KR101379626B1 - 어류의 에드워드시엘라증 및 연쇄구균증용 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 어류의 에드워드시엘라증 및 연쇄구균증 백신의 제공에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 (A)에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주의 불활화 균체, (B) 상기 대상 어류 이외의 어류 유래주의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체로서, (A)가 정형(定型) 에드워드시엘라·타르다인 경우는 비정형(非定型) 에드워드시엘라·타르다이고, 반대인 경우는 정형 에드워드시엘라·타르다인 불활화 균체를 함유하는 대상 어류의 에드워드시엘라증용 백신, 또는 이들에 추가하여 (C) 스트렙토코커스·이니에 및/또는 스트렙토코커스·파라우베리스의 불활화 균체를 함유하는 어류의 에드워드시엘라증 및/또는 연쇄구균증용 백신에 관한 것이다.
Description
본 발명은, 어류의 에드워드시엘라증용 백신 및 연쇄구균증용 백신에 관한 것이다.
최근, 어류의 양식어업은 현저하게 발전했지만, 그것에 수반하여 바이러스병이나 세균병이 다발하여, 커다란 경제적 피해를 초래하고 있다.
이 중, 세균병의 치료제로서는, 항생물질이나 합성 항균제가 사용되고 있지만, 이러한 항균성 물질에 대해 내성균이 출현하고 있어, 충분한 치료 효과가 얻어지지 않고 있다. 또한, 치료제로서 사용하는 약제의 어체(魚體) 내 잔류에 의한 공중위생상의 문제가 발생하고 있어, 항균성 물질에 의존하지 않는 어병(魚病) 대책의 확립이 강하게 요망되고 있다.
이러한 관점에서, 백신의 개발은 중요하다. 바이러스병에 대해서는, 방어, 잿방어, 참돔 등의 이리도바이러스병에 의한 피해가 컸지만, 이들의 바이러스병에 대한 백신이 시판됨으로써 병의 발생이 적어지고 있다. 세균병에 대해서는, 방어의 연쇄구균증, 넙치의 연쇄구균증, 넙치의 에드워드시엘라증, 도미의 에드워드시엘라증 등에 의한 피해가 크다. 이 중, 방어의 연쇄구균증에 대해서는, 백신이 개발됨 으로써, 병의 발생률이 감소하기 시작하고 있다.
그러나, 넙치나 도미의 세균병에 대한 백신은, 아직까지 충분하다고는 할 수 없다. 즉, 경제적 피해가 큰 넙치의 에드워드시엘라증에 대해서는, 오래전부터 백신의 개발이 시도되어 왔다(비특허문헌 1). 그러나, 병원균인 에드워드시엘라·타르다(Edwardsiella tarda)의 넙치 유래주의 포르말린 사균(死菌)을 백신으로서 투여하면, 넙치의 혈액 중에 항체가 산생되고, 백혈구가 활발하게 E. tarda를 탐식하지만, 백혈구에 의한 살균작용에 대해 병원균이 저항하여, 백혈구 내에서 계속해서 생존하기 때문에, 백신에 의한 예방효과는 인정되지 않아, 오늘날에 이르기까지 유효한 백신은 개발되어 있지 않다. 또한, 동일한 이유에 의해, 도미의 에드워드시엘라증에 대해서도, 백신이 개발되어 있지 않다.
한편, 넙치의 연쇄구균증은, 스트렙토코커스·이니에(Streptococcus iniae), 스트렙토코커스·파라우베리스(S. parauberis), 및 락토코커스·가르비에(Lactococcus garvieae)에 의해 발생하는 병의 총칭으로, 스트렙토코커스·이니에 감염증에 대한 백신이 개발된 현재에 있어서는, 스트렙토코커스·파라우베리스에 의한 연쇄구균증이 다발하여, 커다란 피해를 초래하고 있어, 완전한 백신의 개발이 요망되고 있다. 또한, 양식현장에서의 에드워드시엘라증과 연쇄구균증이 혼합감염증으로서 동시에 발생하는 경우가 많은 것으로부터, 이들 두 질병에 대한 적확한 효과를 발휘하는 혼합백신의 개발이 기대되고 있다.
비특허문헌 1: 메쿠치 등; 어병연구, 30(4), 251-256: 1995
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 과제는, 넙치나 도미 등의 어류의 에드워드시엘라증에 유효한 백신 및 연쇄구균증에 유효한 백신을 제공하는 것에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
이에 본 발명자는, 에드워드시엘라·타르다의 넙치 유래의 불활화(不活化) 균체에, 참돔, 붉돔 등의 어류 유래의 비정형 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체를 혼합하여 넙치에 투여한 바, 그 넙치로부터 분리한 매크로파지와 림프구의 혼재하에 있어서, 에드워드시엘라·타르다의 넙치 유래주의 생균(生菌)을 매크로파지가 탐식할 뿐 아니라, 신속하게 살멸(殺滅)하는 것을 발견하였다. 또한, 이들 백신을 투여한 넙치를 에드워드시엘라·타르다로 공격한 바, 높은 방어 효과를 갖는 것을 발견하였다. 또한, 이 백신에, 스트렙토코커스·이니에 및/또는 스트렙토코커스·파라우베리스 전체를 병용하면, 넙치의 에드워드시엘라증과 연쇄구균증에 유효한 혼합백신이 얻어지는 것도 발견하였다. 또한, 넙치 뿐 아니라, 도미, 기타 어류에서도, 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류의 불활화 균체에, 정형 또는 비정형 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체를 혼합하여 투여하면, 대상 어류의 에드워드시엘라·타르다에 대한 높은 방어 효과가 얻어지는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은, (A) 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주의 불활화 균체, 및 (B) 상기 대상 어류 이외의 어류 유래주의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체로서, (A)가 정형(定型) 에드워드시엘라·타르다인 경우는 비정형(非定型) 에드워드시엘라·타르다이고, 반대인 경우는 정형 에드워드시엘라·타르다인 불활화 균체를 함유하는 대상 어류의 에드워드시엘라증용 백신을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은, (A) 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주의 불활화 균체, (B) 상기 대상 어류 이외의 어류 유래주의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체로서, (A)가 정형 에드워드시엘라·타르다인 경우는 비정형 에드워드시엘라·타르다이고, 반대인 경우는 정형 에드워드시엘라·타르다인 불활화 균체, 및 (C) 스트렙토코커스·이니에 및/또는 스트랩토코커스·파라우베리스의 불활화 균체를 함유하는 대상 어류의 에드워드시엘라증 및/또는 연쇄구균증용 백신을 제공하는 것이다.
