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KR101445265B1 - 히알루론산-핵산 접합체 및 이를 포함하는 핵산 전달용 조성물 - Google Patents

히알루론산-핵산 접합체 및 이를 포함하는 핵산 전달용 조성물 Download PDF

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KR101445265B1
KR101445265B1 KR1020120103521A KR20120103521A KR101445265B1 KR 101445265 B1 KR101445265 B1 KR 101445265B1 KR 1020120103521 A KR1020120103521 A KR 1020120103521A KR 20120103521 A KR20120103521 A KR 20120103521A KR 101445265 B1 KR101445265 B1 KR 101445265B1
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양정아
공원호
이민영
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Abstract

체내 핵산 전달체 개발을 위한 히알루론산-핵산 접합체 및 이를 이용한 핵산 전달 시스템 개발에 관한 것이다. 구체적으로, 히알루론산과 알킬렌디아민과의 접합체와 핵산이 이황화 결합으로 연결되어 있는 히알루론산-핵산 접합체; 상기 히알루론산-핵산 접합체를 유효성분으로 포함하는 핵산 전달체 조성물; 상기 히알루론산-핵산 접합체의 제조 방법; 및 상기 히알루론산-핵산 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 핵산의 체내 전달 방법이 제공된다.

Description

히알루론산-핵산 접합체 및 이를 포함하는 핵산 전달용 조성물{Hyaluronic acid-nucleic acid conjugate and composition for nucleic acid delivery containing the same}
본 발명은 체내 핵산 전달체 개발을 위한 히알루론산-핵산 접합체 및 이를 이용한 핵산 전달 시스템 개발에 관한 것이다. 구체적으로, 히알루론산과 알킬렌디아민과의 접합체와 핵산이 이황화 결합으로 연결되어 있는 히알루론산-핵산 접합체; 상기 히알루론산-핵산 접합체를 유효성분으로 포함하는 핵산 전달체 조성물; 상기 히알루론산-핵산 접합체의 제조 방법; 및 상기 히알루론산-핵산 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 핵산의 체내 전달 방법과 관련된 것이다.
RNA 간섭현상이 1998년 Fire와 Mello에 의해 발견된 이래 siRNA를 활용하여 인간의 질환치료에 활용하고자 하는 노력이 지속되고 있다. 합성 가능한 짧은 길이의 RNA가 세포 내에서 특정 유전자의 발현을 억제할 수 있다는 사실에 기반하여 새로운 차원의 치료제로서 많은 주목을 받고 있다. 그러나 siRNA는 매우 유력한 약물 후보임에도 불구하고 치료제로서 개발하기에는 전달 방법이 큰 장애물로서 존재하고 있다. 음전하를 띄는 RNA 분자는 역시 음전하를 띄고 있는 세포막을 통과하기가 어렵기 때문에 세포 내 전달력이 매우 떨어지고, 또한 체내로 유입된 RNA 분자는 분해효소에 의하여 빠르게 분해된다. 이를 극복하기 위하여 바이러스를 이용하여 전달체를 개발하거나, 양이온성 지질계 담체 또는 양이온성 고분자를 이용한 접합체 등을 이용하여 핵산 전달체를 개발하는 연구가 활발히 이루어져 왔다. 바이러스를 이용한 전달체의 경우 매우 높은 전달 효율을 보이지만, 바이러스 사용시의 안전성 문제로 사람에의 적용이 매우 제한된다는 단점이 있다.
따라서, 보다 안전한 대안으로서 양이온성 고분자나 지질체를 이용한 전달체 개발이 주목 받고 있다. 양이온성 물질들은 음전하를 띄고 있는 핵산 물질과 전하 상보성을 통한 접합체 (polyplex)를 형성하여 siRNA를 분해 효소들로부터 보호하고, 세포 내 전달을 용이하게 하는 것은 물론, 세포 내 엔도좀 (endosome)에서 pH 완충작용을 바탕으로 siRNA를 세포질로 전달하는 것이 보고된 바 있다. 그러나 양이온성 고분자는 세포의 괴사 (necrosis) 및 자살 (apoptosis)를 유도할 뿐만 아니라 체내로 전달 될 경우 세포응집을 야기하고 혈액단백질과의 결합에 의하여 전달 효율이 약화된다는 단점이 알려져 있다. 이를 극복하기 위하여 저분자량의 양이온성 고분자나 선형 고분자를 이용한 전달체 개발이 고려되고 있지만. 낮은 전하량으로 인하여 siRNA와의 결합이 용이하지 않으며, 전달 효율 또한 약하기 때문에 전달체로 개발되기에는 한계가 있다.
따라서 본 발명은 핵산과 양이온성 고분자와의 접합체 형성을 용이하게 하고, 접합체의 독성을 약화시킴으로써 보다 효율적인 핵산 전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로, 일 예는 히알루론산(HA)과 알킬렌디아민과의 접합체를 제공한다.
다른 예는 상기 히알루론산(HA)과 알킬렌디아민과의 접합체와 핵산이 이황화 결합으로 연결되어 있는 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체를 제공한다.
다른 예는 상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체를 유효성분으로 포함하는 핵산 전달체 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 핵산의 체내 전달 방법을 제공한다.
