KR101367568B1 - Ａｂｃ 수송체 조절을 통한 퇴행성신경질환에서 이상단백질 조절 - Google Patents
Ａｂｃ 수송체 조절을 통한 퇴행성신경질환에서 이상단백질 조절 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 ABC 수송체(ATP-binding cassette transporter) 조절의 새로운 용도에 관한 것으로 ABC 수송체(ATP-binding cassette transporter) 조절을 통한 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 방법, 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 물질 스크리닝 방법, ABC 수송체 이상에 의한 질환 또는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 퇴행성 신경질환에 대한 새로운 발병기전을 확립할 수 있으며, 아직까지 치료 약물이 없었으나 새로운 발병기전을 기반으로 새로운 신경질환 치료방법 및 효과적인 약물 발굴과 치료제 개발방법 및 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 퇴행성 신경질환 외 ABC 수송체 이상에 의한 질환의 예방 또는 치료에도 효과적이다.
본 발명은 퇴행성 신경질환에 대한 새로운 발병기전을 확립할 수 있으며, 아직까지 치료 약물이 없었으나 새로운 발병기전을 기반으로 새로운 신경질환 치료방법 및 효과적인 약물 발굴과 치료제 개발방법 및 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 퇴행성 신경질환 외 ABC 수송체 이상에 의한 질환의 예방 또는 치료에도 효과적이다.
Description
본 발명은 ABC 수송체(ATP-binding cassette transporter) 조절의 새로운 용도에 관한 것으로 ABC 수송체(ATP-binding cassette transporter) 조절을 통한 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 방법, 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 물질 스크리닝 방법, ABC 수송체 이상에 의한 질환 또는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨씨병(Parkinson's disease), 광우병(Mad Cow disease; Prion disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 루게릭병 (Amyotrophic lateral sclerosis) 등 대부분의 퇴행성신경질환들의 공통된 병인으로 신경세포 내외에 걸친 단백질의 비정상적 축적과 그에 따른 단백질 응집 및 침착이 확인되고 있다. 이들 세포 안팎에 형성된 단백질 침착물은 신경세포에 세포내외 단백질의 과축적과 응집을 유도하고, 세포에 독성으로 작용하여 궁극적으로는 세포사멸을 유도한다. 현재, 이러한 증상을 제어하는 의약품은 개발되지 못하였으며 질병증상 완화를 위한 약물만이 환자들에게 처방되는 실정이다.
상기한 바와 같이 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 ABC 수송체 조절의 새로운 용도에 관하여 연구한 결과, ABC 수송체의 활성 또는 발현량을 조절하여 퇴행성 신경질환의 진행을 조절 할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 ABC 수송체(ATP-binding cassette transporter) 조절을 통한 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 헌팅턴병 모델 생쥐의 분화된 신경 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 후보물질을 접촉시킨 신경세포 및 후보물질을 접촉시키지 아니한 신경세포의 ABC 수송체 활성 및 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 스크리닝 방법에 의해 얻어진 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료물질을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 스크리닝 방법에 의해 얻어진 물질을 유효성분으로 함유하는 ABC 수송체 이상에 의한 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 ABC 수송체(ATP-binding cassette transporter) 조절을 통한 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 헌팅턴병 모델 생쥐의 분화된 신경 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 후보물질을 접촉시킨 신경세포 및 후보물질을 접촉시키지 아니한 신경세포의 ABC 수송체 활성 및 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
또한 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 얻어진 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 물질을 제공한다.
또한 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료물질을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 얻어진 물질을 유효성분으로 함유하는 ABC 수송체 이상에 의한 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 ABC 수송체(ATP-binding cassette transporter) 조절을 통한 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 ABC 수송체(ATP-binding cassette transporter) 조절하는 것을 특징으로 한다.
ABC 수송체(ATP-Binding Cassette transporter)는 막단백질로서 ATP가 결합되는 결합부위를 갖고 상기 ATP 에너지를 이용하여 세포내의 세포질로부터 세포바깥쪽으로 물질을 능동적으로 수송하는 강력한 물질수송단백질의 하나이다.
