KR101443428B1

KR101443428B1 - 발효홍삼을 유효성분으로 함유하는 비만예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101443428B1
Application number: KR1020110146436A
Authority: KR
Inventors: 한찬규; 김현진; 김혜영
Original assignee: (주)그린바이오; 한국식품연구원
Priority date: 2010-12-29
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2014-09-25
Anticipated expiration: 2031-12-29
Also published as: KR20120076331A

Abstract

본 발명은 발효홍삼 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 비만예방 및 치료용 조성물은 약제학적 또는 식품조성물로서 지방세포의 분화를 억제하여 비만예방 및 치료에 탁월한 효과를 발휘한다.

Description

발효홍삼을 유효성분으로 함유하는 비만예방 및 치료용 조성물{PREVENTING AND TREATING COMPOSITION FOR OBESITY COMPRISING THE EXTRACTS OF FERMENTED RED GINSENG}

본 발명은 비만예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 발효홍삼을 유효성분으로 함유하여 약제학적 또는 식품조성물로서 지방세포의 분화를 억제하여 비만예방 및 치료에 탁월한 효과를 발휘하는 비만예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

비만은 단순히 비만자체의 심각성 보다 이로 인해 유발되는 당뇨병, 동맥경화, 심혈관계 질환과 고지혈증 등과 같은 대사성질환이 심각한 사회문제로 대두되고 있다. 최근 보건복지가족부가 발표한 자료에 따르면 최근 2년 사이 우리 국민의 신체활동량은 줄고 비만 관련 질환은 늘어난 것으로 나타났다. BMI 25 이상인 비만자의 경우 특히 남성에서 36.2%로 1.5% 증가했으며(10년간 11.1% 증가) BMI 30 이상의 고도비만율도 4.1%로 0.6% 증가하였다. 비만은 체내 잉여 에너지가 중성지방 및 기타 지방대사물의 형태로 지방조직에 저장됨으로서 일차적으로 나타나며, 이러한 에너지대사의 불균형에 따른 종합적인 대사이상에 의해 유발되는 질병으로서 식이조절뿐만 아니라 식욕조절 호르몬 대사, 지방세포분화, 지방합성 및 분해과정 그리고 열생성반응 등 다양한 측면에서의 접근이 요구되고 있다. 또한 소아 청소년 비만 유병률도 증가추세였으며 비만과 관련된 고지혈증도 지속적으로 늘어 10.8%로 2.7% 증가된 것으로 조사되었다. 따라서, 항비만 소재개발 연구는 식욕억제 물질인 렙틴(leptin)의 저항성을 유도하는 사이토카인 시그날링 3 서프레서(cytokine signaling 3 suppressor), 시상하부에 존재하는 음식 섭취 조절에 관여하는 카나비노이드 리셉터 1 길항제(cannabinoid receptor 1 antagonist), 식욕 촉진을 일으키는 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y) 길항제 등 식욕을 억제하여 체중을 감소시키는 것과 성장 호르몬 합성물 (AOD9604), 지방대사 촉진 및 대사율 증가 활성을 지닌 β3-adrenergic receptor agonist, UCP 과다발현을 통해 에너지 소비 촉진에 관여하는 PPARδ 등 에너지 소모를 증가시켜 체중을 감소시키는 방향으로 이뤄지고 있다.

그동안 비만 치료를 위해 개발된 약물들은 효과에 비해 부작용이 심각해 항비만 효과는 높고 부작용이 적은 천연소재의 새로운 작용기전을 가진 물질의 개발이 절실히 요구되고 있다.

[선행기술문헌]
1. 공개특허공보 제10-2008-0029989호(2008.04.03)
2. Journal of Korean Society for Applied Biological Chemistry,51(3),2008.09.pp.188-193

본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 발효홍삼을 유효성분으로 함유하여 약제학적 또는 식품조성물로서 지방세포의 분화를 억제하여 비만예방 및 치료에 탁월한 효과를 발휘하는 비만예방 및 치료용 조성물을 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.

(1) 발효홍삼 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만예방 및 치료용 조성물.

