KR101374248B1 - 세포성 면역반응 증가를 위한 항원의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 T 세포의 항원 특이성을 증가시켜 바이러스 관련 질환 또는 종양에 대한 면역치료에 사용할 수 있는 세포성 면역반응의 증가를 위한 항원 제조방법에 관한 것으로, 전혀 다른 단백질 분해 메커니즘에 관여하는 유비퀴틴과 오르니틴 디카르복실라아제를 바이러스 항원 또는 종양항원에 동시에 융합시키고, RNA 형태로 수지상세포에 도입함으로써 T 세포에 대한 항원성을 높여 다양한 바이러스 질환 또는 종양에 대한 우수한 면역치료법을 제공하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 T 세포의 항원 특이성을 증가시켜 바이러스 관련 질환 또는 종양에 대한 면역치료에 사용할 수 있는 세포성 면역반응 증가를 위한 항원의 제조방법에 관한 것이다.
사람 사이토메갈로바이러스(Human cytomegalovirus, HCMV)는 대다수 집단에서 나타나며(60-90%), 줄기세포 이식 수혜자 및 HIV-양성체 같은 면역저항성 감약숙주에서 심각한 질병을 유발한다. HCMV가 어떤 종류의 세포 타입에서는 바이러스 잠복 상태로 들어갈 수도 있긴 하나, 동물 모델 및 면역이 저하된 사람에서의 연구에 따르면 세포 면역 반응이 HCMV 관련 질환에 대한 보호에 중요한 요소임을 제안하고 있다. CD8+ T 세포는 바이러스 복제를 조절함에 있어 특히 중요하며, 바이러스 유전자 산물인 pp65는 CD8+ T 세포반응의 면역우성 표적이다. 몇몇 연구자들은 HCMV-특이 T 세포의 확대방법(expansion method)을 개발하고, 입양 전달을 수행한 바 있다. 임상실험을 위해 인 비트로에서 HCMV에 특이적인 세포독성 T 세포(CTLs)를 자극하기 위해 섬유아세포, 림포블라스토이드 세포주(LCLs) 및 수지상세포를 모두 사용하였다. 비록 입양 면역치료법이 지배적인 접근법이기는 하나, 향후 임상실험의 성공을 향상시키기 위해서는 CTL 발생 프로토콜의 최적화가 여전히 요구되는 실정이다.
항원 프로세싱 및 제시는 T 세포 활성화에 필요한 면역치료적 전략을 위한 중요한 단계이다. 프로테아좀은 펩타이드 발생 후 MHC 클래스 I 분자 제시 경로를 위한 항원 프로세싱과 관련된 전달체에 의해 ER로 옮겨지도록 하는 중심 세포질 프로세싱 단위이다. 프로테아좀은 19S 서브유닛을 통해 유비퀴틴화된 단백질을 인식하고, 풀며, 단백질 가수분해를 위해 20S 서브유닛에 이들 기질의 탈유비퀴틴화된 형태를 표적화한다. 세포 면역을 피하기 위해, 몇몇 바이러스들은 MHC 클래스 I 분자에 의해 바이러스 펩타이드를 CTLs에 제시하는 것을 억제하기 위한 방법으로서 단백질의 프로테아좀 분해를 방해하는 메커니즘을 발전시켜왔다.
단백질은 보통 직접적인 인식 및 프로테아좀에 의한 분해를 위한 유비퀴틴화를 겪는다. 유비퀴틴 프로테아좀 시스템은 다수의 생물학적 과정, 예를 들어, 세포 주기 진행, 세포 분화, 신호 전달, DNA 회복, 세포사멸 및 스트레스 반응 등에서 중요한 역할을 담당한다. 또한, 항원제시세포의 표면에서 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시되고, CD8+ T 세포에 의해 인식되는 항원 펩타이드는 Ub 프로테아좀 시스템에 의해 단백질분해적으로 생성된다. 프로테아좀에 의한 표적 단백질의 분해를 가능케 하기 위해, 돌연변이시킨 N-말단 Ub 모이어티를 갖는 인위적으로 융합된 단백질들이 개발되었고, 이 과정은 Ub 융합 분해 경로라 부른다. 이 접근은 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시된 항원 펩타이드의 생성을 향상시키기 위해 효과적으로 CTL 반응을 유도하도록 마우스에서 유전자 백신 및 mRNA-감염된 수지상세포 백신을 적용하였다. 아데노바이러스 트랜스유전자에서 항원에 Ub 서열을 부가함으로써 마우스의 생체 내에서 CD8+ T 세포 면역원성을 향상시키고, 인 비트로에서 사람 수지상세포에 의해 코딩된 펩타이드의 HLA 클래스 I에 의해 제한된 제시를 증가시켰다. 유비퀴틴화된 항원이 감염된 인공 APC는 또한 항원-특이 CD8+ T 세포를 효과적으로 준비하고 증식시킨다.
한편, 어떤 단백질은 유비퀴틴화를 요구하지 않고 프로테아좀에 의해 분해되는 것으로 생각된다. 예를 들어, 사이클린 의존성 키나아제 억제제 p21Cip1, 트로포닌 및 ornithine decarboxylase (ODC)가 있다. ODC는 Ub 독립적인 방식으로 분해된 단백질 중 가장 잘 연구된 예이며, 폴리아민 생합성을 위한 대사 경로에서 1차 및 율속효소이다. 폴리아민은 정상 세포 성장을 위해서는 필수적이나 과량인 경우 세포독성이 있기 때문에, 세포들은 폴리아민의 농도를 빠르게 및 순간적으로 증가시키는 방식을 개발하였다. 26S 프로테아좀의 대부분의 기질은 폴리-Ub 사슬에 결합되어 인식되나, ODC는 26S 프로테아좀의 작용에 의해 Ub의 요구 없이 분해된다. 대신, ODC는 독특하게 폴리아민에 의해 유도된 단백질, 일명 안티자임과 반응하여 분해 표적이 된다. ODC의 N-말단에 융합된 키메라 융합 단백질은 ODC의 프로테아좀 의존성 분해 및 세포성 표적 단백질과의 상호작용을 촉진한다.
항원의 프로테아좀성 분해를 향상시키고 면역 반응을 증가시키는 Ub 또는 ODC의 보고가 있다고는 하나, Ub 및 ODC 간의 직접적인 비교는 아직까지 실행된 바 없다.
본 발명의 목적은 T 세포에 대한 항원성을 높여 면역치료를 개선하기 위한 전략으로써 단백질 분해에 관련된 단백질과 바이러스 항원 또는 종양항원을 융합시킨 융합 항원을 이용한 면역치료법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이러스 항원 또는 종양항원에 유비퀴틴(Ubiquitin, Ub) 및 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)가 동시에 결합되어 있는 융합 항원을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 항원을 발현하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 항원 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 질환 또는 종양의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 항원을 코딩하는 유전자 또는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 항원-제시세포를 제공한다.
본 발명은 또한 MHC 클래스 I 분자 및 본 발명의 융합 항원 간의 복합체가 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에 제시된 항원-제시세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원-제시세포를 포함하는 바이러스성 질환 또는 종양 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원-제시 세포에 제시되는, MHC 클래스 I 분자 및 본 발명의 융합 항원 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 림프구를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 항원을 발현하는 항원-제시 세포를 이용하여 T 림프구를 자극하는 단계를 포함하는 세포독성 T 림프구의 in vitro 유도방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 세포독성 T 림프구를 포함하는 바이러스 질환 또는 종양의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 전혀 다른 단백질 분해 메커니즘에 관여하는 유비퀴틴과 오르니틴 디카르복실라아제를 바이러스 항원 또는 종양항원에 동시에 융합시키고, RNA 형태로 수지상세포에 도입함으로써 T 세포에 대한 항원성을 높여 다양한 바이러스 질환 또는 종양에 대한 우수한 면역치료법을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 유비퀴틴 및/또는 오르니틴 디카르복실라아제에 융합된 EGFP의 발현을 나타낸 것으로, (A) Ub-EGFP 작제물과 (B) Ub- 및/또는 ODC-융합된 EGFP 작제물을 형질감염 시킨 LCL의 플로우 사이토메트리 분석 결과이고, (C)는 프로테아좀 억제제인 MG132 부재 또는 존재 하에서, Ub- 및/또는 ODC-융합된 EGFP 작제물을 형질감염 시킨 293 세포의 플로우 사이토메트리 분석결과이다.
