종류의 크로스링크를 촉진시키는 트랜스글루타미다제 (transglutamidase)를 이용하여 효소적으로 아미노기와 직접 링크될 수 있다.

본 명세서에서 "항체 생성의 부스팅(boost the production of antibodies)"은 항원에 대한 이차 노출 동안에 나타나는 메모리 B-세포의 활성화를 말하며, 이는 “부스터 반응”이라 불리고, 장기간 “이차” 메모리 면역반응의 지표가 되며 항체의 장기간 생성을 초래한다.

본 명세서에서 "수송단백질(carrier protein)" 은 자기 자신에 대해 또는 수송단백질과 복합체를 이루는 항원에 대한 면역반응을 유발하는 백신에 사용되는 단백질을 말한다. 바람직하게는, 상기 항원은 복합체 내에서 포획되어 수송단백질과 비공유 결합을 이룬다. 그러나, 항원과 수송단백질은 서로 공유결합 할 수도 있다. 바람직하게는, 수송단백질은 T-세포가 인식하는 에피토프를 포함한다. 수송단백질에는 분쇄형 펩타이드인 다중 항원성 펩타이드 [multi-antigepeptide (MAP)]가 포함된다. 바람직하게는 MAP는 라이신을 포함한다. 예시적인 바람직한 수송단백질은 디프테리아 톡신(diphtheria toxin) 또는 그 변이체, 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid), 데타누스 톡신(tetanus toxin) 또는 그 변이체, 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid), 녹농균 엑소톡신 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A) 또는 그 변이체, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 테타누스 톡신 절편 C, 박테리아 편모, 뉴몰리신(Pneumolysin), 나이세리아 수막염균(Neisseria menningitidi)의 외막단백질, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Hcp1 단백질, 대장균의 이열성 엔테로톡신(enterotoxin), 쉬가-유사 톡신(shiga-like toxin), 인간 LTB 단백질, 리스테리올리신 O (또는 관련 단백질), 총박테리아 세포의 단백질 추출물, 탄저균(Bacillus anthracis)의 방어항원에 대한 DNI(dominant negative mutant) 또는 대장균 베타-갈락토시다아제 또는 링커에 의해 크로스링크 될 수 있는 그 밖의 모든 단백질이다.

본 명세서에서 "DNl"는 Benson 등이 서술한 탄저균의 방어항원의 변이형태인 DNI(dominant negative mutant)단백질을 말한다(Biochemistry 37:3941-3948 (1998)).

본 명세서에서 "포획된(entrapped)"은 항원에 있어 항원이 수송단백질과의 복합체 내에서 생리적인 상태로 머물러 있음을 말한다. 바람직하게는 항원은 수송단백질과의 중요한 공유결합 없이 복합체 내에 포획된다. 여기서 중요한 공유결합이 없다함은 50 % 이하의 항원만이 수송단백질에 공유결합함을 말한다. 바람직하게는 40 %, 30 %, 10 %, 또는 5 % 이하의 항원이 수송단백질에 공유결합한다.

본 명세서에서 "감염(infection)"은 미생물이 대상체에 침투하는 것을 말한다. 미생물의 예로는 박테리아, 곰팡이, 기생충 또는 바이러스가 있다. 감염은 예를 들어, 대상체의 몸 내부 또는 표면에 일반적으로 존재하는 미생물이 과도한 증식을 하거나, 대상체의 몸 내부 또는 표면에 일반적으로 존재하지 않는 미생물이 증식하는 것을 말한다. 대상체는 몸 내부 또는 표면의 미생물이 과도하게 증식하거나, 미생물의 존재가 세포를 손상시키거나 대상체의 조직에 병리학적 증상을 일으킬 경우 고통을 받는다.

본 명세서에서 "감염성 물질(infectious agent)"은 감염을 일으키는 미생물을 말한다.

본 명세서에서 "면역원(immunogenic)"이란 대상체에서 면역반응을 유도하는 물질을 말한다. 바람직하게는, 면역반응은 IgG 항체의 생산을 포함하는 T-세포 의존성 면역반응이다.

본 명세서에서 "미생물(microbe)"은 박테리아, 곰팡이, 기생충 또는 대상체의 감염을 유발할 수 있는 바이러스를 말한다.

본 명세서에서 "미생물 캡슐 중합체(microbial capsular polymer)"는 미생물의 캡슐 코팅에 존재하는 중합체를 말한다. 바람직하게는, 미생물 캡슐 중합체는 다당류, 인다당류(phosphopolysaccharide), N-아세틸 치환된 아미노 슈가를 가진 다당류, 설펀화 슈가(sulfanylated sugar)를 가진 다당류, 그밖의 황산-변성(sulfate-modified)슈가, 인산-변성(phosphate-modified)슈가, 폴리 알콜, 폴리 아미노산, 테이콘산 및 지질다당류(lipopolysaccharide)의 O 측쇄이다.

본 명세서에서 "단량체(monomer)"는 동종 단량체들과 2개 또는 그 이상의 결합을 형성하여 반복적인 단량체 구조들의 사슬이나 여러개의 분쇄로써 중합체의 일부를 형성할 수 있는 분자구조를 말한다.

본 명세서에서 "유기중합체(organic polymer)"는 단량체들이 공유결합한 구조로 구성된 중합체로서, 각각의 단량체들이 3개 이상의 탄소, 산소, 수소, 인산, 질소 및 황산 원자 중 3개 이상의 원자를 가진다. 바람직스럽게는, 유기 중합체는 다당류, 인다당류(phosphopolysaccharide), N-아세틸 치환된 아미노 슈가를 가진 다당류, 설펀화 슈가(sulfanylated sugar)를 가진 다당류, 그밖의 황산-변성(sulfate-modified)슈가, 인산-변성(phosphate-modified)슈가, 폴리 알콜, 폴리 아미노산, 테이톤산, 및 지질다당류의 O 측쇄이다.

본 명세서에서 "폴리알콜(polyalcohol)"은 카보닐기가 1차 또는 2차 하이드록시기로 환원된 탄수화물의 수소화 형태를 말한다. 예시적인 폴리알콜은 폴리알킬렌 글리콜(PAG)과 같은 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)로서 폴리메틸렌 글리콜(PMG), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌글리콜이 이에 속하고, 폴리비닐알콜 (PVA); 폴리에틸렌-코-말레산 무수물; 폴리스티렌-코-말레산무수물; 카복시메틸-덱스트란을 포함하는 덱스트란; 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸세룰로오스, 카복시에틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필셀룰로오스를 포함하는 셀룰로스; 치토산의 (chitosan)의 가수분해산물; 하이드로에틸-스타치 및 하이드록시 프로필- 스타치 같은 전분; 글리코겐; 아가로스 및 그 유도체; 구아 검(guar gum); 풀루란(pullulan); 이눌린; 잔탄 검(xanthan gum); 카라지난(carrageenan); 펙틴; 알진산 가수분해물; 소르비톨(sorbitol); 글루코스, 만노오스, 갈락토스, 아라비노스, 글루코스, 자일로스, 쓰레오스(threose), 소르보스(sorbose), 프럭토스, 글리세롤, 말토스셀로비오스(maltose cellobiose), 수크로스, 아밀로스, 아밀로펙틴의 알콜; 또는 모노프로필렌글리콜(MPG).

본 명세서의 "폴리아미노산(poly amino acid)"는 최소 2개의 아미노산들이 펩타이드 결합으로 연결된 것을 말한다. 바람직하게는, 폴리아미노산은 아미노산 시퀀스의 반복 또는 동일한 아미노산의 사슬(예; 호모 중합체)을 포함하는 펩타이드이다.

본 명세서에서 "쉬프 염기의 환원(reducing a Schiff base)"은 아조메틴(azomethine) 또는 화학식 R₁R₂C=N-R₃의 화합물(R_1,R₂및R₃는 전형적으로 탄소를 포함하는 화학구조이다)을 쉬프 염기의 이중결합을 수소원자로 포화시키는 환원제에 노출시키는 것을 말한다. 환원 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 명세서에서 항체 또는 항체의 절편에 "특이적으로 결합(specifically binds)"한다 함은 항체 또는 항체의 절편이 특정단백질, 예를 들어 항원,에 대해 동량의 다른 단백질에 대해서보다 증가된 친화력을 가짐을 말한다. 바람직하게는, 항체 또는 항체의 절편은 그들의 항원에 대해 연관된 항원들을 포함하여 동량의 다른 항원에 대해서보다 2배, 5배, 10배, 30배 또는 100배의 친화력을 가지며, 이는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)분석을 이용하여 결정되었다.

본 명세서에서 "대상체(subject)"라 함은 미생물에 의해 감염될 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 대상체는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 랫트,소, 양, 염소 또는 말일 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 대상체는 인간 어린이와 같은 인간이다. 바람직하게는 대상체는 인간 갓난아기, 유아 또는 사춘기 이전의 어린이이다.

본 명세서에서 "T세포-비의존성 항원(T-cell independent antigen)"은 T 림프구의 도움 없이 항체를 생산하는 항원을 말한다. 바람직하게는 T세포-비의존성 항원은 T 림프구의 도움 없이 B 림프구를 직접 자극한다. 예시적인 T세포-비의존성 항원은 바람직하게는 캡슐 항원 폴리-감마-D-글루타민산(PGA), 알진산(algenate), 덱스트란, 다당류(PS), 폴리아미노산, 폴리알콜, 및 핵산을 포함한다.

발명의 이점

본 발명은 종래의 백신 기술에 비해 제조가 더 간단하고, 화학적 문제가 적고, 면역학적 문제가 적으며, 더 저렴하며, 다양한 항원 및 수송단백질에 대한 적응성이 접합 기술에 비해 더 뛰어나며, 다가 항원의 생성을 위한 유연성이 더 뛰어난 백신을 제공한다.

본 발명의 백신은 면역반응을 유발시키는 항원과 수송단백질 사이에 공유 결합을 필요로 하지 않으므로 접합 백신 기술에 비해 백신의 제조 방법이 단순하고 비용이 절감된다. 다당류-단백질 접합 백신은 생산단가가 매우 높아 선진국에서만 판매되어 왔다; 종래의 접합 백신은 각각의 백신에 요구되는 특화된 화학구조와 다당류 및 단백질의 생산 및 순화를 위한 비용으로 인해 낮은 가격으로 생산하기가 어려웠다.

또한, 본 발명의 백신은 종전에 다루기 어려운 항원에 대한 면역반응을 안전하게 유도한다. 이러한 백신은 모노밸런트(면역반응을 유도하는 단일의 항원을 가짐) 혹은 멀티밸런트(다중의 면역반응을 유도하는 다중의 항원을 가짐)일 수 있다. 다루기 어려운 항원에 대한 면역반응을 유도하는 것으로 알려진 TLR(Toll-like receptor) 리간드를 가지는 백신은 안전하지 못한바, 그 이유는 본 발명의 백신과 비교하여 TLR 리간드가 종종 친염증성이고, 소량에 의해서도 독성을 나타내며, 반응성이 크며, 부작용을 유발하는 경향이 있기 때문이다.

본 발명의 다른 특성 및 이점은 이하의 발명의 상세한 설명과 도면, 청구항을 통해 명확해진다.

본 발명은 백신 조성물, 그 제조방법 및 T-세포 비의존성 항원 또는 약한 면역반응을 유발하는 다당류, 폴리알콜, 폴리아미노산 및 다른 유기 중합체들과 같은 항원에 대한 면역을 제공하는 상기 백신의 투여방법에 관한 것이다. 본 발명의 백신은 종래의 다당류-단백질 접합 백신의 유효한 면역학적 특성을 가지지만 접합백신과 비교하여 바람직한 차이점이 있다. 즉, 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 항원과 수송단백질을 연결함에 있어 중요한 원자공유결합을 필요로 하지 않는다. 대신 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 항원은 수송단백질에 포획된다. 예를 들어, 단백질 매트릭스는 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 용해성 항원의 존재 하에서 수송단백질 분자와 공유 크로스링크를 함으로서 형성될 수 있다 : 이들 백신은 단백질 매트릭스 백신으로 불린다. 수송단백질은 서로 매우 잘 크로스링크되어 항원을 포획하고 항원의 수용을 촉진하며 면역세포에서의 항체생산을 유발할 수 있는 매트릭스를 형성할 수 있다. 수송단백질 매트릭스는 항원을 에워싸는 "망사(mesh)" 형태 또는 항원이 "실(string)"이고 단백질 또는 크로스링크된 단백질 복합체가 "구슬(bead)"인 "실 위의 구슬(beads on a string)"형태일 수 있다. 수송단백질이 상기 항원을 둘러싸 링을 형성하거나 3차원적 망사를 형성하여 그안에 항원이 빠져들게되면서 항원이 수송단백질에 포획된다. 또한, 수송단백질과 항원은 크로스링크될 수 있다. 예를 들어, 항원사슬과 수송단백질의 사슬 내 크로스링크(intra-chain cross-links)가 이루어진다. 바람직한 구현예에 따르면, 항원과 수송단백질은 비공유결합을 한다. 이러한 비공유 결합은 소수성 상호작용, 이온성 상호작용, 반데르 발스 상호작용 또는 수소결합을 포함할 수 있다. 비공유결합은 항원과 단백질 복합체가 비공유적으로 결합된 물리적인 기하구조일 수 있다(상기 "실 위의 구슬형태(bead on a string" analogy above)참조).

수송단백질은 항원을 포획하기 위해 스스로와 크로스링크될 필요는 없다. 항원은, 예를 들어, 수송단백질과 항원을 액체용제에서 혼합한 뒤 수송단백질을 침전시켜, 결과적으로 항원과 단백질을 동반침전시킴으로서 포획될 수 있다. 항원은 항원과 수송단백질의 혼합물로부터의 화합물(예를 들어 알부민, 소듐 헥사메타포스페이트, 폴리포스파젠 또는 그 밖의 소수성 또는 이온성 상호작용에 의해 유발된 단백질에 대한 친화력을 가지는 중합체)을 침전시켜 수송단백질에 포획시킬 수 있다. 단백질을 침전시키는 방법은 공지된 기술이며, 예를 들어 다음의 단계를 포함한다; (1) 혼합물의 pH를 변화시키는 단계; (2) 혼합물의 이온염의 농도를 증가 또는 감소시킴으로써 용액의 이온세기를 변화시키는 단계; (3) 또는 TCA(trichloroacetic acid) 또는 황산암모늄을 용액에 첨가하는 단계; (4) 혼합물을 가열하여 단백질을 응고시킴으로써 침전 또는 젤 등을 형성하는 단계; (5) 혼합물 내의 단백질을 화학적으로 변형시켜 불용성으로 만드는 단계; 및 (6) 단백질 용액을 이온화 방사선(자외선, 감마선 또는 베타선)으로 충분히 조사하여 단백질을 크로스링크시키거나 침전시키는 단계.

