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KR101429696B1 - 안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도 - Google Patents

안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도 Download PDF

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KR101429696B1
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Abstract

본 발명은 생체 내에서의 안전성, 조직특이성 및 항암 활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도에 관한 것으로, 상세하게는 간조직 특이적 PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 유전자의 프로모터, 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 암 특이적 유전자에 작용하는 트랜스 스플라이싱 라이보자임(trans-splicing ribozyme), 상기 라이보자임 3' 엑손에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자, 및 혈청형(serotype) 35의 섬유 혹(fiber knob)과 혈청형 5의 사프트(shaft)를 포함하고, 아데노바이러스 E1, E3 및 E4 orf1 부터 orf4 유전자가 결손된 재조합 아데노바이러스는 생체 내에서의 현저한 안전성, 표적 조직에 대한 높은 특이성 및 현저한 항암 효과를 나타내므로 유전자 전달 벡터로서 항암제 또는 암 진단제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도{Recombinant adenovirus with enhanced safety and anti-cancer activity and use thereof}
본 발명은 간조직 특이적 PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 유전자의 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 암 특이적 유전자에 작용하는 트랜스 스플라이싱 라이보자임(trans-splicing ribozyme); 상기 라이보자임 3' 엑손에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자; 및 혈청형(serotype) 35의 섬유 혹(fiber knob)과 혈청형 5의 사프트(shaft)를 포함하고, 아데노바이러스 E1, E3 및 E4 orf1 부터 orf4 유전자가 결손된 재조합 아데노바이러스(Adenovirus) 및 이의 용도에 관한 것이다.
간암은 세계적으로 가장 흔한 암들 중의 하나로서, 높은 치사율 때문에 모든 암 중에서 3번째로 높은 사망률을 나타낸다. 지난 20년간 질병의 이해 및 치료적 선택에 대한 주요한 발전에도 불구하고, 간암은 종래의 약물에 잘 반응하지 아니하여 치료가 어렵고, 침습과 간 전이의 가능성 때문에 치료 후에도 재발이 흔한 것으로 알려져 있다.
현재까지 일반적으로 시행되고 있는 간암의 치료방법은 크게 부분 간 절제술 또는 간 이식술을 포함하는 수술적 요법과 경동맥 화학색전술, 경피적 에탄올 주입술, 고주파 열 치료법 등을 포함하는 비수술적 요법으로 나뉜다. 그러나 간암에 수반되는 경변으로 인하여 대부분의 간암환자들의 간 기능이 광범위하게 쇠퇴되어 있기 때문에 이러한 치료법의 적용이 용이하지 않다. 간 절제술의 경우 전체 간암환자의 약 10 내지 20%만이 대상이 될 수 있고, 재발율도 매년 약 10 - 30% 정도인 것으로 알려져 있다. 간 이식술은 공여자의 부족으로 인해 일반적인 치료법으로 이용되지 못하고 있고, 국소 치료법의 경우는 조기에 발견된 작은 암의 치료로 그 대상이 국한된다. 광범위 암 치료법으로 알려져 있는 전신 화학요법 또는 방사선 치료 등도 단지 부분적으로만 효과를 보이고 있다. 따라서 간암에 대한 새로운 치료전략의 개발이 필요하게 되었고, 최근 면역치료, 호르몬치료, 및 유전자 치료 등 다양한 연구들이 진행되고 있다.
유전자 치료는 선천적 또는 후천적 유전자 결함, 바이러스성 질병, 암 또는 심혈관계 질환 등과 같은 만성 질환의 치료와 예방을 위하여, DNA 및 RNA 등의 유전물질을 인체 내에 투여하여 치료 단백질을 발현시키거나 특정 단백질의 발현을 억제하도록 하는 치료 방법으로서, 질병의 원인을 유전자 차원에서 해석하여 근본적으로 치료할 수 있기 때문에 난치병의 극복은 물론 기존 의료 방식의 대체 수단으로 기대되고 있는 방법이다. 일반적으로 사용되는 유전자 치료용 아데노바이러스 벡터는 복제에 필수적인 일련의 유전자들을 삭제시키고, 프로모터 활성의 수준이 높은 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 로우스사르코마바이러스(RSV) 프로모터를 넣어 치료 목적 단백질의 생체 내에서의 높은 발현을 유도한다.
최근에는, 유전자 치료에 활용될 수 있는 타겟 유전자들의 다수가 세포분열을 많이 하는 일반 세포에도 발현함으로 인해서 발생하는 부작용을 줄이기 위한 노력으로 암세포 특이적인 치료가 시도되고 있다. 암 또는 조직 특이적 프로모터를 사용한 전사적 표적 종양 유전자 치료는 암세포가 조절되지 않는 증식 및 세포 생존에 중요한 많은 유전자를 과발현 또는 활성화시키는 성질을 이용한다.
한편, 테트라하이메나 써모필라(Tetrahymena thermophila)로부터의 그룹 I 인트론 라이보자임이 실험관 내에서 뿐만 아니라 박테리아 나아가 인체 세포 내에서 트랜스-스플라이싱 반응을 수행함으로써 두 별도로 존재하는 전사체를 서로 연결시킬 수 있음이 보고되었다(Been, M. and Cech, T. 1986, One binding site determines sequence specificity of Tetrahymena pre-rRNA self-splicing, trans-splicing, and RNA enzyme activity. Cell 47: 207-216; Sullenger, B.A. and Cech, T.R. 1994, Ribozyme-mediated repair of defective mRNA by targeted, trans-splicing. Nature 371: 619-622; Jones, J.T., Lee, S.W., and Sullenger, B.A. 1996, Tagging ribozyme reaction sites to follow trans-splicing in mammalian cells. Nat Med. 2: 643-648).
따라서, 그룹 I 인트론을 기초로 한 트랜스-스플라이싱 라이보자임에 의해 질환과 관련된 유전자 전사체 또는 정상세포에서는 발현이 안 되고 질병 세포에서만 특이적으로 발현되는 특정 RNA가 표적이 된 후 그 RNA가 정상적인 RNA로 보정되거나 또는 새로운 치료용 유전자 전사체로 치환되도록 재 프로그램을 유발함으로써 매우 질환 특이적이며 안전한 유전자 치료 기술이 될 수 있다. 즉, 단지 표적 유전자 전사체가 존재 시에만 RNA 치환이 일어날 것이므로 결과적으로 단지 적절한 시간과 공간에서만 우리가 원하는 유전자 산물이 만들어질 것이다. 특히, 세포 내 발현되는 RNA를 표적으로 한 후 원하는 유전자 산물로 대치하는 방법이므로 도입하고자 하는 유전자 발현 양이 조절될 수 있다. 또한, 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 질환 특이 RNA를 제거함과 동시에 우리가 원하는 치료용 유전자 산물의 발현을 유도할 수 있으므로 치료 효과를 배가시킬 수 있다.
또한, 라이보자임에 기초한 hTERT(human Telomerase reverse trasncriptase)-타겟 전략은 텔로머라제의 활성 때문에, 정상 간 조직에는 인식되지 않고, 간세포암종에서는 89.5%로 인식될 수 있는 새로운 간암의 치료 방법으로 보고되었다(Nagao K, Tomimatsu M, Endo H et al: Telomerase reverse trasncriptase mRNA expression and terlomerase activity in hepatocellular carcinoma. J Gastrenterol 1999; 34;83-87). hTERT(human Telomerase reverse transcriptase)는 암 세포의 불멸성(immortality) 및 증식(proliferation) 능력을 조절하는 가장 중요한 효소 중의 하나로, 이 텔로머라제(telomerase)는 무한히 복제되는 생식세포, 조혈세포 및 암세포에서 80 내지 90%의 텔로머라제 활성을 가지고 있지만, 암세포 주변의 정상세포들은 그 활성을 가지고 있지 않다(Bryan, T.M. and Cech, T.R. 1999, Telomerase and the maintenance of chromosome ends. Curr. Opin. Cell Biol. 11; 318-324). 텔로머라제의 이런 특성을 이용하여 세포 성장에 관여하는 텔로머라제의 억제자를 개발함으로써 암세포의 증식을 억제하려는 시도가 최근 활발히 진행되고 있다(Bryan, T.M., Englezou, A., Gupta, J., Bacchetti, S., and Reddel, R.R. 1995, Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. Embo J. 14; 4240-4248; Artandi, S.E. and DePinho, R.A. 2000, Mice without telomerase: what can they teach us about human cancer Nat. Med. 6; 852-855).