도 2는 Ub(G), Ub(A), 또는 Ub(V)와 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA를 전기충격 시킨 수지상세포에 의한 CD8+ T 세포의 자극을 나타낸 것으로, (A)는 Ub-pp65 작제물을 도시한 것이고, (B)는 IFN-γ ELISPOT 분석결과이며, Mock DC는 mock로 전기충격 시킨 수지상세포를 의미하고, 별표는 Student t test에 의해 측정될 때, DC/pp65에 비해 통계적으로 유의적인 차이를 뜻한다(*p<0.05).
도 3은 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA를 전기충격 시킨 수지상세포에 의한 CD8+ T 세포의 자극을 나타낸 것으로, (A)는 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 도시한 것이고, (B)는 pp65 (레인 1 및 5), Ub(G)-pp65 (레인 2 및 6), pp65-ODC (레인 3 및 7), 및 Ub(G)-pp65-ODC (레인 4 및 8)를 발현하는 293 세포의 항-pp65 단클론 항체로 염색한 웨스턴 블랏팅 결과이며, (C)는 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 전기충격 시킨 8명의 다른 공여자 유래의 수지상세포를 나타낸 것이다.
도 4는 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 전기충격 시킨 수지상세포의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극을 나타낸 것으로 IFN-γ ELISPOT 분석 결과이며, 별표는 pp65에 비해 통계적으로 유의한 차이가 있음을 뜻하고(*p<0.05), 2개의 별표는 상기 그룹과 pp65, Ub(G)-pp65, 및 pp65-ODC 그룹 간의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(**p<0.05).
도 5는 미성숙 또는 성숙 상태에서 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 전기충격 시킨 수지상세포에 의한 CD8+ T 세포의 자극을 나타낸 것으로, (A)는 EGFP RNA로 전기충격 시킨 수지상세포 및 이들 세포에서 EGFP 발현에 대한 FACS 분석 결과이고(실선 그림), (B)는 각 상태에서 수지상세포의 표현형 분석에 사용된 플로우 사이토메트리 결과이며, (C)는 IFN-γ ELISPOT 분석을 위해 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 전기충격 시킨 수지상세포이고, (D)는 W6/32 mAb 를 사용하여 수행한 MHC 클래스 I 블록킹 연구 결과이며, 별표는 W6/32 mAb의 유무에 따른 각 수지상세포의 상태 간의 통계적으로 유의적인 차이를 뜻한다(*p<0.05).
도 6은 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 전기충격 시킨 수지상세포에 의한 pp65 특이 CTL의 인 비트로 발생을 나타낸 것으로, (A)는 pp65에 융합된 Ub 및/또는 ODC를 코딩하는 mRNA에 의해 형질도입된 수지상세포를 사용하여 반응 T 세포를 자극시킨 후 증식 능력의 측정 결과와, 형질전환체 세포주인 K562/HLA-A*0201, 펄스되지 않은 K562/HLA-A*0201 또는 pp65 펩타이드를 펄스시킨 K562/HLA-A*0201/pp65 pep를 IFN-γ ELISPOT 분석(B) 및 크롬 방출 분석(C)을 위한 표적세포로 형질전환체 세포주인 K562/HLA-A*0201, 펄스되지 않은 K562/HLA-A*0201 또는 pp65 펩타이드를 펄스시킨 K562/HLA-A*0201/pp65 pep를 사용한 결과이며, Mock DC는 mock로 전기충격 시킨 수지상세포를 의미하고, 별표는 pp65에 비해 통계적으로 유의적인 차이를 뜻하고(*p<0.05), 2개의 별표는 상기 그룹과 pp65, Ub(G)-pp65, 또는 pp65-ODC 그룹 간의 통계적으로 유의적인 차이를 나타낸다(**p<0.05).
도 2는 Ub(G), Ub(A), 또는 Ub(V)와 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA를 전기충격 시킨 수지상세포에 의한 CD8+ T 세포의 자극을 나타낸 것으로, (A)는 Ub-pp65 작제물을 도시한 것이고, (B)는 IFN-γ ELISPOT 분석결과이며, Mock DC는 mock로 전기충격 시킨 수지상세포를 의미하고, 별표는 Student t test에 의해 측정될 때, DC/pp65에 비해 통계적으로 유의적인 차이를 뜻한다(*p<0.05).
도 3은 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA를 전기충격 시킨 수지상세포에 의한 CD8+ T 세포의 자극을 나타낸 것으로, (A)는 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 도시한 것이고, (B)는 pp65 (레인 1 및 5), Ub(G)-pp65 (레인 2 및 6), pp65-ODC (레인 3 및 7), 및 Ub(G)-pp65-ODC (레인 4 및 8)를 발현하는 293 세포의 항-pp65 단클론 항체로 염색한 웨스턴 블랏팅 결과이며, (C)는 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 전기충격 시킨 8명의 다른 공여자 유래의 수지상세포를 나타낸 것이다.
도 4는 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 전기충격 시킨 수지상세포의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극을 나타낸 것으로 IFN-γ ELISPOT 분석 결과이며, 별표는 pp65에 비해 통계적으로 유의한 차이가 있음을 뜻하고(*p<0.05), 2개의 별표는 상기 그룹과 pp65, Ub(G)-pp65, 및 pp65-ODC 그룹 간의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(**p<0.05).
도 5는 미성숙 또는 성숙 상태에서 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 전기충격 시킨 수지상세포에 의한 CD8+ T 세포의 자극을 나타낸 것으로, (A)는 EGFP RNA로 전기충격 시킨 수지상세포 및 이들 세포에서 EGFP 발현에 대한 FACS 분석 결과이고(실선 그림), (B)는 각 상태에서 수지상세포의 표현형 분석에 사용된 플로우 사이토메트리 결과이며, (C)는 IFN-γ ELISPOT 분석을 위해 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 전기충격 시킨 수지상세포이고, (D)는 W6/32 mAb 를 사용하여 수행한 MHC 클래스 I 블록킹 연구 결과이며, 별표는 W6/32 mAb의 유무에 따른 각 수지상세포의 상태 간의 통계적으로 유의적인 차이를 뜻한다(*p<0.05).
도 6은 Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 전기충격 시킨 수지상세포에 의한 pp65 특이 CTL의 인 비트로 발생을 나타낸 것으로, (A)는 pp65에 융합된 Ub 및/또는 ODC를 코딩하는 mRNA에 의해 형질도입된 수지상세포를 사용하여 반응 T 세포를 자극시킨 후 증식 능력의 측정 결과와, 형질전환체 세포주인 K562/HLA-A*0201, 펄스되지 않은 K562/HLA-A*0201 또는 pp65 펩타이드를 펄스시킨 K562/HLA-A*0201/pp65 pep를 IFN-γ ELISPOT 분석(B) 및 크롬 방출 분석(C)을 위한 표적세포로 형질전환체 세포주인 K562/HLA-A*0201, 펄스되지 않은 K562/HLA-A*0201 또는 pp65 펩타이드를 펄스시킨 K562/HLA-A*0201/pp65 pep를 사용한 결과이며, Mock DC는 mock로 전기충격 시킨 수지상세포를 의미하고, 별표는 pp65에 비해 통계적으로 유의적인 차이를 뜻하고(*p<0.05), 2개의 별표는 상기 그룹과 pp65, Ub(G)-pp65, 또는 pp65-ODC 그룹 간의 통계적으로 유의적인 차이를 나타낸다(**p<0.05).
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 바이러스 항원 또는 종양항원에 유비퀴틴(Ubiquitin, Ub) 및 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)가 동시에 결합되어 있는 융합 항원에 관한 것이다.
본 발명자들은 주요조직적합복합체(MHC) 클래스 I 분자로의 항원 제시능을 높이기 위해 프로테오좀 성 단백질 분해에 관여하는 유비퀴틴과, 유비퀴틴 독립 시스템, 예를 들어 오르니틴 디카르복실라아제를 바이러스 항원 또는 종양항원에 결합시켜 융합 항원을 제조하여 항원 특이적인 면역 반응을 증가함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 융합 항원은 공지의 바이러스 항원 또는 종양항원에 유비퀴틴과 오르니틴 디카르복실라아제를 동시에 결합시킴으로써 상기 바이러스 항원 또는 종양항원의 프로테오좀 표적화를 높여 효과적으로 분해시키는 것을 특징으로 한다. 놀랍게도 유비퀴틴과 오르니틴 디카르복실라아제에 의한 단백질 분해는 경쟁적이지 않고 시너지 효과를 도출한다.
또한, 본 발명의 융합 항원은 세포독성 T 림프구, 보다 바람직하게는 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 자극을 향상시키는 데 이는 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시되는 항원 펩타이드의 생성을 향상시킨 결과에서 기인한다. 다시 말해, 본 발명의 융합 항원은 MHC 클래스 I 경로에 의한 효과적인 항원 제시를 통해 T 세포의 직접적인 자극뿐만 아니라 인 비트로에서 항원-특이 T 세포의 발생을 증가시킨다.