병원균의 캡슐 단백질이 사용되면, 이러한 백신은 PCMV(protein capsular matrix vaccines)라 불린다. 실시예에서 기재한 것처럼, PCMV는 T-세포 비의존성 캡슐 항원, PGA(poly-gamma-D-glutamic acid), 알진산(algenate), 덱스트란 및 예시적인 수송단백질인 DNI에 기초한 백신들을 포함하여 생산된다. PGA PCMV는 대량생산이 간단하고 종래의 전형적인 PGA-단백질 접합백신의 면역반응을 유발한다는것이 밝혀졌다. 본 발명의 백신은 항원의 존재 하에서 모든 가능한 수송단백질을 크로스링크시키는 모든 가능한 링커를 사용함으로써 제조될 수 있다. 선호되는 예시적 링커, 수송단백질 및 항원에 대해 서술한다.

다당류(PS)는 당류(saccharide)의 중합체이다. 캡슐로부터 유래된 다당류는 나이세리아 수막염균, 폐렴연쇄상구균, 살모넬라 티피, 인플루엔자간균 B와 같은 캡슐화 된 박테리아 병원균에 대한 방어면역에 포함된 1차 항원성 물질이다. 미생물 다당류에 기초한 백신을 이용한 청년과 성인에 대한 면역접종은 질병치료에 효과적이었으나, 유아나 어린 아이들(예를 들어 24개월 미만의 어린이)에게 방어면역을 제공하는 데에는 덜 효과적임이 입증되었다. 어린 아이들은 성숙하고 적응력있는 면역 창고를 발달시키지 못하고, 이러한 어린 백신 피투여자에서의 캡슐 다당류 같은 T-세포 비의존성 항원은 면역원성이 떨어지고 장기적 방어면역 반응(예를 들어 면역학적 기억 반응)을 유발하지 못한다. 다당류같은 T-세포 비의존성 항원은 다당류와 단백질간의 화학적 결합에 의해 T-세포 의존성 항원으로 전환될 수 있다. 이러한 과정은 "접합(conjugation)"이라 불리며, 다당류 구조내의 원자와 수송단백질내의 아미노산 측쇄 원자와의 공유결합 형성단계를 포함한다. 이러한 접합백신은 B-세포의 성숙 및 항체생산의 양을 증가시키는 아이소타입(isotype) 스위치를 더 효율적으로 촉진한다. 방어항체는 그들의 다당류 항원에 대해 높은 친화력을 보이며, 전형적으로 상보적 고정활성 및 옵소닌화 이펙터(opsonic effector) 활성을 가지는 면역글로불린 G(IgG)의 서브클래스이다. 예로서, 다당류와 수송단백질 테타누스 톡소이드와의 접합에 의한 항-다당류 IgG 면역반응의 유도의 비제한적인 과정을 도 1에 나타내었다. 이 모델에서, 다당류를 인식하는 항체 수용체를 가지는 B-세포만이 다당류-단백질 접합체와 결합한다. 따라서, 수송단백질은 올바른 다당류 결합 특이성을 가진 B-세포 표면에 결합한다. 단백질-다당류 복합체는 이러한 B-세포에 의해 세포내 액포(vacuolar)구획으로 가져가진 후 단백질 분해과정(proteolytic degradation)에 의해 수송이 행해진다. 수송단백질에서 유래된 펩타이드는 운반되고 MHC-Ⅱ(MHC-Class Ⅱ receptor)의 제시 그루브(presentation groove)에 로딩된다. 이 MHC-Ⅱ-수송 펩타이드 복합체는 B-세포 표면에 놓여진다. T-세포 수용체(TCR)가 MHC-Ⅱ-펩타이드 복합체를 인식하는 즉시, T-세포는 활성화되어 B-세포의 분화를 돕는 사이토카인을 분비한다. B-세포는 많은 숫자로 증가하고 항체를 분비하는 플라즈마 세포로 분화한다. Ig M은 처음에 플라즈마 세포에 의해 생산되지만 나중엔 플라즈마 세포가 클래스 스위치를 하여 Ig G와 같은 다른 아이소타입 클래스의 항체를 생산하도록 T-세포가 돕는다. 이러한 과정은 플라즈마 세포가 변이를 일으킴으로써 다당류-단백질 접합체에 대한 더 높은 친화력을 가지는 항체 수용체의 생산을 유도하면서 진행된다. 항원이 제거되면서, 더 높은 친화력의 플라즈마 세포만이 남겨진 다당류-단백질 접합체에 의해 활성화된다. T-세포에 의한 플라즈마 세포의 성숙과정은 계속되어 플라즈마 세포의 숫자는 증가하고 Ig G 클래스의 항체에 높은 친화력을 가지게 된다. 플라즈마 세포의 숫자의 증가는 면역접종된 인간 등의 대상체 혈청 내의 항-다당류 Ig G 항체의 숫자를 측정함으로써 쉽게 탐지할 수 있다.

결국 성숙 및 스위치 과정은 다당류에 특이적이며 수명이 긴 메모리 B-세포의 생산을 가져온다. 메모리 B-세포는 다당류에 노출되었을 때 즉시 활성화되는 독특한 특성이 있다. 활성화로 인해 메모리 B-세포는 항-다당류 Ig G를 다중적이고 빠르게 생산한다. 다당류 항원에 대한 2차 노출에서 야기되는 메모리 B-세포의 활성화는 "부스터 반응(booster response)"라고 불리며, 장기 2차 기억 면역반응의 척도가 된다. 1차 면역접종은 Ig M 항체 및 약간의 Ig G 항체의 생산을 촉진시킬 수 있다. 2차 면역접종과 동시에, 메모리 세포는 이미 1차 접종에서 프로그램되었으므로 대량의 Ig G를 생산하는 기억 면역 반응을 유도한다.

T-세포 비의존성 항원은 대계 Ig G항체의 생산과 같은 지속적인 면역반응을 촉진시키진 않지만, 덜 강력하고 더 일시적인 Ig M 항체의 생산을 촉진한다. 다당류 항원 단독으론 Ig G의 부스터 반응을 유발시키지 못하며, 다당류-단백질 접합체로 1차 면역접종이 되어 메모리 세포들이 Ig G를 생산하도록 유도된 경우에만 부스터 반응을 일으킨다. 백신접종된 동물이나 인간에서의 부스터 반응은 다당류를 가지는 미생물에 노출된 경우의 방어반응을 모방한 것이라 여겨진다. 이런 장기기억은 백신이 면역접종된 대상체에서 수년 후 작용하는데 있어 중요하다. 따라서, 다당류-단백질 접합체는 (1) 다당류 항원에 대한 Ig G항체를 다량 유도하는 능력 및 (2) 다당류 항원에 대한 기억 면역반응을 유도하는 능력으로 인해 가치가 있다. 다당류 항원은 전형적으로 이러한 특성을 보이지 않으며 따라서 열등한 항원이다. 접합 백신의 합성의 어려움 및 그 생산비용으로 인해 많은 박테리아 질병에 대한 접합백신의 발전은 더뎠다. 다른 T-세포 비의존성 항원들은 폴리-감마-D-글루타민산(PGA)같은 아미노산의 호모중합체 또는 폴리알콜을 포함한다. 대부분의 생물학적 중합체는 T-세포 비의존성 항원이다. 중합체는 B-세포의 Ig 수용체와 크로스링크 할 수 있으며, 중합체의 반복적인 화학구조로 인해 B-세포가 이들을 인식한다(따라서 에피토프가 된다). 중합체들은 다당류처럼 B-세포를 활성화하여 항-중합체 Ig M을 생산하도록 할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 호모중합체인 탄저균의 PGA는 면역원성이 떨어지는 캡슐 폴리머이자 T-세포 비의존성 항원이다. 수송단백질과 접합된 PGA로 구성된 백신은 면역원성이 매우 높고, 항-PGA Ig G 및 PGA에 대한 면역학적 기억를 유도할 수 있다. 그러므로, 대부분의 중합체들은 MHC-Ⅱ 에 포함되어 반응이 진행되지 않고 T-세포의 도움도 받을 수 없기 때문에 면역원성의 측면에 있어서 다당류처럼 반응한다. 자연계에서 TRL(Toll-like receptor)이라고 불리는 새로운 클래스의 수용체와 반응하는 몇몇 예외적인 중합체가 있다. 일단 활성화되면, TLR은 숙주세포에서의 사이토카인 생산을 유도하고 적합한 면역 반응의 변화를 만들어낸다. 몇몇 다당류는 TLR 리간드에 공유결합되어있거나 이러한 리간드들에 의해 오염되어있다. 예를 들어, LPS(lipopolysaccharide)는 매우 면역원성이 강하며 Ig G와 기억반응을 유도한다; LPS의 지방부분 A(lipid A moiety)는 TLR 리간드이며 면역학적 특성의 원인부일 수 있다.

또 다른 예를 들면, 몇몇 폐렴구균(pneumococcal)의 다당류는 수송단백질과 결합하지 않고도 Ig G로의 아이소토프 스위치를 유발한다는 점에서 접합백신의 면역학적 특성을 가짐이 밝혀졌다. 최근에, 폐렴연쇄상구균의 개개의 다당류 뿐 아니라 상업적 다당류 백신인 Pneumovax-23도 TLR 리간드에 의해 오염된다는 사실이 밝혀졌다.(Sen et al. J. Immunol. 175:3084-3091(2005)). 이 발견은 왜 이러한 다당류 시료가 단백질과의 접합 없이도 Ig G로의 스위치를 유도하는지를 설명해준다. 이 폐렴상구균 다당류는 대식세포에 의한 IL-6 및 TNF-α의 분비를 유도한다. 그러나, 다당류를 페놀추출법으로 더 순화시키면 사이토카인의 분비가 일어나지 않는다. 페놀이 추출된 다당류는 면역원성이 낮고 더 이상 항-다당류 Ig G를 유도하지 않는다. 따라서, 페놀 추출은 다당류의 이런 비정상적인 면역원성의 원인인 오염분자를 제거한다. 오염분자는 대식세포에서 TLR-의존성 사이토카인 반응을 활성화하는 능력을 가진 TLR 리간드인 것으로 보인다. 다당류를 페놀추출에 의해 좀 더 순화하면 TLR 리간드를 제거하고 다당류가 완전한 T-세포 비의존성이 되도록 한다.

이상의 예시는 다당류 항원이 단백질과 탄수화물 간 공유결합 없이도 다당류-단백질 접합항원처럼 행동한다는 사실을 말해준다. 불행하게도, TLR 리간드는 대계 인화성이다. 예를 들면, LPS는 소량으로도 독성을 갖는다. 따라서, TLR 리간드를 다당류와 혼합하면 다당류에 대한 면역반응이 확장될 수 있으며, 이러한 접근은 반응성이 있고 부작용을 유발하는 백신을 생성하는 경향이 있다. 접합 백신 기술은 면역원성과 안정성에서 바람직한 다당류 백신을 생산하는 방법에 있어 여전히 하나의 선택으로 남아있다.

다당류-단백질 접합백신의 발달은 박테리아 병원균에 의한 소아 질병을 크게 감소시켰다. 인플루엔자간균 B, 수막염구균 및 스트렙토코커스에 대한 백신을 포함한 이러한 소량의 백신은 선진국에서 상업적으로 구입가능하다. 이러한 다당류-단백질 접합 백신은 개발도상국에서는 생산과 판매가 매우 고가에서 이루어진다. 예를 들어, 상업적으로 구입 가능한 7가-폐렴상구균 접합백신은 1hl 복용량당 약 58불 (2006 U.S. dollars)이며 4회 복용을 요한다. 가격만으로도 이들 백신은 개발도상국에서 접하기가 어렵다. 종래의 접합 백신은 저가로 생상하기가 어려운데, 이는 다당류와 단백질 모두에 대한 생산 및 순화과정이 포함되기 때문이다. 대개 두 물질 모두 접합 반응 이전에 합리적 접합 효율성을 가지기 위해 높은 순도를 가질 것을 요한다. 전형적으로, 접합반응은 선택된 다당류와 수송단백질의 화학구조에 특이적인 다양한 다당류에 대해 진행되어야 한다. 이러한 결합 반응은 전형적으로 라이신 잔기의 입실론(epsilon)아미노 측쇄를 통해 수송단백질과의 결합을 형성할 수 있는 다당류의 작용기가 도입된다. 이러한 커플링 그룹을 도입하기 위한 다당류의 화학적 변형은 다당류의 에피토프를 파괴할 수 있고, 새로운 에피토프(예를 들면 링커나 변형된 당류 그룹과 결합된)가 도입되는데, 그 중요성은 신중한 면역학적 분석을 통해서만 평가될 수 있다. 더 나아가, 종래의 다당류-단백질 접합백신에 있어 다당류의 크기, 수송단백질 분자당 다당류의 숫자, 선택된 수송단백질의 특성 및 결합 구조의 타입은 모두 접합백신의 면역원성에 영향을 주었다. 이를테면 90개 이상의 알려진 혈청형 각각이 다른 PS 구조를 가지는 폐렴구균병(Bentley et al. PLOS Genetics 31:262-269(2006))의 경우에, 하나의 단일 접합 방법으로는 모든 혈청형에 대응할 수 없다. 재현성 있는 면역적 특성을 갖는 접합 백신의 재현성 있는 합성을 위해서는, 다당류의 크기, 수송단백질 분자 당 다당류의 숫자 및 선택된 수송단백질의 특성 및 결합 구조의 타입을 신중히 조절하여야 하며, 이로 인해 접합백신의 생산 비용이 크게 증가한다. 항생물질에 대한 저항성이 나타남으로서 안전하고 효율적인 백신의 개발이 시급해졌다. 특히 개발도상국에 있어서 범용성있는 백신을 생산하는 데는 비용의 효율성도 요구된다. 1개 또는 그 이상의 박테리아 종에서 유래한 다양한 항원성의 많은 다당류 항원에 대해 접합백신의 합동 작용은 소아기의 면역화에 있어 백신투여를 단순화 할 것이다. 그러나, 현재의 접합백신 기술은 비용면에서 효율적이지 않아 합동 접합백신(ombination conjugate vaccines)을 개발도상국에 공급하는 것은 불가능하다. 안정된 시장이 구축된 개발도상국가에서도 복잡한 접합백신 기술을 필요로 하는 Wyeth의 7가 접합 폐렴구균 백신의 공급 상황은 접합백신 기술을 요하는 백신의 생산 및 비축이 얼마나 어려운지를 보여준다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백신은 1개 또는 그 이상의 박테리아 캡슐 물질이 다가 수송단백질에 포획된 다가 캡슐 매트릭스 백신(PCMV)이다. PCMV는 캡슐과 같은 적당한 순도의 항원을 출발물질로서 필요로 하기 때문에 쉽게 생산할 수 있다. 예를 들어, Vedan의 폴리-감마-D-글루타민산(PGA)은 언급한 바와 같이 순도가 낮다(이것은 DNI에서 활성을 가지는 프로테아제를 운반한다). 이것은 T-세포 비의존성 항원에게서 기대되는 똑같은 작용을 한다(실시예 1). PGA를 PCMV에 결합시키는 것은 단백질 대 PGA의 비율이 7배 범위에서 차이가 나는 세가지 PCMV시료들 모두에 있어서 성공적이었다.