이에, 본 발명자들은 간암 치료를 위한 유전자 치료방법에 대해 연구를 계속해오고 있으며, 조직 특이적 프로모터와 암 특이적 유전자를 타겟팅하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 이용한 유전자 치료 방법을 개발하였으며, 특히 간조직 특이적 PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 유전자의 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 암 특이적 유전자에 작용하는 트랜스 스플라이싱 라이보자임(trans-splicing ribozyme); 상기 라이보자임 3' 엑손에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자; 및 혈청형(serotype) 35의 섬유 혹(fiber knob)과 혈청형 5의 사프트(shaft)를 포함하고, 아데노바이러스 E1, E3 및 E4 orf1 부터 orf4 유전자가 결손된 재조합 아데노바이러스(Adenovirus)의 경우 치료효율 및 안정성이 현저히 높은 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2011-0103119 A1
Bryan, T.M., Englezou, A., Gupta, J., Bacchetti, S., and Reddel, R.R. 1995, Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. Embo J. 14; 4240-4248; Artandi, S.E. and DePinho, R.A. 2000, Mice without telomerase: what can they teach us about human cancer Nat. Med. 6; 852-855. Bryan, T.M. and Cech, T.R. 1999, Telomerase and the maintenance of chromosome ends. Curr. Opin. Cell Biol. 11; 318-324. Nagao K, Tomimatsu M, Endo H et al: Telomerase reverse trasncriptase mRNA expression and terlomerase activity in hepatocellular carcinoma. J Gastrenterol 1999; 34;83-87). hTERT(human Telomerase reverse transcriptase. Yeh P, Dedieu JF, Orsini C, Vigne E, Denefle P, Perricaudet M. J Virol. 1996 Jan;70(1):559-65. Efficient dual transcomplementation of adenovirus E1 and E4 regions from a 293-derived cell line expressing a minimal E4 functional unit. Shayakhmetov DM, Lieber A. J Virol. 2000 Nov;74(22):10274-86. Dependence of adenovirus infectivity on length of the fiber shaft domain.
본 발명의 목적은 생체 내에서의 안전성, 조직특이성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스(Adenovirus) 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 간조직 특이적 PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 유전자의 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 암 특이적 유전자에 작용하는 트랜스 스플라이싱 라이보자임(trans-splicing ribozyme); 상기 라이보자임 3' 엑손에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자; 및 혈청형(serotype) 35의 섬유 혹(fiber knob)과 혈청형 5의 사프트(shaft)를 포함하고, 아데노바이러스(Adenovirus) E1, E3 및 E4 orf1 부터 orf4 유전자가 결손된 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은,
1) 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 암 세포에 도입하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 암 세포에서 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 간암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명의 간조직 특이적 PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 유전자의 프로모터, 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 암 특이적 유전자에 작용하는 트랜스 스플라이싱 라이보자임(trans-splicing ribozyme), 상기 라이보자임 3' 엑손에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자, 및 혈청형(serotype) 35의 섬유 혹(fiber knob)과 혈청형 5의 사프트(shaft)를 포함하고, 아데노바이러스 E1, E3 및 E4 orf1 부터 orf4 유전자가 결손된 재조합 아데노바이러스는 생체 내에서의 현저한 안전성, 표적 조직에 대한 높은 특이성 및 현저한 항암 효과를 나타내므로 유전자 전달 벡터로서 항암제 또는 암 진단제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 조직 특이적 프로모터 PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase)와 HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)를 포함하는 pPEPCK-HSVtk(pPT-O), 및 PEPCK, HSVtk 및 ApoE(Apolipoprotein E) 인핸서를 포함하는 pPEPCK- HSVtk-Enh(pPT-E) 재조합 아데노바이러스의 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 ApoE 인핸서의 존재에 따른 PEPCK로 유도된 HSVtk 활성을 확인한 도이다.
도 4는 CMV 프로모터, 녹색형광단백질(GFP)을 포함하고 E1 및 E3 유전자가 결실된 재조합 아데노바이러스(Ad5CMV. GFP) 및 CMV 프로모터, 녹색형광단백질(GFC) 및 혈청형 35의 섬유 혹과 혈청형 5의 샤프트를 포함하고, E1 및 E3 유전자가 결실된 재조합 아데노바이러스(Ad5/35CMV. GFP)의 모식도를 나타낸 도이다.
도 5는 Ad5CMV. GFP 및 Ad5/35CMV. GFP를 Hep3B 간암 세포주에 감염시킨 후 GFP-양성 세포수를 확인한 도이다.
도 6은 Ad5/35CMV. GFP로 감염된 Hep3B 간암 세포주에서 정량적-PCR(quantitative PCR)을 이용한 아데노바이러스 게놈 수를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 간암 특이적 효과를 확인한 도이다.
도 8은 Ad-PRT의 트랜스-스플라이싱 작용 확인을 확인한 도이다.
도 9는 PEPCK-양성 및 hTERT-양성 간암 세포주(HepG2, SNU398 및 SNU739), 및 PEPCK-음성 및 hTERT-음성 비 간암 세포주(인간 상피 세포(Human epithelial cell; HDF), 폐암 세포주(SBC-5) 및 대장암 세포주(HCT116))에서 간암 특이적 효과를 확인한 도이다.
도 10 정상 간에서 재조합 아데노바이러스에 매개한 TK(thymidine kinase) 유전자의 발현을 micro-PET/CT 이미지 및 표준화 흡수값(standardized uptake values; SUV)을 통해 확인한 도이다.
도 11은 암 유발 마우스에서 Ad-PRT의 간암-특이적 표적화 능력을 microPET-MR fusion 이미지를 통해 확인한 도이다.
도 12는 재조합 아데노바이러스가 감염되었는지 확인하기 위하여, 정상 부ㅇ위(normal; N) 및 간암 부의(tumor; T)에서 각각 RNA를 분리한 후, RT-PCR 분석법을 수행한 도이다.
도 13은 Ad-Mock, Ad-CRT, Ad-PT 및 Ad-PRT로 처치된 마우스 그룹(n=10/group)의 생존 플랏(survival plot)을 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 방법을 이용하여 평가한 도이다.
도 14는 Ad-Mock, Ad-CRT, Ad-PT 및 Ad-PRT로 처치된 마우스 그룹(n=10/group)의 간 기능을 GCV 처치 후, 3일째 및 6일째에 간 특이적 효소인 ALT 및 AST로 측정한 결과를 나타낸 도이다; 오차 막대기는 평균 값±SEM을 나타낸다.
도 15는 간암조직에서 H&E 염색을 이용한 대표적인 조직 검사 결과 및 TUNEL 분석법을 이용한 세포사멸의 평가를 나타낸 도이다; TUNEL 분석에서 짙은 갈색의 핵 및 세포 염색은 세포사멸을 의미한다.
도 16은 Ad-PRT에 의한 간세포 암종 세포의 침습 억제 및 신생혈관 억제를 나타낸 도이다; 대표적인 침습 세포를 영상화하였고(위쪽), 각 그룹의 데이터는 평균 값±SEM(***p<0.001)로 표현되었다(오른쪽); 침습 세포 수의 3번의 독립적인 실험에서 적어도 5개 부위에서 카운팅하였고, 통계적 유의성은 t-test를 이용하여 평가되었다.
도 17은 Ad-PRT에 의한 간세포 암종 마우스에서의 면역조직화학적 평가를 통한 감소된 VEGF 및 CD34 발현을 나타낸 도이다.
도 18은 18F-FDG PET/CT 영상을 이용한 Ad-PRT의 치료적 효능을 나타낸 도이다; 각 그룹의 대표적인 18F-FDG PET/CT 영상은 간에서의 SUVmax 값과 함께 나타내었다.
도 19는 Ad-PRT를 투여한 간암세포 암종 마우스 모델에서의 PET/CT 영상을 5주 동안 관찰한 결과를 나타낸 도이다; 아래 도면 3개는 5주 후의 부검 결과로, 왼쪽은 외관 사진, 가운데는 왼쪽 간엽의 조직 사진, 오른쪽은 오른쪽 간엽의 조직 사진으로 파란색 종괴가 간세포암종이다.
도 20은 Ad-Mock를 투여한 간세포 암종 마우스 모델에서의 microPET 영상을 2주 동안 관찰한 영상을 나타낸 도이다.
도 21은 Ad-Mock(n=5), Ad-PRT(n=5) 그룹에서의 종양 SUVmax 값을 나타낸 그래프이다; 오차 막대기는 평균 값±SEM을 나타낸다(**p<0.01).
도 22는 Ad-PRT를 투여한 간세포 암종 마우스 모델에서의 microPET 영상을 2주 동안 관찰한 영상을 나타낸 도이다.
도 23은 각 그룹의 대표적인 간 조직 현미경 사진(H&E 염색)을 나타낸 도이다.
도 24는 종양 세포 접종 14일 후에, PRT(n=20) 및 Mock(n=10) 그룹에서의 조양 무게를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 용어를 상세히 설명한다.
