KR101428799B1 - A recombinant industrial yeast having auxotrophic marker, a recombinant yeast producing ethanol from pentose and hexose prepared by using the yeast, and a method for producing ethanol from pentose and hexose using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 ura3 유전자의 활성이 불활성화되어 우라실에 대해 영양요구성 선별 마커를 가지는 유전자 재조합용 효모 및 이를 이용하여 유전자 재조합 균주를 제조하는 방법, 그리고 상기 균주에 오탄당 발효 관련 유전자가 도입되어 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 산업용 재조합 효모 및 이를 이용하여 오탄당 및 육탄당 포함 배지에서 에탄올을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant yeast having an auxotrophic selectable marker for uracil inactivated by the activity of the ura3 gene, a method for producing a recombinant strain using the recombinant yeast, and a method for producing an oligosaccharide- An industrial recombinant yeast capable of fermenting a saccharified saccharide, and a method for producing ethanol in a medium containing pentose and hexose saccharide in high yield using the same.
Description
본 발명은 유전자 재조합이 용이하도록 유전자 결손에 의한 영양요구성 마커를 가진 유전자 재조합용 산업 효모 균주 및 이를 이용한 유전자 재조합 균주의 제조 방법, 그리고 상기 균주를 이용하여 제조한 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 신규한 재조합 효모 균주 및 이를 이용한 에탄올 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an industrial yeast strain for gene recombination having a nutritional requirement marker due to gene deletion so as to facilitate gene recombination, a method for producing a recombinant strain using the yeast strain, and a method for producing an oligosaccharide A recombinant yeast strain, and a method for producing ethanol using the same.
최근 환경문제와 에너지자원 확보의 문제로 인해 대체 에너지인 바이오 에탄올에 관한 관심이 증폭되고 있다. 전세계적으로 바이오 에탄올의 생산량 또한 매년 증가하며 수송용 연료에서 대체 에너지로서의 위치를 확고히 하고 있다. 국내에서도 바이오 에탄올의 적용에 관한 실증사업이 진행되었고 RFS(의무혼합제도)의 시행에 관한 간담회와 정책들이 준비되고 있는 실정이다. Recently, environmental problems and securing energy resources have stimulated interest in bioethanol as an alternative energy source. Worldwide, the production of bioethanol also increases every year, securing its position as an alternative energy source for transportation fuels. In Korea, demonstration of the application of bioethanol has been carried out, and meetings and policies on the implementation of the RFS have been prepared.
바이오 에탄올은 미생물 발효에 의해 생산되는 바이오 연료를 말하며 주로 효모가 많이 사용되고 있다. 그 이유는 가장 오랜 기간 에탄올 발효에 손쉽게 사용되어 왔고, 여러 저해에 대한 내성과 안정성이 뛰어나 산업적으로 용이하기 때문이다. 이와 같은 이유로 각 산업분야에 적합한 효모 균주의 선별과 개량 등이 많이 보고되었고, 최근에는 유전자 재조합 기술의 발달에 따라 효모를 이용한 재조합 단백질의 생산 및 바이오 케미컬 생산 등에 관한 많은 연구가 진행 중이다. 그럼에도 불구하고 지금까지 보고된 대부분의 재조합 효모들은 실험실 연구 수준에 불과하여 산업용 효모 수준의 안정성과 생산성을 나타내지 못하고, 한편으로 기존에 사용되고 있는 산업용 효모들은 핵수체가 이배체, 삼배체, 또는 그 이상의 다배체 효모인 것으로 알려져 있어 다른 특성을 부여하기 위한 유전자 재조합이 어려운 것으로 보고되고 있다. Bioethanol is a biofuel produced by fermentation of microorganisms. Yeast is mainly used. The reason for this is that it has been used for the longest period of ethanol fermentation easily and is industrially easy because it has excellent resistance and stability against various inhibitions. For this reason, the selection and improvement of yeast strains suitable for each industrial field have been reported. In recent years, according to the development of recombinant DNA technology, many studies on the production of recombinant proteins and biochemical production using yeast are underway. Nevertheless, most of the recombinant yeasts reported so far are at the laboratory level only and do not show the stability and productivity of the industrial yeast level. On the other hand, the industrial yeasts that have been used in the past are those in which the nuclear bodies are diploid, triple, It is known that yeast is difficult to recombine to give other characteristics.
재조합 효모를 이용한 바이오 에탄올 생산에서 고려해야 할 중요한 요소 중 하나는 적절한 선별 마커의 도입이다. One of the important factors to consider in bioethanol production using recombinant yeast is the introduction of appropriate selection markers.
미생물의 유전자 재조합시 가장 통상적으로 사용되는 선별 마커는 항생제 내성 유전자이다. 항생제 내성 유전자를 가지는 숙주 세포는 해당 항생제 내성 유전자 생성물에 의해 분해될 수 있는 항생제가 보충된 배지 중에서 성장할 수 있으나, 항생제 내성 유전자를 가지지 않는 세포는 항생제에 의해 사멸되므로 미생물의 선별이 가능하다. 그러나, 미생물에서 항생제 내성 유전자의 존재는 환경, 조절 및 상업적 문제들을 야기하며 생물학적 안전성에 대해 잠재적인 위험이 되는 것으로 확인되었다. 또한 효모의 경우에는 널리 사용되는 항생제 마커가 제한되어 있고, 그 선택 감도가 각 균주에 따라 차이가 많이 나므로 항생제 마커의 사용에 제한이 많다.The most commonly used selectable marker in microbial genetic recombination is the antibiotic resistance gene. A host cell carrying an antibiotic resistance gene can grow in a medium supplemented with an antibiotic that can be degraded by the antibiotic resistant gene product, but the cells that do not have the antibiotic resistance gene are killed by the antibiotic, so that the microorganism can be selected. However, the presence of antibiotic resistance genes in microorganisms has led to environmental, regulatory, and commercial problems and has been identified as a potential risk to biological safety. Also, in the case of yeast, widely used antibiotic markers are limited, and the selection sensitivity is different according to each strain, so there are many restrictions on the use of antibiotic markers.
이에, 영양요구성 선별 마커가 항생제 선별에 대한 대안으로서 개발되었다. 특히 효모는 널리 사용되는 항생제 마커가 제한되어 있고, 그 선택 감도가 각 균주에 따라 차이가 많이 나므로, 주로 대학 실험실 및 연구소에서는 단수체 효모의 단백질 생합성 유전자 결손을 이용하여 영양요구성 마커를 유전자 재조합에 사용한다. 그러나 산업용 효모의 재조합의 경우 다배체의 특성으로 유전자 조작이 어려워 우수한 산업용 균주 개발에 제한이 있으며, 여전히 항생제 내성에 대한 선별 마커를 사용하므로 항생제 내성이 우수한 wild type 효모에 대하여 선별이 어려운 문제가 있다. 따라서 산업용 효모에도 재조합 선별 마커의 삽입과 같은 일차적인 재조합 효모 기반 기술의 필요성이 부각되고 있다.Thus, nutritional screening markers were developed as an alternative to antibiotic screening. In particular, since yeast has a limited range of widely used antibiotic markers, and the sensitivity of selection varies widely with each strain, universal laboratories and laboratories use genetic defects of protein biosynthetic genes in yeast, . However, in the case of industrial yeast recombination, it is difficult to genetically manipulate yeast due to the characteristics of polyploidy. Thus, there is a limitation in development of excellent industrial strains, and selection marker for antibiotic resistance is still used, . Therefore, the need for a primary recombinant yeast-based technology such as the insertion of recombinant selection markers into industrial yeast is highlighted.
재조합 효모를 이용한 바이오 에탄올 생산에서 고려해야 할 또 다른 중요한 요소 중 하나는 발효 기질의 이용가능성을 확대하는 것이다. Another important factor to consider in bioethanol production using recombinant yeast is to increase the availability of fermentation substrates.
재조합 효모를 이용한 바이오 에탄올 생산에 관한 연구는 최근 섬유질계 바이오매스를 이용한 2세대 바이오 에탄올 생산과 관련하여 에탄올 발효 수율을 향상시킬 수 있는 오탄당 발효에 그 초점이 맞추어져 있다. 전처리된 섬유질계 바이오매스는 대부분 글루코스(glucose)로 전환되지만 자일로스(xylose) 또한 10% 이상 차지하므로, 자일로스를 이용할 경우 총 에탄올 생산량 및 발효 수율을 향상시킬수 있다. Studies on the production of bioethanol using recombinant yeast have recently focused on the pentose fermentation that can improve the ethanol fermentation yield in relation to the second generation bioethanol production using the fibrous biomass. Most of the pretreated fibrous biomass is converted to glucose, but xylose is also occupied by more than 10%, so that total ethanol production and fermentation yield can be improved by using xylose.
그러나 에탄올 발효에 많이 사용되는 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주는 글루코스와 같은 육탄당 대사 효율이 우수한 반면 자일로스와 같은 오탄당의 발효는 불가능하다. 이에, 자일로스의 에탄올 전환을 위해 오탄당 발효가 가능한 효모인 피치아 속(Pichia spp.) 또는 캔디다 속(Candida spp.) 균주를 이용한 발효가 시도되고 있으나, 사카로마이세스 세레비지애와 같은 고수율, 고생산성의 균주를 찾기가 어렵다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애에 자일로스 대사 관련 유전자를 삽입하여 자일로스 발효가 가능하도록 하는 방법들은 발효 수율 및 생산성이 산업용 효모에 미치지 못하여 산업적 이용이 불가능한 실정이다.However, Saccharomyces cerevisiae strain, which is a yeast widely used for ethanol fermentation, is excellent in the metabolism efficiency of chitosan sugar such as glucose, but fermentation of pentose sugar such as xylose is impossible. In order to convert xylose to ethanol, fermentation using Pichia spp. Or Candida spp., Which is a yeast capable of fermenting pentose, has been attempted. However, fermentation such as Saccharomyces cerevisiae It is difficult to find a strain with high yield and yield. In addition, methods in which xylose fermentation is enabled by inserting a gene related to metabolism of xylose into Saccharomyces cerevisiae is not available for industrial use because the yield and productivity of fermentation are insufficient for industrial yeast.
따라서 당 에탄올 발효 산업에서는 유전자 재조합이 용이하도록 선별 마커가 도입된 산업용 효모의 개발과 에탄올 발효의 수율 향상을 위해 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 산업용 재조합 효모의 개발이 절실하게 요구되고 있다. Therefore, in the sugar ethanol fermentation industry, it is urgently required to develop an industrial yeast in which a selection marker is introduced so as to facilitate gene recombination, and an industrially recombinant yeast capable of fermenting pentane sugar and hexane sugar to improve the yield of ethanol fermentation.