본 발명의 융합 항원에 결합되는 유비퀴틴은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 아미노산 서열 중 1 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 변이 서열을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 오르니틴 디카르복실라아제는 포유동물 및 진균 유래의 C-말단에 있는 시그널 도메인을 사용할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 아미노산 서열 중 1 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 변이 서열을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 명세서에서, "아미노산 서열 중 1 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 변이 서열"이란 인위적으로 제작한 소위 개변단백질이나, 단백질을 코딩하는 DNA에 일반적으로 보이는 다형, 변이나 수식반응 등에 의해 얻어지는 기능적으로 동등한 특성을 갖는 단백질의 아미노산 서열을 의미하고, 이 변이 단백질을 코딩하는 DNA는 부위특이적 변이유발이나 PCR법 등으로 제조할 수 있다. 또한, 여기에서 치환, 결실 또는 부가되는 아미노산 잔기의 수는 상기의 부위특이적 변이 유발 등의 공지된 방법에 의해 치환, 결실 또는 부가할 수 있는 정도의 수를 가리킨다.
또한, 본 명세서에서 "기능적으로 동등한 특성을 갖는 유도체"란 상기 유비퀴틴과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 것으로, 구체적으로, 상기 펩타이드 중의 일부의 아미노산 잔기를 치환, 결실 또는 부가한 유도체, 및 이 펩타이드 또는 이 펩타이드의 일부의 아미노산 잔기를 치환, 결실 또는 부가한 유도체의 아미노기 또는 카르복실기를 수식한 유도체를 의미한다.
상기 펩타이드 중의 일부의 아미노산 잔기를 치환, 결실 또는 부가한 유도체로서는, 바람직하게는, 바이러스 항원 또는 종양항원 펩타이드 중에서 세포독성 T 림프구(CTL)와의 결합에 관여하는 에피토프 영역은 보존되고, MHC 클래스 I 또는 II 항원과의 결합에 관여하는 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 유도체를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 그 유도체로 하나의 아미노산 잔기만을 치환한 것을 들 수 있다(Immunol.84:298-303, 1995 참조).
이와 같은 유도체는, 시판되는 펩타이드 합성기로 용이하게 합성가능하고, 합성된 유도체의 MHC 클래스 I 분자와의 결합친화성은 이 유도체와 방사성 동위원소로 표식된 표준 펩타이드와의 MHC 클래스 I 또는 II 분자로의 결합의 경합저해조합에 의해, 무세포계로 용이하게 측정할 수 있다(R.T.Kubo 외, J.Immunol.,152:3913, 1994). 따라서, 제작한 여러 가지의 펩타이드 유도체를 이 조합에 이용함으로써, CTL 유도활성을 갖는 펩타이드 유도체를 용이하게 선택할 수 있다. 이와 같이 하여 선택된 펩타이드 유도체는, CTL 과의 결합성은 그대로 유지하면서, MHC 클래스 I 또는 II 분자에 의해 강하게 결합가능하기 때문에, 더욱 유용한 종양항원 펩타이드로 적용할 수 있다.
아미노기의 수식기로서는, 예를 들면 아실기를 들 수 있고, 구체적으로는 탄소수 1 내지 6 의 알카노일기, 페닐기로 치환된 탄소수 1 내지 6 의 알카노일기, 탄소수 5 내지 7 의 시클로알킬기로 치환된 카르보닐기, 탄소수 1 내지 6 의 알킬술포닐기, 페닐술포닐기 등을 들 수 있다.
카르복실기의 수식기로서는, 예를 들면 에스테르기 및 아미드기를 들 수 있고, 에스테르기의 구체예로서는, 탄소수 1 내지 6 의 알킬에스테르기, 페닐기로 치환된 탄소수 1 내지 6 의 알킬에스테르기, 탄소수 5 내지 7 의 시클로알킬에스테르기 등을 들 수 있고, 아미드기의 구체예로서는, 아미드기, 탄소수 1 내지 6 의 알킬기 하나 또는 2 개로 치환된 아미드기, 페닐기로 치환된 탄소수 1 내지 6 의 알킬기 하나 또는 2 개로 치환된 아미드기, 아미드기의 질소원자를 함유하여 5 내지 7 원의 아자시클로알칸을 형성하는 아미드기 등을 들 수 있다.
또한, 상기 바이러스 항원 또는 종양항원은 바람직하게는 종양을 발생하는 항원일 수 있다. 예를 들어, 사람 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr-virus), 사이토메갈로 바이러스 pp65, 단순 포진 바이러스 유형 1과 2, 그리고 인체 포진 바이러스 6, 7 및 8에 의해 암호화된 단백질과 같은 포진 바이러스 등의 바이러스 항원; 또는, T-세포에 의해 인지되는 흑색종 항원(Melanoma Antigen Recognized by T-cell:MART), 티로신 관련 단백질(tyrosine related protein:trp), 흑색종 항원-1(Melanoma Antigen-1:MAGE-1), 흑색종 항원-2(Melanoma Antigen-2:MAGE-2), 흑색종 항원-3(Melanoma Antigen-3:MAGE-3), 100-kDa 글리시리진-결합 단백질(100-kDa Glycyrrhizin-binding protein:gp100), HER-2, PSA, 라스(Ras) 폐암 연관 항원, 다른 종양 특이적 항원, 조직 특이적 항원 또는 종양 연관 항원들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 융합 항원에 있어서, 바람직하게는 바이러스 항원 또는 종양항원의 N-말단에 유비퀴틴이 결합되고, C-말단에는 오르니틴 디카르복실라아제가 동시에 결합되는 것이 좋다. 상기와 같이 결합될 경우 바이러스 항원 또는 종양항원의 프로테오좀 표적화를 높여 효과적으로 분해시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 항원을 발현하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터에 바이러스 항원 또는 종양항원과, 상기 서열번호 1 및 2에 기재된 단백질을 코딩하는 핵산을 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 발현용 벡터로 pcDNA3을 사용하였지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균주 발현용 벡터가 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 재조합 벡터에 의한 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.
숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.
상기 재조합 벡터를 임의의 숙주세포에 도입시킴으로써 형질전환체가 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 융합 항원을 발현하는 재조합 벡터를 대장균 균주 DH5αF1에 도입하여 형질전환체를 제조하였다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 항원 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 질환 또는 종양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 융합 항원을 유효성분으로 함유하는 의약은 예를 들면, 본 발명의 융합 항원을 바이러스 질환 또는 종양 환자 등에게 투여함으로써 바이러스 질환 또는 종양을 치료 또는 예방할 수 있다. 본 발명의 융합 항원이 세포 내에서 MHC 클래스 I 분자와 결합하여, 세포 표면에 고밀도로 제시됨으로써, 바이러스 또는 종양 특이적 CTL이 체내에서 효율적으로 증식하게 되어, 이로써 바이러스 질환 또는 종양의 치료 또는 예방이 달성된다.
본 발명의 융합 항원은 단백질, 이의 단편, 펩타이드, 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 유도체를 단독 또는 2 종 이상을 조합하여 이용할 수 있고, 이들을 유효성분으로 함유하는 의약은, 세포성 면역이 효과적으로 성립되도록 면역 보강제와 함께 투여하거나, 입자상의 제형으로 하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 항원을 코딩하는 유전자는 바이러스 또는 종양-특이적 항원으로 작용하며, 상기 유전자의 발현에 의해 생산되는 융합 항원이 바이러스 또는 종양-특이적 면역 반응을 증강시킴으로써 바이러스 질환 또는 종양 예방 또는 치료에 관여할 수 있다.
본 발명의 유전자를 유효성분으로 함유하는 의약은 예를 들면, 본 발명의 유전자를 바이러스 질환 또는 종양 환자 등에 투여함으로써 세포 내에서 융합 항원 단백질이 고발현되고, 상기 단백질은 프로테오좀성 분해를 거쳐 바이러스 항원 또는 종양항원 펩타이드가 MHC 클래스 I 분자와 결합하여 세포 표면에 고밀도로 제시됨으로써 바이러스 또는 종양 특이적 CTL이 체내에서 효율적으로 증식하게 되어 이로써 바이러스 질환 또는 종양의 치료 또는 예방이 달성된다.
상기 유전자는 DNA 또는 RNA 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 DNA를 투여하여 세포 내에 도입하는 방법으로서는, 바이러스 벡터에 의한 방법을 사용할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바이러스 벡터에 의한 방법으로서는, 예를 들면 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련바이러스, 헤르페스바이러스, 왁시니아바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스바이러스 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에 본 발명의 DNA를 혼합하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 중에서, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 왁시니아바이러스 등을 이용한 방법이 특히 바람직하다.
