KR101377116B1 - 면역 및 자가면역의 조절제로서의 세라마이드 유도체 - Google Patents

Abstract

NK T 세포를 조절하는 α-갈락토실세라마이드 및 글리코실세라마이드("세라마이드-유사 당지질"). 세라마이드-유사 당지질은 NK T 세포 내에서 유도된 사이토카인 내에서 변화하고 NK T 세포에 화합물을 효과적으로 제시하는 것이 가능한 항원-제시 세포 내에서 변화한다. 수지상 세포와 결합된 세라마이드-유사 당지질의 약제학적 조성물로서의 세라마이드-유사 당지질의 약제학적 조성물이 제공된다. 또한 NK T 세포를 활성화시키고, 면역체계를 자극시키고, 포유류를 치료하기 위한 백신 내 세라마이드-유사 당지질의 이용 방법이 제공된다. 또한 본 발명은 CD 1 d 단백질을 발현하는 세포의 존재시 NK T 세포를 활성화시키는 화합물의 능력을 평가하는 방법을 제공한다.

α-갈락토실세라마이드, 글리코실세라마이드, 사이토카인, NK T 세포

Description

면역 및 자가면역의 조절제로서의 세라마이드 유도체{Ceramide derivatives as modulators of immunity and autoimmunity}

관련 출원에 대한 교차 참고문헌

본 출원은 2004년 8월 27일 출원된 미국 임시 출원 제60/605,362호의 이익을 청구하고, 이의 내용은 그 전체가 여기에 포함된다.

정부 권한

본 연구의 일부는 미국국립보건원의 보조금으로 지원되었다. 정부는 본 발명의 일정 권한을 지닌다.

본 발명은 일반적으로 면역 세포의 활성화에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 NK T 세포를 조절하는 화합물의 확인에 관한 것이다.

관련 선행기술의 기재

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NK T 세포

"자연 살해 T 세포(NK T 세포)"로 표기되는 T 림프구의 신규한 계통은 최근 확인되었고 많은 중요한 방식으로 통상의 αβ T 세포와 구별됨이 증명되었다(Bendelac et al., 1997; Bendekc 1998). NK T 세포는 마우스에서 먼저 확인되었으나(Bendelac et al., 1997) 최근 연구는 인간에서 표현형 및 기능 면에서 상당히 보존됨을 나타내었다 (Exley et al., 1997; Spada et al., 1998; Davodeau et a]., 1997). 먼저 이들 T 세포는 NK 계통 마커 NK1.1(NKR-P1C) 및 αβ T 세포 수용체의 동시발현으로 인해 별개의 집단으로 인식되었다. 이들은 CD4⁺ 또는 CD^-8^-("이중 음성" 또는 DN)인 것으로 판명되었고 낮은 또는 중간의 T 세포 수용체(TCR) 수치(TCR^int)를 포함한 많은 특정한 표현형적 특성 및 NK 좌위(즉, NK 1.1, CD69, CD94 및 다양한 Ly-49 패밀리 멤버)에 의해 인코드되는 다양한 C-형태 렉틴(lectin)의 발현을 지닌 것으로 현재 인식된다. 더욱이 그들의 일반적인 기준 상태에서도 이들은 활성화된 표현형(CD44^hi, CD62L^lo IL-2Rβ^hi)의 지표 마커를 발현한다. NK T 세포는 흉선 및 흉선외 발달 경로 모두로부터 기원하고, 이들의 일반적 전환은 골수내 존재하는 지속성 집단에 의해 보상되는 것으로 나타났다(Eberl et al., 1998). 이들은 내재하는 간 T 세포의 30% 정도를 포함하는 정상 간 내에서 높은 수치로 축적되고, 비장 및 골수의 T 세포의 실질적 분획을 구성하며 다른 림프구 조직 내에서 적으나 검출 가능한 수로 발견된다.

많은 NK T 세포의 중요한 특성은 매우 제한된 다양성을 지닌 TCR의 그들의 발현이다. 정상 동물 내에서 대부분의 쥐과 NK1.1⁺ T 세포의 TCRα 사슬은 절대적으로 동일하고 접합적 다양성 없이 생식계열 Vα14 및 Jα281 유전자 세그먼트의 정확한 재배열에 의해 형성된다(Koseki et al., 1991 ; Lantz et al., 1994). 이러한 불변성 TCRα 사슬은 일반적으로 단지 소수의 생식계열 Vβ 유전자(가장 일반적으로 마우스 내 Vβ8 패밀리 멤버, 또한 Vβ2 및 Vβ7도 중요하게 표현됨)를 향해 높게 비뚤어진 Vβ 유전자 용법을 나타내는 반-불변성 TCRβ 사슬과 쌍을 이룬다. 또한 이러한 TCR 구조는 상동적 불변성 TCRα 사슬(Vα24-JαQ) 및 제한된 Vβ 유전자 용법(가장 일반적으로 Vβ11)을 발현하는 인간 NK T 세포에서도 나타나고, 따라서 NK T 세포가 보존된 비다형성 리간드를 인식해야함을 의미한다(Porcelli et al., 1993; Exley et al., 1997; Lantz et al., 1994).

현재 불변성 TCRα 사슬을 발현하는 NK T 세포의 대부분이 인간, 마우스 및 거의 모든 포유류 사이에 보존된 비다형성 MHC계 I-유사 세포 표면 당단백질인 CD1d 분자의 인식에 의해 선택됨이 잘 성립되어 있다(Bendelac et al , 1995, Exley et al , 1997, 미국 특허 제5,679,347호, 제5,853,737호 및 제6,238,676호도 참조) . 인간에서 CD1 패밀리는 염색체 1에 지도화된 5개의 비다형성 유전자로 구성된다. 이들은 MHC계 I 항원-제시 분자와 현저한 구조적 유사성을 지닌 5개의 개별적이나 밀접하게 관련된 세포 표면 당단백질(CDIa, CDIb, CDIc, CDId 및 CDIe로 명명된)을 인코드한다. 인간 CD1 단백질의 일부(CDIa, CDIb 및 CDIc - 그룹 1 CD1로 집합적으로 표기됨)는 미코박테리아의 세포벽 및 및 다른 박테리아성 병원균에서 발견되는 특정 지질 및 당지질에 반응하는 T 세포 서브세트에 대한 항원 제시 분자로서 기능한다(Porcelli et al., 1998, Porcelli et al., 1999). 이러한 기능을 수행하는 CD1 단백질의 능력은 단백질의 2개 막 말단 도메인에 의해 형성된 깊은 소수성 포켓 내에 소수성 알킬 사슬을 포획하는 지질 결합 단백질로서 작용하는 그들의 능력에 기인하는 것으로 보인다(Moody et al., 1999). 이는 그의 친수서 또는 극성 두부(head group)가 특정 CD1 제한된 T 세포의 TCR과 직접적인 상호작용에 접근 용이하게 하도록 항원 지질이 디스플레이되도록 유도한다(도 1).

인간 그룹 1 CD1 분자의 지질 항원 제시 기능의 발견은 유사한 기능이 설치류에서 보존된 이들 패밀리만의 멤버인 CD1d 단백질에 대해서도 존재함을 제안하였다. 이들 가능성은 배양된 세포로부터 분리된 CD1d 분자가 CD1d 소수성 포켓 내에 결합된 자가 당지질 리간드를 나타낼 수 있는 글리코실 포스파티딜이노시톨과 비공유결합적으로 결합된다는 발견에 의해 지지된다(Joyce et al., 1998). 아마도 더욱 더 인상적인 점은 세라마이드-유사 당지질(즉, α-갈락토실세라마이드(α GalCer) 및 관련 α-글리코실 세라마이드)이 쥐과 NK T 세포에 의해 강한 CD1d-제한 반응을 자극시킬 수 있다는 발견이다(Kawano et al., 1997). 이들 화합물은 α-아노머 헥소오스 당(갈락토스 또는 글루코스는 NK T 세포 인식에 활성적임)을 포함하고, 단지 β-아노머 당만을 포함한 포유류 조직 내에서 일반적으로 발생하는 세라마이드와 구분한다. 현저하게는 이들 화합물은 현재 그 출처가 본래 분리된 해양 해면동물에서만 자연 발생하는 것으로 알려져 있고, αGalCer가 종양 보유 마우스 내에 주사시 면역 활성화의 결과로서 극적인 종양 폐기를 유도한다는 것이 증명되었을 대 면역학자의 관심의 대상이 되었다(Kobayashi et al., 1995). 그 결과로서 이러한 활성은 αGalCer이 CD1d 의존적 메커니즘을 통해 NK T 세포를 신속하게 활성화시킬 수 있는 능력과 결합되었다. αGalCer이 CD1d에 결합하고 따라서 NK T 세포의 TCR에 대한 측정 가능한 친화력을 지닌 분자 복합체를 생성함이 결정적으로 나타났다(Naidenko et al., 1999, Matsuda et al., 2000, Benlagha et al. , 2000). 따라서 αGalCer는 생체 내 및 시험관 내 모두에서 대부분의 NK T 세포의 활성화를 가능하게 할 수 있는 유효한 약제를 제공한다.

문헌에서 KRN7000으로 불리는 매우 광범위하게 연구된 NK T 활성화 αGalCer는 설치류에서 그의 항-암 활성을 기반으로 해양 해면동물로부터 처음 분리된 αGalCer의 천연 형태와 유사한 구조를 지닌 합성 분자이다(Kawano et al., 1997, Kobayashi et al., 1995; Iyima et al., 1998, Inoue et al., 1997, Kobayashi et al., 1996a, 1996b, Hakagawa et al., 2000, Uchimura et al., 1997a, Uchimura et al., 1997b; Motoki et al., 1996a, Motoki et al., 1995; Nakagawa et al., 1998, Yamaguchi et al., 1996; Morita et al., 1995; Motoki et al., 1996b). KRN7000의 구조는 도 1에 나타나 있다.

KRN7000의 유효한 활성 및 동물의 암, 감염성 및 자가면역질환 상의 유망한 치료 효과의 제공시 큰 유효성 또는 다른 활성과의 구조적 아날로그 개발의 가능성이 명백한 관심 영역이다. 이러한 관점에서 하나의 선행 연구는 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)의 마우스 모델 내 자가면역을 억제하는 증가된 능력을 나타내는 절제된 스핑고신 기제를 지닌 KRN7000의 합성 아날로그를 기술하였다(Mryamoyo et al., 2001). 이를 보고한 연구자에 의해 "OCH"로 명명된 이러한 화합물의 구조는 도 3에 나타나 있다. αGalCer 스핑고신 기제 내에서 변화된 다양한 변이체는 미국 특허 제5,936,076호에서 확인되었다. 한편, 지방산 사슬 변형 상의 연구는 극히 적다. 지방산 사슬 길이 변이는 Kawano, et al. (1997)에 의해 연구되었으나 이러한 분석은 매우 제한적이고 어떠한 흥미로운 특성도 나타내지 않았다.

1997년 11월부터 현재까지의 많은 문헌은 KRN7000이 포유류의 면역체계를 활성화시키는 메커니즘을 연구하고 있다(Kawano et al., 1997, Benlagha et al., 2000; Burdin et al., 1999; Crowe et al., 2003; Naidenko et al., 1999; Sidobre et al., 2002, Godfrey et al., 2000; Smyth and Godfrey, 2000). 이들 연구는 KRN7000의 효과에 대한 가장 근접한 메커니즘이 일부 상피 및 다른 세포 계통뿐만 아니라 대부분의 조혈세포 상에서 발현되는 CD1d 단백질에 대한 이들 화합물의 결합임을 동일하게 나타낸다. KRN7000의 CD1d에 대한 결합은 자연살해 T 세포(NK T 세포)로 불리는 T 림프구 서브세트의 T 세포 항원 수용체(TCR)에 의해 높은 친화력으로 인식되는 분자 복합체를 생성한다. KRN7000/CD1d 복합체의 인식은 간, 비장 및 다른 림프구 기관 내에 존재하고 잠재적으로 어떠한 세포로도 이동하는 잠재력을 지닌 NK T 세포의 신속한 활성화를 유도한다. 활성화된 NK T 세포는 광범위한 케모카인 및 다른 사이토카인을 신속하게 분비시키고, 또한 수지상 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 같은 다른 세포 형태를 활성화시키는 능력을 지닌다. KRN7000/CD1d 복합체에 의한 NK T 세포의 활성화를 수반하는 일련의 이벤트는 면역체계 상의 많은 잠재적인 다운스트림 효과를 지니는 것으로 나타났다. 예를 들어 어떠한 형태의 감염의 셋팅시 이는 감염에 대한 적응성 면역을 후원하고 치유를 촉진시키는 보조 효과를 유도할 수 있다. 또는 어떠한 형태의 자가면역질환의 셋팅시 KRN7000에 의한 NK T 세포의 활성화는 조직 파괴를 억제하고 질환을 개선하는 방식으로 자가면역 반응의 진행을 변화시킬 수 있다. 후자의 효과는 자발적 제1형 당뇨병의 마우스 모델(즉, NOD 마우스 스트레인, 도 2) 내에서 특히 강한 것으로 보고되었다(Sharif et al., 2001; Sharif et al., 2002; Hong et al., 2001; Wang et al., 2001).

NK T 림프구의 기능은 불완전하게 해석되어 있으나 다양한 연구는 면역 반응의 조절시 이들 T 세포에 대한 중요한 역할을 지적한다. NK T 세포의 특징은 그 들의 αβ TCR을 통한 자극시 다량의 IL-4 및 IFN-γ의 신속한 생성이다(Exley et al., 1997; Yoshimoto et al., 1994; Yoshimoto et al., 1995a; Yoshimoto et al., 1995b). 실제로 면역 활성화 동안 IL-4의 초기 생성에 중요한 주요 세포로서 이들의 증명은 이들이 제2형(Th2) T 세포 반응을 극성화시키는데 중요한 역할을 함을 나타내었다. 이러한 관점에서 NK T 세포가 마우스 내 다양한 다른 병원균으로의 감염 결과를 측정하는데 중요한 역할을 하는 것으로 확인된 것은 놀라운 것은 아니다. 더욱이 NK T 세포에 대한 주요한 면역조절적 역할은 인간 및 NOD 마우스 모델 모두에서 자가면역 제1형 당뇨병 내에서 제안되었다. 인간 피험체에 있어서 소인이 있는 피험체 내에서의 명백한 당뇨병으로의 진행은 순환하는 NK T 세포 수의 감소 및 IFNγ의 생성을 유지하는 동안 IL-4를 생성하는 이들 세포의 능력의 상실과 관련됨이 수립되었다(Wilson et al., 1998). 이들 발견은 NOD 마우스 내 실질적으로 동일한 관찰에 의해 강하게 지지된다. 매우 중요하게는 많은 연구는 NOD 모델 내 당뇨병의 발병이 양자 이동을 통해 유용한 IL-4 생성 NK T 세포수를 증가시킴으로서 또는 Vα14-Jα281 TCRα 트랜스유전자의 발현에 의해 지연되거나 예방할 수 있음을 나타낸다(Hammond et al., 1998; Laloux et al., 2001). 최근 생체 내에서 NOD 마우스의 αGalCer(KRN7000)로의 치료가 명백한 당뇨병의 발병을 변화시키거나 지연시키거나 또는 예방할 수 있음이 나타났고 자가면역 장애의 조절을 위한 약학적 약제로서의 이러한 화합물 및 관련 아날로그의 개발에 대한 강한 전례를 제공하였다.