이에, 본 발명자들은 이전의 연구에서 제공했던 사카로마이세스 세레비지애 CHY1011 균주 (국내특허등록 10-0955945)에 상동교차(homologous recombination)를 이용한 유전자 결손 방법을 통해 우라실 생합성에 관여하는 ura3 유전자를 불활성화시켜 우라실에 대한 영양요구성 선별 마커를 가진 유전자 재조합용 효모 CHY1001 를 제조하였으며, 나아가 상기 CHY1001 균주에 자일로스 대사에 관련된 자일로스 이소머라제 (Xylose isomerase, XI) 및 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase, XK)를 코딩하는 유전자를 코돈 최적화하여 도입함으로써 오탄당의 에탄올 발효능이 추가된 산업용 에탄올 발효 효모 CHY1002x를 제조하여 본 발명을 완성하였다.Therefore, the inventors of the present invention found that the ura3 gene involved in the biosynthesis of uracil through the gene deletion method using homologous recombination was introduced into the Saccharomyces cerevisiae CHY1011 strain (Korean Patent Registration No. 10-0955945) Inactivating yeast CHY1001 having auxotrophic selectable markers for uracil was prepared. Further, in the CHY1001 strain, the xylose isomerase (XI) related to xylem metabolism and the xylulose isomerase kinase, XK) was codon-optimized to produce an industrial ethanol-fermenting yeast CHY1002x having an ethanol-efficacious effect of pentose sugar, thereby completing the present invention.
본 발명의 목적은 산업적으로 다양한 유전자 재조합이 가능하도록 영양요구성 선별 마커를 가진 산업용 효모 균주를 제공하고, 나아가 이를 이용하여 자일로스의 에탄올 발효가 가능한 고수율의 재조합 효모를 제공하는데 있다. 또한, 자일로스가 함유된 발효 배지에서 자일로스의 에탄올 발효를 통해 고수율로 에탄올을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide an industrial yeast strain having an auxotrophic selectable marker so as to enable industrially various gene recombination, and to provide a high yield recombinant yeast capable of fermenting ethanol of xylose using the strain. It is another object of the present invention to provide a method for producing ethanol at a high yield through fermentation of xylose in a fermentation medium containing xylose.
구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 ura3 유전자가 불활성화되어 우라실에 대한 영양요구성 선별 마커를 가지는, 유전자 재조합용 산업 효모인 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주 (수탁번호 KCTC 12179BP)를 제공하는 것이다.Specifically, one object of the present invention is to provide a strain of Saccharomyces cerevisiae CHY1001 (Accession No. KCTC 12179BP) which is an industrial yeast for gene recombination, in which the ura3 gene is inactivated to have auxotrophic selection markers for uracil .
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 균주에 ura3 유전자 및 외래 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 유전자 재조합 균주의 제조 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for producing a recombinant strain, which comprises introducing a ura3 gene and a foreign gene into the strain.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주 (수탁번호 KCTC 12179BP)에 ura3 유전자, 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 코딩하는 유전자 및 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase)를 코딩하는 유전자가 도입된, 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 사카로마이세스 세레비지애 균주를 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a method for screening a ura3 gene, a gene encoding xylose isomerase, and a gene encoding xylulose kinase in a strain of Saccharomyces cerevisiae CHY1001 (Accession No. KCTC 12179BP) Which is capable of fermenting the pentose and the saccharified saccharomyces cerevisiae strain into which the gene coding for the saccharomyces cerevisiae is introduced.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 균주의 제조 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for producing the Saccharomyces cerevisiae CHY1002x strain.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 균주를 포함하는 에탄올 생산용 조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a composition for producing ethanol comprising the strain Saccharomyces cerevisiae CHY1002x.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 균주를 오탄당, 또는 오탄당 및 육탄당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 에탄올의 제조 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for producing ethanol comprising culturing the strain in a culture medium containing pentose, or pentose and hexose.
하나의 양태로서, 본 발명은 ura3 유전자가 불활성화되어 우라실에 대한 영양요구성 선별 마커를 가지는, 유전자 재조합용 산업 효모인 사카로마이세스 세레비지애 KCTC 12179BP 균주에 관한 것이다. In one embodiment, the present invention relates to Saccharomyces cerevisiae KCTC 12179BP strain, a recombinant industrial yeast strain in which the ura3 gene is inactivated to have auxotrophic selection markers for uracil.
본 발명에서 "영양요구성(auxotrophy)"이란, 성장 및 대사에 요구되는 특정 물질을 제조하는 능력이 제거되거나 감소되도록 변형된 세포를 지칭한다. 이와 대비하여, "원영양성(prototrophy)"이란, 성장 및 대사에 필요한 특정 물질을 제조할 수 있는 세포를 지칭한다.The term " auxotrophy "as used herein refers to a cell that has been modified to eliminate or reduce the ability to produce a particular substance required for growth and metabolism. In contrast, "prototrophy" refers to a cell capable of producing a specific substance required for growth and metabolism.
본 발명에서 "ura3 유전자"란, 피리미딘 생합성계의 5-포스페이트 디카르복실레이즈 (5-phosphate decarboxylase)를 코딩하는 구조 유전자로서, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 가진다. In the present invention, "ura3 gene" is a structural gene encoding 5-phosphate decarboxylase of pyrimidine biosynthesis system, preferably having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명에서 "불활성" 이란, 유전자의 일부 또는 전체에 결실, 삽입, 치환, 역위 또는 중복 등의 변이가 일어나 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 활성이 없어지거나 감소된 상태를 의미한다. 본 발명의 목적상, ura3 유전자의 불활성화는 ura3 유전자의 일부 또는 전체에 변이가 일어나 우라실에 대한 영양요구성을 획득한 상태를 의미한다.The term "inactive" in the present invention means a state in which a mutation such as deletion, insertion, substitution, inversion, or redundancy occurs in a part or whole of a gene and the activity of the microorganism in its natural state is lost or decreased. For the purpose of the present invention, the inactivation of the ura3 gene means a state in which a mutation occurs in a part or all of the ura3 gene to obtain nutritional requirements for uracil.
효모 균주를 이용한 벡터 시스템에서는 박테리아의 유전자 재조합에서 통상적으로 사용되는 항생제 내성 유전자를 이용한 선별 마커보다는 필수 아미노산의 생합성에 관련한 유전자를 이용한 영양요구성 마커가 바람직하다. 본 발명에서는 ura3 유전자를 타켓으로 산업용 효모에 선별 마커를 도입하고자 하였다.In a vector system using a yeast strain, a nutritional requirement marker using a gene related to the biosynthesis of an essential amino acid is preferable to a selection marker using an antibiotic resistance gene conventionally used in bacterial gene recombination. In the present invention, the ura3 gene was targeted to introduce a selection marker to industrial yeast.
ura3 유전자에 변이가 일어나면 우라실에 대한 영양요구성을 나타냄과 동시에 5-플루오로-오로틱산 (5-fluoro-orotic acid, 5-FOA) 내성 변이주로서의 성질을 나타내게 된다. 이에 따라, ura3 유전자 변이를 가진 균주는 우라실이 제거된 배지에서는 생장할 수 없으나, 우라실이 존재하는 배지에서는 5-FOA 가 첨가되더라도 생장이 가능하다. 반대로, ura3 가 활성을 가지는 균주는 우라실이 제거된 배지에서 생장이 가능하나, 우라실이 존재하는 배지에 5-FOA 가 첨가되는 경우에는 ura3 활성에 의하여 5-FOA 가 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 과 같은 독성 물질로 전환되기 때문에 균주의 생장이 불가능하다. When the mutation occurs in the ura3 gene, it shows the nutritional requirement for uracil and the 5-fluoro-orotic acid (5-FOA) resistance mutant. Thus, strains with the ura3 gene mutation can not grow on the media from which uracil is removed, but growth can be achieved even with 5-FOA in media containing uracil. On the other hand, strains having ura3 activity can grow in the medium from which uracil is removed, but when 5-FOA is added to the medium in which uracil is present, 5-FOA acts as 5-fluorouracil (5- fluorouracil), so that the growth of the strain is impossible.
따라서, 본 발명에서 ura3 유전자가 불활성화된 균주는 5-FOA 및 우라실을 이용한 선별이 용이해지므로 유전자 재조합을 위한 숙주 균주로 적합한 특징이 있다.Therefore, the strain in which the ura3 gene is inactivated in the present invention is suitable as a host strain for gene recombination since it is easy to select using 5-FOA and uracil.
바람직하게, 본 발명의 ura3 영양요구성 균주는, 고생산성 에탄올 발효 산업용 효모인 사카로마이세스 세레비지애 CHY1011 균주 (국내특허등록 10-0955945)에 ura3 유전자 결손 카셋트를 도입함으로써, 상동교차를 이용한 유전자 결손 방법을 통해 ura3 유전자를 불활성화시켜 제조된 것이다. Preferably, the ura3 auxotrophic strains of the present invention are obtained by introducing the ura3 gene deletion cassette into the strain Saccharomyces cerevisiae CHY1011 (domestic patent registration 10-0955945), which is a yeast for high productivity ethanol fermentation industry, And by inactivating the ura3 gene through a gene deletion method.