본 발명은 기존의 고분자를 이용한 핵산 전달체의 문제점으로 지적 받아 왔던 양이온성 고분자의 높은 독성 및 낮은 전달 효율을 해결하기 위한 것이다. 구체적으로, 핵산 전달체로 널리 알려져 있는 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine, PEI)의 경우 가지형 고분자의 경우엔 높은 전달 효율을 보이는 대신 강한 양이온성으로 인해 세포 및 체내 실험에서 높은 독성을 보인다고 보고되고 있다. 대안으로서 선형 타입이나 저분자 타입이 제시되고 있지만, 독성이 약한 대신 핵산 물질과의 접합체 형성이 용이하지 않고 전달 효율이 매우 약하다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 핵산 물질에 생체 적합성이 뛰어난 음이온성 고분자인 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA)을 도입하여 음이온성 강화를 통해 접합체 형성을 용이하게 하고, 높은 양전하를 중화하여 세포 및 체내 독성을 감소시키고자 연구를 거듭하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 예는 히알루론산과 알킬렌디아민과의 접합체(히알루론산-알킬렌디아민 접합체)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 히알루론산-알킬렌디아민 접합체는 히알루론산 및 알킬렌디아민을 포함하고, 상기 알킬렌디아민의 두 개의 아민기 중 하나가 히알루론산의 카르복시기에 연결된 것일 수 있다. 상기 히알루론산-알킬렌디아민 접합체는 핵산과 이황화결합을 통하여 연결되어 안정적으로 핵산을 체내에 전달할 수 있는 이점을 가지므로, 핵산 전달 용도로 유용하다. 또한, 히알루론산과 알킬렌디아민과의 접합체는 히알루론산과 알킬렌디아민의 반응시간을 조절함으로써 이들의 치환율 (즉, 히알루론산의 카르복실기 중에서 알킬렌디아민과 반응한 카르복시기의 비율)을 용이하게 조절할 수 있다는 이점도 갖는다 (실시예 <1-1> 참조). 구체적으로, 히알루론산과 알킬렌디아민의 반응시간과 치환률이 비례하므로, 높은 치환률을 구현하고자 하는 경우 반응 시간을 길게 하고, 낮은 치환률을 구현하고자 하는 경우에는 반응 시간을 짧게 조절할 수 있다. 히알루론산이 체내에 있는 수용체에 결합할 때 치환율에 의해 결합력이 결정되기 때문에, 생체물질 전달에 있어서 히알루론산의 치환률이 중요할 수 있다. 예컨대, 히알루론산의 치환률이 높아질수록 히알루론산이 체내에서 수용체와 결합하지 않고 오랜 시간 동안 체내를 순환하는데 비해, 히알루론산의 치환률이 낮을수록 히알루론산이 수용체에 결합하는 경향이 강해지기 때문에 수용체가 많이 발현하는 조직으로 표적지향형 전달이 가능해지므로, 히알루론산의 치환률을 적절히 조절함으로써 원하는 특징의 구현이 가능하다.
다른 예는 히알루론산과 알킬렌디아민과의 접합체와 핵산이 이황화 결합으로 연결되어 있는 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체와 관련된 것이다. 보다 구체적으로 상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체는 히알루론산, 알킬렌디아민 및 티올기가 도입된 핵산을 포함하고, 상기 알킬렌디아민의 두 개의 아민기 중 하나는 히알루론산의 카르복시기에 연결되고, 나머지 하나의 아민기는 핵산에 도입된 티올기와 이황화 결합을 통하여 연결된 것일 수 있다. 상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체는 핵산의 체내 전달용 조성물로서 유용하다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상기 히알루론산(hyaluronic acid; HA)은 음이온성 뮤코다당류로서, 동물 유래의 유리체, 관절액, 연골, 피부 등에 존재하는 생체 유래 물질이며, 다음의 화학식 1의 구조의 단위체로 이루어진 고분자이다.
Figure 112012075634518-pat00001
본 발명에서 사용 가능한 히알루론산의 분자량에는 제한이 없으나, 중량평균분자량 범위가 약 10,000 내지 3,000,000 사이인 것이 좋다.
본 발명에서 사용되는 알킬렌디아민은 특별히 제한되는 것은 아니지만 탄소수 1 내지 10, 구체적으로 4 내지 8인 것이 좋으며(화학식 2), 예컨대 디아미노부탄(1,4-diaminobutane, DAB), 헥사메틸렌디아민 (Hexamethylenediamine; HMDA) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다:
Figure 112012075634518-pat00002
(m= 1 내지 10의 정수, 구체적으로 4 내지 8의 정수)
알킬렌디아민의 두 개의 아민기 중에서 하나가 히알루론산의 카르복시기에 연결되어 아래의 화학식 3와 같은 구조의 접합체를 형성한다.
Figure 112012075634518-pat00003
상기 식 중, m은 1 내지 10의 정수, 구체적으로 4 내지 8의 정수이고, p 및 q는 각각 독립적으로 16 내지 2500에서 선택된 정수이다.
상기와 같은 히알루론산-알킬렌디아민 접합체에 핵산이 결합된 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체가 제공된다. 이 때 핵산은 히알루론산-알킬렌디아민 접합체의 아민기와 이황화결합을 통하여 연결된 것을 특징으로 한다. 이황화 결합은 세포질 내로 전달되었을 때 분해가 용이하기 때문에, 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체가 이황화결합을 통하여 연결됨으로써, 핵산(예컨대, siRNA)의 방출에 유리할 수 있다.
즉, 알킬렌디아민의 두 개의 아민기 중에서 하나는 히알루론산의 카르복시기와 결합되어 있고, 나머지 하나는 핵산과 이황화 결합을 통하여 연결됨으로써, 히알루론산과 핵산은 알킬렌디아민을 통하여 접합체를 이루게 된다.
이와 같이 히알루론산이 알킬렌디아민을 통하여 접합체를 생성함으로써, 알킬렌디아민을 통하지 않는 경우와 비교하여, 접합체의 생성률이 현저하게 높아지는 이점이 있다. 예컨대, 히알루론산이 알킬렌디아민을 통하여 접합체를 생성하는 경우의 접합체 생성률은 약 60% 이상, 예컨대, 약 60-70% 정도일 수 있으나, 알킬렌디아민을 통하지 않는 경우의 히알루론산과 핵산과의 접합체 생성률은 약 20% 이하, 예컨대 10-20% 정도에 불과하다 (실험예 1 및 도 4a 및 4b 참조).