본 발명의 RNA를 투여하여 세포 내에 도입하는 방법으로서는 전기충격법을 사용할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 유전자를 실제로 의약으로 적용시키기 위해서는, 유전자를 직접 체내에 도입하는 in vivo 법, 및 인체로부터 어떤 종류의 세포를 채집하여 체외에서 유전자를 이 세포에 도입하여 그 세포를 체내로 되돌리는 ex vivo 법이 있다. 보다 바람직하게는 in vivo 법이 좋다.
in vivo 법으로 투여하는 경우에는, 치료 목적의 질환, 증상 등에 따른 적당한 투여경로로 투여될 수 있다. 예를 들어 정맥, 동맥, 피하, 근육내, 경피 주사로 투여될 수 있다. 투여 요법은 단일 투여 또는 다중 투여일 수 있다. 또한, 투여용 조성물은 용액과 같은 다양한 투여 형태로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 통상의 담체를 첨가한 주사 형태로 전형적으로 제조될 수 있다. 또는, 유전자가 리포좀 또는 세포막-융합 리포좀에 함유될 경우에는 현탁액, 동결 약물, 원심분리-농축된 동결 약물 등의 리포좀 제제의 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체 및 희석제는 그 자체로 조성물을 투여받는 개체에 유해한 반응을 일으키지 않는 담체 및 희석제일 수 있다. 구체적으로 담체는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 리포좀, 불활성 바이러스 입자일 수 있으며, 당업자가 필요에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 희석제로는 구체적으로 물, 염수, 글리세롤, 에탄올이 사용될 수 있으며, 습윤제, 유화제, pH 완충제 등이 조성물 중에 포함될 수 있다.
주사용으로 제제화할 경우 적합한 형태는 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 수성용액 또는 분산액 및 멸균분말의 형태일 수 있다. 이들은 제조 조건하에서 안정해야 하고, 세균 또는 진균과 같은 미생물의 오염에 대항하여 보존되어야 한다. 미생물의 오염은 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등을 사용하여 예방할 수 있다. 주사제제에는 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨이 포함될 수 있다. 주사제의 장시간 흡수를 위해, 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물 내 유전자량은 치료할 질병, 환자의 연령과 체중 등에 따라 달라질 수 있으나, 본 발명의 유전자를 수일마다 내지 수개월마다 일반적으로 0.0001 내지 100mg, 바람직하게는 0.001 내지 10mg으로 투여한다.
본 발명의 융합 항원 또는 이를 코딩하는 유전자를 바이러스 질환 또는 종양의 치료에 사용시, 환자의 체내에 특이적인 CTL 을 효율적으로 유도하는 투여 방법을 확립하는 것이 중요하다. 이를 위한 한가지 방법으로, 본 발명의 융합 항원을 코딩하는 유전자 또는 상기 융합 항원을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 항원-제시세포를 제공한다.
본 발명의 융합 항원을 코딩하는 유전자 또는 상기 융합 항원을 발현하는 재조합 벡터를 도입하기 위한 숙주세포로 항원-제시능을 갖는 세포를 사용하는 경우, 바이러스 항원 또는 종양항원을 제시할 수 있는 MHC 클래스 I 분자, 또는 HLA 분자를 세포 표면에 발현하는 세포로서, 예를 들어, 수지상세포, 단핵세포, CD4 T 세포, B 세포, 또는 γδ T(gamma delta T) 세포 등을 사용할 수 있다. 상기 CD4 T 세포, B 세포, 또는 γδ T 세포는 미경험(naive) 상태, 활성화 상태, 또는 증폭(expansion)된 상태인 것을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 수지상세포를 사용할 수 있다.
상기 수지상세포는 마크로파지 보다 약 50배 높은 수준의 MHC 분자들을 발현함으로써 T 수용체의 고용을 위한 더 많은 펩타이드/MHC 리간드를 제공하게 되고 또한 T 세포 활성화에 매우 중요한 고정 분자와 공동분자(costimulatory molecule)를 매우 높은 수준으로 발현한다. T 세포 특이 케모카인을 코드화하는 유전자들 또한 T 세포 반응을 유도하는 수지상세포의 강한 활성도를 더해주어 결과적으로 바이러스 또는 종양 특이 T 세포를 효과적으로 유발할 수 있다.
상기 항원-제시 세포는 예컨대,
말초혈액단핵세포로부터 림프구를 발생시키는 단계; 및
본 발명의 융합 항원을 코딩하는 유전자 RNA를 상기 림프구에 탑재시키는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.
보다 구체적으로 예컨대,
(a) GM-CSF 및 IL-4를 첨가하여 말초혈액단핵세포로부터 미성숙 수지상세포를 유도하는 단계;
(b) 본 발명의 융합 항원을 코딩하는 유전자 RNA를 미성숙 수지상세포에 탑재시키는 단계; 및
(c) 상기 융합 항원 RNA 탑재 수지상세포에 성숙유도인자로 GM-CSF, IL-4, TNF-α 및 LPS를 첨가하여 수지상세포를 성숙시키는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.
본 발명의 융합 항원을 코딩하는 RNA는 융합 항원을 코딩하는 RNA 를 벡터에 주입한 것을 T7 RNA 폴리머라아제와 혼합하여 인 비트로 트랜스크립션을 수행하여 제조할 수 있으며, 벡터로는 pcDNA3 벡터 등을 사용할 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
상기 단계 (b)의 융합 항원 RNA 탑재는 전기충격법(electroporation)을 통해 수행될 수 있으며, 단계 (c)는 성숙 유도인자를 포함하는 성숙화 칵테일에서 미성숙 수지상세포를 12시간 내지 2일, 구체적으로 1일간 배양하는 과정을 거쳐 수행될 수 있다.
상기 수지상세포로의 항원의 전달은 다양한 형태로 이루어져 왔는데, 단백질 또는 펩타이드는 항원 특이 면역 반응을 유도할 수 있으나 바이러스 항원 또는 종양 항원의 제한된 부분만을 제시하므로 강한 면역 반응을 유발하기 어렵고, 바이러스 분쇄물 또는 종양 분쇄물(tumor lysate)은 알려지지 않은 항원까지도 면역반응을 유발할 수 있지만 자가 항원에 대한 면역 반응에 의한 부작용이 일어날 수 있으며, DNA는 유전자 전이 효율이 매우 낮아 항원의 제시가 효과적이지 못하다. 아데노바이러스는 효과적으로 수지상세포로 항원을 전달할 수 있으나 아데노바이러스 생산에 많은 시간과 노동력이 요구된다. 이에 반해 특이 본 발명의 융합 항원의 RNA을 전기충격법으로 수지상세포로 전달할 경우 항원의 높은 전이율을 보이고, 세포독성이 적고, 단백질로 빠르게 발현하며, 임상적으로 적용이 가능하다는 장점이 있다. 또한 RNA 형태로 전달된 융합 항원은 수지상세포에서 MHC 클래스 I분자를 제시함으로써 세포 살해 T 세포와 보조 T 세포를 동시에 활성화시켜 바이러스 항원 또는 종양항원에 대한 특이 면역반응을 극대화 할 수 있는 특징이 있다.
또한, 상기 환자의 체내에 특이적인 CTL 을 효율적으로 유도하는 투여 방법으로 다른 한가지 방법으로, 본 발명은 또한 MHC 클래스 I 분자 및 본 발명의 융합 항원 간의 복합체가 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에 제시된 항원-제시세포를 제공한다.
본 발명의 항원-제시 세포는 본 발명의 융합 항원이 탑재되어 바이러스 또는 종양 특이적인 면역반응을 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서, "탑재 (loading 또는 pulsing)"란 수지상세포와 같은 항원-제시 세포(antigen presenting cell, APC)가 항원을 포획하여 분해한 후 이를 MHC 분자에 실어 표면에 표출하는 것으로써, 이와 같이 항원이 탑재된 세포는 강력한 항원 특이적인 T 림프구의 활성을 유도한다.
상기 항원-제시능을 갖는 세포는 본 발명의 융합 항원을 제시할 수 있는 MHC 클래스 I 분자를 세포 표면에 발현하는 세포로서, 예를 들어, 수지상세포, 단핵세포, CD4 T세포, B 세포, 또는 γδ T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다. 상기 CD4 T 세포, B 세포, 또는 γδ T 세포는 미경험(naive) 상태, 활성화 상태, 또는 확대(expansion)된 상태인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 항원-제시 세포를 제조하기 위해 말초혈액단핵세포에서 항원-제시능을 갖는 세포를 분리하고, MHC 클래스 I 분자와 상기 융합 항원 간의 복합체를 형성하도록 생체 밖에서 본 발명의 융합 항원으로 펄스를 준다. 상기 복합체는 바람직하게는 MHC 클래스 I 분자와 상기 융합 항원의 에피토프(epitope)의 결합 형태이다.