본 발명의 백신을 만드는 방법에 있어 캡슐 다당류 등의 항원에 대한 어떠한 화학적 지식도 요하지 않기 때문에 상기 방법은 항원과 수송단백질의 화학구조에 적합한 크로스링크 화학의 개발에 대한 필요가 중요하지 않다. 어떤 항원들이 링커와 반응할 수 있으나, 이는 백신의 효율성을 떨어뜨리지 않는다. 이는 항원과 수송단백질의 의도하지 않은 크로스링크도 면역원성을 가지기 때문이다. 본 발명의 백신에서 항원과 수송단백질의 크로스링크는 백신의 효율성을 위해 요구되는 사항이 아니다. 이는 생산과 개발이 어려웠던 종래의 접합백신과의 중요한차이점이다. 본 발명의 백신은 바람직하게는 적어도 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 또는 심지어 100 % 의 크로스링크된 수송단백질을 가지며, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 또는 90 % 이하의 항원이 수소단백질과 크로스링크된다. 바람직하게는 10 % 이하의 항원이 수송단백질에 크로스링크되고, 최소 50 %의 수송단백질이 크로스링크된다.

여기서 서술된 백신의 제조방법은 캡슐 중합체와 같은 항원의 과도한 변형을 가져오지 않는다. 일반적으로 항원은 가능한 변형, 예컨대 중합체 사슬의 말단에서 환원당을 포함하는 PS 캡슐의 환원당의 환원과 같은 변형을 가짐면서 동일한 상태로 남는다. 이러한 소수의 변형은 대부분의 캡슐 다당류의 면역원성에 영향을 미치지 못하는데, 이는 말단의 슈가는 중합체 내부에서보다 100-1000배 더 숫자가 적기 때문이다. 반대로, 종래의 접합백신에 있어 캡슐 중합체 등의 항원 내에 수송단백질과의 공유적 유착을 위한 링커 그룹을 도입하는 것이 필수적이었다. 카르복시기나 아미노기 같은 반응성 있는 작용기가 없는 캡슐 중합체 등의 항원에 있어 링커가 필요했다. 예를 들어, 다당류에 링커를 도입하면 캡슐 에피토프가 파괴되고 숙주 자신의 에피토프와의 알려지지 않은 면역학적 교차 반응성으로 인해 바람직스럽지 않은 새로운 에피토프가 생성된다.

여기서 서술한 백신의 제조방법은 접합백신 기술보다 간단한데, 이는 상기 방법의 화학적 특성이 수송단백질(예를 들어 DNI, 콜레라 톡신B 서브유닛, 디프테리아 톡신, 테타누스 톡신 C절편 또는 대장균 베타-갈락토시다제)의 크로스링크 화학구조에만 좌우되기 때문이다. 예를 들어, 캡슐 중합체가 DNI와 혼합된 경우 크로스링크 비율에 영향을 미치지만, 크로스링크의 패턴 및 범위는 사용되는 단백질, 그 농도 및 글루타르알데히드 등의 크로스링크 시약의 농도에 더 영향을 받을 뿐 캡슐 중합체의 영향을 받지 않는다. 이러한 변수는 쉽게 조정되므로, 백신을 만드는 시간, 노력 및 비용이 절감될 수 있다.

여기서 서술한 PCMV 백신의 제조방법은 어떠한 캡슐 중합체, 아미노기가 포함된 중합체등의 어떤 항원에도 적용될 수 있으며. 보로화 수소의 환원에 의해 파괴될 수 있는 중요한 에피토프를 가지지 않는 수송단백질 등의 어떤 수송단백질에도 적용될 수 있다. 본 방법에서 사용되는 수송단백질은 바람직하게는 적어도 2개의 라이신 잔기 또는 블록되지 않고 화학적 변형에 의하여 크로스링크를 할 수 있는 다른 잔기를 가진다. 테타누스 톡소이드는 가능한 수송단백질의 하나이다. 이 독소는 단백질의 아미노기와 반응하는 포름알데히드에 의해 해독된다. 다른 바람직한 수송단백질에는 코레라 톡신 B 서브유닛(SBL Vaccin AB에서 구입가능), 디프테리아 톡신, 테타누스 톡신 C절편 (Sigma Aldrich에서 구입가능), DNI 또는 대장균의 베타-갈락토시다제(Sigma Aldrich에서 구입 가능)이 있다.

현재 다가(multivalent) 접합백신은 각각의 접합백신을 만든 후, 이들을 혼합하여 "칵테일(cocktail)" 접합백신을 형성함으로써 제조된다(예를 들어 Wyeth 7가 폐렴구균 백신, Prevnar). 본 발명에서의 백신 제조방법은 수송단백질과 크로스링크되기 전에 화학적으로 다른 백신들(예를 들어 캡슐 유기 중합체)을 혼합함으로써 또는 개별적으로 합성된 본 발명의 특이적 백신을 혼합함으로써 다가 백신을 만드는 데에 사용될 수 있다. 이러한 유연성은 현재의 다가 백신 제조법에 비해 중요한 이점을 제공한다. 본 발명의 실시예에서 논의된 예시적인 백신인 PCMV 백신 #1-3은 이들 백신이 PGA 분자와 DNI 단백질을 이루는 원자들간 공유결합을 형성하지 않을 것으로 예상되었음에도 접합백신처럼 작용했다. 글루타르알데히드는 라이신 잔기의 입실론 아미노기를 가지는 단백질의 아미노 측쇄와 주로 잘 반응한다. PGA 중합체는 자유로운 아미노기를 가지지 않고, 글루타르알데히드와 반응하지 않는 카르복실 측쇄만을 가지고 있다. 따라서, PCMV에 의해 유발된 접합-유사 면역반응은 긴 PGA 분자가 DNI 단백질 분자의 크로스링크된 매트릭스 내에서 분자적으로 포획되어 있음을 말해준다.

무제한 모델에 의하면, 포획은 DNI 단백질과 PGA를 B-세포내로 운반하기 위해 일어나며, B-세포는 PGA를 면역학적으로 인식하는 Ig 수용체를 경유하여 이러한 매트릭스에 결합한다. B-세포들이 수용되면, 매트릭스는 종래의 접합백신에서와 비슷한 방법으로 분해되며 이로써 MHC-Ⅱ 분자에 나타나는 DNI-유래 펩타이드가 된다. 이후 T-세포의 도움으로 B-세포는 확장하고 Ig G를 생산하는 플라즈마 세포 및 PGA 특이적 기억 세포가 된다. 따라서, 무제한 모델에 의하면 PCMV는 단백질-접합 캡슐 백신과 면역학적으로 유사하게 작용하지만 PCMV는 수송단백질과 캡슐 중합체간의 공유결합이 없다는 점에서 차이가 난다.

PCMV를 포함한 본 발명의 백신들은 소아 백신등에서 조합으로서 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 백신은 폐렴상구균 감염, 스트렙토코커스(A 및 B그룹)감염, 인플루엔자간균 B("HiB") 감염, 수막염균(예를 들어 나이세리아 수막염균) 감염 및 그람 네거티브 박테리아(예를 들어 녹농균, 야토균) (Thirumalapura et al. J. Med. Microbiol. 54:693-695 (2005); Vinogradov and Perry, Carbohydr. Res.339:1643-1648 (2004); Vinogradov et al. Carbohydr. Res. 214:289-297 (1991)), 쉬겔라 종, 살모넬라 종, 아시네토박터 종, 버크홀데리아 종 및 대장균에 대한 백신으로 사용될 수 있다.

본 발명의 백신을 생산하는 데 있어 하나 또는 그 이상의 항원(예를 들어 여기서 언급한 항원)의 존재하에서 수송단백질(예를 들어 여기서 언급한 단백질)을 크로스링크시키기 위해 어떠한 링커(예를 들어 여기서 언급한 링커)도 사용할 수 있다. 만약 하나의 항원이 사용된다면, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 1가라고 불린다. 만약 1개가 넘는 항원이 사용된다면, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 다가라고 불린다. 만약 미생물 캡슐 중합체가 항원이라면, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 단백질 캡슐 매트릭스 백신(PCMV)이라고 불린다.

링커

크로스링킹 수송단백질은 당업계에 잘 알려져 있고 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드에스테르(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), 카보디이미드 및 비스-비아조타이즈드 벤지딘을 포함한다.

수송단백질에의 직접 크로스링크하는 일반적 방법 및 반응 부분은 호모 이중작용기 또는 헤테로 이중작용기 링커를 이용하는 방법이 기술된다. (G. T. Hermanson. Bioconjugate Techniques, (1996)); Dick and Beurret. Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol. Immunol. 10:48-114 (1989)). 예를 들어, 수송단백질에 라이신이 많으면 이론적으로 크로스링커의 카르복실기와 반응할 수 있는n+1개의 1차 아민(말단 아민을 포함하여)이 있다. 따라서, 이러한 직접적인 접합과정을 이용하면 생성물은 n+1개의 아미드 결합을 가지는 것으로 제한된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서 채택한 링커는 두 개의 단백질을 연결하는 결합이다. 링커는 두 개의 수송단백질 (A) 및 (B)와 공유결합하는 부속기가 있는 선형, 고리형 또는 분쇄형 분자 골격을 가질 수 있다. 어떤 수송단백질도 1개 가 넘는 수송단백질과 결합할 수 있으며, 이에 의해 수송단백질들이 교차결합된 매트릭스가 만들어져 항원이 여기에 포획될 수 있다. 결합기란 작용기(A) 또는 (B)를 가지는 링커(L)의 반응 부위의 조합으로 만들어진 공유 결합을 말한다. 링커 그룹은 에스터, 카바메이트, 사이오에스터(thioester), 이민, 다이설파이드, 아마이드, 에테르, 사이오에테르(thioether), 설폰아미드, 아이소우레아, 이미도에스터, 아미딘, 포스포아미데이트(phosphoramidate), 포스포다이에스터 및 하이드라존을 제한없이 포함한다.

(A)와 (B)의 링크는 공유적 수단에 의해 이뤄지는데, 여기엔 (A) 및 (B)에 위치한 1개 또는 그 이상의 작용기와의 결합(결합기)형성을 포함한다.

이러한 목적을 위한 화학적 반응성을 가지는 작용기의 예는 많은 수송단백질에 포함된 자연계의 아미노산에 존재하는 아미노, 하이드록시, 설피드릴 (sulfhydryl), 카복시, 카보닐, 사이오에테르, 구아니딜, 이미다졸 및 페놀기를 제한없이 포함한다.

(A)와 (B)간의 공유결합은 이들 내의 작용기와 반응할 수 있는 부분을 가진 (L)링커를 사용함으로써 효율적일 수 있다. 반응의 생성물은 (L)과 (A)를 그리고 (L)과 (B)를 연결하는 새로운 결합을 포함하는 결합기이다. 예를 들어, (A)의 하이드록시기는 (L)이나 그 활성화 된 유도체의 카복시기와 반응하여(아래 참조) 에스터 결합기를 형성할 수 있다.

설피드릴기와의 반응을 할 수 있는 부분의 예에는 XCH₂CO-(X=Br, Cl, or I)타입의 α-할로아세틸(α-haloacetyl)이 있으며, 이는 설피드릴기와 특별한 반응성을 보이지만, 이미다졸, 사이오에테르, 페놀 및 아미노기와도 반응한다.(Gurd, Methods Enzymol. 11:532 (1967). N-말레이미드(N-Maleimide) 유도체도 설피드릴기에 대해 선택성이 있는 것으로 생각되지만, 특정 조건하에서 아미노기들을 결합시키는데 더 유용할 수 있다. 2-이미노사이올란(2-iminothiolane)같은 시약은 아미노기를 변형하여 사이오기(thiol group)를 도입하는데, 다이설파이드 브릿지(disulphide bridge)를 형성하면서 크로스링크가 일어난다면 이는 설피드릴기로 간주될 수 있다.

