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KR101429193B1 - 클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 - Google Patents

클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 Download PDF

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KR101429193B1
KR101429193B1 KR1020130053046A KR20130053046A KR101429193B1 KR 101429193 B1 KR101429193 B1 KR 101429193B1 KR 1020130053046 A KR1020130053046 A KR 1020130053046A KR 20130053046 A KR20130053046 A KR 20130053046A KR 101429193 B1 KR101429193 B1 KR 101429193B1
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KR
South Korea
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aptamer
nucleic acid
ctc
acid aptamer
aptamers
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Active
Application number
KR1020130053046A
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English (en)
Inventor
정상희
김정한
이륜표
민정란
임명운
Original Assignee
호서대학교 산학협력단
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Publication date
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Abstract

본 발명은 클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 이용한 클로르테트라사이클린의 검출 방법, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 클로르테트라사이클린 검출용 조성물 및 검출 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 앱타머는 클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합함으로써, 클로르테트라사이클린에 높은 친화도 및 특이도를 나타내는바, 식품, 상하수원, 인체 등으로부터 잔류 항생물질을 효과적으로 검출할 수 있다.

Description

클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 {Nucleic acid aptamer specifically binding to chlortetracycline}
본 발명은 클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 이용한 클로르테트라사이클린 검출 방법, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 클로르테트라사이클린 검출용 조성물 및 검출 키트에 관한 것이다.
테트라사이클린 (TC, Tetracycline)계 항생제는 현재 가장 널리 이용되는 항생제이다. 이들 항생제는 인체 및 동물용 의약품으로 일반적으로 세균에 의한 감염치료 시에 사용되어 상처 또는 감염의 치료율을 높이거나, 축수산물의 감염 예방 차원에서 직접 투여되거나 사료의 형태로 동물에게 주입된다.
그러나 현재 동물의 사료 찌꺼기나 배설물에 들어있던 잔류 테트라사이클린 또는 그 유사체가 토양이나 물에 흡수되었다가 환경에서의 여러 경로를 통하여 사람에게까지 영향을 줄 수 있어 문제가 된다. 특히 꿀, 우유, 계란 등에 잔류되어 있는 테트라사이클린은 이미 몇몇의 연구를 통해 그 문제점이 보고되었다.
또한 테트라사이클린계 화합물 등의 항생제가 잔류되어 있는 농축수산물을 장기간 섭취할 경우에 생체 내에 내성이 생겨 면역력을 떨어뜨리는 등 부작용이 생길 수 있다. 다시 말해 동물들에 대한 항생제 오남용으로 인해 일반적인 식중독균이 ‘다제내성균’(슈퍼 박테리아)이 된다면, 일반적으로 사용하는 항생제로는 식중독을 치료할 수 없게 되고, 이를 치유하기 위해 더 독한 항생제를 투여하는 악순환이 반복된다. 따라서 항생제의 오남용을 방지하는 것은 물론이고 식품의 안전성을 확보하기 위해 잔류된 항생제를 검출하는 방법을 개발하는 것이 필요하다.
앱타머는 특정 타깃에 대해 높은 특이성과 친화도를 갖는 단일가닥 DNA 또는 RNA의 구조체를 말한다. 앱타머는 센서 분야에서 이용되는 기존의 감지물질인 항체보다도 훨씬 표적에 대한 친화도가 높고, 열 안정성이 우수하며, in vitro에서 합성이 가능하기 때문에 동물에게 항원을 주입하여 항체를 생산하는 번거로운 공정을 생략할 수 있어 비용 면에서 훨씬 우위에 있고, 타깃 물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생체 분자나 환경 호르몬이나 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 박테리아 등의 다양한 타깃에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 따라서 앱타머는 극미량의 잔류 항생제의 검출방법에 도입하기에 매우 적절한 물질이며, 이를 활용한 나노바이오 기술을 이용하여 다른 특정 물질을 검출하는데도 응용할 수 있다. 이렇게 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템, 그리고 바이오센서로 이용하기 위한 목적으로 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 기존의 앱타머 개발의 목표는 대부분 의료 진단용 바이오센서 개발이나 질병의 표적물질을 대상으로 하는 신약 개발에 대한 연구가 대부분이었다.