이때, 상기 이황화 결합은 티올기가 도입된 핵산과 상기 히알루론산-알킬렌디아민 접합체가 티올기를 갖는 화합물, 예컨대, 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate; SPDP) 등의 화합물의 존재하에서 반응하여 핵산과 알킬렌디아민 사이에 형성된 것일 수 있다. 이 때 티올기가 도입되는 핵산의 부위는 크게 제한이 없으나, siRNA의 효율을 저해시키는 안티센스 가닥의 5'-OH또는 인산 말단(phosphate terminus) 등의 부위를 제외한 부위에 도입되는 것이 좋고, 구체적으로 3' 말단, 보가 구체적으로 센스가닥의 3' 말단에 도입되는 것이 좋다.
상기 핵산은 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 또는 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 모든 종류의 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 핵산일 수 있으며, 구체적으로는 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산은 이황화 결합 도입을 위하여, 예컨대 3' 말단에, 티올기가 도입된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 핵산은 센스 가닥의 3' 말단에 티올기가 도입된 핵산, 예컨대 siRNA일 수 있다.
상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체에서, 히알루론산 (예컨대, 분자량 100kDa) 한 분자당 접합된 siRNA의 개수는 2개 내지 15개, 구체적으로 2 내지 11개일 수 있다 (도 7b 참조).
상기 핵산에의 티올기의 도입은 당업계에 널리 알려진 통상적인 방법으로 수행 가능하다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체는 다음의 화학식 4의 구조를 갖는 것일 수 있다 (히알루론산-이중가닥 핵산 (예컨대 siRNA) 접합체).
Figure 112012075634518-pat00004
상기 식 중, m은 1 내지 10의 정수, 구체적으로 4 내지 8의 정수이고, p 및 q는 각각 독립적으로 16 내지 2500에서 선택된 정수이다.
예컨대, 알킬렌디아민이 디아미노부탄인 경우, 상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체는 다음의 화학식 5의 구조를 갖는 것일 수 있다:
Figure 112012075634518-pat00005
특히, 간 조직 내에 히알루론산의 수용체가 많기 때문에 체내 전달시 간 조직 특이적 전달에 특별히 유리하다.
상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체는 정전기적 결합에 의한 핵산과의 결합에 기여할 수 있는 양이온성 고분자를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민(PEI) (예컨대, 선형 폴리에틸렌이민, 분지형 폴리에틸렌이민), 폴리(L-라이신)[poly(L-lysine)], 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 키토산(chitosan), 폴리 양이온성 덴드리머(poly cationic dendrimers; 예컨대, 폴리아미도아민 덴드리머(Polyamidoamine Dendrimers), 폴리(프로필렌이민) 덴드리머(Poly(propylenimine) Dendrimers), 폴리(L-라이신) 덴드리머(Poly(L-lysine) Dendrimers) 등), 양이온성 펩타이드(cationic peptides; 예컨대, TAT 펩타이드, 안테나페디아 호메오도메인 펩타이드(Antennapedia Homeodomain Peptide), MPG 펩타이드, 트랜스포탄 펩타이드(Transportan Peptide), 프로타민(protamine) 등), 퀀텀닷(quantum dot), 금나노입자(gold nanoparticle), 실리카 나노입자(silica nanoparticle), 탄소유도체 나노입자(carbon derivative nanopartilces; 예컨대, 탄소나노튜브(carbon nanotube), 그래핀(grapheme), 카본닷(carbon dot) 등), 고형리피드 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 양이온성 고분자는 선형 폴리에틸렌이민 (linear PEI)일 수 있다. 상기 양이온선 고분자 (예컨대, 선형 폴리에틸렌이민)의 평균 분자량은 특별한 제한은 없으나 약 1kD 내지 50kD, 구체적으로 약 10kD 내지 25kD인 것이 좋다. 이와 같은 양이온성 고분자를 추가로 포함함으로써, 접합체 형성시 입자의 크기를 줄이고, 핵산의 엔도좀 탈출을 도와, 핵산의 전달 효율을 높일 수 있다.
상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체는 핵산에 히알루론산을 이황화결합을 통하여 접합시킴으로써, 다음과 같은 이점을 얻을 수 있다. 핵산, 특히 siRNA는 음이온성이 약하고 구조가 단단하여 양이온성 고분자와 접합체를 이룰 때 불리한 점이 있는데, 음이온성이 강한 히알루론산을 접합함으로써 보다 용이하게 접합체를 형성할 수 있다. 또한, 히알루론산은 생체내 또는 세포내 환경에서 핵산 분해 효소 (예컨대, RNase)에 의한 공격으로부터 핵산(예컨대, siRNA)을 보호하는 역할을 수행하여, 핵산 접합체의 체내에서 안전성을 증진시킨다. 또한, 선형 폴리에틸렌이민 등의 양이온성 고분자를 추가로 포함하는 경우, 표면 전하가 낮아져서, 체내에서의 비특이적인 상호작용 (non-specific interaction)을 감소시킬 수 있다.
다른 예는 상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체를 유효성분으로 포함하는 핵산 전달체 조성물과 관련된 것이다. 상기한 바와 같이, 상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체는 생체 적합성이 뛰어난 음이온성 고분자인 히알루론산을 포함함으로써 음이온성 강화를 통하여 알킬렌디아민의 높은 양전하를 중화하여 세포 및 체내 독성이 감소되고 체내 전달 효율이 높은 것을 특징으로 한다. 또한, 히알루론산-알킬렌디아민 접합체에 단순히 핵산을 혼합한 형태가 아니고, 상기 접합체에 핵산을 이황화 결합을 통하여 연결시킨 접합체 형태를 가짐으로써, 접합체 형성에 보다 유리하고, 핵산 분해 효소에 의한 핵산 분해를 감소시켜서 안전성이 증대되고, 체내 비특이적 상호작용이 감소되는 등의 이점을 갖는다.