숙주 균주인 사카로마이세스 세레비지애 CHY1011 균주는 국내특허등록 10-0955945 에 의하여 본 발명자들이 제공한 균주로, 수탁번호 KCTC 11250BP 로 나타내어지며, 에탄올 생산 공장의 토양으로부터 분리되고 고온의 조건에서도 에탄올 생산성이 우수한 균주이다. 상기 CHY1011 균주는 타원형이고, 통성 혐기성이며,생육 온도가 10 내지 45℃ 이고, 생육 pH 가 pH 2.5 내지 7이며, 발효 최적 온도가 30 내지 40℃로 상기 온도 범위에서 발효비율이 80% 내지 95%이다. CHY1011 균주에 관한 국내특허등록 10-0955945 는 전체가 본 발명에 참고로 포함된다.The host strain Saccharomyces cerevisiae CHY1011 strain is a strain provided by the present inventors in accordance with Korean Patent Registration No. 10-0955945 and is represented by Accession No. KCTC 11250BP and is isolated from the soil of the ethanol production plant and can be dissolved in ethanol It is an excellent strain. Wherein the CHY1011 strain is ellipsoidal, flowable anaerobically and has a growth temperature of 10 to 45 DEG C, a growth pH of 2.5 to 7, an optimum fermentation temperature of 30 to 40 DEG C and a fermentation ratio of 80% to 95% to be. Korean Patent Registration No. 10-0955945 for strain CHY1011 is incorporated herein by reference in its entirety.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, ura3 유전자를 포함하는 셔틀 벡터인 pYX12 (전북대학교)의 ura3 유전자 부위에 1.3kbp의 유전자 단편을 삽입하여 pYE-UKO 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머와 Pfu 폴리머레이즈를 사용하여 PCR 증폭하고 PCR 산물을 정제 및 회수한 후, 양 말단 부위에 ura3 유전자와 상동교차(homologous recombination)가 가능하도록 약 100bp 이상의 상동 염기서열을 추가하여 ura3 유전자 결손 카셋트(서열번호 2)를 제조하였다. 이어서, 상기 ura3 유전자 결손 카셋트를 CHY1011 균주에 형질전환하고, 상동교차에 의한 유전자 결손을 유도하여, ura3 유전자가 불활성화된 변이 균주를 수득하였다.In a specific example of the present invention, a pYE-UKO vector was prepared by inserting a 1.3 kbp gene fragment into the ura3 gene region of pYX12 (Chonbuk National University), which is a shuttle vector containing the ura3 gene, The PCR product was purified and recovered using primer No. 8 and Pfu polymerase, and a homologous sequence of about 100 bp or more was added to both ends of the ura3 gene to enable homologous recombination. The ura3 gene A deficient cassette (SEQ ID NO: 2) was prepared. Subsequently, the ura3 gene-deficient cassette was transformed into CHY1011 strain, and genetic defects by homologous crossing were induced to obtain a mutant strain in which the ura3 gene was inactivated.
본 발명자들은 상기 균주에 ura3 유전자 결손 카셋트가 성공적으로 형질전환 및 상동교차되어 ura3 유전자 결손이 유도되었음을 PCR 을 통해 확인하고 (도 2), 상기 변이 균주가 우라실에 대한 영양요구성 및 5-FOA 내성을 나타냄을 확인하였으며 (도 3), 나아가 상기 변이 균주에 ura3 유전자가 포함된 벡터를 삽입할 경우 ura3 유전자 보상에 의하여 최소배지에서 정상적인 성장이 가능함을 확인하였다 (도 4). The present inventors confirmed by PCR that the ura3 gene-deficient cassette was successfully transformed and homologous to the above strain, and that the mutant strain had a nutritional requirement for uracil and 5-FOA resistance (Fig. 2) (Fig. 3). Further, it was confirmed that when the vector containing the ura3 gene was inserted into the mutant strain, normal growth was possible in the minimal medium by the ura3 gene compensation (Fig. 4).
이에, 본 발명자들은 상기 ura3 유전자가 불활성화된 변이 균주를 CHY1001 로 명명하고, 이를 대전광역시 유성구 과학로 125번지에 위치한 한국생명공학연구원에 2012년 4월 4일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC 12179BP 를 부여받았다.Therefore, the present inventors named CHY1001 as a mutant strain in which the ura3 gene was inactivated, and deposited this on April 4, 2012 at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, located at No. 125, Science Route, Yuseong-Gu, Daejeon Metropolitan City and received the accession number KCTC 12179BP .
상기와 같이 우라실 영양요구성 선별 마커를 가진 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주는 유전자 재조합을 통한 재조합 단백질의 생산 및 특정 대사 조작이 산업적으로 유용하므로, 예컨대 유전자 재조합을 위한 발현 숙주로 활용될 수 있다. As described above, the Saccharomyces cerevisiae CHY1001 strain having the uracil auxotrophic selectable marker is industrially useful for production of recombinant protein through gene recombination and specific metabolism manipulation, so that it can be used as an expression host for genetic recombination have.
따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 CHY1001 균주에 ura3 유전자 및 외래 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 유전자 재조합 균주의 제조 방법에 관한 것이다.Accordingly, as another embodiment, the present invention relates to a method for producing a recombinant strain comprising the step of introducing a ura3 gene and a foreign gene into the CHY1001 strain.
본 발명은 상기와 같이 우라실 영양요구성 선별 마커를 가진 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주를 이용하여 다양한 유전자 재조합 균주를 제조하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing various recombinant strains using Saccharomyces cerevisiae CHY1001 strain having the urasin auxotrophic selection marker as described above.
본 발명에서 "외래 유전자" 또는 "목적 유전자"란, 숙주 균주가 속한 종이 아닌 외래종 또는 숙주 균주가 아닌 다른 균주로부터 기원되는 유전자, 또는 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 형태의 유전자를 의미하며, 외래 유전자는 전사될 특정 목적 핵산으로 폴리펩타이드를 코딩한다. 외래 유전자는 당업자가 원하는 모든 유전자가 가능하나, 본 발명의 목적상, 바람직하게 상기 외래 유전자는 CHY1001 균주의 에탄올의 생산능을 보다 향상시킬 수 있도록 에탄올 발효 및 생산과 관련된 유용한 유전자들일 수 있으며, 그 예로는 에탄올 발효 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 들 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 자일로스 이소머라제(xylose isomerase) 및 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase)를 코딩하는 유전자를 도입하였으나, 이 외에도 다양한 외래 유전자들을 도입할 수 있다.The term "foreign gene" or "objective gene" in the present invention means a gene derived from a strain other than an exogenous or host strain not belonging to the host strain, or a genetically modified form from its native form, The gene encodes the polypeptide with the specific target nucleic acid to be transcribed. For the purpose of the present invention, preferably, the foreign gene may be useful genes related to ethanol fermentation and production so that the productivity of CHY1001 strain can be further improved, An example is a gene encoding an enzyme involved in the ethanol fermentation pathway. In a specific embodiment of the present invention, a gene coding for xylose isomerase and xylulose kinase is introduced, but various foreign genes can be introduced in addition to the gene encoding xylose isomerase and xylulose kinase.
본 발명에서 ura3 유전자의 도입은 CHY1001 균주에서 ura3 유전자 보상에 의하여 상기 균주의 원영양성을 복구하기 위한 것이다. 바람직하게, ura3 유전자 및 외래 유전자의 도입 전에는 ura3 유전자가 결손된 상기 CHY1001 균주를 우라실 첨가 배지와 같이 영양요구성을 보완해주는 배지에 배양하여 유지하다가, ura3 유전자 및 외래 유전자의 도입 후에는 상기 균주을 우라실가 제거된 배지에 배양할 수 있다. 이 때 ura3 유전자 및 외래 유전자가 성공적으로 도입되지 않은 숙주 균주들은 여전히 ura3 유전자가 결손된 상태에 있게 되어 우라실이 제거된 배지에서 생장할 수 없기 때문에, 이러한 방식으로 유전자 재조합 균주를 용이하게 선별해낼 수 있다.The introduction of the ura3 gene in the present invention is intended to restore the original nutritional status of the strain by the ura3 gene compensation in the CHY1001 strain. Preferably, prior to the introduction of the ura3 gene and the foreign gene, the CHY1001 strain lacking the ura3 gene is cultured and maintained in a medium supplementing nutritional requirements such as uracil-added medium. After introduction of the ura3 gene and the foreign gene, And then cultured in the removed medium. In this case, the host strains in which the ura3 gene and the foreign gene are not successfully introduced can still be screened for the recombinant strain in this manner because the ura3 gene is still deficient and can not grow in the uracil-free medium have.
상기 ura3 유전자 및 외래 유전자는 벡터에 삽입된 채로 CHY1001 균주에 도입될 수 있으며, 상기 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 재조합 벡터는 숙주 세포 내에서 ura3 유전자 및 외래 유전자가 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하며, 예를 들어 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 및 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA, 인핸서 서열, 목적하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비해독영역, 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수 있다.The ura3 gene and the foreign gene may be introduced into the CHY1001 strain while being inserted into the vector. Various vectors such as a plasmid, a virus, and a cosmid may be used as the vector. The recombinant vector includes a cloning vector and an expression vector. The recombinant vector comprises an essential regulatory element operably linked to the expression of the ura3 gene and the foreign gene in the host cell and includes, for example, a promoter, an initiation codon, a gene encoding the desired protein, a termination codon and a terminator . In addition, DNA encoding the signal peptide, an enhancer sequence, a comparative marker region at the 5 'end and the 3' end of the desired gene, a selectable marker region, or a replicable unit may suitably be contained.
ura3 유전자 및 외래 유전자의 도입 방법으로는 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 리튬아세테이트법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총(gene gun) 등 당 업계에서 널리 사용되는 방법들을 적용할 수 있다.Methods for introducing ura3 gene and foreign gene include calcium phosphate method or calcium chloride / rubidium chloride method, lithium acetate method, electroporation, electroinjection, chemical treatment such as PEG, gun), which are widely used in the art.
바람직한 양태로, 본 발명은 상기와 같이 우라실 영양요구성 선별 마커를 가진 CHY1001 균주에 ura3 유전자와 함께 자일로스 대사에 관련된 자일로스 이소머라제 및 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자를 도입함으로써 오탄당의 에탄올 발효능이 추가된 산업용 에탄올 발효 효모 CHY1002x를 제공한다. In a preferred embodiment of the present invention, the gene coding for xylose isomerase and xylulose kinase associated with xylose metabolism, together with the ura3 gene, is introduced into the CHY1001 strain having the uracil auxotrophic selection marker as described above, Provides industrial ethanol-fermented yeast CHY1002x with added efficacy.
따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주에 ura3 유전자, 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자 및 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자가 도입된, 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 사카로마이세스 세레비지애 균주에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 균주는 수탁번호 KCTC 12180BP 의 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 균주이다.Accordingly, in another aspect, the present invention provides a method for producing a mutant strain of Saccharomyces cerevisiae CHY1001, which comprises introducing a ura3 gene, a gene encoding xylose isomerase, and a gene coding for xylulose kinase, The present invention relates to a strain of Saccharomyces cerevisiae capable of fermentation. Preferably, the strain is Saccharomyces cerevisiae CHY1002x strain with accession number KCTC 12180BP.
또한, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주에 ura3 유전자, 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자 및 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환하는 단계를 포함하는, 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 사카로마이세스 세레비지애 균주를 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 균주는 수탁번호 KCTC 12180BP 의 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 균주이다.The present invention also relates to a method for producing a recombinant vector of Saccharomyces cerevisiae CHY1001 comprising transforming a vector comprising a ura3 gene, a gene encoding xylose isomerase and a gene encoding xylulose kinase, And a method for producing a Saccharomyces cerevisiae strain capable of fermenting the saccharified saccharin. Preferably, the strain is Saccharomyces cerevisiae CHY1002x strain with accession number KCTC 12180BP.