이러한 ABC 수송체의 기질(substrates) 로는 다수의 항암제(antitumor drugs)들, 시메티딘(cimetidine), 독성물질인 페오포바이드 a(pheohpobide a), PhIP 등, 내인성기질(Endogenous substrate)인 에스트론3-설페이트(estrone 3-sulfate), 엽산(folic acid), 17-에스트라디올 설페이트(estradial sulfate), 17-에스트라디올 17-(-D-글루코로나이드), 프로토포피린 IX(PPIX) 등, 형광염료인 호치스트 (Hoechest)33342, BODIPY-prazosin, BBR 3390 등이 알려져 있다.
본 발명의 ABC 수송체는 예를 들어 MDR(Multidrug resistance protein, 다제내성 단백질), MRP(Multidrug resistance-associated protein), MXR(mitoxantrone resistant protein)일 수 있으며, 바람직하게는 MDR(다제내성 단백질)일 수 있다.
퇴행성 신경질환이란 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 여러 가지 증상을 유발하는 질환을 말하며, 예를 들어 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(Multiple system strophy), 헌팅턴병(Huntington's disease), 루게릭병(근위축성 측색 경화증, Amyotrophic lateral sclerosis;ALS), 본태성 진전증(Essential tremor), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico-basal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨스-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam), 픽병(Pick's disease) 일 수 있다.
파킨슨병(Parkinson's disease)은 간뇌의 변성 또는 동맥경화적인 변화를 주로 한 중추신경계의 퇴행성 질환으로, 운동장애가 주증상이며, 정상인의 뇌에서 흑색질이라는 부위의 신경세포들이 변성되고 이 곳에서 만들어지는 신경전달 물질인 도파민이 결핍되어 초래된다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease)은 노인에서의 치매의 원인 중 가장 흔한 형태로, 뇌의 전반적인 위축, 뇌실의 확장, 신경섬유의 다발성 병변(neurofibrillary tangle)과 초로성 반점(neuritic plaque) 등의 병리조직학적 특징을 나타내며, 점진적인 기억, 판단, 언어능력 등 지적인 기능의 감퇴와 일상생활능력, 인격, 행동양상의 장애를 초래한다.
일명 루게릭병으로 불리는 근위축성측삭경화증(ALS)은 대뇌와 척수의 운동신경 세포가 파괴되어 이 세포의 지배를 받는 근육이 점점 힘을 잃어가는 퇴행성 신경질환으로, 근위축, 근력약화, 섬유속성연축 등의 임상적인 증상을 나타낸다.
헌팅턴병은 독성 단백질 집합체가 뇌에 형성되어 신경계에 영향을 미쳐서 나타나는 유전성 뇌 질환으로 대개 안면 경련과 함께 시작되고, 나중에는 떨림이 신체 다른 부위에까지 퍼져서 환자의 의사와 상관없이 비틀리는 운동으로 발전한다.(무도병이란 의미의 chorea는 무용술이란 의미의 choreography와 어원이 같다. 무도병의 비틀리는 움직임이 때로는 약간 무용 같아 보이기도 하기 때문이다.) 점차 경련이나 비틀리는 운동이 환자의 걷기, 말하기, 그리고 다른 자발적인 운동을 더욱 더 방해하게 된다. 특히 새로운 운동습관을 형성하는 능력이 쇠퇴한다.
다발성 경화증 (MS)은 인간 중추 신경계 (CNS)의 염증성 및 탈수초성 퇴행성 질환이다. 이는 청년기의 질환으로, 70％-80％가 20세 내지 40세 사이에 발병된다. MS는 임상 경과, 자기 공명 영상화 (MRI) 스캔 평가, 및 생검 및 부검 재료의 병리학 분석을 기초로 하는 이질적인 장애이다. 이 질환은 척수, 뇌간, 뇌신경, 소뇌, 뇌, 및 인지 증후군을 포함하여 다수의 가능한 조합으로 스스로 징조를 나타낸다.