기존의 잔류항생제 검출방법은 잔류 항생제가 녹아있는 성분에 따라 각기 다른 시험용액을 조제하여 잔류항생제를 추출, 정제하여 액체크로마토그래피로 정량하는 방법이었다. 기존의 방법은 녹인 물질에 따른 시험법도 소수이고, 시험용액을 각기 조제하는 것도 번거로웠다. 또한 추출, 정제 과정 중에 검출물질의 손실이 있을 수도 있으므로 정확한 정량이 어려웠다. 이러한 잔류의약품, 항생제 및 환경호르몬 등과 같은 저분자 유해물질 결합 특이적 앱타머들은 상수원 및 하천에 잔류하는 시료뿐만 아니라 인체 등 생체 내에서의 잔류 유해물질 검출 및 진단 기술로서 적용할 수 있는데 비하여 기존의 잔류항생제 검출 방법은 오직 식품이나 물에만 적합한 방법이 제시되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 항생물질의 한 종류인 클로르테트라사이클린에 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 핵산 앱타머를 개발하였다. 또한, 상기 클로르테트라사이클린 및 그 유도체에 특이적으로 결합 가능한 핵산 앱타머를 포함하는 조성물을 생산하여 식품, 상하수원, 인체 등으로부터 잔류 항생물질을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일 양상은 클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 양상은 상기 핵산 앱타머를 이용한 클로르테트라사이클린의 검출 방법, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 클로르테트라사이클린 검출용 조성물 및 검출 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 GCCCG, GCG, GTGG 및 TGTGCT로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는, 클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 제공한다.
본 발명의 핵산 앱타머는, 높은 친화성으로 타겟 물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다. 이때, 상기 앱타머가 RNA인 경우에는, 염기서열에 있어서 T는 U로 인식될 수 있다.
본 발명에 있어서, 클로르테트라사이클린은 테트라사이클린계 화합물로서, 분자식은 C 22 H 23 ClN 2 O 8 이며 분자량은 478.88 g/mol이다. 상기 클로르테트라사이클린은 자연으로부터 수득되거나, 화학적 합성 또는 재조합 방법으로 수득할 수 있으며, 이를 제한하지 않는다. 또한, 상기 클로르테트라사이클린은 이의 염 또는 유도체를 포함한다.
상기 앱타머는 GCCCG, GCG, GTGG 또는 TGTGCT의 모티프를 포함하며, 바람직하게는 상기 앱타머가 서열번호 9 내지 13 중 어느 하나의 염기서열을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 4 내지 8 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
상기 핵산 앱타머를 구성하는 총 뉴클레오티드의 수는 15~200 nts일 수 있으며, 바람직하게는 15~80 nts인 것일 수 있다 총 뉴클레오티드의 수가 적으면, 화학 합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한, 화학 수식도 용이하고 생체 내 안정성도 높으며 독성도 낮게 된다. 아울러, 상기 핵산 앱타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 리보오스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자 또는 -O-알킬기 (예:-O-CH3), -O-아실기 (예, -O-CHO), 아미노기 (예, -NH2)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다.
또한, 상기 앱타머는 상기 앱타머를 구성하는 핵산서열과 90 % 이상 100 % 미만의 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다. 90 %이상 100 %미만의 상동성을 가지는 핵산서열이란 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 90 %이상 100 %미만의 서열에 공통성이 있는 것으로서, 클로르테트라사이클린에 결합능을 보이는 핵산서열을 의미한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 핵산 앱타머를 포함하는, 클로르테트라사이클린 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 핵산 앱타머는 클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합함으로써, 클로르테트라사이클린에 높은 친화도 및 특이도를 나타내는바, 식품, 상하수원, 인체 등으로부터 잔류 항생물질을 효과적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 핵산 앱타머를 시료에 첨가하는 단계를 포함하는, 클로르테트라사이클린의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 시료는 타겟 물질을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석을 수행할 수 있는 조성물로서, 액체, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료일 수 있다. 이때, 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함할 수 있다.
상기 첨가되는 핵산 앱타머는 0.1 nM 내지 100 nM일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 nM 내지 10 nM, 더욱 바람직하게는 1 nM 내지 7 nM일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 핵산 앱타머를 포함하는, 클로르테트라사이클린 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 앱타머는 클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합함으로써, 클로르테트라사이클린에 높은 친화도 및 특이도를 나타내는바, 식품, 상하수원, 인체 등으로부터 잔류 항생물질을 효과적으로 검출할 수 있다.