현재, 양식어류에 많은 감염증이 발생하여, 막대한 경제적 피해를 초래하고 있어, 본 발명의 백신을 사용하면, 백신이 개발되어 있지 않았던 어류의 에드워드시엘라증을 확실하게 예방할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신을 사용하면, 어류의 에드워드시엘라증과 연쇄구균증의 혼합감염에 대해서도 확실하게 예방할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 어류의 에드워드시엘라증용 백신은, (A) 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주의 불활화 균체와, (B) 상기 대상 어류 이외의 어류 유래주의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체로서, (A)가 정형 에드워드시엘라·타르다인 경우는 비정형 에드워드시엘라·타르다이고, 반대인 경우는 정형 에드워드시엘라·타르다인 불활화 균체를 함유하는 것이다. 여기서 대상 어류란, 백신 투여의 대상이 되는 어류를 의미한다.
본 발명에 있어서 대상 어류로서는, 에드워드시엘라·타르다에 감염되는 어류라면 특별히 제한되지 않지만, 넙치, 뱀장어, 메기, 틸라피아 등의 정형 에드워드시엘라·타르다에 감염되는 어류, 및 도미, 붉돔, 방어 등의 비정형 에드워드시엘라·타르다에 감염되는 어류의 양식대상 어류를 들 수 있다. 이 중, 에드워드시엘라·타르다에 의한 감염피해가 큰 넙치, 뱀장어, 메기, 도미가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 정형 에드워드시엘라·타르다는, 편모(鞭毛)(주모(周毛))를 가지며, 운동성이 있는 균으로, 넙치, 뱀장어, 메기, 틸라피아를 감염시키는 것이 알려져 있다. 한편, 비정형 에드워드시엘라·타르다란, 에드워드시엘라·타르다에 분류되어 있지만, 편모(주모)를 갖지 않고, 운동성이 없는 관점에서, 정형 에드워드시엘라와는 상이한 균으로, 참돔, 붉돔, 방어 등을 감염시키는 것이 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 넙치에는, 넙치·가자미류에 속하는 가자미목·가자미아목의 양식대상 어류가 포함된다. 구체적으로는, 넙치(Paralichthys olivaceus), 터봇(Scophthalmus maximus), 노랑가자미(Verasper moseri), 범가자미(Verasper variegatus) 등이 포함된다. 또한, 도미에는, 농어목, 농어아목, 도미과의 양식어류가 포함된다. 구체적으로는, 참돔(Pagus major), 감성돔(Acanthopagrus schlegeli), 붉돔(Evynnis japonica), 황돔(Taius tumifrons) 등이 포함된다. 또한, 틸라피아에는, 나일틸라피아(Oreochromis niloticus), 틸라피아 모잠비카(Oreochromis mossambicus), 레드틸라피아(O. mossambicus와 O. urolepis hornorum의 교배종)가, 방어에는 방어(Seriola quinqueradiata), 잿방어(Seriola dumerili), 부시리(Seriola lalandi)가, 뱀장어에는 일본 양식 뱀장어(Anguilla japonica), 유럽 뱀장어(Anguilla anguilla)가, 메기에는 차넬메기(Ictalurus punctatus) 등이 포함된다.
(A) 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주로서는, 에드워드시엘라·타르다에 감염된 대상 어류로부터 통상의 방법에 따라 분리한 것을 들 수 있다. 예를 들어 (A) 에드워드시엘라·타르다의 넙치 유래주로서는, OA-3주, EH-5주, UH-2주 등을 들 수 있다. 또한, 에드워드시엘라·타르다의 참돔 유래주로서는, UT-1주, UT-4주, YK-1주 등을 들 수 있다. 에드워드시엘라·타르다의 뱀장어 유래주로서는, NES-2주, SE-6주를 들 수 있다.
이들의 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주의 불활화 균체로서는, 포르말린처리 사균체(死菌體), 가열처리 사균체, 페놀처리 사균체, 자외선조사 사균체 등을 들 수 있지만, 포르말린처리 사균체가 바람직하다. 포르말린처리는, 통상 균체 함유액에 대해, 0.3~0.7%가 되도록 포르말린을 첨가하면 된다.
(A) 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주의 불활화 균체는, 108~1011 CFU/mL 농도로 하는 것이 바람직하다.
(B) 상기 대상 어류 이외의 어류 유래주의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체로서, (A)가 정형 에드워드시엘라·타르다인 경우는 비정형 에드워드시엘라·타르다이고, 반대의 경우는 정형 에드워드시엘라·타르다인 불활화 균체란, 예를 들어 대상 어류가 넙치인 경우는 (A)는 정형 에드워드시엘라·타르다이기 때문에, (B)는 비정형 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체이면 되고, 예를 들어 도미 유래의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체이면 된다. 대상 어류가 도미인 경우에는, (A)는 비정형 에드워드시엘라·타르다이기 때문에, (B)는 정형의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체이면 되고, 예를 들어 넙치 유래의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체이면 된다. 이들은 에드워드시엘라·타르다에 감염된 어류로부터 통상의 방법에 따라 분리하여 얻어진다. 당해 주(株)의 불활화 방법은, 상기 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주의 경우와 동일하다.