본 발명에서 "에탄올 발효"란, 당분이 효모에 의하여 이산화탄소와 에탄올로 분해하여 이루어지는 발효를 의미한다. 에탄올 발효에 많이 사용되는 효모인 사카로마이세스 세레비지애 균주는 글루코스와 같은 육탄당 대사 효율이 우수한 반면 자일로스와 같은 오탄당의 발효는 불가능하다. 이에, 본 발명에서는 육탄당 뿐만 아니라 자일로스와 같은 오탄당을 기질로 하여 고수율로 에탄올 발효가 가능한 산업용 재조합 효모를 제공하기 위하여, CHY1001 균주에 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자 및 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자를 도입하였다.In the present invention, "ethanol fermentation" means fermentation in which sugar is decomposed by carbon dioxide and ethanol by yeast. Saccharomyces cerevisiae, a yeast widely used for ethanol fermentation, has excellent chitosan metabolism efficiency such as glucose, but fermentation of pentose sugar such as xylose is impossible. Therefore, in order to provide industrially recombinant yeast capable of ethanol fermentation at high yield using not only hexose but also oligosaccharide such as xylose as a substrate, a gene coding for xylose isomerase and a gene encoding xylulose isomerase in CHY1001 strain Lt; / RTI >
본 발명에서 "자일로스"란, 식물 세포벽을 구성하며 바이오매스의 10~40%를 구성하고 있는 비셀룰로스계 다당류인 헤미셀룰로스의 주요 구성성분으로 목재나 농업 부산물로부터 얻어지는 바이오매스로 글루코스 다음으로 풍부하게 존재하는 당질이다. 원핵생물과 진핵생물의 D-자일로스 대사경로는 초기단계에서 서로 다른 대사경로를 거쳐 D-자일룰로스가 된 다음 D-자일룰로스-5-포스페이트로 전환된다.In the present invention, "xylose" is a major constituent of hemicellulose, which is a non-cellulose polysaccharide constituting 10 to 40% of biomass constituting plant cell walls. It is a biomass obtained from wood or agricultural by- It is the saccharide that exists. The D-xylose metabolic pathway of prokaryotes and eukaryotes is converted to D-xylulose-5-phosphate by D-xylulose through different metabolic pathways at an early stage.
본 발명에서 "자일로스 이소머라제"란, 자일로스와 자일룰로스 사이의 이성질화 반응을 촉매하는 효소이다. 박테리아 유래의 자일로스 이소머라제는 자일리톨(xylitol)을 중간대사산물로 축적하지 않고 바로 자일로스를 자일룰로스(xylulose)로 전환할 수 있어 효율적인 대사 과정으로 알려져 있으나, 효모에서 발현시에는 코돈의 상이함으로 인하여 발현 및 단백질 활성에 제한이 많다. 따라서, 본 발명에서는 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자는 코돈 최적화(codon optimization)에 의해 S. cerevisiae에서 자주 사용되는 코돈으로 변경하여 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 사용할 수 있다. In the present invention, "xylose isomerase" is an enzyme that catalyzes the isomerization reaction between xylose and xylulose. Bacterial-derived xylose isomerase is known to be an efficient metabolic process because it can convert xylose to xylulose without accumulating xylitol as an intermediate metabolite. However, when expressed in yeast, There are many limitations on expression and protein activity due to differences. Therefore, in the present invention, it is preferable that the gene coding for xylose isomerase is changed to a codon frequently used in S. cerevisiae by codon optimization, more preferably the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 Can be used.
본 발명에서 "자일룰로스 키나아제"란, D-자일룰로스와 D-자일룰로스-5-포스페이트 간의 전환 반응을 촉매하는 효소로, 이에 의하여 D-자일룰로스가 인산화된 다음 오탄당 인산경로와 EMP 경로를 거쳐 에탄올 생산이 이루어진다. 본 발명에서는 CHY1001 균주에 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자를 도입하기 위하여, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애에서 유래한 서열번호 4의 염기서열을 사용할 수 있다. In the present invention, "xylulose kinase" is an enzyme that catalyzes a conversion reaction between D-xylulose and D-xylulose-5-phosphate whereby D-xylulose is phosphorylated, Ethanol production takes place via the EMP pathway. In the present invention, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 derived from Saccharomyces cerevisiae can be used to introduce a gene encoding xylulose kinase into the CHY1001 strain.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, ura3 유전자를 포함하는 셔틀 벡터인 pYX12 (전북대학교) 벡터에 코돈 최적화된 자일로스 이소머라제 유전자(서열번호 3) 및 S. cerevisiae 유래의 자일룰로스 키나아제 유전자(서열번호 4)를 각각 접합하여, ura3 유전자, 자일로스 이소머라제 유전자 및 자일룰로스 키나아제 유전자를 모두 포함하는 재조합 벡터 pYXIXKopt 를 제조하고 (도 5), 이를 앞에서 얻어진 ura3 결손 효모 CHY1001 에 도입하였다. In a specific embodiment of the present invention, a codon-optimized xylose isomerase gene (SEQ ID NO: 3) and a xylulose kinase gene derived from S. cerevisiae (sequence No. 4), respectively, to prepare a recombinant vector pYXIXKopt containing both the ura3 gene, the xylose isomerase gene and the xylulose kinase gene (Fig. 5) and introduced into the ura3 deletion yeast CHY1001 obtained above.
본 발명자들은 상기 pYXIXKopt 가 도입된 재조합 효모가 육탄당인 글루코스 뿐만 아니라 오탄당인 자일로스를 소모하면서 에탄올을 생산하는 것을 확인하였고, 특히 모균주인 CHY1011 에 비해 13.1 g/L의 에탄올을 추가로 생산하였음을 확인하였다 (도 6).The present inventors confirmed that the recombinant yeast into which pYXIXKopt was introduced produced ethanol while consuming not only glucose as a chitin but also xylose as a pentose, and produced 13.1 g / L of ethanol in comparison with CHY1011 as a parent strain. (Fig. 6).
이에, 본 발명자들은 상기 오탄당 발효능을 획득한 균주를 CHY1002x 로 명명하고, 이를 대전광역시 유성구 과학로 125번지에 위치한 한국생명공학연구원에 2012년 4월 4일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC 12180BP 를 부여받았다. 상기 균주는 산업적으로 육탄당 뿐 아니라 오탄당인 자일로스의 대사가 가능하고, 에탄올 생산량을 증대시킴으로 인해 에탄올의 산업적 생산에 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the present inventors named CHY1002x as the strain obtained the above-mentioned osteogenic effect and deposited this on Apr. 4, 2012 at the Korea Biotechnology Research Institute located at No. 125, Science Route, Yuseong-Gu, Daejeon Metropolitan City and granted the accession number KCTC 12180BP received. The above-mentioned strain can metabolize xylose, which is a pentane sugar as well as a hexane, industrially and can be usefully used for industrial production of ethanol by increasing ethanol production.
따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주에 ura3 유전자, 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자 및 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 균주를 오탄당, 또는 오탄당 및 육탄당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 에탄올의 제조 방법에 관한 것이다.Accordingly, in another aspect, the present invention provides a method for producing a strain of Saccharomyces cerevisiae strain CHY1001, comprising the step of culturing the ura3 gene, the gene encoding xylose isomerase, and the gene encoding xylulose kinase, And culturing the strain of Leviathiae in a medium containing pentose, or pentose and hexose.
또한, 본 발명은 상기 사카로마이세스 세레비지애 균주를 포함하는 에탄올 생산용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for producing ethanol comprising the above-mentioned Saccharomyces cerevisiae strain.
바람직하게, 상기 균주는 수탁번호 KCTC 12180BP 의 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 균주이다.Preferably, the strain is Saccharomyces cerevisiae CHY1002x strain with accession number KCTC 12180BP.
본 발명은 상기 재조합 효모 CHY1002x를 이용하여 자일로스가 함유된 에탄올 발효 배지에서 육탄당인 글루코스 뿐 아니라, 오탄당인 자일로스의 에탄올 발효가 추가적으로 가능한 것을 특징으로 하는 고수율의 에탄올 제조방법을 제공한다.The present invention provides a high yield ethanol production method using the recombinant yeast CHY1002x, wherein the fermentation medium containing xylose is capable of additionally fermenting xylose, which is a saccharide, as well as glucose as a saccharide.
상기 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되며, 바람직하게는 반연속식 또는 연속식 제조 공정에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예로, 상기 반연속식 또는 연속식 공정은 섬유질계 바이오매스의 전처리 공정, 당화공정, 발효공정 및 정제공정을 포함하는 에탄올 제조 방법일 수 있다.The cultivation can be carried out according to well-known methods, and the conditions such as the culture temperature, the culture time and the pH of the culture medium can be appropriately adjusted. In addition, the culture method includes a batch culture, a cintinuous culture and a fed-batch culture, preferably by a semi-continuous or continuous production process, But is not limited thereto. For example, the semi-continuous or continuous process may be an ethanol production process including a pretreatment process, a saccharification process, a fermentation process, and a purification process of the fibrous biomass.
상기 섬유질계 바이오매스의 전처리 공정에서는 수산화나트륨, 암모니아, 묽은 염산, 황산 등의 전처리액을 이용하여 적정 온도와 시간을 조절하여 실시할 수 있으며, 상기 당화공정은 전처리된 바이오매스를 당화탱크에서 온도와 시간을 조절하여 효소적 가수분해에 의해 진행될 수 있다. The pretreatment of the fibrous biomass may be carried out by adjusting the appropriate temperature and time using a pretreatment liquid such as sodium hydroxide, ammonia, diluted hydrochloric acid, sulfuric acid, etc. The saccharification process is a process in which the pretreated biomass is heated in the saccharification tank And by enzymatic hydrolysis with controlled time.
상기 발효공정은 상기 사카로마이세스 세레비시애를 이용하여 에탄올 발효를 수행하는 것일 수 있다. 상기 발효공정에서는 당화된 섬유질이 발효되며, 당화되지 못한 섬유질의 경우, 당화가 지속된다. 상기 효모의 성질을 이용하여 상기 당화단계와 발효단계는 동시에 수행할 수 있다. 또한, 상기 발효 공정의 경우 실질적으로 발효뿐 아니라 당화도 진행되기 때문에 당화공정이 생략 가능하다.The fermentation process may be to perform ethanol fermentation using the saccharomyces cerevisiae. In the fermentation process, the saccharified fiber is fermented, and in the case of the non-saccharified fiber, saccharification continues. The saccharification step and the fermentation step can be performed simultaneously using the properties of the yeast. In addition, in the case of the fermentation process, the saccharification process can be omitted because not only fermentation but also saccharification proceed.