도 1은 클로르테트라사이클린 (CTC) 특이적 앱타머의 결합 특성을 나타낸 도이다. A는 ELAA를 이용한 선발된 앱타머 CTC6, CTC8, CTC11, CTC17, 및 CTC18의 결합 어세이 결과이다. ssDNA 라이브러리를 음성 대조군으로 사용하였다. B는 ELAA에 따른 포화곡선 및 해리상수 (Kd)를 나타낸 도이다.
도 2는 m-fold로 예측한 선발된 앱타머들의 2차 구조 모델이다.
도 3은 간접적 경합 (Indirect competitive, ic)-ELAA의 결과를 나타낸 도이다. A는 상이한 농도의 앱타머 CTC8을 이용한 CTC에 대한 검량선 (calibration curve)을 나타낸 도이다. B는 완충액 또는 우유 중에서 5 nM CTC8로 수행된 경합선 (competition curve)을 나타낸 도이다.
도 4는 TC, OTC 및 CTC에 대한 5 nM 앱타머 CTC8의 교차-반응도를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 시약 및 장치
테트라사이클린 (tetracycline, TC), 옥시테트라사이클린 (oxytetracycline, OTC), 클로로테트라사이클린 (chlortetracycline, CTC)의 염산염, 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA), 1,1´-카르보닐디이미다졸, 홀스래디쉬 페록시다아제 (horseradish peroxidase, HRP), 3,30,5,50-테트라메틸벤지딘 (3,30,5,50-tetramethylbenzidine, TMB) 액체 기질, 계난백으로부터의 알부민 (OVA) 및 완충액 구성 성분을 Sigma (USA)사로부터 구매하였다. HRP-스트렙타비딘 복합체 (conjugate)는 Thermo Scientific (France)에서 구매하였다. ssDNA 랜덤 라이브러리, 프라이머 (aptF, aptR, aptRBioT) 및 비오틴화된 (biotinylated) 앱타머는 Bioneer (Korea)사에서 합성하였다. Taq DNA 중합효소 및 dNTP는 GeneAll (Korea)로부터 구매하였다. 우유는 슈퍼마켓에서 구매하였다.
ELAA (enzyme-linked aptamer assay)는 Maxisorp 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 (polystyrene microtiter plates) (NUNC, Denmark)에서 수행하였다. 효소 활성은 450 nm에서 Spectra max plus 384 (Molecular Device, USA)를 이용하여 검출하였다. PCR 증폭은 자동화된 DNA thermocycler (AxyGen, USA) 내에서 수행하였다. ssDNA 또는 dsDNA의 농도는 Nanodrop (ASP-2680, ACTgene Inc., USA)를 이용하여 측정하였다.
실시예 2: 변경된 ELAA 를 이용한 CTC 특이적 앱타머의 선발 및 시퀀싱
CTC에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선발하기 위하여, 40 랜덤 뉴클레오타이드를 포함하고 불변 프라이머 어닐링 부분: 5´- CGTACGGAATTCGCTAGC-N40-GGATCCGAGCTCCACGTG-3´ (서열번호 1)로 측면화 된 (flanked) 랜덤 ssDNA 라이브러리를 초기 풀 (initial pool)로 사용하였다. 3 개의 상이한 프라이머: aptF 5´-CGTACGGAATTCGCTAGC-3´ (서열번호 2), aptR 5´-CACGTGGAGCTCGGATCC-3´ (서열번호 3) 및 aptRBioT (5´ 비오틴된 aptR과 동일)이 PCR 증폭에 사용하였다. 사용에 앞서, 11.25 ug의 랜덤 DNA 라이브러리 풀을 100 uL의 결합 완충액 (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 7.2)에 용해시키고 10분동안 95 ℃에서 변성 (denature)시켰으며, 5분동안 4 ℃에서 신속하게 냉각시키고 5분동안 RT에 위치시켰다.
클로르테트라사이클린을 검출하는 앱타머의 선별은 ELAA 방법으로 수행하였다.