자가면역질환

자가면역질환은 그들 자신의 세포 및 조직을 공격하는 환자의 면역체계 결과이다. 이는 다발경화증, 중증근육무력증, 애디슨병, 원형탈모증, 강직성 척추염, 항인지질증후군, 베체트병, 크론병 및 궤양성 대장염, 구드패스츄어 증후군, 심상성 천포창, 원발성 담즙성 간경변, 류마티스열, 사르코이드증, 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 이식편대숙주병, 메니에르병, 류마티스관절염, 당뇨병, 전신홍반루푸스(SLE), 건선, 피부경화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 췌장염, 염증성 장질환, 사구체신염, 뇌척수염 및 시오겐병을 포함한 다양한 질환을 유발한다. 대부분의 경우 자가면역질환의 병인학은 불충분하게 이해되어 있고, 또한 전신홍반루푸스와 같은 자가면역질환에 대한 일부 치료가 존재하나 모든 심각한 단점을 지닌다. 따라서 자가면역질환에 대한 더욱 안전하고 더욱 효과적인 치료에 대한 요구가 존재한다.

전신홍반루푸스(SLE)는 다수의 중추 기관을 손상시키고 최상의 유용한 통상의 치료가 적용되더라도 실질적인 질병률 및 사망률을 유발하는 일반적인 자가면역질환이다(Kotzm, 1996, Pisetsky et al., 1997). SLE의 발병학에 대한 최근의 모델은 B 림프구의 자가반응성 및 다양한 자가항체의 생성에 초점이 맞춰져 있다. 유행병학 연구 및 동물 모델 유래의 다수의 데이터는 이중 나선 DNA(dsDNA) 및 특정 핵산/단백질 복합체와 같은 인간 내 SLE 관련 특정 자가항체가 질병 발병학에 직접적인 역할을 한다는 견지를 지지한다(Hahn, 1998). 따라서 SLE의 원인 및 효과적인 치료에 대한 연구의 중요한 목적은 B 세포 구획 내에서 내성을 유지시키고 B 세포 자가반응성을 조절하는 메커니즘을 확인하는 것이다. 이러한 메커니즘은 SLE의 개선된 치료 및 예방의 개발에 대한 가장 효과적인 타겟을 제공한다.

최근 SLE 마우스 모델은 이러한 장애를 유도하는 기본 메커니즘의 이해에 크게 기여하였다(Datta, 1988; Silveira and Baxter, 2001). 인간 질병의 많은 관점에 강하게 평행하도록 일반적으로 수용되는 SLE의 하나의 유전성 쥐과 모델은 뉴질랜드 흑색 암컷 마우스와 뉴질랜드 백색 수컷 마우스 사이의 F1 교배(NZB/W F1 마우스) 내에서 발생한 것이다. 이들 마우스는 IgM 및 이중-나선 DNA(dsDNA) 항체의 분비와 함께 초기 연령에서 B 세포 자가반응성의 사인을 발달시킨다. 약 6월령에서 NZB/W F1 마우스는 IgM부터 IgG까지의 자가항체 분비의 변화를 나타내고 이는 사구체신염의 병원균이고 그의 면역 복합체에 기여하는 양이온성 IgG 항-dsDNA 항체의 생성과 관련된다(Zeng et al., 2000). 유사한 방식으로 lpr 돌연변이를 지닌 마우스는 자발적 SLE-유사 질환의 연령 의존적 발달을 나타내고, 이는 다시 인간의 SLE의 특징인 dsDNA 및 다른 타겟 항원에 대한 IgG 항체의 높은 역가의 발생과 관련된다. 이들 SLE의 자발적 모델은 B 세포 자가반응성 및 SLE의 발달을 예방하는데 하는 역할이 무엇인지를 측정하기 위해 면역 조절 및 내성의 다양한 메커니즘을 조사하는 우수한 모델 시스템을 제공한다.

마우스의 자발적 SLE의 이들 유전성 모델에 더하여 다양한 모델이 자가면역 소인이 없는 유전적 배경 상에 SLE의 유도를 유발하는 과정을 연구하는데 발명되었다. 이들 모델은 자가반응성 림프구를 지속적이고 활성화되게 하는 정상 면역 내성의 분열을 유도하는 메커니즘을 측정하는데 유용하였다. 이러한 모델이 일반적으로 실질적인 질환의 정확한 자극을 제공하지 않으나 이들은 자가반응성 유도 직후 발생하는 이벤트를 조사 가능하게 한다. SLE의 특징과 유사한 자가항체 생성을 유도하는 유도성 B 세포 자가반응성의 2가지 모델은 R4A 중쇄(heavy chain) 형질전환 마우스 및 MAP-펩타이드 유도 자가면역 마우스 모델이다.

B 세포 자가반응성의 R4A 형질전환 마우스 모델은 B 세포 내성 메커니즘 상의 매우 유익한 연구의 목적이 되었다(Bynoe et al., 2000; Kuo et al., 1999; Bynoe et al., 1999). 이들 마우스는 R4A로 불리는 단일클론 항-dsDNA 항체의 재배열된 IgG2b 중쇄를 인코드하는 트랜스유전자를 발현한다. 본래 R4A 항체는 dsDNA에 대한 중등도의 친화성을 지니고 신장 사구체 내 침전물을 형성하는 경향으로 인해 BALB/c 마우스 내 병원성 항체로 분류된다. 또한 R4A는 최근 α-액티닌으로 확인된 혈관사이세포 상에서 발현되는 단백질 항원에 높은 친화력으로 결합하는 것으로 나타났다. R4A 형질전환(R4A Tg) 마우스에서 재배열된 IgG2b 중쇄는 많은 내인성 경쇄(light chain)와 결합하여 비자가면역 특이성의 추정 가능하게 큰 배열뿐만 아니라 dsDNA에 대해 변화하는 친화성을 지닌 항체를 생성한다.

혈청 자가항체 역가는 R4A Tg 마우스에서는 무시 가능하나 마우스는 항-dsDNA B 세포의 적어도 3개 이상의 개별적 집단을 지닌다(Spatz et al., 1997). 또한 정상적으로 결실된 R4A Tg 마우스의 높은 친화성 항-dsDNA B 세포는 이들 마우스의 에스트라디올(estradiol)로의 치료에 의해 감소될 수 있다(Bynoe et al., 2000). 이러한 형질전환 모델은 항-dsDNA의 인식을 향한 강한 본질적 구부러짐(skewing)을 지닌 B 세포의 선택 및 생존을 조절하는 인자를 연구하는 민감성 환경을 제공한다.

MAP-펩타이드 유도 모델에서 비자가면역 BALB/c 마우스는 합성 펩타이드(DWEYSVWLSN)의 다중화 형태로의 면역접종 후 루푸스-유사 자가면역을 발달시키도록 유도될 수 있다(Gaynor et al., 1997; Putterman et al., 1998; Putterman et al., 2000). 항원 펩타이드는 dsDNA의 미메토프(mimetope)로서 기능하는 핵심 서열(DWEYS)을 포함한다. 펩타이드 미메토프의 면역원성을 증가시키기 위해 DWEYSVWLSN이 8개의 분지된 폴리리신 골격에 컨쥬게이트되고 Complete Freud 보조제 내에 유화된다. 이러한 다중 항원 펩타이드(multiple antigenic peptide, MAP) 컨쥬게이트로 면역된 마우스는 IgM과 IgG 동형 모두의 항-dsDNA 항체를 발달시키고 또한 SLE의 다른 다양한 자가항원 특징에 대한 항체를 발달시키고 IgM 및 IgG가 신장 사구체 내에 축적된다. MAP-펩타이드 면역화 BALB/c 마우스로부터 분리된 항-dsDNA 항체는 NZB/W F과 같은 자발적 유전성 쥐과 SLE 모델로부터 분리된 자가항체와 일부 현저한 유사성을 나타낸다. 이러한 모델은 내성을 분열시키는 능력을 지닌 한정된 면역 자극의 제어된 적용 후 정상 동물 내에서 발달하는 자가면역의 제어를 평가하는 기회를 제공한다.

많은 연구는 자가면역 당뇨병의 발달과 관련된 바와 유사한 NK T 세포 내 결함이 SLE 내에서도 존재함을 나타낸다. 예를 들어 Takeda and Dennert는 C57BL/6 lpr/lpr 마우스 내 자가면역의 발달이 NK1.1⁺ 세포의 소멸과 상호관련됨을 보고하였고, NK1.1⁺ 세포의 채택 이동이 질환의 발병을 지연시키는 반면 이들 세포의 삭제가 생체 내에서 질환을 가속화시킴을 나타내었다(Takeda et al., 1993). 이러한 연구는 생체 내 분석시 NK 세포와 NK T 세포 사이를 구별하지 않았으나 시험관 내에서 CD3⁺ NK1.1⁺ 집단이 항-DNA 자가항체 생성의 직접적인 억제를 매개함을 증명하였다. 그 결과로 Mieza et al.은 MRL 1pr/lpr, C3H gld/gld 및 NZB/W F1 마우스를 포함한 다양한 루푸스-빈발 마우스 내의 질환 발달과 동시에 불변성 Vα14-Jα281 재배열을 발현하는 NK T 세포의 현저한 감소 및 최종적 소멸의 발생을 나타내었다(Mieza et al , 1996). 또한 이들 연구자들은 Vα14 NK T 세포의 수치가 상향조절된 Vα14 형질전환 MRL lpr/lpr 마우스가 그의 림프증식질환의 유의적인 억제를 나타내었고, Vα14 NK T 세포가 SLE의 이러한 동물 모델 내 질환 발병 및 진행에 유의적인 역할을 함을 확인시켰다.

중요하게는 SLE 증상의 인간에서의 최근 발견은 마우스 SLE 모델에서 발현된 NK T 세포 내 결함과 밀접하게 유사한 것을 포함한 CD1-반응성 T 세포의 변화를 증명하였다. 예를 들어 Sielmg et al.은 SLE 증상의 인간 피험자가 그들의 순환성 림프구 풀(pool) 내에 증가된 수의 CD1-제한된 CD4^-8^- T 세포를 지니고 이들 특정한 T 세포는 B 세포가 항체를 생성하고 동형 스위칭을 진행하도록 효과적으로 촉발시킬 수 있음을 보고하였다(Sielmg et al., 2000). 이들 T 세포는 CD1d와 함께 B 세포에 의해 강하게 발현되는 것으로 알려진 2개 인간 CD1 이소폼 중의 하나인 인간 CD1c 단백질을 인식하는 것으로 판명되었다. 불변성 TCRα 사슬을 발현하는 NK T 세포가 활성 SLE 증상을 지닌 인간 피험자 내 순환에는 본질적으로 존재하지 않음을 나타낸 Oishi et al.에 의해 보고된 결과가 더욱 더 두드러진다. 코르티코스테로이드 유도 완화 후 NK T 세포는 다시 검출될 수 있고 이들 조절성 T 세포의 존재와 질환 활성 수준 사이의 역비례 상관관계를 수립하였다(Oishi et al., 2001).

또다른 최근 연구는 인간 SLE에서의 이러한 많은 발견을 확인시켰고(Kojo et al , 2001), Sumida et al.에 의해 세포핵 항원에 대한 현저한 자가항체 생성을 포함하여 SLE와 일부 특징을 공유한 전신성 자가면역질환인 전신경화증 증상의 환자 연구에서 매우 유사한 발견이 보고되었다 (Sumida et al , 1995). 이들 결과는 쥐과 모델 및 실제 SLE 및 인간의 다른 관련 자가면역질환에서 보고된 비정상 사이의 강한 상관관계를 나타낸다. CD4-CD8-NK T 세포의 수를 증가시킴으로서 자가면 역질환을 치료하는 방법을 개시한 미국 특허 제6,162,609호도 참조. 이들 세포를 증가시키는 개시된 방법은 이들을 CD1d 또는 그의 단편에 노출시키는 것이다.

다른 자가면역질환은 이들이 자가항체에 의해 적어도 일부는 매개된 병인을 지닌다는 점에서 SLE와 유사한 것으로 나타났다. 여기서 중증근육무력증, 심상성천포창, 길랑-바레 증후군, 항인지질 증후군, 구드패스츄어 증후군, 이식편대숙주병, 다발경화증, 원발성 담즙성 간경변, 피부경화증, 혈관염, 백반증, 베게너육아종증, 류마티스관절염, 사구체신염, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 시오겐병이 포함된다.

백신

T-독립성 항원 및 T-의존성 항원 모두에 대한 백신이 개발되었고 개발 중이다. T-독립성 면역 반응은 일반적으로 효과적인 백신을 생성하는데 필요한 기억 성분을 지니지 않기 때문에 T-독립성 항원에 대한 백신은 종종 일반적으로 특징적인 다당류와 같은 T-독립성 반응을 유도하는 병원균의 성분을 채취하고 T-의존성 반응을 유도하는 것이 가능한 담체 분자에 상기 성분을 컨쥬게이트시킴으로서 개발된다. 따라서 상기 성분은 T-의존성 항원의 일부가 되고 아마도 T-독립성 병원균의 성분에 대한 T-독립성 면역 반응(및 기억 B 세포 생성)을 유발한다. 그러나 T-독립성 항원에 대한 많은 백신뿐만 아니라 이들 백신은 백신 접종된 동물이 병원 균에 의한 결과적인 도전을 효과적으로 격퇴할 수 있게 하는 충분한 T-의존성 면역 반응을 유도할 수 없다. KRN7000은 T 세포를 활성화시키고 T-의존성 반응을 개선시키는 그의 능력으로 인해 백신에 대한 효과적인 보조제인 것으로 나타났다(PCT 특허 공보 WO93/05055).