본 발명의 용어 "아데노바이러스(Adenovirus)"란, 아데노바이러스 벡터와 동일한 의미가 있고, 아데노비리디아(Adenoviridae)에 속에 속하는 바이러스를 의미하며, 상기 아데노비리디아에는 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus) 속의 동물성 아데노바이러스를 모두 포함한다. 특히, 인간의 아데노바이러스는 A-F 아속(subgenera) 및 이의 개개의 혈청형을 포함하며, A-F 아속은 인간의 아데노바이러스 제1형, 제2형, 제3형, 제4형, 제4a형, 제5형, 제6형, 제7형, 제8형, 제9형, 제10형, 제11형(Ad11A 및 Ad11P), 제12형, 제13형, 제14형, 제15형, 제16형, 제17형, 제18형, 제19형, 제19a형, 제20형, 제21형, 제22형, 제23형, 제24형, 제25형, 제26형, 제27형, 제28형, 제29형, 제30형, 제31형, 제32형, 제33형, 제34형, 제34a형, 제35형, 제35p형, 제36형, 제37형, 제38형, 제39형, 제40형, 제41형, 제42형, 제43형, 제44형, 제45형, 제46형, 제47형, 제48형 및 제91형이 포함된다.
본 발명의 용어 "프로모터"란, 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 기능적으로 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.
본 발명에서 용어 "조직 특이적 프로모터"란, 조직 특이적으로 프로모터 다운스트림(downstream) 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 업스트림(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 말한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 간조직 특이적 PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 유전자의 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 암 특이적 유전자에 작용하는 트랜스 스플라이싱 라이보자임(trans-splicing ribozyme); 상기 라이보자임 3' 엑손에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자; 및 혈청형(serotype) 35의 섬유 혹(fiber knob)과 혈청형 5의 사프트(shaft)를 포함하고, 아데노바이러스 E1, E3 및 E4 orf1 내지 orf4 유전자가 결손된 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
상기 간조직 특이적 PEPCK 유전자의 프로모터는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 간조직 특이적 프로모터에 의해 라이보자임이 특정 타겟 조직에서만 발현되며, 암 특이적 유전자에 대한 RNA 치환 활성을 갖는 트랜스-스플라이싱 라이보자임의 작용을 통해 정상 조직이 아닌 암 조직에서만 라이보자임의 트랜스-스플라이싱 활성이 기능하며, 이에 따라 암이 발생한 조직 외의 다른 조직에서 아데노바이러스가 작용하지 못하여 유전자 치료에 따른 부작용을 현저히 감소시킬 수 있다.
상기 프로모터는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 ApoA1의 인트론을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 암 특이적 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 조직 특이적 프로모터에 의해 특정 조직에서만 발현되고, 상기 특정 조직에서만 발현된 라이보자임은 세포 내 발현되는 특정 암 특이적 유전자를 표적으로 하여 트랜스-스플라이싱 반응을 수행하며, 치료 유전자 또는 리포터 유전자를 접합한다.
상기 암 특이적 유전자는 암세포에서 특이적으로 발현되는 유전자를 의미하며, hTERT(human Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA, AFP(alphafetoprotein) mRNA, CEA(carcinoembryonic antigen) mRNA, PSA(Prostate-specific antigen) mRNA, 또는 CKAP2(Cytoskeleton-associated protein 2) mRNA인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 라이보자임은 암에 특이적 유전자를 표적으로 하여 트랜스-스플라이싱 반응을 수행하여 새로운 치료 유전자 또는 리포터 유전자를 암 특이적 유전자에 연결할 수 있는 것이 바람직하고, 암에 특이적인 RNA 전사체인 hTERT의 mRNA를 인지하여 트랜스-스플라이싱하는 능력이 검증된 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 hTERT 표적 트랜스-스플라이싱 그룹 Ⅰ라이보자임인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 혈청형(serotype) 35의 섬유 혹(fiber knob)과 혈청형 5의 사프트(shaft)는 공지된 방법(Shayakhmetov DM, et. al. J Virol. 2000 Nov;74(22):10274-86)을 이용하여 혈청형 5의 섬유 혹 부분을 혈청형 35의 섬유 혹 부분으로 치환하여 제작하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 아데노바이러스는 ApoE(apolipoprotein E) 유전자의 인핸서(서열번호: 6), PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 유전자의 인핸서, 혈청알부민 유전자의 인핸서, AFP(alphafetoprotein) 유전자의 인핸서, CEA(carcinoembryonic antigen) 유전자의 인핸서 또는 PSA(Prostate-specific antigen) 유전자의 인핸서를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 아데노바이러스는 E4 orf1 부터 orf4 유전자가 결손된 재조합 아데노바이러스인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, E4 orf1 부터 orf4 유전자가 결손된 재조합 아데노바이러스는 공지된 방법(Yeh P, Dedieu JF, et. al. J Virol. 1996 Jan;70(1):559-65)을 통해 제작할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 E4 orf1 부터 orf4는 정상세포에 손상을 입히므로, 상기 E4 orf1 부터 orf4 유전자를 결손시킨 경우, 안정성이 유의적으로 증가하고, 또한 상기 E4 orf1 부터 orf4의 결손된 재조합 아데노바이러스는 외인성 치료유전자를 수용할 공간이 증가하므로, 약 7 kb의 외인성 치료유전자를 수용할 수 있다.
상기 치료 유전자는 약제감수성유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자 및 항신생 혈관 생성 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 HSV-tk(Herpessimplex virus-thymidine kinase) 유전자인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 약제감수성 유전자(drug-sensitizinggene)는 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시키는 효소에 대한 유전자로 유전자가 이입된 세포가 사멸하게 되므로 자살 유전자(suicide gene)로도 불린다. 즉, 정상세포에는 독성이 없는 전구체를 전신적으로 투여했을 때 암세포에만 전구체가 독성 대사체(toxic metabolite)로 전환되어 약제에 대한 감수성을 변화시킴으로써 암세포를 파괴시키는 방법이다. 대표적으로 HSV-tk(Herpessimplex virus-thymidine kinase) 유전자와 갠시클로비르(ganciclovir), 대장균의 사이토신 탈아미노효소(cytosine deaminase, CD) 유전자와 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine, 5-FC)가 가능하나 이에 한정되지 않는다.
상기 세포사멸 유전자(proapoptotic gene)는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 세포사멸 유전자로, p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 코딩하는 유전자가 포함된다.
상기 세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)는 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자(국제특허출원공개 WO 97/16459호 및 WO 96/30385호) 등이 있다.
상기 세포독성 유전자(cytotoxic gene)는 세포 내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 일예로, 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 등이 있다.
상기 종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 종양 괴사 인자(tumornecrosis factor-α, TNF-α), p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자,WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자(Lee et al., Nature, 329,642, 1987), MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일단백질(adenomatous polyposis coil protein)(Albertsen et al. 미국특허공보 US 5,783,666호), 결손된 결장종양 (DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자(Chenget al. Proc. Nat. Acad. Sci., 95,3042-3047, 1998), MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자 및 VHL 유전자가 포함된다.
상기 항원성 유전자(antigenic gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 p53(Levine, A., 국제특허출원공개 WO 94/02167호)이 포함된다.
상기 사이토카인 유전자(cytokine gene)는 세포 내에서 발현되어 사이토카인을 생성하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 GM-CSF, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20), 인터페론 α,β, γ(인터페론 α-2b) 및 인터페론 α-2α-1과 같은 융합체 등이 포함된다.
상기 항신생혈관 생성 유전자(anti-angiogenic gene)는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 그 예로 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.
본 발명의 PEPCK_APO intron-ribozyme_HSVtk 서열은 서열번호 24로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에서는 상기 라이보자임 활성을 통해 암 특이 유전자에 리포터 유전자를 접합할 수 있다. 이렇게 특정 조직에서 암 특이 유전자에 접합된 리포터 유전자는 프로모터의 전사 활성에 따라 리포터 단백질로 발현된다. 이에 따라 발현된 리포터 단백질의 활성 또는 양을 측정함으로써 암 세포를 진단할 수 있다. 이때 리포터 유전자는 본 발명이 속하는 분야에서 공지된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 LacZ, 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT: chloramphenicol acetyl transferase), 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase), 반딧불이(firefly) 루시퍼라아제, 적색형광단백질(RFP), 녹색형광단백질(GFP), 분비성 태반 알칼라인 포스파타아제(secreted placental alkaline phosphatase, SEAP) 또는 HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)를 암호화하는 유전자를 사용한다.