아미노기와 반응할 수 있는 반응성 있는 부분의 예로는, 알킬화 및 아실화 시약이 있다. 대표적인 알킬화 시약은 다음과 같다:

(i)α-할로아세틸(α-haloacetyl)로서, 이는 반응성있는 사이올기가 없을 때 아미노기에 대한 특이성을 보이며, XCH₂CO-(X=Br, Cl, or I) 타입이다(Wong. Biochemistry 24:5337 (1979));

(ii) N-말레이미드 (N-maleimide derivative) 유도체로서, 이는 마이클 반응(Michael type reaction) 또는 고이구조에 카보닐기를 첨가하는 아실화 반응을 톨해 아미노기와 반응할 수 있다(Smyth et al. Chem. Soc. 82:4600 (1960): Biochem. J. 91:589 (1964));

(iii) 반응성 있는 니트로할로아로마틱 (nitrohaloaromatic)화합물과 같은 아릴 할라이드;

(iv) 알칼할라이드 (McKenzie et al. J. Protein Chem. 7:581 1988);

(v) 아미노기와 함께 쉬프(Schiff)염기를 형성할 수 있는 알데히드 및 케톤으로서, 이들 아미노기는 환원을 통해 안정된 아민을 형성한다;

(vi)에피크로로하이드린(epichlorohydrin) 및 비속시란(bisoxirane)과 같은 에폭사이드(epoxide) 유도체로서, 이들은 아마노기, 설피드릴기, 페놀릭하이드록시기와 반응할 수 있다;

(vii) s-트리아진(s-triazines)의 염소 함유 유도체로서, 이들은 아미노, 설피드릴, 하이드록시기와 같은 친핵체에 대해 매우 반응성이 크다;

(viii) 상기의 s-트리아진에 기초한 아지리딘(aziridines)으로서 (Ross. J. Adv. Cancer Res. 2: 1 (1954)), 이는 아미노기와 같은 친핵체와 고리열림을 통한 반응성이 크다;

(ix) 스권린산 디에틸 에스터(squaric acid diethyl ester) (Tietze. Chem. Ber.124:1215 (1991)); 및

(x) α-할로알킬 에테르(α-haloalkyl ether)로서, 이들은 활성화가 에테르의 산소원자에 의해 일어나므로, 더 반응성이 높은 알킬화 시약이다(Benneche et al. Eur. J. Med. Chem. 28:463 (1993)).

아미노기와 잘 반응하는 아실화 시약으로는 다음의 것이 있다.

(i) 이소사이아네이트(isocyanates) 및 이소티오사이아네이트(isothiocyanates) 중 특히 방향성 유도체로서, 이들은 각각 안정된 우레아(urea) 및 사이오우레아(thiourea) 유도체를 형성한다;

(ii) 설포닐 클로라이드(sulfonyl chloride)( Herzig et al. Biopolymers 2:349 (1964));

(iii) 아실할라이드;

(iv) 니트로페닐에스터(nitrophenylester) or N-하이드록시숙시니미딜 에스터(N-hydroxysuccinimidyl ester)와 같은 반응성 있는 에스터;

(v) 혼합되거나, 대칭형이거나, N-카복시언하이드라이드(N-carboxyanhydrides)인 무수물산(acid anhydride);

(vi) 그 밖에 아마이드 결합의 형성에 유용한 시약 (M.Bodansky. Principles of Peptide Synthesis, Springer- Verlag (1984));

(vii) 아실아자이드(acylazide)로서, 아자이드기는 소듐니트라이트를 이용하여 만들어진 하이드라자이드(hydrazide) 유도체로부터 합성된다(Wetz et al. Anal. Biochem. 58:347 (1974)); 및

(viii) 이미도에스터로서, 이는 아미노 그룹과 반응하여 안정된 아미딘을 형성한다 (Hunter and Ludwig J. Am. Chem. Soc. 84:3491 (1962)).

글루타르알데히드와 같은 알데히드 및 케톤은 아민과 반응하여 쉬프 염기를 만들 수 있으며, 이는 환원적 아민화 반응을 통해 안정화될 수 있다. 알콕시아미노기(Alkoxylamino) 부분은 케톤 및 알데히드와 쉽게 반응하여 안정한 알콕사민(alkoxamine)을 생성한다(Webb et al. Bioconjugate Chem. 1 :96 (1990)).

카복시기와 반응할 수 있는 반응성 있는 부분은 디아조아세테이트에스터(diazoacetate ester) 및 디아조아세트아마이드(diazoacetamides)와 같은 디아조 화합물을 포함하며. 이들은 높은 특이성으로 반응하여 에스터르 생성한다 (Herriot Adv. Protein Chem. 3:169 (1947)). O-아실우레아(O-acylurea)형성을 통해 반응하여 아마이드 결합을 형성하는 카보디이미드같은 카복시산 변환시약도 쓰일 수 있다.

(A)또는 (B)의 작용기는 원하는 바에 따라, 예를 들어 추가적인 반응성과 선택성을 부여하기 위해, 반응 전에 다른 작용기로 변환될 수 있다. 이러한 목적을 위한 예시적인 유용한 방법은 디카복실릭 언하이드라이드(dicarboxylic anhydride)를 이용한 아민의 카복시산으로의 변환; N-아세틸호모시스테인 사이오아세톤(N-acetylhomocysteinethiolactone), S-아세틸머캅토숙시닉언하이드라이드(S-acetylmercaptosuccinic anhydride), 2-이미노사이올란(2-iminothiolane) 또는 사이올-함유 숙시니미딜(thiol-containing succinimidyl)유도체를 이용한 아민의 사이올(thiol)로의 변환; α-할로아세테이트를 이용한 사이올의 카복시산으로의 변환; 에틸렌이민(ethylenimine) 또는 2-브로모에틸라민(2-bromoethylamine)을 이용한 사이올의 아민으로의 변환; 카보디이민(carbodiimide)과 디이민(diamine)을 차례로 이용한 카복시산의 아민으로의 변환; 및 토실 클로라이드를 이용한 뒤 사이오아세테이트로 트랜스에스터화 한 후 소듐아세테이트로 가수분해하여 알콜을 사이올로 변환하는 과정을 포함한다.

소위 말하는 무-길이 링커(zero-length linker)는 추가적인 결합물질 없이 (A)화학기의 반응성 있는 부분과 (B)화학기의 반응성 있는 부분간의 직접적인 공유결합을 포함하며, 본 발명에서처럼 사용될 수 있다. 예로서, (L)은 (A)의 산소원저와 (B)의 카보닐 또는 사이오카보닐 부분간의 화학결합에 해당한다. 예를 들어 아미노기(A)는 카보닐기(B)에 A-L-B(L은 아마이드 결합) 또는 N-R에 결합된 R-C=O(R은 동일하거나 서로 다른 두 개의 단백질 분자 의 아미노산 측쇄에서 유래한 탄소사슬)의 형태가 되는 카보디이미드 구조를 이용하여 결합할 수 있다.

그러나 가장 일반적으로, 링커는 스페이서(spacer)에 의해 연결된 두 개나 그 이상의 반응성 있는 부분을 가지고 있다. 스페이서의 존재는 이중작용기성 링커가 (A) 및 (B)내의 특정 작용기와 반응할 수 있게 하여 두 화합물간 공유결합이 형성될 수 있도록 한다. 링커(L)의 반응성 있는 부분은 같을 수도 있고(호모 이중작용기성 링커), 다를 수도 있어(헤테로 이중작용기성 링커 혹은 여러개의 비유사한 반응부분이 있는 경우 헤테로 다중기능성 링커), (A)와 (B)사이에 공유결합을 유발하는 다양한 가능한 시약을 제공한다.

스페이서 엘리먼트는 전형적으로 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5-10의 방향성 잔기, 탄소수 5-10의 고리계 또는 -(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-(n은 1-4)를 포함한다.

링크 시약에 의해 도입된 외부시약의 특성은 한

링크 시약에 의해 도입된 외부시약의 특성은 약동학적 특성 및 최종의 백신 생산물의 활성을 가져올 수 있다.따라서 생분해가 가능하거나, 화학적으로 민감하거나, 효소의 절단부위에 결합하는 스페이서 암(spacer arm)을 가지는 절단 가능한 링커를 도입하는 것이 바람직하다.

이러한 절단 가능한 링커는 예를 들어 PCT 국제출원 공보 WO92/17436 에 참고문헌과 함께 서술되어 있으며, 생체 내에서 쉽게 생분해된다.몇몇 경우에, 링크그룹은 에스터라아제 (esterase)의 존재 하에 절단되지만, 이런 효소가 없을 때는 안정하다.(A) 및 (B)는따라서 유리하게 링크되어 발병 부위의 효소 활성에 의해 천천히 방출될 수 있다.링커는 생분해가 가능한 디에스터, 디아마이드 또는 화학식 I의 디카바메이트기와 링크그룹을 형성할 수 있다.

화학식 1:

-(Z¹)₀-(Y¹)_u-(Z)_s-(R₁₁)-(Z³)_t-(Y²)_v-(Z⁴)_p-

각각의 Z¹, Z², Z³및 Z⁴는 O, S 및 NR₁₂(R₁₂는 수소 또는 알킬기)로부터 독립적으로 선택되었다; 각각의 Y¹ 및 Y²는 카보닐, 사이오카보닐, 설포닐, 포스포릴 또는 유사한 산-생성기로부터 독립적으로 선택되었다; o, p, s, t, u 및 v는 각각 독립적으로 o 또는 1이다; R₁₁은 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5-10의 방향족 잔기, 탄소수 3-10의 고리계, -(CH₂CH₂O)_qCH₂CH2- (q는 1-4) 또는 -(Z^I)_O-(Y¹)_U-(Z²)_S- 를 -(Z³)_t-(Y²)_v-(Z⁴)_p-에 결합시키는 화학결합이다.

본 발명에서 사용된 예시적인 바람직한 링커(L)를 화학식 2-3에 나타내었다.

화학식 2

화학식 3

링커는 (A) 및 (B)의 탄소와 모두 공유결합 한다.따라서, 화학식 2-3의 링커(L)은 수송단백질 (A) 및 (B)와 디피란(dipyran), 에스터 또는 카바메이트 결합기를 통해 결합한다.이들 구현예에 있어서, R₁₃은 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5-10의 방향족 잔기, 탄소수 3-10의 고리계, -(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂(n은 1-4) 또는 두 개의 질소나 2개의 카보닐을 연결하는 화학결합이다.

하이드라존(hydrazone) 결합을 형성하도록 설계된 링커는 화학식 4의 구조를 가진다.

화학식 4

Z⁵는O, S, 또는 NR₁₆(R₁₆은 수소 또는 알킬기이다; R₁₅는 수소, 알킬 또는 헤테로알킬로부터 선택되었다; Y³는 카보닐, 사이오카보닐, 설포닐, 포스포릴 또는 (A)의 산소와 공유결합 하는 유사한 산-생산기이다; w 는 0 또는 1이다; R₁₄는 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5-10의 방향족 잔기, 탄소수 3-10의 고리계, -(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂(n은 1-4) 또는 -(Y³)-(Z⁵)_w-를

에 연결시키는 화학결합이다; X₄는 하이드라진기를 가지면서 X₄가 케톤 또는 알데히드의 산소원자인 링커 2의 전구체 (B)의 축합반응에 의해 만들어진 하이드라존이다.

수송단백질

일반적으로, 본 발명에서는 생리학적으로 항원에 의해 포획될 수 있는 수송단백질이 사용될 수 있다.바람직하게는, 항원은 수송단백질과의 중요한 공유결합 없이 복합체 내에서 수송단백질에 포획된다.중요한 공유결합이 없다 함은 50 % 가 넘지 않는 항원이 수송단백질에 공유적으로 결합한 것을 말한다.바람직한 구현예에 의하면, 40%, 30%, 10%, 또는 5%가 넘지 않는 항원이 수송단백질에 공유적으로 결합한다.항원/수송단백질 복합체는 알룸(alum) 같은 다른 화합물을 포함할 수 있으며, 이러한 다른 화합물은, 바람직하게는 항원과 수송단백질을 포획할 수 있다.

본 발명의 백신에서 사용된 수송단백질은 바람직하게는 홀로이거나 항원과 결합된 형태로서 대상체에서의 면역반응을 유발한다.바람직하게는, 수송단백질은 T-세포에 의해 인식되는 적어도 한개의 에피토프를 가진다.

바람직하게는, 에피토프는 대상체에서 T-세포 반응을 유도할 수 있고, B-세포를 자극하여 중요한 전체 항원에 대한 항체생산을 유도할 수 있다.본 발명에서 언급된 에피토프는 특정 항체분자나 그 절편에 대한 특이적 반응의 원인이 되는 항원에 대한 어떠한 결정자도 포함한다.에피토프 결정자는 대개 화학적 활성을 가지는 아미노산, 당 측쇄 등의 표면 분자의 집합으로 구성되며, 특이적 전하 특성 뿐 아니라 특이적 3차원 구조를 가진다.면역원성 특성을 가지기 위해서는 단백질이나 다당류는 T-세포를 자극할 수 있어야 한다.그러나 T-세포에 의해 인식되는 에피토프를 가지지 않는 수송단백질도 역시 면역원성이 있다.

강력한 면역반응을 유발하는 것으로 알려진 수송단백질을 선택함으로써, 다양한 집단의 대상체가 여기서 언급한 PCMV에 의해 치료될 수 있다.수송단백질은 바람직하게는 백신에 대한 강력한 면역반응을 유발할 수 있도록 충분히 외래적인 물질이다.전형적으로, 사용되는 수송단백질은 중요한 항원에 대한 면역원성을 부여할 수 있는 분자이다.바람직한 구현예에 따르면, 수송단백질은 본래 높은 면역원성을 가지는 단백질이다.따라서 높은 면역원성을 가지고 항원에 대한 항체생산을 최대화 할 수 있는 수송단백질이 바람직하다.

본 발명에서의 다양한 수송단백질에는, 예를 들어 톡신과 (화학적 또는 유전적)톡소이드가 있으며, 이들은 변이체일 수도 그렇지 않을 수도 있는 바, 여기에는안트락스 톡신, PA 및 DNI (PharmAthene, Inc.), 디프테리아 톡소이드 (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.) 또는 CRM 197, 테타누스 톡신, 테타누스 톡소이드(Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.),테타누스 톡신 절편 Z, 녹농균 엑소톡신 A 또는 그 변이체, 박테리아 편모, 뉴몰리신, 나이세리아수막염균의 외막단백질 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)), 녹농균 Hcpl 단백질, 대장균의 이열성 엔테로톡신, 쉬가-유사 톡신, 인간 LTB 단백질, 총 박테리아 세포 추출 단백질 및 그 밖에 링커에 의해 크로스 링크될 수 있는 모든 단백질이 포함된다.바람직스럽게는, 수송단백질은 콜레라 톡신 B 서브유닛(SBL 백신B에서 얻을 수 있다),디프테리아 톡신, 테타누스 톡신 절편 C(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다), DNI 및 대장균의 베타-갈락토시다아제(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다)이다.다른 바람직한 수송단백질은 BSA(bovine serum albumin), P40 및 치킨 리보플라빈(다른 기재가 없는 수송단백질은 Sigma Aldrich에서 구입항 수 있다)이다.다른 예시적인 수송단백질로 분쇄형 펩타이드인 MAP(multi-antigenic peptide)가 있다.MAP를 사용함으로써, 다중 분쇄 아미노산 잔기에 의해 크로스링크 밀도는 최대화되었다.MAP를 형성하는 아미노산의 예시로서 라이신이 있으나 이에 한정되지 않는다.