CTC-BSA 복합체는 EDC 결합법 (EDC coupling method)을 이용하여 변형된 종래의 과정에 따라서 합성되었다. 총 1 mM CTC를 30 mL 인산완충식염수 (phosphate buffered saline) 완충액 (PBS; 1.47 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4)에 용해시키고, 1 mM 소듐 클로로아세테이트 (sodium chloroacetate)를 용액에 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 10 시간 동안 실온 (RT, 25 ℃)에서 교반하고 침전시킨 후 여과하였다. CTC-COOH를 60 ℃에서 건조하고 분광광도계 (spectrophotometer)를 이용하여 확인하였다. 뒤이어, 200 uM CTC-COOH를 2 mL N-디메틸포름아미드 (N-dimethylformamide)에 용해시키고, 5 uM BSA를 10 mL의 PBS (100 mM, pH 8.0)에 용해시키며, 100 mM EDC를 0.5 mL 증류수에 용해시켰다. 총 반응 혼합물을 4 ℃에서 4시간 동안 교반시킨 후 밤새 4 ℃에서 보관하였다. 투석 (dialysis)은 결합되지 않은 CTC를 제거하기 위해, 10,000 MWCO 투석 카세트 (Slide-A-Lyzer, Pierce)를 이용하여 24시간 동안 수행하였다. 결합되지 않은 CTC가 분광계를 방해하기 때문에, 복합체의 투석 후에 한하여 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있었다. 결과적으로 얻은 CTC-BSA 복합체는 분광광도계를 이용하여 확인하고 차후 사용을 위하여 -20 ℃에서 보관하였다.
ELAA 방법의 구체적인 순서는 아래와 같다. 처음으로, 코팅 과정에 있어서, 50 mM 탄산염 완충액에서 pH 9.6 조건에서, CTC-BSA 복합체 또는 BSA를 마이크로타이터 플레이트의 웰에 흡착시켰다. 코팅 부피는 10 ug/mL의 CTC-BSA 복합체 또는 BSA 용액 100 uL/웰이고, 플레이트는 4 ℃에서 밤새 배양시켰다. 배양된 플레이트를 200 uL/웰의 1 % (w/v) OVA 용액 (블로킹 완충액, blocking buffer)으로 도포하고, 37 ℃에서 60분간 결합 완충액에서 제조하였다. 그 뒤, BSA에 비특이적 결합할 수 있는 후보자들을 제거하기 위하여 변성된 DNA 라이브러리 풀을 BSA-코팅된 웰에 첨가하였다. 결합되지 않은 DNA를 수집하여 CTC-BSA 코팅된 웰에 37 ℃에서 60분 동안 첨가하였다. 배양 후, 결합되지 않거나 약하게 결합된 DNA를 PBST를 이용한 3번의 세척단계에서 제거하였다. 결합된 DNA를 Tris-HCl (40 mM, pH 8.0), EDTA (10 mM), 우레아 (3.5 M), 및 Tween 20 (0.02 %)를 포함하는 200 uL 용출 완충액으로 80 ℃에서 10분간 CTC-BSA 코팅된 웰로부터 용출시키고, ssDNA를 회수하였다. 이 과정을 결합된 ssDNA를 용출시키기 위하여 3 차례 반복하였다. 용출된 올리고뉴클레오티드를 에탄올 침전법을 이용하여 침전시키고, ssDNA를 10 uL의 EB 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.5)에 용해시켰다. 용출된 ssDNA 분획은 PCR (1 사이클은 95 °C에서 5분 동안, 35 사이클은 95 °C에서 30초 동안, 72 °C에서 30초 동안, 및 1 사이클은 72 °C에서 5분 동안)로 비오틴화된 역방향 프라이머 (aptRBioT)를 이용하여 증폭하였고, 이는 Dynabeads 스트렙타비딘 M-280에서의 알칼리 변성법 (alkali denaturation)을 이용한 앱타머 가닥의 차후 정제를 가능하게 하였다. 각 라운드에서의 최종 ssDNA 양은 Nanodrop를 이용하여 측정하였다. 12 라운드 후, ssDNA를 변형되지 않은 aptF 및 aptR 프라이머를 이용하여 증폭하고 TOPO PCRII (Invitrogen) 내에서 복제하였다. 11개의 삽입된 후보자 앱타머를 시퀀싱하였다.
그 결과, 클론에 삽입된 11개의 앱타머 중 5개의 앱타머가 식별되었으며, CTC 결합 친화도 (binding affinity)를 위하여 스크리닝 되었다. 선발된 5개의 앱타머를 CTC6, CTC8, CTC11, CTC17 및 CTC18로 설계하였다. 5개의 앱타머의 서열번호 및 서열정보는 아래와 같다.