수동적 면역

암 치료에 대한 증가하는 중요한 모드는 비-호지킨 림프종(NHL) 내 CD20 또는 유방암 증상의 환자 서브세트 내 Her2/neu와 같은 특정 종양 타겟 분자에 대한 인간 항체의 투여이다. NHL의 치료를 위한 항-CD20 항체의 효율은 자연 살해(NK) 세포의 주요 기능인 항체 의존성 세포적 세포독성(antibody dependedt cellular cytotoxicity(ADCC)에 의해 부분적으로 매개됨이 증명되었다. 종양 항원에 대해 지시된 이러한 수동적으로 전달된 항체 치료제의 효율을 증가시키기 위한 잠재적으로 중요한 전략은 NK 세포의 활성화 및 확장을 증진시키는 보조제를 동시-투여함으로서 NK 활성화를 증가시키는 것이다. IFNγ 생산 NK 세포의 활성화에서의 NK T 세포의 중요한 역할로 인해 NK T 세포의 NK 자극 활성화를 더욱 증가시킨다고 여기서 기술된 분자는 항체 치료제에 대한 중요한 보조제일 것이다.

포유류 면역에 있어서 NK T 세포의 중요성으로 인해 NK T 세포의 추가 조절제의 확인 및 특성화에 대한 요구가 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 설명한 다.

발명의 요약

따라서 본 발명자들은 많은 αGalCer 변이체가 NK T 세포를 활성화시키는 것이 가능하고, 화합물을 효과적으로 제시하는 세포 형태와 다르고, NK T 세포 활성화에 이용시 변화된 사이토카인 프로파일을 유도함을 발견하였다.

따라서 일부의 실시태양에서 본 발명은 식 Ⅰ을 포함한 α-갈락토실세라마이드에 관한 것이다:

식 Ⅰ

R1은 -(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃을 제외한 적어도 하나 이상의 C=C 결합을 지닌 선형 또는 분지형 C₁-C₂₇ 알켄이고, 또는 R1은 C(OH)-R3이고 상기 R3은 적어도 하나 이상의 C=C 결합을 지닌 선형 또는 분지형 C₁-C₂₆ 알켄이고;

R2는 하기 (a)∼(e) 중의 하나이고;

(a) -CH₂(CH₂)_XCH₃,

(b) -CH(OH)(CH₂)_XCH₃,

(c) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)₂,

(d) -CH=CH((CH₂)_XCH₃,

(e) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)CH₂CH₃

X는 5∼17 범위의 정수임.

또다른 실시태양에서 본 발명은 식 Ⅰ을 포함한 α-갈락토실세라마이드에 관한 것이다:

식 Ⅰ

R1은 분지형 C₁-C₂₇ 알켄이고 또는

R1은 C(OH)-R3이고 상기 R3은 선형 또는 분지형 C₁-C₂₆ 알켄이고;

R2는 하기 (a)∼(e) 중의 하나이고;

(a) -CH₂(CH₂)_XCH₃,

(b) -CH(OH)(CH₂)_XCH₃,

(c) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)₂,

(d) -CH=CH((CH₂)_XCH₃,

(e) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)CH₂CH₃

X는 5∼17 범위의 정수임.

추가 실시태양에서 본 발명은 식 Ⅰ을 포함한 α-갈락토실세라마이드에 관한 것이다:

식 Ⅰ

R1은 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄이고 (ⅰ) 상기 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄은 C₅-C₁₅ 시클로알칸, C₅-C₁₅ 시클로알켄, 헤테로사이클 또는 방향족 고리로 치환되거나 (ⅱ) 상기 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄은 C₆-C₂₇ 알킬 또는 알케닐 사슬 내에 C₅-C₁₅ 시클로알칸, C₅-C₁₅ 시클로알켄, 헤테로사이클 또는 방향족 고리를 포함하고;

R2는 하기 (a)∼(e) 중의 하나이고;

(a) -CH₂(CH₂)_XCH₃,

(b) -CH(OH)(CH₂)_XCH₃,

(c) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)₂,

(d) -CH=CH((CH₂)_XCH₃,

(e) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)CH₂CH₃

X는 5∼17 범위의 정수임.

또한 본 발명은 식 Ⅰ을 포함한 α-갈락토실세라마이드에 관한 것이다:

식 Ⅰ

R1은 -C(=O)OCH₂CH₃, -(CH₂)₆CH₃, -(CH₂)₄Cl, -(CH₂)₁₆CH₃, -(CH₂)₅CH₃, -(CH₂)₂CH₃, -(CH₂)₄CH₃, -(CH₂)₈CH₃, -C(CH₂)₁₀CH₃, -C(CH₂)₁₂CH₃으로 구성된 군에서 선택되고;

R2는 하기 (a)∼(e) 중의 하나이고;

(a) -CH₂(CH₂)_XCH₃,

(b) -CH(OH)(CH₂)_XCH₃,

(c) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)₂,

(d) -CH=CH((CH₂)_XCH₃,

(e) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)CH₂CH₃

X는 5∼17 범위의 정수임.

또다른 실시태양에서 본 발명은 식 Ⅱ를 포함한 글리코실세라마이드에 관한 것이다:

식 Ⅱ

R1은 선형 또는 분지형 C₁-C₂₇ 알칸 또는 알켄이고 또는

R1은 C(OH)-R3이고 상기 R3은 적어도 하나 이상의 C=C 결합을 지닌 선형 또는 분지형 C₁-C₂₆ 알켄이고 또는

R1은 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄이고 (ⅰ) 상기 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄은 C₅-C₁₅ 시클로알칸, C₅-C₁₅ 시클로알켄, 헤테로사이클 또는 방향족 고리로 치환되거나 (ⅱ) 상기 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄은 C₆-C₂₇ 알킬 또는 알케닐 사슬 내에 C₅-C₁₅ 시클로알칸, C₅-C₁₅ 시클로알켄, 헤테로사이클 또는 방향족 고리를 포함하고;

R2는 하기 (a)∼(e) 중의 하나이고;

(a) -CH₂(CH₂)_XCH₃,

(b) -CH(OH)(CH₂)_XCH₃,

(c) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)₂,

(d) -CH=CH((CH₂)_XCH₃,

(e) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)CH₂CH₃

X는 5∼17 범위의 정수이고;

R4는 α-갈락토실 이외의 α-결합 단당류 또는 β-결합 단당류임.

또한 본 발명은 상기 기술된 α-갈락토실세라마이드 또는 글리코실세라마이드를 포함한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또다른 실시태양에서 본 발명은 상기 기술된 α-갈락토실세라마이드 또는 글리코실세라마이드 및 수지상 세포를 포함한 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 포유류 내 백신의 투여 방법에 관한 것이다. 본 방법은 상기 α-갈락토실세라마이드 또는 글리코실세라마이드와 결합된 백신을 투여하는 단계를 포함한다.

추가 실시태양에서 본 발명은 NK T 세포의 활성화 방법에 관한 것이다. 본 방법은 NK T 세포를 상기 기술된 α-갈락토실세라마이드 또는 글리코실세라마이드와 접촉시키는 단계를 포함한다.

또한 본 발명은 포유류의 면역체계의 자극 방법에 관한 것이다. 본 방법은 유효량의 상기 기술된 약제학적 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함한다.

또한 본 발명은 수지상 세포를 상기 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계 및 상기 수지상 세포를 포유류에 주입하는 단계에 의한 포유류 면역체계의 자극 방법에 관한 것이다.

또다른 실시태양에서 본 발명은 CD1d 단백질을 발현하는 세포의 존재시 NK T 세포를 활성화시키는 화합물의 능력을 평가하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 CD1d 단백질을 발현하는 하나 이상의 세포 형태의 존재시 NK T 세포와 상기 화합물을 결합시키는 단계 및 NK T 세포가 활성화되는지 여부를 평가하는 단계를 포함한다.

또한 본 발명은 포유류 내 자가면역질환, 암 또는 감염의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 본 방법은 상기 기술된 약제학적 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 다양한 세라마이드-유사 당지질 즉, α-갈락토실세라마이드 또는 다른 α-글리코실세라마이드("세라마이드-유사 당지질")이 NK T 세포 특히 KRN7000 내의 지방산인 모이어티 내 변이체를 조절하는 것이 가능하다는 발견에 기반한다. 또한 본 발명은 세라마이드-유사 당지질이 이들을 효과적으로 제시하는 세포 형태와 다르고 NK T 세포 활성화에 사용시 변화된 사이토카인 프로파일을 유도할 수 있다는 발견에 기반한다.

하나의 실시태양에서 세라마이드-유사 당지질은 NK T 세포에 의한 사이토카인 생성을 활성화시킨다. 또다른 실시태양에서 세라마이드-유사 당지질은 NK T 세포에 의한 사이토카인 생성을 억제시킨다. 또다른 실시태양에서 세라마이드-유사 당지질은 NK T 세포에 의해 생성된 사이토카인 비율을 변화시킨다.

정의:

여기서 사용된 "화합물을 제시"라는 문구는 NK T 세포의 조절을 유발하는 복합체를 제공하기 위해 세포가 세포 표면 상에서 화합물에 결합함을 의미한다.

여기서 사용된 "화합물을 효과적으로 제시"라는 문구는 화합물이 약 1 μM 이하의 농도로 존재시 NK T 세포의 조절을 유발하는 복합체를 제공하기 위해 세포가 그의 표면 상에서 화합물에 결합함을 의미한다.

여기서 사용된 "조절한다", "조절"이라는 용어는 제공된 기능이 변화되었음을 의미한다. 예를 들어 "복합체가 NK T 세포의 활성 또는 활성화를 조절한다"라는 문구는 복합체가 NK T 세포의 활성화 예를 들어 사이토카인의 생성이 복합체의 부재시와 다르게 함을 의미한다. 활성의 변화는 예를 들어 복합체의 부재시 생성된 사이토카인의 함량과 비교시 복합체의 존재시 생성된 사이토카인의 함량 증가(NK T 세포의 활성화 또는 유도) 또는 복합체의 부재시 생성된 사이토카인의 함량과 비교시 복합체의 존재시 생성된 사이토카인의 함량 감소(NK T 세포의 억제) 또는 NK T 세포에 의해 생성된 다른 사이토카인의 비율의 변화가 될 수 있다.

여기서 사용된 "C₆-C₂₇ 알칸"이라는 문구는 6∼27개 탄소 원자를 지닌 선형 사슬 또는 분지형 비-환형 탄화수소를 의미한다. 대표적인 선형 사슬 C₆-C₂₇ 알칸은 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-헵틸, -n-옥틸, -n-노닐 및 -n-데실을 포함한다. 대표적인 분지형 C₆-C₂₇ 알칸은 -이소프로필, -세컨더리-부틸, -이소부틸, -터셔리-부틸, -이소펜틴, -네오펜틴, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 1,1-디메틸프로필, l,2-디메틸프로필, l-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 3-에틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-메틸헥실, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 1 ,2-디메틸펜틸, 1,3-디메틸펜틸, 1,2-디메틸헥실, 1,3-디메틸헥실, 3,3-디메틸헥실, 1 ,2-디메틸헵틸, 1,3-디메틸헵틸 및 3,3-디메틸헵틸을 포함한다.

여기서 사용된 "C₆-C₂₇ 알켄"이라는 문구는 6∼27개 탄소 원자를 지니고 적어도 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합을 포함하는 선형 사슬 또는 분지형 비-환형 탄화수소를 의미한다. 대표적인 선형 사슬 및 분지형 C₆-C₂₇ 알켄은 -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-l-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, -1-헥세닐, -2-헥세닐, -3-헥세닐, -1-헵테닐, -2-헵테닐, -3-헵테닐, -1-옥테닐, -2-옥테닐, -3-옥테닐, -1-노네닐, -2-노네닐, -3-노네닐, - 1-데세닐, -2-데세닐, -3-데세닐 등을 포함한다.

여기서 사용된 "C₅-C₁₅ 시클로알칸"이라는 문구는 5∼15개 탄소 원자를 지닌 포화 환형 탄화수소를 의미한다. 대표적인 C₅-C₁₅ 시클로알칸은 시클로펜틸, -시클로헥실, -시클로헵틸, -시클로옥틸, -시클로노닐 및 -시클로데실이다. 또한 "C₅-C₁₅ 시클로알칸"이라는 문구는 바이시클로알칸 및 트리시클로알칸을 포함한다. 여기서 사용된 바이시클로알칸이라는 용어는 8∼15개 탄소 원자 및 적어도 하나 이상의 포화된 환형 알킬 고리를 지닌 이중-환형 탄화수소 고리 시스템을 의미한다. 대표적인 바이시클로알칸은 -인다닐, -1,2,3,4-테트라하이드로나프틸, -5,6,7,8-테트라하이드로나프틸- 1, -퍼하이드포나프틸 등을 포함한다. 여기서 사용된 "트리시클로알칸"이라는 용어는 8∼15개 탄소 원자 및 적어도 하나 이상의 포화된 고리를 지닌 삼중-환형 탄화수소 고리 시스템을 의미한다. 대표적인 트리시클로알칸은 피레닐, -1,2,3,4-테트라하이드로안트라세닐, -퍼하이드로안트라세닐 -아세안트레닐, -1,2,3,4-테트라하이드로펜안트레닐, -5,6,7,8-테트라하이드로펜안트레닐, -퍼하이드로펜안트레닐 등을 포함한다.