BSA와 KLH(keyhole limpet hemocyanin)는 모두 동물을 이용한 백신의 개발과정에서 수송체로 쓰였다.치료용 백신의 합성에 이용되는 수송단백질에는 수많은 병원성 박테리아의 톡신과 그들의 톡소이드가 포함되나 이에 한정되지 않는다.그 예로는 티프테리아와 테타누스 톡신과 이들의 의학적으로 허용되는 톡소이드가 포함된다.다른 가능한 수송단백질에는 CRM(cross-reacting material)이라 불리는 박테리아 톡신과 유사한 항원성을 가지는 단백질이 있다.본 발명의 수송단백질은 인간에게서 유래하지 않고 인간의 음식에 존재하지 않는 모든 단백질도 포함된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고리-유사 구조를 형성하는 단백질은 PCMV를 만드는데 사용된다.이러한 단백질에는 녹농균의 Hcp 단백질, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 대장균의 이열성 엔테로톡신 및 쉬가-유사 톡신이 있다.이러한 고리-유사 구조는 선형 다당류 사슬이 링 모양의 단백질 복합체를 관통하는 염주(beads on a string)형태를 형성할 수 있다.단백질이 크로스링크된 후에, 이러한 복합체는 매우 안정할 것으로 예측되었다.단백질의 구조적 데이터는 이러한 중앙 채널이 다당류 사슬이 쉽게 들어갈 수 있을 만큼 넓음을 보여준다.에를 들어, Hcp1 헥사고리의 중앙 채널은 42 옹스트롬으로 5.5 옹스트롬의 다당류 사슬 몇개를 수용하기에 충분한 너비이다(Mougous et al., Science 312(5779) 1526- 1530, (2006)).다른 한편, 단백질 고리는 다당류 주위를 둘러쌀 수도 있다(예를 들어, 특정 물리적 화학적 환경 하에서 자연적으로 링에 합쳐지는 모노머 수송단백질의 서브유닛으로부터).이러한 링 안에 합쳐져 들어갈 수 있는 모노머 단백질은 당업계에 공지되어 있으며, 뉴몰리신(Walker et al. Infect.. Immun. 55(5): 1184-1189 (1987); Kanclerski and Mollby, J. Clin. Microbiol. 25(2):222-225 (1987)), 리스테리올리신 O(Kayal and Charbit. FEMS Microbiol. Rev. 30:514- 529 (2006); Mengaud et al. Infect. Immun. 55(12):3225-3227 (1987)), DNI, 안트락스 PA, Hcp1, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 쉬가 톡신 B 서브유닛, 편모 및 당업계에 알려진 많은 관련 단백질을 포함한다.

또 다른 바람직한 구현예에 의하면, TLR(Toll-like receptor) 아고니스트가 수송단백질로 사용될 수 있다.TLR의 활성화는 적합한 면역반응을 형성하는데 있어 중요하며, 친화력의 성숙, 아이소타입 스위치, 면역학적 기억에 있어 핵심적 역할을 한다.콜레라균(Vibrio cholerae)의 편모(FLA)는 TLR 아고니스트이다.20 mg 이상의 FLA 단백질이 재조합 대장균으로부터 추출되었으며, 이는 IL-6 대식세포의 유도 분석에서 강력한 TLR 활성인자임이 밝혀졌다.뿐만 아니라, 잘 보존된 폐렴연쇄상구균의 단백질인 뉴몰리신 또한 TLR4를 활성화시키는 것으로 밝혀졌으며, 또한 방어항원이기도 하다.따라서, 이 단백질은 PCMV 수송단백질로 이용될 수 있다.

더 나아가, 나이세리아 수막염균 등의 외막단백질(OMP)은 HIB 접합백신(Merck)의 수송단백질로 이용되며, 폐렴연쇄상구균의 총 박테리아 세포에서 추출한 단백질은 동물 감염 모델에서 적어도 부분적인 보호역할을 함아 밝혀졌다.본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 이러한 단백질 혼합물은 PCMV 수송단백질의 원천임이 밝혀졌다.

바람직한 구현예에 따르면, PCMV 방법은적어도 2개의 라이신 잔기 또는 블록되지 않고 화학적 변형에 의해 크로스링크 할 수 있는 다른 잔기를 가지는 수송단백질이 사용된다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 수송단백질은 멀티머(예를 들어 적어도 5개의 서브유닛을 포함하는)이다. 바람직하게는, 멀티머는 호모멀티머이다.

또 다른 구현예에 의하면, DNI는 사용전 해독이 필요없는 비독성 물질이므로 수송단백질로 사용된다. 나아가, DNI가 중요한 항원에 대한 면역반응 뿐 아니라탄저균에 대한 방어면역 반응도 유도하기 때문에 DNI의 사용은 바람직하다. 또한 DNI는 내부에 설파이드 결합이 없다. 이러한 결합은 단백질을 변성시켜 에피토프를 파괴할 수도 있는 보로화수소 환원에 민감하다

목적의 항원

본 발명의 백신 조성물과 그 제조 및 투여 방법은 어떠한 중요 항원, 예를 들어 다당류, 폴리 알콜 또는 폴리 아미노산에 대해서도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 중요 항원은 백신의 제조 과정에서 일어나는 화학반응에 의해 파괴되는 1차 그룹을 가지지 않는다. 예를 들어 보로화수소의 환원을 통해 항원의 다이설파이드 결합을 파괴함으로써 항원을 변성시키는 경우가 그것이다. 예시적인 중요 항원으로 다당류같은 유기중합체(예를 들어 적어도 18개의 잔기를 가지는 다당류), 인다당류(phosphopolysaccharide), N-아세틸 치환된 아미노 당을 가진 다당류, 설펀화 슈가(sulfanylated sugar)를 가진 다당류, 그밖의 황산-변성(sulfate-modified)슈가, 인산-변성(phosphate-modified)슈가, 폴리 알콜, 폴리 아미노산, 테이콘산, 및 지질다당류의 O 측쇄이다. 예시적인 중요 항원은 캡슐 유기 중합체를 포함하며, 여기엔 박테리아, 곰팡이, 기생충 및 바이러스 등의 미생물이 합성하는 것과 일반적인 방법으로 생물학적 원천에서 채취한 것이 있다. 예시적인 중요 항원은 미생물 캡슐 유기 중합체를 포함하며, 여기에는 탄저균과 같은 바실러스 종(Wang and Lucas. Infect. Immun. 72(9): 5460-5463 (2004)), 폐렴연쇄상구균(Bentley et al. PLoS Genet. 2(3):e31, Epub (2006); Kolkman et al. J. Biochemistry 123:937-945 (1998); and Kong et al. J. Med. Micorbiol. 54:351-356 (2005)), 쉬겔라(Zhao et al. Carbohydr. Res. 342(9): 1275- 1279 Epub (2007)), 인플루엔자간균, 나이세리아 수막염균, 스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 티피, 스트렙토코커스 피오진(Streptococcus pyogenes), 대장균(Zhao et al. Carbohydr. Res. 342(9): 1275- 1279 Epub (2007)) 및 녹농균같은 박테리아로부터 채취한 것, 크립토코커스 및 칸디다같은 곰팡이로부터 채취한 것(Ovodov, Biochemistry (Mosc)) 71(9):937-954 (2006); Lee et al. Adv. Exp. Med. Biol. 491:453-471 (2001); Lee, Mol. Immunol. 24(10): 1005- 1019 (1987))을 포함한다. 예시적인 중요 항원은 또한 자연계에 나타나지 않는 비생물학적 물질도 또한 포함된다.

백신 조성물

본 발명의 백신 조성물은 소아 백신과 같이 조합하여 사용되어질 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 백신은 예를 들어 폐렴구균 감염, 인플루엔지간균 B 감염, 스트렙토코커스 감염(A 및 B그룹), 수막염균 감염에 대한 백신으로 사용될 수 있고, 그람 네거티브 박테리아(예를 들어 녹농균, 야토균, 쉬겔라 종, 살모넬라 종, 아시네토박터 종, 버크홀데리아 종 및 대장균)에 대한 백신으로 사용될 수 있다.

백신의 구성에는 바람직하게는 적어도 한 개의 수송단백질, 1개 또는 그 이상의 중요 항원 및 약제학적으로 허용 가능한 수송체나 첨가제(예를 들어 알루미늄 포스페이트, 염화나트륨 및 살균수)를 포함한다. 백신 조성물은 면역원성을 증가시키는 보조체계(물 속의 오일 및 그밖의 당업계에 알려진 체계 또는 약제학적으로 허용 가능한 첨가제)가 포함될 수도 있다. 생리학적 환경에서 불용성인 수송체/항원 복합체는 대상체에 항원을 투여한 후 천천히 방출되기 때문에 바람직하다. 이런 복합체는 바람직하게 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 함유하는 현탁액에서 수송된다. 그러나, 수송체/항원 복합체는 생리학적 상태에서 가용성일 수도 있다.

전형적으로 백신은 약 0.5 mL의 부피로 피하 주사되거나, 0.1 mL 부피로 피내 주사되거나, 0.002-0.02 mL부피로 경피 투여된다. 0.5ml 의 백신은 약 2-500 μg 의 수송단백질에 포획된 2-500 μg 의 항원을 함유한다. 바람직한 구현예에 따르면, 0.5 ml 의 투여량에, 약 10 μg 의 항원이 약 10 μg 의 수송단백질에 포획되어 있다. 항원과 수송단백질간의 몰 비율은 1:10(예를 들어 한 부분의 항원 대 두 부분의 수송체 또는 한 부분의 항원 대 세 부분의 수송체) 내지 10:1(예를 들어 세 부분의 항원 대 한 부분의 수송체 또는 두 부분의 항원 대 한 부분의 수송체)이다. 바람직한 구현예에 따르면, 항원과 수송단백질간의 몰 비율은 1:1이다. 한편, 항원과 수송단백질 간의 건조 중량비는 바람직하게는 1:10 내지 10:1이다(예를 들어 건조 중량 1:1).

펩타이드 또는 접합체는 위에서 분해될 수 있으므로, 백신은 바람직하게는 비경구(예를 들어 피하, 피내, 경피 또는 정맥주사)로 투여된다. 피부층을 물리적으로 관통하는 전달이 바람직하지만(예를 들어 바늘, 에어건 또는 침식 ), 본 발명의 백신은 피부 흡착에 의해 투여할 수도 있다.

특히, 본 발명의 백신은 적합한 면역 보조제와 함께 근육내 주사, 피내 주사, 경피성 접종을 함우로써 대상체에 투여될 수 있다. 본 발명의 백신은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있으며, 감염성 물질에 의한 감염을 막기 위해 항체의 생산을 부스팅 시키는 2차 투여가 종종 포함된다. 백신 투여의 빈도 및 양은 백신의 고유의 활성에 의해 좌우되며, 관례적인 실험에 의해 쉽게 결정된다.

예를 들어, 유아에게 있어, 접종계획은 약 4-8주 간격(생후 2개월에 시작하여)으로 0.5 ml씩 3회투여 후 4회째 투여는 생후 12-15주가 되었을때 이루어지는 것일 수 있다. 몇몇 백신에 있어서 5번째 투여는 생후 4-6년이 지났을 때 이루어지는 것이 바람직하다.

첫 번째 투여를 하는 나이는 일반적으로 생후 2개월이며, 백신은 생후 6주된 유아에게 투여될 수 있다. 관례적인 유아 백신 접종시기가 지난 어린이에 있어서 본 발명의 백신이 아래의 스케쥴에 따라 투여될 수 있다.

첫 번째 투여 연령	투여 계획
7-11개월	총 3번의 0.5 ml 투여; 첫 두 번은 적어도 4주 간격으로, 세 번째 투여는 두 번째 투여 후 적어도 2개월 후 투여
12-23개월	적어도 2개월 간격으로 2번 0.5 ml 투여
24개월-9년	0.5 ml 한번 투여

성인에 있어서, 0.5 ml 의 투여가 2-8주 간격으로 두 번 행해지며, 이는 장기 방어를 제공하기에 충분하다. 부스터 투여는 접종받은 적이 있는 11세 이상의 성인 및 어린이에게 10년마다 행해지는 것이 바람직하다.

단일 투여나 다중 투여를 위한 조제가 가능한데, 예를 들어 밀봉된 앰플이나 유리병에 냉동-건조하여 보관될 수 있고, 사용 직전에 즉시 살균 액상 수송액만을 첨가한다. 본 발명의 백신은 약제학적으로 허용 가능한 부형액에서 조제될 수 있으며,알룸 하이드록사이드 겔, 보조제 시료 또는 살린이 이에 해당한다. 그런 뒤 적합한 면역 보조제와 함께 근육내 주사, 피내 주사, 경피성 주사를 한다.

본 발명은 여기서 서술한 백신이 포함된 키트도 포함한다(예를 들어 PCMV). 본 발명의 키트는 백신 접종을 위해 키트를 사용하는 방법의 설명서를 포함한다.

면역 접종계획의 효율성은 대상체에서 항원 타이터를 측정하는 방법에 의해서 결정될 수 있다. 일반적으로 약 1 μg/ml 인 소량의 항원 타이터(바람직하게는 Ig G 타이터)가 장기 방어면역의 지표가 된다.

항원/수송단백질 복합체는 바람직하게는 10 nm -100 μm의 직경을 가진다. 바이러스는 100 nm 의 직경을 가지며 면역원성을 가진다. 총 박테리아 세포 1-10 μm 의 직경을 가지며 역시 면역원성을 가진다. 작은 덩어리의 박테리아는 약 100 μm 의 직경을 가진다. 특정한 구현예에 있어서, 백신 조성물에서의 항원/수송 단백질 복합체는 바람직하게는 100 nm - 10 μm 의 직경을 가진다. 이러한 복합체는 불용성일 수 있다.

