KR101400997B1 - Method for Preparing Herboxidiene Using Streptomyces chromofuscus - Google Patents
Method for Preparing Herboxidiene Using Streptomyces chromofuscus Download PDFInfo
- Publication number
- KR101400997B1 KR101400997B1 KR1020120109185A KR20120109185A KR101400997B1 KR 101400997 B1 KR101400997 B1 KR 101400997B1 KR 1020120109185 A KR1020120109185 A KR 1020120109185A KR 20120109185 A KR20120109185 A KR 20120109185A KR 101400997 B1 KR101400997 B1 KR 101400997B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- herb
- oxydien
- culture
- streptomyces
- glycerol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- ISZXEMUWHQLLTC-LSIVYLFASA-N 2-[(2r,5s,6s)-6-[(2e,4e,6s)-7-[(2r,3r)-3-[(2r,3r,4r)-4-hydroxy-3-methoxypentan-2-yl]-2-methyloxiran-2-yl]-6-methylhepta-2,4-dien-2-yl]-5-methyloxan-2-yl]acetic acid Chemical compound CO[C@@H]([C@@H](C)O)[C@@H](C)[C@H]1O[C@]1(C)C[C@H](C)\C=C\C=C(/C)[C@@H]1[C@@H](C)CC[C@H](CC(O)=O)O1 ISZXEMUWHQLLTC-LSIVYLFASA-N 0.000 title claims abstract description 15
- ISZXEMUWHQLLTC-UHFFFAOYSA-N Herboxidiene Natural products COC(C(C)O)C(C)C1OC1(C)CC(C)C=CC=C(C)C1C(C)CCC(CC(O)=O)O1 ISZXEMUWHQLLTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 15
- 241000147083 Streptomyces chromofuscus Species 0.000 title claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 61
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims abstract description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 134
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 9
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 claims description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 abstract description 34
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 abstract description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 abstract description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 35
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 28
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 24
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 6
- LMSDCGXQALIMLM-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;iron Chemical compound [Fe].OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O LMSDCGXQALIMLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- -1 oxy diene Chemical class 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- OLBCVFGFOZPWHH-UHFFFAOYSA-N propofol Chemical compound CC(C)C1=CC=CC(C(C)C)=C1O OLBCVFGFOZPWHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004134 propofol Drugs 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N p-methoxybenzaldehyde Chemical compound COC1=CC=C(C=O)C=C1 ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WTGQALLALWYDJH-AKTDCHNFSA-N scopolamine hydrobromide Chemical compound Br.C1([C@@H](CO)C(=O)OC2C[C@@H]3N([C@@H](C2)[C@H]2[C@@H]3O2)C)=CC=CC=C1 WTGQALLALWYDJH-AKTDCHNFSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940055835 triptone Drugs 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- ODCWYMIRDDJXKW-UHFFFAOYSA-N simazine Chemical compound CCNC1=NC(Cl)=NC(NCC)=N1 ODCWYMIRDDJXKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 스트렙토마이세스 크로모푸스코스(Streptomyces chromofuscus)를 이용한 허브옥시디엔(herboxidiene)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 허브옥시디엔의 생산성을 향상시키기 위한 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 균주의 배양 배지 및 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 배양 배지 및 배양 방법은 허브옥시디엔의 생산성을 증가시킬 수 있으므로, 생산된 허브옥시디엔을 제초제 및 항암제 등의 농업 분야 및 의학 분야에 효과적으로 적용할 수 있다.The present invention is Streptomyces chromotherapy crispus course (Streptomyces The present invention relates to a method for producing herboxidiene using chromofuscus, and more particularly, to a culture medium for a Streptomyces chromopus course strain and a culture method for improving the productivity of herb oxydienes.
Since the culture medium and the culture method according to the present invention can increase the productivity of herb oxydien, the produced herb oxydien can be effectively applied to agricultural fields and medical fields such as herbicides and anticancer drugs.
Description
본 발명은 스트렙토마이세스 크로모푸스코스(Streptomyces chromofuscus)를 이용한 허브옥시디엔(herboxidiene)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 허브옥시디엔의 생산성을 향상시키기 위한스트렙토마이세스 크로모푸스코스 균주의 배양 배지 및 배양방법에 관한 것이다.
The present invention is Streptomyces chromotherapy crispus course (Streptomyces The present invention relates to a method for producing herboxidiene using chromofuscus, and more particularly, to a culture medium for a Streptomyces chromopus course strain and a culture method for improving the productivity of herb oxydienes.
허브옥시디엔(herboxidiene)은 폴리케타이드(polyketide)계열로 스트렙토마이세스 크로모푸스코스(Streptomyces chromofuscus)에서 생산되는 것으로 알려져 있으며(Miller-Wideman M. et al ., J. Antibiot , 45:914, 1992), 최근에는 허브옥시디엔의 생합성 유전자 클러스터(53kb)에 대해 밝혀졌다 Shao L. et al ., Appl Environ Microbiol , 78:2034, 2012).Hub oxy diene (herboxidiene) is poly Kane Tide (polyketide) series as a Streptomyces chromotherapy crispus course (Streptomyces chromofuscus ) (Miller-Wideman M. et . al, J. Antibiot, 45: 914, 1992), has recently been found for the biosynthetic gene cluster (53kb) of the hub Oxy Dien Shao L. et al ., Appl . Environ Microbiol , 78: 2034, 2012).
허브옥시디엔은 벼, 강낭콩 및 밀 등에는 영향을 주지 않고 다양한 잡초를 선택적으로 제거하므로 제초제로 유용하게 사용할 수 있으며(Edmunds A. J. et al., Tetrahedron , 53:2785, 1997), LDL(low density lipoprotein), 리셉터(receptor) 유전자의 발현 증가를 통해 LDL의 합성을 증가시켜 콜레스테롤을 감소시키는 효과가 있다 (Koguchi Y. et al ., J. Antibiot, 50:970, 1997). 또한, 루시퍼레이즈 리셉터 유전자 발현을 증가시켜 세포의 사멸을 유도하고, 암세포의 성장을 억제하는 효과가 있어 항암제로도 유용하게 사용할 수 있다 (Sakai Y. et al ., J. Antibiot, 55:863. 2002; Hasegawa M. et al ., ACS Chem Biol, 6:229, 2011). Herb oxydien can be used as a herbicide (Edmunds AJ et al., Tetrahedron , 53: 2785, 1997) and can be used as a herbicide because it selectively removes various weeds without affecting rice, ), And increases the expression of receptor genes, thereby increasing LDL synthesis and reducing cholesterol (Koguchi Y. et < RTI ID = 0.0 > al ., J. Antibiot , 50: 970,1997). In addition, it increases the expression of the luciferase receptor gene, induces cell death, and inhibits the growth of cancer cells, thus being useful as an anticancer agent (Sakai Y. et al. meat al ., J. Antibiot ., 55: 863. 2002; Hasegawa M. et al ., ACS Chem Biol , 6: 229, 2011).