여기서 사용된 "C₅-C₁₅ 시클로알켄"이라는 문구는 환형 시스템 내 적어도 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합 및 5∼15개 탄소 원자를 지닌 단일-환형 비-방향족 탄화수소를 의미한다. 대표적인 C₅-C₁₅ 시클로알켄은 -시클로펜테닐, -시클로펜타디에닐, -시클로헥세닐, -시클로헥사디에닐, -시클로헵테닐, -시클로헵타디에닐, -시클로헵타트리에닐, -시클로옥테닐, -시클로옥타디에닐, -시클로옥타트리에닐, -시클로옥타테트라에닐, -시클로노네닐, -시클로노나데닐, -시클로데세닐, -시클로데카디에닐 등을 포함한다. 또한 C₅-C₁₅ 시클로알켄이라는 문구 바이시클로알켄 및 트리시클로알켄을 포함한다. 여기서 사용된 "바이시클로알켄"이라는 용어는 고리 중의 하나 내에 적어도 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합 및 8∼15개 탄소 원자를 지닌 이중환형 탄화수소 고리 시스템을 의미한다. 대표적인 바이시클로알켄은 -인데닐, -펜탈레닐, -나프탈레닐, -아줄fp닐, -헵탈레닐, -1,2,7,8-테트라하이드로나프탈레닐 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 여기서 사용된 "트리시클로알켄"이라는 용어는 고리 중의 하나 내에 적어도 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합 및 8∼15개 탄소 원자를 지닌 삼중-환형 탄화수소 고리 시스템을 의미한다. 대표적인 트리시클로알켄은 -안트라세닐, -페난트레닐, -페날레닐, -아세나프탈레닐, as-인다세닐, s-인다세닐 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

여기서 사용된 "헤티로사이클"이라는 용어는 4개까지의 헤테로원자를 포함한 포화되거나 불포화된 비-방향족 또는 방향족인 3∼10-멤버된 단일환형 또는 이중환형 헤테로사이클 고리를 의미한다. 각각의 헤테로원자는 4분화될 수 있는 질소; 산소; 및 술폭시드 및 술폰을 포함한 황으로부터 독립적으로 선택된다. 헤테로사이클은 질소, 황 또는 탄소 원자를 통해 부착될 수 있다. 대표적인 헤테로사이클은 피리딜, 푸릴, 티오페닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 트아디아졸릴, 이속사졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 피라다아지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 모폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 하이드라토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피린디닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 퀴놀리닐, -이소퀴놀리닐, -크로모닐, -코우마리닐, -인돌릴, -인돌리지닐, -벤조[b]푸라닐, -벤조[b]티오페닐, -인다졸릴, -푸리닐, -4H-퀴놀리지닐, -이소퀴놀릴, -퀴놀릴, -프탈리지닐, -나프티리디닐, -카바졸릴, -β-카르볼리닐 등을 포함한다. 또한 헤테로사이클이라는 용어는 헤테로아릴을 포함한다. 여기서 사용된 "헤테로아릴"이라는 용어는 단일- 및 이중-환형 고리 시스템 모두를 포함한 5∼10개 멤버의 방향족 헤테로사이클 고리를 의미하고, 고리의 하나 또는 둘 중의 하나의 적어도 하나 이상의 탄소 원자는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자와 대체됨을 특징으로 한다. 헤테로아릴 고리의 하나 또는 둘은 적어도 하나 이상의 탄소 원자를 포함한다. 대표적인 헤테로아릴은 피리딜, 푸릴, 벤조푸라닐, 티오페닐, 벤조티오페닐, 퀴놀리닐, 피롤릴, 인돌릴, 옥사졸릴, 벤조옥사졸릴, 이미다졸릴, 벤지이미다졸릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 이소옥사졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 티아디아졸릴, 트리아지닐, 신놀리닐, 프탈라지닐 및 퀴나졸리닐을 포함한다.

여기서 사용된 "방향족 고리"라는 문구는 단일, 이중환형 및 삼중환형 고리 시스템을 포함한 5∼14 멤버된 방향족 탄소환상화합물을 의미한다. 대표적인 탄소환상화합물은 페닐, 나프틸, 안트릴 및 펜안트릴이다.

여기서 사용된 "옥소"라는 문구는 산소에 대한 이중 결합을 의미한다.

여기서 사용된 "할로" 및 "할로겐"이라는 문구는 클로로, 브로모, 이오도 및 플루오로를 의미한다.

여기서 사용된 "백신용 보조제"라는 용어는 특정 항원의 면역원성을 비-특이적으로 증가시키는 어떠한 물질을 의미한다.

"치료" 및 "치료하는"이라는 문구는 질병, 장애 또는 그 증후의 개선 또는 중지를 포함한다.

"예방" 또는 "예방하는"이라는 문구는 질병, 장애 또는 그 증후의 발병 방지를 포함한다.

세라마이드-유사 당지질

하나의 실시태양에서 본 발명은 식 Ⅰ을 포함한 α-갈락토실세라마이드인 세라마이드-유사 당지질에 관한 것이다:

식Ⅰ

R1은 -(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃을 제외한 적어도 하나 이상의 C=C 결합을 지닌 선형 또는 분지형 C₁-C₂₇ 알켄이고, 또는 R1은 C(OH)-R3이고 상기 R3은 적어도 하나 이상의 C=C 결합을 지닌 선형 또는 분지형 C₁-C₂₆ 알켄이고;

R2는 하기 (a)∼(e) 중의 하나이고;

(a) -CH₂(CH₂)_XCH₃,

(b) -CH(OH)(CH₂)_XCH₃,

(c) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)₂,

(d) -CH=CH((CH₂)_XCH₃,

(e) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)CH₂CH₃

X는 5∼17 범위의 정수임.

스핑고신 모이어티 내에 모이어티 (a)∼(e)를 지닌 세라마이드-유사 당지질은 NK T 세포를 활성화시키는 것이 가능하다고 알려져 있다. 미국 특허 제5,936,076호 참조. 그러나 상기 특허는 지방산 모이어티 내 변이가 NK T 세포를 활성화시키는 것이 가능한지 여부를 평가하지 않았다.

하나의 실시태양에서 화합물이 광범위하게 조사되었기 때문에 스핑고신 모이어티(R2)는 KRN7000과 동일한 -CH(OH)(CH₂)₁₂CH₃이다.

실시예에서 기술된 바와 같이 세라마이드-유사 당지질 일부는 NK T 세포를 활성화시키는 KRN7000의 능력과 유사하거나 그 보다 더 강하다. 이들 세라마이드-유사 당지질은 다양한 지방산 길이 및 불포화 지방산 결합의 수를 지닐 수 있다. 세라마이드-유사 당지질의 예는 Rl이 (CH₂)₉CH=CH-CH₂-CH=CH(CH₂)₄CH₃인 DB03-4; Rl이 (CH₂)₂CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH=CH-(CH₂)₄CH₃인 DB03-5; Rl이 (CH₂)₃CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH₃인 DB03-6; 및 Rl이 (CH₂)₇CH=CH-CH₂-CH=CH=(CH₂)₄-CH₃인 DB03-10을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

하나의 실시태양에서 세라마이드-유사 당지질의 이중 결합은 시스 배열을 지닌다.

하나의 실시태양에서 세라마이드-유사 당지질의 R2 모이어티는 KRN7000 즉, -CH(OH)(CH₂)₁₂CH₃과 동일하다.

하나의 실시태양에서 세라마이드-유사 당지질은 사이토카인의 생성을 유도하거나 억제하는 것이 가능하다. 하나의 실시태양에서 세라마이드-유사 당지질은 KRN7000의 동일한 농도에 의해 유도되는 것과 동일하거나 더 높은 수치로 NK T 세포에 의한 사이토카인 생성을 유도한다. 또한 세라마이드-유사 당지질은 이들이 유도하는 NK T 면역 반응을 변화시킨다. 예를 들어 실시예에 기술된 바와 같이 NK T 세포에 의해 생성되는 다른 사이토카인의 비율은 다른 세라마이드-유사 당지질과 다를 수 있다.

사이토카인 생성을 유도하거나 억제하는 세라마이드-유사 당지질의 능력은 NK T 세포에 의해 생성되는 사이토카인을 측정함으로서 측정될 수 있다. NK T 세포에 의한 사이토카인 생성의 측정 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 여기에 기술된 것을 포함하나 이에 한정적인 것은 아닌 당분야에 알려진 방법이 NK T 세포에 의한 사이토카인 생성을 측정하는데 이용될 수 있다. 하나의 실시태양에서 사이토카인은 IL-2, IL-4 또는 IFNγ이다. NK T 세포에 의한 생성이 세라마이드-유사 당지질을 이용하여 조절될 수 있는 다른 사이토카인은 T_H2-결합 사이토카인; 사이토카인 IL-13, IL-10, IL-5, RANTES, TNFα 및 림포톡신(lymphotoxin)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

NK T 세포 유도의 또다른 측정은 CD40L의 발현이다(CD154). 도 11 참조. 따라서 세라마이드-유사 당지질의 NK T 세포-유도 효율의 측정은 CD40L의 발현을 측정함으로서 측정될 수 있다. CD40L의 발현 측정 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 실시예에 기술된 것으로 포함하나 이에 한정적인 것은 아닌 당분야에 알려진 어떠한 방법도 CD40L 발현을 측정하는데 이용될 수 있다. 하나의 실시태양에서 CD40L 수치는 당분야에 잘 알려진 방법에 의한 형광-표지 항-CD40L 항체의 염색 후 세포 분류에 의해 측정된다.

하나의 실시태양에서 NK T 세포 내 사이토카인 또는 CD40L과 같은 세포 마커는 RMA-S.mCD1d과 같은 림프구 라인, JAWS Ⅱ와 같은 골수계 수지상 APC 라인 또는 HeLa.hCD1d와 같은 상피 APC 라인과 같은 CD1d를 발현하는 항원-제시 세포(APC) 라인을 이용하여 본 발명의 세라마이드-유사 당지질로서 달성된다(실시예 참조).

또한 본 발명은 식 Ⅰ을 포함한 α-갈락토실세라마이드인 세라마이드-유사 당지질에 관한 것이다:

식Ⅰ

R1은 분지형 C₁-C₂₇ 알칸이고, 또는

R1은 C(OH)-R3이고 상기 R3은 선형 또는 분지형 C₁-C₂₆ 알켄이고;

R2는 하기 (a)∼(e) 중의 하나이고;

(a) -CH₂(CH₂)_XCH₃,

(b) -CH(OH)(CH₂)_XCH₃,

(c) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)₂,

(d) -CH=CH((CH₂)_XCH₃,

(e) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)CH₂CH₃

X는 5∼17 범위의 정수임.

이들 α-갈라토실세라마이드의 하나의 실시태양에서 R2는 -CH(OH)(CH₂)₁₂CH₃ 즉, KRN7000이다.

또다른 실시태양에서 본 발명은 식 Ⅰ을 포함한 α-갈락토실세라마이드인 세라마이드-유사 당지질에 관한 것이다:

식 Ⅰ

R1은 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄이고 (ⅰ) 상기 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄은 C₅-C₁₅ 시클로알칸, C₅-C₁₅ 시클로알켄, 헤테로사이클 또는 방향족 고리로 치환되거나 (ⅱ) 상기 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄은 C₆-C₂₇ 알킬 또는 알케닐 사슬 내에 C₅-C₁₅ 시클로알칸, C₅-C₁₅ 시클로알켄, 헤테로사이클 또는 방향족 고리를 포함하고;

R2는 하기 (a)∼(e) 중의 하나이고;

(a) -CH₂(CH₂)_XCH₃,

(b) -CH(OH)(CH₂)_XCH₃,

(c) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)₂,

(d) -CH=CH((CH₂)_XCH₃,

(e) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)CH₂CH₃

X는 5∼17 범위의 정수임.

이들 화합물의 하나의 실시태양에서 R2는 -CH(OH)(CH₂)₁₂CH₃ 즉, KRN7000과 동일하다.

일부의 실시태양에서 R1은 옥소; 하이드록시; 할로겐; -OC(O)R₅; -OR₅; -C(O)R₅; 또는 N(R₅)₂로 치환되고, 상기 각각의 R₅는 독립적으로는 수소, C₁-C₆ 알킬 또는 방향족 고리이며, 선택적으로는 할로겐, 하이드록시, 할로겐, -OC(O)R₆, -OR₆, -C(O)R₆, N(R₆)₂로 치환되고, 상기 각각의 R₆은 독립적으로는 C₁-C₆ 수소 또는 알킬이다.

하나의 실시태양에서 R1은 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄이고, 상기 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄은 사슬 내에 C₅-C₁₅ 시클로알칸, C₅-C₁₅ 시클로알켄, 헤테로사이클 또는 방향족 고리를 포함한다.

하나의 실시태양에서 R1은 하기 모이어티 중의 하나이다:

( )는 식 Ⅰ의 화합물로의 R1의 부착 지점을 나타낸다. 이들 화합물의 예는 DB03-4, DB03-5, 및 YTC03 화합물 4, 6, 11, 15, 17, 18, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 60 및 61이다(실시예, 도 5 및 표 1 참조). 특히 효과적인 화합물은 DB03-4 및 YTC03 화합물 6, 17, 25, 31, 33, 35, 46, 47, 50, 56, 59 및 60이다.

이들 α-갈락토실세라마이드의 다른 실시태양에서 R2는 KRN7000과 동일한 -CH(OH)(CH₂)₁₂CH₃이다.

추가적인 실시태양에서 본 발명은 식 Ⅰ을 포함한 α-갈락토실세라마이드인 세라마이드-유사 당지질에 관한 것이다:

식 Ⅰ

R1은 -C(=O)OCH₂CH₃, -(CH₂)₆CH₃, -(CH₂)₄Cl, -(CH₂)₁₆CH₃, -(CH₂)₅CH₃, -(CH₂)₂CH₃, -(CH₂)₄CH₃, -(CH₂)₈CH₃, -C(CH₂)₁₀CH₃, -C(CH₂)₁₂CH₃으로 구성된 군에서 선택되고;

R2는 하기 (a)∼(e) 중의 하나이고;

(a) -CH₂(CH₂)_XCH₃,

(b) -CH(OH)(CH₂)_XCH₃,

(c) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)₂,

(d) -CH=CH((CH₂)_XCH₃,

(e) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)CH₂CH₃

X는 5∼17 범위의 정수임.

실시예에 기술된 바와 같이 도 5 내의 YTCO3-4, 6, 11, 15, 25, 27, 31, 34, 35 및 36을 참조.

상기 기술된 다른 실시태양에 나타난 바와 같이 R2는 KRN7000과 동일한 -CH(OH)(CH₂)₁₂CH₃이다.