핵산 전달체 조성물은 포유류, 예컨대 인간에게 투여될 수 있으며, 투여 목적에 따라서 혈관, 근육, 피하, 경구, 뼈, 경피, 국소 조직 등의 투여 경로를 통하여 적절하게 투여될 수 있고, 투여 형태, 투여 목적, 투여 대상 등에 따라서 용액, 현탁 주사제, 정제 또는 캡슐제 등의 다양한 형태로 적절하게 제형화될 수 있다.
또 다른 예는 상기 히알루론산-알킬렌디아민 접합체의 제조 방법과 관련된 것이다. 구체적으로, 상기 방법은 히알루론산의 카르복시기에 알킬렌디아민의 두 개의 아민기 중 하나의 아민기를 결합시켜 히알루론산-알킬렌디아민 접합체를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 예는 상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체의 제조 방법과 관련된 것이다.
구체적으로, 상기 방법은
히알루론산의 카르복시기에 알킬렌디아민의 두 개의 아민기 중 하나의 아민기를 결합시켜 히알루론산-알킬렌디아민 접합체를 형성하는 단계;
3' 말단에 티올기가 도입된 핵산을 준비하는 단계; 및
상기 형성된 히알루론산-알킬렌디아민 접합체의 나머지 아민기와 상기 핵산의 3' 말단에 도입된 티올기 간 이황화 결합을 형성하여, 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체를 생성하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 히알루론산-알킬렌디아민 접합체를 형성하는 단계는 예컨대, 히알루론산에 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)프로필]카르보디이미드(1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide, EDC)와 1-히드록시 벤트리아졸 모노하이드레이트(1-hydroxy bentriazole monohydrate, HOBt), N-히드록시설포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS) 및 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 첨가하여 히알루론산(HA)의 카르복실기에 알킬렌디아민을 결합시켜 히알루론산-알킬렌디아민 접합체를 형성시키는 것일 수 있다. 이 때, HOBt, sulfo-NHS, 및 NHS로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 EDC의 첨가량은 각각 히알루론산의 카르복실기 대비 당량비 기준으로 1:4 내지 1:20 (히알루론산의 카르복시기 당량: HOBt, sulfo-NHS, 및 NHS로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 당량 또는EDC의 당량)인 범위로 할 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 히알루론산-알킬렌디아민 접합체 형성 과정은 반응 시간을 조절함으로써 치환률의 조절이 용이하다는 이점을 갖기 때문에, 원하는 치환률을 갖는 접합체의 제조가 용이하다. 예컨대, 치환율이 높은 접합체 생성을 원하는 경우에는 반응시간을 길게 조절할 수 있고, 치환율이 낮은 접합체 생성을 원하는 경우에는 반응시간을 짧게 조절할 수 있다. 예컨대, 약 3분 내지 약 48시간 범위에서 반응 시간 조절이 가능하며, 반응 후 NaOH 1M 수용액을 이용하여 pH 7로 맞추고 이후 여과 과정을 통해 반응하지 않은 시료들을 제거 하여 적정한 치환율을 얻을 수 있다.
상기 티올기가 도입된 핵산을 준비하는 단계는 당업계에 공지된 통상의 방법에 의하여 핵산의 3' 말단에 티올기를 도입하거나 티올기가 도입된 핵산을 입수하여 준비함으로써 수행될 수 있으며, 히알루론산-알킬렌디아민 접합체를 형성하는 단계 이전, 이후 또는 동시에 수행 가능하다.
상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체를 생성 단계에서, 상기 합성된 히알루론산-알킬렌디아민 접합체(예컨대, HA-DAB)의 아민기와 티올기가 도입된 핵산(예컨대, 센스 가닥의 3' 말단에 티올기가 도입된 siRNA)에 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate; SPDP) 등을 상기 히알루론산-알킬렌디아민 접합체의 아민기 대비 1 내지 3몰배, 구체적으로 약 2몰배의 양으로 첨가하고 반응시켜, 피리딜기(pyridyl group)를 도입하고, 티올-교환 반응(thiol-exchange reaction)을 통하여 히알루론산-알킬렌디아민 접합체의 아민기와 핵산의 티올기를 결합시켜, 이황화 결합이 포함된 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체를 생성한다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 방법으로 알킬렌디아민을 통하여 히알루론산과 핵산 접합체를 형성하는 경우, 접합체 생성률이 약 60% 이상, 예컨대 60 내지 70% 정도로, 기존의 알킬렌디아민을 사용하지 않는 경우의 접합체 생성률이 약 20% 이하인 것과 비교하여, 현저하게 우수한 접합체 생성률을 달성할 수 있게 된다.
상기 방법은 생성된 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체에 저독성의 양이온성 고분자인 선형 폴리에틸렌이민 (linear PEI; 예컨대 평균분자량 10kD 내지 25kD)를 첨가하여 접합체를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예는 상기 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 핵산의 체내 전달 방법과 관련된 것이다.