(2) 제 1항에 있어서,

상기 조성물은 팽화홍삼 또는 이의 추출물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비만예방 및 치료용 조성물.

(3) 제 1항에 있어서,

상기 조성물은 발효홍삼과 팽화홍삼은 중량비로 10:90 ~ 90:10 혼합되는 것을 특징으로 하는 비만예방 및 치료용 조성물.

(4) 발효홍삼 또는 이의 추출물, 혹은 팽화홍삼 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물.

(5) 발효홍삼 또는 이의 추출물, 및 팽화홍삼 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만예방 및 치료를 위한 건강기능성 식품조성물.

(6) 제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 각 추출물은 열수 또는 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 비만예방 및 치료용 식품조성물.

(7) 홍삼추출물을 인간을 제외한 동물에 급여하는 단계; 상기 각 추출물이 급여된 동물로부터 혈장을 분리하는 단계; 상기 분리된 혈장으로부터 라이소포스파티딜콜린의 질량분석을 수행하는 단계; 및 상기 각 물질의 질량분석결과를 비교하여 발효홍삼추출물, 팽화홍삼추출물 및 일반홍삼추출물을 판단하는 단계를 포함하는 비만치료용 홍삼추출물의 종류 판정방법.

(8) 제 7항에 있어서, 상기 라이소포스파티딜콜린은 라이소포스파티딜콜린(18:0), 라이소포스파티딜콜린(16:0), 라이소포스파티딜콜린(18:1), 및 라이소포스파티딜콜린(18:2)인 것을 특징으로 하는 홍삼추출물의 판단방법.

(9) 제 7항에 의해 판정된 팽화홍삼추출물 또는 발효홍삼추출물을 유효성분으로 함유하는 비만치료용 조성물.

(10) 제 9항에 있어서, 상기 홍삼추출물은 열수추출물 또는 에탄올추출물인 것을 특징으로 하는 비만치료용 조성물.

본 발명에 따른 비만예방 및 치료용 조성물은 발효홍삼을 유효성분으로 함유하여 약제학적 또는 식품조성물로서 지방세포의 분화를 억제하여 비만예방 및 치료에 탁월한 효과를 발휘한다.

도 1은 본 발명에 따른 홍삼을 대상으로 실시한 LC/MS 측정 결과(A), 스코어플롯(B) 및 로딩플롯(C).
도 2는 본 발명에 따른 발효홍삼과 팽화홍삼을 대상으로 실시한 PLS-DA 스코어플롯(A) 및 S-플롯(B)

본 발명은 발효홍삼(또는 이의 추출물)을 유효성분으로 함유하는 비만예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 비만예방 및 치료용 조성물은 지방세포의 분화를 억제하고, 또 항비만활성의 타겟으로 잘 알려진 AMPK(5'AMP-activated protein kinase)를 활성화하여 항비만 활성을 발휘한다.

본 발명에 따른 발효홍삼은 홍삼추출물을 발효시킨 것 뿐만 아니라 홍삼을 발효시킨 것 내지 이의 추출물을 포함한다.

홍삼의 발효에 사용될 수 있는 미생물로는 아스퍼질라스 오라이제(Asperigillus oryzae), 뮤코 록시(Mucor rouxii), 라이조푸스 나바니쿠스(Rhizopus javanicus)와 같은 곰팡이 혹은 락토바실러스 퍼멘텀과 같은 세균을 이용할 수 있다.

본 발명에 의하면 이들 균들이 생산하는 알파 아밀라제(α-amylase) 및 베타 아밀라제(β-amylase), 셀루라제(cellulase) 및 글루코아밀라제(glucoamylase) 등에 의해 약리적활성이 높은 유용 사포닌 함량이 높고, 관능성이 개선된 발효홍삼을 얻을 수 있다. 이때 발효과정은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 원료 홍삼에 대하여 0.1 ~ 1.0 중량% 첨가 후 35~45℃에서 12시간~15일간 발효처리하는 것에 의해 수행되어질 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 이와 같은 발효홍삼 그 자체 또는 분말상태의 것을 사용하여도 좋으며, 이의 추출물의 형태로 사용하여도 좋다. 발효홍삼의 추출물은 열수추출물, 에탄올 추출물 또는 물과 에탄올의 혼합물을 이용한 추출물, 또는 초임계추출물을 포함한다.