수지상세포를 사용할 경우, 본 발명의 항원-제시 세포는 예를 들어, Ficoll 방법을 이용하여 말초혈액단핵세포에서 림프구를 분리하고, 비유착성 세포를 제거하고, 수지상세포를 유도하기 위해 유착성 세포를 GM-CSF 및 IL-4 존재 하에서 배양하고, 본 발명의 융합 항원으로 상기 수지상세포를 배양, 펄스 자극함으로써 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원-제시세포를 포함하는 바이러스성 질환 또는 종양 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항원-제시 세포를 백신접종하여 면역반응을 유도할 수 있으며, 특히 항원에 대한 세포독성 T 림프구의 반응을 유도하는데 특히 유용하다. 상기 면역반응은 특이적 (T 림프구) 및/또는 비특이적 면역반응일 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 항원-제시 세포를 백신접종하여 바이러스 질환 또는 종양의 저해에 관여하는 것은 Th1 CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구, 또는 이들 둘 다에 의해서일 수 있다.
상기 백신은 바람직하게는 질환 치료용 백신(therapeutic vaccine)일 수 있다.
본 발명의 상기 항원-제시 세포를 활성 성분으로 함유하는 바이러스 질환 또는 종양의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물은 기타 면역조절제와 함께 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 항원-제시 세포와 함께 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체 및/또는 희석제의 종류는 전술한 바와 같다.
또한, 전술한 바와 같이, 본 발명의 또 다른 측면은 인간, 특히 바이러스 질환 또는 암환자에서 항원에 대한 면역반응을 유도하거나, 또는 촉진하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 전술한 바와 같은 백신 조성물 또는 항원-제시 세포 유효량을 바이러스 질환 또는 암환자에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 상태의 치료 및/또는 예방에 관련하여 본 발명의 항원-제시 세포를 사용하는 것에 관계된다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 질병의 예로는 흑색종, 폐암, 유방암, 전립선암 등의 다양한 종류의 종양, 자가 면역 질환 등을 포함한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 항원-제시 세포 백신을 이용하여 바이러스 질환 또는 종양-특이적인 면역반응을 증강시킴으로써 바이러스 질환 또는 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 여기서, 상기 조성물의 투여는, 질병 상태의 발병 또는 진행을 저해하거나, 중지시키거나, 지연시키거나, 예방하는 면역반응을 유도하거나 또 다르게는 촉진한다.
'유효량'은 목적하는 면역반응을 적어도 부분적으로 달성하거나 또는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 이 양은 치료되어야 할 개체의 건강과 물리적 상태, 치료되어야 할 개체의 분류적 군, 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 목적하는 보호의 정도, 백신 제제, 의학적 상황의 평가 및 기타 관련 인자에 따라 달라진다. 이 양은 통상적인 시도를 통해 측정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것으로 예상되며, 예를 들어 신장암 질환의 치료를 위해서 성인 60 ㎏을 기준으로 1회 투여당 2 ×106 내지 2×107세포/주사의 양으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원-제시 세포에 제시되는, MHC 클래스 I 분자 및 본 발명의 융합 항원 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 림프구, 이를 포함하는 조성물, 또는 상기 융합 항원을 발현하는 항원-제시 세포를 이용하여 T 림프구를 자극하는 단계를 포함하는 세포독성 T 림프구의 in vitro 유도방법에 관한 것이다.
본 발명의 세포독성 T 림프구는 본 발명의 종양항원과 MHC 클래스 I 분자 간의 복합체를 인식하여 종양 특이적인 면역반응을 유도하며, 상기 림프구는 자극원 및/또는 항원의 종류에 따라 Th1 CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구, 또는 이들 둘 다일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 비율을 1:2로 혼합하여 유비퀴틴 및 오르니틴 디카르복실라아제가 동시에 탑재된 수지상세포를 자극할 경우, CD8+ T 림프구가 증가한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 세포독성 T 림프구를 안정적으로 유지하기 위해, 바람직하게는 생리적 식염수, 인산염 완충 식염수 (PBS), 배지 등을 포함한다. 이는, 예를 들어, 정맥 내, 피하, 또는 피부내 투여될 수 있다. 종양의 치료를 위해 세포독성 T 림프구를 활성 성분으로 함유하는 상기와 같은 조성물을 환자의 체내로 재 주입함으로써, 종양의 치료를 달성하기 위한 특이적인 세포독성 T 림프구가 통상의 종양항원-양성 환자에서 효율적으로 유도된다. 환자 및 사용할 펩타이드 간의 MHC 타입이 적합성이 있어야 함은 당연하다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 유비퀴틴 및 오르니틴 디카르복실라아제가 결합된 융합 항원 및 상기 융합 항원이 탑재된 수지상세포 백신의 제조
PCR에 의한 PBMC 게놈 DNA로부터 76 잔기를 갖는 유비퀴틴 단량체를 코딩하는 서열(sequence from GenBank, accession number NM_021009)을 얻었다. BamHI 제한효소 부위 및 ATG 시작 코돈을 50 프라이머(5'-AGA GGA TCC ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACT CTG ACT GG-3')에 도입하였다. 30 프라이머는 EcoRI 클로닝 부위(5'-TCT GAA TTC CCC ACC TCT GAG CG GAG CAC CAG G-3')를 포함한다. PCR 산물을 pcDNA3 벡터(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)에서 인핸스드 녹색형광단백질(EGFP) 또는 pp65의 N-말단에 도입하였다. Ub의 C-말단 절단 부위 글리신 잔기를 알라닌 또는 발린으로 변이시켜 일련의 Ub 작제물, Ub(G)-EGFP 또는 pp65, Ub(A)-EGFP 또는 pp65, 및 Ub(V)-EGFP 또는 pp65를 생성하였다.
마우스 유래 ODC의 C-말단 단편(sequence from GenBank, accession number M0624)은 XbaI (ACC TCT AGA ATG TCA CGG CCA ATG TGG CA) 및 ApaI 절단 부위(CCA GGG CCC CTA CAC ATT GAT CCT AGC AGA A)가 결합된 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 마우스 수지상세포의 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 이 PCR 산물을 XbaI 및 ApaI으로 절단하고 나서, pcDNA3 벡터(Invitrogen)에서 EGFP 또는 pp65의 C-말단에 도입하였다.
상기 증폭된 ODC C-말단은 시퀀싱 결과 32번째 아미노산이 세린에서 프롤린으로 치환되어 있었다.
플라스미드 구조는 시퀀싱하여 확인하였다. 모든 작제물들은 대장균 DH5aF1에 형질전환되고, 플라스미드 DNA를 추출하여 Nucleo-Bond Xtra midi kit (Macherey-Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 정제하였다.
(세포주)
Epstein-Barr virus (EBV)에 의해 형질전환된 림포블라스토이드 세포주(LCLs)는 말초혈액단핵세포(PBMCs)와 배양된 B95-8 EBV 균주의 농축된 EBV 함유 상등액과 함께 배양하여 공여자로부터 발생시켰다. 안정한 형질전환체인 K562/HLAA*0201는 pcDNA3/HLA-A*0201를 사람 CML 세포주 K562에 형질감염시켜 수립하였다. LCLs 및 K562/HLAA*0201 세포는 10% 우태아혈청(FBS; Sigma, Saint Louis, MO), 2mM L-글루타민 (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD, USA), 및 페니실린-스트렙토마이신(100U/mL; Lonza Walkersville)을 포함하는 RPMI 1640 (Lonza Walkersville, Walkersville, MD, USA)에서 유지하였다.
(MACS 시스템이 있는 세포의 분리)
8명의 건강한 기증자로부터 사람 말초혈액 샘플을 얻고, Ficoll- Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA) 밀도구배 원심분리를 통해 단핵세포를 분리하였다. 본 연구는 대한민국 서울시 주재 가톨릭대학교 의과대학 산하 심의 위원회로부터 승인받았다. 밀도 분리 후, 제조업체 설명서에 따라 자기 마이크로비드(Miltenyi Biotec)가 결합된 각각 항-CD14 및 항-CD8 항체를 이용한 MACS(magnetic cell-sorting) 시스템(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)을 통해 CD14+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 분리하였다.