(B)의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체는, 108~1011 CFU/mL로 하는 것이 바람직하다.
또한, (A) 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주의 균 수와 (B)의 에드워드시엘라·타르다의 균 수는, (A):(B)=1:0.1~1, 특히 1:0.5~1이 바람직하다.
본 발명의 어류의 에드워드시엘라증 및/또는 연쇄구균증 백신은, 상기의 (A) 및 (B)의 불활화 균체에 추가하여, (C) 스트렙토코커스·이니에 및/또는 스트랩토코커스·파라우베리스의 불활화 균체를 함유한다. 당해 백신의 경우에는, (A)가 에드워드시엘라·타르다의 넙치 유래의 불활화 균체이고, (B)가 비정형 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체인 것이 바람직하다. 즉, 넙치의 에드워드시엘라증 및/또는 연쇄구균증용 백신인 것이 바람직하다.
스트렙토코커스·이니에의 불활화 균체로서는, 일반적으로 입수 가능한 균주, 예를 들어 KH-2주, ES-1주, MK-1주, EY-5주 등의 불활화 균체를 사용할 수 있다. 또한, 스트렙토코커스·파라우베리스의 불활화 균체로서는, 일반적으로 입수 가능한 균주, 예를 들어 AM-1주, AM-4주, AK-3주, US-6주 등의 불활화 균체를 사용할 수 있다. 이들 균주의 불활화 방법은 상기 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주와 동일하다.
이들 스트렙토코커스·이니에의 불활화 균체와 스트렙토코커스·파라우베리스의 불활화 균체는 병용하는 것이 바람직하다. 이들 불활화 균체는, 각각 108~1011 CFU/mL로 하는 것이 바람직하다.
어류의 에드워드시엘라증 및/또는 연쇄구균증용 백신으로서는, (A) 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주와, (B) 상기 (B)의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체와, (C1) 스트렙토코커스·이니에 및 (C2) 스트렙토코커스·파라우베리스의 4종을 조합시키는 것이 특히 바람직하다.
상기 4종의 불활화 균체의 균 수는, (A):(B):(C)=1:(0.1~1):(1~10), 특히 1:(0.5~1):(1~3)이 바람직하다. 여기서 (C)는, 2종의 주 각각의 균 수이다. 상기 (A)와 (B)와 (C1)과 (C2)의 조합의 경우에는, (A):(B):(C1):(C2)=1:(0.1~1):(1~10):(1~10), 특히 1:(0.5~1):(1~3):(1~3)이 바람직하다.
본 발명의 백신은, 각 불활화 균체 성분을 각각 별개의 제제로 하여 키트로 해도 되지만, 각 불활화 균체를 함유하는 하나의 제제로서 사용하는 것이 투여함에 있어 바람직하다.
본 발명의 백신은, 주사제의 형태여도 되며, 경구 투여의 형태여도 된다. 주사제로 하는 경우에는, 상기 불활화 균체 이외에, 생리식염수를 배합해도 된다. 또한, 경구 투여로 하는 경우에는, 각종 부형제를 첨가하여 분말이나 과립상으로 해도 되며, 사료에 혼화하거나 하여 제조할 수 있다.
본 발명 백신의 사용법으로서는, 대상 어류의 근육 내나 복강 내 등으로의 주사를 들 수 있다. 주사에 사용하는 경우, 체중이 100 g 정도인 대상 어류의 근육 내에 약 0.1 mL를 접종하는 것이 바람직하다. 대상 어류의 체중이 상기 보다도 크게 상이한 경우에는, 그 비율에 따라 접종량을 증감한다. 이들 백신을 경구 투여하는 경우에는, 대상 어류의 체중 kg당 1일량으로서 1~10 mL를, 모이스트펠렛 사료에 혼화하거나, 또는 사료 중량의 5~10% 양의 물에 백신을 현탁하여 고형 사료에 분무하는 등의 방법으로 5~10일간 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명 백신의 작용 메커니즘은 명확하지는 않지만, 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주를 비롯하여, 각 균주가 갖는 특수한 항원성에 의한 것이 아니라, 대상 어류 이외의 어류 유래의 정형 또는 비정형 에드워드시엘라·타르다가 대상 어류 유래의 에드워드시엘라·타르다와의 공존하에서만 발휘하는, 식세포의 살균능에 대한 림프구도 동원한 활성화에 의한 것이라고 생각되어진다.
다음으로 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 조금도 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 본 발명의 백신을 접종한 넙치의 백혈구 탐식활성
시험방법: 평균 체중 310 g의 넙치를 10마리씩의 3군(1~3구)으로 나누어, 수온 23℃에서 사육하였다. 본 발명의 1구에는, 에드워드시엘라·타르다(E. tarda)의 넙치 유래의 OA-3주 및 참돔 유래 UT-1주를 트립틱 소이 브로쓰(Tryptic soy broth)에서 25℃, 30시간 배양하여, 그 포르말린 사균 각각을 등량 혼합한 액(대략의 균 수: 넙치 유래주 1.8×109, 참돔 유래주 1.2×109 CFU/mL)을, 2구에는 대조로서, 동일하게 배양한 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주의 포르말린 사균(대략의 균 수: 3.6×109 CFU/mL)을, 3구에는 대조로서, 트립틱 소이 브로쓰에 0.5%의 비율로 포르말린을 첨가한 액을, 넙치의 가슴 지느러미 상방의 근육 내에 0.1 mL씩 접종하였다. 접종 30일 후에 미부(尾部) 혈관으로부터 헤파린 나트륨으로 처리한 주사기를 사용하여 각구 5마리씩 채혈하여, 이하의 실험에 공급하였다.