열수 추출물의 경우 1∼10배의 물을 가하여 1 내지 2기압, 80∼120℃하에 1∼12시간 추출하는 것이 바람직하다. 에탄올 추출물의 경우 50 내지 100% 에탄올로 이루어진 추출용매를 이용할 수 있고, 초임계 추출물은 에탄올을 추출용매로 하여 250 내지 350bar의 압력하에 수행되어질 수 있다.

본 발명에 따른 비만예방 및 치료용 조성물은 상기 발효홍삼이 전체 중량 대비 0.1 내지 99.9 중량% 함유된 것을 특징으로 한다. 만일 0.1중량% 미만으로 첨가되면 지방세포의 분화억제 및 AMPK 활성이 낮아 소기의 비만억제효과를 달성하기 곤란하고, 99.9 중량%를 초과하면 초과에 따른 추가적인 활성을 기대하기 곤란하고 경제적으로도 바람직하지 않다.

본 발명에 의하면, 상기 발효홍삼 또는 이의 추출물과 함께 팽화홍삼 또는 이의 추출물을 혼합하여 첨가하는 것이 바람직하다. 본 발명에 의하면 발효홍삼과 팽화홍삼은 약리활성성분, 특히 주요 사포닌 성분에 있어서의 차이가 존재하고 그 약리적 활성에 있어서도 차이가 존재하며, 이들의 혼합처방에 의해 항비만활성이 보다 증가하는 것으로 판단된다. 발효홍삼 및 팽화홍삼은 중량비로 10:90 ~ 90:10 혼합되는 것이 바람직하며, 상기 혼합비를 벗어날 경우에는 항비만 활성에 있어서 발효홍삼을 단독으로 처리하는 경우와 대비할 때 유의적인 변화를 기대할 수 없기 때문이다.

또한 상기 팽화홍삼의 경우 원료홍삼을 용량 5ℓ의 공지의 파핑장치를 이용할 때, 최대압력은 15㎏/㎠, 온도는 120∼150℃에서 팽화시켜 얻을 수 있으며, 구체적으로는 특허등록번호 제10-0325778호의 팽화조건을 그대로 이용하여도 좋다.

본 발명에 의하면 상기 팽화홍삼을 필요에 따라 유산균을 이용하여 발효시킨 팽화홍삼의 발효물을 더 첨가하여도 좋다. 이 경우 상기 팽화홍삼 또는 이의 추출물 100 중량부에 대하여 10 내지 50 중량부의 범위내에서 대체하여 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 발효홍삼 또는 이의 추출물을 포함하는 비만예방 및 치료용 조성물은 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서, 상기 발효홍삼 또는 이의 추출물 외에 첨가되는 성분에 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 다당류, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등; 과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 솔비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용하는 것도 좋다.

상기 외에 본 발명의 비만억제용 조성물은 다양한 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 특별히 한정되지는 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부에 대하여 0 내지 약 10 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 상기 발효홍삼 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만억제용 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1㎏ 당 0.001 내지 5g의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 흡수율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 실제 항비만 활성을 갖는 홍삼제품을 제조하여 유통시킬 경우 이들 홍삼이 발효홍삼, 팽화홍삼 혹은 일반홍삼인지를 판단하는 것은 매우 어렵다. 현재 다양한 약리적 활성으로 인해 그 수요가 폭발적으로 증가하고 있으며, 시판되는 일부 제품들에 첨가된 홍삼 또는 이의 추출물의 첨가여부를 확인하는 것 조차 쉽지 않고, 더욱이 항비만 활성에 있어서도 팽화홍삼과 발효홍삼 제품의 경우 그 약리활성은 일반 홍삼추출물과는 상당한 차이가 있는 것이 확인되었음에도 불구하고 정확하게 구분하여 표기되어 있지도 아니한 실정 하에 이에 대한 진위여부를 소비자에게 확인시켜줄 수단이 시급히 강구되어져야 한다. 이에 본 발명에서는 이들 각 제품에 대한 소비자의 권리를 보호하기 위해 이를 정확하게 판정하기 위한 방법을 제공한다.