한편 본 발명은
(a) 헌팅턴병 모델 생쥐의 분화된 신경 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 후보물질을 접촉시킨 신경세포 및 후보물질을 접촉시키지 아니한 신경세포의 ABC 수송체 활성 및 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명의 방법을 단계별로 설명한다.
(a) 헌팅턴병 모델 생쥐의 분화된 신경 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계
(a) 단계에서는 헌팅턴병 모델 생쥐의 분화된 신경 세포에 후보물질을 접촉시킨다.
후보물질이란 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료의 효능이 있을 것이라 예상되는 생명체에 적용 가능한 물질을 말한다. 본 발명의 후보물질은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.
본 발명의 방법으로 스크리닝되거나 동정될 수 있는 후보물질은 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 상기 후보물질은 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 후보물질은 펩타이드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩타이드일 수 있다. 상기 펩타이드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스화(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.
또한 상기 후보물질은 "핵산"일 수 있다. 핵산 후보물질은 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스화" 랜덤 핵산일 수 있다.
또한 상기 후보물질은 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다.
본 발명의 후보물질은 예를 들어 ABC 수송체 유전자의 전사를 촉진 시킬 수 있는 물질, ABC 수송체 유전자의 전사활성을 유도하는 것으로 알려져 있는 전사활성인자를 활성화 시키는 물질, ABC 수송체 mRNA를 조절하는 RNA 종류들(siRNA, miRNA, iRNA), ABC 수송체 단백질를 활성화 시키는 물질(TWD1/ FKBP42)일 수 있다.
(b) 상기 후보물질을 접촉시킨 신경세포 및 후보물질을 접촉시키지 아니한 신경세포의 ABC 수송체 활성 및 발현량을 측정하는 단계
(b) 단계에서는 상기 후보물질을 접촉시킨 신경세포 및 후보물질을 접촉시키지 아니한 신경세포의 ABC 수송체 활성 및 발현량을 측정한다.
ABC 수송체 활성 및 발현량을 측정하는 방법은 시험관 내(in vitro)에서 상기 유전자와 시험 대상 물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류 세포와 시험 대상 물질을 반응시킨 후 노던 블랏 분석(northern blot assay), 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포내로 도입한 후 시험 대상 물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있다.
퇴행성 신결질환은 신경세포의 ABC 수송체 활성 및 발현량을 조절에 따라 예방 또는 치료될 수 있으므로 상기와 같은 방법에 의하여 퇴행성 신경질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝 할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 얻어진 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 물질을 제공한다.
퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 물질이란 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료의 효능이 있는 생명체에 적용 가능한 물질을 말하며 예를 들어 ABC 수송체 유전자의 전사를 촉진 시킬 수 있는 물질, ABC 수송체 유전자의 전사활성을 유도하는 것으로 알려져 있는 전사활성인자를 활성화 시키는 물질, ABC 수송체 mRNA를 조절하는 RNA 종류들(siRNA, miRNA, iRNA), ABC 수송체 단백질를 활성화 시키는 물질(TWD1/ FKBP42)일 수 있다. 더욱 바람직하게는 microRNA27a 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 RNA인 microRNA27a일 수 있다.
microRNA(miRNA)는 특히 발생 과정에서 유전자 발현의 조절을 보조하는 비번역 RNA(non-coding RNA)를 말한다.
본 발명의 일실시예에서는 헌팅턴병 모델 생쥐의 분화된 신경 세포에 다양한 후보물질을 접촉시켜 ABC 수송체의 활성이 증가하는지 여부를 확인하였다. 그 결과 microRNA27a가 ABC 수송체 중 하나인 MDR1의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 서열번호1로 표시되는 microRNA27a를 헌팅턴병 in vitro 모델에 처리하여 돌연변이 헌팅틴의 응집율 변화를 측정하였다. 그 결과 microRNA27a를 처리한 군의 경우 돌연변이 헌팅틴의 응집이 감소하는 것을 확인하였다.