(수지상세포의 배양)
미성숙 수지상세포는 37℃, 5% CO2의 항습 배양기에서 6-7일 동안 3일 마다 10% FBS, 2mM L-글루타민, 및 페니실린-스트렙토마이신(100 U/ml; Lonza Walkersville)이 첨가된 RPMI 1640 배지 (Lonza Walkersville)에서 (GM-CSF, 100 ㎍/mL; Endogen, Woburn, MA, USA) 및 인터루킨(IL)-4 (50 ng/mL; Genzyme, Cambridge, MA, USA)과 함께 배양하여 CD14+ 단핵구로부터 발생시켰다.
시작 7일째, GM-CSF (100 ㎍/mL; Endogen), IL-4 (50 ㎍/mL; Genzyme), tumor necrosis factor (TNF)-α (100 ㎍/mL; Endogen), 및 lipopolysaccharide (LPS, 100 ㎍/mL; Sigma)를 포함하는 성숙화 칵테일을 사용하여 미성숙 수지상세포를 24시간 동안 성숙시켰다.
(뉴클레오펙션(Nucleofection) 및 전기충격)
DNA 형질감염을 위해, 제조업체 설명서에 따라, 사람 B 세포 뉴클레오펙션 키트 kit (Amaxa, Koln, Germany)를 사용하여 5㎍의 플라스미드 DNA를 LCLs (총, 1-3×106)에 형질감염시켰다. Nucleofector (Amaxa) program X-1를 사용하였다.
인 비트로 mRNA 합성 전에, 플라스미드는 적당한 제한효소로 선형화하였다. 인 비트로 트랜스크립션은 제공된 설명서(mMESSAGE mMACHINE T7 ultra kit; Ambion, Austin, TX, USA)에 따라 T7 폴리머라아제로 수행하였다. RNA 농도는 분광광도계로 측정하였고, mRNA 산물은 형질감염 전까지 -80℃에서 저장하였다. RNA 형질감염을 위해, 수지상세포는 Opti-MEM (Gibco/BRL)로 2회 세척하고, 1×107/mL의 농도가 되도록 재현탁하였다. 200㎕의 수지상세포 현탁액을 인비트 전사된 mRNA 40mg과 혼합하고, BTX ECM 830 square-wave electroporator (BTX, San Diego, CA, USA)를 사용하여 표준 2mm 갭 큐벳에서 300V에서 500 msec 동안 전기충격을 실시하였다. 미성숙 수지상세포는 미리 데운 RPMI 1640 배지(Lonza Walkersville)에서 재현탁시키고, 4시간 후 전기충격을 실시한 미성숙 수지상세포를 성숙화 칵테일을 사용하여 24시간 동안 성숙시켰다(E-M DCs). 전기충격을 실시한 성숙 수지상세포는 성숙화 칵테일로 즉시 옮기고 사용하기 전까지 37℃, CO2 배양기에서 오버나이트 동안 배양하였다(M-E DCs).
(칼슘 포스페이트에 의한 형질감염)
293 세포는 10% FBS, 2mM L-글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신(100 U/mL)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양하였다. 칼슘-포스페이트에 의한 형질감염을 위해, 형질감염 전에 1일 동안 293 세포(5×106)를 10cm 디쉬에 플레이팅하였다. 배양 배지는 형질감염 1시간 전에 신선한 배지로 바꿔주었다. 플라스미드 DNA(20㎍)를 칼슘 설페이트 용액에 부가하였다. DNA-칼슘 설페이트의 혼합물을 HEPES 완충된 염수(HBS)에 한 방울씩 부가하고 온화하게 혼합하였다. 상기 혼합물은 배양 배지에 1:10의 비율로 부가하였다. 형질감염 30시간 후 배지에 프로테아좀 억제제 MG132 (5 μM)를 부가하고, 세포는 추가로 18시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포는 2회 세척하고, 플로우 사이토메트리 및 웨스턴 블랏팅을 통해 분석하였다.
(웨스턴 블랏 분석)
293 세포는 칼슘 포스페이트에 의한 형질감염에 따라 Ub/ODC 플라스미드 DNA 20㎍으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 42시간째에 세포를 수집하고, 패시브 라이시스 완충용액(Promega, Madison, WI)에서 용해시켰다. pp65 및 pp65-키메라의 축적은 10% SDS-PAGE 전기영동에 의해 분석하고, 상기 단백질은 니트로셀룰로우즈 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 포스페이트 완충된 염수(PBS)에서 5% 무지방 우유와 함께 배양하고, 항-pp65 단클론성 항체(mAb)(Fitzgerald Industries International, Concord, MA, USA)와 함께 48℃에서 오버나이트 동안 배양하였다. 세척 후, 상기 멤브레인을 알칼라인 포스파타아제 결합된 염소 항-마우스 IgG 항체(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England) 와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 면역반응 밴드는 enhanced chemiluminescence (ECL) Western blotting analysis system (Amersham Biosciences)를 사용하여 검출하였다.
(In vitro CTL 유도)
항원 형질감염 후, 성숙된 수지상세포는 20Gy로 감마선 조사하였다. 이 과정은 대조군 배양에서 부산물을 완전히 억제한다. 제조업체 설명서에 따라 MACS (Miltenyi Biotec)에 의해 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 발생하기 위한 소스로서 PBMC의 CD14-음성 분획을 사용하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율이 1:2가 되도록 최종 농도가 각각 2×106 세포/웰 및 2×105 세포/웰로 하여, 10% FBS, 2mM L-글루타민, 및 페니실린-스트렙토마이신(100U/ml)이 부가된 RPMI 1640를 함유한 24-웰 플레이트에서 수지상세포와 공동 배양하였다. 7일째에 재자극을 위해 세포를 수집하였다. 수지상세포를 1×105 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, T 세포를 1×106 세포/웰의 밀도로 부가하였다. 8일 이후부터 3일 마다 IL-2 (20U/mL; Endogen)를 부가하였다. 3회 자극 후, T 세포의 항원-특이 면역 반응을 평가하였다.
(IFN-γ ELISPOT(enzyme-linked immunospot) 분석
세포 분비성 IFN-γ를 검출하기 위해, 제조업체 설명서(BD ELISPOT assay kit; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 따라 ELISPOT 분석을 수행하였다.
요약하면, pp65 펩타이드(10㎍/mL)를 탑재하거나, Ub/ODC를 코딩하는 각 RNA로 형질감염된 수지상세포를 자극세포로 사용하였다. AnyGen(Gwangju, Republic of Korea)은 HLA-A*0201 항원 유래 펩타이드 pp65 495-503(NLVPMVATV)을 합성하였다. 공여자로부터 분리한 T 세포집단 또는 인비트로 발생된 T 세포를 수지상세포와 10:1의 비율로 혼합하였다. 세포를 U-바텀 96-웰 플레이트(Falcon; BD Biosciences, Bedford, MA, USA)에서 완전 배지 200mL 내에서 4시간 동안 배양한 후, 모든 앨리쿼트는 IFN-γ 코팅된 ELISPOT 플레이트로 옮기고 다시 20시간 동안 배양하였다. 스팟을 관찰하기 위해, 스트렙타비딘-호스래디쉬 페록시다아제 (HRP) 및 기질을 사용하였다. AID-ELISPOT reader (AID Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany)를 사용하여 IFN-γ 분비 세포에 해당하는 스팟 수를 카운팅하였다.
MHC 클래스 I 분자에 의한 항원 제시를 차단하기 위해, Ub/ODC 제작물을 코딩하는 각 RNA로 형질감염시킨 1×106 수지상세포를 쥐 IgG2a 항-사람 MHC 클래스 I 단클론성 항체 W6/32 (5 ㎍/mL)과 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 세척하고, IFN-γ ELISPOT 분석을 위해 T 세포와 10:1의 비율로 혼합하였다.
(51Cr 방출 분석)
항원으로 형질감염된 각 수지상세포를 사용하여 3회 자극 후, 펩타이드로 펄스된 K562/HLA-A*0201를 표적세포로 사용하고, 표준 51Cr 방출 분석을 통해 특이 용해를 측정하였다. 96-웰 V 바텀 플레이트(Costar; Corning Life Sciences, Acton, MA, USA)에서 작동 T 세포(E:T 비율= 40:1 ~ 10:1)를 위해 pp65 펩타이드를 탑재하거나 그렇지 않은 K562/HLA-A*0201 세포를 106 세포 당 100 μCi의 Na2[51Cr]O4과 배양하였다. 37℃에서 4시간 동안 배양한 후, 각 웰에서 150mL의 무세포 상등액을 96-웰 루마플레이트(Packard BioScience/PerkinElmer, Meriden, CT, USA)에 수집하고, Packard microplate scintillation counter (Packard BioScience/PerkinElmer)를 사용하여 방사능을 카운팅하였다. 최대 방출은 4% 트리톤 X-100 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)을 첨가하여 평가하고, 자발적인 방출은 작동 세포의 부재 하에서 표지된 웰에서 측정하였다. 데이터는 3반복 배양으로부터 분당 평균 카운트(CPM)±SD 로 나타내었다. 특이 용해율은 다음 식으로 계산하였다:
[(실험 방출-자발적인 방출)/(최대 방출-자발적인 방출)]×100%
(통계분석)
통계분석은 GraphPad Prism 5 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)로 수행하였다. 통계 테스트는 3회의 각 실험치에 적용하였다. 결과는 평균의 평균±표준오차로 나타내었다. 통계 분석은 Student t 테스트를 통해 수행하였다. 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의적인 것으로 간주하였다.