또한, 상기 제조방법의 구체적인 예로는 에탄올 발효조 내에 전분, 설탕, 섬유질 및 포도당으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상을 포함하는 기질을 반연속 또는 연속적으로 공급하고, 상기 기질 및 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 를 이용하여 에탄올 발효를 수행하여 에탄올을 생산하고, 상기 에탄올을 포함하는 발효액을 반연속 또는 연속적으로 배출하는 단계를 포함하는 반연속 또는 연속식 공정으로 수행하고 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 를 이용하는 것일 수 있다.In addition, as a specific example of the above-mentioned production method, a substrate containing at least one selected from the group consisting of starch, sugar, fiber and glucose is semi-continuously or continuously supplied into an ethanol fermentation tank, and the substrate and saccharomyces cerevisiae The process according to any of the preceding claims, characterized in that the method comprises the step of performing ethanol fermentation using CHY1002x to produce ethanol and semi-continuous or continuous release of the ethanol-containing fermentation broth, and the saccharomyces cerevisiae CHY1002x It can be used.
에탄올을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 세포 또는 배양 배지로부터 에탄올을 분리해낼 수 있다. 에탄올 회수 방법의 예로서, 증류, 여과, 크로마토그래피 및 HPLC 등의 방법이 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.The method for recovering ethanol can be carried out by separating ethanol from a cell or a culture medium by a method widely known in the art. Examples of the ethanol recovery method include distillation, filtration, chromatography, and HPLC. However, the present invention is not limited to these examples.
본 발명은 ura3 유전자를 유전자 재조합의 선별 마커로 사용할 수 있는 산업용 효모 숙주를 제공하여, 재조합 단백질의 생산 및 특정 대사 조작이 산업적으로 유용하다. 또한 이 숙주를 이용하여 자일로스의 에탄올 발효 관련 유전자를 삽입한 재조합 효모를 제공하여 산업적으로 육탄당 뿐 아니라 오탄당인 자일로스의 대사가 가능하고, 에탄올 생산량을 증대시킴으로 인해 에탄올의 산업적 생산에 유용하다.The present invention provides industrially useful yeast hosts that can use the ura3 gene as a selection marker for gene recombination, and thus production of recombinant proteins and specific metabolism manipulation are industrially useful. The present invention also provides a recombinant yeast in which an ethanol fermentation-related gene of xylose is inserted using this host, so that it is industrially useful for the industrial production of ethanol because it can metabolize xylose, which is a pentose as well as a hexane, and increase ethanol production .
도 1 의 (A)는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 ura3 유전자에 대한 PCR 산물을 확인한 결과를 나타낸다. 도 1 의 (B) 는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 ura3 결손 카셋트에 대한 PCR 산물을 확인한 결과를 나타낸다. lane 1 은 S. cerevisiae CHY1011의 cDNA를 주형으로 하는 PCR 산물, lane 2 는 대조군으로서 ura3 유전자를 가진 pYX12 벡터를 주형으로 하는 PCR 산물, lane 3 은 ura3 결손 카셋트에 대한 PCR 산물을 나타내고, lane M 은 1kb ladder marker 를 나타낸다.
도 2 의 (A)는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 ura3 유전자의 상동교차를 PCR 산물을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 도 2 의 (B)는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 ura3 유전자의 상동교차를 PCR 산물을 통해 확인한 결과를 나타낸다. lane M 은 1kb ladder marker, lane 1 은 유전자 결손 균주 CHY1011/ura-의 cDNA를 주형으로 하는 PCR 산물을, lane 2 및 3 은 대조군 균주 CHY1011의 cDNA를 주형으로 하는 PCR 산물을 나타낸다.
도 3은 최종 선별된 결손 효모(CHY1011/ura-) 의 우라실에 대한 영양요구성 을 확인한 결과를 나타낸다. (A) 는 최소배지MM+5-FOA(우라실 첨가) 배지 및 (B)는 MM(우라실 미첨가) 배지에서의 결과를 나타낸다.
도 4 는 최종 선별된 결손 효모(CHY1011/ura-) 의 ura3 유전자 보상에 의한 플라스미드의 형질전환 적용을 확인한 결과를 나타낸다. (A) 는 형질전환에 대한 대조군으로 CHY1011/ura- 균주를 최소배지(MM)에 도말한 결과를, (B) 는 CHY1011/ura- 균주에 ura3 유전자를 선별 마커로 사용하는 플라스미드를 형질전환하여 MM배지에 도말한 결과를 나타낸다.
도 5 는 자일로스 대사 관련 유전자 재조합 벡터 pYXIXKopt 의 제작과정 모식도를 나타낸다.
도 6 은 본 발명의 재조합 효모 CHY1002x를 대조 균주 CHY1011과 비교하여 글루코스 및 자일로스의 대사와 그에 따른 에탄올 생산을 확인한 그래프를 나타낸다. Fig. 1 (A) shows the results of PCR for the ura3 gene using the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. Fig. 1 (B) shows the result of confirming the PCR products of the ura3-deficient cassette using the primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
FIG. 2 (A) shows the result of confirming the homology crossing of the ura3 gene using the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 through PCR products. Fig. 2 (B) shows the result of confirming the homology crossing of the ura3 gene using the primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 through PCR products. lane M represents a 1 kb ladder marker,
FIG. 3 shows the result of confirming the nutritional composition of uracil of the finally selected deficient yeast (CHY1011 / ura-). (A) shows the results in the minimal medium MM + 5-FOA (uracil added) medium and (B) in the MM (uracil added) medium.
Fig. 4 shows the result of confirming the transformation of the plasmid by the ura3 gene compensation of the finally selected deletion yeast (CHY1011 / ura-). (A) shows the result of spiking the CHY1011 / ura-strain on the minimal medium (MM) as a control for transformation, (B) transforms the plasmid using the ura3 gene as a selection marker in CHY1011 / ura- MM medium.
5 shows a schematic diagram of the production process of the xylose metabolism-related gene recombination vector pYXIXKopt.
6 is a graph showing the metabolism of glucose and xylose and the production of ethanol by comparing the recombinant yeast CHY1002x of the present invention with the control strain CHY1011.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
실시예Example
1. One.
ura
본 발명에 사용된 산업용 고생산성 에탄올 발효 효모 CHY1011 (수탁번호 KCTC 11250BP)은 게놈 시퀀싱이 되어 있지 않아 ura3 유전자에 대한 정보는 없으나 선행연구 결과 사카로마이세스 세레비지애로 동정되었으므로 (국내특허등록 10-0955945), NCBI database 상의 사카로마이세스 세레비지애 염기서열을 이용하여 ura3 유전자 염기서열을 참고하였다. 효모 CHY1011에 ura3 유전자가 동일하게 존재하는지 확인하기 위해 ura 3 유전자 클로닝 프라이머(서열번호 5 및 6)를 제작하여 PCR을 통해 해당 유전자가 당 산업용 효모에도 존재함을 확인하였다 (도 1A). Since the industrial high productivity ethanol fermenting yeast CHY1011 (Accession No. KCTC 11250BP) used in the present invention is not genomic sequenced and has no information on the ura3 gene, it has been previously identified as Saccharomyces cerevisiae (Korean Patent No. 10- 0955945), the ura3 gene sequence was referred to using the Saccharomyces cerevisiae base sequence in the NCBI database. To confirm whether the ura3 gene exists in yeast CHY1011 in the same manner, ura3 gene cloning primers (SEQ ID NOS: 5 and 6) were prepared, and it was confirmed by PCR that the gene was also present in the sugar yeast.
서열번호 5 : 5'- GAATTCTTGTGAGTTTAGTATACA -3' SEQ ID NO: 5: 5'- GAATTCTTGTGAGTTTAGTATACA -3 '
서열번호 6 : 5'- GAATTCCGGTAATCTCCGAACAGA -3'SEQ ID NO: 6: 5'-GAATTCCGGTAATCTCCGAACAGA -3 '
이후 ura3 유전자 결손 카셋트를 포함한 벡터 pYE-UKO를 제작하기 위해 pYX12 (전북대학교)의 ura3 유전자를 사용하여 ura3 유전자 내부의 Apa I site를 이용하여 ura3 유전자를 불활성화하기 위한 약 1.3kb 정도의 유전자 단편을 삽입하였다. 유전자 단편은 클로닝할 때 양말단에 Apa I 제한효소 site를 추가하여 PCR을 통해 그 단편을 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편들은 정제 및 회수한 후, Apa I 제한효소로 처리한 후, 동일 효소로 처리된 pYX12 벡터와 접합함으로써 pYE-UKO 벡터를 제작하였다. ura3 유전자 결손 카셋트는 pYE-UKO 벡터를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머와 Pfu 폴리머레이즈를 사용하여 PCR을 수행한 후, 정제 및 회수하여 완성하였다 (도 1B). 또한 상기 ura3 유전자 결손 카셋트는 양 말단 부위에 ura3 유전자와 상동교차가 일어나도록 약 100bp의 상동염기서열을 갖도록 제작하였고, 상기 카셋트의 염기 서열을 서열번호 2에 나타내었다. Then, to construct a vector pYE-UKO containing the ura3 gene-deficient cassette, the ura3 gene of pYX12 (Chonbuk National University) was used, and the gene fragment of about 1.3 kb for inactivating the ura3 gene using Apa I site inside the ura3 gene Was inserted. The gene fragment was amplified by PCR by adding Apa I restriction site at both ends of the clone. The amplified DNA fragments were purified and recovered, treated with Apa I restriction enzyme, and ligated with the same enzyme-treated pYX12 vector to construct pYE-UKO vector. The ura3 gene-deficient cassette was purified by PCR using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and Pfu polymerase using the pYE-UKO vector as a template, followed by purification and recovery (FIG. In addition, the ura3 gene deletion cassette was prepared to have a homologous base sequence of about 100 bp so that homologous crossover with the ura3 gene occurs at both end regions. The nucleotide sequence of the cassette is shown in SEQ ID NO: 2.