한편, 허브옥시디엔을 산업적으로 이용하기 위해 허브옥시디엔 및 허브옥시디엔의 아날로그(analoge)의 화학적 합성방법 등의 대량생산 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 생산가격이 비싼 문제점이 있다 (Blakemore P. R. et al ., J. Chem. Soc . Perkin Trans, 1:955, 1999; Pellicena M. et al ., Org Lett, 13:5350, 2011; Ghosh A. K. et al ., Org Lett, 13:66, 2011). On the other hand, in order to utilize herb oxydien industrially, mass production methods such as a method of chemical synthesis of analogs of herb oxydienes and herb oxydienes have been studied, but the production cost is high (Blakemore PR et get , J. Chem. Soc . Perkin Trans, ≪ / RTI > 1: 955, 1999; Pellicena M.meat get ., Org Lett, 13: 5350, 2011; Ghosh A. K. meat get ., Org Lett, 13: 66, 2011).
이에 본 발명자들은 허브옥시디엔의 생산균주인 스트렙토마이세스 크로모푸스코스(Streptomyces chromofuscus)에서 허브옥시디엔의 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 허브옥시디엔 생산 균주의 성장 및 허브옥시디엔의 생산을 증가시키는 배양 배지 및 배양방법을 확립하고 본 발명을 완성하게 되었다.
Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to increase the production of herb oxydienes in Streptomyces chromofuscus , a production strain of herb oxydien , and found that the growth of herb oxydien producing strains and the production of herb oxydienes And the present invention has been completed.
본 발명의 목적은 허브옥시디엔을 생산하는 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 균주의 배양 배지 및 그 배양방법을 제공하는 데 있다.
It is an object of the present invention to provide a culture medium of a Streptomyces chromopus course strain producing herb oxydienes and a culture method therefor.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 글리세롤(glycerol) 3.5 중량% 내지 7 중량% 및 프로플로(ProFlo) 0.25 중량% 내지 0.8 중량%를 포함하는 허브옥시디엔(herboxidiene) 생산 균주의 배양 배지를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a culture medium for producing herboxidiene comprising 3.5 to 7% by weight of glycerol and 0.25 to 0.8% by weight of ProFlo, to provide.
본 발명은 또한, 상기의 배양 배지에 허브옥시디엔 생산 균주를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 허브옥시디엔 생산 균주의 배양방법을 제공한다. The present invention also provides a method for culturing a herb oxydien producing strain, characterized in that the herb oxydien producing strain is inoculated to the above culture medium and cultured.
본 발명은 또한, (a) 상기의 배양 배지에 허브옥시디엔 생산 균주를 배양하여 허브옥시디엔을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 허브옥시디엔을 수득하는 단계를 포함하는 허브옥시디엔의 제조방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for producing a herbicidal composition, comprising the steps of: (a) culturing a herb oxydien producing strain in the above culture medium to produce herb oxydien; And (b) obtaining the resulting herb oxydienes. ≪ Desc /
본 발명에 따른 배양 배지 및 배양방법은 허브옥시디엔의 생산성을 증가시킬 수 있으므로, 생산된 허브옥시디엔을 제초제 및 항암제 등의 농업 분야 및 의학 분야에 효과적으로 적용할 수 있다.
Since the culture medium and the culture method according to the present invention can increase the productivity of herb oxydien, the produced herb oxydien can be effectively applied to agricultural fields and medical fields such as herbicides and anticancer drugs.
도 1은 허브옥시디엔 생산 균주의 배양 배지에 첨가되는 탄소원의 농도를 다르게 하였을 때 생산된 허브옥시디엔을 TCL로 분석한 데이터이다.
도 2는 허브옥시디엔 생산 균주의 배양 배지에 첨가되는 질소원의 농도를 다르게 하였을 때 생산된 허브옥시디엔을 TCL로 분석한 데이터이다.
도 3은 배지 No. 6A6와 기본배지인 No. 1에서 허브옥시디엔의 생산정도를 TCL로 분석한 데이터이다.
도 4는 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 균주의 성장 정도(◆) 및 pH(■)를 24시간 간격으로 5일 동안 분석한 데이터이다.
도 5는 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 균주를 5일 동안 배양하였을 때, 허브옥시디엔의 생산정도를dd TCL로 분석한 데이터이다
도 6은 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 균주를 8일 동안 배양하였을 때, 허브옥시디엔의 생산정도를 TCL로 분석한 데이터이다.
도 7는 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 균주의 배양 24시간 내지 48시간 후에 아무것도 첨가하지 않거나(without), 프로플로(mass-N-Fed), 글리세롤(mass-C-Fed) 및 프로플로와 글리세롤(mass-N:C-Fed)을 첨가하였을 때 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 균주의 성장 정도를 나타낸 데이터이다.
도 8은 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 균주의 배양 24시간 내지 48시간 후에 아무것도 첨가하지 않거나, 프로플로(A), 글리세롤(B) 및 프로플로와 글리세롤(C)을 첨가하였을 때 허브옥시디엔의 생산 정도를 HPLC로 분석한 데이터이다1 is data obtained by analyzing herb oxydienes produced by different concentrations of carbon sources added to a culture medium of a herb oxydien producing strain with TCL.
2 is data obtained by analyzing herb oxydien produced by TCL when the concentration of nitrogen source added to the culture medium of the herb oxydien producing strain is different.
Fig. 6A6 and the No. 1 medium, the primary medium. 1 is the TCL analysis of the degree of production of herb oxydien.
FIG. 4 is data obtained by analyzing the degree of growth () and pH () of Streptomyces chromopus course strain for 5 days at intervals of 24 hours.
FIG. 5 shows data on the degree of production of herb oxydien when the strain Streptomyces chromopus course was cultured for 5 days using dd TCL
6 is data obtained by analyzing the degree of herb oxydien production by TCL when the Streptomyces chromopus course strain was cultured for 8 days.
FIG. 7 is a graph showing the results of the measurement of the mass-N-Fed, mass-C-Fed, and propofol and glycerol, without or with the addition of 24 hours to 48 hours after the culture of Streptomyces chromopus course. (mass-N: C-Fed) was added to the culture medium to evaluate the growth of Streptomyces chromopus course strain.
FIG. 8 is a graph showing the effect of the addition of propofol (A), glycerol (B) and propofol and glycerol (C), without any addition of the strain Streptomyces chromopus course for 24 hours to 48 hours after the culture, The data on the degree of production are analyzed by HPLC
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.
본 발명은 일 관점에서, 글리세롤(glycerol) 3.5 중량% 내지 7 중량% 및 프로플로(ProFlo) 0.25 중량% 내지 0.8 중량%를 포함하는 허브옥시디엔(herboxidiene) 생산 균주의 배양 배지에 관한 것이다. In one aspect, the present invention relates to a culture medium of herboxidiene producing strains comprising 3.5 to 7 wt% of glycerol and 0.25 to 0.8 wt% of ProFlo.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 인산칼륨(KH2PO4), 염화나트륨(NaCl), 탄산칼슘(CaCO3), 황산아연(ZnSO4.7H2O) 및 킬레이트 철(Fe-EDTA) 중에서 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, at least one of potassium phosphate (KH 2 PO 4 ), sodium chloride (NaCl), calcium carbonate (CaCO 3 ), zinc sulfate (ZnSO 4 .7H 2 O) and chelate iron As shown in FIG.