상기 환자는 포유류, 예컨대 인간일 수 있으며, 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체에 포함된 핵산의 투여를 필요로 하는 환자일 수 있다. 투여 경로는 혈관, 근육, 피하, 경구, 뼈, 경피, 국소 조직 등을 통할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 음전하를 띄고 생체 내 적합성이 뛰어난 히알루론산을 핵산에 도입하여, 핵산의 체내 안정성을 향상 시키고 양이온성 고분자와의 접합체 형성을 좀 더 용이하게 하여, 핵산의 전달 효율을 향상시키는 것과 관련된 것이다. 또한 히알루론산은 체내로 전달했을 때 간 표적 지향성을 가지고 있기 때문에, 이를 이용한 간 표적 지향형 핵산 전달체를 개발하는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 핵산 전달용 고분자의 제조방법 및 상기 접합체를 포함하는 핵산 전달용 조성물은 기존의 기술에 비하여 핵산을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있고, 상대적으로 독성이 적은 양이온성 고분자를 활용할 수 있기 때문에 독성을 효과적으로 감소시킬 수 있으며, 간 표적 지향성 및 피부 투과성 등의 뛰어난 생체 적합 특성을 지니고 있는 히알루론산을 도입하여 다양한 핵산 전달 방법에 적용해 볼 수 있다.
도 1은 히알루론산과 알킬렌디아민을 반응시켜 히알루론산에 아민기를 도입하는 합성 방법을 표현한 것이다.
도 2는 HA-DAB가 합성되었는지 여부를 1H NMR을 이용하여 분석한 결과이다.
도 3은 HA-DAB에 SPDP를 이용하여 이황화 결합이 포함된 HA-핵산 접합체를 합성하는 방법을 표현한 것이다.
도 4a 및 4b는 HA-DAB-siRNA(4a) 또는 HA-siRNA(4b)가 합성되었는지 여부를 HPLC를 이용하여 분석한 결과이다.
도 5a 내지 5d는 HA-DAB-siRNA가 환원제에 의한 분리 여부를 아가로스 젤 전기영동 실험을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 HA-DAB-siRNA의 독성을 MDA-MB-231 세포주를 이용해 MTT로 확인한 결과이다.
도 7a와 7b는 루시퍼라아제를 발현하는 MDA-MB-231 세포에 다양한 비율의 HA-DAB-siRNA/LPEI 복합체를 처리하여 루시퍼라아제 발현을 측정한 결과를 보여준다.
도 8a와 8b는 HA-DAB-siRNA/lPEI 입자의 입자의 크기(8a)와 표면 전하(8b)를 각각 보여준다.
도 9는 MDA-MB-231 세포에 cellular uptake 저해제와 HA-DAB-siRNA 접합체를 처리한 후의 형광현미경 관찰 결과를 보여준다.
도 10은 MDA-MB-231 세포에 cellular uptake 저해제와 HA-DAB-siRNA 접합체를 처리한 후의 루시퍼라아제 활성을 측정한 결과를 보여준다.
도 11은 HA-DAB-siNRA 접합체의 간조직에서의 타겟 유전자 억제 활성을 보여주는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > HA 와 siRNA 의 이황화 결합에 의한 HA - siRNA 의 합성 방법
<1-1> HA - DAB 합성
HA-siRNA 접합체 개발을 위하여 HA-DAB(1,4-diaminobutane)를 합성하는 방법을 도 1에 간략히 도시하였다. 구체적으로, 분자량 100kDa인 HA(100g)의 카르복실기(carboxyl group)를 pH 6.0에서 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)-프로필]카르보디이민(1-ethyl-3- [3-(dimethylamino)-propyl]carbodiimide, EDC) 및 1-히드록시 벤트리아졸 모노하이드레이트(1-hydroxy bentriazole monohydrate, HOBt)로 활성화 시킨 다음, 1,4-디아미노부탄(1,4-diaminobutane, DAB)을 첨가하여 HA-DAB를 합성하였다. 이 때, EDC, HOBt, 및 DAB 는 상기 HA 단위체 (M.W. 401) 대비 각각 4배, 4배, 및 10배씩 (이상 몰 기준) 첨가하였다. 이때 DAB는 HA의 카르복실기에 대하여 4몰배 이상의 과량으로 처리하여 HA간의 크로스링크가 일어나지 않게 하였다.
이 때 반응 시간을 1시간, 6시간, 24시간으로 다양하게 하여 서로 다른 치환율을 가진 합성물을 수득하였다. 상기와 같이 수득된 합성물을 여과 튜브(cut off 10kDa)를 이용하여 여과 정제하여 HA-DAB를 제조하였다. 상기와 같이 HA-DAB가 합성되었는지 여부를 1H NMR를 이용하여 확인하고 그 결과를 도 2에 기재하였다. 상기 도 2에 기재된 바와 같이, 1H NMR 결과에서 HA-DAB의 치환율(NaOH 1M 수용액을 이용하여 pH 7로 맞추고 측정)은 HA 특성 피크 영역 (1.9ppm)과 DAB 특성 피크 (1.6ppm)를 비교함으로써 얻을 수 있다. 1시간, 6시간, 및 24시간으로 반응시켰을 때의 치환율은 각각 19.2%, 37.8%, 및 43.3 %로 얻어졌다.
<1-2> 이황화 결합이 도입된 HA - DAB - siRNA 합성
도 3에 도시된 과정을 통하여, 이황화 결합이 도입된 HA-siRNA 접합체를 합성하였다. 구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 합성된 HA-DAB (20 mg; 4.8 x 10- 5몰)와 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate; SPDP) (5.6 mg; 1.8 x 10- 5몰) 를 섞고 반응시켜 HA 체인에 피리딜기(pyridyl group)를 도입하고 여과 튜브 (M.W.C.O 100kDa)를 이용해 여과 정제하였다. 정제된 HA-DAB-SPDP는 TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine)를 처리하고 343nm에서 흡광도를 측정하여 피리딜기의 농도를 계산하였다 (피리미딜기 농도: 34 mM).