이와 같이 본 발명의 퇴행성 신경질환 치료용 물질은 퇴행성 신경질환을 예방 및 치료하는 효능이 뛰어나다.
따라서 본 발명의 다른 목적은 상기 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료물질을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 상기 스크리닝 방법은 퇴행성 신경질환을 예방 또는 치료하는 물질을 스크리닝 할 수 있으며, 동시에 ABC 수송체 활성 및 발현량을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝 할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 스크리인 방법에 의해 얻어진 물질을 유효성분으로 함유하는 ABC 수송체 이상에 의한 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
퇴행성 신경질환이란 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 여러 가지 증상을 유발하는 질환을 말하며, 예를 들어 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(Multiple system strophy), 헌팅턴병(Huntington's disease), 루게릭병(근위축성 측색 경화증, Amyotrophic lateral sclerosis;ALS), 본태성 진전증(Essential tremor), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico-basal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨스-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam), 픽병(Pick's disease) 일 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 퇴행성 신결질환은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병 및 다발성 경화증일 수 있다.
ABC 수송체(ATP-Binding Cassette transporter)는 막단백질로서 ATP가 결합되는 결합부위를 갖고 상기 ATP 에너지를 이용하여 세포내의 세포질로부터 세포바깥쪽으로 물질을 능동적으로 수송하는 강력한 물질수송단백질의 하나이다.
이러한 ABC 수송체의 기질(substrates) 로는 다수의 항암제(antitumor drugs)들, 시메티딘(cimetidine), 독성물질인 페오포바이드 a(pheohpobide a), PhIP 등, 내인성기질(Endogenous substrate)인 에스트론3-설페이트(estrone 3-sulfate), 엽산(folic acid), 17-에스트라디올 설페이트(estradial sulfate), 17-에스트라디올 17-(-D-글루코로나이드), 프로토포피린 IX(PPIX) 등, 형광염료인 호치스트 (Hoechest)33342, BODIPY-prazosin, BBR 3390 등이 알려져 있다.
따라서 ABC 수송체 이상에 의한 질환은 상기 ABC 수송체 기질이 관여하는 질환일 수 있으며, 바람직하게는 암 일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 항암제 내성이 있는 암일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 퇴행성신경질환 in vitro 모델을 만들기 위해 헌팅턴병 유전자변형 동물모델로부터 신경줄기세포 배양을 실시하였으며 배양한 신경줄기세포를 분화조건하에 다양한 신경성 세포로 분화를 유도하였다. 그 결과 분화된 세포에서 헌팅턴병원 이상단백질인 돌연변이 헌팅틴의 응집과 축적을 확인하였다. 그리고 세포내 돌연변이 헌팅틴의 응집과 축적에 따른 다제내성 단백질의 감소를 확인하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 확립한 헌팅턴병 in vitro 모델에서 다제내성 단백질을 저해했을 경우 돌연변이 헌팅틴의 응집과 축적이 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명의 조성물은 아무것도 타지 않거나 혹은 종래 기술의 약학적 담체와 조합으로 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 적용 가능한 고체 담체는 향미료, 윤활제, 용해화제, 현탁화제, 충전제, 유동 촉진제(glidant), 압축 보조제, 바인더, 정제 붕괴제 또는 봉입 재료로서의 역할도 할 수 있는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 분말의 경우, 담체는 미분화된 활성 성분과 혼합될 수 있는 미분화된 고체일 수 있다.
정제의 경우, 활성 성분은 적절한 압축 특성을 가진 담체와 적절한 비율로 혼합되어 소망하는 형상과 크기로 압축될 수 있다. 분말 및 정제는 활성성분을 약 99%까지 포함할 수 있다. 적절한 고체 담체는 예를 들어 칼슘 포스페이트, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당류, 락토오즈, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 저융점 왁스(low melting wax), 및 이온 교환수지를 포함한다. 액체 담체는 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 엘릭서(elixir)를 제조한는 데에 사용될 수 있다.