사전에, 생리식염수에 현탁한 넙치 유래의 E. tarda OA-3주를 60℃, 10분간 정치(靜置)한 뒤에 원심하고, 균 수가 약 2×1010 CFU/mL가 되도록 증류수에 현탁하였다. 이 균액 2 mL를 직경 6 ㎝의 플라스틱 샬레에 첨가하여 1시간 정치 후, 상청을 파스퇴르 피펫으로 제거하고, 드라이어로 건조시켰다. 이 샬레에 백신을 접종한 상기의 넙치 혈액을 1.5 mL씩 중층하고, 23℃에서 30분간 정치 후, 파스퇴르 피펫으로 혈액을 제거하여, 표면을 생리식염수로 세정하였다. 샬레를 드라이어로 건조시키고, 메탄올로 고정 후 김자 염색(Giemsa staining)을 행한 후, R1PP2를 사용하여, 현미경하에서 식균 플라크 부분의 면적을 측정하였다. 실시예 1, 2에서의 시험구분을 표 1에 나타내었다.
시험결과: 본 발명구 및 대조구에서의 넙치 백혈구의 E. tarda 넙치 유래주에 대한 탐식활성을 10 시야 중의 플라크 수, 플라크 1개당의 면적 및 전체 플라크의 총 면적으로서 표 2에 나타내었다. 세균을 탐식한 백혈구의 수를 나타내는 플라크 수는, 각종 균체를 접종한 1, 2구가 배지를 주사한 3구에 비해 많고, 특히 E. tarda의 넙치 및 참돔 유래주를 접종한 1구가 다른 구에 비해 유의하게 많았다(p<0.05, 0.01). 각각의 백혈구의 탐식능을 나타내는 플라크 1개당의 면적은, E. tarda의 넙치 및 참돔 유래주를 접종한 1구가 다른 구에 비해서 유의하게 컸다(p<0.05, 0.01). 또한, 세균을 탐식하는 백혈구의 종합능력을 평가하는 플라크 총 면적에 대해서는, 1, 2구의 순으로 크고, 특히 1구가 2, 3구에 비해서 유의하게 컸다(p<0.05, 0.01). 이처럼, 본 발명의 E. tarda 넙치 유래주 및 참돔 유래주의 포르말린 사균을 넙치에 접종함으로써, E. tarda에 대한 백혈구의 탐식활성이 유의하게 높아지는 것이 명확해졌다. 또한, E. tarda 넙치 유래주만의 포르말린 사균을 접종한 경우에도, 넙치 백혈구의 탐식활성이 높아지는 경향이 확인되었다.
(실시예 2) 본 발명의 백신을 접종한 넙치의 매크로파지 살균활성
시험방법: 실시예 1에서 사용한 표 1의 각구 10마리씩의 넙치 중, 나머지 5마리로부터 동일하게 채혈하여, 퍼콜 연속밀도 구배원심법으로 매크로파지와 림프구를 분리 후, 이들의 농도가 약 1.5×105 세포/mL씩이 되도록, 또한 매크로파지만이 상기 농도가 되도록 검체도 마련하여, 각각을 행크스액에 부유시키고, 그 부유액 0.2 mL를 커버글라스에 올려, CO2 농도 5%, 25℃에서 1시간 배양하였다. 배양 후, 백혈구와 유래가 같은 넙치의 혈청으로 옵소닌화한 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주의 현탁액(균 수: 약 3×106 CFU/mL)을 0.1 mL 첨가하여, 상기 조건에서 1시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 림프구 및 탐식되지 않은 세균을 제거하고, 일부의 검체에는 아크리딘·오렌지 염색을 행하고, 다른 커버글라스에는, 추가적으로 배양을 계속하여 2, 3, 4시간 후마다 동일한 염색을 행하여, 형광현미경으로 매크로파지 내에서의 살균 유무를 관찰하였다.
시험결과: 본 발명구 및 대조구에서의 넙치 매크로파지의 E. tarda 넙치 유래주에 대한 살균활성을 살균율(%)로서 표 3에 나타내었다. 본 발명의 1구, 즉 E. tarda의 넙치 및 참돔 유래주 포르말린 사균을 접종한 구의 살균활성이 2, 3구의 그것들에 비해 높고, 특히 반응시간 2시간 후 이후에는, 1구와 2, 3구 사이에 유의한 차가 보였다(p<0.05, 0.01). 즉, 본 발명의 1구에서의 넙치 매크로파지는, 세균 탐식 후, 신속하게 살균하는 것이 명확해졌다. 또한, 1구에 있어서, 매크로파지만의 경우에 비해, 매크로파지와 림프구의 공존조건하에서의 살균활성이 유의(p<0.05)하게 높았던 점에서, E. tarda의 넙치 유래주에 참돔 유래주를 첨가함으로써, 림프구의 매크로파지에 미치는 기능이 높아지는 것이 시사되었다.
(실시예 3) 본 발명의 백신을 경구 투여한 넙치의 매크로파지 살균활성
시험방법: 평균 체중 375 g인 넙치를 5마리씩 2군(1, 2구)으로 나누어, 수온 24℃에서 사육하였다. 본 발명의 1구에는, E. tarda 넙치 유래 OA-3주 및 참돔 유래 UT-1주를 트립틱 소이 브로쓰에서 25℃, 24시간 배양하여, 그 포르말린 사균의 각각을 등량 혼합한 액(대략의 균 수: 넙치 유래주 3.4×1010, 참돔 유래주 3.0×1010 CFU/mL)을, 2구에는 대조로서, 동일하게 배양한 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주의 포르말린 사균(대략의 균 수: 6.8×1010 CFU/mL)을, 넙치 1마리당의 1일량으로서 1 mL가 되도록 모이스트펠렛에 혼화하여, 비닐 세관(細管)을 장착한 주사기로 7일간 경구 투여하였다. 경구 투여 종료 30일 후에 미부 혈관으로부터 헤파린 나트륨으로 처리한 주사기를 사용하여 각 구 5마리씩 채혈하여, 실시예 2에 기재된 방법으로 매크로파지의 살균활성을 조사하였다. 실시예 3에서의 시험구분을 표 4에 나타내었다.