이러한 리포터 단백질들의 활성은 하기와 같이 당업자에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 측정할 수 있다:
반딧불이 루시퍼라아제(de Wet J. et al., Mol. Cell Biol., 7, 725-737, 1987 참조), 레닐라루시퍼라아제([Lorenz W.W. et al., PNAS 88, 4438-42, 1991) 참조), 클로람페니콜 아세틸 전이효소(Gorman C.et al.,Mol. Cell Biol., 2, 1044-1051, 1982 참조), LacZ(Hall C.V. et al., J. Mol. Appl. Genet .,2,101-109, 1983 참조), 인간 성장 호르몬(Selden R. et al.., Mol. Cell Biol., 6, 3173-3179, 1986 참조), 녹색 형광 단백질(Chalfie M. et al., Science, 263, 802-805, 1994 참조) 및 분비성 태반 알칼린 포스파타아제(Berger, J. et al., Gene, 66, 1-10, 1988 참조). 또한, 티미딘 키나제(thymidine kinase)를 리포터 단백질로 한 경우 PET(positron emission tomography) 이미징 법을 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 조직 특이적 프로모터, 이 프로모터와 작동가능하게 연결된 암 특이적 유전자에 작용하는 트랜스 스플라이싱 라이보자임(trans-splicing ribozyme), 라이보자임 3' 엑손에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자 및 혈청형(serotype) 35의 섬유 혹(fiber knob)과 혈청형 5의 사프트(shaft)를 포함하고, 아데노바이러스 E1, E3 및 E4 orf1 내지 orf4 유전자가 결손된 재조합 아데노바이러스를 제조하였다(도 1 참조).
또한, 인핸서 유무에 따른 치료 유전자의 효과를 확인하기 위하여, 인핸서를 포함하지 않는 pPT-O 재조합 아데노바이러스 및 인핸서를 포함하는 pPT-E 재조합 아데노바이러스를 제작하여, Hep3B 간암 세포주 및 SK-OV3 난소암 세포주에 각각 형질감염시켜, GCV 업테이크 분석을 수행한 결과, ApoE 인핸서를 포함하지 않는 pPT-O 재조합 아데노바이러스는 간암세포주 및 난소암 세포주에서 유의적인 변화를 나타내지 않는 반면, ApoE 인핸서를 포함하는 pPT-E 재조합 아데노바이러스는 PEPCK 양성 간암 세포주에서 현저한 HSVtk 활성을 나타내었으나, SK-OV3 난소암 세포주에서는 유의적인 변화를 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 혈청형 35의 섬유 혹(fiber knob)과 혈청형 5의 샤프트를 포함하는 아데노바이러스의 감염성을 확인하기 위하여, 도 4의 재조합 아데노바이러스를 제조하여, Hep3B 간암 세포주에서 정량적 PCR을 이용하여 아데노바이러스 게놈수를 측정한 결과, 본 발명의 혈청형 35의 섬유 혹과 혈청형 5의 샤프트를 포함하는 Ad5/35CMV. GFP는 Ad5CMV. GFP와 비교하여 감염성이 현저히 증가한 것을 확인하였다(도 5 및 6 참조).
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 Ad-PRT의 간암 특이적 항암효과를 확인하기 위하여, 재조합 아데노바이러스를 Hep3B 간암 세포주 및 SK-OV3 난소암 세포주에 감염시킨 후, GCV를 처치하여 세포 생존율을 측정한 결과, 간암 세포주에서는 사멸 정도가 높았으나, 난소암 세포주에서는 유의적인 세포 사멸을 나타내지 않아 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 간암 특이적임을 확인하였다(도 7 참조)
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 Ad-PRT의 트랜스-스플라이싱 작용을 확인하기 위하여, Hep3B 간암 세포주 및 SK-OV3 난소암 세포주에 감염시킨 후, RNA 분석을 수행하였으며, 그 결과 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 간암 세포주에서 트랜스-접합 분자(TSM, trans-spliced molecules)가 생성됨을 확인하였다(도 8 참조).
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 Ad-PRT의 간암 특이적 독성 효과를 확인하기 위하여, 간암 세포주, 비-간암 세포주, 폐암 세포주 및 대장암 세포주를 이용하여 세포 사멸 효과를 확인한 결과, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 간암 세포주에서만 유의적인 세포 사멸 효과를 나타냄을 확인하였다(도 9 참조).
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 Ad-PRT의 생체 내(in vivo)에서의 간암-특이적 표적화 능력을 확인하기 위하여, 마우스에 재조합 아데노바이러스를 투여하고, 조영제를 micro-PET/CT를 통해 검출한 결과, 양성 대조군에서는 조영제가 광범위하게 검출되었지만, 본 발명의 재조합 아데노바이러스에서는 조영제 흡수 신호가 간에서 나타나지 않아, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 유전자 타겟 조직에 대한 높은 특이성을 나타냄을 확인하였다(도 10 참조). 또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 Ad-PRT가 간암-특이적으로 잘 감염되었는지 확인하기 위하여, 정상 부위 및 간암 부위에서 각각 RNA를 분리하여 RT-PCR 분석을 수행한 결과, 간암 조직에서 본 발명의 재조합 아데노바이러스 말단 부위(ITR) 및 치료유전자(TK)가 현저히 발현되는 것을 확인하였다(도 12 참조).
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 Ad-PRT의 생체 내(in vivo)에서의 안전성을 분석하기 위하여, 재조합 아데노바이러스가 처치된 마우스의 생존 플랏(survival plot), 간 기능 평가 및 TUNEL 분석법을 수행한 결과, 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 투여된 마우스는 모두 생존하였으며, 간 기능의 저하가 나타나지 않았고, 정상 간세포가 병리학적으로 영향을 받지 않음을 확인하여, 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 현저한 안전성을 나타내는 것을 확인하였다(도 13 내지 15 참조).
또한, 마트리겔 침습 검정법 및 면역조직화학적 분석법을 이용하여, 종양세포 침습에 있어서의 hTERT 제거의 영향을 확인한 결과, 라이보자임 매개 hTERT 제거가 암 전이 또는 신생혈관 관련 경로의 억제를 통한 생체 내 항암 작용을 나타내는 것을 확인하였다(도 16 및 도 17 참조).
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 Ad-PRT의 생체 내(in vivo)에서의 항암 효능을 분석하기 위하여, 재조합 아데노바이러스 처치된 마우스의 micro-PET/CT 영상 분석, 조직 분석 및 종양 무게 분석을 수행한 결과, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 간암에 대해 강한 항암 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 18 내지 24 참조).
따라서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 생체 내에서의 현저한 안전성, 표적 조직에 대한 높은 특이성 및 현저한 항암 효과를 가져, 유전자 치료 요법에서 항암용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 항암용 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는, 다양한 종양 세포에 대하여 항종양 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 뇌암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 식도암, 췌장암, 방광암, 전립선암, 대장암, 결장암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 난소암에서 복강 내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암 및 두경부암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결정암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테터 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.
본 발명 항암용 약학적 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ×105 내지 1 × 1015 PFU/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 1 × 1010PFU를 이틀에 한 번씩 5일 동안 주사한다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제(chemotherapeutic agent)는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 마이토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오 로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사및 γ-선 조사 등이다. 바람직하게는 갠시클로비르(ganciclovir)와 병용하여 사용한다.
또한, 본 발명은 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 상기 재조합 아데노바이러스로 암 세포에 도입하는 단계; 및
2) 암 세포에서 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 간암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 숙주세포가 리포터 단백질을 발현하도록 하기 때문에 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 도입된 암 세포는 리포터 단백질을 나타낼 수 있으며, 이러한 리포터 단백질의 검출은 상술한 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 의해 진단될 수 있는 암 또는 종양은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이며, 가장 바람직하게는 간암이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 재조합 아데노바이러스 구축
본 발명의 재조합 아데노바이러스를 제작하기 위하여, 라이보자임은 공지된 문헌에 기재된 방법에 의해 제작하였다(Kwon et al., Mol. Ther. 12:824-834, 2005). 또한, PEPCK 유전자의 프로모터는 공지된 문헌에 기재된 방법에 의해 제작하였다(Kwon, B.S. et al, FEBS Lett 580, 5033-5043, 2006). 또한, PEPCK 프로모터, ApoA1(Apolipoprotein A1) 인트론, 라이보자임 및 HSVtk 유전자로 구성된 PEPCK.Rz.HSVtk를 포함하는 pcDNA 3.1(Invitrogen) 벡터(pPEPCK.Rz.HSVtk)는 공지된 문헌에 기재된 방법에 의해 제작하였다(Song MS, et. al. Cancer Gene Ther2009;16:113-125.). 그런 다음, 상기 PEPCK.Rz.HSVtk를 포함하는 pcDNA 3.1(Invitrogen) 벡터(pPEPCK.Rz.HSVtk)로부터 PEPCK.HSVtk를 SalI과 SmaI 제한효소로 자르고 미리 SalI과 EcoRV 제한효소로 잘라 놓은 pZAP1.1△NotI/BglII 벡터(OD260, Boise, ID)와 연결하여 pZAP1.1(PEPCK.TK)를 제작하였다. 아울러, pZAP1.1△NotI/BglII 벡터의 BglII와 NotI은 추후 ribozyme을 넣어야 할 제한효소 자리의 중복을 피하고자 미리 제거하였다. 이 후, hTERT를 인지하는 ribozyme 서열을 하기 프라이머를 이용하여 CMV-Ribo-TK vector(단국대학교 이성욱교수님으로부터 수득)에서부터 증폭한 후, 상기 제작한 pZAP1.1(PEPCK-TK) vector(BglII→NotI(treated by Klenow))를 증폭된 ribozyme 서열과(BamHI/HpaI처리) 함께 결합하여 pZAP1.1(PEPCK.Rz/As.TK)를 제작하였다.