이하 본 발명을 구체적 실시예, 구현예, 특성을 통해 서술한다. 이는 발명을 설명하기 위한 목적일 뿐 발명의 범위를 제한하기 위함이 아니다. 이하의 실시예는 발명의 한정으로 해석되어서는 아니 된다.

도 1은 다당류와 수송단백질인 테나우스 톡소이드(tenaus toxoid)간의 접합체에 대한 접합 백신의 항-다당류 Ig G의 무제한 면역반응 유도과정을 도식화 한 것이다. 이 모델에서, 다당류를 인식하는 항체 수용체를 가지는 B세포만이 다당류-단백질 접합체와 결합한다. 따라서 수송단백질은 정확한 다당류 결합 특성을 가지는 B세포 표면에 결합한다.

도 2는 PCMV와 대조군의 크로스 링킹(cross-linking)을 탐지하기 위한 SDS PAGE의 웨스턴 블롯 분석 및 항-PA 항혈청의 웨스턴 블로팅 결과이다. DNI 단백질은 글루타르알데히드의 크로스 링킹 이전에 84kDa 지점에서 이동하였다. PVCM1-PVCM3(레인 1-3)에서 분자량이 220kDa 이상의 밴드가 이동함으로써 DNI 단백질이 폭넓은 크로스 링킹을 하고 있음을 보여준다. PGA가 없느 경우에 홀로 크로스 링킹되는 DNI 단백질 역시 높은 분자량을 보여준다(레인 5). 반대로 PGA와 혼 합하고 글루타르알데히드를 처리하지는 않은 DNI 단백질은 DNI 혹은 더 작은 분자량의 물질과 함께 이동함을 확인하였다(레인 4).

도 3은 세가지 PCMV (PCMV1-PCMV3)와 두가지 대조군 항원 4 및 5로 면역화된 마우스에서의 Ig M 및 Ig G 에 의한 항-DNI 면역반응을 측정하기 위한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다. DNI 단백질은 글루타르알데히드와 크로스링크되지 않은 대조군 4를 제외한 모든 표본에서 매우 면역원성이 높았다. 그러나, 이러한 DNI에 대한 면역반응은 전적으로 Ig G에 기초한다. 어떤 항-DNI Ig M 도 면역화 반응 7일째까지 제거되지 않는 동안 중요한 항-DNI Ig G의 반응은 PCMV로 면역화 된 마우스 및 크로스링크된 DNI로만 면역화 된 마우스 에서 17일간 관찰되었다. 4번 표본을 포함한 모든 표본에서 30일째에 DNI에 대한 강력한 면역촉진반응이 관찰되었다.

도 4는 세가지 PGMV (PGMV1-PGMV3) 및 두가지 항원 대조군 4번 및 5번으로 면역화 된 마우스에서의 Ig M에 의한 항-PGA 면역반응을 측정하기 위한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 항-PGA Ig M의 반응은 캡슐 단량체의 전형적인 형태를 보여준다. 4번 대조군은 7일째에 탐지 가능한 항-PGA Ig M 반응을 보였으나, 이 반응은 17인째 혹은 30일째에 부스팅되지 않았다. 모든 PCMV 표본은 7일째에 항-PGA Ig M의 반응을 유도하였으며, 17일과 30일째엔 더 강력한 항-PGA Ig M의 반응을 이끌어냈다. 예상했듯이 5번대조군(크로스링크된 DNI로만 구성된)은 Ig M 또는 Ig G 어느 것에 의한 항-PGA반응도 유발시키지 않았다.

도 5는 세가지 PGMV (PGMV1-PGMV3) 및 두가지 항원 대조군 4번 및 5번으로 면역화 된 마우스에서 Ig G가 나타내는 항-PGA 면역 반응을 측정하기 위해 ELISA 분석을 한 결과를 나타낸 그래프이다. PCMV1-3은 17일째에 나타나고 30일째에 명확히 부스팅하는 Ig G에 의한 강력한 항-PGA 면역반응을 보인다.

도 6은 면역화 이전과 DNI, 알지네이트(DNI-ALG C,DNI_ALG A) 및 DNI,알지네이트(ALG), 덱스트란(DEX) 및 PGA로 구성된 one pot trivalent PCMV를 포함하는 PCMV에 의한 면역화 이후 30일째의 혈청 Ig M 항체의 농도를 나타낸 그래프이다.

도 7은 DNI, 알지네이트(DNI-ALG C,DNI_ALG A) 및 DNI,알지네이트(ALG), 덱스트란(DEX) 및 PGA로 구성된 one pot trivalent PCMV를 포함하는 PCMV에 의한 면역화 이후 60일째의 혈청 Ig G 항체의 농도를 나타낸 그래프이다.

도 8은 DNI, 알지네이트(DNI-ALG C,DNI_ALG A) 및 DNI,알지네이트(ALG), 덱스트란(DEX) 및 PGA로 구성된 one pot trivalent PCMV를 포함하는 PCMV에 의한 면역화 이후 128일째의 항-다당류 Ig G 항체의 농도를 나타낸 그래프이다.

도 9a 및 9b는 폐렴구균 다당류(S. pneumoniae pss)[American Type Culture Collection, Merk or SII(Serum Institute of India)]를 이용한 인터루킨(IL)-6 에세이 그래프이다.

도 10은 SII에서 얻은 pss 6B의 오염물이 처리 2(trt 2; 1M 수산화나트륨에서 80℃로 한시간 배양)를 통해 지워질 수 있음을 보여주는 그래프이다. 처리 1(trt1)은 다당류로부터 단백질을 제거하기 위한 다섯 번의 연속된 페놀 추출과정이다.

도 11은 pss 6B를 함유하는 PCMV가 Prevnar보다 Ig G 생산을 유도하는데 더 효과적임을 보여주는 그래프이다(BSA = Bovine Serum Albumine, DT = Diphtheria toxin; DTx = Diphtheria toxoid; and TTx = tetanus toxoid).

도 12는 pss 6B를 함유하는 PCMV가 Ig M 생산을 유도하는데 Prevnar와 동일한 효율성을 가짐을 보여주는 그래프이다.

도 13은 pss 6B를 함유하는 PCMV가 Prevnar보다 Ig G 생산을 유도하는데 더 효과적임을 보여주는 그래프이다.

도 14-16은 pss 14를 함유하는 PCMV가 Prevnar와 비교하여 Ig G 생산을 유도하는데 대략 동일한 효율성을 가짐을 보여주는 그래프이다(DTx = Diphtheria toxonoid; TTx = Tetanus toxoid).

실시예 1 : 백신과 대조군의 제작

캡슐형 폴리 감마-D-글루타민산(PGA)은 Vedan(Taiwan)으로부터 구입하거나 Rhie 등의 방법(Prod. natl. Acad. Sci 100: 10925-10930(2003))에 의해 정제하였다. DNI(dominent negative mutant)는 탄저균(B. anthracis)의 PA(protective antigen)의 변이형태로써 Benson 등의 방법(Biochemistry 37 : 3941-3948 (1998))에 의해 대장균으로부터 생산되었다. PGA 및 DNI 단백질은 사용 전에 pH 7.4(SP 7.4)의 0.05 M 의 인산나트륨 완충액에 충분히 투석하였다. DNI 스톡 용액은 30 mg/ml의 농도를 가진다. PGA 스톡용액은 134 mg/ml의 농도를 가진다. 링커 글루타르알데히드는 Pierce에서 25% 스톡액으로 구입하였다. PCMV(Protein Capsular Matrix Vaccine)과 대조군은 반응에서 표 1과 같이 조합되었다.

PCMV 표본 1-3, 대조군 4 및 5의 제작을 위한 반응의 조합

반응#	DNI	PGA	dH2O	25% 글루타르알데히드
	ml	ml	ml	ml	명칭
1	20	1	3	0.8	PCMV1
2	12	4	8	0.8	PCMV1
3	16	2	6	0.8	PCMV1
4	16	2	6	0	P+C대조군
5	16	0	8	0.8	P만의 대조군

상온(22℃)에서 글루타르알데히드 없이 다섯 개의 반응이 조합되었다. T=0의 조건에서 0.1 ml 의 글루타르알데히드(G25)가 지시된 반응에 첨가하였다. 30초 후에 다시 0.1 ml의 G25를 첨가하였고 지시된 반응에 G25가 총 0.8ml를 첨가할때까지 상기 과정을 반복한다. 하기의 순서로 다양한 탁도와 불용성 젤-유사 입자(particle)를 조성함으로써 이중작용기성 글루타르알데히드분자에 의한 DNI 분자의 크로스링크를 육안으로 관찰할 수 있었다 : 탁도 및 젤 형성 정도의 순서가 반응1>반응2>반응3>반응4 이고 반응 5는 완전히 투명하고 가용성인 상태이다. 1시간 뒤에, pH 9.3의 0.5 M 의 붕산염(sodium borate) 완충액(SBH)내에 혼합된 2 ml 의 보로수소화나트륨(sodium borohydride) 1 M 을 6개의 반응 모두에 첨가시켜 DNI 분자의 아미노 측쇄와 이중작용기성 글루타르알데히드 분자간에 형성된 쉬프 염기를 환원시켰다. 실리콘 소포제(0.01ml)를 각각의 반응에 첨가하여 반응 동안 발생하는 거품을 제어하였다. 반응물을 4℃에서 72시간동안 보관하였다. 모든 반응물을 SP7.4에 대해 48시간동안 충분히 투석하였다. 불용성 물질은 최종 생성물의 원심분리를 통해 제거하였으며 사용시까지 4℃에서 보관하였다.

종래의 우태아혈청(BSA)과 PGA간의 접합체는 하기의 방법에 따라 수용성 카보디이미드인 EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드)를 이용한 BSA의 아미노기와 PGA의 카르복실기간의 커플링을 통해 합성하였다 : 물에서 30 mg/ml BSA 5 ml 를 NP7.5에서 134 mg/ml PGA 1 ml 와 혼합한다. EDCA 50 mg 을 첨가하여 실온에서 반응을 3시간동안 진행시킨다. 반응은 활성화기를 차단하기 위한 1 mM 의 글리신이 포함된 SP7.4에 대해 18시간동안 4℃에서 투석하였다. 그리고 나서 SP7.4에 대해서만 24시간동안 4℃에서 투석하였다. 최종산물은 PGA-BSA 접합체라고 불린다.

PCMV와 대조군 표본을 합성하고 투석한 뒤, DNI 단백질의 분자 상태를 시험하여 다양한 양의 PGA의 존재 혹은 부존재하에서 글루타르알데히드가 분자 단계에서 정말로 단백질과 크로스링크 되었는지 확인하였다. PCMV와 대조군표본은 SDS (sodium dodecyl sulphate) 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(PAGE)과 항-PA 항혈청을 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 모니터링한다. 도 2에서 보듯이 DNI 단백질은 글루타르알데히드의 크로스링크 이전에 84kDa에서 이동한다. PCVMl-PCMV3(레인1-3)은 220kDa 이상의 분자량에서 밴드가 이동함으로써 DNI 단백질이 광범위한 크로스링크를 함을 보여준다. PGA가 없이 홀로 크로스링크되는 DNI 단백질도 높은 분자량을 나타낸다(레인 5). 반대로, PGA와 혼합하였으나 글루타르알데히드를 처리하지 않은 DNI는 DNI 또는 더 낮은 분자량의 물질과 함께 이동한다. Vedan(Taiwan)에서 구입한 PGA 표본은 DNI에 대한 활성을 가지는 프로테아제에 의해 오염된 것으로 보인다. 그러나 6번 레인의 Vedan PGA의 샘플은 항-PA 항혈청과 반응하는 오염단백질의 함유량이 낮아 관찰된 밴드는 다양한 반응을 통해 DNI로부터 유래된 생성물임을 보여준다.

뿐만 아니라, 콜레라균(Vibrio cholerae)의 편모(FLA)가 PCMV에 포함되는 DNI보다 나은 수송단백질인지 여부를 알아보기 위해 PGA 와 하나 이상의 폐구균(pneumococcal) 다당류를 항원으로 사용하였다. 수송단백질의 효과는 PGA에 작용하는 Ig G 의 양과 다양한 PCMV 및 이들의 단백질에 의한 면역과정을 톨해 얻어지는 다당류의 양에 의해 측정한다.

PCMV는 아미노기를 이중작용기성 크로스링커를 사용하지 않고 카르복시기에 직접 크로스링크시켜 만들 수 있다. 특히 PCMV는 카보디이마드를 이용하여 아미노기와 수송단백질의 카르복시기를 크로스링크시킴으로써 만들 수 있다. 이 화학구조는 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 및 글루타민산 측쇄의 카르복시기 간의 펩타이드 결합을 형성한다. 아미노기는 톡소이드로 처리된 포르말린에 대부분 차단되지만 포르말린은 카르복시기와 전혀 반응하지 않는다. 따라서, 카보디이미드는 글루타르알데히드에 저항할 수 있는 포르말린 톡소이드를 이용한 PCMV 함성에 유용할 수 있다. 크로스링킹은 SDS-PAGE에 의해 쉽게 탐지된다. 글루타르알데히드와 같은 크로스링커의 첨가에 따른 고분자량의 단백질“얼룩”의 존재는 크로스 링크가 일어났음을 알려준다.

SDS-PAGE에 의해 탐지된 수송단백질의 크로스링크

글루타르알데히드	부존재	존재	존재	존재	존재
캡슐 중합체	-PGA	-PGA	+PGA	+PS6B	+PS23F
BSA	-	+	+	+	+
디프테리아 톡신	-	+	+	n.d.	n.d
디프테리아 톡소이드	-	-	-	n.d.	n.d
테타누스 톡소이드	-	+	+	n.d.	n.d

+표시는 SDS-PAGE에서 크로스 링크가 탐지되었음을 나타내고, -표시는 글루타르알데히드가 없는 대조군에서 단백질 이동의 변동이 없음을 나타낸다. n.d.는 분석이 행해지지 않아 알 수 없음을 나타낸다.