시험결과: 본 발명구 및 대조구에서의 백신 경구 투여 후에서의 넙치 매크로파지의 E. tarda 넙치 유래주에 대한 살균활성을 살균율(%)로서 표 5에 나타내었다. 본 발명의 1구, 즉, E. tarda의 넙치 및 참돔 유래주의 포르말린 사균을 경구 투여한 구의 살균활성이 E. tarda 넙치 유래주의 포르말린 사균만을 경구 투여한 2구에 비해 높고, 특히 반응시간 2시간 후 이후에는, 1구와 2구 사이에 유의한 차(p<0.05, 0.01)가 보였다. 즉, 본 발명의 1구에서의 넙치 매크로파지는, 세균 탐식 후, 신속하게 살균하는 것이 명확해졌다. 또한, 1구에 있어서, 매크로파지만의 경우에 비해, 매크로파지와 림프구 공존하에서의 살균활성이 유의(p<0.05)하게 높았던 점으로부터, E. tarda의 넙치 유래주에 참돔 유래주를 첨가함으로써, 림프구의 매크로파지에 미치는 기능이 높아지는 것이 시사되었다.
(실시예 4) 넙치의 에드워드시엘라증에 대한 본 발명의 백신의 예방효과-적정 항원량의 검토
시험방법: 평균 체중 96 g의 넙치를 FRP제 수조(2.5×1.5×1.0(높이)m) 8조에 1군 60마리씩의 8군(1~8구)으로 나누어, 성장과 동시에 분양하여, 수온 19~25℃에서 10개월간 사육하였다. 본 발명의 1~3구에는 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주 및 참돔 유래 UT-1주의 각각을 트립틱 소이 브로쓰에서 25℃, 30시간 배양 후, 표 6에 나타내는 균 수가 되도록 조정하여 포르말린 사균으로 하고, 혼합하였다. 대조로서의 4~6구에는 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주를, 7구에는 참돔 유래 UT-1주를 동일하게 배양 후, 표 6에 나타내는 균 수가 되도록 조정하여, 포르말린 사균으로 하였다. 대조로서의 8구에는 상기의 배지에 0.5%의 비율로 포르말린을 첨가하였다.
이들 백신을 넙치의 가슴 지느러미 상방의 근육 내에 0.1 mL씩 접종하고, 접종 1, 6, 10개월 후에 각 구 20마리에 대해, 상기와 동일한 방법으로 배양한 E. tarda OA-3주를 현탁한 해수(대략의 균 수: 8.5×107 CFU/mL)에 30분간 침지하여 공격하였다. 공격 후 30일간 관찰하여 생잔율을 구하였다.
시험결과: 본 발명구 및 대조구에서의 백신 접종 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔율을 표 7에 나타내었다. 본 발명의 1~3구, 즉 E. tarda의 넙치 및 참돔 유래주의 포르말린 사균을 백신으로서 접종한 구 중, 백신의 균 수를 108~1010 CFU/mL로 한 2 및 3구에 있어서는, 백신 접종 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔율이 대조구(4~8구)에 비해 유의(p<0.05, 0.01)하게 높았다. 또한, 본 발명구 중, 2 및 3구와 1구의 생잔 수에도 유의(p<0.05)한 차가 보였다. 이들 결과로부터, E. tarda의 넙치 유래주만, 또는 참돔 유래주만을 투여한 경우에 있어서는, 예방효과는 인정되지 않고, 넙치 유래주와 참돔 유래주의 포르말린 사균을 혼합하여, 투여함으로써, 넙치의 E. tarda의 감염에 대한 방어능이 높아져, 본 병을 예방할 수 있는 것이 명확해졌다. 또한, 백신으로서 사용하는 경우의 적당한 항원량은, E. tarda의 넙치 유래주 및 참돔 유래주 모두 108~1010 CFU/mL 정도라고 생각되어졌다.
(실시예 5) 넙치의 에드워드시엘라증에 대한 본 발명의 백신의 예방효과-백신에 사용하는 2균종(주)의 혼합 비율의 검토
시험방법: 평균 체중 125 g의 넙치를 FRP제 수조(2.5×1.5×1.0(높이)m) 6조에 1군 40마리씩의 6군(1~6구)으로 나누어, 수온 20~25℃에서 6개월간 사육하였다. 본 발명의 1~4구에는 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주 및 참돔 유래 UT-1주의 각각을 트립틱 소이 브로쓰에서 25℃, 30시간 배양 후, 표 8에 나타내는 균 수가 되도록 조정하고 포르말린 사균으로 하여, 혼합하였다. 대조로서의 5구는 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주를 동일하게 하여 배양 후, 포르말린 사균으로 하고, 6구는 트립틱 소이 브로쓰에서 0.5%의 비율로 포르말린을 첨가하였다.
이들 백신을 넙치의 가슴 지느러미 상방의 근육 내에 0.1 mL씩 접종하고, 접종 1 및 6개월 후에 각 구 20마리씩에 대하여, 상기와 동일한 방법으로 배양한 E. tarda OA-3주를 현탁한 해수(대략의 균 수: 8.3×107 CFU/mL)에 30분간 침지하여 공격하였다. 공격 후 30일간 관찰하여 생잔율을 구하였다.