이러한 방법은 본 발명에 의하면 홍삼추출물을 인간을 제외한 동물(예를 들어, 래트 등)에 급여하는 단계; 상기 각 추출물이 급여된 동물로부터 혈장을 분리하는 단계; 상기 분리된 혈장으로부터 라이소포스파티딜콜린의 질량분석을 수행하는 단계; 및 상기 각 물질의 질량분석결과를 비교하여 발효홍삼추출물, 팽화홍삼추출물 및 일반홍삼추출물을 판단하는 단계를 통해 달성되어진다.

상기 본 발명에 따른 홍삼추출물의 종류를 판별하기 위한 방법을 위해 LC/MS 방법이 이용되어질 수 있으며, 본 발명에 의하면 특히 이들의 판별을 위한 혈장내 대사체 중 마커로서 라이소포스파티딜콜린, 바람직하게는 라이소포스파티딜콜린(18:0), 라이소포스파티딜콜린(16:0), 라이소포스파티딜콜린(18:1), 및 라이소포스파티딜콜린(18:2)이 사용되어질 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 참조하여 보다 구체적으로 설명하고자 하나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것으로 해석되어져서는 아니될 것이다.

[실시예 1] 추출물의 수득

건조된 홍삼, 홍삼의 열수추출물에 락토바실러스 퍼멘텀 0.5중량%를 첨가하여 35℃에서 24 시간 발효시킨 발효홍삼, 원료 홍삼에 15㎏/㎠하에서 120℃에서 5분간 처리하여 얻은 팽화홍삼 각 1 kg을 5L 에탄올로 일주일간 냉침시킨 후 여과지 (Whatman No. 2 filter paper)를 이용하여 여과하고 여액을 감압 농축하는 과정을 3회 반복하여 에탄올 추출물을 얻은 후, 각각 4℃에 보관하였다.

[실시예 2] 지방세포 분화 억제능 평가

상기 실시예에서 얻은 각 홍삼 추출물의 지방세포 분화 억제능을 평가하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포를 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 소태아혈청(FBS)과 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)은 웰진 (Daegu, South Korea)에서 구입하였다. AMPK 활성검정키트는 밀리포어(Danvers, MA, USA)로부터 구입하였다. 인슐린, 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX), 덱사메타존(DEX)는 시그마-알드리치(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다.

본 발명에서는 홍삼 추출물의 항비만 활성을 검증하기 위하여, 지방세포분화 억제분석 및 Oil-Red O염색을 실시하였다.

지방세포분화억제 모델로서, 3T3-L1 지방전구세포를 DMEM에 10% FBS를 첨가하여 이틀 동안 배양하였다. 세포가 완전히 컨플루언트(confluent)해졌을 때 세포의 분화를 호르모날 칵테일(10 ug/ml 인슐린, 0.5 mM IBMX, 및 0.5 uM DEX)을 이용하여 시작하였다.

그 후에 매 이틀마다 DMEM에 10ug/ml 인슐린이 포함된 배지로 갈아주고 8일 후에 지방분화를 종료하였다. 실시예 1의 각 홍삼 추출물은 최초 호르모날 칵테일과 함께 각각 10, 50, 100uM의 농도로 첨가하였다.

지방세포 분화가 끝난 후 지방분화 정도를 Oil Red O 염색법을 통하여 측정하였는데, 세포를 인산완충식염수 (PBS)로 두 번 세척한 후 3.7% 포름알데히드 함유 PBS에서 10분 동안 고정하였다.

그 후 포름알데히드를 버린 후 다시 PBS 두 번 세척하였다. 다시 0.2% Oil Red O 용액을 1시간 동안 상온에 노출 시키고 염색된 지방 모습은 현미경으로 관찰하거나 또는 이소프로판올로 염색된 Oil Red O 염료를 세포로부터 분리시킨 후 ELISA 리더로 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.