또한, 비경구 투여를 위해 담체는 에틸 올레이트(ethyl oleate) 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 비경구 투여를 위한 멸균 액체 형태 조성물에서는 멸균 액체 담체가 사용된다. 멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약학적 조성물은 예를 들어, 근육내 주사, 복강내(intraperitoneal) 주사 또는 피하 주사에 의해 이용될 수 있다. 멸균 용액은 또한 정맥 내에 투여될 수 있다.
경구 투여는 액체 또는 고체 조성물 형태일 수 있다. 한 구현예에서 본 발명의 조성물은 예를 들어 정제 또는 캅셀과 같은 단위 투여분(unit dosage) 형태이다. 이러한 형태에서, 조성물은 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 투여분으로 다시 나누어질 수 있다. 단위 투여분 형태는 패키지화 조성물, 예를 들어 패키지화 파우더, 바이알, 앰플, 미리 채워진 주사기 또는 액체를 함유하는 향낭(sachet)일 수 있다.
본 발명의 조성물의 유효성분은 1일당 체중 1kg 당 약 0.01 내지 약 100mg의 1일 용량(daily dose)으로 환산될 수 있다. 그러나, 사용된 특정 투여량은 환자의 요구 조건, 환자가 가진 질환의 심각성 및 화합물의 활성에 따라 변화될 수 있다. 특정한 상황에서 최적의 투여량의 결정은 임상적으로 이루어질 수 있으며, 당해 분야의 기술 내이다.
이와 같이 상기한 본 발명은 퇴행성 신경질환에 대한 새로운 발병기전을 확립할 수 있으며, 아직까지 치료 약물이 없었으나 새로운 발병기전을 기반으로 새로운 신경질환 치료방법 및 효과적인 약물 발굴과 치료제 개발방법 및 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 퇴행성 신경질환 외 ABC 수송체 이상에 의한 질환의 예방 또는 치료에도 효과적이다.
도 1은 헌팅턴병 유전자 변형 동물 모델에서 유래한 신경줄기세포 배양 모양(neurosphere) 이다.
도 2는 헌팅턴병 유전자 변형 동물 모델에서 유래한 신경줄기세포의 분화능을 보여주는 면역현광 염색결과이다(MAP2 & Tuj1;neuron, GFAP;astrocyte, O4; oligodendrocyte).
도 3은 헌팅턴병 유전자 변형 동물 모델에서 유래한 신경줄기세포를 분화 유도 후 돌연변이 헌팅틴 응집에 반응하는 항체(Em48)를 이용한 면역현광 염색결과 이다(Blue; Dapi, Red; Em48-돌연변이 헌팅틴 응집).
도 4는 헌팅턴병 in vitro 모델에서 분화과정에 따른 돌연변이 헌팅틴 단백질의 응집을 형광염색(Red)한 도면이다.
도 5는 헌팅턴병 in vitro 모델에서 다제내성 단백질 발현을 조사하는 결과로서, 분화되었을 경우 단재내성 단백질의 발현이 감소되는 것을 보여주는 도면이다.
도 6은 다제내성 단백질(MDR)의 기능과 저해제를 통한 물질 이동에 대한 모식도이다.
도 7은 헌팅턴병 in vitro 모델에서 다제내성 단백질의 efflux 실험으로서 세포가 분화했을 경우 다제내성 단백질의 기능이 저하되는 현상을 보여주는 결과이다.
도 8은 헌팅턴병 in vitro 모델에서 다제내성 단백질을 저해하였을 경우 돌연변이 헌팅틴의 응집이 증가하는 것을 보여주는 결과이다.
도 9는 헌팅턴병 in vitro 모델에서 microRNA27a를 처리한 경우 돌연변이 헌팅틴의 응집이 감소하는 것을 보여주는 결과이다(둥근 원부분이 헌팅틴 응집이 일어난 세포임).