또한 본 발명은 αGalCer의 갈락토스 모이어티가 다른 α-결합 단당류와 치환될 수 있고, 수득된 α-갈락토실세라마이드가 NK T 세포를 활성화시키는 것이 가능함을 발견하였다. 도 5d, 11 및 실시예 참조. 따라서 본 발명은 식 Ⅱ를 포함한 글리코실세라마이드인 세라마이드-유사 당지질에 관한 것이다:

식 Ⅱ

R1은 선형 또는 분지형 C₁-C₂₇ 알칸 또는 알켄이고 또는

R1은 C(OH)-R3이고 상기 R3은 적어도 하나 이상의 C=C 결합을 지닌 선형 또는 분지형 C₁-C₂₆ 알켄이고 또는

R1은 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄이고 (ⅰ) 상기 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄은 C₅-C₁₅ 시클로알칸, C₅-C₁₅ 시클로알켄, 헤테로사이클 또는 방향족 고리로 치환되거나 (ⅱ) 상기 C₆-C₂₇ 알칸 또는 알켄은 C₆-C₂₇ 알킬 또는 알케닐 사슬 내에 C₅-C₁₅ 시클로알칸, C₅-C₁₅ 시클로알켄, 헤테로사이클 또는 방향족 고리를 포함하고;

R2는 하기 (a)∼(e) 중의 하나이고;

(a) -CH₂(CH₂)_XCH₃,

(b) -CH(OH)(CH₂)_XCH₃,

(c) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)₂,

(d) -CH=CH((CH₂)_XCH₃,

(e) -CH(OH)(CH₂)_XCH(CH₃)CH₂CH₃

X는 5∼17 범위의 정수이고;

R4는 α-갈락토실 이외의 α-결합 단당류 또는 β-결합 단당류임.

하나의 실시태양에서 R4는 α-갈락토실 이외의 α-결합 단당류이다.

하나의 실시태양에서 α-결합 단당류는 α-글루코실이다.

또다른 실시태양에서 α-결합 단당류는 α-푸코실이다.

하나의 실시태양에서 R4는 β-결합 단당류이다.

하나의 실시태양에서 β-결합 단당류는 β-만노실이다.

이들 실시태양의 멤버의 예는 R4는 푸코오스이고 R1은 (CH₂)₂₂-CH₃인(실시예 및 도 11 참조) DB03-8(도 5b)이고, R4는 글루코스인(실시예 및 도 5d 참조) DB02-1이다. 하나의 실시태양에서 R2는 CH(OH)-(CH₂)₁₃-CH₃이다. 하나의 실시태양에서 R1은 (CH₂)₂₂-CH₃이고 R2는 CH(OH)-(CH₂)₁₃-CH₃이다. 그러나 상기 개시된 α-갈락토실세라마이드 내에서 효과적인 R1의 모이어티는 α-글루코실세라마이드 내에서도 유용할 것으로 예측된다. 이들 실시태양의 단당류(R4 위치에서의)의 예는 글루코스, 푸코오스, 갈락토스 및 만노오스이다.

R4가 β-결합 단당류인 대표적인 예는 DB04-8 및 DB04-9이다.

본 발명의 일부 대표적 세라마이드-유사 당지질은 하기 표에 제공된다:

생체 내 활성은 마우스 내 활성을 나타낸다(실시예 참조).

시험관 내 활성은 쥐과 세포 분석 시스템 내 활성을 나타낸다(실시예 참조).

DB03-3, DB03-4, DB03-5, DB03-7, DB03-8, DB03-9, DB03-10 및 YTCO3-17의 각각은 쥐과 세포 분석 시스템을 이용한 사이토카인 조절에 대한 시험관 내 활성을 나타내고, 일부 화합물의 경우 활성은 인간의 시험관 내 NKT 세포 분석 시스템 내에서도 나타났다. 예를 들어 DB03-4 및 DB03-5는 시험관 내에서 인간 NKT 세포 콜론의 자극에 활성적이고, 문헌에서 수립된 배양 시스템을 이용하여 조사시 증식성 반응 및 사이토카인 분비를 유도한다(즉 Spada FM, Sugita M, Watts GFM, Koezuka Y, and Porcelli SA. Low expression but potent antigen presenting function of CDId on monocyte lineage cells, Eur. J. Immunol., 30:3468-3477 (2000) 및 Spada FM, Koezuka Y, Porcelli SA, CD Id-restricted recognition of synthetic glycolipid antigens by human NK T cells. JExp Med; 188:1529-1534 (1998) 참조. 또한 Lee PT et al., J Clin Invest., 2002 Sep;l 10(6):793-800 참조). 더욱이 이들 화합물은 정상 혈액 표본 내에서 인간 NKT 세포에 강하게 결합하는 당지질 인간 CD1d 테트라머를 생성시키는 이용될 수 있고, 이는 인간 CD1d에 의해 제시되는 경우 이들 당지질이 인간 NKT 세포의 T 세포 항원 수용체에 의해 강하게 인식됨을 나타낸다(NKT 세포를 연구하기 위한 CD1d 테트라머 생성 및 적용에 대한 방법은 Yu KOA, Im JS, Molano A, Dutronc Y, Illarionov PA, Forestier C, Fujiwara N, Arias I, Miyake S, Yamamura T, Chang Y- T, Besra GS, Porcelli SA, Modulation of CD Id-restricted NKT cell responses using N-acyl variants of α-galactosylceramides, Proc. Nat. Acad. Sd. (USA), 102:3383-8 (2005)에 기술되어 있음).

또한 이들 화합물의 일부는 마우스 내 사이토카인 조절에 대한 활성을 나타내었다(실시예 참조). DB03-4 및 DB03-5 모두는 타입 2 사이토카인 즉, 항-염증성 효과를 지니고 둔화된 IFNγ 및 NK 세포 전이활성(transactivation)과 함께 iNKT 세포 내 IL-4의 강한 유도제인 사이토카인을 유도하게 하는 경향을 나타낸다. DB03-3은 IL-4의 우수한 유도제이고, 일부 쥐과 스트레인의 경우 시험관 내의 INFγ의 강한 유도제이다. IFNγ의 높운 수치의 생성은 종종 NK 세포 활성화와 관련된다. DB03-9 및 DB03-10은 시험관 내에서의 IL-4의 강한 유도제이고, IL-2의 약한 유도제이며 IFNγ의 중등도의 유도제이다. YTC03-17은 시험관 내 연구에서 강한 작용제 활성을 나타낸다. DB03-8은 시험관 내에서 iNKT 세포의 약한 작용제이고 NZB/W-F1 마우스 내에서 SLE를 악화시킨다. DB03-8은 가능한 길항제/부분적 작용제로 판단된다 즉, 이는 iNKT의 길항제로 작용하거나 미성숙 부분적 활성화를 자극시키기 때문에 iNKT의 직접적 또는 간접적 활성을 저해한다.

여기서 사용된 iNKT 세포라는 용어는 마우스 내에서 Vα14-Jα18 및 인간 내에서 Vα24-Jα18로 구성된 불변성 TCRα 사슬 재배열을 발현하는 CD1d-의존성 T 세포의 특정 서브세트를 의미한다. 이들 세포는 CD1d에 의해 제시된 α-갈락토실세라마이드에 일정하게 반응적이다. 또한 이들 세포는 "타입 1" NKT 세포로 표기되고 다른 타입의 NKT 세포 사이의 판별과 이와 관련한 명명법은 Godfrey et al., Nat Rev Immunol. 2004 Mar,4(3):231-7의 간행물에 요약되어 있다. 강하거나 약한 작용제 활성의 측정을 위한 CD1d-제시 당지질 iNKT에 의한 사이토카인 생성의 측정 방법은 Yu KOA, Im JS, Molano A, Dutronc Y, Illaπonov PA, Forestier C, Fujiwara N, Anas I, Miyake S, Yamamura T, Chang Y- T, Besra GS, Porcelli SA, Modulation of CDld-restπcted NKT cell responses using N-acyl variants of α-galactosylceramides, Proc. Nat. Acad Sci. (USA), 102:3383-8 (2005)에 기술되어 있고, Godfrey DI et al., Nat Rev Immunol. 2004 Mar,4(3):231-7을 참고.

YTCO3-24 및 YTCO3-25는 NZB/W F1 마우스 유래의 비세포(splenocyte)로의 시험관 내 IFNγ 대비 증가된 IL-4 유도를 나타낸다. DB03-6은 IFNγ 및 최소 IL-2 유도 대비 IL-4의 명백한 증가와 함께 비세포 배양액 내 작용제이다.

하기 합성 스킴은 세라마이드-유사 당지질을 제조하는데 이용되는 합성 방법론을 기술한다:

이들 합성 공정을 이용하여 아지도 스핑고신 전구체(화합물 8)는 약 18시간 동안 실온에서 D-라이소스(화합물 1)을 아세톤/H₂SO₄와 반응시켜 화합물 2를 제공함으로서 제조된다(단계 a). 이후 화합물 2는 약 16시간 동안 실온에서 CH₂C_l2 내에서 터셔리-염화부틸디프로필실릴(TBDPSCI), 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 및 Et₃N과 반응되어 화합물 3을 제공한다(단계 b). 이후 화합물 3은 약 0℃에서 테트라하이드로푸란(THF) 내에서 트리페닐포스핀(Ph₃P), 1-프로모데칸 및 BuLi과 반응된 후 반응 혼합물을 실온으로 온난화시키고 약 18시간 동안 실온에 유지시켜 화합물 4를 제공한다(단계 c). 이후 화합물 4는 31℃에서 약 24시간 동안 CH₂C_l2 내에서 염화메실(MsCl) 및 피리딘과 반응되어 화합물 5를 제공한다(단계 d). 이후 화합물 5는 약 2시간 동안 실온에서 CH₂Cl₂/Me0H 내에서 HCl과 반응되어 화합물 5를 제공한다(단계 2). 화합물 5는 약 20시간 동안 실온에서 Pd/BaSO₄ 촉매를 이용하여 H₂와 반응되어 화합물 6을 제공한다. 화합물 6은 95℃에서 약 4시간 동안 디메틸포름아마이드(DMF) 내에서 NaN₃과 반응되어 화합물 7을 제공한다. 이후 화합물 7은 플루오르화테트라-부틸암모늄(TBAF)(80%)과 반응되어 아지도 스핑고신 전구체(화합물 8)을 제공한다.

이후 아지도 스핑고신 전구체(화합물8)의 3,4-디하이드록시기는 이소프로필리덴아세탈로서 보호되고 위치-2에서 클로로-디메틸실릴에테르를 지닌 아실 보호된 티로페닐 갈락토스에 커플되어(화합물 9) 글리코실 중간물을 제공한다(화합물 10). 또한 α-갈락토실 아지도 스핑고신 중간물(화합물 11)은 분자내 아글리콘 전달 전략을 이용하여 수득되고, 이에 의해 D. Crich and M. Smith, in J. Am. Chem. Soc, 123:9015 (2001)에 기술된 바와 같이 티오글리코시드는 벤젠술피닐피페리딘(BSP)/트리플루오로메탄술포닉 안하이드리드(Tf₂O)에 의해 활성화된다. 이후 화합물 11의 아지드기는 아민으로 환원되고 산염화물로서 활성화된 적당한 지방산으로 N-아세틸화되어 화합물 12를 제공한다. 이후 잔여 하이드록실 보호기는 세라마이드-유사 당지질(화합물 13)을 제공하는 산성 및 염기성 조건을 이용하여 화합물 12로부터 제거된다. 또한 K Yu et al. PNAS, March 1, 2005, 102:(9), 3383-3388 참조.

또한 당업자에 알려진 다른 방법도 세라마이드-유사 당지질을 제조하는데 이용될 수 있다. 예를 들어 세라마이드-유사 당지질은 미국 특허 제5,936,076호에 기술된 방법론을 이용하여 수득될 수 있다.

약제적 조성물, 투여 방법 및 이용 방법

세라마이드-유사 당지질이 자가면역질환, 다양한 암 또는 염증과 같은 장애의 백신 또는 치료에 유용한 것으로 예측되기 때문에 상기 세라마이드-유사 당지질을 포함한 약제적 조성물도 숙고된다.

따라서 본 발명은 세라마이드-유사 당지질 및 약제적으로 수용 가능한 부형제를 포함한 약제적 조성물에 관한 것이다.

약제적 조성물은 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 제조될 수 있다(Remington The Science and Practice of Pharmacy 20tn ed. ("Remington"), edited by A. Gennaro, Philadelphia College of Pharmacy and Science 2000 (the contents of which are expressly incorporated herein by reference hereto), p. 858-856 참조).

따라서 세라마이드-유사 당지질의 조성물은 예를 들어 세라마이드-유사 당지질을 불활성 희석제 또는 식용 담체과 결합시킴으로서 경구, 설, 설하, 구강 또는 구강내 투여용으로 고안될 수 있다. 약제적 조성물은 젤라틴 캡슐 내에 동봉되거나 정제로 압축된다. 경구 치료 투여의 목적으로 본 발명의 약제적 조성물은 정제, 구내정, 캡슐, 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 츄잉검 등의 형태이다.

정제, 알약, 캡슐, 구내정 등은 결합제, 수용제, 붕괴제, 윤활제, 감미제 및 향미제도 포함한다. 본 발명의 약제적 조성물에 사용될 수 있는 적당한 부형제는 당업제에게 잘 알려져 있다(Remington 참조). 결합제의 예는 미세결정 셀룰로스, 검 트래그캔스(tragcanth) 또는 젤라틴을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 희석제의 예는 전분 또는 락토오스를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 붕괴제의 예는 알긴산, 옥수수 전분 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 윤활제의 예는 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산칼륨을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 유동화제의 예는 콜로이드성 이산화실리콘이다. 감미제의 예는 슈크로스, 사카린 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 향미제의 예는 페퍼민트, 메틸 살리실산염, 오렌지 향미제를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 이들 다양한 조성물 제조시 사용되는 물질은 약제적으로 정제되고 사용되는 함량 내에 무독성이어야 한다.

본 발명의 약제적 조성물은 예를 들어 정맥내, 근육내, 경막내 또는 피하 주사에 의해 비경구적으로 용이하게 투여될 수 있다. 비경구 투여는 본 발명의 조성물을 용액 또는 현탁액 내에 통합시킴으로서 달성될 수 있다. 또한 이러한 용액 또는 현탁액은 주사용 웨이퍼, 식염수, 고정 오일, 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제를 포함한다. 또한 비경구 포뮬레이션은 예를 들어 벤질알코올 또는 메틸파라벤과 같은 항박테리아제, 아스코르브산 또는 이황화나트륨과 같은 항산화제 및 EDTA와 같은 킬레이트제를 포함한다. 초산염, 구연산염 또는 인산염과 같은 완충액 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 삼투 조정용 약제도 첨가된다. 비경구 제제는 앰플, 1회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다수 용량 바이알 내에 동봉될 수 있다.