정량된 HA-DAB-SPDP 용액에 센스 가닥 (sense strand)의 3' 말단에 티올기(thiol group)가 도입된 anti-luciferase siRNA (sense strand: CCACACUAUUUAGCUUCUUdTdT (서열번호 1-dTdT); antisense strand: AAGAAGCUAAAUAGUGUGGdTdTdT (서열번호 2-dTdTdT))을 상기 피리미딜기 농도의 0.2 몰 배에서 1 배의 다양한 비율로 첨가하여 이황화 결합이 포함된 HA-DAB-siRNA 접합체를 합성하였다. 이 때 합성된 HA-DAB-siRNA는 HA 100kDa 한 분자당 접합된 siRNA의 개수를 2개에서 15개 사이로 조절할 수 있다.
< 실험예 1> HA - DAB - siRNA 접합체 확인
상기 실시예 <1-2>에서 합성된 HA-DAB-siRNA 접합체의 생성을 확인하기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하였다. 상기 HPLC 조건은 superdex 200 10/300 GL (GE health) 컬럼을 사용하였고 이동상은 pH 7.0 50 mM 포스페이트 버퍼 (phosphate buffer), 흐름 속도는 0.5 ml/min를 사용했고 210 nm와 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 4a에 기재하였고, 결과를 바탕으로 합성물을 분리 정제하였다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, HA-DAB-siRNA 접합체 생성률(반응률)은 약 64%인 것으로 확인되었다. 반면, DAB를 사용하지 않고, SPDP 대신에 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드(3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide, PDPH)를 사용하여 합성된 HA-siRNA 접합체의 260nm에서의 흡광도 측정 결과를 도 4b에 나타내었으며, 도 4b로부터 계산되는 바로서, HA-siRNA 접합체의 생성률은 약 12% 수준이었다.
상기 접합체 생성률(반응률)은 다음의 식으로 계산하였다:
반응률(%) = {(접합체 생성에 소요된 siRNA 수준)/(반응 초기에 첨가한 siRNA 수준)}X100
또한 분리 정제된 합성물은 아가로스 젤 전기영동을 통해 합성 여부 및 환원제(TCEP)에 의한 분해 여부를 확인하여, 그 결과를 도 5a 내지 5d에 기재하였다.
도 5a 내지 5d는 두 가지 다른 cross linker로 합성된 HA-DAB-siRNA 접합체를 아가로즈 전기영동을 통해 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 5a에서, HA-ss-siRNA는 HA와 siRNA 사이에 이황화결합 (-ss-)이 포함된 접합체를 의미하고, HA-siRNA는 이황화결합이 아닌 일반적인 공유결합으로 연결되어 있는 접합체(대조군)를 의미한다. 오른쪽 두 컬럼에서 보는 바와 같이, 환원제인 TCEP를 처리했을 때 이황화결합이 포함된 접합체에서는 siRNA가 분리되어 아래 부분에 밴드가 나타나는데 비하여, 대조군에서는 siRNA가 분리되지 못하고 그대로 윗부분에 남아 있는 것을 확인할 수 있다.
또한 도 5b 내지 5d는 HA-DAB-siRNA 접합체의 안전성을 평가하기 위하여 HA-DAB-siRNA 접합체에 FBS를 첨가하여 시간별로 아가로즈 전기영동을 통해 남아있는 siRNA의 양을 확인하였다 (도 5b 및 도c에서 HA-siRNA conjugate는 HA-DAB-siRNA 접합체를 의미함). 그 결과 HA-DAB-siRNA 접합체는 HA-DAB-siRNA 접합하지 않은 siRNA(naked siRNA)에 비해 오랜 시간 동안 분해되지 않고 남아있는 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 2> HA - DAB - siRNA / lPEI 입자 특성 평가
HA-DAB-siRNA/lPEI 입자의 특성을 평가하기 위하여, 상기 제조된 HA-DAB-siRNA (siRNA 기준 1 nmol에 해당하는 양)과 다양한 N/P ratio 의 lPEI(선형 폴리에틸렌이민; 분자량 25 kDa)를 혼합하여 접합체를 만들고, 이를 PBS 1ml에 희석하고, DLS analyzer(Zetasizer Nano, Malvern Instrument Co., UK)를 이용해 입자의 크기와 표면 전하를 측정하여 각각 도 8a (입자 크기)와 8b(표면 전하)에 각각 나타내었다.
도 8a는 다양한 N/P 비율로 lPEI와 복합체를 형성했을 때 입자의 크기를 측정한 결과로서, siRNA/lPEI 복합체의 경우 복합체가 밀도 있게 형성되지 못하여 크기가 크지만, HA-DAB-siRNA/lPEI 복합체의 경우에는 HA의 음전하성과 구조적 유연성에 기반하여 밀도 있는 복합체가 만들어지기 때문에 크기가 상대적으로 작게 관찰되고 있다. 도 8b는 다양한 N/P 비율에서의 표면 전하 측정 결과를 보여주는 것으로, siRNA/lPEI가 강한 양전하를 띄어 체내에서 혈액 성분들과 비특이적 상호작용에 의해 전달 효율이 감소하고 강한 독성을 띌 것으로 예상되는데 반하여, HA-DAB-siRNA/lPEI는 음전하를 띄고 있어 이러한 문제점들을 극복할 수 있다.