Figure 112012095934760-pat00001
그런 다음, 상기 제작한 pZAP1.1(PEPCK.Rz/As.TK)에 poly A signal(서열번호: 5)과 enhancer(서열번호: 6)을 결합하여 pZAP1.1(PEPCK.Rz/As.TK) 최종 폼(complete form)을 제작하였다. 아울러, 아데노바이러스 E1, E3 및 E4 orf1 부터 orf4 유전자가 결손은 공지된 방법을 이용하였다(Yeh P, Dedieu JF, et. al. J Virol. 1996 Jan;70(1):559-65). 그런 다음, 공지된 방법(Shayakhmetov DM, et. al. J Virol. 2000 Nov;74(22):10274-86)을 이용하여 pAd363(OD260)에서 섬유 혹(fiber knob) 부분을 혈청형(serotype) 35의 섬유 혹으로 치환하여 pAd363.35fk를 제작한 후, 상기 제작한 pZAP1.1(PEPCK.Rz/As.TK) 최종 폼을 SfiI으로 절단시키고 연결시켜, 최종 재조합 아데노바이러스 벡터를 제작한 다음, HEK293세포에서 증폭하였다(도 1).
< 실시예 2> 세포 배양
본 발명에서 사용된 모든 인간 암 세포 및 인간 유선 상피성 세포주(human mammary epithelial cell line; HMEC)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였다.
Hep3B 세포 및 HMECs는 10% 우태아 혈청(FBS)(Invitrogen 사, 미국)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin; P/S)(Invitrogen사, 미국)이 포함된 RPMI1640 배지에서 배양하였고, 상기 세포주들 모두 37℃ 및 5%의 이산화탄소의 조건을 가진 배양기에서 배양된 후, 하기 실험에 사용하였다.
< 실험예 1> 인핸서 유무에 따른 치료유전자의 효과 확인
ApoE 인핸서의 존재에 따른 PEPCK로 유도된 HSVtk 활성을 확인하기 위하여, 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 조직 특이적 프로모터 PEPCK와 HSVtk를 포함하는 pPEPCK-HSVtk(pPT-O), 및 PEPCK, HSVtk 및 ApoE 인핸서를 포함하는 pPEPCK- HSVtk-Enh(pPT-E) 재조합 아데노바이러스를 제작하였다(도 2). 그런 다음, 24 웰 플레이트에서 상기 각각의 재조합 아데노바이러스 1 MOI를 Hep3B 간암 세포주 및 SK-OV3 난소암 세포주에 각각 감염시킨 다음, 48시간 후, 상기 감염된 세포에 1.0 mCi/ml [8-3H]penciclovir(PCV) 처리 및 비처리한 후, 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 상기 세포를 0.1 % SDS 200 ml에 용해시킨 다음, 방사능을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, ApoE 인핸서를 포함하지 않는 pPT-O 재조합 아데노바이러스는 간암세포주 및 난소암 세포주에서 유의적인 변화를 나타내지 않는 반면, ApoE 인핸서를 포함하는 pPT-E 재조합 아데노바이러스는 PEPCK 양성 간암 세포주에서 현저한 HSVtk 활성을 나타내었으나, SK-OV3 난소암 세포주에서는 유의적인 변화를 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 3).
< 실험예 2> 혈청형( serotype ) 35의 섬유 혹( fiber knob )과 혈청형 5의 샤프트( shaft)를 포함하는 아데노바이러스의 감염성 확인
혈청형 35의 섬유 혹과 혈청형 5의 샤프트를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 감염성을 확인하기 위하여, CMV 프로모터, 녹색형광단백질(GFC)을 포함하고 E1 및 E3 유전자가 결실된 재조합 아데노바이러스(Ad5CMV. GFP)를 제작하였다. 또한, CMV 프로모터, 녹색형광단백질(GFC) 및 혈청형 35의 섬유 혹과 혈청형 5의 샤프트를 포함하고, E1 및 E3 유전자가 결실된 재조합 아데노바이러스(Ad5/35CMV. GFP)를 제작하였다(도 4). 그런 다음, 상기 각각의 재조합 아데노바이러스를 Hep3B 간암 세포주에 감염시킨 후, 유세포 분류기(flow cytometry) 및 현미경 관찰을 통해 GFP-양성 세포수를 확인하였다. 또한, 상기 Ad5CMV. GFP 및 Ad5/35CMV. GFP로 감염된 Hep3B 간암 세포주에서 정량적-PCR을 이용한 아데노바이러스 게놈 복제 수를 측정하였다.
구체적으로, DNA는 QIAamp DNA mini kit 추출한 후, 60 ul nuclease-free water에 녹인 다음, 상기 DNA 농도를 nano-drop을 이용하여 측정하였다. 정량 PCR(qPCR)은 10 ml 2 X SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa BIO INC 사, 일본), 200 nM 표적 프라이머 세트(AdITR-F: 5'-AGC CAA TAT GAT AAT CAG GGG GTG-3'(서열번호: 9), AdITR-R: 5'-TAC GCG CTA TGA GTA ACA CAA A-3'(서열번호: 10)) 및 0.4 ml 50 X ROX 참고 염색제를 포함하는 20 ml의 총 볼륨에 50 ng 게놈 DNA를 사용해서 수행하였다. PCR 조건은 ABI PRISM 7900HT(Applied biosystems 사, 미국)을 사용해서 95℃에서 30 초 및 60℃에서 1 분의 조건에서 40 사이클이다. 베타-액틴(-actin)의 증폭은 관심 있는 유전자를 가지고 병행하여 수행하였고 -[Ct표적Ct베타 액틴]처럼 정의된 Ct에 의한 표적 단백질 발현의 상대량을 분석하였다. 표준 곡선은 아데노 바이러스 입자 101 에서 109 의 범위에서 결정하였다. 각 분석은 주형을 포함하고 있지 않은 대조군을 포함한다. 모든 측정은 3회 반복하여 수행하였다. 5% 이상의 다양성의 계수를 갖는 샘플은 재시험하였다.
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 혈청형 35의 섬유 혹과 혈청형 5의 샤프트를 포함하는 Ad5/35CMV. GFP는 Ad5CMV. GFP와 비교하여 감염성이 현저히 증가한 것을 확인하였다(도 5 및 도 6).
< 실험예 3> 재조합 아데노바이러스의 간암 특이적 효과 확인
간 조직 특이적 PEPCK 프로모터와 hTERT(human Telomerase reverse trasncriptase)를 타겟팅하는 라이보자임 및 혈청형(serotype) 35의 섬유 혹과 혈청형 5의 샤프트를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 간암 특이적 항암효과를 확인하기 위하여, Ad-PRT, Ad-PT 및 Ad-Mock을 다양한 감염다중도(MOI: multiplicities of infection)로 Hep3B 간암 세포주 및 SK-OV3 난소암 세포주에 감염시킨 후, 100 ㎛ 갠시클로비(GCV)를 처치하였다. 그런 다음, 상기 처치 후, 5일째 살아 있는 세포의 비율을 확인하기 위하여, 크리스털 바이올렛(crystal violet) 분석을 실시하였다.
구체적으로, 크리스털 바이올렛 분석은 세포주의 배양 배지(culture media)를 제거하고 PBS로 두 번 씻어 주고 2.3% 크리스털 바이올렛 용액을 넣어 주고 10분간 반응시킨 후에 PBS로 씻은 다음, 100% MeOH로 세포를 고정한 후 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 간암세포주인 Hep3B에서는 Ad-Mock에 비해 Ad-PRT 및 Ad-PT로 감염시킨 세포에서 사멸 정도가 높은 것을 확인하였고, 난소암세포주인 SKOV3에서는 Ad-PRT, Ad-PT 및 Ad-Mock 모두에서 유의적인 세포사멸을 나타내지 않으므로, 본 발명의 Ad-PRT는 간암 특이적임을 확인하였다(도 7).