도 10은 헌팅턴병 in vitro 모델에서 microRNA27a를 처리한 경우 돌연변이 헌팅틴의 응집이 감소하는 정도를 수치화한 결과 그래프이다(Em48/Dapi: 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집에 특이적으로 반응하는 Em48로 염색된 부분과 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색된 부분의 비율).
도 2는 헌팅턴병 유전자 변형 동물 모델에서 유래한 신경줄기세포의 분화능을 보여주는 면역현광 염색결과이다(MAP2 & Tuj1;neuron, GFAP;astrocyte, O4; oligodendrocyte).
도 3은 헌팅턴병 유전자 변형 동물 모델에서 유래한 신경줄기세포를 분화 유도 후 돌연변이 헌팅틴 응집에 반응하는 항체(Em48)를 이용한 면역현광 염색결과 이다(Blue; Dapi, Red; Em48-돌연변이 헌팅틴 응집).
도 4는 헌팅턴병 in vitro 모델에서 분화과정에 따른 돌연변이 헌팅틴 단백질의 응집을 형광염색(Red)한 도면이다.
도 5는 헌팅턴병 in vitro 모델에서 다제내성 단백질 발현을 조사하는 결과로서, 분화되었을 경우 단재내성 단백질의 발현이 감소되는 것을 보여주는 도면이다.
도 6은 다제내성 단백질(MDR)의 기능과 저해제를 통한 물질 이동에 대한 모식도이다.
도 7은 헌팅턴병 in vitro 모델에서 다제내성 단백질의 efflux 실험으로서 세포가 분화했을 경우 다제내성 단백질의 기능이 저하되는 현상을 보여주는 결과이다.
도 8은 헌팅턴병 in vitro 모델에서 다제내성 단백질을 저해하였을 경우 돌연변이 헌팅틴의 응집이 증가하는 것을 보여주는 결과이다.
도 9는 헌팅턴병 in vitro 모델에서 microRNA27a를 처리한 경우 돌연변이 헌팅틴의 응집이 감소하는 것을 보여주는 결과이다(둥근 원부분이 헌팅틴 응집이 일어난 세포임).
도 10은 헌팅턴병 in vitro 모델에서 microRNA27a를 처리한 경우 돌연변이 헌팅틴의 응집이 감소하는 정도를 수치화한 결과 그래프이다(Em48/Dapi: 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집에 특이적으로 반응하는 Em48로 염색된 부분과 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색된 부분의 비율).
이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 헌팅턴병 in vitro 모델 확립
헌팅턴병 형질전화 동물 모델에서 신경줄기세포 (neuronal stem cell) 배양을 위해 헌팅턴병 동물 B6CBA-Tg(HDexon1)62Gpb/1J (Jackson laboratory, USA)에서 태어난 newborn 마우스의 subventricular zone(SVZ) 조직을 얻은 후 Trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 분리하고, 250g에서 10분간 원심분리하여 세포를 얻은 후, DMEM/F12 medium + B27 + 20 ng/ml bFGF + 20 ng/ml epidermal growth factor 배양액에 배양하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, Neurosphere 계대 배양을 통해 헌팅턴병 n vitro 실험에 사용할 세포수를 확보하였다.
그리고, 상기 배양한 헌팅턴병 동물 모델 유래 신경줄기세포가 헌팅턴병 in vitro 모델로서의 적합성을 확인하기 위하여 특화된 신경세포 분화 배지 (Neuronal differentiation media, Stem cell corporation)로 신경세포로의 분화를 유도하였다. 분화 후, neuronal 항체(GFAP; astrocyte, Tuj1 and MAP2; neuron, O4; oligodendrocyte)를 이용하여 신경세포의 분화 효율을 조사하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 신경세포와 glia 세포로의 분화를 확인하였고 이렇게 분화된 세포를 헌팅턴병 in vitro 모델로 사용하였다.