	처리 농도	Mean (%) ± SD
분화유도		100
일반홍삼 추출물	10ug/ml	110.2± 5.4
	50ug/ml	103.5± 4.9
	100ug/ml	60.6± 4.2
발효홍삼 추출물	10ug/ml	105.3± 2.4
	50ug/ml	98.2± 5.7
	100ug/ml	52.3± 2.1
발효홍삼+팽화홍삼추출물 (1:1)	10ug/ml	103.1± 1.9
	50ug/ml	90.5± 7.2
	100ug/ml	50.6± 4.3

상기와 같은 과정을 통해 홍삼 추출물을 이용하여 지방세포의 분화억제능을 평가한 결과 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 모든 홍삼 추출물에서 농도의존적으로 지방세포의 분화를 억제하는 활성이 관찰되었으나. 발효홍삼과 팽화홍삼의 경우에서 보다 지방세포의 분화억제활성이 높은 것을 확인하였다.

[실험예 3] 혈장으로부터 대사체 추출

상기 각 실시예에 의해 획득한 다양한 홍삼 추출물(일반 홍삼추출물, 발효홍삼추출물, 팽화홍삼추출물)을 각각 7주간 투여한 래트와 물을 투여한 대조군의 눈에서 혈액을 1% EDTA가 도포된 혈액채취용 튜브에 수집한 한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 혈장 400 ㎕에 아세토니트릴 (ACN) 800 ㎕를 넣어 4 ℃에서 20분간 천천히 흔들어주면서 단백질을 침전시킨 후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈장에서 단백질을 제거하였다. 단백질이 제거된 혈장을 건조시킨 후 표준물질을 함유한 200 ㎕ 20% 메탄올로 다시 녹인 후 5 ㎕를 UPLC에 주사하였다.

[실험예 3] UPLC-Q-TOF MS를 이용한 대사체 분석

실험과정

UPLC 시스템 (워터스, 밀포드, MA, 미국)에 장착된 애쿼티 UPLC BEH C₁₈ 칼럼 (2.1ㅧ50 mm, 1.7 ㎛; 워터스)를 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 평행시킨 후 시료를 0.1% TFA를 함유한 ACN의 농도를 점진적으로 증가시키면서 유속 0.35 mL/min로 13분간 분리 분석하였으며 C₁₈ 칼럼-UPLC로 분석되어 나온 용리액은 Quadrupole-Time of Flight (Q-TOF) 질량분석기(워터스)로 분석하였다. Q-TOF는 ESI 포지티브 모드에서 분석하였으며, 캐필러리와 샘플링콘(sampling cone)의 전압은 각각 3 kV와 30 V, 탈용매(desolvation)는 유속 700 L/h, 온도 300℃, 소스 온도는 110℃이다. TOF MS 데이타는 스캔시간은 0.2 초, 스캔지연시간 0.02 초에서 m/z 50-1000 범위에서 분석되었다. 분석의 정확도와 재현성을 높이기 위해 모든 분석에 200ρmole 류신-엔케팔린 (ESI 포지티브 모드에서 556.2771 Da)을 랙스프레이(lack spray)로 사용하였으며 QC(quality control)를 위해 5개 표준물질을 함유하는 혼합물질을 시료 5번 분석 때마다 한번씩 분석하였다. 물질의 동정을 위해 10-30 eV의 충돌에너지 램프(ramp)를 이용하여 MS/MS 스펙트라를 얻었으며 얻은 MS/MS 데이타는 elemental composition analysis software와 online-database [chemspider database (www.chemspider.com)]를 이용하여 비교 분석하였다.

정상군과 홍삼투여군의 혈장 LC/MS 데이타는 MarkerLynx (Waters, Milford, MA, USA)에 의해서 정렬되고 총 피크 강도에 의해 정규화되었다. 피크는 5% 높이/1 초에서의 피크폭, 잡음소거, 6, 강도 문턱값(intensity threshold), 50의 조건에서 수집되었으며 매스톨러런스(mass tolerance), 0.04 Da, 체류시간창(retention time window), 0.15 조건에서 정렬되었다.