표 2에 나타난 실험을 위해 200 마이크로리터의 반응을 pH 7.5의 50 mM HEPES(4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid)에서 수행하고 2시간동안 분위기온도(Ambient Temperature)에서 배양하였다. 반응은 120M의 보로수소화나타륨에 의해 종료되었다. 글루타르알데히드는 64 mM 를 첨가하였고, BSA( bovine serum albumin) 15mg/ml를 사용하였으며, 디프테리아 톡신,디프테리아 톡소이드 및 테타누스 톡소이드가 약 5 mg/ml 로 사용되었다. PGA는 13.4 mg/ml, 폐 다당류(pneumo PS) 6B 및 23F가 4 mg/ml 첨가되었다.

표 2에서 보는 바와 같이, 포르말린이 처리된 몇몇 단백질(예;디프테리아 톡소이드)은 글루타르알데히드와 잘 크로스링크되지 않으며, 따라서 PCMV 합성을 위해서 다른 크로스링크 화학구조가 필요하다. 테타누스 톡소이드와 같은 다른 단백질들은 글루타르알데히드와 크로스링크되기는 하나 디프테리아 톡신이나 BSA같은 비변형 단백질만큼 광범위하게 크로스링크되지는 않는다.

실시예 2 : 면역화와 항-DNI 및 항-PGA 면역반응의 분석

표 1에 게재된 5개 반응의 가용성 생성물을 흡광도 280 nm 의 동일한 단백질 농도로 조절하였다. 생후 약 5-7주 된 BALB/c 마우스(Charles River)를 그림 2에 나타낸 면역화 연구에 사용하였다. 마우스들을 실험 첫날 PCMV 백신1-3 과 DNI 단백질 20 μg의 항원 표본 대조군 4 및 5 를 복강주사 함으로써 면역 접종시켰다. 모든 마우스들은 7일째에 출혈을 보였고 10일째에 같은 양의 항원표본을 투여하자 면역반응이 부스팅되었다. 마우스들은 30일째에 다시 출혈을 하며 사망했다.

혈액 표본의 혈청은 응고가 일어난 후 수집한 후 -20℃에서 저장하였다. ELlSA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 분석을 통해 항-PGA 및 항-DNI 혈청 항체의 양을 측정하였다. 요약하자면, Immulon 2HB ELISA (VWR) 마이크로티터 디쉬를 pH 9.6, 0.5 μg/well, 100 μl/well의 탄산나트륨 완충액에서 BSA-PGA 또는 DNI 로 코팅하였다. 밤새 4℃에서 배양한 후, 항원으로 코팅된 플레이트는TBST(TBS-0.1% Tween)에 첨가된 3% BSA (w/v)와 함께 1시간동안 실온 또는 하룻밤동안 4℃에서 배양함으로써 차단하였다. 면역 촉진 이후의 각각의 시점에서의 4마리 마우스로부터 추출한 혈청표본은 TBST로 순차적으로 희석한 후, 항원으로 코팅한 플레이트에 첨가한 후 최소 1시간동안 배양하였다. 항-DNI 및 항-PGA 항체 반응은 알칼린 포스페이타제(Zymed)와 접합된 마우스 Ig G 또는 Ig M에 대한 레빗 항-혈청을 이용하여 측정하였다. p-니트로페닐 포스페이트(PNPP)기질을 각각의 웰에 첨가하고 각각의 반응에 대하여 405 nm에서의 흡광도를 결정하였다. 데이터는 상호 최종 타이터(reciprocal endpoint titer)로 기재되어 있고, 이는 음성대조군의 흡광도보다 높은 두 개의 표준편차인 OD₄₀₅리딩을 얻기 위한 최대 희석치로 정의된다.

세 개의 PCMV 표본 1-3과 두 개의 항원 대조군 표본 4 및 5(그림 3-5)로 면역 접종한 마우스의 Ig M과 Ig G 특이 항-DNI 및 항-PGA 면역반응을 측정하기 위해 ELISA 분석을 실시하였다. 그림 3에서 보듯이 DNI 단백질은 글루타르알데히드와 크로스링크되지 않은 대조군 표본 4를 제외하고 모든 표본에서 매우 면역반응을 잘 일으킨다. 그러나, 이런 DNI 특이 면역반응은 전적으로 Ig G에 기초한다. 어떤 항-DNI Ig M 도 면역접종 후 7일째까지 검출하지 못했으나, PCMV 표본들 또는 DNI로만 크로스링크 된 표본(5번 표본)으로 면역접종한 마우스에서 중요한 항-DNI Ig G 의 반응은 17일째에 검출하였다.

항-PGA Ig M 의 반응은 캡슐중합체의 전형적인 패턴을 보인다(그림 4). 대조군 표본 4는 7일째에 탐지 가능한 항-PGA Ig M 반응을 보이지만, 이 반응은 17일 또는 30일째에 상승되지 않는다. 모든 PCMV 표본은 7일째에 항-PGA Ig M 반응을 유도하였고, 더 강한 항-PGA Ig M 반응을 17일째 및 30일째에 생성하였다. 예상했듯이, 대조군 표본 5(DNI와만 크로스 링크된)는 Ig M 또는 Ig G 에 기초한 항-PGA 반응을 생성하지 않았다. 반대로, PCMV 1-3(표본 1-3)은 17일째에 명확히 나타나고, 30일째에 확연히 부스팅하는 강한 Ig G 에 의한 항-PGA 반응을 생성하였다(그림 5). PCMV 1-3에 의한 Ig G 의 항-PGA 반응은 Aulinger 등이 보고한 종래의 PGA-DNI 접합 백신에서 관찰된 PGA에 대한 반응(Infect. Immun. 73:3408-3414(2005)) 및 Rhie 등이 보고한 폴리아미노산(PA)-PGA에 대한 반응(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925-10930(2003))과 유사하다. 따라서 PCMV백신 #1, #2 및 #3은 알려진 탄저균의 T-의존성 방어항원인 캡슐 PGA에 대한 면역그로불린 G의 반응을 유도함으로써 모두 종래의 PGA 접합백신과 동일한 작용을 한다(Wang et al. Infect. Immun. 72:5460-5463(2004)). PGA와 혼합된 DNI(크로스링크되지 않는)를 함유한 대조군 표본 5는 PGA에 대해 탐지 가능한 Ig G 반응을 유발시키지 않아 PCMV 표본 1-3에서 DNI가 Ig G 의 항-PGA 반응을 촉진시키는데 있어 TLR 리간드로 작용하지 않음을 보여준다. 이 결과로 또한 PGA는 낮은 면역원성을 가지는 T-세포 비의존성 면역원이라는 사실을 확인하였다. 그렇지 않으면 단백질과 공유결합을 통해 결합하였을 것이기 때문이다(Rhie et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925-10930 (2003)). PCMV 방법은 상기 방법이 결과적으로 DNI 단백질을 PGA 분자와 직접적으로 크로스링크시키지 않음에도 불구하고 명확히 PGA를 T-세포 의존성 면역원으로 변환시킨다.

이러한 데이터는 PCMV 방법이 종래의 접합백신과 유사한 특성의 면역원을 생산할 수 있음을 보여준다. PGA PCMV는 여기서 서술한 방법을 이용하여 쉽게 만들 수 있고, 전형적인 PGA-단백질 접합백신에 의한 면역반응을 유도한다는 것을 발견하였다. 표 1에 개시된 작은 스케일의 반응들은 도 3에 요약된 도식에 따라 1000마리의 마우스를 면역접종하기에 충분한 양의 PCMV를 만든다. 본 데이터는 PGA와 DNI로부터 만들어진 PCMV가 탄저균에 의해 유발된 탄저병을 예방하는 백신으로 쓰일 수 있음을 뒷받침한다.

실시예 3 : 추가적 PCMVs의 생성 및 특성

PCMV 기술은 다양한 구조와 이온 극성의 캡슐 항원에 적용될 수 있다. 23 개 타입의 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumonia) 다당류는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였고, Merck, Inc.에서 생산하였다. 이들 다당류는 분자구조에 있어서 매우 다양하고, 매우 음이온성이거나, 부분적으로 양이온성이거나, 전기적으로 중성이거나, 인산화 되어있거나, 선형이거나, 가지구조를 가지고 있고, 그밖의 많은 변형을 가지는 다당류를 포함한다. 예비적인 실험에서 일곱 개의 캡슐 타입의 Wyeth product Prevnar (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 및 23F)과 일치하는 이들 다당류의 소량을 마우스의 매크로파지에 의한 IL-6 생산을 유도하는 능력을 측정하기 위해 분석하였다. 타입 4 다당류는 이 분석에서 활성을 보였다 ; lipopolysaccharide(LPS)는 TLR 길항제를 위한 대조군이다. 다른 다당류들(예를 들어 타입 3), PGA-DNI 및 크로스링크하지 않는 대조군에서 만들어진 PCMV 백신 뿐 아니라 PGA, 야토균(Francisella tularensis)의 O 항원 다당류도 분석하였다. 이 실험은 타입 3 폐렴연쇄상구균 다당류와 PGA의 적은 범위가 (and to a lesser extent PGA) TLS 아고니스트 에 오염되었음을 보여준다. 야토균 및 PCMV의 다당류는 분석에서 비교적 깨끗하였다. 페놀 추출물과 에탄올 침전물은 알려지지 않은 잔여 TRL 아고니스트를 제거함으로써 연속적인 두가지 처리를 한 후에 폐렴쌍구균 다당류 타입 3을 정화할 수 있다. 따라서, 여섯가지 폐렴쌍구균 다당류들과 야토균 O 항원 다당류는 IL-6 생산을 위해 정화됨이 밝혀졌다.

IL-6 생산을 위해 정화되는 일곱가지 다당류를 위한 PCMV들은 실시예 1에서와 비슷한 방법으로 DNI를 수송단백질로 이용함으로써 합성하였다. 예비적인 면역원성 실험은 일곱가지 PCMV 모두가 다양한 정도의 면역원성을 가짐을 뒷받침한다. 폐렴쌍구균의 DNI-기초 “1가 ”PCMV 다당류 14 (14-PCMV)는 세 번째 면역접종에서 크게 부스팅하는 항-PPS14 Ig G를 높은 타이터로 유도함을 발견하였다.

놀랍게도 14-PCMV가 다른 여섯가지 PCMV들과 혼합되어 “칵테일A”면역원을 만들 경우에 동일한 면역 반응이 일어났다. Prevnar는 알룸(alum)이 흡수된 “보조적”백신이기 때문에 6가의 PCMV 칵테일이 알룸 보조제에 흡착될 수 있을 것인지가 결정되었다. PCMV 또는 DNI 단백질과 혼합된 (그러나 글루타르알데히드와는 크로스링크되지 않은) 다당류의 대조군 혼합물에 노출된 후 알룸에 흡착된 다량의 폐렴쌍구균 다당류의 측정을 통한 면역 분석의 결과는 PCMV의 다당류들이 대조군(다당류+ 크로스링크되지 않은 DNI 단백질)의 다당류보다 알룸에 흡착된다는 사실을 보여주었다(면역검정(immunoassay)에서 더 희석된 PCMV의 높은 면역반응성에 의해 알 수 있듯이).

마우스의 면역화를 이용하여 알룸 보조제에 흡착시키거나 또는 흡착시키지 않은 상태에서 헵타밸런시 PCMV의 면역원성을 평가하였다. 알룸 보조제는 PS14에 대한 면역반응의 속도론적 특성을 개선시켰고 보조제로 처리되지 않은 백신보다 7일 빨리 상기 다당류에 대한 Ig G를 유도하였다. 그러나 헵타밸런시 PCMV는 알룸의 부존재 하에서 면역원성이 대조군 크로스링되지 않은 다당류+DNI 조합이 알룸의 존재 하에서 보여주는 면역원성 보다 높게 나타났다. 이러한 결과는, PCMV 과정이 다당류들을 마우스에 대한 면역원성을 보다 높게 한다는 것을 보여주며, 접합 백신의 칵테일과 유사하게 면역반응을 유도할 수 있는 칵테일의 제조에 PCMV 과정이 이용될 수 있다는 것을 뒷받침한다.

추가 실험에서, 페놀 추출 및 에탄올 침전을 실시하여, 상업적으로 구입한 23개 폐렴연쇄상구균 다당류로부터 TLR 아고니스트 오염물을 제거한다. 표준방법에 따라 페리토니얼 대식세포에 의한 IL-6의 유도에 대하여 처리된 다당류들을 시험함으로써, 오염물의 제거를 확인한다. IL-6 유도 활성이 없는 다당류들을 이용하여 PCMV의 제조한다. PCMVs에 이용된 다른 다당류는 야토균으로부터 정제된 O 항원 PS 및 탄저균으로부터 얻는 PGA 캡슐을 포함한다. 총 25종 캡슐을 가지고 실험한다(23종 폐렴연쇄상구균 타입, 야토병 및 탄저병 타입 각각 1종).

25종의 캡슐 타입이 실시예 1에서의 방법에 의해 DNI 단백질을 이용하여 PCMV를 만들기 위해 사용되었다. 초기의 PCMV 시료를 만들기 위해 다당류 대 단백질을 1:1비율(대략 1:1의 건조중량 비율)로 하였다. 예비적인 실험에서 다양한 PCMV 시료의 면역원성과 완벽히 연관되는 크로스링크를 하는 단백질에 대한 증거를 찾기 위해 각각의 시료를 SDS-PAGE로 특징지웠다. 같은 캡슐 타입(예;6B 및 23F)에 있어서 택일적 크로스링킹이 이용될 수 있다. SDS-PAGE 등에서 단백질 크로스링킹의 증거를 보여주는 모든 PCMV 시료에 대해 면역원성 실험을 수행한다. 예를 들면, 다섯 개의 각각 다른 매트릭스 단백질 및 두 개의 다른 항원을 사용하는 열 개의 다른 PCMV를 다음과 같이 만든다. 5개의 매트릭스 단백질은 그들이 FDA 승인 백신에서 현재 사용되는지 여부 또는 그밖에 PCMV시료의 안정성을 측정하기 위한 탐침으로써 사용될 수 있는 특성이 있는지를 기초로 선택한다. 사용되는 매트릭스 단백질은 (1)콜레라 톡신 B 서브유닛(SBL 백신B에서 얻을 수 있다),(2)디프테리아 톡신(diphtheria toxin),(3)테타누스 톡신(tetanus toxin)절편 C("Frag C")(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다),(4)DNI 및 (5)대장균의 베타-갈락토시다아제(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다)이다. 탄저균 또는 폐렴연쇄상구균 캡슐 타입 14에서 추출한 폴리-D-글루타민산(Suarez et al. Appl. Environ. Micobiol. 67:969-971 (2001))을 캡슐 항원으로 사용한다. 이들 두가지 캡슐 항원은 DNI를 상응하는 PCMV에서 매트릭스 단백질로 함께 사용할 경우 매우 고 면역원성이 된다. 각각의 캡슐 항원은 각각 5개의 선택된 매트릭스 단백질과 결합하여 10개의 다른 PCMV를 만든다.