본 발명에 있어서, 허브옥시디엔(herboxidiene) 생산 균주는 스트렙토마이세스 크로모푸스코스(Streptomyces chromofuscus)인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the herbicide producing strain is Streptomyces chromofuscus .
본 발명의 일 실시예에서, 허브옥시디엔 생산 균주의 대량배양을 위한 배지 조건 확립을 위하여, 배지에 첨가되는 탄소원 및 질소원을 변화시켜 실험을 진행하였다. 그 결과, 말토오스 및 수크로오스를 탄소원으로 첨가한 배지에서는 허브옥시디엔의 생산량이 증가하지 않았으며, 탄소원으로 글리세롤이 첨가된 배지(No.3)에서 허브옥시디엔의 생산량은 582.6㎎/㎖으로, 기본 배지인 1번 배지(No. 1)에 비해 10.6배 생산량이 증가한 것을 확인하였다 (표 1). 또한, 펩톤, 트립톤, 소이빈플라워를 질소원으로 첨가한 배지에서는 질소원으로 프로플로(ProFlo)를 첨가한 배지(No.6)보다 허브옥시디엔의 생산량이 감소하는 것을 보여, 허브옥시디엔의 생산을 증가시키기 위한 배지의 질소원으로 프로플로(ProFlo)가 적합한 것을 확인할 수 있었다. In one embodiment of the present invention, in order to establish a culture condition for mass culture of a herb oxydien producing strain, the carbon source and the nitrogen source added to the culture medium were changed to experiment. As a result, in the medium supplemented with maltose and sucrose as a carbon source, the production amount of herb oxydien was not increased, and in the medium (No.3) in which glycerol was added as a carbon source, the production amount of herb oxydien was 582.6 mg / (Table 1). It was confirmed that the production amount was 10.6 times higher than the No. 1 medium (No. 1). In addition, in the medium supplemented with peptone, tryptone and soybean flower as a nitrogen source, the production of herb oxydienes was lower than that of medium (No. 6) supplemented with ProFlo as a nitrogen source. Production of herb oxydien It is confirmed that ProFlo is suitable as the nitrogen source of the medium for increasing the number of the cells.
본 발명에서 프로플로(ProFlo)는 목화씨를 효소로 처리한 추출물로 허브옥시디엔 생합성 과정을 위한 전구체인 아세틸 조효소 A(acetyl-CoA)의 형성에 부분적으로 관여하기 때문에 허브옥시디엔의 생산량이 증가한 것이라고 볼 수 있다.In the present invention, ProFlo is an extract obtained by treating cottonseed with an enzyme, which is partially involved in the formation of acetyl-CoA, a precursor for the herboxydene biosynthesis process, so that the production amount of herb oxydien is increased can see.
상기에서 선별된 배지 No. 6의 조성의 무기질 중에서 질산칼륨(KNO3)을 제외한 배지는 No. 6A라고 명명하고 허브옥시디엔의 생산 정도를 확인한 결과, 배지 No. 6 및 질산칼륨(KNO3)을 제외한 배지 No. 6A에서 생산된 허브옥시디엔의 생산량은 각각 582.6㎎/㎖ 및 585.0㎎/㎖으로 기본 배지 No. 1에 비해 각각 10.6배 및 10.7배 생산량이 증가한 것을 확인하였으며, 질산칼륨(KNO3)을 제외한 배지 No. 6A에서 높은 허브옥시디엔의 생산성을 보이는 것을 확인하였다 (표 3). The culture medium No. selected in the above. The medium excluding the potassium nitrate (KNO 3 ) among the minerals having the composition of No. 6A, and the degree of production of herb oxydien was checked. 6 and potassium nitrate (KNO 3 ). The yields of herb oxydienes produced in 6A were 582.6 mg / ml and 585.0 mg / ml, respectively. 1 and 10.7 times, respectively, compared to that of the medium No. 1 except for potassium nitrate (KNO 3 ). 6A showed high herb oxydien productivity (Table 3).
상기의 배지에 첨가되는 질산칼륨(KNO3)은 무기질소원(inorganic nitrogen source)로 질산염(nitrates), 아질산염(nitrite) 및 다양한 암모늄 염(ammonium salts)은 균주에서 생산되는 항생물질(antibiotic production)의 생산을 감소시키는 것으로 알려져 있다 (Aharonowitz Y, Ann Rev Microbial , 34:209, 1980).Potassium nitrate (KNO 3 ) added to the culture medium is an inorganic nitrogen source, and nitrates, nitrites and various ammonium salts of antibiotic production It is known to reduce production (Aharonowitz Y, Ann Rev Microbial , 34: 209, 1980).
또한, 허브옥시디엔 생산 균주의 대량배양을 위한 배지 조건 확립을 위하여, 배지에 첨가되는 탄소원인 글리세롤과 질소원인 프로플로(ProFlo)의 양을 다양하게 하여 스트렙토마이세스 크로모푸스코스를 배양한 결과, 5 중량%의 글리세롤(표 4) 및 0.25 중량%의 프로플로(ProFlo)(표 5)를 첨가한 배지 No. 6A6에서 가장 높은 허브옥시디엔의 생산성을 보이는 것을 확인하였다 (도 1 및 도 2)In addition, in order to establish a culture condition for mass culture of herb oxydien producing strains, the amount of glycerol, which is a carbon source added to the medium, and the amount of nitrogen source ProFlo were varied to cultivate Streptomyces chromopus course , 5% by weight of glycerol (Table 4) and 0.25% by weight of ProFlo (Table 5). 6A6 showed the highest productivity of herb oxydien (Figures 1 and 2)
본 발명은 다른 관점에서, 상기의 배양 배지에 허브옥시디엔 생산 균주를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 허브옥시디엔 생산 균주의 배양방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a method for culturing a herb oxydien producing strain, which comprises culturing the herb oxydien producing strain in the above culture medium and inoculating it.
본 발명에 있어서, 허브옥시디엔(herboxidiene) 생산 균주는 스트렙토마이세스 크로모푸스코스(Streptomyces chromofuscus)인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the hub oxy diene (herboxidiene) producing strain is Streptomyces chromotherapy crispus course (Streptomyces chromofuscus ).