서열번호 7 : 5'- CAGTACCCTTAGTATATT -3'SEQ ID NO: 7: 5'-CAGTACCCTTAGTATATT-3 '
서열번호 8 : 5'- TCTGTCTTCGAAGAGTA -3'
SEQ ID NO: 8: 5'-TCTGTCTTCGAAGAGTA-3 '
실시예Example 2. 2. ura3ura3 유전자 결손 재조합 효모의 제작 Fabrication of genetically-defective recombinant yeast
CHY1011 균주(국내특허등록 10-0955945)는 우수한 에탄올 발효 산업용 효모이나 재조합에 사용가능한 선별 마커가 없어 유전자 재조합이 불가하였다. 이에, CHY1011의 산업적으로 다양한 활용을 위하여 유전자 재조합에 사용될 수 있는 우라실에 대한 영양요구성 마커를 도입하고자 실시예 1의 유전자 결손 카셋트를 이용하여 Ura3 유전자 결손 재조합 효모 균주를 제작하였다. The CHY1011 strain (Korean Patent Registration No. 10-0955945) was not capable of genetically recombinant because it did not have a good yeast for ethanol fermentation industry or a selectable marker for recombination. Thus, Ure3 gene-deficient recombinant yeast strains were prepared using the gene-deficient cassette of Example 1 in order to introduce nutritional requirement markers for uracil, which can be used for gene recombination, for various industrial applications of CHY1011.
먼저, 실시예 1 에서 제조한 ura3 유전자 결손 카셋트를 이용하여 화학적 형질전환 방법인 LiAc (lithium acetate) 형질전환 방법으로 형질전환 및 상동교차에 의한 유전자 결손이 유도되도록 하였다. 형질전환이 유도된 효모 혼합물들은 32℃ 에서 1시간 가량 배양 후 선별배지인 YPD-5-FOA 한천배지(yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%, 5-FOA 0.1%, agar 2%)에 도말하였다. 선별배지에서 2~3일간 배양한 후 확인된 콜로니들은 멸균팁을 이용하여 다른 YPD-5-FOA 배지에 5회 이상 계대배양하여 재조합 균주의 유전자 결손이 안정적으로 유지되도록 하였다. 최종적으로 얻어진 결손 균주는 실시예 1에 기재한 서열번호 5 및 6, 그리고 서열번호 7 및 8을 이용하여 각각 PCR을 통해 증폭하고, 증폭된 각 단편들을 다음 그림과 같이 CHY1011의 것과 비교하여 ura3 유전자 내부에 삽입된 DNA 단편(약1.3kb)의 길이만큼 증가된 것을 최종 확인하였다 (도 2A 및 2B).
First, the ura3 gene deletion cassette prepared in Example 1 was used to induce transcriptional and homologous crossing-induced gene deletion by LiAc (lithium acetate) transformation, which is a chemical transformation method. YPD-5-FOA agar medium (
실시예Example 3. 3. ura3ura3 유전자 결손 효모의 Gene-deficient yeast 영양요구성Nutritional requirements 확인 Confirm
실시예 2에서 얻어진 ura3 결손 균주가 유전자 재조합에 사용될 수 있기 위해서는 ura3 유전자의 불활성화로 인해 필수 아미노산인 우라실에 대한 영양요구성을 가져야 하므로, 배지 내의 우라실에 대한 영양요구도를 확인하였다. 이를 위하여, 선별된 ura3 결손 균주를 최소배지(casamino acid without amino acid (w/o a.a.) 0.067%, glucose 2%, agar 2%)에 우라실 (0.005%) 및 5-FOA(0.1%) 를 첨가한 배지와 우라실이 첨가되지 않은 최소배지에 각각 대조 균주들과 함께 도말(streaking)한 후 생육 여부를 확인하였다. 대조군으로 사용한 모균주 CHY1011은 FOA 첨가 배지에서는 ura3 유전자의 활성으로 생육이 불가하였고, 우라실이 제거된 최소배지에서는 ura3 유전자의 활성으로 인해 글루코스로부터 필수아미노산을 자체 대사하여 생육이 가능하였다. 반면 실험실용 균주로 널리 사용되는 S2805(ura-) 균주(기보유중인 ura3 유전자 결손 효모, 산업용 효모가 아닌 실험실용 균주)와 선별 결손 균주(CHY1011/ura-)는 우라실이 첨가된 최소배지에서는 FOA의 첨가에도 ura3 유전자의 불활성화로 생육이 가능하였으나, 우라실이 제거된 최소배지에서는 생육이 불가하였다. 따라서 선별균주 CHY1011/ura3- 의 우라실 영양요구성을 확인할 수 있었다 (도 3A 및 3B).In order for the ura3-deficient strain obtained in Example 2 to be used for gene recombination, the nutritional requirement for uracil, which is an essential amino acid due to the inactivation of the ura3 gene, must be established. For this purpose, uracil (0.005%) and 5-FOA (0.1%) were added to a minimal medium (0.067% of casamino acid without amino acid (w / o aa),
또한, ura3 유전자가 포함된 벡터를 삽입할 경우, ura3 유전자가 보상되어 최소배지에서 정상적인 생장이 가능해야 최종적인 재조합 선별 마커로서 사용이 가능하므로, 다음과 같이 벡터 형질전환에 의한 ura3 유전자 보상에 관한 실험을 실시하였다. CHY1011/ura-는 ura3 유전자가 포함된 pYES2 벡터를 이용하여 LiAc 형질전환법에 의한 형질전환을 시도하여 선별 배지인 우라실이 결핍된 최소배지에 도말하였다. 대조군으로는 CHY1011/ura- 를 벡터 없이 동일한 형질전환 방법으로 수행하여 동일 최소배지에 도말하였다. 그 결과, 대조군 CHY1011/ura-는 최소배지에서 생육이 불가한 반면 pYES2 벡터가 형질전환된 CHY1011/pYES2 균주들은 그림과 같이 선별되었음을 확인하였다 (도 4A 및 4B).In addition, when a vector containing the ura3 gene is inserted, since the ura3 gene can be compensated for, it can be used as a final recombinant selection marker if it can grow normally in a minimal medium. Therefore, Experiments were conducted. CHY1011 / ura- was transfected by LiAc transformation using pYES2 vector containing ura3 gene and plated on the minimal medium lacking uracil, the selection medium. As a control, CHY1011 / ura- was carried out in the same minimal medium with the same transformation method without vector. As a result, it was confirmed that the CHY1011 / pYES2 strain transformed with the pYES2 vector was selected as shown in Fig. 4A and Fig. 4B, while the control group CHY1011 / ura- was not grown in the minimal medium.
이로부터 최종 선별 후보 CHY1011/ura- 는 산업용 효모로서 유전자 재조합이 가능함을 확인하여 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001이라 명명하고 한국생명공학연구원에 균주를 특허기탁하였다 (수탁번호 KCTC 12179BP).
From this, the final selection candidate CHY1011 / ura- was confirmed to be genetically recombinant as an industrial yeast, and named Saccharomyces cerevisiae CHY1001 and deposited a patent with the Korea Biotechnology Research Institute (Accession No. KCTC 12179BP).
실시예Example 4. 4. 자일로스Xylose 대사 관련 유전자 재조합 벡터 및 재조합 효모 제작 Metabolism-related gene recombination vector and recombinant yeast production
사카로마이세스 세레비지애로부터 자일로스를 이용하여 에탄올 생산을 유도하기 위해서 박테리아 유래의 자일로스 이소머라제(XI)를 이용하였다. 박테리아 유래의 자일로스 이소머라제는 XYL A, XYL B 에 의한 대사과정에 비해 redox balance에 덜 영향을 미칠 뿐 아니라 자일리톨(xylitol)을 중간대사산물로 축적하지 않고 바로 자일로스를 자일룰로스(xylulose)로 전환할 수 있어 효율적인 대사 과정으로 알려져 있다. 그러나 이 대사과정은 박테리아 유래의 유전자를 사용함으로 인해서 효모에서의 발현과 단백질 활성에 제한이 많은 것으로 보고되고 있다. 그러므로 박테리아 유래의 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자는 코돈 최적화(codon optimization)에 의해 S. cerevisiae에서 자주 사용되는 코돈으로 변경하여 본 발명에 사용하였다. XI의 코돈 최적화는 ㈜Genotech의 코돈 최적화 시스템을 사용하여 염기서열을 디자인하였다.Bacterial-derived xylose isomerase (XI) was used to induce ethanol production using xylose from Saccharomyces cerevisiae. Bacterial-derived xylose isomerase has less effect on the redox balance than xylose and xylose metabolism, and it does not accumulate xylitol as an intermediate metabolite, but directly converts xylose to xylulose ), Which is known as an efficient metabolic process. However, this metabolic process has been reported to be restricted in expression and protein activity in yeast by using a gene derived from bacteria. Therefore, the gene coding for bacterial origin xylose isomerase was changed to codons frequently used in S. cerevisiae by codon optimization and used in the present invention. The codon optimization of XI was designed by using Genotech's codon optimization system.
자일로스 대사 관련 유전자 재조합 벡터 pYXIXKopt는 효모-대장균 셔틀벡터인 pYX12 벡터에 코돈 최적화된 XI 유전자(서열번호 3)와 S. cerevisiae 유래의 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase, XK-sc) (서열번호 4) 유전자가 접합된 벡터이다. 바이오니아로부터 유전자합성서비스를 이용하여 코돈 최적화가 이루어진 XI-opt 유전자와 XK-sc 유전자를 합성하였고, 합성된 pGEM-XI-opt, pGEM-XK-sc로부터 BamH I, Xho I 제한효소로 처리한 후 BamH I 제한효소로 처리한 셔틀벡터와 함께 라이게이즈로 접합하여 재조합 벡터 pYXIXKopt를 완성하였다 (도 5). The xylose metabolism-related gene recombination vector pYXIXKopt was constructed by introducing a codon-optimized XI gene (SEQ ID NO: 3) into the yeast-E. coli shuttle vector pYX12 vector and xylulose kinase (XK-sc) ) Is a gene-conjugated vector. The XI-opt gene and the XK-sc gene, which were codon-optimized using the gene synthesis service from bioneer, were synthesized. After treatment with the Bam H I and Xho I restriction enzymes from the synthesized pGEM-XI-opt and pGEM-XK-sc And ligated together with a shuttle vector treated with Bam H I restriction enzyme to complete the recombinant vector pYXIXKopt (FIG. 5).
완성된 재조합 벡터 pYXIXKopt는 앞에서 얻어진 ura3 결손 효모 CHY1001에 LiAc 형질전환 방법을 이용하여 도입하였고, 앞에서 테스트한 우라실 결핍 최소배지에 도말하여 32?에서 2~3일 배양한 후 단일 콜로니를 형성하는 형질전환체를 선별하였다. 선별된 형질전환체들은 글루코스 대신 자일로스를 2% 첨가한 MMX 한천배지(casamino acid w/o a.a. 0.067%, xylose 2%, agar 2%)에서 5회 이상 계대 배양한 후, 생육이 우수한 재조합 효모를 최종 선별하였다. 최종 선별된 재조합 효모는 모균주 CHY1001과 달리 자일로스를 함유한 배지에서 자일로스를 소모하여 에탄올로 전환하는 발효 경향을 확인하였으므로 이 재조합 효모를 S. cerevisiae CHY1002x 라고 명칭하고 한국생명공학연구원에 특허균주 기탁을 하였다 (수탁번호 KCTC 12180BP).