< 실험예 4> Ad - PRT 의 트랜스- 스플라이싱 작용 확인
상기 <실시예 1>에서 제작한 Ad-PRT의 트랜스-스플라이싱 작용을 확인하기 위하여, Ad-PRT 및 Ad-Mock을 각각 0, 1, 5 및 10 MOI로 Hep3B 간암 세포주 및 SK-OV3 난소암 세포주에 감염시킨 후, RNA 분석을 수행하였다.
구체적으로, 재조합 아데노바이러스가 처리된 세포들의 라이보자임 RNA의 수준을 분석하기 위해 20 mM EDTA를 포함한 트리졸(Trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA) 용액을 이용하여 전체 RNA 5㎍을 추출한 후, 10 mM L-아르기닌아미드와 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 역전사하였다. 상보적 DNA는 HSVtk 특이적 프라이머(5'-GCGAACATCTACACCACACA-3'(서열번호: 11) 및 5'-AGTTAGCCTCCCCCATCTC-3'(서열번호: 12))를 이용하여 증폭시켰다. 또한, 검증을 위해서 GAPDH 특이적 프라이머(5'-TGACATCAAGAAGGTGGTGA-3'(서열번호: 13) 및 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(서열번호: 14))를 이용하여 상보적 DNA를 증폭시켰다. 세포 내에서의 트랜스-접합 RNA 산출물을 확인하기 위해서 전체 RNA에서 HSVtk 특이적 프라이머(5'-CGGGATCCTCAGTTAGCCTCCCCCAT-3'(서열번호: 15))를 사용하여 10 mM L-아르기닌아미드의 존재하에서 역전사 반응을 수행했으며 그 결과물을 주형으로 하여 hTERT RNA의 5' 말단 특이적인 5'프라이머(5'-GGGGAATTCAGCGCTGCGTCCTGCT-3'(서열번호: 16))와 HSV-tk의 3' 말단의 염기서열에 특이적인 3' 프라이머(5'-GTTATCTGGGCGCTTGTCAA-3'(서열번호: 17))를 가지고 상보적 DNA를 증폭시켰다. 이 상보적 DNA를 주형으로 하여 다시 트랜스-접합 결합 부위 특이적인 5' 프라이머(5'-GCTGCGTCCTGCTAAAAC-3'(서열번호: 18))와 HSVtk의 염기서열 특이적인 네스티드 3' 프라이머(5'-CAGTAGCGTGGGCATTTTCT-3'(서열번호: 19))를 이용하여, 증폭, 클로닝 및 염기서열 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, Ad-PRT 재조합 아데노바이러스로 감염된 hTERT+ Hep3B 세포들에서는 트랜스-접합 분자(TSM, trans-spliced molecules)가 생성되었으나 hTERT- SKOV3 세포에서는 TSM이 생성되지 않는 것을 확인하였다. 따라서, Ad-PRT에 감염된 Hep3B 세포의 트랜스-접합 분자(TSM)는 타겟 hTERT RNA의 간 특이적 트랜스-접합 반응으로부터 생성된 것을 확인하였다(도 8).
< 실험예 5> Ad - PRT 의 간암 특이적 독성 확인
Ad-PRT의 간암 특이적 독성 효과를 확인하기 위하여, 상기 <실시예 2>에서 배앙한 PEPCK-양성 및 hTERT-양성 간암 세포주(HepG2, SNU398 및 SNU739), 및 PEPCK-음성 및 hTERT-음성 비 간암 세포주(인간 상피 세포(Human epithelial cell; HDF), 폐암 세포주(SBC-5) 및 대장암 세포주(HCT116))에 Ad-PRT 10 MOI를 처리한 후, 상기 <실험예 3>과 동일한 방법으로 세포 사멸 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, Ad-PRT는 비 간암 세포주에서는 유의적인 반응을 나타내지 않았으나, 간암 세포주에서는 현저한 세포 사멸 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 Ad-PRT는 간암 특이적 독성 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 9).
< 실험예 6> 생체 내( in vivo ) Ad - PRT 의 간암-특이적 표적화 능력 확인
<6-1> 실험 동물
실험 동물로 4 내지 5주 된 수컷 Balb/c-누드 마우스(오리엔트바이오, 한국)를 사용하였다. 실험동물은 무병균 조건에서 사육되었으며, 사용 전 최소 1주일 동안 실험실 환경에 길들여졌고, AAALAC 국제 동물 관리 규정(AAALAC International Animal Care policy)에 따르는 국립암센터 동물관리센터에서 사육되었다(accredited unitNational Cancer Center Research Institute: unit number-1392)
<6-2> Ad - PRT 의 간암-특이적 표적화 능력 확인
생체 내 Ad-PRT의 간암-특이적 표적화 능력을 확인하기 위해서, 본 발명의 재조합바이러스를 암을 가지고 있지 않은 상기 <6-1> 마우스에 상기 Ad-PRT를 전신적으로 투여하고, 정상 간에 감염여부를 [18F]FHBG (9-(4-[18F]fluoro-3-hydroxymethylbutylguanine) 조영제를 이용하여 micro-PET/CT를 통해 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 재조합바이러스가 감염된 간에서 재조합 아데노바이러스에 매개한 TK(thymidine kinase) 유전자가 발현이 되면, [18F]FHBG 조영제가 재조합 아데노바이러스가 감염된 세포에 흡수가 되고 micro-PET/CT을 사용해서 검출을 하였다. 이에, 상기 <실시예 1>에서 제조한 Ad-Mock, Ad-CT, Ad-PT 및 Ad-PRT을 각각 5 x 108pfu로 비 암 유발 마우스 꼬리 정맥을 통해 전신적으로 주입을 하였고, 주입 2일 후에 micro-PET/CT을 사용해서 확인하였다.
또한, PET을 사용해서 HSVtk의 발현을 검출하기 위해서, Ad-Mock, Ad-CT, Ad-PT 및 Ad-PRT이 주입된 누드마우스를 100% 산소 안에서 2% 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 마취했고, 적어도 6시간 절식한 후 마취가 되어있는 동안 18F-FHBG(14.8 MBq)를 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. [18F]FHBG (9-(4-[18F]fluoro-3-hydroxymethylbutylguanine)는 PET를 사용해서 HSVtk의 발현을 검출하기 위해서 사용하였다.
PET-CT 혼합 영상은 CT(6분간 300 μA 및 40 kV; resolution = 200; acquired projection number =360)를 위한 엑스레이 조건 아래에서 3차원 자료수집 모드(GE 사, 미국)를 수행했다. 영상들은 [수학식 1]을 사용해서 표준화 흡수값(standardized uptake values; SUV)에 평준화하였다.
[수학식 1]
SUV = 감쇄 보정 평균조직 활동 농도(decay corrected mean tissue activity concentration)(Bq/ml) / (투여량 (Bq) x 체중( g))
모든 MRI 영상들은 7 T 바이오스펙 분광계(Biospec spectrometer) (Bruker 사, 독일)를 이용하여 확인하였다. T2 중량적 고속 회전 공명 펄스(weighted fast spin echo pulse) 서열은 하기와 같이 설정을 가지고 기록되었다:
반복 시간(repetition time; TR) = 2,500 ms; 잔향 시간(echo time; TE) = 30 ms; 256*256 matrix; 가시 영역(field of view; FOV) = 3*3 cm; 절편 두께(slice thickness )= 0.7 mm; 평균 수(number of average) = 2; RARE factor = 4.
PET/MR 혼합 실험을 위해서, MRI 영상, MRI 영상은 일반적인 토대(bed)를 사용한 PET-CT 스캔을 수행하였다.
PET/MR 융합 실험을 위해서, MRI 영상을 일반적인 토대(bed)를 사용한 PET-CT 스캔 후에 수행하였다. PET-MR영상 융합 처리는 OsiriX 영상 소프트웨어를 사용해서 수행하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, HSVtk 유전자 발현과 연관된 [18F]FHBG 분포는 Ad-PT 및 Ad-CT 투여시, 간에서 광범위하게 나타난 반면에, Ad-PRT 투여 군은 Ad-PRT의 간에 대한 강한 내재성 방향성에도 불구하고, [18F]FHBG 흡수 신호가 간에서 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 10). 따라서, 본 발명의 Ad-PRT는 라이보자임과 조직 특이적 프로모터 PEPCK의 이중 조절을 통해, 유전자 타겟 조직에 대한 높은 특이성을 나타냄을 확인하였다.