본 발명의 약제적 조성물은 직장을 용이하게 투여될 수 있다. 직장 투여는 직장 또는 대장 내로 약제적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이는 좌약 또는 관장제를 이용하여 달성될 수 있다. 좌약 포뮬레이션은 당분야에 알려진 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어 좌약 포뮬레이션은 약 120℃로 글리세린을 가열시키고 상기 글리세린 내 세라마이드-유사 당지질을 용해시키고 정제수가 첨가된 후 가열된 글리세린을 혼합시키고 뜨거운 혼합물을 좌약 주형에 주입시킴으로서 제조될 수 있다.

본 발명의 약제적 조성물은 경피성으로 용이하게 투여될 수 있다. 경피 투여는 피부를 통한 조성물의 피부 관통 흡수를 포함한다. 경피 포뮬레이션은 패취(잘 알려진 니코틴 패취와 같은), 연고, 크림, 겔, 고약(salve) 등을 포함한다.

본 발명은 세라마이드-유사 당지질의 치료적으로 유요한 함량을 비강으로 투여하는 것을 포함한다. 여기서 사용된 비강 투여는 약제적 조성물을 환자의 비강 통로 또는 비강의 점막으로 투여하는 것을 포함한다. 조성물의 비강 투여용 약제적 조성물은 치료적으로 유효한 함량의 세라마이드-유사 당지질 및 부형제를 포함하고 잘-알려진 방법에 의해 제조되고 예를 들어 비강 스프레이, 비강 드롭, 현탁액, 겔, 연고, 크림 또는 분말과 같이 비강 투여로 개조된다. 또한 약제적 조성물의 투여는 비강 탐폰 또는 비강 스폰지를 이용하여 수행된다.

또한 세라마이드-유사 당지질은 수지상 세포와 같은 CD1d-함유 항원 제시 세포와 유용하게 결합될 수 있다. 이러한 혼합물은 NK T 세포를 활성화시키는 것으로 예측된다. 따라서 본 발명은 세라마이드-유사 당지질 및 수지상 세포와 같은 CD1d-함유 항원 제시 세포를 포함한 약제적 조성물을 포함한다.

기억 T 및 B 세포의 유도시 NK T 세포 활성화 역할에 기반하여 당업자는 세라마이드-유사 당지질이 유용한 백신 보조제임을 이해할 것이다. 따라서 또다른 실시태양에서 본 발명은 백신용 보조제로서 사용하기 적당한, 세라마이드-유사 당지질을 포함한 약제적 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 백신의 투여 방법에 관한 것이다. 본 방법은 상기-기술된 세라마이드-유사 당지질과 결합된 백신을 투여하는 것을 포함한다.

NK T 세포의 유도시 NK T 세포 활성화 역할에 기반하여 당업자는 세라마이드-유사 당지질이 수동적으로 투여되는 항체의 효과를 증가시키는 유용한 보조제임을 이해할 것이다. 따라서 또다른 실시태양에서 본 발명은 수동적으로 투여되는 항체용 보조제로서 사용하기 적당한, 세라마이드-유사 당지질을 포함한 약제적 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 치료적 항체의 투여 방법에 관한 것이다. 본 방법은 상기-기술된 세라마이드-유사 당지질과 결합된 항체를 투여하는 것을 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 이용 방법은 세라마이드-유사 당지질을 포유류에 투여하는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서 포유류는 인간이다.

더욱이 본 발명은 NK T 세포 활성화의 조절 방법에 관한 것이다. 본 방법은 NK T 세포를 세라마이드-유사 당지질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서 NK T 세포는 세라마이드-유사 당지질과의 접촉 후 사이토카인의 증가된 생성을 나타낸다. 하나의 실시태양에서 NK T 세포는 세라마이드-유사 당지질과의 접촉 후 사이토카인의 감소된 생성을 나타낸다. 이들 실시태양의 사이토카인은 IL-2, IL-4 또는 IFNγ가 될 수 있다. NK T 세포의 조절은 예를 들어 IL-2, IL-4 또는 IFNγ와 같은 특징적 사이토카인의 생성 또는 증가된 CD40L 발현에 의해 측정될 수 있다.

하나의 실시태양에서 NK T 세포는 생체 포유류 내에 존재한다. 하나의 실시태양에서 동물은 활성화된 NK T 세포에 의해 영향을 받는 자가면역질환, 암 또는 감염을 지니거나 이에 대한 위험한 상태인 포유류이다. 또다른 실시태양에서 포유류는 제1형 당뇨병과 같은 자가면역질환을 지니거나 이에 대한 위험한 상태이다. 이들 실시태양에서 세라마이드-유사 당지질은 상기 포유류에 직접 투여되거나 생체 외로 수지상 세포에 먼저 첨가된 후 세라마이드-유사 당지질로 부하된 수지상 세포를 포유류 내에 주입함으로서 투여될 수 있다. 하나의 실시태양에서 이들 생체 외 실시태양에서 수지상 세포는 동일한 포유류로부터 유래된다. 하나의 실시태양에서 포유류는 인간이다. 생체 외에서 α-갈락토실세라마이드를 수지상 세포와 결합시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 생체 외에서 α-갈락토실세라마이드를 수지상 세포와 결합시키기 위한 당업자에게 알려진 어떠한 방법도 생체 외에서 α-갈락토실세라마이드를 수지상 세포와 결합시키는 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 대표적 방법론은 D.H. Chang et al., Sustained expansion of NKT cells and antigen-specific T cells after injection of alpha-galactosyl-ceramide loaded mature dendritic cells in cancer patients, J Exp Med , May 2, 2005, 201(9):1503-17; S. Fujii et al., Detection and activation of human Valpha24+ natural killer T cells using alpha-galactosyl ceramide-pulsed dendritic cells, J Immunol Methods Jan 15, 2003; 272(1-2): 147-59, and S. Fujii et al., Prolonged IFN-gamma-producing NKT respouse induced with alpha-galactosylceramide-loaded DCs, Nat Immunol Sep 3, 2002, (9):867-74에 기술된 것을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

본 발명은 포유류 내 면역체계의 자극 방법에 관한 것이다. 본 방법은 유효량의 세라마이드-유사 당지질을 포유류 내에 투여하는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서 포유류에 투여되는 유효량의 세라마이드-유사 당지질은 약제적 조성물로서 투여된다. 하나의 실시태양에서 포유류는 암을 지닌다. 또다른 실시태양에서 포유류는 제1형 당뇨병을 지닌다. 또다른 실시태양에서 포유류는 류머티스관절염과 같은 염증성 질환을 지닌다.

관련 실시태양에서 본 방법은 수지상 세포를 세라마이드-유사 당지질과 접촉시킨 후 상기 수지상 세포를 포유류 내에 주입시키는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서 수지상 세포는 세라마이드-유사 당지질의 약제적 조성물과 접촉된다.

실시예에 기술된 실험에 나타난 바와 같이 NK T 세포를 활성화시키는 것이 가능한 세라마이드-유사 당지질은 사용되는 항원-제시 세포에 따라 NK T 세포 유도의 프로파일 내에 차이가 있다. 예를 들어 일부 세라마이드-유사 당지질은 일부 항원-제시 세포의 존재시 사이토카인을 유도하는 것이 가능하고 다른 것이 아니다. 따라서 NK T 세포를 유도하는 α-갈락토실세라마이드 또는 다른 α-글리코실세라마이드와 같은 화합물의 능력은 하나 이상의 형태의 항원 제시 세포를 이용함으로서 최상으로 측정된다. 따라서 본 발명은 화합물을 CD1d 단백질을 발현하는 NK T 세포와 결합시킨 후 NK T 세포가 활성화되는지 여부를 조사하는 것을 포함한다. 세포 형태는 예를 들어 림프구 세포, 수지상 세포 또는 상피 세포일 수 있으나 이에 한정적인 것은 아니다. 실시예 참조. NK T 세포의 활성화는 여기서 기술된 것을 포함하나 이에 한정적인 것은 아닌 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 사이토카인 생성의 증가를 측정함으로서 측정될 수 있다(실시예 및 도 5a 및 5에 나타난 데이터 참조).

시험 화합물은 CD1d에 결합하고 NK T 세포를 활성화하거나 억제할 것으로 가정된 어떠한 화합물도 될 수 있다. 실례는 지질타이코산, α-갈락토실세라마이드 및 다른 α-글리코실세라마이드, 예를 들어 상기 기술된 세라마이드-유사 당지질 같은 것을 포함한다.

또한 본 발명은 활성화된 NK T 세포에 의해 영향 받는 자가면역질환, 암 또는 염증을 지니거나 이의 발달 위험이 있는 포유류의 치료 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 NK T 세포의 활성을 조절함으로서 영향 받는 포유류 내 장애를 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 대표적 장애는 자가면역질환, 암, 만성 알레르기 질환 또는 염증을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 하나의 실시태양에서 포유류 내 장애는 NK T 세포를 활성화시킴으로서 치료되거나 예방된다. 실례는 췌장 β 섬세포의 파괴를 저해하기 위한 NK T 세포의 활성화에 의한 제1형 당뇨병의 치료이다. 또다른 실시태양에서 포유류 내 장애는 NK T 세포의 활성화를 억제함으로서 치료되거나 예방된다. 실례는 O. Akbari et al., Essential role of NKT cells producing 1L-4 and IL- 13 in the development of allergen-induced airway hyperreactivity, Nature Med, May 2003 9(5):582-588에 기술된 바와 같은 NK T 세포의 억제에 의한 알레르기성 기도 과다반응, 알레르기성 천식 모델의 치료이다.

또다른 실시태양에서 포유류 내 장애는 NK T 세포에 의해 생성되는 사이토카인을 변화시켜 타입 2 또는 타입 1 사이토카인 생성에 대한 반응으로 치우치게 함으로서 치료되거나 예방된다. 본 방법은 포유류에 세라마이드-유사 당지질을 투여하는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서 세라마이드-유사 당지질은 약제적 조성물로서 투여된다. 하나의 실시태양에서 포유류는 예를 들어 제1형 당뇨병, 중증근육무력증, 심상성천포창, 전신홍반루푸스, 길랑-바레 증후군, 항인지질증후군, 구드패스츄어 증후군, 이식편대숙주병, 다발경화증, 원발성 담즙성 간경변증, 피부경화증, 혈관염, 백반증, 베게너육아종증, 류마티스관절염, 사구체신염, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 건선, 시오겐병과 같은 자가면역질환을 지니거나 이의 위험 상태이다. 하나의 실시태양에서 장애는 천식 또는 아토피피부염과 같은 만성 알레르기질환이다. 상기 기술된 다른 실시태양과 같이 약제적 조성물은 상기 기술된 방법에 의해 포유류 내에 직접 투여되거나 생체 외로 수지상 세포에 먼저 첨가된 후 포유류 내에 상기 수지상 세포를 주입함으로서 투여된다.

장애의 치료 또는 예방에 효과적인 세라마이드-유사 당지질의 함량은 표준 임상 기술에 의해 측정될 수 있다. 더욱이 시험관 내 또는 생체 내 분석은 최적 용량 범위를 확인하는데 선택적으로 이용될 수 있다. 또한 이용되는 정확한 용량은 투여 경로 및 치료되는 장애의 경중도에 따라 달라질 것이고, 의사의 판단 및 공개된 임상 연구의 관점에서 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 그러나 적당한 유효 용량 함량은 매주 체중 킬로그램 당 약 1,000 마이크로그램 이하이나 일반적으로 매주 체중 킬로그램 당 약 1∼10,000 마이크로그램의 범위이다. 하나의 실시태양에서 유효 용량 함량은 매주 체중 킬로그램 당 약 10∼5,000 마이크로그램의 범위이다. 또다른 실시태양에서 유효 용량 함량은 매주 체중 킬로그램 당 약 50∼1,000 마이크로그램의 범위이다. 또다른 실시태양에서 유효 용량 함량은 매주 체중 킬로그램 당 약 75∼500 마이크로그램의 범위이다. 여기서 기술된 유효 용량 함량은 투여되는 총 함량을 나타내고 즉, 하나 이상의 세라마이드-유사 당지질이 투여되는 경우 유효 용량 함량은 투여되는 총 함량에 상응한다. 세라마이드-유사 당지질은 매주 단독 용량으로 또는 분배된 용량으로 투여될 수 있다.

세라마이드-유사 당지질은 인간에 사용하기에 앞서 원하는 치료적 또는 예방적 활성에 대해 시험관 내에서 또는 생체 내에서 분석될 수 있다. 동물 모델 시스템은 안전성 및 효능을 증명하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 실시태양은 하기 실시예에 기술되어 있다. 청구범위 내의 또다른 실시태양은 여기서 개시된 본 발명의 명세서 또는 실행의 고려로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 실시예와 함께 명세서는 실시예를 따르는 청구항에 의해 나타난 본 발명의 범위 및 정신에 대한 예증으로서만 고려되어야 한다.

도 1은 CD1d-제한 NK T 세포의 특이적 활성제인 αGalCer KRN7000의 구조를 나타낸 것이다. KRN7000은 ((2S, 3S, 4R)-l-O-(α-D-갈락토피라노실)-N- 헥사코사노일-2-아미노-l ,3,4-옥타데카네트리올)이다. 이는 C18 피토스핑고신 기제 및 C26 지방산기를 포함한다. 미국특허 제5,780,441호 참조.

도 2는 KRN7000이 NOD 마우스에서 제1형 당뇨병을 예방한다는 Hong et al. (2001)의 자료를 나타낸다. 마우스는 4주령 시작시 KRN7000이 주 2회 주사되었다. 상단 그래프는 약 75∼5%의 당뇨병 유도의 감소를 나타낸다. 하단 그래프는 이러한 효과가 CD1에 대한 넉아웃 좌위를 지닌 NOD 마우스에서는 나타나지 않음을 나타낸다. 이들 마우스는 KRN7000의 알려진 효과 전부에 필요한 CD1-제한 NK T 세포를 지니지 않는다.

도 3은 마우스 EAE의 자가면역 염증을 억제하는 증가된 능력을 지닌 αGalCer의 아날로그인 OCH의 구조를 나타낸다. 이는 단축된 C9 스핑고신 기제(C18 스핑고신 기제와 반대)를 지닌다는 점에서 KRN7000 구조와 다르다.

도 4는 본 발명에서 확인된 아미노-치환 세라마이드-유사 당지질에 대한 핵심 서열 및 그의 합성에 대한 커플링 반응을 나타낸다.