시험결과: 본 발명구 및 대조구에서의 백신 접종 1, 6개월 후에 공격한 후의 생잔율을 표 9에 나타내었다. 본 발명의 1~4구, 즉 E. tarda의 넙치 및 참돔 유래주의 포르말린 사균을 백신으로서 접종한 구 중, 넙치 유래주의 균 수가 109 CFU/mL에 대해, 참돔 유래주의 균 수가 다소 하회하거나 108 CFU/mL로 한 2, 3구에 있어서는, 백신 접종 1, 6개월 후에 공격한 후의 생잔율이 대조구(5, 6구)에 비해 유의(p<0.05, 0.01)하게 높았다. 그러나, 참돔 유래주의 균 수가 넙치 유래주의 그것을 1 오더 상회하거나, 107 CFU/mL 레벨까지 적게 한 경우에는 생잔율이 낮았다.
이들 결과로부터, 본 발명의 백신의 효과 발현에는 E. tarda의 넙치 유래주의 균 수와 참돔 유래주의 균 수의 혼합비율이 중요한 것이 명확해졌다.
(실시예 6) 넙치의 에드워드시엘라증에 대한 본 발명의 경구 백신의 예방효과
시험방법: 평균 체중 108 g의 넙치를 FRP제 수조(2.5×1.5×1.0(높이)m) 5조에 1군 60마리씩 5군(1~5구)으로 나누어, 수온 18~26℃에서 10개월간 사육하였다. 본 발명의 1~3구에는 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주 및 참돔 유래 UT-1주를, 또한 대조구로서의 4구에는 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주를, 모두 실시예 4, 5와 동일한 방법으로 포르말린 사균으로 하고, 넙치 1마리당의 1일량으로서 표 10에 나타내는 균량이 되도록, 모이스트펠렛에 혼화하여, 비닐 세관을 장착한 주사기로 7일간 경구 투여하였다. 대조로서의 5구에는 배지를 혼화한 모이스트펠렛을 부여하였다. 백신을 경구 투여한 후, 1, 6, 10개월 후에 각구 20마리씩을 E. tarda를 현탁한 해수(대략의 균 수: 7.4×10 CFU/mL)에 30분간 침지하여 공격하였다. 공격 후 30일간 관찰하여 생잔율을 구하였다.
시험결과: 본 발명구 및 대조구에서의 백신의 경구 투여 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔율을 표 11에 나타내었다. 본 발명의 1~3구, 즉 E. tarda의 넙치 및 참돔 유래주의 포르말린 사균을 경구 투여한 구에 있어서는, 백신의 투여 종료 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔율이 대조구(4, 5구)에 비해 유의(p<0.05, 0.01)하게 높았다. 또한, 백신으로서의 투여균량이 많을수록 생잔율이 높은 경향이 보였다. 이들 결과로부터, 본 발명의 백신은 경구 투여법에 있어서도, 넙치의 에드워드시엘라증에 대해 예방효과를 갖는 것이 명확해졌다.
(실시예 7) 넙치의 에드워드시엘라증 및 연쇄구균증에 대한 본 발명의 백신의 예방효과
시험방법: 평균 체중 105 g의 넙치를 FRP제 수조(2.5×1.5×1.0(높이)m) 5조에 1군 60마리씩의 5군(1~5군)으로 나누어, 성장과 동시에 분양하여, 수온 18~25℃에서 10개월간 사육하였다. 본 발명의 1~3구의 백신으로서, E. tarda의 넙치 유래 OA-3주 및 참돔 유래 UT-1주의 각각을 실시예 4~6과 동일한 방법으로 포르말린 사균으로 하고, 추가적으로 넙치 유래의 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae) KH-2주 및 스트렙토코커스 파라우베리스(S. parauberis) AM-1주의 각각을 브레인 하트 인퓨전(Brain heart infusion)에서 25℃, 20시간 배양 후의 포르말린 사균을 첨가하였다. 대조로서의 4구에는 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주, S. iniae KH-2주, S. parauberis AM-1주의 포르말린 사균 혼합액을 사용하였다. 백신으로서 사용한 상기 세균의 균 수를 표 12에 나타내었다. 또한, 5구는 무처치 대조구로 하였다.
이들 백신을 넙치의 가슴 지느러미 상방의 근육 내에 0.1 mL씩 접종하고, 접종 1, 6, 10개월 후에 각 구 20마리씩에 대해, S. iniae KH-2주, S. parauberis AM-1주의 배양균을, 각각 6.7×104 CFU/㎏(체중)이 되도록 근육 내에 접종하고, 추가적으로 6시간 후에 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주의 배양균을 현탁한 해수(균 수: 7.2×107 CFU/mL)에 30분간 침지하여 공격하였다. 공격 후 30일간 관찰하여 생잔율을 구하는 동시에, 사망어로부터 세균을 분리하여 병원균 종의 동정(同定)을 행하였다.
시험결과: 본 발명구 및 대조구에서의 백신 접종 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔율을 표 13에 나타내었다. 본 발명의 1~3구, 즉 E. tarda의 넙치 유래주, 참돔 유래주, S. iniae, S. parauberis의 포르말린 사균을 백신으로서 접종한 구에 있어서는, 접종 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔율이 E. tarda의 넙치 유래주, S. iniae, S. parauberis의 포르말린 사균을 접종한 4구 및 무처치의 5구에 비해 유의(p<0.05, 0.01)하게 높았다. 또한, E. tarda의 참돔 유래주를 제외한 3종의 세균의 균 수가 본 발명의 3구와 동일한 4구에 있어서는, 사망어의 다수로부터, E. tarda 뿐 아니라, S. iniae 및 S. parauberis가 분리되었다. 그러나, 백신으로서 사용한 4종의 세균의 균 수가 가장 적었던 1구와 2, 3구 사이에 유의(p<0.05)한 차가 인정되었다.