PCMV에 대해 종래의 접합 백신에서 관찰되는 것처럼 마우스에서 아이소타입 항체가 Ig G 로 스위치(switch)되는 것을 유도하는 능력을 시험할 수 있다. 모든 항원은 알룸에 흡착될 수 있고 일반적으로 PCMV 시료당 5마리의 마우스가 사용된다. 마우스는 시험대상의 항원에 대한 면역반응의 기준선을 얻기 위해 미리 출혈시킨다. 마우스는 이후 표준 IP 주사 프로토콜에 따라 3번(실험전날, 7일째, 14일째) 면역접종시키며, 1차 접종 후 10일째 20일째, 30일째, 60일째에 각각 수집한다. 마우스 혈청은 다당류 및 수송단백질에 대한 Ig G의 표준 ELISA 에세이에 의해 분석한다. 이 실험에서, 다양한 PCMV 시료의 항-다당류 Ig G를 유도하는 능력을 거의 면역원성이 없는 비접합 다당류와 비교하여 측정하기 위해 다당류만으로 면역 접종된 마우스로 구성된 대조군을 사용한다. 유망한 PCMV(예를 들면 다당류에 대해 많은 양의 Ig G를 유도하는)에 대해선 더 신중한 면역학적 분석을 하여 쥐에서의 PCMV에 대한 면역 반응의 속도론적 및 양적 반응의 측면을 확립한다. 또는, 유망한 PCMV와 그들의 상응하는 대조군은 레빗 항-혈청의 생산을 위해 상업적 판매자에게 제공될 수 있다. 유사한 면역분석이 레빗에서의 면역원성, 유도된 항원의 분류 및 면역반응의 속도론을 측정하기 위해 행해진다. 이 실험에서 대조군은 디프테리아 톡신과 연관된 비독성 변이 단백질인 CRMl 97에 결합된 7개의 각기 다른 종래의 접합 다당류 백신의 혼합물에 흡착된 알룸의 상업적 생산품인 Prevnar이다.

PCMV에 의해 유도된 항체 반응의 기능성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 항-다당류 항체가 포집된(encapsulated) 폐렴연쇄상구균을 옵소닌화하여 대식세포가 식균작용을 하게 하는 능력을 측정함으로써 그 기능성을 가늠한다. 폐렴연쇄상구균의 위협으로부터 동물을 지키는 것은 면역접종된 동물에서의 백신의 효과를 증명하는 또다른 방법이다.

실시예 4 : PCMV와 Prevnar의 비교

Merck 을 통해 혹은 Serum Institute of India (SII)에서 직접 구한 ATCC에서 얻은 폐렴연쇄상구균 다당류(pps) 6B, 14, 23F 의 상대적 청결성을 결정하였다. IL-6 발현은 pps의 청결성의 척도로 사용하였고, LPS는“더러움”의 양성대조군으로 사용되었다. 도 9A에서 보듯이, Merck pps 6B, 14, 및 23F는 청결하나, 도 9B에서 보듯이 SIl의 pps 6B는 더럽다. 도 10에 나타난 바와 같이 처리 2 (1M 수산화나트륨에서 80℃로 1시간 배양)는 SII pps 6B를 제거한다. 청결한 pps 6B를 접합 백신과 PCMV의 면역원성의 비교에 사용한다. 표 3에서 보는 바와 같이 오염물은 LPS가 아니다.

다당류의 엔도톡신 분석

다당류	엔도톡신 unit/mg 다당류
SII pps 6B-무처리	0.75
SII pps 6B-무처리	0.85
SII pps 6B-처리 2	0.24
다양한 Merck pps	0.1-0.4

도 11 및 13은 알룸 보조제인 Prevnar가 pps 6B에 대한 Ig G 항체를 유도하는 것과 알룸으로 보조되는 PCMV(BSA 와 pps 6B; 디프테리아 톡신과 pps 6B; 디프테리아 톡소이드와 pps 6B; 및 테타누스 톡소이드와 pps 6B)가 Prevnar에서 관찰되는 것보다 더 잘 유도함을 보여준다. 도 12에서 보듯이, 알룸으로 보조되는 PCMV에 대한 Ig M 의 반응은 Prevnar의 그것과 유사하다.

뿐만 아니라, 도 14-16에서 보듯이, Prevnar의 대부분의 면역원성 pps인 pps 14 에 있어, 디프테리아 톡소이드와 pps 14 또는 테타누스 톡소이드와 pps 14를 포함하는 알룸으로 보조되는 PCMV는 대략 Prevnar과 동일한 Ig G의 유도 효과를 보인다.

실시예 5 : 다가(Multivalent) PCMVs

다가(Multivalent) 면역원은 DNI 수송단백질과 글루타르알데히드가 크로스링크하기 전에 각각 다른 캡슐 유기 중합체를 화학적으로 혼합하는 PCMV 방법을 사용하여 만들어진다("one pot synthetic reaction"). 이들 종류의 3가 면역원은 DNI를 수송단백질로 이용하여 3개의 유기 중합체 - PGA, 알긴산 및 덱스트란 - 로부터 만들어진다. 이들 3가 백신은 면역원성을 가지고 상기 세 종류의 유기 중합체에 대한 면역반응을 생성한다. 도 6에 혼주혈청(pooled serum) Ig M을 면역접종 전 및 접종 30일 후에 분석한 결과를 나타내었다. 도 7에선 항원 특이적 혈청 Ig GG 항원 타이터의 접종 60일후를, 도 8에선 항-다당류 혈청 항체 타이터의 접종 128일 후를 각각 보여준다. 도 6-8에서 보듯이, 단가 알긴산 PCMV 시료는 마우스에서도 면역반응을 생성한다. 다가 PCMV 면역원도 각각 별개로 합성되는 특정 PCMV들을 혼합하여 “칵테일” 백신을 형성함으로써 만들어질 수 있다.

본 명세서에 인용되고 참조된 모든 특허, 특허출원 및 특허출원 공개 및 다른 공개문헌들은, 각각의 특허, 특허출원 및 특허출원 공개 및 다른 공개문헌이 특이적으로 그리고 개별적으로 본 명세서에 참조로서 삽입된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

Claims

항원 및 수송단백질 매트릭스를 포함하는 백신 조성물에 있어서, (ⅰ) 상기 수송단백질 매트릭스는 서로 공유적으로 크로스링크된 수송 단백질 분자를 포함하며, (ⅱ)상기 항원의 50% 이하는 상기 수송단백질과 공유적으로 크로스링크 되어있고, (ⅲ)상기 항원은 상기 수송단백질 매트릭스에 포획(entrapped)되어 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 복합체는 10 nm-100 μm의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 복합체는 100 nm-100 μm의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 복합체는 100 nm-10 μm의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 복합체는 포유류에 투여된 경우 상기 포유류에서 T- 세포 의존성 면역반응을 유발하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 항원과 상기 수송단백질의 몰 비율은 1:10 내지 10:1인 것을 특징으로 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 수송단백질은 멀티머인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 멀티머는 최소 5개의 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 멀티머는 호모멀티머인 것을 특징으로 하는 백신조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 공유적 크로스 링크는 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 또는 글루타메이트 측쇄의 카르복실기 사이의 펩타이드 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 공유적 크로스링크는 화학식
의 화합물을 포함하고, 상기 화학식에서 R_n은 탄소수 1 내지 12의 선형 또는 분쇄형 알킬, 1 내지 12개 원자의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2 내지 12의 선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2 내지 12의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5 내지 10의 방향족 잔기, 3 내지 10개의 원자의 고리형 시스템 또는 -(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂-(상기 q는 1 내지 4 또는 두 개의 알데히드기를 연결하는 화학결합이다)인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 공유적 크로스 링크는 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르, 카보디이미드 또는 비스-비아조타이즈드 벤지딘을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 공유적 크로스 링크는 이중작용기성 크로스링커(bifunctional cross linker)를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 이중작용기성 크로스링커는 글루타르알데히드, 비스[설포닐숙시니미딜]수베레이트 또는 디메틸아디피미데이트인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡신(diphtheria toxin), 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid), 데타누스 톡신(tetanus toxin), 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid), 녹농균 엑소톡신 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A), 콜레라 톡신 B 서브유닛, 테타누스 톡신 절편 C, 박테리아 편모, 뉴몰리신(Pneumolysin), 나이세리아 수막염균(Neisseria menningitidi)의 외막단백질, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Hcp1(haemolysin co-regulated protein 1) 단백질, 대장균의 이열성 엔테로톡신(enterotoxin), 쉬가-유사 톡신(shiga-like toxin), 인간 LTB(lymphotoxin-beta) 단백질, 리스테리올리신 O, 총박테리아 세포의 단백질 추출물, 탄저균(Bacillus anthracis)의 방어항원에 대한 DNI(dominant negative mutant) 또는 대장균 베타-갈락토시다아제인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 18 항에 있어서, 상기 총박테리아 세포는 녹농균 또는 스트렙토코커스 세포인 것을 특징으로 하는 백신조성물.
제 18 항에 있어서, 상기 박테리아 편모는 비브리오 콜레라균(Vibrio cholerae)의 편모 단백질인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 18 항에 있어서, 상기 쉬가-유사 톡신은 쉬겔라(Shigella) SltB2(Shiga-like toxin subunit B2) 단백질인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 항원은 다당류, 폴리알콜 또는 폴리 아미노산인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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제 28 항에 있어서, 상기 다당류는 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)의 다당류, 야토균(Francisella tularensis) 다당류, 탄저균(Bacillus anthracis) 다당류, 인플루엔자간균(Haemophilus influenzae) 다당류, 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 다당류, 살모넬라 종 다당류, 쉬겔라(Shigella) 다당류 또는 나이세리아 수막염균(Neisseria meningitidis) 다당류인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 30 항에 있어서, 상기 폐렴연쇄상구균 다당류는 캡슐 타입 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10A, 10B, 10F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11F, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B, 18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22F, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25A, 25F, 27, 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33B, 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F 또는 48인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 항원은 미생물 캡슐 중합체인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 33 항에 있어서, 상기 미생물 캡슐 중합체는 탄저균의 폴리-감마-D-글루타민산인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 제2항원을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물,
제 38 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 다중 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
다음의 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법: (ⅰ) 항원과 수송단백질의 혼합물을 제조하기 위하여 항원을 수송단백질과 혼합하는 단계 및; (ⅱ) 상기 혼합물에 상기 수송 단백질을 공유적으로 크로스링크시키는 링커를 투여하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 수송 단백질을 크로스링크시켜 수송 단백질 매트릭스를 형성하는 단계로써 상기 항원은 상기 수송 단백질 매트릭스에 포획되며, 상기 항원의 50% 이하가 백신 조성물 내에서 상기 수송단백질과 크로스링크 되는 것을 특징으로 하는 단계.
제 40 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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제 40 항에 있어서, 상기 백신 조성물 내에서 상기 항원 대 상기 수송단백질의 몰 비율은 1:10 내지 10:1인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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제 40 항에 있어서, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡신(diphtheria toxin), 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid), 데타누스 톡신(tetanus toxin), 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid), 녹농균 엑소톡신 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A), 콜레라 톡신 B 서브유닛, 테타누스 톡신 절편 C, 박테리아 편모, 뉴몰리신(Pneumolysin), 나이세리아 수막염균(Neisseria menningitidi)의 외막단백질, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Hcp1(haemolysin co-regulated protein 1) 단백질, 대장균의 이열성 엔테로톡신(enterotoxin), 쉬가-유사 톡신(shiga-like toxin), 인간 LTB(lymphotoxin-beta) 단백질, 리스테리올리신 O, 총박테리아 세포의 단백질 추출물, 탄저균(Bacillus anthracis)의 방어항원에 대한 DNI(dominant negative mutant) 또는 대장균 베타-갈락토시다아제인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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제 40 항에 있어서, 상기 항원은 다당류, 폴리알코올 또는 폴리 아미노산인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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제 64 항에 있어서, 상기 다당류는 폐렴연쇄상구균 다당류, 야토균 다당류, 탄저균 다당류, 인플루엔자간균 다당류, 살모넬라 티피 다당류, 살모넬라 종 다당류, 쉬겔라 다당류 또는 나이세리아 수막염균 다당류인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 66 항에 있어서, 상기 폐렴연쇄상구균 다당류는 캡슐 타입 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10A, 10B, 10F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11F, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B, 18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22F, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25A, 25F, 27, 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33B, 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F 또는 48인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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제 40 항에 있어서, 상기 항원은 미생물 캡슐 중합체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 69 항에 있어서, 상기 미생물 캡슐 중합체는 탄저균의 폴리-감마-D-글루타민산인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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제 40 항에 있어서, 상기 방법은 제 2 항원을 포획시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 74 항에 있어서, 상기 방법은 다중 항원을 수송 단백질에 포획시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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제 40 항에 있어서, 상기 공유적 크로스링크는 이중작용기성 크로스링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 85 항에 있어서, 상기 이중작용기성 크로스링커는 글루타르알데히드, 비스[설포닐숙시니미딜]수베레이트 또는 디메틸아디피미데이트인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 40 항에 있어서, 상기 링커는 화학식
의 화합물이고, 상기 화학식에서 Rn은 탄소수 1 내지 12의 선형 또는 분쇄형 알킬, 1 내지 12개 원자의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2 내지 12의 선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2 내지 12의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5 내지 10의 방향족 잔기, 3 내지 10개의 원자의 고리형 시스템 또는 -(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂-(상기 q는 1 내지 4 또는 두 개의 알데히드기를 연결하는 화학결합이다)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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제 1 항의 백신 조성물을 포함하는 대상체에서의 항원에 대한 면역반응 유도용 조성물.
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제 105 항에 있어서, 상기 면역반응의 유도는 상기 대상체이 감염성 물질에 의한 감염을 막거나 감소시키기에 충분한 정도인 것을 특징으로 하는 조성물.
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