도 5. 패널 A는 결합적 합성에 의해 생성된 세라마이드-유사 당지질의 생물 활성 선별의 실험 결과를 나타낸 것이다. NK T 하이브리도마 DN32.D3은 미량역가판 웰 내에서 CD1d-트랜스펙트된 RMA-S 세포와 배양되었다. 각각의 세라마이드-유사 당지질은 0.5∼500 nM 범위의 농도로 적정되었고, 상청액은 IL-2 방출 측정을 위해 24시간 후 채취되었다. 활성 단위는 최대 IL-2 방출의 반을 제공하는데 필요한 세라마이드-유사 당지질의 농도의 역수로서 계산되었고, 모든 수치는 KRN7000의 활성으로 표준화되었다(1 단위로 정의됨). 점선은 KRN7000에 대한 활성 수치를 나타낸다. KRN7000 대비 현저하게 증가된 활성을 지닌 2개의 세라마이드-유사 당지질의 구조가 나타나 있다. 패널 B는 패널 A 및 표 1에 기술된 실험에서 시험된 세라마이드-유사 당지질의 구조를 나타낸 것이다. 패널 C는 표 1의 결과의 그래프적 표시를 나타낸 것이다. 패널 D는 DB01-1의 갈락토스를 대체시킨 글루코스를 제외하고는 DB01-1과 동일한 α-글루코실세라마이드인 DB02-1에 의한 CD1d-의존성 증식의 자극을 나타낸 것이다.

도 6은 다양한 제시 세포 형태에 의한 세라마이드-유사 당지질의 차별적 제시의 실험 결과를 나타낸 것이다. 항원 제시 세포(APC)로서 3가지 다른 세포 형태를 이용한 8개의 선택된 세라마이드-유사 당지질에 반응한 NK T 하이브리도마 DN32.D3에 의한 IL-2의 생성이 나타나 있다(상단). 이러한 실험에서 사용된 각각의 세라마이드-유사 당지질 내의 아미노 결합된 측쇄의 구조는 하단에 나타나 있다.

도 7은 세라마이드-유사 당지질의 유효성 상의 지방산 사슬 길이의 효과를 나타낸 것이다. 표시된 사슬 길이를 지닌 세라마이드-유사 당지질은 항원 제시 세포(APC)로서 RMA-S/CD1d를 이용한 NK T 하이브리도마 DN32.D3의 자극에 대해 시험되었다.

도 8은 C20 FA 세라마이드-유사 당지질의 유효성 상의 지방산 사슬 불포화 효과를 나타낸 것이다. 표시된 사슬 길이 및 표시된 이중 결합 수를 지닌 세라마이드-유사 당지질은 도 7과 동일하게 NK T 하이브리도마 DN32.D3의 자극에 대해 시험되었다.

도 9는 세라마이드-유사 당지질 DB03-4 및 DB03-5에 의한 마우스의 생체 내 IL-4 생성의 선택적 자극을 나타낸 것이다. DBOl-1, DB03-4 또는 DB03-5의 단일 주입 후 IL-4 및 IFNγ의 혈청 수치가 나타나 있다. C57BL/6 마우스(11∼13주령)는 4.8 나노몰의 상기 화합물 또는 인산염 완충 식염수(PBS)/운반체 대조군의 단일 복강내 주사가 제공되었다. 혈청 사이토카인 수치는 포획 ELISA에 의해 2시간 및 20시간 후 측정되었다. 바(bar)는 표준 편차를 지닌 3마리 마우스의 평균을 나타낸다. DBO1-1은 KRN7000(C25에 비교된 C24 지방산)과 거의 동일한 구조를 지니고 다수의 생물검정시 KRN7000과 구별 가능하지 않음이 주지됨. 본 발명자들은 DB01-1이 본 발명자들에 의해 합성되고 본 연구에 용이하게 이용 가능하고 KRN7000은 라이센스 제한으로 인해 이용 불가능하기 때문에 "KRN7000 모방제"로 사용한다.

도 10은 DB03-4 및 DB03-5가 KRN7000보다 NOD 마우스의 당뇨병 예방에 우수함을 수립하는 실험 결과를 나타낸 것이다. 6∼8마리 암컷 NOD 마우스 일단은 4∼5주령 시작시 주 1회 위약(운반제) 또는 DB01-1(KRN7000으로 표시), DB03-4 또는 DB03-5 주입으로 치료되었다. 치료는 5회 주입(DB03-4) 또는 7회 주입(DB03-5) 후 중단되었다. 상단 그래프는 당뇨의 발병률을 나타내고 하단 그래프는 각 일단의 생존율을 나타낸다.

도 11은 본 발명의 다양한 세라마이드-유사 당지질이 CD40L(CD154)의 발현을 자극시킬 수 있음을 나타내는 실험 결과 그래프를 나타낸 것이다.

면역 및 자가면역의 조절제로서 α-갈락토실세라마이드 및 다른 α-글리코실세라마이드의 아미노 치환 유도체

면역조절 활성을 지닌 신규한 아미노 치환 형태의 α-갈락토실세라마이드의 제조 및 확인

OCH 및 그의 자가면역 조직 손상 방지에 대한 증가된 특성의 발견은 KRN7000 구조에 기반한 많은 아날로그의 평가를 착수하는데 본 발명자들에게 강한 자극을 제공하였다. 본 발명자들이 선택한 전략은 KRN7000의 아미노-결합된 지방산 사슬의 변형 또는 치환에 기반한 아날로그를 개발하는 것이었다. 이러한 선택은 2가질 고려사항에 의해 지침되었다. 첫 번째로 OCH의 발견으로 다른 연구자들에 의한 스핑고신 기제의 변형에 대한 일부 연구는 이미 착수되었고, 따라서 이러한 분야는 완전히 신규한 것은 아니었다. 미국 특허 제5,936,076호 참조. 한편, 지방산 사슬의 변형에 대한 선행 연구는 극히 드물게 나타났다. 지방산 사슬 길이 변이는 Kawano, et al. (1997)에 의해 연구되었으나 이러한 분석은 매우 한정적이고 어떠한 흥미로운 특성도 나타내지 않았다. 또한 이들 화합물의 효과적인 제조 방법은 개발되었다.

이들 방법을 이용하여 본 발명자는 KRN7000의 60개 이상의 신규한 아미노 치환된 아날로그를 제조하였다. 이들은 CD1d를 발현하는 다양한 형태의 세포의 존재시 또는 조직 배양 플레이트 표면에 결합된 재조합 CD1d 단백질의 존재시 NK T 세포 하이브리도마를 활성화시키는 화합물의 능력을 평가하는 기능적 분석으로 선별되었다(도 5).

도 5a에 나타난 CD1d를 발현하는 다양한 형태의 세포의 존재시 NK T 세포 하이브리도마를 활성화시키는 화합물의 능력은 쥐과 NK T 세포 하이브리도마 자극 분석법을 이용하여 측정되었다. CD1d-트랜스펙트된 RMA-S 세포는 6시간 동안 37℃ 에서 다양한 농도의 세라마이드-유사 당지질을 함유한 100 마이크로리터 완전 배지 내 내의 평편-바닥 조직 배양 플레이트 내 50,000 세포/웰로 플레이트되었다. 이후 플레이트는 원심분리되었고(430g, 3분), 세포는 PBS로 3회 세척되었다. 이후 50,000개 NKT 하이브리도마 세포(클론 DN3A4.1-2)가 12시간 자극을 위해 100 마이크로리터의 배지 내에 첨가되었다. 인큐베이션 종류시 무-세포 상청액이 수집되었고 표준 포획 ELISA에 의해 IL-2에 대해 분석되었다. 세라마이드-유사 당지질의 상대 유효성은 반-최대 반응(1/EC₅₀)에서의 역수 유효 농도로부터 계산되었고, KRN7000에 대해 관찰된 유효성으로의 표준화에 의한 단위로 표기되었다. 세라마이드-유사 당지질의 구조는 도 5b에 제공되어 있다.

이들 선별 분석의 결과는 본 발명의 수집 내 5∼10%의 아날로그는 KRN7000과 동일하거나 더 높은 유효성을 지님을 나타내었다(유효성은 NK T 세포 하이브리도마의 최대 반 반응을 제공하는데 필요한 몰농도에 의해 정의되었음). 도 5a에 나타난 대표적 분석에서 7개의 화합물이 KRN7000보다 실질적으로 더 높은 유효성을 나타내었다. 더욱이 증가된 유효성을 지닌 이들 화합물 일부는 KRN7000과 비교시 증가된 최대 활성도 나타내었다(시험되는 화합물 희석 범위에 대한 분석에서 달성된 반응 최대 수치로서 정의됨; 데이터는 나타나지 않음).

표 1은 화합물 YTCO3-42 또는 YTCO3-61에 대한 증식 분석, IL-4 분석 및 IFN γ 분석에 의한 결과를 나타내고, 이는 IFNγ에 대한 IL-4의 비율뿐만 아니라 증식을 유도하고 2개의 사이토카인을 유도하는 그들의 능력의 변이성을 나타낸다. 도 5c는 사이토카인 반응에 대해 표 1에 나타난 결과의 그래프 묘사를 나타낸 것이다. 표 1 및 도 5c는 정상 마우스 비세포에 의한 사이토카인 생성이 세라마이드-유사 당지질로 자극됨을 나타낸다. 표 1 및 도 5c에 나타난 사이토카인 반응은 하기 절차에 의해 측정되었다: C57BL/6 마우스 유래의 비세포 덩어리는 2000 마이크로리터 완전 배지 내에서 500 nM의 농도로 희석된 세라마이드-유사 당지질을 지닌 96-웰 평편-바닥 조직 배양 플레이트 내에서 웰 당 300,000으로 플레이트되었다. 37℃에서 48시간 후 150 마이크로리터의 상청액이 사이토카인 측정을 위해 채취되었다. IL-4 및 IFNγ의 상청액 수치는 포획 및 비오틴화 검출 항체쌍(각각 클론 11B11 / BVD6-24G2-비오틴 및 R4-6A2 / XMGl 2-비오틴, BD Pharmmgen, San Diego, California)을 이용한 표준 효소면역측정법(ELISA)에 의해 측정되었다. 사이토카인 함량은 TMB-Turbo 기질(Pierce, Rockford, Illinois)과 함께 스트렙토아비딘-당근과산화효소(Zymed, South San Francisco, California)를 이용하여 또는 대안으로 4-니트로페닐 포스페이트 디소듐 헥사하이드레이트 기질(Titertek, Huntsville, Alabama)과 함께 스트렙토아비딘-알칼리성 포스파타제(Zymed)를 이용하여 나타내었다. IL-4 및 IFNγ에 대한 표준물질은 Peprotech (Rocky Hill, New Jersey)로부터 구입되었다.

표 1은 화합물 YTCO3-42부터 YTCO3-61까지에 의한 CD1d-의존성 증식의 자극 을 나타낸다. 결과는 하기 절차에 따른 비세포 증식 분석법을 이용하여 수득되었다: C57BL/6 마우스 유래의 비세포 덩어리는 완전 배지 내에서 나타난 농도로 희석된 나타난 세라마이드-유사 당지질을 지닌 96-웰 평편-바닥 조직 배양 플레이트 내에서 웰 당 300,000으로 플레이트되었다. 37℃에서 48시간 후 플레이트 웰은 50 마이크로Ci/ml ³H-티미딘을 함유한 20 마이크로리터의 배지로 펄스되었고 18시간 동안 인큐베이트되었다. 세포 증식은 96-웰 필터매트 상에 펄스된 세포를 채취하고 1450 Microbeta Trilux instrument(Wallac/Perkm Elmer, Boston, Massachusetts) 상에서 섬광 계측함으로서 측정되었다. 도 5d는 글루코스가 DB01-1의 갈락토스를 대체한 것을 제외하고는 DB01-1과 동일한 α-글루코실세라마이드인 DB02-1에 의한 CD1d-의존성 증식의 자극을 나타낸다. 도 5d에 나타난 결과는 표 1에 제공된 증식 데이터를 수득하는데 이용된 동일한 방법에 의해 수득되었다.

아날로그의 구조/활성 관련성

선별 분석으로부터 판명된 최대 관심의 화합물은 주로 2가지의 일반적 카테고리로 분류된다. 이들은 다양한 불포화 정도를 지닌 절제된 지방산 사슬을 함유한 α-갈락토실세라마이드 또는 그의 아미드 결합 분지 내 방향족 고리를 지닌 α-갈락토실세라마이드이다. 본 발명의 결과는 KRN700의 아미노 치환 내 이들 변경은 화합물의 생물학적 활성 상에 적어도 3가지 이상의 가능한 효과를 지닐 수 있음을 나타낸다: 1) 유효성/활성의 변화, 2) 화합물을 효과적으로 제시하는 세포 형태의 변화 및 3) 생성되는 사이토카인 형태의 측면에서 NK T 세포 활성화 결과의 변화. 이들 효과의 실례는 하기 도면에 제공되어 있다.

도 6은 다른 형태의 항원 제시 세포(APC)가 NK T 세포 활성화 분석에 이용시 다양한 효능의 세라마이드-유사 당지질의 차별적 제시를 나타낸다. 8개의 선택된 세라마이드-유사 당지질에 반응한 NK T 하이브리도마 DN32D3에 의한 IL-2 생성은 항원 제시 세포로서 다른 세포 형태를 이용하여 측정되었다. RMA-S.mCD1d는 쥐과 CD1d를 발현하도록 트랜스펙트된 마우스 림프종 라인이었다. JAWS Ⅱ는 마우스 CD1d를 자연적으로 발현하는 마우스 수지상 세포 라인이다. HeLa.hCD1d는 인간 CD1d를 발현하도록 트랜스펙트된 인간 자궁경부 암종 세포주이다. 분석은 도 5a에 기술된 결과에 대해 상기 기술된 바와 동일한 방식으로 수행되었다.

예를 들어 YTC03-17이 림프구 세포주(RMA-S) 상에 발현되는 CD1d 분자에 의해 제시되는 경우 KRN7000보다 현저하게 더 유효한 반면 이들 두 화합물은 상피 종양 세포주(HeLa) 상에서 발현되는 CD1d 분자에 의해 거의 동일하게 제시됨을 주지해야 한다. 수지상 세포주(JAWS-Ⅱ)는 항원 제시 세포로 이용되는 경우 YTC03-17에 대한 반응이 거의 없거나 전혀 없다. 비페닐 치환이 활성 화합물을 생성할 수 있다는 증명에 추가하여 본 연구는 화합물이 제시되는 CD1d를 지닌 세포 형태에 따라 현저하게 달라짐을 나타낸다.