데이터 프로세싱을 걸친 LC/MS 데이타셋은 SIMCA-P⁺버전 12.0.1 (유메트릭스, 유메아, 스웨덴)의 다변량통계분석 방법을 이용하여 분석되었다. 다변량통계분석 방법 중 부분최소제곱판별분석(partial least-squares discriminant analysis) (PLS-DA)와 직교부분최소제곱판별분석(orthogonal partial least-squares discriminant analysis) (OPLS-DA) 방법이 사용되었으며 호텔링스 72테스트(hotelling's T2test)는 PLS-DA나 OPLS-DA로 분석된 데이타들 중 95% 신뢰구간에서 벗어나는 것들을 확인하기 위하여 사용되었다. PLS-DA와 OPLS-DA 모델은 R²X, R²Y, Q²Y 세 파라미터를 이용하여 분석된 모델의 퀄리티를 측정하였다. 모델의 양호는 R²X와 R²Y, 예측 가능성은 Q²Y 값으로 측정하며 모델의 밸리데이션을 위해 7-폴드 밸리데이션(7-fold validation)이 PLS-DA와 OPLS-DA 모델에 적용되었으며 모델의 신뢰성은 퍼뮤테이션 테스트 (n=200)에 의해서 측정되었다. 시료 그룹간의 차이에 관여하는 대사체들을 찾기 위해서 모든 대사체들의 이온강도는 인디펜던트 티 테스트(independent t-test)의 만-휘트니 유 테스트(the Mann-Whitney U-test)를 이용하여 통계분석하였으며 로딩플롯(loading plot)과 에스 플롯(S-plot)을 사용하여 차이에 관여하는 대사체를 시각화시켜줬다.

실험결과

다양한 홍삼 (일반홍삼추출물, 발효홍삼추출물, 팽화홍삼추출물)을 투여한 실험동물모델과 물을 투여한 대조군의 혈장의 대사체를 LC/MS로 분석한 결과 도 1(A)에서 보는 바와 같이 대부분의 혈장 대사체들이 C18 칼럼에서 고농도의 ACN로 분리되는 것으로 보아 소수성의 성질을 갖는 물질들임을 알 수 있었으며 홍삼투여군에서 대사체 프로파일이 다소 감소되는 경향을 보였다. 이들 MS 데이타를 PLS-DA 다변량통계분석 방법으로 분석한 결과 1차콤파운트 t(1)과 2차콤파운트 t(2)를 이용하여 스코어 클롯(score plot)상에서 팽화홍삼과 발효홍삼 투여군은 서로 분명하게 분리되지 않은 반면 일반홍삼, 대조군과는 t(1)을 기준으로 분명하게 분리되었다. 또한 일반홍삼 투여군도 대조군과 t(2)를 기준으로 분리되는 것을 확인할 수 있다. 스코어플롯상에서 실험 그룹들의 분리에 관여하는 대사체들을 확인하기 위하여 도 1(C)에서 보는 바와 같이 Num와 W*c(1)을 이용하여 로딩플롯(loading plot)을 수행하였다. 로딩플롯상에서 높은 W*c(1) 값을 보일수록 그룹간의 차이에 크게 기여하는 것으로 나타난 반면 "0"값에 근접할수록 변화가 없는 물질들을 의미한다. 로딩플롯 상에서 높은 W*c(1) 값을 보이는 대부분이 대사체들이 UPLC 분리 마지막 부분에 집중되어서 나오는 것으로 보아 소수성 물질들인 것으로 사료되며 이들 대사체들의 전체 시료의 정량적 프로파일의 변화를 확인한 결과 홍삼추출물 투여군이 대조군에 비해 대부분 감소한 것으로 나타났다.