< 실험예 7> 암 유발 마우스에서 Ad - PRT 의 간암-특이적 표적화 능력 확인
암 유발 마우스에서 Ad-PRT의 간암-특이적 표적화 능력을 확인하기 위하여, Ad-PRT 및 Ad-Mock 각각을 마우스에 전신적으로 투여하고, 암세포에 감염여부를 [18F]FHBG 조영제를 이용한 micro-PET/MR를 통해 확인하였다.
구체적으로, 마우스의 이자(intraspleen)를 통해 간암 세포주인 Hep3B 세포를 주입한 다음, 3주 후에 Ad-PRT 및 Ad-Mock을 각각 5 x 108pfu로 마우스 꼬리 정맥을 통해 전신적으로 주입을 하였고 micro-PET/MR 혼성 실험을 이용하여 HSVtk의 발현을 확인하였다. 또한, 간암 성장 확인은 18F-FDG(14.8 MBq)를 사용해서 PET 영상화를 수행하였으며, MRI 영상은 PET-CT 스캔으로 수행하였고, PET-MR 영상 혼합 처리는 OsiriX 영상소프트웨어를 사용해서 수행했다.
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 감염되었는지 확인하기 위하여, 상기 마우스의 정상 부위(normal; N) 및 간암 부위(tumor; T)에서 각각 RNA를 분리한 후, RT-PCR 분석법을 수행하였다.
구체적으로, Ad-PRT 에 의한 TSM의 생산은 내포적(nested) RT-PCR을 사용해서 조사하였다. 첫 번째 PCR은 트랜스 스플라이싱 반응의 결합 부위를 위한 특이적 5' 프라이머(5'-GGG GAA TTC AGC GCT GCG TCC TGC T-3'(서열번호: 20)) 및 HSVtk를 위한 3' 프라이머(5'-GTT ATC TGG GCG CTT GTC AA-3'(서열번호: 21))를 사용해서 수행하였다. 두 번째 PCR은 HSVtk의 내부 서열을 위한 프라이머(정방향 5'-CGT CCT GCT AAA GTT GGC CGC-3'(서열번호: 22) 및 역방향 5'-GCA GTT GCG TGG TGG TGG TT-3'(서열번호: 23))를 사용해서 수행하였다.
그 결과, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 간암 세포주에 의해 유발되는 종양 지역에서 Ad-PRT에 의한 신호들이 검출(흰색 화살표)되었고, 이는 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 매우 훌륭한 간암 표적화를 형성을 할 수 확인하였고(도 11), 또한 Ad-PRT가 감염된 간암 조직(T)에서 아데노 바이러스 말단 부위(ITR) 및 치료유전자(TK)가 현저히 발현되는 것을 확인하였다(도 12).
< 실험예 8> 생체 내( in vivo )에서의 Ad - PRT 의 안전성의 분석
<8-1> 생체 내 실험을 위한 마우스 모델의 제조 및 바이러스의 투여
인간 간세포암종(HCC)이 모방된 다발성 마우스 간암 모델은 Balb/c-누드 마우스(Orient Bio 사, 대한민국)에 Hep3B 3x106 세포를 비장 내 투여하여 제조하였다. 상기 동물은 AAALAC 국제 동물 관리 규정(AAALAC International Animal Care policy; 공인 규격(accredited unit)National Cancer Center Research Institute: 유닛 넘버(unit number)-1392)을 준수하는 국립암센터의 동물관리센터에서 사육되었다. 거의 모든 마우스는 Hep3B 세포 투여 12 또는 14일 후에 간에서, 특히 간의 경계부위에서 육안 검사에 의해서 쉽게 검출되는 다발성 소형 종양 결절을 확인했다. 또한, 마우스의 대다수에서 비장 종양 결절도 나타난 것을 확인하였다.
<8-2> 생체 내( in vivo )에서의 Ad - PRT 의 안전성의 분석
본 발명자들은 Ad-PRT의 안전성을 평가를 위해서, 상기 <8-1>에서 제조한 종양이 형성된 마우스(n=10)에 재조합 아데노바이러스 5 x 108 pfu를 정맥 내로 투여하고 GCV를 14일 동안 처리하였다.
구체적으로 각각 Ad-Mock, Ad-CRT, Ad-PT 및 Ad-PRT로 처치된 군의 생존 플랏(survival plots)은 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 방법을 이용하여 평가되었고, 마우스의 간 기능은 혈청 ALT 및 AST를 이용하여 측정하였다.
또한, 간 특이적인 효소 수치(ALT 및 AST)는 GCV 처치 후 3일 및 6일에 UV 분광계를 이용하여 측정하였고, 대표적으로 다수의 암 조직(n=6/group)에서 H&E 염색을 하여 조직학적 관찰을 수행하였으며, 세포 사멸 평가를 TUNEL법을 이용하여 수행하였다.
TUNEL 분석법은 In situ 세포 검출 키트(Cell Detection Kit) (Roche 사, 독일)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, Ad-PT를 투여한 마우스는 약 10일까지 생존한 반면, Ad-Mock 및 Ad- PRT군에서는 모든 마우스가 생존하는 것을 확인하였다(도 13). 또한, Ad-PT 군에서는 간 특이적 효소 ALT 및 AST의 양은 매우 높은 반면, Ad-PRT 및 Ad-Mock 군에서는 변화하지 않았고, 특히 6일째에도 변화하지 않았다(도 14). 아울러, CMV 프로모터가 PEPCK 대신에 Rz-HSVtk를 조절하는 Ad-CRT는 Ad-PT와 비슷하게 강한 독성을 나타내는 것을 확인하였다(도 13).
따라서, 본 발명의 Ad-PRT는 Ad-PT 및 Ad-CRT에 비해서 현저한 안전성 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 조직학적 검사로 Ad-PRT 및 Ad-Mock군에서 정상 간세포가 병리학적으로 영향을 받지 않음을 확인하였다(도 15). 구체적으로, TUNEL 분석을 이용하여, Ad-PRT 처리군 종양 결절에서 자가세포사멸의 특징들(예 암갈색 점)이 현저하게 나타남을 확인하였다. 이와 대조적으로, Ad-PT 처리군 마우스들 간에서는 간세포의 미만성 부종, 반점성 괴사(spotty necrosis) 및 사멸이 나타났고, 6일째에는 더 광범위하게 확장되었다(도 15). 자가세포사멸적인 특징들은 Ad-PT군에서 종양성 간세포 및 비종양성 간세포에서 두드러지게 관찰되었다. Ad-PT군에서 종양 결절의 자가세포사멸 빈도는 Ad-PRT군 보다 더 적었다. 이러한 결과들은 간 특이적 프로모터 PEPCK의 도입이, Rz-매개 표적화에 있어서 부가적인 안전성을 제공하며, Ad-PRT가 비종양성 간세포를 손상시키지 않고 특이적으로 HCC를 표적화할 수 있다는 것을 확인하였다.
< 실험예 9> 생체 내( in vivo )에서의 Ad - PRT 의 치료적 효능의 분석
<9-1> 종양세포 침습에 있어서의 hTERT 제거의 영향
본 발명자들은 종양세포 침습에 있어서, 라이보자임에 의한 hTERT 제거의 영향을 확인하기 위해, GCV 처치되지 않은 아데노바이러스-처치 세포에서 마트리겔 침습 검정법(matrigel invasion assay)을 수행하였다.
구체적으로, 바이러스 감염 4일 후, 24-웰 플레이트에서 마트리젤(Matrigel)(BD Bioscience 사, 미국)로 코팅된 폴리카보네이트 필터(polycarbonate filters) (6.5-mm 직경, 8.0 mm 구멍 크기, BD Bioscience 사, 미국)의 상층 챔버(chambers)에 Hep3B 세포 (5 x 105)를 플레이팅 시키고, 24시간 배양했다. 침습 세포들은 Diff-Quik 염색 키트(Sysmex사, 미국)를 사용해서 고정화 및 염색되었고, 역상 현미경(phase contrast microscope)을 사용해서 영상화하고 계산하였다. 각 막 필터에 5곳의 무작위로 선별한 지역을 정량했다. 또한, 면역조직화학적 분석법(immunohistochemical assays)은 4- 에서 6-㎛-두께 파라핀에 담근 간 샘플을 반-자동면역염색기(Semi-autoimmunostainer) (Roche 사, 스위스)을 사용해서 제조사의 지시에 따라서 수행하였다. 샘플들은 일차 항체(항-VEGF-C; 1:50, 항-CD34; 1:200, AB Biotech사)로 처치되었고, 면역 염색은 디아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine) 기질 시스템을 사용해서 수행하였다. 슬라이드는 푸르게 염색되는 헤마토실린(hematoxylin)을 가지고 교차염색을 하였다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 간암 세포 침습 특성의 강한 억제는 비 처리군 또는 Ad-MOCK 및 Ad-PT 감염군과 달리 Ad-PRT 처리 군에서 관찰되었다(도 16).