이때, 본 발명의 균주는 1 중량% 내지 5 중량%의 양으로 접종할 수 있으며, 바람직하게는 4 중량%를 접종하는 것이 좋으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, the strain of the present invention can be inoculated in an amount of 1 wt% to 5 wt%, preferably 4 wt%, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 허브옥시디엔 생산 균주는 5일 내지 8일 동안 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 8일 동안 배양하는 것이 좋으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 허브옥시디엔 생산 균주는 20℃ 내지 40℃에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 28℃에서 배양하는 것이 좋으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the herb oxydien producing strain may be characterized in that it is cultured for 5 days to 8 days, preferably for 8 days, but is not limited thereto. In addition, the herb oxydien producing strain may be characterized by culturing at 20 ° C to 40 ° C, preferably at 28 ° C, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 배양 24시간 내지 48시간 후에 글리세롤(glycerol) 및 프로플로(ProFlo) 중에서 하나 이상을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 36시간 후에 첨가하는 것이 좋으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, after 24 hours to 48 hours of culturing, one or more of glycerol and ProFlo may be further added, preferably added after 36 hours, But is not limited to.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기의 배양 배지에 허브옥시디엔 생산 균주를 배양하여 허브옥시디엔을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 허브옥시디엔을 수득하는 단계를 포함하는 허브옥시디엔의 제조방법에 관한 것이다. According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a herbicidal composition, comprising: (a) culturing a herb oxydien producing strain in the above culture medium to produce herbicoxidene; And (b) obtaining the resulting herb oxydienes. ≪ Desc /
본 발명에 있어서, 허브옥시디엔(herboxidiene) 생산 균주는 스트렙토마이세스 크로모푸스코스(Streptomyces chromofuscus)인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the hub oxy diene (herboxidiene) producing strain is Streptomyces chromotherapy crispus course (Streptomyces chromofuscus ).
이때, 본 발명의 균주는 1 중량% 내지 5 중량%의 양으로 접종할 수 있으며, 바람직하게는 4 중량%를 접종하는 것이 좋으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, the strain of the present invention can be inoculated in an amount of 1 wt% to 5 wt%, preferably 4 wt%, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 허브옥시디엔 생산 균주는 5일 내지 8일 동안 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 8일 동안 배양하는 것이 좋으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 허브옥시디엔 생산 균주는 20℃ 내지 40℃에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 28℃에서 배양하는 것이 좋으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the herb oxydien producing strain may be characterized in that it is cultured for 5 days to 8 days, preferably for 8 days, but is not limited thereto. The herb oxydien producing strain may be characterized by culturing at 20 ° C to 40 ° C, preferably at 28 ° C, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에서, 배지 No. 6A6를 이용하여, 허브옥시디엔 생산 균주인 스트렙토마이세스 크로모푸스코스를 배양하였을 때, 균주의 성장 속도 및 허브옥시디엔의 생산량을 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 그 결과, 스트렙토마이세스 크로모푸스코스는 배양 48시간까지는 성장기(exponential phase), 배양 72시간까지는 정지기(stationary phase)에 해당하며, 그 이후 사멸기(death phase)를 보이는 것을 확인하였다 (표 6 및 도 4). 배양 72시간 이후부터는 균체량이 감소하는 결과를 보였지만, 허브옥시디엔은 점점 생산량이 증가하여 배양 5일째 생산량이 높은 것을 확인하였다 (도 5). In an embodiment of the present invention, 6A6, an experiment was conducted to confirm the growth rate of the strain and the production amount of herb oxydien when the herb oxydien producing strain Streptomyces chromopus course was cultured. As a result, it was confirmed that the Streptomyces chromopus course corresponds to a stationary phase up to the exponential phase for up to 48 hours of culture and up to 72 hours after the incubation, and then to the death phase thereafter 6 and Fig. 4). From 72 hours after the incubation, the amount of the bacterial cells was decreased. However, it was confirmed that the production of herb oxydien gradually increased and the production was increased on the 5th day of culture (FIG. 5).
또한, 허브옥시디엔의 생산량이 증가한 배양 5일 이후에의 허브옥시디엔의 생산량 변화를 확인하기 위하여, 상기와 같은 방법으로 최대 8일까지 24시간 간격으로 배양 배지를 회수하여 허브옥시디엔의 생산량을 확인한 결과, 배양 8일째 배양 배지를 회수하는 것이 허브옥시디엔의 생산성이 높은 것을 확인하였다 (도 6).In order to confirm the change in the production of herb oxydien after 5 days of cultivation in which the production of herb oxydien was increased, the culture medium was recovered at intervals of 24 hours for up to 8 days as described above to produce herb oxydienes As a result, it was confirmed that the productivity of herb oxydien was high by recovering the culture medium on the eighth day of cultivation (Fig. 6).
본 발명에 있어서, 배양 24시간 내지 48시간 후에 글리세롤(glycerol) 및 프로플로(ProFlo) 중에서 하나 이상을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 36시간 후에 첨가하는 것이 좋으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, after 24 hours to 48 hours of culturing, one or more of glycerol and ProFlo may be further added, preferably added after 36 hours, But is not limited to.
허브옥시디엔의 최적 생산 조건을 확립하기 위하여 영양분 첨가 시간 및 종류를 다양하게 하여 균체의 무게를 측정한 결과, 배양 36시간 후에 탄소원 또는 질소원을 첨가해 준 경우가 24시간 및 48시간에 첨가해준 경우보다 균체의 성장이 증가한 것을 확인하였으며, 그 중에서 배양 36시간 후에 글리세롤 2.5 중량%와 프로플로 0.125 중량%를 함께 처리한 군이 가장 높은 균체 성장을 보이는 것을 확인하였다 (도 7). In order to establish the optimal production conditions of herb oxydien, the weights of the cells were measured by varying the time and kinds of nutrient addition. As a result, when carbon source or nitrogen source was added 36 hours after culturing, 24 hours and 48 hours were added And it was confirmed that the group treated with 2.5% by weight of glycerol and 0.125% by weight of propylene showed the highest cell growth (FIG. 7).
또한, 허브옥시디엔의 생산량을 HPLC(도 8)를 이용하여 확인한 결과, 배양 36시간 후에 글리세롤 2.5 중량%와 프로플로 0.125 중량%를 함께 처리한 군에서 1086.9㎎/㎖으로 가장 높은 허브옥시디엔 생산량을 보이는 것을 확인하였다 (표 7). 이는 아무것도 처리하지 않은 배지 No. 6A6 및 기본 배지 No. 1과 비교하였을 때, 각각 1.5배 및 19.8배 생산성이 증가한 것을 알 수 있었다.
As a result of confirming the production amount of herb oxydien using HPLC (FIG. 8), it was found that the highest herboxydene production amount was 1086.9 mg / ml in the group treated with 2.5% by weight of glycerol and 0.125% by weight of propylene after 36 hours of culture (Table 7). This indicates that the culture medium No. < RTI ID = 0.0 > 6A6 < / RTI > 1, productivity increased by 1.5 times and 19.8 times, respectively.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.