두 그룹간의 차이를 좀 더 확인하기 위하여 두 그룹의 PLS-DA 스코어플롯 (도 2(A))을 수행한 결과 다소 차이는 있지만 모든 스코어플롯에서 1차 콤파운트 t(1)을 기준으로 두 그룹이 서로 분리되는 것을 확인하였으며 이런 분리에 관여하는 대사체들을 확인하기위하여 p(1)과 p(corr)(1)를 이용하여 S-플롯을 수행하였다. S-플롯은 p(1)과 p(corr)(1) 값이 둘 다 포지티브 또는 네가티브 값이 클 때 두 그룹의 차이에 크게 기여한다. 거의 모든 S-플롯에서 두 그룹간의 차이에 관여하는 주요 대사체들은 거의 비슷한 것으로 확인되었다. 대조군과 팽화홍삼, 발효홍삼, 일반홍삼을 각각 비교했을 때 팽화홍삼, 발효홍삼의 경우 7 종류 이상의 주요 대사체들이 변화한 반면 일반홍삼은 3개의 주요 대사체들이 관여한 것으로 확인되었다. 홍삼 투여군끼리 비교한 결과 일반홍삼과 발효 또는 팽화홍삼 사이에는 뚜렷한 분리를 보이면서 대조군과의 플롯에서 확인된 주요 대사체들이 관여하는 것으로 확인되었지만 발효홍삼과 팽화홍삼의 플롯에서는 증가와 감소되는 대사체들이 다소 혼재되어 있는 것으로 확인되었다.

도 1과 2에서 수행된 PLS-DA 플롯이 잘 된 모델인지를 다양한 퀄리티 파라미터를 이용하여 확인한 결과 표 2에서 보는 바와 같이 모든 그룹을 한 플롯에서 표현한 경우 예측 가능성(Q₂)이 21.7%으로 다소 낮기는 하지만 퍼뮤테이션(permutation) (n=200)한 값이 R과 Q의 인터섹트(intercept)가 각각 0.4, 0.05보다 낮은 것으로 보아 오버피팅(overfitting)되지 않은 것으로 확인되었다. 두 그룹끼리 비교한 모델들의 피팅 퀄리티(fitting quality)를 확인한 결과 피팅굿니스(fitting goodness) (R₂)는 다소 높은 반면 예측 가능성 값은 비교 그룹에 따라 다른 경향을 보였다. 특히, 팽화홍삼과 발효홍삼을 비교한 모델인 경우 예측 가능성 값이 "-" 값을 보여 두 그룹간의 비교는 적합하지 않은 것으로 사료되며 대조군과 일반홍삼의 경우도 다소 낮은 예측 가능성 (14.1%)을 보인 반면 다른 모델에서는 50%이상의 높은 Q₂ 값을 보여 PLS-DA 모델 피팅퀄리티가 높은 것으로 확인되었고 오버피팅 가능성도 낮은 것으로 보아 팽화홍삼-발효홍삼 모델을 제외한 모든 모델에서 다소 차이는 있지만 PLS-DA를 이용하여 대사체를 분석하기에 적합한 것으로 사료되었다.

모델	No	R²X_cum ^b	R²Y_cum ^b	Q²X_cum ^b	R_interceptc	Q_interceptc
Con,팽화 발효,일반	2	0.702	0.408	0.217	0.118	-0.123
Con,팽화	3	0.786	0.987	0.934	0.798	-0.112
Con,발효	3	0.838	0.969	0.882	0.721	-0.0885
Con,일반	2	0.682	0.632	0.141	0.631	-0.0176
팽화,발효	2	0.441	0.676	-0.103	0.637	-0.0198
팽화,일반	2	0.714	0.88	0.575	0.472	-0.016
발효,일반	5	0.883	0.981	0.741	0.905	0.0489

* 상기 표 1에서 No는 성분의 수, R²X_cum ^b와 R²Y_cum ^b는 X와 Y 매트릭스에서 cumulative modeled variation이고, Q²X_cum ^b는 Y 매트릭스에서 cumulative ppredicted variation이며, R과 Q_intercept는 permutation test 후 얻은 것이다(n=200)