Figure 112013041426768-pat00001
이 후보군 중에서, CTC6, CTC8, CTC17 및 CTC18의 4개의 앱타머가 CTC에 좋은 결합친화도를 나타냄을 확인하였다. 앱타머 CTC6, CTC8, CTC17 및 CTC18이 다른 앱타머에 비하여 CTC에 높은 결합능 (binding capacity)을 가짐을 확인할 수 있었다 (도 1A).
ClustalW를 이용한 5개의 앱타머의 가변적인 40-뉴클레오티드 (N40) 위치에 대한 서열을 분석하였으며 그 결과는 아래 표 2에 나타내었다.
Figure 112013041426768-pat00002
상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 앱타머가 고도로 보존된 서열 (GCCCG 또는 GCG)과 다수의 공통 서열 (consensus sequence) 모티프 (GTGG 또는 TGTGCT)를 포함함을 알 수 있었다. 이 보존된 서열 및 공통 서열 모티프는 회문식 서열 (palindromic sequence)이며, 이 회문식 서열이 앱타머의 특이적 결합에 영향을 미치는 것으로 판단된다.
또한 이 앱타머들의 이차구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 특정하였다 (도 2). 이 앱타머의 보존된 서열 및 공통서열 모티프는 각 앱타머의 줄기 및 고리 부위에 위치하였다 (표 2 및 도 2). 앱타머의 N40 가변 부위에 차이가 존재함에도 불구하고, 이들 앱타머의 2차 구조는 매우 유사함 구조를 가지고 있었다. 특히, CTC6과 CTC8은 다른 앱타머 구조에 비하여 상호 매우 유사한 구조를 가지고 있었다. 그러나, 이 두 앱타머는 CTC에 대한 결합능에 차이를 나타냈다 (도 1). 이러한 결과는 5개의 앱타머의 서열 중 고도로 보존된 서열 모티프 및 이차 구조가 CTC의 인식 및 결합에 영향을 미침을 나타낸다.
실시예 3: 선발된 앱타머의 CTC 에 대한 결합 특성 확인
선발된 앱타머의 CTC에 대한 결합 친화도를 비교하기 위하여 ELAA 방법을 수행하였다. 또한 BSA 코팅된 웰 플레이트를 이용하여 앱타머가 BSA에 결합하는지 여부를 확인하였다. 랜덤 올리고뉴클레오티드 (Oligo) 라이브러리를 음성 대조군으로 사용하였다.
처음, 비오틴화된 앱타머를 90 ℃에서 5분간 가열하고, 5분간 4℃에서 냉각하고, 10분간 RT에 위치시켰다. 그 뒤 각 앱타머 5 nM를 1% (w/v) OVA 용액으로 블로킹된 마이크로타이터 플레이트의 BSA 또는 CTC-BSA가 코팅된 웰에 37 ℃에서 60 분간 배양하였다. 결합 반응 후, 스트렙타비딘-HRP (0.5 ug/mL) 용액을 첨가하여 반응시켰다 (30 분, 37 °C). 최종 단계는 100 uL의 TMB 용액을 첨가하고 30분 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다 (100 uL/웰의 1 N H2SO4를 첨가하여 담금질 (quenching) 후). 각 단계는 반복되는 교반으로 수행하였고 빛을 차단하였다. 또한 각 단계 사이에 PBST를 이용하여 3차례씩 웰을 헹궜다. 어세이는 3차례 수행하였다.
CTC와 앱타머의 최적의 실행 조건을 결정하기 위하여, 상이한 농도 (1 ug, 5 ug 및 10 ug/mL)의 고정된 CTC-BSA 복합체를 다양한 농도의 비오틴화된 앱타머에 노출시켰다. 웰의 코팅을 5 ug/mL의 CTC-BSA 복합체를 이용하여 수행하였다. 스트렙타비딘-HRP의 농도는 0.5 ug/mL 였다. 결합반응은 선발된 앱타머의 일렬의 농도 (1-20 nM)에 대한 CTC-BSA 복합체의 정량 (constant quantity)을 이용하여 수행하였다.