< 실험예 3> HA - DAB - siRNA 세포 독성 및 유전자 억제 효율 평가
HA-DAB-siRNA 접합체의 독성을 평가하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 구체적으로 10%(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum)과 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지(GIBCO-BRL, NY, 미국)에서 배양한 MDA-MB-231 세포(CELL BIOLABS, INC, CA, US / ESM000113)를 96-웰 플레이트에 5x103 cells/well 의 양으로 분주하여, 플레이트의 약 70% 정도로 세포가 자랄 때까지 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양한 다음, 각 웰에 상기 실시예 <1-2>에서 제조된 HA-DAB-siRNA를 다양한 농도로 주입하여 24시간 동안 배양한 후 MTT assay로 세포 독성을 평가하고 그 결과(세포 생존률)를 도 6에 기재하였다. 도 6에서 HA-DAB-siRNA_High로 표시된 것은 치환률이 38%인 것을, HA-DAB-siRNA_Low로 표시된 것은 치환율이 19%인 것을 각각 의미한다. 도 6에서 확인되는 바와 같이, DAB 치환율과 상관없이 HA-DAB-siRNA 접합체는 세포독성을 보이지 않는다.
HA-DAB-siRNA 접합체의 유전자 억제 효율을 평가하기 위하여 독성이 적은 선형 폴리에틸렌이민과 접합체를 형성하고 이를 세포에 처리하여 유전자의 발현 정도를 측정하였다. 구체적으로 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)과 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지(GIBCO-BRL, NY, 미국)에서 배양한 루시퍼라제(luciferase) 발현 MDA-MB-231 세포 (CELL BIOLABS, INC, CA, US / ESM000113)를 96-웰 플레이트에 5x103 cells/well의 양으로 분주하여, 플레이트의 약 70% 정도로 세포가 자랄 때까지 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
접합체를 형성하기 위하여 상기 실시예 <1-2>에서 제작된 HA-DAB-siRNA 접합체와 선형 폴리에틸렌이민(25kD)을 다양한 비율로 150mM NaCl 용액에서 15분간 섞고 보관한 다음 이를 앞에서 준비된 세포에 처리하고 24시간 동안 추가적으로 배양하였다. 24시간 후에 cell lysis buffer (4M NaCl, 1M Tris-Cl(pH 7.5), 0.5M EDTA (pH 8.0), 1M NaF, 500mM NaVO3, 1M DTT, 100mM PMSF / 바이오프린스 코리아 (Bio Prince Korea Co., Ltd))를 처리하고 형광 루미노메타(Luminometer)를 사용하여 30 초간 루시페라제(luciferase) 활성을 측정하여 그 결과를 도 7a 및 7b에 나타내었다.
도 7a 및 7b에서 Control은 siRNA를 처리하지 않은 군을 의미한다. 도 7a에서, N/P ratio는 siRNA의 Phosphate 대비 선형 PEI의 아민그룹의 몰 수를 의미하고, HA-siRNA(SPDP)는 SPDP를 사용해서 링커(도 3 참조; 한쪽은 피리딜기고 다른 한쪽은 NHS기)를 통하여 이황화결합으로 siRNA를 연결한 접합체이고, HA-siRNA(EMCS; N-epsilon-Malemidocaproyl-oxysuccinimide ester)는 이황화결합이 포함되지 않은 링커(한쪽은 NHS 기가 있고 다른 한쪽에는 말레이미드(maleimide)기가 있어서 아민기와 티올기를 연결하는 링커)를 사용하여 이황화결합이 도입되지 않아서 세포 내에서 해리가 일어나지 않도록 제작한 대조군 접합체이다.
도 7a에서 확인되는 바와 같이, 이황화결합이 도입된 HA-siRNA(SPDP)의 루시퍼라아제의 억제 효율이 우수함을 알 수 있다.
도 7b는 HA의 하나의 체인당 결합된 siRNA의 개수를 다양하게 하여 그 각각의 유전자 억제 효율을 비교 관찰한 실험 결과이다. 도 7b에서, HA-siRNA_2, HA-siRNA_7, HA-siRNA_11은 각각 HA 체인에 붙어 있는 siRNA의 개수가 2개, 7개, 11개인 것을 의미하며, siRNA/Lipofectamine(Lipo)은 양성대조군으로서 siRNA에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)과 함께 복합체를 형성하여 위 실험과 같은 조건으로 처리한 군을 의미한다. 도 7b 에서 알 수 있는 바와 같이, 시험된 모든 경우에서 우수한 루시퍼라아제 억제 효율이 우수한 것으로 나타났으며, 특히 하나의 HA 체인에 결합된 siRNA 개수가 7개인 HA-siRNA_7을 이용하였을 때 가장 유전자 억제 효율이 높은 것으로 관찰되었다.
< 실험예 4> HA - DAB - siRNA / lPEI 입자의 세포 전달 메카니즘 확인
HA-DAB-siRNA/lPEI 입자의 세포 전달 메카니즘 확인하기 위하여, 센스 가닥의 5'이 cy3로 표지된 siRNA를 bioneer 사에서 구입하여 사용한 것을 제외하고 실험예 3에서와 같이 HA-DAB-siRNA 접합체와 선형 폴리에틸렌이민과의 접합체를 제작하고, 이를 세포에 처리하고 다양한 cellular uptake 저해제를 투여하였다. 보다 구체적으로 MDA-MB-231 세포(CELL BIOLABS, INC, CA, US / ESM000113) 2 x 105 개를 8 chamber slide glass에서 하루 동안 키우고, cellular uptake 저해제로서 클로로프로마진(Chloropromazine; 10 μg/mL; 시그마알드리치), 니스타틴(Nystatin; 50 μg/mL; 시그마알드리치), wortmannin(50 μg/mL; 시그마알드리치)를 각각 첨가한 배지(10% 우태아혈청(fetal bovine serum)과 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지(GIBCO-BRL, NY, 미국)로 교체한 다음, HA-DAB-siRNA/LPEI 복합체(siRNA 기준 농도0.5 nmol/ml)를 처리하여 2시간 동안 incubation 하였다. 이후 세포를 고정하고 공초첨 형광 현미경 (LSM 510, Carl-Zeiss)으로 관찰하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
또한 상기와 같이 각각의 저해제가 포함된 배지를 교체하고 이후 실험예 3의 방법으로 루시퍼라아제 활성을 확인하여 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 9 및 10에서 알 수 있는 바와 같이, clathrine mediated endocytosis를 저해하는 nystatin에 의해 가장 많이 세포 전달이 억제되는 것을 확인하였다. 이는 기존에 알려진 HA의 세포 전달 메커니즘과 일치하는 결과로서 이로서 HA-DAB-siRNA/lPEI가 HA와 같은 메커니즘으로 세포 내로 전달되는 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 5> HA - DAB - siRNA / lPEI 입자의 마우스 간 조직내 유전자 억제 효과 확인
HA-DAB-siNRA/lPEI접합체의 체내 유전자 억제 효율을 평가하기 위하여, siNRA로 다음의 Apolipoprotein B에 대한 siRNA를 사용한 것을 제외하고 상기 실시예 1-2에 기재된 발명과 동일한 방법으로 제작된 HA-DAB-siRNA와 선형 PEI의 접합체를 형성한 다음, 다양한 투여량으로 마우스(balb/c mouse, 6주령, 체중 25g; 포항공과대학교 동물실험실) 꼬리 정맥에 투여하였다.