도 1과 2에서 확인한 바와 같이 홍삼 투여군과 대조군 또는 홍삼 투여군간의 서로 분리되는 것을 확인하였으며 이들 분리에 관여하는 주요 대사체들을 UPLC-Q-TOF MS를 이용하여 동정한 결과 총 1494개의 혈장 대사체들 중 통계적으로 유의적인 차이 (p<0.05)를 보인 756개 (모든 그룹비교 모델) 중 11개의 라이소포스파티딜콜린 (lysoPC), 2개의 아미노산 (류신, 트립토판), 포스파티딜콜린 (PCs)가 주요 대사체들로 확인되었다. 이중에서 지방산 18:0, 16:0, 18:1, 18:2를 각각 갖고 있는 lysoPC들이 가장 크게 그룹별 차이에 관여하는 것으로 확인되었다(표 3).

No	Identity	Exact mass	Actual mass	Mass error (mDa)	Ms fragment (ESI^-]	fold change(vs.control)			VIP
No	Identity	Exact mass	Actual mass	Mass error (mDa)	Ms fragment (ESI^-]	팽화홍삼	발효홍삼	일반홍삼	VIP
1	류신	132.1025	132.0985	-4.0	86	0.52^*	0.47^*	1.59^**	1.89
2	트립토판	205.0977	205.0949	-2.8	188,146,118,91	0.58^*	0.55^*	1.34	1.11
3	LysoPC(14:0)	468.3090	468.3064	-2.6	184,104,86	0.74^*	0.57^*	0.71	0.55
4	LysoPC(16:0)	496.3403	496.3374	-2.9	184,104,86	0.68^*	0.69^*	1.04	12.20
5	LysoPC(16:1)	494.3247	494.3232	1.5	184,104,86	0.67	0.49^*	0.70	1.69
6	LysoPC(17:0)	510.3560	510.3542	-1.8	184,104,86	0.42^*	0.33^*	0.43^*	1.18
7	LysoPC(18:0)	524.3716	524.3698	-1.8	184,104,86	0.69^*	0.58^*	1.21	21.61
8	LysoPC(18:1)	522.3560	522.3549	-1.1	184,104,86	0.59^*	0.62^*	0.88	11.08
9	LysoPC(18:2)	520.3403	520.3385	-1.8	184,104,86	0.81	0.76	1.13	7.86
10	LysoPC(19:0)	538.3873	538.3868	-0.5	184,104,86	0.52	0.35	0.84	0.75
11	LysoPC(20:4)	544.3403	544.3398	-0.5	184,104,86	0.83	0.55^*	1.23	11.29
12	LysoPC(20:1)	550.3873	550.3869	-0.4	184,104,86	0.51^*	0.48^*	0.76	1.02
13	LysoPC(22:6)	568.3403	568.3408	0.5	184,104,86	0.56^*	0.41^*	0.82	2.90
14	PCs¹ ⁾				184	0.56^*	0.51^*	0.85

* mean difference is significant at the p<0.05 level

상기와 같이, 대조군과 비교했을 때 홍삼 투여군의 혈장인지질 수준이 모두 감소하는 것으로 확인되었으며 팽화 또는 발효홍삼 투여군이 일반홍삼 투여군보다 더 인지질 수준이 낮은 것으로 조사되었다. 실험동물모델의 몸무게를 홍삼투여 후 7주까지의 변화를 조사한 결과 팽화홍삼과 발효홍삼 투여군의 몸무게가 대조군과 일반홍삼 투여군에 비해 감소하는 경향을 보였다. 따라서, 팽화홍삼과 발효홍삼은 항비만 효과가 큰 것을 알 수 있을 뿐만 아니라, 대사체의 프로파일을 통해 이들 간의 분리를 명확하게 할 수 있는 가능성을 발견하였다..

상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

원료홍삼에 대하여 0.5 중량%의 락토바실러스 퍼멘텀을 첨가하여 35℃에서 24시간 발효하여 얻은 발효홍삼의 에탄올 추출물; 및
15kg/㎠, 120℃에서 5분간 팽화한 팽화홍삼의 에탄올 추출물을 중량비로 1:1로 혼합한 것을 유효성분으로 함유하는 식품조성물.
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