실시예Example 1: One: 허브옥시디엔Herb oxydien 생산 균주의 대량배양을 위한 배지 조건 확립 Establishment of culture conditions for mass culture of production strains
1-1 : 1-1: 허브옥시디엔Herb oxydien 생산 균주의 준비 Preparation of production strains
허브옥시디엔을 생산하는 것으로 알려진 스트렙토마이세스 크로모푸스코스(Streptomyces chromofuscus ATCC49982)를 배양하기 위하여, 균주와 50㎖ ISP-2(International Streptomyces Project) 배양배지(효모추출물 0.4 중량%, 맥아추출물 1 중량% 및 글루코오스 0.4 중량%)를 500㎖ 배플(baffle) 플라스크에 넣고 28℃에서 36시간 동안 235rpm으로 진탕 배양하였다.
In order to culture Streptomyces chromofuscus ATCC49982, which is known to produce herb oxydienes, the strain and 50 ml ISP-2 (International Streptomyces Project) culture medium (yeast extract 0.4 wt%,
1-2 : 1-2: 허브옥시디엔Herb oxydien 생산 균주의 대량배양을 위한 For the mass culture of production strains 탄소원Carbon source (( carboncarbon sourcesource ) 선별) Selection
허브옥시디엔 생산 균주의 대량배양을 위한 배지 조건 확립을 위하여, 탄소, 질소 및 무기질 등을 변화시켜 실험을 진행하였다. In order to establish the culture conditions for mass culture of herb oxydien producing strains, experiments were carried out by changing carbon, nitrogen and minerals.
적합한 탄소원을 선별하기 위하여, 옥수수 전분(corn starch), 말토오스(maltose), 글리세롤(glycerol) 및 수크로오스(sucrose)을 각각 3.5 중량%로 첨가하고 질소원과 무기질을 동일하게 한 4종류의 배지(표 1)를 멸균하여 준비하였으며, 배지의 pH는 멸균 전에 pH 7.2로 조정하였다. 멸균된 4종류의 배지에 상기에서 배양한 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 4%를 접종하여 28℃에서 5일 동안 235rpm으로 진탕 배양하였다. In order to select a suitable carbon source, four kinds of media were prepared in which corn starch, maltose, glycerol and sucrose were respectively added in an amount of 3.5% by weight and the nitrogen source and the mineral were the same ) Was prepared by sterilization, and the pH of the medium was adjusted to pH 7.2 before sterilization. 4% of Streptomyces chromopus course cultured as described above was inoculated into the four kinds of sterilized media and cultured at 28 DEG C for 5 days with shaking at 235 rpm.
그 결과, 말토오소 및 수크로오스를 탄소원으로 첨가한 배지에서는 허브옥시디엔의 생산량이 증가하지 않았으며, 글리세롤이 첨가된 배지(No.3)에서 허브옥시디엔의 생산량은 582.6㎎/㎖으로, 기본 배지인 1번 배지(No. 1)에 비해 10.6배 생산량이 증가한 것을 확인하였다 (표 1).
As a result, in the medium supplemented with maltose and sucrose as a carbon source, the production amount of herb oxydien was not increased, and the production amount of herb oxydien in the medium supplemented with glycerol (No. 3) was 582.6 mg / (Table 1), which was 10.6 times higher than that of No. 1 medium (No. 1).
3.5%Carbon sources
3.5%
0.8% Nitrogen sources
0.8%
(mg/L)Herboxidiene
(mg / L)
1-3 : 1-3: 허브옥시디엔Herb oxydien 생산 균주의 대량배양을 위한 질소원( Nitrogen source for mass culture of production strains NitrogenNitrogen sourcessources ) 선별) Selection
허브옥시디엔 생산 균주의 대량배양을 위한 배지 조건 확립을 위하여, 탄소, 질소 및 무기질 등을 변화시켜 실험을 진행하였다. In order to establish the culture conditions for mass culture of herb oxydien producing strains, experiments were carried out by changing carbon, nitrogen and minerals.
적합한 질소원을 선별하기 위하여, 펩톤(peptone), 프로플로(ProFlo, 목화씨를 효소로 처리함), 트립톤(triptone) 및 소이빈플라워(soybean flour)를 각각 0.8 중량%첨가 하고, 실시예 1-2의 배지 No. 3과 같이 글리세롤 및 무기질을 동일하게 한 4종류의 배지(표 2)를 멸균하여 준비하였으며, 배지의 pH는 멸균 전에 pH 7.2로 조정하였다. 멸균된 4종류의 배지에 상기에서 배양한 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 4 중량%를 접종하여 28℃에서 5일 동안 235rpm으로 진탕 배양하였다. In order to select a suitable nitrogen source, 0.8 wt% of peptone, ProFlo (treated with an enzyme of cottonseed), triptone and soybean flour were added in an amount of 0.8
그 결과, 펩톤, 트립톤 및 소이빈플라워를 질소원으로 첨가한 배지에서는 허브옥시디엔의 생산량이 감소하였으므로, 허브옥시디엔의 생산을 증가시키기 위한 배지의 질소원으로 프로플로(ProFlo)가 적합한 것을 확인할 수 있었다 (표 2).
As a result, it was confirmed that ProFlo was suitable as the nitrogen source of the medium for increasing the production of herb oxydien because the production amount of herb oxydien was decreased in the medium in which the peptone, the tryptone and the soybean flower were added as the nitrogen source (Table 2).
sources
3.5%Carbon
sources
3.5%
0.8%Nitrogen sources
0.8%
(mg/L)Herboxidiene
(mg / L)
1-4 : 1-4: 허브옥시디엔Herb oxydien 생산 균주의 대량배양을 위한 무기질 선별 Mineral sorting for mass culture of production strains
허브옥시디엔 생산 균주의 대량배양을 위한 배지 조건 확립을 위하여, 탄소, 질소 및 무기질 등을 변화시켜 실험을 진행하였다. In order to establish the culture conditions for mass culture of herb oxydien producing strains, experiments were carried out by changing carbon, nitrogen and minerals.
상기 실시예 1-3의 배지 No. 6의 조성의 무기질 중에서 질산칼륨(KNO3)을 제외한 나머지 무기질, 탄소원 및 질소원을 동일하게 하여 동일하게 하여 멸균하여 준비하였으며, 배지의 pH는 멸균 전에 pH 7.2로 조정하였다 (표 3). 질산칼륨(KNO3)을 제외한 배지는 No. 6A라고 명명하였으며, 상기에서 배양한 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 4 중량%를 접종하여 28℃에서 5일 동안 235rpm으로 진탕 배양하였다. The culture medium No. of Example 1-3. 6 was sterilized in the same manner as in Example 1 except that potassium nitrate (KNO 3 ) was minced. The pH of the medium was adjusted to 7.2 before sterilization (Table 3). The medium except for potassium nitrate (KNO 3 ) 6A, and 4% by weight of Streptomyces chromopus cultured in the above was inoculated and cultured at 28 DEG C for 5 days with shaking at 235 rpm.
그 결과, 배지 No. 6 및 질산칼륨(KNO3)을 제외한 배지 No. 6A에서 생산된 허브옥시디엔의 생산량은 각각 582.6㎎/㎖ 및 585.0㎎/㎖으로 기본 배지 No. 1에 비해 각각 10.6배 및 10.7배 생산량이 증가한 것을 확인하였으며, 질산칼륨(KNO3)을 제외한 배지 No. 6A에서 높은 허브옥시디엔의 생산성을 보이는 것을 확인하였다.