이들 결과로부터, E. tarda의 넙치 유래주, 참돔 유래주, S. iniae, S. parauberis의 포르말린 사균의 혼합액은, 넙치의 에드워드시엘라증 및 연쇄구균증의 백신으로서 우수한 예방효과를 갖는 것이 명확해졌다. 또한, 본 발명구와 4구의 생잔율 및 각종 병원균의 분리 빈도에 현저한 차가 인정된 것으로부터, 백신 중에 참돔 유래의 비정형 E. tarda를 첨가함으로써, 에드워드시엘라증 뿐 아니라 연쇄구균증에 대한 예방효과를 높일 수 있는 것이 명확해졌다. 그러나, 적확한 효과를 발현시키기에 필요한 균 수는, 각 균종 모두 약 108 CFU/mL 이상으로 판단되었다.
(실시예 8) 넙치의 에드워드시엘라증 및 연쇄구균증에 대한 본 발명의 경구 백신의 예방효과
시험방법: 평균 체중 92 g의 넙치를 FRP제 수조(2.5×1.5×1.0(높이)m) 6조에 1군 60마리씩의 6군(1~6구)으로 나누어, 성장과 동시에 분양하여, 수온 19~25℃에서 10개월간 사육하였다. 본 발명의 1~4구의 백신으로서, 실시예 7과 동일하게 S. parauberis AM-1주의 각각을 표 14에 나타낸 균 수가 되도록 조정한 후 포르말린 사균으로 하였다. 5구는 E. tarda의 참돔 유래주를 포함하지 않는 백신의 대조구로 하고, 6구는 무처치 대조구로 하였다.
이들 백신을 넙치 1마리당 1일의 균량이 표 14의 균 수가 되도록, 사료 중량의 10%량의 증류수에 현탁하고, 고형 배합사료에 분무한 후, 2시간 정치하여 흡착시키고, 1일당의 급이량(給餌量)이 어체중의 2%가 되도록, 5 또는 10일간 주었다. 백신의 투여 종료 1, 6, 10개월 후에 각 구 20마리씩에 대해, S. iniae KH-2주, S.paraberis AM-1주를, 각각 5.6×104, 6.8×104 CFU/㎏(체중)이 되도록 근육 내에 접종하고, 추가적으로 6시간 후에 E. tarda OA-3주의 배양균을 현탁한 해수(균 수 8.1×107 CFU/mL)에 30분간 침지하여 공격하였다. 공격 후 30일간 관찰하여 생잔율을 구하는 동시에, 사망어로부터 세균을 분리하여 병원균의 종의 동정을 행하였다.
시험결과: 본 발명구 및 대조구에서의 백신 접종 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔율을 표 15에 나타내었다. 본 발명의 1~4구, 즉 E. tarda의 넙치 유래주, 참돔 유래주, S. iniae, S. parauberis의 포르말린 사균을 백신으로서 5 또는 10일간 경구 투여한 구에 있어서는, 투여 종료 후, 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔율이 대조구(5, 6구)에 비해 유의(p<0.01)하게 높았다. 이들 결과로부터, E. tarda의 넙치 유래주, 참돔 유래주, S. iniae, S. parauberis의 포르말린 사균의 혼합액은, 경구 투여한 경우에 있어서도, 넙치의 에드워드시엘라증 및 연쇄구균증의 백신으로서 우수한 효과를 갖는 것이 명확해졌다. 또한, 본 발명구와 5구의 생잔율 및 각종 병원균의 분리 빈도에 현저한 차가 인정된 것으로부터, 백신 중에서 E. tarda의 참돔 유래주를 첨가함으로써, 에드워드시엘라증 뿐 아니라 연쇄구균증에 대한 예방효과를 높이는 것이 명확해졌다.
(실시예 9) 넙치의 에드워드시엘라증 및 연쇄구균증에 대한 본 발명의 백신의 예방효과-공시(供試) 균주의 항원성과 효과의 검토
시험방법: 평균 체중 95 g의 넙치를 FRP제 수조(2.5×1.5×1.0(높이)m) 7조에 1군 60마리씩의 7군(1~7구)으로 나누어, 성장과 동시에 분양하여, 수온 17~26℃에서 10개월간 사육하였다. 공시 균주의 항원성과 예방효과의 관계를 명확하게 하기 위해서, 본 발명의 1~3 및 5구에는 E. tarda 넙치 유래의 항원성이 상이한 OA-3, EH-5, UH-2주를, 동일하게 E. tarda 참돔 유래의 UT-1, UT-4, YK-1을, 또한 S. iniae KH-2, ES-1, MK-1주 및 S. parauberis AM-1, AM-4, AK-3주를 실시예 7, 8과 동일한 방법으로 배양하고, 표 16에 나타낸 균 수가 되도록 조정하여, 포르말린 사균으로 한 후 혼합하였다. 대조로서의 4구에는 E. tarda의 참돔 유래주를 제외한 3균종의 포르말린 사균을, 6구에는 S. iniae ES-1주 및 S. parauberis AM-4주의 포르말린 사균을 백신으로 하고, 7구는 무처치 대조구로 하였다.
이들 백신을 넙치의 가슴 지느러미 상방의 근육 내에 0.1 mL씩 접종하고, 접종 1, 6, 10개월 후에 각 구 20마리씩을 사용하여, 실시예 7과 동일한 방법에 의해 인위 감염에 의한 공격과 백신 효과의 평가를 행하였다. 또한, 5 및 6구에 대해서는 S. iniae와 S. parauberis에 의한 인위 감염을 행하였다.