또한 도 6은 일부 분석시 증가된 유효성을 나타낸 아날로그를 포함한 추가적 페닐을 나타낸다. 다시 결과는 이용된 항원 제시 세포의 형태에 매우 의존적이다. 예를 들어 YTCO3-3O이 HeLa 세포에 의해 제시되는 경우 독특한 유효성을 지니나 RMA-S 세포에 의해 제시되는 경우 KRN7000과 유사한 유효성을 지님을 주지해야 한다.

도 7은 지방산 사슬이 포화되는 경우 N-결합된 지방산 길이의 변이 효과를 나타낸다. 이러한 특정 시스템 내에서 C12 길이에서 발생하는 최적 활성으로 유효성 상의 사슬 길이의 명확한 작용이 나타남을 주지해야 한다. 항원-제시 세포의 특성을 변화시킴으로서 이러한 효과가 어떻게 영향을 받게 될 것인지는 연구되어야 한다. 도 8은 지방산 길이가 C20으로 일정하게 유지되는 경우 지방산 사슬 내의 불포화 도입 효과를 나타낸다. 매우 증가된 유효성을 지닌 이중불포화 아날로그(DB03-4)로 유효성 상의 극적인 효과가 관찰된다. 다시, 항원-제시 세포의 특성을 변화시킴으로서 이러한 효과가 어떻게 영향을 받게 될 것인지는 연구되어야 한다. 각 아날로그의 상대 유효성은 도 5a에 기재된 결과에 대해 상기 기술된 바와 같이 마우스 NK T 세포 하이브리도마 DN3A4.1-2에 의한 IL-2 생성을 측정함으로서 측정되었다.

도 8은 C20 지방산 세라마이드-유사 당지질의 유효성 상의 지방산 사슬 불포화의 효과를 나타낸다. 나타낸 사슬 길이 및 나타낸 이중 결합 수를 지닌 세라마이드-유사 당지질은 도 7에 기재된 결과에 대해 상기 기술된 바와 같이 마우스 NK T 세포 하이브리도마 DN3A4.1-2에 의한 IL-2 생성을 측정함으로서 NK T 하이브리도마 DN32.D3의 자극에 대해 시험되었다.

KRN7000 아날로그의 가장 흥미로운 유효성은 일부의 경우 이들이 모화합물로의 자극 후 발생하는 것과 질적으로 다른 면역 반응을 유도한다는 점이다. 이는 Yamamura와 동료들에 의해 공개된 스핑고신 사슬 길이 변이체 OCH(Miyamoto et al., 2001)의 경우에 나타나 있다. 이러한 경우 OCH가 마우스 생체 내에 투여시 인터루킨-4(IL-4)의 선택적 생성을 유도하고 KRN7000의 주입 후 관찰되는 인터페론-γ의 강한 생성을 자극하는데 실패하였음을 나타내었다. 이러한 NK T 세포에 의한 IL-4 생성의 선택적 활성화는 중추신경계 자가면역질환의 EAE 모델 내에서의 OCH의 증가된 치료적 효과에 대한 기초가 됨이 제안되었다. 본 발명자들은 본 발명의 세라마이드-유사 당지질 일부를 이용하여 NK T 세포 반응 특성 상의 유사한 생체 내 효과를 관찰하였다. 도 9에 나타난 바와 같이 불포화된 C20 지방산을 함유한 2개의 세라마이드-유사 당지질(DB03-4 및 DB03-5)은 마우스 내 주입 2시간 후 강한 IL-4 반응을 유도한다. 이들 반응은 KRN7000(C26 대신 C24 지방산, 그 외는 동일함)과 구조적으로 거의 동일하고 연구 중 그의 활성 측면에서 구별 불가능한 아날로그인 DB01-1에 나타난 바와 동일하다. 그러나 DB01-1이 주입 20시간 후 강한 IFNγ 반응도 유발한 반면 IFNγ의 이러한 후기 파동은 2개의 C20 세라마이드-유사 당지질에서는 나타나지 않았다. 이러한 선택적 IL-4 유도는 OCH 아날로그에 대해 보고된 것과 실질적으로 동일하고, 따라서 생체 내 질적으로 다른 면역조절 효과를 유도하는 KRN7000의 아미노 치환된 아날로그의 잠재성을 나타낸다. 도 9에 나타난 결과는 C57BL/6 마우스에 DBOl-1, DB03-4, 또는 DB03-5의 단일 주입 투여 후 IL-4 및 IFNγ의 혈청 수치를 측정함으로서 수득되었다. C57BL/6 마우스(11∼13주령)는 4.8 나노몰의 세라마이드-유사 당지질 또는 PBS/운반체 대조군의 단일 복강내 주사가 제공되었다. 혈청 사이토카인 수치는 포획 ELISA에 의해 2 및 20시간 후 측정되었다. 바는 3마리의 표준편차를 지닌 평균을 나타낸다.

도 11은 CD40L 발현 자극시 다양한 KRN7000 아날로그의 차별적 효과를 나타낸다. 또한 도 11은 갈락토스를 대체한 프록토스를 지닌 DB03-8이 CD40L을 유도하는 것이 가능하였기 때문에 이들 세라마이드 화합물의 갈락토스 모이어티가 동일한 활성을 보유하면서 또다른 단당류로 대체될 수 있음을 나타낸다. 도 11에 나타난 세라마이드-유사 당지질에 의한 CD40L의 상향조절은 0.5 μM의 세라마이드-유사 당지질의 존재시 NK T 하이브리도마 DN3A4.1-2와 RMA-S/CD1d 세포를 2 : 1 비율로 18시간 인큐베이트함으로서 수득되었다. 이후 세포는 재현탁되었고 CD5 및 CD40L에 특이적인 mAbs로 표지되었다. CD40L의 수치는 CD5 염색에 대해 게이트된(gated) 집단의 FACS 분석에 의해 측정되었다.

또한 α-글루코실세라마이드 DB02-1에 의한 CD1d-의존성 증식의 자극을 나타내는 5d도 참조. DB02-1은 IFNγ 및 IL-4 모두를 포함한 유의적인 사이토카인 생성도 자극시켰다. 흥미롭게는 시험관 내 비세포 배양액 내에서 DB02-1에 반응하여 생성되는 IFNγ 수치가 아날로그의 모든 농도에서 DB01-1에 의해 자극되는 것보다 현저하게 저하된 반면 IL-4 수치는 100 μM 이상의 용량과 거의 동일하였다. 이는 DB02-1이 TH2-편향된 사이토카인 반응을 자극하는 잠재성을 지닌 NKT 세포 작용제임을 나타낸다.

IL-4의 선택적 증가가 많은 자가면역질환의 셋팅시 보호제 또는 치료제가 될 수 있다는 광범위하게 유지되는 믿음을 기반으로 본 발명자들은 당뇨병 성향의 NOD 마우스 내 DB03-4 및 DB03-5와 같은 화합물의 효능을 조사하는 연구를 개시하였다. 이러한 연구는 본 발명의 세라마이드-유사 당지질이 NOD 마우스 내 당뇨병 예방에 KRN7000 및 KRN7000-의태 DB01-1보다 우수함을 나타낸다(도 10). 도 10은 제1형 당뇨병이 세라마이드-유사 당지질로 치료된 NOD 마우스 내에서 지연되거나 예방될 수 있음을 나타낸다. 도 10에 나타난 결과는 5주령부터 시작된 9∼12마리의 암컷 NOD 마우스로 구성된 3개 그룹을 세라마이드-유사 당지질로 치료함으로서 수득되었다. 나타낸 세라마이드-유사 당지질(DB03-4, DB03-5 또는 KRN7000)은 200 마이크로그램/kg의 용량으로 주1회 복강내 주사되었다. 치료는 11주령에 중단되었고 마우스는 당뇨(상단) 및 사망(하단)에 대해 매주 모니터되었다.

세라마이드-유사 당지질로의 행체 내 마우스 치료 관련 실험에 있어서, 세라마이드-유사 당지질은 0.2 ml PBS + 0.025% Tween-20 또는 운반체 단독 내에서 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 투여되었다. 일반적 용량은 주사 당 동물 당 약 4∼5 nM이다. 복강내, 정맥내 또는 경구 경로에 의한 α-갈락토실세라마이드를 마우스에 투여하는 대표적 참고문헌은 S. Sharif et al., Activation of natural killer T cells by alpha- galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes, Nat Med., Sep. 7, 2001, (9):1057-62 및 K. Miyamoto et al., A synthetic glycohpid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells, Nature Oct. 4, 2001, 413(6855):531-4이다.

이들 연구는 신규한 면역학적으로 활성인 αGalCer의 아날로그 패널을 확인하였다. 이들 화합물은 이러한 패밀리의 선행 연구되고 잘-문헌화된 원형인 KRN7000과는 구조면에서 유의적으로 다르다. 본 발명자는 질환의 예방 및 치료의 다양한 적용을 위해 이들을 더 우수한 작용제로 만드는 특정 아날로그의 많은 중요한 특성을 이미 증명하였다. 또한 이들 화합물은 알레르기질환에 대한 면역치료용 또는 암의 치료용 백신에 대한 자극 반응에 대한 보조제로서도 유용하다.

상기 관점에서 본 발명의 일부 장점이 달성되고 또다른 장점이 성취되는 것으로 나타날 것이다.

본 발명의 정신에 위배됨이 없이 다양한 변화가 상기 방법 및 조성물에서 이루어질 수 있기 때문에 상기 명세서 내에 포함되고 수반된 도면에 나타난 모든 기재사항은 한정적인 것이 아닌 예시적인 것으로 해석되어야 한다.

본 출원서 내에 인용된 모든 문헌은 참고문헌에 포함된다. 본 참고문헌의 논의는 저자에 의해 이루어진 주장을 요약한 것에 불과하고 참고문헌이 당분야를 구성한다는 권한은 이루어지지 않는다. 본 출원인은 인용문헌의 정확성 및 적절성에 이의를 제기하는 권한을 보유한다.

Claims (50)

1. 식 Ⅰ을 포함한 α-갈락토실세라마이드:

   

   식 Ⅰ

   상기 식에서

   R1은 -(CH₂)₉CH=CH-CH₂-CH=CH(CH₂)₄CH₃,

   -(CH₂)₃CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH=CH-(CH₂)₄CH₃,

   -(CH₂)₃CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂-CH₃,

   -(CH₂)₇CH=CH-CH₂-CH=CH-(CH₂)₄-CH₃에서 선택된 치환기 이고;

   R2는 -CH(OH)(CH₂)₁₃CH₃ 이다.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 이중 결합은 시스(cis)임을 특징으로 하는 α-갈락토실세라마이드
4. 제 1항에 있어서, 상기 α-갈락토실세라마이드는 하기 구조식을 지님을 특징으로 하는 α-갈락토실세라마이드

   
5. 제 1항에 있어서, 상기 α-갈락토실세라마이드는 하기 구조식을 지님을 특징으로 하는 α-갈락토실세라마이드

   
6. 제 1항에 있어서, 상기 α-갈락토실세라마이드의 농도는 동일한 농도의 KRN7000에 의해 유도되는 것과 동일하거나 더 높은 수치로 NK T 세포에 의한 사이토카인 생성을 유도하는 것이 가능함을 특징으로 하는 α-갈락토실세라마이드
7. 제 6항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-4 및 IFNγ로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 α-갈락토실세라마이드
8. 제 6항에 있어서, 상기 사이토카인은 림프구 항원-제시 세포를 이용하여 유도됨을 특징으로 하는 α-갈락토실세라마이드
9. 제 6항에 있어서, 상기 사이토카인은 골수계 수지상 항원-제시 세포를 이용 하여 유도됨을 특징으로 하는 α-갈락토실세라마이드
10. 제 6항에 있어서, 상기 사이토카인은 상피 항원-제시 세포를 이용하여 유도됨을 특징으로 하는 α-갈락토실세라마이드
11. 제 1항에 있어서, 상기 α-갈락토실세라마이드의 농도는 동일한 농도의 KRN7000에 의해 유도되는 것과 동일하거나 더 높은 수치로 NK T 세포에 의한 CD40L 발현을 유도하는 것이 가능함을 특징으로 하는 α-갈락토실세라마이드
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31. 제 1항 또는 제 3항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 α-갈락토실세라마이드를 유효 성분으로 함유하고 수지상 세포 및 약제학적으로 수용 가능한 부형제를 포함하는 자가면역질환, 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물
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33. 제 1항 또는 제 3항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 α-갈락토실세라마이드를 유효 성분으로 함유하는 자가면역질환, 암 또는 감염성 질환의 예방을 위한 포유류 투여용 백신 조성물
34. 제 1항 또는 제 3항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 α-갈락토실세라마이드와 NK T 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 NK T 세포의 시험관 내 활성화 방법
35. 제 34항에 있어서, 상기 NK T 세포는 상기 α-갈락토실세라마이드와의 접촉시키는 단계 후 증가된 사이토카인 생성을 나타냄을 특징으로 하는 시험관 내 활성화 방법
36. 제 35항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-4 및 IFNγ로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 시험관 내 활성화 방법
37. 제 34항에 있어서, 상기 NK T 세포는 상기 α-갈락토실세라마이드와의 접촉시키는 단계 후 증가된 CD40L 발현을 나타냄을 특징으로 하는 시험관 내 활성화 방법
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43. 제 1항 또는 제 3항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 α-갈락토실세라마이드를 유효 성분으로 함유하는 포유류 내의 자연살해(NK) T 세포를 자극시키기 위한 조성물
44. 제 43항에 있어서, 상기 포유류는 암을 지님을 특징으로 하는 조성물
45. 제 43항에 있어서, 상기 포유류는 제1형 당뇨병을 지님을 특징으로 하는 조성물
46. 제 1항 또는 제 3항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 α-갈락토실세라마이드를 유효 성분으로 함유하고 포유류 내에서 자가면역질환, 암 또는 감염의 예방 및 치료를 위한 조성물
47. 제 46항에 있어서, 상기 자가면역질환은 제1형 당뇨병, 중증근육무력증, 심상성천포창, 전신성 홍반성 낭창, 길랭-바레 증후군, 항인지질항체 증후군, 구드패스츄어 증후군, 이식편대숙주병, 다발성 경화증, 원발성 담즙성 간경변, 피부경화증, 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 류마티스 관절염, 사구체 신염, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 건선, 쇼그렌병에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물
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