또한, 도 17에 나타난 바와 같이, Ad-Mock 감염 군에서 간암세포는 VEGF가 강하게 염색되었으나, VEGF 발현은 Ad-PRT 군에서 급격하게 감소된 것을 확인하였다. 또한, CD34 면역염색법에 나타난 것과 같이, 종양 부위에서 혈관 형성이 Ad-Mock에 비해 Ad-PRT군에서 거의 완전하게 억제된 것을 확인하였다(도 17).
따라서, 라이보자임(Ribozyme) 매개 hTERT 제거가 암 전이 또는 신생혈관 관련 경로의 억제를 통한 생체 내 항암 작용을 나타내는 것을 확인하였다.
<9-2> 간세포암종 마우스 모델에서의 Ad - PRT 의 항- HCC 효과 분석
본 발명자들은 간세포암종 마우스 모델에서 Ad-PRT의 항-HCC 효과를 분석하기 위해, 무작위로 Ad-PRT(20마리)군 및 Ad-Mock(10마리)군으로 나누어 30마리의 누드 마우스들에 Hep3B 세포주를 투여하였다. Ad-PRT의 정맥 투여 후 14일째 생체 내 영상(n=10) 및 생검(n=30)을 이용해서 모니터링을 하였다.
구체적으로, 항-HCC 효과를 측정하기 위해서, GCV 처리 후, 14일째에 안락사시켰고, 모든 간엽은 제거, 측정되었고, 사진 촬영을 하고, 헤마토실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해 순차적으로 절편화되었다. 종양 부위(tumor fraction)는 아페리오 이미지스코프(Aperio Imagescope) v10.2.2.2319 소프트웨어를 사용해서 수치화됐고, 종양 무게는 종양 부위 수치와 간 중량을 곱하여 계산되었다.
종양 성장 모니터를 위해서 사용한 PET 영상화는 상기 실시예 <6-2>와 동일한 방법으로 수행하였다.
모니터링 후, 두 군 동물들 모두 안락사시켰고, 해당 동물의 간을 생체 내 영상 모니터링 결과들과 조직 병리학적 소견들이 일치하는지 확인하기 위해서 검사하였다.
본 발명자들은 모든 동물을 14일째 마이크로-PET/CT를 사용해서 영상화했고 두 개의 서로 다른 처리에 있어서, FDG의 이자의 흡수에 기초하여 비슷한 종양 개시 단계를 갖는 두 군으로 마우스를 무작위로 나누었다(도 18).
그 결과, 도 19 및 20에 나타낸 바와 같이, Ad-PRT 처리군(n=5)의 SUV 최대치는 2.5132±0.194였고, Ad-Mock 처리군은 2.6916±0.561이었다. 아데노바이러스와 GCV 처리 후 14일째, Ad-Mock 처리 동물들은 처치 전보다 2 내지 4배의 더 강한 간에서의 [18F]FDG PET 신호를 나타내었다. 이에 반해, Ad-PRT 처리된 마우스는 Ad-Mock 처리(간에서, 2.195±0.459 vs. 3.850±0.564, p=0.00531)와 비교해서 유의적으로 약한 신호를 나타냈다(도 21).
따라서, 간과 이자에서 Ad-PRT로부터 발현된 HSVtk가 Hep3B 간암 세포 사멸을 촉발시키는 것을 확인하였다.
또한, 간의 상태가 생체 내 영상 모니터링 결과들과 조직학적 소견들이 일치하는지 확인한 결과, 도 20 및 22(PET 영상) 및 도 23(조직 사진)에 나타났듯이, Ad-Mock 군은 주목할만한 복부 팽창을 보였다. 대조군 동물들의 간은 간세포암종(HCC)에 의해 대부분 침습된 반면, Ad-PRT 그룹 동물들의 간은 PET 영상 결과에서 나타났듯이, 가끔, 분산되고, 작고 옅은 핑크색 종양 결절이 나타났다. 또한, 본 발명자들은 Ad-Mock 군 동물에서 급속한 종양 성장과 종양 색전을 일으키는 균질한(homogenous) 호산성 세포의 다발성 침윤(multifocal infiltration)을 관찰할 수 있었으나, Ad-PRT 군에서는 관찰할 수 없었다(도 23).
또한, 종양 무게는 종양 부위 수치와 간 중량을 곱하여 계산된 종양 무게는 대조군에서는 4.60 ±1.11이고, Ad-PRT군은 0.49 ±0.62로, 매우 유의적인 차이를 나타내었다(p= 0.00254)(도 24). 따라서, Ad-PRT는 간암에 대한 강한 항암 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
<110> National Cancer Center <120> Recombinant adenovirus with enhanced safety and anti-cancer activity and use thereof <130> 12p-10-07 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2080 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPCK promoter sequence <400> 1 cgagctcttt ggggagtcct aagagggcag ctggcaatgg acacctagca gtccctttga 60 gacttatttc agatggagct gtagaaagat gccatggctc acagtgcctc cctgggaagg 120 gggcagaggg ctgcccagtg aggcctcttg cgagcaggaa atcaccagag acaaggaaag 180 accagacccc aggatgacct cagttaggcc ttgcccgact gtcctcagag tcccattctc 240 tgtgtcctgg ttcttttaga agatcatgga cctccaggtc atttcgtaac cggaatctgc 300 cttgcggggg gttttgacaa gctatggtat agtgtatgtg ggggtactga cgaattggaa 360 gatcatggag accccttctc ctcctccatc attggtctgc cacatccctc ccaggagact 420 cacagcagag agaccttgga tgtatgtagg gtgctttaaa actccagctg agttacagtc 480 tctcctttct gttttcacct taaccttcca gggatgcaaa cccacgacag gtttagcagc 540 agagtggagg ctggccatga atctcagaga aagtgctcac tggaaaggct ggtttagccc 600 aggcctgatg tggaggcact gagctggacg 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Sequence <220> <223> AdITR reverse primer <400> 10 tacgcgctat gagtaacaca aa 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSVtk specific forward primer <400> 11 gcgaacatct acaccacaca 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSVtk specific reverse primer <400> 12 agttagcctc ccccatctc 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 13 tgacatcaag aaggtggtga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reversse primer <400> 14 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSVtk specific primer <400> 15 cgggatcctc agttagcctc ccccat 26 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTERT RNA specific primer <400> 16 ggggaattca gcgctgcgtc ctgct 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-tk specific primer <400> 17 gttatctggg cgcttgtcaa 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> 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Claims (13)

  1. 간조직 특이적 PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 유전자의 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 암 특이적 유전자에 작용하는 트랜스 스플라이싱 라이보자임(trans-splicing ribozyme); 상기 라이보자임 3' 엑손에 연결된 치료 유전자 또는 리포터 유전자; 및 혈청형(serotype) 35의 섬유 혹(fiber knob)과 혈청형 5의 사프트(shaft)를 포함하고, 아데노바이러스 E1, E3 및 E4 orf1 내지 orf4 유전자가 결손된 재조합 아데노바이러스.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 간조직 특이적 PEPCK 유전자의 프로모터는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 ApoA1의 인트론을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 암 특이적 유전자는 hTERT(human Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA, AFP(alphafetoprotein) mRNA, CEA(carcinoembryonic antigen) mRNA, PSA(Prostate-specific antigen) mRNA, 또는 CKAP2(Cytoskeleton-associated protein 2) mRNA인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 라이보자임은 hTERT(human Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA를 특이적으로 표적하는 트랜스-스플라이싱 그룹 I 라이보자임인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 치료 유전자는 약제감수성유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자 및 항신생 혈관 생성 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 LacZ, 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT: chloramphenicol acetyl transferase), 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase), 반딧불이(firefly) 루시퍼라아제, 적색형광단백질(RFP), 녹색형광단백질(GFP), 분비성 태반 알칼라인 포스파타아제(secreted placental alkaline phosphatase, SEAP) 또는 HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)를 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 서열번호 6으로 기재되는ApoE(apolipoprotein E) 유전자의 인핸서, PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 유전자의 인핸서, 혈청알부민 유전자의 인핸서, AFP(alphafetoprotein) 유전자의 인핸서, CEA(carcinoembryonic antigen) 유전자의 인핸서 또는 PSA(Prostate-specific antigen) 유전자의 인핸서를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  9. 제1항에 있어서, 상기 트랜스 스플라이싱 라이보자임은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  10. 제1항에 있어서, 상기 치료 유전자는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase) 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물.
  13. 1) 시험관내(In vitro)에서 제 1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노바이러스를 암세포에 도입하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 암 세포에서 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 시험관내(In vitro)에서 간암 진단을 위한 정보 제공방법.

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