앱타머 CTC6, CTC8, CTC17 및 CTC18의 해리 상수 (dissociation constant) (Kd)를 결정하였다 (도 1B). 결합 반응은 상기와 동일하게, 다만 증가된 양의 비오틴화된 앱타머 (1-20 nM)를 이용하여 수행하였다. CTC에 결합된 앱타머의 양은 흡광도 측정으로 결정하였고, 이를 결합 %로 전환하였다. 값은 하기와 같다: % (A/A100) = (A/A100) × 100, 여기서 A는 1 nM 내지 20 nM의 앱타머 양의 흡광도 값이고, A100는 20 nM의 앱타머 CTC8의 흡광도 값이다. Kd는 비선형 회귀 분석으로 계산하였다.
도 1B는 결합 데이터에 대한 비-선형 회기분석을 나타낸다. 앱타머 CTC6, CTC8, CTC17 및 CTC18의 해리 상수 (dissociation constant) (Kd)를 결합 테이터의 비선형 회귀 분석으로 결정하였다 (도 1B). 4개의 앱타머에 대한 해리상수는 나노몰 (nanomolar)의 범위였다. 이들 앱타머 중, CTC8 및 CTC18이 가장 좋은 결합능을 나타냈으며, 다른 앱타머 CTC16 및 CTC17에 비해 매우 낮은 Kd 값 (4.2 및 5.6 nM)을 나타내었다 (도 1B). CTC16 및 CTC17의 Kd값은 10.4 및 13.7 nM으로 나타났다 (도 1B). 가장 높은 결합능을 나타탠 앱타머 CTC8이 CTC 검출 확인에 사용되었다.
실시예 4: 간접적 경합 ELAA ( indirect competitive ELAA , ic - ELAA )를 이용한 CTC 의 검출
간접적 경합 어세이에서, 앱타머와 고정화된 항원의 농도는 타겟 물질에 대한 앱타머의 민감도를 결정하는 중요한 요인이다. Ic-ELAA는 고정된 CTC-BSA 복합체의 농도 및 앱타머의 농도에 의존한다.
또한, 비특이적 흡착을 막기 위하여 블로킹 용액의 선별이 필요하다. 일반적으로 혈청 알부민 및 무지방 분유 (dry milk)가 면역 어세이에서 블로킹 용액으로 사용된다. 이 어세이에서 2개의 상이한 블로킹 용액이 기본 간섭 (background interference)를 줄이는 것으로 확인되었다. 분유가 OVA에 비하여 높은 기본을 나타내었으며, 이는 내생의 비오틴을 포함하기 때문이다. 따라서, 이는 비오틴-스트렙타비딘 시스템을 이용한 어세이의 결과에 영향을 미친다.
구체적으로는, 경합은 비-표지된 CTC 및 비오틴화된 앱타머의 첨가로 수행되었다. 용액은 결합 완충액에서 준비하였으며, 경합 시간은 37 ℃에서 60분이었다. 경합 반응 후, 스트텝타비딘-HRP 용액을 첨가하고 반응시켰다. 최종적으로 100 uL의 TMB 용액을 첨가하고 상기 기술한 바와 같이 흡광도를 측정하였다. 어세이는 5 차례 수행하였다. 흡광도 값은 실험 억제 값 (A/A0)으로 하기와 같이 전환하였다; % (A/A0) = (A/A0) × 100 여기서 A는 경합 어세이의 흡광도 값이고, A0는 비-경쟁 어세이의 흡광도 값이다.
도 3A에 나타난 바와 같이, 3개의 CTC8의 농도 (5, 10 및 20 nM)가 CTC에 대한 민감도를 분석하기 위하여 사용되었으며, 플레이트 웰을 코팅한 CTC-BSA의 농도는 CTC-특이적 앱타머의 결합 어세이에서 사용된 농도와 동일한 농도로 사용되었다. 앱타머의 5 nM 농도가 용이한 검출 신호를 위한 최적의 민감도 및 충분한 흡광도 값을 주는 것으로 선발되었다. 이러한 결과는 적은 양의 앱타머를 사용하는 경우 민감도가 증가한다는 것을 나타낸다.