As a result, 6 and potassium nitrate (KNO 3 ). The yields of herb oxydienes produced in 6A were 582.6 mg / ml and 585.0 mg / ml, respectively. 1 and 10.7 times, respectively, compared to that of the medium No. 1 except for potassium nitrate (KNO 3 ). 6A showed high productivity of herb oxydien.
3.5%Carbon sources
3.5%
0.8%Nitrogen sources
0.8%
(mg/L)Herboxidiene
(mg / L)
1-5 : 1-5: 허브옥시디엔Herb oxydien 생산 균주의 대량배양을 위한 For the mass culture of production strains 탄소원Carbon source 및 질소원 함량 조건 확립 And nitrogen source content conditions
허브옥시디엔 생산 균주의 대량배양을 위한 배지 조건 확립을 위하여, 배지에 첨가되는 탄소원인 글리세롤과 질소원인 프로플로(ProFlo)의 양을 다양하게 하여 스트렙토마이세스 크로모푸스코스를 배양하였다. Streptomyces chromopus course was cultured by varying the amount of glycerol, which is a carbon source added to the medium, and ProFlo, which is a nitrogen source, in order to establish medium conditions for mass culture of herb oxydien producing strains.
상기 실시예 1-4의 배지 No. 6A의 배지 조건을 기본으로 하여, 글리세롤의 양을 5 중량%, 6 중량% 및 7 중량%로 첨가하고 질소원 및 무기질을 동일하게 한 배지(배지 No. 6A, No. 6A1, No. 6A2 및 No. 6A3)를 멸균하여 준비하였으며, 배지의 pH는 멸균 전에 pH 7.2로 조정하였다 (표 4). 멸균된 배지에 상기에서 배양한 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 4%를 접종하여 28℃에서 5일 동안 235rpm으로 진탕 배양하였다. The culture medium No. of Example 1-4. 6A1, No. 6A2 and No. 6A, in which the amount of glycerol was added in an amount of 5% by weight, 6% by weight and 7% by weight, 6A3) were prepared and the pH of the medium was adjusted to pH 7.2 before sterilization (Table 4). The sterilized medium was inoculated with 4% of Streptomyces chromopus course cultured as described above, and cultured at 28 ° C for 5 days with shaking at 235 rpm.
배양 추출물은 TLC(thin-layer chromatography)를 이용하여 분석하였으며, 클로로포름(CHCl3)과 메탄올(MeOH)을 9:1로 혼합한 조건에서 수행하였다. Rf(Retention factor) 값은 UV 와 p-anisaldehyde반응을 통해 결정하였으며, Rf 값은 0.44로 확인되었다. The cultured extract was analyzed by thin-layer chromatography (TLC), and the mixture was mixed with chloroform (CHCl 3 ) and methanol (MeOH) at a ratio of 9: 1. The retention factor (Rf) value was determined by UV and p- anisaldehyde reaction, and the Rf value was 0.44.
그 결과, 5 중량%의 글리세롤을 첨가한 배지 No. 6A1에서 가장 높은 허브옥시디엔의 생산성을 보이는 것을 확인하였다 (도 1).
As a result, the medium No. 5 containing 5% by weight of glycerol was added. 6A1 showed the highest productivity of herb oxydien (FIG. 1).
(%)Carbon sources
(%)
0.8%Nitrogen sources
0.8%
3.5Glycerol
3.5
5Glycerol
5
6Glycerol
6
7Glycerol
7
가장 높은 허브옥시디엔의 생산성을 보인 배지 No. 6A1와 같이 첨가되는 글리세롤의 양(5%) 및 무기질의 양을 동일하게 한 배지에 프로플로(ProFlo)의 양을 0.6 중량%, 0.4 중량% 및 0.25 중량%로 첨가한 배지(배지 No. 6A1, No. 6A4, No. 6A5 및 No. 6A6)를 멸균하여 준비하였으며, 배지의 pH는 멸균 전에 pH 7.2로 조정하였다 (표 5). 멸균된 배지에 상기에서 배양한 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 4 중량%를 접종하여 28℃에서 5일 동안 235rpm으로 진탕 배양한 후 배양 추출물을 TLC(thin-layer chromatography)를 이용하여 분석하였다. Medium No. 1 showed the highest productivity of herb oxydien. (Medium No. 6A1) supplemented with 0.6% by weight, 0.4% by weight and 0.25% by weight of the amount of ProFlo was added to a medium in which the amount of glycerol (5% , No. 6A4, No. 6A5 and No. 6A6) were sterilized and the pH of the medium was adjusted to pH 7.2 before sterilization (Table 5). The sterilized medium was inoculated with 4% by weight of the Streptomyces chromopus course cultured as described above, and cultured at 28 ° C for 5 days with shaking at 235 rpm. The culture extract was analyzed by thin-layer chromatography (TLC).
그 결과, 0.25 중량%의 프로플로(ProFlo)를 첨가한 배지 No. 6A6에서 가장 높은 허브옥시디엔의 생산성을 보이는 것을 확인하였다 (도 2). 이후의 실험에서 배지 No. 6A6를 이용하여 스트렙토마이세스 크로모푸스코스를 배양하였다.
As a result, it was found that a culture medium No. 1 containing 0.25% by weight of ProFlo was added. 6A6 showed the highest productivity of herb oxydien (FIG. 2). In the subsequent experiments, Streptomyces chromopus course was cultured using 6A6.
5%Carbon sources
5%
(%)Nitrogen sources
(%)
0.8ProFlo
0.8
0.6ProFlo
0.6
0.4ProFlo
0.4
0.25ProFlo
0.25
실시예Example 2: 2: 허브옥시디엔Herb oxydien 생산 균주의 성장속도 및 The growth rate of the production strain and 허브옥시디엔Herb oxydien 생산량 분석 Yield analysis
허브옥시디엔 생산 균주인 스트렙토마이세스 크로모푸스코스의 성장 속도 및 허브옥시디엔의 생산량을 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. Experiments were conducted to confirm the growth rate of the herb oxydien producing strain Streptomyces chromopus course and the production of herb oxydienes.
상기 실시예 1-1에서 ISP-2 배양 배지에서 배양된 스트렙토마이세스 크로모푸스코스 4.5㎎을 150㎖의 배지 No. 6A6와 함께 2ℓ배플(baffle) 플라스크에 넣고 28℃에서 36시간 동안 235rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 5일 동안 배양액 10㎖를 24시간 간격으로 회수하여, 3000rpm으로 15분간 원심분리하여 세포 펠릿(pellet)을 분리하였다. 분리된 세포 펠릿은 탈이온수(deionized water)로 두번 세척하였으며, 80℃에서 건조시킨 후에 균사체(mycelia)의 무게를 측정하여 스트렙토마이세스 크로모푸스코스의 성장 속도를 확인하였다. 4.5 mg of the Streptomyces chromopus course cultured in the ISP-2 culture medium in Example 1-1 was added to 150 ml of medium No. 1. 6A6 in a 2 l baffle flask and incubated at 28 DEG C for 36 hours with shaking at 235 rpm. For 5 days of culture, 10 ml of the culture solution was collected at intervals of 24 hours, and centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to separate the cell pellet. The separated cell pellet was washed twice with deionized water. After drying at 80 ° C, the growth rate of Streptomyces chromopus course was measured by measuring the weight of mycelia (mycelia).