The completed recombinant vector pYXIXKopt was introduced into the ura3-deficient yeast CHY1001 obtained above using the LiAc transformation method. The transformant was cultured on the minimal medium of uracil deficiency tested and incubated for 2 to 3 days at 32 ° C., and transformed to form a single colony . The selected transformants were subcultured more than 5 times in MMX agar medium (0.067% of casamino acid w / o aa, 2% of xylose, 2% of agar) supplemented with 2% of xylose instead of glucose, Were selected. The final recombinant yeast was identified as S. cerevisiae CHY1002x because it had a fermentation tendency to consume xylose in xylose-containing medium and convert it into ethanol, unlike parent strain CHY1001. (Accession No. KCTC 12180BP).
실시예Example 5. 오탄당 발효 재조합 효모를 이용한 에탄올 발효 5. Ethanol fermentation using pentose fermented recombinant yeast
실시예 4 에서 얻어진 오탄당 자일로스 발효 재조합 효모를 이용하여 다음과 같이 자일로스가 함유된 배지를 이용하여 에탄올 발효를 확인하였다. 재조합 효모 CHY1002x 와 대조 균주 CHY1011 를 15mL YPGX(yeast extract 0.5%, peptone 0.5%, glucose 2.5%, xylose 2.5%)를 함유한 50mL falcon tube 에 접종하여 32?에서 14시간 배양한 후, 150mL 의 동일 YPGX를 함유한 500mL 플라스크에 계대배양하여 5시간 더 배양한 액을 오육탄당 발효의 접종액으로 사용하였다. 메인 오육탄당 발효는 2L 발효조를 이용하여 1.5L의 YPGX(yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%, xylose 5%) 배지에 위의 접종액을 접종하여 32?에서 발효하였다. 발효조의 교반속도는 200rpm으로 고정하였고, 공기는 주입하지 않았다. 그 결과, 다음 그림에서 보이는 것처럼 20 g/L의 글루코스는 두 균주 모두 10시간 이내에 소모하였고, 이후 대조 균주 CHY1011은 추가적인 자일로스의 소모나 에탄올 생산이 없었던 반면, 재조합 효모 CHY1002x는 이후로도 자일로스를 소모하면서 에탄올을 생산하는 것을 확인하였다. 20 g/L의 글루코스와 50 g/L의 자일로스가 함유된 배지에서 대조 균주 CHY1011는 당이용성의 제한으로 인해 20 g/L 글루코스만을 대사하여 9.3 g/L의 에탄올을 생산하였고, 재조합 효모 CHY1002x는 20 g/L 글루코스 뿐만 아니라 추가적으로 자일로스도 소모하여 총 22.4 g/L의 에탄올을 생산하였다. 즉, CHY1011에 비해 13.1 g/L의 에탄올을 추가로 생산하였음을 확인하였다 (도 6). 이 같은 결과는 산업적으로도 자일로스가 일부 포함된 전분질계 발효나 오육탄당의 혼합당의 배지 형태를 가지는 섬유질계 바이오매스 유래의 에탄올 발효에서 추가적인 에탄올 생산에 매우 유용할 것으로 판단된다.
Ethanol fermentation was confirmed using the xylose-containing medium as described below using the fermented yeast of xylose fermentation obtained in Example 4. The recombinant yeast CHY1002x and the control strain CHY1011 were inoculated in a 50 ml falcon tube containing 15 ml of YPGX (yeast extract 0.5%, peptone 0.5%, glucose 2.5%, xylose 2.5%) and cultured at 32 ° C for 14 hours. 150 ml of the same YPGX And then cultured for another 5 hours. This solution was used as the inoculum for the fermentation of omega-3-phosphate fermentation. The main fermentation was carried out in a 2L fermenter at 32 ° C inoculated with 1.5L of YPGX (
<110> CHANGHAE ETHANOL CO., LTD. <120> A recombinant industrial yeast having auxotrophic marker, a recombinant yeast producing ethanol from pentose and hexose prepared by using the yeast, and a method for producing ethanol from pentose and hexose using the same <130> DPP20121423KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> gene <222> (1)..(1107) <223> ura3 gene <400> 1 gggtaataac tgatataatt aaattgaagc tctaatttgt gagtttagta tacatgcatt 60 tacttataat acagtttttt agttttgctg gccgcatctt ctcaaatatg cttcccagcc 120 tgcttttctg taacgttcac cctctacctt agcatccctt ccctttgcaa atagtcctct 180 tccaacaata ataatgtcag atcctgtaga gaccacatca tccacggttc tatactgttg 240 acccaatgcg tctcccttgt catctaaacc cacaccgggt gtcataatca accaatcgta 300 accttcatct cttccaccca tgtctctttg agcaataaag ccgataacaa aatctttgtc 360 gctcttcgca atgtcaacag tacccttagt atattctcca gtagataggg agcccttgca 420 tgacaattct gctaacatca aaaggcctct aggttccttt gttacttctt ctgccgcctg 480 cttcaaaccg 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ccatggatag aacttacgga aatataacag atccaatgga attggctaag 240 gcaaaagttg acgctggttt cgaattaatg actaaactcg gaatagaatt cttctgtttt 300 catgacgcag atatagctcc ggaaggtgat acttttgaag agtcaaagaa gaatttattt 360 gaaatcgttg attacataaa agagaagatg gaccagactg gtatcaagtt attatggggg 420 acggcgaata acttttcaca tccaagattt atgcatggtg cttccacgtc ttgcaacgca 480 gacgtgtttg catatgcagc tgctaagatt aagaatgctt tagatgctac gattaaactg 540 ggcgggaagg gttatgtgtt ctggggtggt agggagggtt atgaaacatt attgaataca 600 gatttgggac ttgagcttga taatatggct agactcatga aaatggctgt cgaatatggc 660 cgtgcaaatg gtttcgatgg cgacttctat attgaaccaa aacctaaaga acctactaag 720 caccaatacg attttgatac agccaccgta cttgctttct tgagaaaata tggcctagaa 780 aaagatttca agatgaacat cgaagcaaat catgctactc tagcaggtca tacctttgaa 840 cacgaactgg caatggcgcg agttaatggt gcatttggct ctgttgatgc gaaccagggc 900 gatccaaacc taggatggga tacggatcaa tttcccactg atgttcatag tgcaactttg 960 gcaatgctgg aggttttgaa ggctggtgga ttcacaaatg gaggattgaa ctttgatgca 1020 aaagtcagac gtggttcctt cgagtttgat gatattgcct atggttatat tgccggaatg 1080 gatacttttg cattaggttt aattaaagct gctgagataa tcgacgacgg gagaattgca 1140 aaatttgttg acgacagata cgcaagctat aaaacaggaa ttggtaaagc aattgtagat 1200 gggactacat ctcttgaaga attagagcaa tatgttttaa cacatagtga acctgtgatg 1260 caatcgggta ggcaagaagt tttggaaaca atcgttaata atattttgtt tagataa 1317 <210> 4 <211> 1467 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> gene <222> (1)..(1467) <223> xylulose kinase <400> 4 atgtattata ttggtgtgga tttgggaact tcttctgtga agttagtctt gatgaaggac 60 aatggtgaaa ttaccaaagt ggtctcaaaa gaatatgatt tatttttccc gaagactgga 120 tggtcggaac aaaatccagt ggattggtat aggcaatcag ttgcaggaat aaaagaatta 180 attagtgaca tcaagaacga agaagtagct ggtattagtt ttgggggaca gatgcatgga 240 cttgttatct tagatagtga tgatgaagtc cttagacctg ccattctgtg gaatgatggc 300 aggacaggag aagaatgcga ttatttaaac aatgtcattg gaagagaaaa aatatcccgc 360 tacacagcga atatggctct aactgggttt accgctccca aattattgtg ggttaaaaaa 420 catgaacctg acatctttaa tcgaatagca aaaatcatgt taccaaagga ttaccttgca 480 tatagattta ctggagttca ttgtacggat gtttcagacg cgtctggtat gttattattc 540 gacgtagagc acaaatgctg gagcgacgaa atgatagaaa ttgtaggcat acaaaaaaat 600 caattggcaa acatttatga gagctacgaa gtggttggaa ctttaacgtc caccgctgcc 660 gaagaactag gattaacaac tgaagttaaa gttattgctg gtgctggtga caacgcagca 720 ggtgctattg gtactggaac tatcgaacat ggtatgtgtt ccgtgtcttt aggaacctcc 780 ggtacagtat ttattgcgtc ggataatttt gcagtcgatg aaaataatgc actgcactct 840 tttgcacatg cgaacggtaa ataccacttc ttaggctgta tgttatgtgc agcatctgct 900 aataaatggt ggatggaaga tgttttaaaa acgaaagaat ttgcaaagga acagcaagaa 960 attggtgaac ttggtgagaa cgaagtttac ttcttaccat atttgatggg agagagaact 1020 cctcataatg atccatcagc acgtggcgca ttcgttggta tgtcaatgaa cactactaga 1080 ggagatatga cccttgctgt cttagaaggt gttacatacg ctctgagaga cgcagttgaa 1140 atcgctaggt cttttggtgt tacagtcgaa agagtcaggt taataggtgg tggtgctaag 1200 agtgatttat ggtgtaagtt agtagctaac atcttggacg taacagttga aaaattagct 1260 tgtgaagaag gtcccggata cggtgcagca atgttagcag ctgttgggtg cggtgcttat 1320 gcgaccgtat ctgaggcagc tgataagtta attagagtta cagatacaat acatcaagag 1380 cctgccttgg tggagaagta taataagaaa tatgaggtat tccgtgagtt gtatccagca 1440 ctaaaaccag tatacagaat gctataa 1467 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ura3 gene cloning <400> 5 gaattcttgt gagtttagta taca 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ura3 gene cloning <400> 6 gaattccggt aatctccgaa caga 24 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ura3 deletion cassette <400> 7 cagtaccctt agtatatt 18 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ura3 deletion cassette <400> 8 tctgtcttcg aagagta 17 <110> CHANGHAE ETHANOL CO., LTD. <120> A recombinant industrial yeast having auxotrophic marker, a recombinant yeast producing ethanol from pentose and hexose prepared by using the yeast, and a method for producing ethanol from pentose and hexose using the same <130> DPP20121423 <160> 8 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> gene (1). (1107) <223> ura3 gene <400> 1 gggtaataac tgatataatt aaattgaagc tctaatttgt gagtttagta tacatgcatt 60 tacttataat acagtttttt agttttgctg gccgcatctt ctcaaatatg cttcccagcc 120 tgcttttctg taacgttcac cctctacctt agcatccctt ccctttgcaa atagtcctct 180 tccaacaata ataatgtcag atcctgtaga gaccacatca tccacggttc tatactgttg 240 acccaatgcg tctcccttgt catctaaacc cacaccgggt gtcataatca accaatcgta 300 accttcatct cttccaccca tgtctctttg agcaataaag ccgataacaa aatctttgtc 360 gctcttcgca