<실험예 1> Ub(G), Ub(A), 및 Ub(V)와 융합된 pp65 항원 비교
Ub 경로에서, 단백질들은 Ub 폴리펩타이드에 공유적으로 결합하여 단백질 분해를 위해 표시된다. 표적 단백질로서 Ub 및 EGFP 간의 융합 안정성을 최적화하기 위해, 이들 작제물에서 G76(G) 잔기를 발린 또는 알라닌 중 어느 하나로 변이시켜 다음의 3개의 작제물을 생성하였다(도 1A):
Ub(G)-EGFP: 오리지널
Ub(A)-EGFP 및 Ub(V)-EGFP: 돌연변이
플라스미드를 사용한 LCLs의 즉각적인 형질감염 후, 24시간 후 FACS 분석에 의해 EGFP의 발현을 측정하였다(도 1A). Ub 없는 EGFP(27%) 와 비교하여 Ub(A)-EGFP (5.8%) 및 Ub(V)-EGFP (7.8%) 보다는 Ub(G)-EGFP (2.9%) 가 더 낮은 발현을 나타냈다. 이는 Ub(G)-EGFP가 보다 효과적으로 분해되었음을 뜻하는 것이다.
또한, T 세포를 자극할 수 있는 그들의 능력과 관련하여 도 1A의 결과를 확인하기 위하여 변이 Ub 모두 각각 HCMV 항원 pp65에 융합시켰다(도 2A). 수지상세포에 Ub(G)-pp65, Ub(A)-pp65, 또는 Ub(V)-pp65를 코딩하는 인 비트로 전사된 mRNA 를 전기충격시키고, IFN-γ ELISPOT 분석을 위해 CD+ T 세포와 공동 배양하였다. DC/Ub(G)-pp65 및 DC/Ub(A)-pp65는 DC/pp65(p<0.01)와 비교하여 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포를 유의적으로 더 높은 빈도로 나타냈다(도 2B). C-말단 돌연변이들 중에서, DC/Ub(G)-pp65는 표적 단백질의 분해를 향상시키고 T 세포를 자극할 수 있는 가장 큰 능력을 나타냈다. 이들 결과에 따라, 향후 실험을 위해 Ub(G)를 선택하였다.
<실험예 2> Ub 및/또는 ODC와 융합된 pp65 항원의 비교
다음으로, 세포내 단백질 분해에 대해 표적 단백질과 Ub 및/또는 ODC의 융합 효과를 예비적으로 비교하기 위해, Ub(G)-EGFP, EGFP-ODC, 및 Ub(G)-EGFPODC를 발생시켰다(도 1B). 플라스미드를 이용한 LCLs의 즉각적인 형질감염 후, 24시간 후 FACS 분석을 통해 EGFP 발현을 측정하였다.
Ub 및/또는 ODC에 융합된 EGFP 작제물은 EGFP 자체보다 더 낮은 발현을 나타냈다(30.7%). 또한, Ub(G)-EGFP-ODC는 EGFP-양성 LCLs의 비율의 단지 0.4%를 나타냈으며, 이는 Ub (2.3%) 또는 ODC (1.6%) 단독에 융합된 작제물들 보다 더 낮다. 이들 관찰은 Ub 및 ODC과 표적 단백질의 융합은 Ub 또는 ODC 중 어느 하나와의 융합과 비교하여 표적 단백질의 분해를 효과적으로 유발하는 것 같다.
Ub 및/또는 ODC에 의해 프로테아좀-특이 분해를 입증하기 위해, 293 세포에 EGFP, Ub(G)-EGFP, EGFP-ODC, 및 Ub(G)-EGFP-ODC를 형질감염 시켰다(도 1C). 프로테아좀 억제제인 MG132 부재 하에서, Ub(G)-EGFP (12.4%), EGFP-ODC (13.5%), 및 Ub(G)-EGFP-ODC (10.7%) 그룹은 EGFP 그룹 자체에 비해 더 낮은 발현을 나타냈다(85.1%). EGFP의 발현이 EGFP 그룹 자체에서 감소하기는 하였으나, MG132 존재 하에서 (G)-EGFP (21%), EGFP-ODC (22.5%), 및 Ub(G)-EGFPODC (24.2%)의 EGFP 발현 수준은 EGFP 그룹 자체의 수준으로 유사하게 회복하였다. 이들 결과는 Ub(G)-EGFP, EGFP-ODC, 및 Ub(G)-EGFP-ODC 발현 수준은 EGFP 그룹 자체와 유사하였고, 프로테아좀성 분해는 Ub 및/또는 ODC에 의해 증가함을 뜻하는 것이다.
다음으로, 도 1B 에 나타난 작제물과 유사하게 Ub 및 ODC를 HCMV pp65 항원에 융합시켜 Ub(G)-pp65, pp65-ODC, 및 Ub(G)-pp65-ODC를 생성하였다(도 3A). 또한 항-pp65mAb와의 웨스턴 블랏팅을 통해 293 세포에서 융합 단백질들의 발현을 시험하였다(도 3B).
Ub(G)-pp65, pp65-ODC, 및 Ub(G)-pp65-ODC는 MG132 부재 하에서 pp65 보다 더 낮은 수준으로 검출되었다. 또한, Ub(G)-pp65, pp65-ODC, 및 Ub(G)-pp65-ODC에 대한 밴드 강도는 프로테아좀 억제제인 MG132를 포함할 때 pp65의 수준으로 회복하였다.
인 비트로에서 CD0+ T 세포의 자극 시 pp65에 Ub 및/또는 ODC를 융합시킨 효과를 조사하기 위해, 8명의 건강한 공여자로부터 얻은 CD8+ T 세포를 Ub(G)-pp65, pp65-ODC, 및 Ub(G)-pp65-ODC를 코딩하는 mRNA가 전기충격된 수지상세포로 자극하였다(도 3C).
도 3C에 나타난 바와 같이, DC/Ub(G)-pp65 (49.6±13.9 스팟/1×105 세포;p<0.002), DC/pp65-ODC (35.6±11.1 스팟/1×105 세포;p<0.01), 및 DC/Ub(G)-pp65-ODC (81.1±26.5 스팟/1×105 세포; p<0.002)는 DC/pp65 (19.6±3.2 스팟/1×105 세포)와 비교하여 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포가 유의적으로 더 높은 빈도로 나타났다. DC/Ub(G)-pp65-ODC에 대해 IFN-γ 를 분비하는 CD8+ T 세포의 수는 DC/Ub(G)-pp65(p<0.04) 및 DC/pp65-ODC(p<0.01)과 비교하여 유의적으로 더 높았다. 그러나, DC/Ub(G)-pp65 및 DC/pp65-ODC 간의 유의적인 차이는 없었다.
이들 결과는 pp65에 Ub 또는 ODC를 각각 융합시킨 것은 항원 프로세싱을 효과적으로 향상시키며, 이러한 향상은 Ub 및 ODC 둘 다를 융합시킨 결과에서 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 제안한다.
<실험예 3> CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 Ub-pp65-ODC의 제시
Ub 및 ODC 둘 다 프로테오좀성 분해와 관련이 있어 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시되는 항원 펩타이드의 생성을 향상시키는 데 이용될 수 있다. 따라서, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 항원 제시에서 Ub 및/또는 ODC 융합의 효과를 평가하였다. pp65, Ub(G)-pp65, pp65-ODC, 또는 Ub(G)-pp65-ODC를 코딩하는 mRNA로 전기충격 시킨 수지상세포를 사용하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 자극시켰다.
IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포는 pp65 단독의 경우와 비교하여 Ub 및/또는 ODC와 융합된 pp65를 발현하는 수지상세포에 대한 반응을 유의적으로 증가시키는 반면, IFN-γ를 분비하는 CD4+ T 세포는 유의적으로 증가하지 않았다(도 4). 이들 결과는 Ub 및/또는 ODC와의 융합에 의해 증가된 T 세포 자극은 MHC 클래스 I 경로에 의한 효과적인 항원 제시의 결과임을 제안한다.