세포 펠릿을 제거한 후 얻어진 상층액은 pH의 변화 및 생산된 허브옥시디엔의 양을 측정하였으며,허브옥시디엔의 최대 생산량을 보이는 배양시간을 확인하기 위해. 최대 5일까지 배양된 배지를 회수하여 생산된 허브옥시디엔의 생산량을 확인하였다. 회수된 배양 배지는 여과지(filter paper, Whatman)을 이용하여 여과시킨 후, 여과된 양의 두 배 볼륨의 에틸 아세테이트를 처리하여 에틸 에세테이트 층을 분리하였다. 분리된 에틸 아세테이트 층은 Rota-vapor를 이용하여 농축한 후에 메탄올에 녹여, TLC를 통해 분석하였다. After removing the cell pellet, the supernatant obtained was subjected to pH change and the amount of herb oxydien produced. To determine the incubation time showing the maximum production of herb oxydienes. The medium cultured for up to 5 days was recovered and the yield of herb oxydienes produced was confirmed. The recovered culture medium was filtered using a filter paper (Whatman), and the ethyl acetate layer was separated by treating the filtrate with twice the volume of ethyl acetate. The separated ethyl acetate layer was concentrated using Rota-vapor, dissolved in methanol and analyzed by TLC.
그 결과, 스트렙토마이세스 크로모푸스코스는 배양 48시간까지는 성장기(exponential phase), 배양 72시간까지는 정지기(stationary phase), 그 이후 사멸기(death phase)를 보이는 것을 확인하였다 (표 6 및 도 4). 배양 72시간 이후부터는 균체량이 감소하는 결과를 보였지만, 허브옥시디엔은 점점 생산량이 증가하여 배양 5일째 생산량이 높은 것을 확인하였다 (도 5).
As a result, it was confirmed that the Streptomyces chromopus course exhibited an exponential phase up to 48 hours of culture, a stationary phase up to 72 hours of culture, and then a death phase (see Table 6 and FIG. 4). From 72 hours after the incubation, the amount of the bacterial cells was decreased. However, it was confirmed that the production of herb oxydien gradually increased and the production was increased on the 5th day of culture (FIG. 5).
허브옥시디엔의 생산량이 증가한 배양 5일 이후에의 허브옥시디엔의 생산량 변화를 확인하기 위하여, 상기와 같은 방법으로 최대 8일까지 스트렙토마이세스 크로모푸스코스를 배양하였다. 배양 8일까지 24시간 간격으로 배지를 회수하였으며, 회수된 배양 배지를 여과지(filter paper, Whatman)을 이용하여 여과시킨 후, 여과된 양의 두 배 볼륨의 에틸 아세테이트를 처리하여 에틸 에세테이트 층을 분리하였다. 분리된 에틸 아세테이트 층은 Rota-vapor를 이용하여 농축한 후에 메탄올에 녹여, TLC를 통해 분석하였다.Streptomyces chromopus course was cultured for up to 8 days in the same manner as described above to confirm the change in herb oxydien production after 5 days of cultivation with increased production of herb oxydien. The medium was collected at 24-hour intervals until 8 days of culture. The recovered culture medium was filtered using a filter paper (Whatman), and the filtrate was treated with twice the volume of ethyl acetate to obtain an ethyl acetate layer Respectively. The separated ethyl acetate layer was concentrated using Rota-vapor, dissolved in methanol and analyzed by TLC.
그 결과, 허브옥시디엔은 배양 8일째 최대 생산량을 보이는 것을 확인하였다 (도 6).
As a result, it was confirmed that herb oxydien showed the maximum production on the eighth day of culture (Fig. 6).
실시예Example 3: 3: 허브옥시디엔의Herb oxydien 생산을 증가시키기 위한 배양조건 확립 Establish culture conditions to increase production
허브옥시디엔의 생산을 증가시키기 위해서 유가식 배양(fed batch culture)을 수행하였으며, 허브옥시디엔의 최적 생산 조건을 확립하기 위하여 영양분 첨가 시간 및 종류를 다양하게 하여 실험을 수행하였다. In order to increase the production of herb oxydien, fed batch culture was performed. Experiments were carried out by varying the nutrient addition time and kinds in order to establish optimal production conditions of herb oxydien.
스트렙토마이세스 크로모푸스코스는 배지 No. 6A6을 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 배양되었으며, 글리세롤 2.5 중량%, 프로플로 0.125 중량% 및 글리세롤 2.5 중량%와 프로플로 0.125 중량%를 함께 처리한 군으로 나누어, 각각 배양 24시간, 35시간 및 48시간 후에 추가로 탄소원 또는 질소원을 첨가하였다. 배양 8일 후에 각 그룹별로 성장한 균체의 무게를 측정하여, 균체의 성장정도를 확인하였으며, 배양 배지를 회수한 후, HPLC를 이용하여 허브옥시디엔의 생산 정도를 확인하였다.The Streptomyces chromopus course contains the culture medium No. 6A6 in the same manner as in Example 2 and divided into a group treated with 2.5% by weight of glycerol, 0.125% by weight of propylene and 2.5% by weight of glycerol and 0.125% by weight of propylene and cultured for 24 hours and 35 hours And after 48 hours an additional carbon source or nitrogen source was added. After 8 days of culture, the weight of the cells grown by each group was measured to confirm the growth of the cells. After the culture medium was recovered, the degree of production of herb oxydien was confirmed by HPLC.
균체의 무게를 측정한 결과, 배양 36시간 후에 탄소원 또는 질소원을 첨가해 준 경우가 24시간 및 48시간에 첨가해준 경우보다 균체의 성장이 증가한 것을 확인하였으며, 그 중에서 배양 36시간 후에 글리세롤 2.5 중량%와 프로플로 0.125 중량%를 함께 처리한 군이 가장 높은 균체 성장을 보이는 것을 확인하였다 (도 7)
As a result of measuring the weight of the cells, it was confirmed that when the carbon source or nitrogen source was added 36 hours after the culture, the growth of the cells was increased compared to when the cells were added at 24 hours and 48 hours. Among them, after 2.5 hours, And 0.125% by weight of Propyl showed the highest cell growth (Fig. 7)
(2.5)Glycerol
(2.5)
(2.5)Glycerol
(2.5)
(2.5)Glycerol
(2.5)
(0.125)ProFlo
(0.125)
(0.125)ProFlo
(0.125)
(0.125)ProFlo
(0.125)
(2.5:0.125)Glycerol: ProFlo
(2.5: 0.125)
(2.5:0.125)Glycerol: ProFlo
(2.5: 0.125)
(2.5:0.125)Glycerol: ProFlo
(2.5: 0.125)
또한, 허브옥시디엔의 생산량을 HPLC(도 8)를 이용하여 확인한 결과, 배양 36시간 후에 글리세롤 2.5 중량%와 프로플로 0.125 중량%를 함께 처리한 군에서 1086.9㎎/㎖으로 가장 높은 허브옥시디엔 생산량을 보이는 것을 확인하였다 (표 7). 이는 아무것도 처리하지 않은 배지 No. 6A6 및 기본 배지 No. 1과 비교하였을 때, 각각 1.5배 및 19.8배 생산성이 증가한 것을 알 수 있었다.