도 3B는 플레이트 웰에 코팅된 5 ug/mL의 CTC-BSA 및 5 nM의 앱타머 CTC8을 이용한 최적의 조건으로 얻어진 용량 반응곡선 (dose-response curve)을 나타낸다. 이 앱타머의 검량선은 하기와 같이 계산하였다: (1) 완충액 중 CTC8의 결합 (%) = - 15.26 × In [CTC] + 21.251, (R2 = 0.9835); (2) 우유 중 CTC8의 결합 (%) = - 15.84 × In [CTC] + 22.636, (R2 = 0.9746).
또한, CTC에 대한 최상의 민감도를 갖는 앱타머 CTC8의 LOD 및 LOQ를 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
매트릭스 LOD
( ug /L) 		LOQ
( ug /L) 		SD
(평균, %) 		직선성
( Linearity ), R 2
완충액 11.1 60.8 3.6 0.9835
우유 16.6 90.7 4.0 0.9746
표 3에 나타난 바와 같이, CTC에 대한 최상의 민감도를 갖는 앱타머 CTC8의 LOD 및 LOQ은 완충액 내에서 각각 11.1 및 60.8 ug/L였다. 또한 우유에서의 LOD 및 LOQ는 각각 16.6 및 90.7 ug/L였다.
실시예 5: CTC 에 대한 앱타머의 특이도 확인
앱타머 어세이에서, 앱타머가 타겟 물질에 대하여 선택적으로 반응할 수 있는지 여부를 특이도로 측정하였다. 선발된 앱타머, CTC8의 CTC에 대한 특이도는 교차-반응도 (cross-reactivity)를 이용하여 평가하였다. 교차 반응도는 CTC와 구조적으로 유사한 물질인 테트라사이클린 (TC) 및 옥시테트라사이클린 (OTC)과의 간접적 경합 ELAA를 이용하여 수행하였다.
각 물질의 50 % B/B0값 및 교차-반응도는 도 4 및 하기의 표 4에서 나타내었다.
반응물 50% B/B0 ( ug / ml ) 교차-반응도
(%)
클로르테트라사이클린 0.123 100
테트라사이클린 0.395 31.1
옥시테트라사이클린 1.271 9.7
교차-반응도 (%) = A1/A2×100.
A1은 50 % B/B0를 나타내는 CTC의 농도, A2는 50 % B/B0 를 나타내는 교차-반응물의 농도, B/B0는 자유 반응물이 없을 때, 최대로 반응하는 B0 값에 대한 자유 반응물이 존재할 때의 B 값의 반응 비율이다.
도 4 및 표4에 나타난 바와 같이, CTC8은 TC에 대하여 30 % 이상의 교차-반응도를 나타냈으며, OTC에 대해서는 교차-반응도가 10 % 미만이었다. 이러한 결과는 공통 서열 모티프 (GTGG)와 관련이 있는 것으로 판단된다. 그러나, 고도의 보존된 서열 모티프 (GCG 또는 CGGC)가 GTGG 모티프보다 CTC에 대한 결합 친화도에 더욱 강하게 영향을 미치는 것으로 판단된다.
실시예 6: ic - ELAA 및 HPLC - UV 를 이용한 우유 중 CTC 의 검출
우유로부터 CTC의 회수는 2가지 다른 방법, 즉 ic-ELAA 및 HPLC-UV를 이용하여 수행하였다. 다양한 농도의 CTC (50 ug/L 내지 400 ug/L)가 첨가된 우유 샘플을 McIlvaine 완충액으로 추출하였다. EDTA를 포함하는 McIlvaine 완충액은 킬레이팅 물질이 우유 중의 CTC와 상호 결합하는 것을 막으며, 이는 분석물에 대한 추출 효율을 개선할 수 있다. 우유 샘플에서의 CTC의 회수율은 ic-ELAA 및 HPLC-UV로 동시에 분석하였으며, 두 가지 방법에서 얻어진 CTC의 농도를 비교하였다.