시험결과: 본 발명구 및 대조구에서의 백신 접종 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔율을 표 17에 나타내었다. 본 발명의 1~3구, 즉 E. tarda 넙치 유래주, 참돔 유래주, S. iniae 및 S. parauberis의 항원성이 상이한 균주의 포르말린 사균을 조합시켜서 백신으로서 접종한 구에 있어서는, 접종 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔율이, 참돔 유래의 E. tarda를 혼합하지 않은 4구 및 무처치 대조구에 비해 유의(p<0.05, 0.01)하게 높았다. 또한, E. tarda 참돔 유래주를 제외한 3종의 세균을 접종한 4구 및 무처치 대조구에 있어서는, 사망어로부터 E. tarda 뿐 아니라, S. iniae 및 S. parauberis가 고빈도로 분리되었다. 또한, 연쇄구균증의 원인균(S. iniae, S. parauberis)만으로 공격한 5 및 6구에 있어서는, 5구의 생잔율이 유의하게 높고, 참돔 유래의 비정형 E. tarda의 포르말린 사균을 혼합함으로써 연쇄구균증에 대한 예방효과도 높아지는 것이 명확해졌다.
이들 결과로부터, 본 발명의 백신의 효과는, 넙치 유래의 E. tarda를 비롯한 4종의 세균의 각 균주가 갖는 특수한 항원성에 의한 것이 아니라, 참돔 유래의 E. tarda가 넙치 유래 E. tarda와 공존했을 때에만 발휘되는 작용에 의한 것이라는 것이 명확해졌다.
(실시예 10) 도미의 에드워드시엘라증에 대한 본 발명의 백신의 예방효과-적정 항원량의 검토
시험방법: 평균 체중 84 g의 참돔을 FRP제 수조(2.5×1.5×1.0(높이)m) 7조에 1군 60마리씩의 7군(1~7구)으로 나누어, 성장과 동시에 분양하여, 수온 18~27℃에서 10개월간 사육하였다. 본 발명의 1~3구에는 E. tarda의 넙치 유래 OA-3주 및 참돔 유래 UT-1주의 각각을 실시예 4와 동일한 방법으로 배양 후, 표 18에 나타내는 균 수가 되도록 조정하여 포르말린 사균으로 하고, 혼합하였다. 대조로서의 4~6구에는 E. tarda의 참돔 유래 UT-1주만을 동일하게 배양 후, 표 18에 나타내는 균 수가 되도록 조정하여, 포르말린 사균으로 하였다. 7구는 무처치 대조구로 하였다.
이들 백신을 참돔의 복강 내에 0.1 mL씩 접종하고, 접종 1, 6, 10개월 후에 각 구 20마리에 대하여, 참돔 유래의 비정형 E. tarda UT-1주의 배양균을 7.3×105 CFU/㎏(체중)이 되도록 복강 내에 접종하고, 접종 후 30일간 관찰하여 생잔율을 구하여, 백신의 유효성에 대해 평가하였다.
시험결과: 본 발명구 및 대조구에서의 백신 접종 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔율을 표 19에 나타내었다. 본 발명의 1~3구, 즉 E. tarda의 넙치 및 참돔 유래주의 포르말린 사균을 백신으로서 접종한 구 중, 백신의 균 수를 108~1010 CFU/mL로 한 2 및 3구에 있어서는, 백신 접종 1, 6, 10개월 후에 공격한 후의 생잔량이 참돔 유래의 비정형 E. tarda 만을 접종한 4~6구 및 무처치의 7구에 비해 유의(p<0.05, 0.01)하게 높았다. 또한, 본 발명 중, 2 및 3구와 1구의 백신 접종 10개월 후에서의 생잔율에 유의(p<0.05)한 차가 인정되었다.
이들 결과로부터, 참돔의 에드워드시엘라증에 있어서도 넙치의 에드워드시엘라증과 동일하게, 당해 어종 본래의 병원균을 단독으로 사용한 백신으로는 적확한 효과는 얻어지지 않고, 참돔 유래의 비정형 E. tarda와 넙치 유래의 E. tarda의 공존 하에서만, 식세포의 살균능이 활성화하여 우수한 예방효과를 발휘하는 것이 시사되었다. 또한, 백신으로서 사용하는 경우의 적당한 항원량은, E. tarda의 넙치 유래주 및 참돔 유래주 모두, 대략 108~1010 CFU/mL라고 생각되어졌다.
Claims (8)
- (A) 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주의 불활화 균체, 및(B) 상기 대상 어류 이외의 어류 유래주의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체로서, (A)가 정형(定型) 에드워드시엘라·타르다인 경우는 비정형(非定型) 에드워드시엘라·타르다이고, 반대인 경우는 정형 에드워드시엘라·타르다인 불활화 균체를 함유하는 대상 어류의 에드워드시엘라증용 백신으로서,상기 대상 어류가 넙치 또는 도미이고, 상기 대상 어류가 넙치인 경우, 상기 대상 어류 이외의 어류가 도미이고, 상기 대상 어류가 도미인 경우, 상기 대상 어류 이외의 어류가 넙치인 백신.
- 삭제
- 제1항에 있어서,불활화 균체의 균 수가 (A):(B)=1:0.1~1인 백신.
- 제1항 또는 제3항에 있어서,주사제 또는 경구 투여제의 형태인 백신.
- (A) 에드워드시엘라·타르다의 대상 어류 유래주의 불활화 균체,(B) 상기 대상 어류 이외의 어류 유래주의 에드워드시엘라·타르다의 불활화 균체로서, (A)가 정형 에드워드시엘라·타르다인 경우는 비정형 에드워드시엘라·타르다이고, 반대인 경우는 정형 에드워드시엘라·타르다인 불활화 균체, 및(C) 스트렙토코커스·이니에 및/또는 스트렙토코커스·파라우베리스의 불활화 균체를 함유하는 대상 어류의 에드워드시엘라증 및/또는 연쇄구균증용 백신으로서,상기 대상 어류가 넙치이고, 상기 대상 어류 이외의 어류가 도미인 백신.
- 삭제
- 제5항에 있어서,불활화 균체의 균 수가 (A):(B):(C)=1:(0.1~1):(1~10)인 백신.
- 제5항 또는 제7항에 있어서,주사제 또는 경구 투여제의 형태인 백신.
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