atgtcaacag tacccttagt atattctcca gtagataggg agcccttgca 420 tgacaattct gctaacatca aaaggcctct aggttccttt gttacttctt ctgccgcctg 480 cttcaaaccg ctaacaatac ctgggcccac cacaccgtgt gcattcgtaa tgtctgccca 540 ttctgctatt ctgtatacac ccgcagagta ctgcaatttg actgtattac caatgtcagc 600 aaatttttct gtcttcgaag agtaaaaatt gtacttggcg gataatgcct ttagcggctt 660 aactgtgccc tccatggaaa aatcagtcaa gatatccaca tgtgttttta gtaaacaaat 720 tttgggacct aatgcttcaa ctaactccag taattccttg gtggtacgaa catccaatga 780 agcacacaag tttgtttgct tttcgtgcat gatattaaat agcttggcag caacaggact 840 aggatgagta gcagcacgtt ccttatatgt agctttcgac atgatttatc ttcgtttcct 900 gcaggttttt gttctgtgca gttgggttaa gaatactggg caatttcatg tttcttcaac 960 actacatatg cgtatatata ccaatctaag tctgtgctcc ttccttcgtt cttccttctg 1020 ttcggagatt accgaatcaa aaaaatttca aagaaaccga aatcaaaaaa aagaataaaa 1080 aaaaaatgat gaattgaatt gaaaagc 1107 <210> 2 <211> 1527 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ura3 deletion cassette <400> 2 cagtaccctt agtatattct ccagtagata gggagccctt gcatgacaat tctgctaaca 60 tcaaaaggcc tctaggttcc tttgttactt cttctgccgc ctgcttcaaa ccgctaacaa 120 tacctgggcc cagccggcca gatctgagct cgcggccgcg atatcgctag ctcgagccca 180 cacaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt tctcggactc 240 cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt cccctctttc 300 ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa aagagaccgc 360 ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt tctttttctt 420 gaaaattttt ttttttagtt tttttctctt tcgatgacct cccattgata tttaagttaa 480 taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt acaacttttt 540 ttacttcttg ctcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaagggcgg cgttgacaat 600 taatcatcgg catagtatat cggcatagta taatacgaca aggtgaggaa ctaaaccatg 660 gccaagcctt tgtctcaaga agaatccacc ctcattgaaa gagcaacggc tacaatcaac 720 agcatcccca tctctgaaga ctacagcgtc gccagcgcag ctctctctag cgacggccgc 780 atcttcactg gtgtcaatgt atatcatttt actgggggac cttgtgcaga actcgtggtg 840 ctgggcactg ctgctgctgc ggcagctggc aacctgactt gtatcgtcgc gatcggaaat 900 ggaacaggg gcatcttgag cccctgcgga cggtgccgac aggtgcttct cgatctgcat 960 cctgggatca aagccatagt gaaggacagt gatggacagc cgacggcagt tgggattcgt 1020 gaattgctgc cctctggtta tgtgtgggag ggctaagcac ttcgtggccg aggagcagga 1080 ctgacacgtc cgacgcggcc cgacgggtcc gaggcctcgg agatccgtcc cccttttcct 1140 ttgtcgatat catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctccc cccacatccg 1200 ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta 1260 tagttatgtt agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca 1320 gacgcgtgta cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct 1380 cgaaggcttt aatttgcaag ctgaagggcc caccacaccg tgtgcattcg taatgtctgc 1440 ccattctgct attctgtata cacccgcaga gtactgcaat ttgactgtat taccaatgtc 1500 agcaaatttt tctgtcttcg aagagta 1527 <210> 3 <211> 1317 <212> DNA <213> Clostridium phytofermentans <220> <221> gene ≪ 222 > (1) .. (1317) <223> xylose isomerase (codon optimization) <400> 3 atgaaaaatt actttcccaa cgtccctgaa gtaaaatacg aaggccctaa ttcaacaaac 60 ccatttgctt ttaagtacta cgacgccaat aaagtcgttg cgggtaaaac aatgaaagaa 120 cactgtagat ttgcattatc ttggtggcac actctatgtg caggcggtgc tgatccattc 180 ggtgtaacca ccatggatag aacttacgga aatataacag atccaatgga attggctaag 240 gcaaaagttg acgctggttt cgaattaatg actaaactcg gaatagaatt cttctgtttt 300 catgacgcag atatagctcc ggaaggtgat acttttgaag agtcaaagaa gaatttattt 360 gaaatcgttg attacataaa agagaagatg gaccagactg gtatcaagtt attatggggg 420 acggcgaata acttttcaca tccaagattt atgcatggtg cttccacgtc ttgcaacgca 480 gacgtgtttg catatgcagc tgctaagatt aagaatgctt tagatgctac gattaaactg 540 ggcgggaagg gttatgtgtt ctggggtggt agggagggtt atgaaacatt attgaataca 600 gatttgggac ttgagcttga taatatggct agactcatga aaatggctgt cgaatatggc 660 cgtgcaaatg gtttcgatgg cgacttctat attgaaccaa aacctaaaga acctactaag 720 cccaatacg attttgatac agccaccgta cttgctttct tgagaaaata tggcctagaa 780 aaagatttca agatgaacat cgaagcaaat catgctactc tagcaggtca tacctttgaa 840 cacgaactgg caatggcgcg agttaatggt gcatttggct ctgttgatgc gaaccagggc 900 gatccaaacc taggatggga tacggatcaa tttcccactg atgttcatag tgcaactttg 960 gcaatgctgg aggttttgaa ggctggtgga ttcacaaatg gaggattgaa ctttgatgca 1020 aaagtcagac gtggttcctt cgagtttgat gatattgcct atggttatat tgccggaatg 1080 gatacttttg cattaggttt aattaaagct gctgagataa tcgacgacgg gagaattgca 1140 aaatttgttg acgacagata cgcaagctat aaaacaggaa ttggtaaagc aattgtagat 1200 gggactacat ctcttgaaga attagagcaa tatgttttaa cacatagtga acctgtgatg 1260 caatcgggta ggcaagaagt tttggaaaca atcgttaata atattttgtt tagataa 1317 <210> 4 <211> 1467 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> gene <222> (1). (1467) <223> xylulose kinase <400> 4 atgtattata ttggtgtgga tttgggaact tcttctgtga agttagtctt gatgaaggac 60 aatggtgaaa ttaccaaagt ggtctcaaaa gaatatgatt tatttttccc gaagactgga 120 tggtcggaac aaaatccagt ggattggtat aggcaatcag ttgcaggaat aaaagaatta 180 attagtgaca tcaagaacga agaagtagct ggtattagtt ttgggggaca gatgcatgga 240 cttgttatct tagatagtga tgatgaagtc cttagacctg ccattctgtg gaatgatggc 300 aggacaggag aagaatgcga ttatttaaac aatgtcattg gaagagaaaa aatatcccgc 360 tacacagcga atatggctct aactgggttt accgctccca aattattgtg ggttaaaaaa 420 catgaacctg acatctttaa tcgaatagca aaaatcatgt taccaaagga ttaccttgca 480 tatagattta ctggagttca ttgtacggat gtttcagacg cgtctggtat gttattattc 540 gacgtagagc acaaatgctg gagcgacgaa atgatagaaa ttgtaggcat acaaaaaaat 600 caattggcaa acatttatga gagctacgaa gtggttggaa ctttaacgtc caccgctgcc 660 gaagaactag gattaacaac tgaagttaaa gttattgctg gtgctggtga caacgcagca 720 ggtgctattg gtactggaac tatcgaacat ggtatgtgtt ccgtgtcttt aggaacctcc 780 ggtacagtat ttattgcgtc ggataatttt gcagtcgatg aaaataatgc actgcactct 840 tttgcacatg cgaacggtaa ataccacttc ttaggctgta tgttatgtgc agcatctgct 900 aataaatggt ggatggaaga tgttttaaaa acgaaagaat ttgcaaagga acagcaagaa 960 attggtgaac ttggtgagaa cgaagtttac ttcttaccat atttgatggg agagagaact 1020 cctcataatg atccatcagc acgtggcgca ttcgttggta tgtcaatgaa cactactaga 1080 ggagatatga cccttgctgt cttagaaggt gttacatacg ctctgagaga cgcagttgaa 1140 atcgctaggt cttttggtgt tacagtcgaa agagtcaggt taataggtgg tggtgctaag 1200 agtgatttat ggtgtaagtt agtagctaac atcttggacg taacagttga aaaattagct 1260 tgtgaagaag gtcccggata cggtgcagca atgttagcag ctgttgggtg cggtgcttat 1320 gcgaccgtat ctgaggcagc tgataagtta attagagtta cagatacaat acatcaagag 1380 cctgccttgg tggagaagta taataagaaa tatgaggtat tccgtgagtt gtatccagca 1440 ctaaaaccag tatacagaat gctataa 1467 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ura3 gene cloning <400> 5 gaattcttgt gagtttagta taca 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ura3 gene cloning <400> 6 gaattccggt aatctccgaa caga 24 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ura3 deletion cassette <400> 7 cagtaccctt agtatatt 18 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ura3 deletion cassette <400> 8 tctgtcttcg aagagta 17
Claims (12)
유전자 재조합용 다배체 산업 효모, 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주 (수탁번호 KCTC 12179BP).
Wherein the ura3 gene is inactivated by the introduction of a ura3 gene-deficient cassette comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and having an auxotrophic selection marker for uracil,
A strain of recombinant multicellular industrial yeast, Saccharomyces cerevisiae strain CHY1001 (Accession No. KCTC 12179BP).
2. The strain according to claim 1, wherein the ura3 gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
A method for producing a recombinant strain, which comprises introducing a ura3 gene and a foreign gene into the strain of claim 1 or 2.
The strain xylose isomerase consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and the xylose isomerase gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: (xylulose kinase) gene, which is capable of fermenting xylose and saccharose saccharomyces cerevisiae.
6. The strain of claim 5, wherein said strain is Accession No. KCTC 12180BP.
A composition for producing ethanol comprising the strain of claim 5 or 9.
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