구체적으로는, 우유 샘플을 지역 슈퍼마켓에서 구매하고 사용하기 전 4 ℃에서 보관하였다. 우유는 CTC와 함께 킬레이트화 복합체를 형성할 수 있는 단백질, 지방, 탄수화물과 Ca2 + 및 Mg2와 같은 양이온을 포함한다. 이와 같은 물질을 제거하기 위하여, 5 mL의 우유 샘플을 0.02M EDTA (pH 5.0)를 포함하는 5 mL의 McIlvaine 완충액과 혼합하고, 우유단백질의 변성을 위하여 이 혼합물에 0.5 % (v/v) 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid)을 첨가하였다. 그 다음, 우유 샘플을 4 °C에서 20분 동안 8,000 rpm으로 원심분리하여 지방 및 단백질을 제거하였다. pH 7.0으로 적정하기 위하여 상청액에 1 M NaOH를 첨가하였다. 상청액을 0.45 um 필터 (Corning, Germany)로 여과하고 40 ℃에서 온화한 질소 블로우-다운 (blow-down)을 이용하여 증발시켰다. 추출 후 침전물을 결합 완충액으로 재현탁 (resuspended) 시켰다. 우유 샘플 중 CTC의 검출은 상기에서 기술한 바와 같이 앱타머 CTC8을 이용한 ic-ELAA로 입증하였고, 이의 분석을 위하여 HPLC-UV 시스템을 종래 공지된 방법으로 수행하였다.
ic-ELAA 및 HPLC-UV를 이용하여 계산된 우유 샘플로부터 CTC의 회수율을 아래 표 5에 나타내었다.
물질 첨가된 CTC 의 농도 ( ug /L) 측정된 CTC 의 농도
( ug /L, 평균±S.D.) 		회수율
(%, 평균±S.D.)
ic-ELAA 50 49.2±1.6 98.3±3.2
100 101.5±2.2 101.5±2.2
200 185.1±6.3 92.6±3.2
400 365.4±11.4 91.4±2.9
HPLC-UV 50 49.7±1.1 99.3±1.7
100 103.8±1.7 103.8±1.7
200 188.8±2.8 94.4±1.4
400 378.4±7.2 94.7±1.8
표 5에 나타난 바와 같이, 우유에 첨가된 CTC의 회수율은 ic-ELAA 및 HPLC-UV에서 91% 내지 104%였다). 양 방법 모두에서 우유 중 CTC의 회수율이 90 % 또는 그 이상임을 알 수 있었다.
<110> Hoseo University Academic Cooperation Foundation <120> Nucleic acid aptamer specifically binding to chlortetracycline <130> 1-3 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> invariable primer annealing part containing 40 random nucleotide <400> 1 cgtacggaat tcgctagcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptF primer <400> 2 cgtacggaat tcgctagc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptR primer <400> 3 cacgtggagc tcggatcc 18 <210> 4 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer CTC6 full sequence <400> 4 cgtacggaat tcgctagcga aagggacggc ccgtacgatt cagaattctg ccgactgggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 5 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer CTC8 full sequence <400> 5 cgtacggaat tcgctagccc acaccaccat gcgttcacgt ggccagtgtg cccgttgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 6 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer CTC11 full sequence <400> 6 cgtacggaat tcgctagcac ctcggcaagg cgcggactcc aggcggtagg gatgtgctgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 7 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer CTC17 full sequence <400> 7 cgtacggaat tcgctagcac aggcgggcgg tcatgactac agcccggaga ccgtccgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 8 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer CTC18 full sequence <400> 8 cgtacggaat tcgctagcac accgcgacgc gttgtcagtg gctgctatac atgcgcgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer CTC6 N40 sequence <400> 9 gaaagggacg gcccgtacga ttcagaattc tgccgactgg 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer CTC8 N40 sequence <400> 10 ccacaccacc atgcgttcac gtggccagtg tgcccgttgt 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer CTC11 N40 sequence <400> 11 acctcggcaa ggcgcggact ccaggcggta gggatgtgct 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer CTC17 N40 sequence <400> 12 acaggcgggc ggtcatgact acagcccgga gaccgtccgt 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer CTC18 N40 sequence <400> 13 acaccgcgac gcgttgtcag tggctgctat acatgcgcgt 40

Claims (7)

  1. GCCCG, GCG, GTGG 및 TGTGCT로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는, 클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 9 내지 13 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 앱타머.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 4 내지 8 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 앱타머.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 핵산 앱타머를 포함하는, 클로르테트라사이클린 검출용 조성물.
  5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 핵산 앱타머를 시료에 첨가하는 단계를 포함하는, 클로르테트라사이클린의 검출 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 첨가되는 핵산 앱타머는 0.1 nM 내지 100 nM인 것을 특징으로 하는, 클로르테트라사이클린의 검출 방법.
  7. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 핵산 앱타머를 포함하는, 클로르테트라사이클린 검출용 키트.
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