<실험예 4> 수지상세포의 성숙화에 따른 Ub-pp65-ODC의 제시
미성숙 수지상세포는 항원 포획 및 프로세싱에서 특화되도록 하는 반면, 성숙 수지상세포는 항원을 제시하고 T 세포-자극 능력을 증가시킨다. 수지상세포의 성숙화 전 후 RNA 전기충격이 항원 제시에 영향을 미치는 지를 조사하기 위해, 수지상세포는 전기충격 전에 24시간 동안 성숙화 칵테일에서 배양되거나(M-E DCs), 또는 1차 전기충격 후 성숙 수지상세포로의 분화를 유도하였다(E-M DCs).
T 세포 자극에서 결정적으로 중요한 변수인 수지상세포의 형질감염 효율은 모든 수지상세포 그룹 간에 유사하였다(도 5A). 성숙 수지상세포에서 HLA 클래스 I, CD80, CD83, 및 CD86의 발현은 미성숙 수지상세포(iDCs)에 비해 증가하였다. 특히, M-E 수지상세포에서 CD83 및 CD86의 발현은 E-M 수지상세포에 비해 증가하였다(도 5B).
미성숙 및 성숙 수지상세포에 Ub(G)-pp65, pp65-ODC, 또는 Ub(G)-pp65-ODC를 코딩하는 mRNA를 전기충격 시킨 결과, IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포는 pp65 단독의 경우와 비교하여 Ub 및/또는 ODC가 융합된 pp65를 발현하는 모든 수지상세포 그룹에서 유의적으로 증가하였다. 특히, Ub(G)-pp65-ODC의 경우, T 세포 자극은 수지상세포 성숙화에 의해 유의적으로 증가하였다(도 5C). E-M DCs (p<0.03) 및 M-E DCs(p<0.01)는 iDC와 비교하여 유의적으로 증가된 IFN-γ를 분비하는 T 세포를 나타냈다. M-E 수지상세포는 E-M 수지상세포보다 유의적으로 더 높은 수의 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포 수를 나타냈다(p<0.03).
Ub 및 ODC가 MHC 클래스 I 경로에 의한 항원 제시를 증가시키는 지 확인하기 위해, W6/32 mAb를 사용하여 블록킹 연구를 수행하였다.
도 5D에 나타난 바와 같이, IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 수는 iDC, E-M DCs, 및 DC/pp65 및 DC/Ub(G)-pp65-ODC 그룹의 M-E 수지상세포에서 W6/32로 블록킹한 후 유의적으로 감소하였다.
이들 결과를 토대로, Ub(G)-pp65-ODC mRNA를 이용한 수지상세포의 전기충격은 T 세포를 자극하고 MHC 클래스 I 경로에 의한 항원 제시를 향상시킴에 있어서 성숙화 전 보다는 후에 보다 효과적임을 확인하였다.
<실험예 5> Ub 및/또는 ODC에 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 전기충격된 수지상세포에 의한 인 비트로 CTL 유도
인 비트로 CTL 유도를 위해, Ub 및/또는 ODC가 융합된 pp65를 코딩하는 mRNA로 형질감염된 수지상세포를 사용하여 15일 동안 반응 T 세포를 자극시켰다. 증식능은 각 그룹에서 유사하였다(도 6A).
pp65 특이 T 세포의 빈도를 측정하기 위해, pp65 펩타이로 펄스된 K562/HLA-A*0201 세포를 사용하여 IFN-γ ELISPOT 분석을 수행하였다. DC/Ub(G)-pp65 (p<0.02) 및 DC/pp65-ODC (p<0.04)로 자극시킨 배양 T 세포는 DC/pp65로 자극시킨 것에 비해 증가된 IFN-γ를 분비하는 세포를 나타냈다(도 6B).
Ub(G)-pp65-ODC는 pp65에 Ub 또는 ODC를 단독 융합시킨 것에 비해 향상된 IFN-γ 반응을 유도하였다(p<0.01). 또한, DC/Ub(G)-pp65-ODC로 자극시킨 CTL은 다른 그룹으로 자극시킨 CTL에 비해 E:T 비율을 1:20으로 하여 pp65 펩타이드 펄스된 K562/HLA-A*0201 세포에 대해 유의적으로 향상된 세포독성 활성을 나타냈다(52±5% 특이 용해; p<0.01)(도 6C). 그러나, DC/Ub(G)-pp65 및 DC/pp65-ODC로 자극된 CTLs의 세포독성 활성은 DC/pp65 그룹과 유사하였다.
이들 결과는 Ub(G)-pp65-ODC는 T 세포 자극을 직접적으로 향상시킬 뿐만 아니라 인 비트로에서 항원-특이 T 세포를 보다 효과적으로 유도함을 제안한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (19)
- 종양을 발생하는 바이러스 항원 또는 종양항원에 유비퀴틴(Ubiquitin, Ub) 및 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)가 동시에 결합되어 있고,
상기 바이러스 항원은 사람 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr-virus), 사이토메갈로 바이러스 pp65, 단순 포진 바이러스 유형 1과 2, 또는 인체 포진 바이러스 6, 7 및 8에 의해 암호화된 단백질 중에서 선택되고,
상기 종양항원은 T-세포에 의해 인지되는 흑색종 항원(Melanoma Antigen Recognized by T-cell:MART), 티로신 관련 단백질(tyrosine related protein:trp), 흑색종 항원-1(Melanoma Antigen-1:MAGE-1), 흑색종 항원-2(Melanoma Antigen-2:MAGE-2), 흑색종 항원-3(Melanoma Antigen-3:MAGE-3), 100-kDa 글리시리진-결합 단백질(100-kDa Glycyrrhizin-binding protein:gp100), HER-2, PSA, 또는 라스(Ras) 폐암 연관 항원 중에서 선택되는 것인, 융합 항원.
- 제1항에 있어서,
유비퀴틴은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 융합 항원.
- 제1항에 있어서,
오르니틴 디카르복실라아제는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 융합 항원.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
바이러스 항원 또는 종양항원의 N-말단에 유비퀴틴이, C-말단에 오르니틴 디카르복실라아제가 결합되어 있는 융합 항원
- 제1항의 융합 항원을 발현하는 재조합 벡터.
- 제1항의 융합 항원, 또는 이를 코딩하는 RNA 서열을 포함하는 항종양 조성물.
- 삭제
- 제1항의 융합 항원을 코딩하는 RNA 서열, 또는 제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 항원-제시세포.
- 삭제
- 제9항에 있어서,
항원-제시 세포는 수지상세포, 단핵세포, CD4 T 세포, B 세포 및 γδ T(gamma delta T) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 항원-제시세포.
- MHC 클래스 I 분자 및 제1항의 융합 항원 간의 복합체가 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에 제시된 항원-제시세포.
- 제12항에 있어서,
항원-제시능을 갖는 세포는 수지상세포, 단핵세포, CD4 T 세포, B 세포 및 γδ T(gamma delta T) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 항원-제시세포.
- 제13항에 있어서,
CD4 T 세포, B 세포, 또는 γδ T 세포는 미경험(naive) 상태, 활성화 상태, 또는 확대(expansion)된 상태인 항원-제시세포.
- 제1항의 융합 항원을 코딩하는 RNA 서열, 또는 상기 융합 항원을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 항원-제시세포; 또는
표면에 MHC 클래스 I 분자와 제1항의 융합 항원의 복합체가 제시된 항원-제시세포를 포함하는 항종양 조성물.
- 제12항의 항원-제시세포의 표면에 제시된 MHC 클래스 I 분자 및 제1항의 융합 항원 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 항원-특이 T 세포.
- 제16항에 있어서,
항원-특이 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 혼합인 항원-특이 T 세포.
- 제1항의 융합 항원을 발현하는 항원-제시 세포를 이용하여 T 림프구를 자극하는 단계를 포함하는 세포독성 T 림프구의 in vitro 유도방법.
- 제16항의 항원-특이 T 세포를 포함하는 항종양 조성물.
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|---|---|---|---|---|
| KR0177307B1 (ko) * | 1996-02-29 | 1999-04-01 | 성재갑 | B형 간염 바이러스 아종 adr의 표면항원 제조방법 |
| KR101079314B1 (ko) * | 2008-12-05 | 2011-11-04 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 면역 활성을 갖는 항원 특이 세포독성 ｔ 세포(ｃｔｌ)의 시험관내 효율적 생성방법 및 이를 유효성분으로 하는 항종양 치료제 |
-
2010
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Patent Citations (2)
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|---|
| Biochem. Biophys. Res. Commun. 365(4): 621-627(2008. 1. 25.) * |
| J. Biol. Chem. 279(20): 20959-20965(2004. 5. 14.) * |
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