As a result of confirming the production amount of herb oxydien using HPLC (FIG. 8), it was found that the highest herboxydene production amount was 1086.9 mg / ml in the group treated with 2.5% by weight of glycerol and 0.125% by weight of propylene after 36 hours of culture (Table 7). This indicates that the culture medium No. < RTI ID = 0.0 > 6A6 < / RTI > 1, productivity increased by 1.5 times and 19.8 times, respectively.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
Claims (10)
The culture of Streptomyces chromofuscus for the production of herboxidiene, which comprises 3.5 to 7% by weight of glycerol and 0.25 to 0.8% by weight of ProFlo, badge.
The method according to claim 1, wherein at least one of potassium phosphate (KH 2 PO 4 ), sodium chloride (NaCl), calcium carbonate (CaCO 3 ), zinc sulfate (ZnSO 4 .7H 2 O) and chelate iron And a culture medium containing the same.
A method for producing herboxidiene ( Streptomyces chromofuscus ) for the production of herboxidiene, which comprises culturing Streptomyces chromofuscus in the culture medium of claim 1 or 2, Lt; / RTI >
The culture method according to claim 4, wherein at least one of glycerol and ProFlo is further added after 24 hours to 48 hours of culturing.
(a) 제1항 또는 제2항의 배양 배지에 스트렙토마이세스 크로모푸스코스(Streptomyces chromofuscus)를 배양하여 허브옥시디엔을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 허브옥시디엔을 수득하는 단계.
A process for preparing a herb oxydienes comprising the steps of:
(a) culturing Streptomyces chromofuscus in the culture medium of claim 1 or 2 to produce herbicoxidene ; And
(b) obtaining the resulting herb oxadiene.
The method according to claim 7, wherein the Streptomyces chromofuscus is cultured for 5 days to 8 days.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120109185A KR101400997B1 (en) | 2012-09-28 | 2012-09-28 | Method for Preparing Herboxidiene Using Streptomyces chromofuscus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120109185A KR101400997B1 (en) | 2012-09-28 | 2012-09-28 | Method for Preparing Herboxidiene Using Streptomyces chromofuscus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140051474A KR20140051474A (en) | 2014-05-02 |
| KR101400997B1 true KR101400997B1 (en) | 2014-06-19 |
Family
ID=50885119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120109185A Active KR101400997B1 (en) | 2012-09-28 | 2012-09-28 | Method for Preparing Herboxidiene Using Streptomyces chromofuscus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101400997B1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040019450A (en) * | 2002-08-26 | 2004-03-06 | 학교법인 영남학원 | Novel strain Streptomyces sp. YU100 producing extracellular phospholipase D and Use thereof |
-
2012
- 2012-09-28 KR KR1020120109185A patent/KR101400997B1/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040019450A (en) * | 2002-08-26 | 2004-03-06 | 학교법인 영남학원 | Novel strain Streptomyces sp. YU100 producing extracellular phospholipase D and Use thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J. Antibiot., Vol.50, pp.970-971(1997.) * |
| The Journal of Antibiotics, Vol.45, pp.914-921(1992.) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20140051474A (en) | 2014-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA116835C2 (en) | Recombinant microorganism expressing avermectin analogue and use thereof | |
| US9689017B2 (en) | Method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of Bacillus subtilis subsp | |
| CN101333206A (en) | Macrolide compound and its preparation and application | |
| Reddy et al. | Optimization of culture conditions of Streptomyces rochei (MTCC 10109) for the production of antimicrobial metabolites | |
| Premalatha et al. | Production and characterization of naphthoquinone pigment from Fusarium moniliforme MTCC6985 | |
| CN112831421A (en) | Cephalosporin compound production strain and application thereof | |
| CN113388556B (en) | Method for producing aureomycin by using streptomyces aureofaciens | |
| KR101400997B1 (en) | Method for Preparing Herboxidiene Using Streptomyces chromofuscus | |
| KR20120058790A (en) | Streptomyces roseosporus mutant having enhanced productivity of daptomycin and production method of daptomycin using the same | |
| Sanjotha et al. | An in vitro approach for evaluating antimicrobial activity and production of kojic acid by aspergillus flavus isolated from Karwar region | |
| WO2006075395A1 (en) | β-LACTAM ANTIBIOTIC ACTIVITY ENHANCER AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME | |
| CN103014092B (en) | Preparation method for improving productivity of mitomycin C | |
| CN113337432B (en) | Methylophilus for producing pyrroloquinoline quinone and application thereof | |
| JP2025515965A (en) | Methods for improving the fermentation yield of PF1022A | |
| CN104388418A (en) | Method for breeding gibberellic acid high-producing strains by performing low-energy ion induced mutation on gibberella | |
| CN116410890A (en) | Environment-friendly actinomycetes SZF-179 and application thereof in pear black spot control | |
| CN104250621A (en) | Sea streptomyces cinereoruber and method of applying same to prepare aurone compound | |
| EP3086794B1 (en) | Process for the conversion of colchicinoids to their 3-glycosylated derivatives via their respective 3-demethyl analogues | |
| RU2420568C2 (en) | Strain and biosynthesis method of producing antibiotic mitomycin | |
| US7846699B2 (en) | Process for gibberellic acid production with “Fusarium moniliforme” strains | |
| KR20070047811A (en) | Yeast mutant strain, manufacturing method of high glutathione-containing yeast, its culture, fractions, yeast extract and food containing glutathione | |
| CN105733979B (en) | The superior strain of bleomycin derivative 6 '-dehydroxylation-BLM S | |
| JP5694708B2 (en) | A-87774 compounds or salts thereof, processes for producing them, and agricultural chemicals containing them as active ingredients | |
| CN110249942B (en) | Hybrid rice breeding method | |
| CN116751134B (en) | Root-promoting active substance isolated from plant probiotics trichoderma metabolite and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20120928 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20140124 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20140520 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20140522 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20140523 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180409 Year of fee payment: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20180409 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20200406 Start annual number: 7 End annual number: 7 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20210405 Start annual number: 8 End annual number: 8 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20230321 Start annual number: 10 End annual number: 10 |