siNRA against Apolipoprotein B
센스가닥; 5'-GUC AUC ACA CUG AAU ACC AAU dTdT-3' (서열번호 3-dTdT)
안티센스 가닥: 5'-AUU GGU AUU CAG UGU GAU GAC-3' (서열번호 4)
하루 후 간 조직을 적출하여 mRNA를 분리하고 이를 다음의 프라이머를 사용하여 다음의 조건으로 RT-PCR하여 정량 분석한 결과를 도 11에 나타내었다:
sense primer for ApoB: 5'-TTT TCC TCC CAG ATT TCA AGG-3' (서열번호 5)
antisense primer for ApoB: 5'-TCC AGC ATT GGT ATT CAG TGT G-3' (서열번호 6)
sense primer for GAPDH: 5'-CCT TCA TTG ACC TCA ACT AC-3' (서열번호 7)
antisense primer for GAPDH: 5'-GGA AGG CCA TGC CAG TGA GC-3' (서열번호 8)
PCR 조건: 95℃에서 5 분간 initial denaturation 후, 95℃에서 30 초 및 53℃에서 30 초 40 cycles 반복
도 11에 내타낸 바와 같이, 그 결과 주사한 siRNA의 양과 비례하여 간 조직 내 표적 유전자 (Apolipoprotein B)의 mRNA의 양이 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 대조군으로는 non-specific한 luciferase siRNA(상기 실시예 <1-2>에서 제작)를 사용하였다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Hyaluronic acid-nucleic acid conjugate and composition for nucleic acid delivery containing the same <130> DPP20123169KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of anti-luciferase siRNA <400> 1 ccacacuauu uagcuucuu 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of anti-luciferase siRNA <400> 2 aagaagcuaa auagugugg 19 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siNRA against Apolipoprotein B <400> 3 gucaucacac ugaauaccaa u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siNRA against Apolipoprotein B <400> 4 auugguauuc agugugauga c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for ApoB <400> 5 ttttcctccc agatttcaag g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for ApoB <400> 6 tccagcattg gtattcagtg tg 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for GAPDH <400> 7 ccttcattga cctcaactac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for GAPDH <400> 8 ggaaggccat gccagtgagc 20

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 히알루론산, 탄소수 1 내지 10의 알킬렌디아민 및 티올기가 도입된 핵산을 포함하고,
    상기 알킬렌디아민의 두 개의 아민기 중 하나는 히알루론산의 카르복시기에 연결되고, 나머지 하나의 아민기는 핵산에 도입된 티올기와 이황화 결합을 통하여 연결된,
    히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 알킬렌디아민은 탄소수 4 내지 8인 것인,
    히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 히알루론산은 평균분자량 10,000 내지 3,000,000인 것인,
    히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체.
  8. 제5항에 있어서, 다음의 화학식 4의 구조를 갖는, 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체:
    [화학식 4]
    Figure 112012075634518-pat00007

    상기 식 중, m은 1 내지 10의 정수이고, p 및 q는 각각 독립적으로 16 내지 2500에서 선택된 정수이다.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 고분자를 추가로 포함하는, 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민, 폴리(L-라이신), 폴리메타크릴레이트, 키토산(chitosan), 폴리 양이온성 덴드리머(poly cationic dendrimers), 양이온성 펩타이드, 퀀텀닷(quantum dot), 금나노입자, 실리카 나노입자, 탄소유도체 나노입자, 및 고형리피드 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체.
  11. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체를 포함하는 핵산 전달체 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 양이온성 고분자를 추가로 포함하는, 핵산 전달체 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민, 폴리(L-라이신), 폴리메타크릴레이트, 키토산(chitosan), 폴리 양이온성 덴드리머(poly cationic dendrimers), 양이온성 펩타이드, 퀀텀닷(quantum dot), 금나노입자, 실리카 나노입자, 탄소유도체 나노입자, 및 고형리피드 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 핵산 전달체 조성물.
  14. 삭제
  15. 히알루론산의 카르복시기에 탄소수 1 내지 10의 알킬렌디아민의 두 개의 아민기 중 하나의 아민기를 결합시켜 히알루론산-알킬렌디아민 접합체를 형성하는 단계;
    티올기가 도입된 핵산을 준비하는 단계; 및
    상기 형성된 히알루론산-알킬렌디아민 접합체의 아민기와 상기 핵산에 도입된 티올기 간 이황화 결합을 형성하여, 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체를 생성하는 단계
    를 포함하는, 히알루론산-알킬렌디아민-핵산 접합체 제조 방법.
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