실시예 2: 헌팅턴병 in vitro 모델에서 돌연변이 헌팅틴의 응집과 축적 조사
확립한 헌팅턴병 in vitro 모델에서 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집과 축적을 보기위하여 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집에 특이적으로 반응하는 Em48(MAB5374; Milllipore) 항체를 이용하여 세포내 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집에 대해 면역학적 염색을 실시하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 헌팅턴병 in vitro 모델 내 Em48 면역반응이 되는 것을 확인하였으며 이러한 결과는 추후 헌팅턴병 in vitro 모델에서 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집의 변화를 관찰하는데 충족시키는 조건이 된다.
실시예 3: 헌팅턴병 in vitro 모델에서 돌연변이 헌팅틴 응집에 따른 다제내성 단백질 발현조사와 기능 실험
실시예 2에서와 같이 헌팅턴병 in vitro 모델에서 neuronal stem cell/progenitor cell과 분화된 neuronal cells에서 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집 여부를 조사하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, neuronal stem cell/progenitor cell 상태에서는 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집이 관찰이 되지 않았으며, 분화된 neuronal cells에서만 돌연변이 헌팅틴 단백질의 응집이 관찰된 것을 확인하였다.
그리고, 헌팅턴병 in vitro 모델에서 neuronal stem cell/progenitor cell과 분화된 neuronal cells에서 western blot을 이용하여 다제내성 단백질 발현을 조사하였다. neuronal stem cell/progenitor cell과 이를 분화 조건에서 배양하여 분화시킨 neuronal cells에서 각각 단백질을 축출하였다. 그리고 다제내성 단백질을 항원으로 하는 항체(MDR-snata:SantaCruz sc-8313, MDR-Abcam:Abcam ab3366)를 이용하여 western blot 방법으로 neuronal stem cell/progenitor cell과 분화된 neuronal cells에서 다제내성 단백질의 량을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, neuronal stem cell/progenitor cell에 비하여 분화된 neuronal cells에서 다제내성 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 헌팅턴병 in vitro 모델에서 neuronal stem cell/progenitor cell과 분화된 neuronal cells에서 MDR (multidrug resistance) fluorescence efflux assay 시스템을 이용하여 다제내성 단백질의 기능을 조사하였다.
다제내성 단백질은(MDR) 세포 밖으로 물질을 이동시키고 물질의 세포 내 유입은 수동확산(diffusion)에 이루어진다. 세포 내로 물질이 들어올 때는 수동확산에 의해서 들어오는데 다제내성 단백질이 물질을 다시 세포 밖으로 efflux하는 작용을 하게 된다 (도면 6A). 이러한 기작을 이용하여 세포내 형광물질을 넣어준 후 다제내성 단백질 저해제(verapamil)를 이용하여 다제내성 단백질의 기능을 저해한 후 (도면 6B) 형광을 측정할 수 있는 flow cytomery 장비를 이용하여 형광의 유출된 량을 측정하였다. 즉, 다제내성 단백질의 저해를 통해 세포네 형광의 유출량을 측정하여 다제내성 단백질의 기능을 상대적으로 측정하는 시스템으로서, 다제내성 단백질의 기능이 높을수록 저해제를 통한 형광의 유출이 감소되어 두 그래프간의 차이가 커진다 (도면 7A).
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, neuronal stem cell 조건에서 다제내성 단백질의 기능이 작동되는 것을 확인하였으며, 분화된 neuronal cells에서는 다제내성 단백질 기능이 감소하는 것을 확인하였다.
실시예
4:
다제내성
단백질 저해를 통한 이상단백질 응집과 축적의 변화
헌팅턴병 in vitro 모델에서 다재내성 단백질 기능을 저해하는 약물 (verapamil)을 이용하여 세포내 다제내성 단백질의 기능 저해와 돌연변이 헌팅틴 단백의 응집과 축적의 변화를 조사하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 다제내성 단백질의 기능이 저해된 실험군(Verapamil)에서 돌연변이 헌팅틴 응집이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 3 및 4의 결과에 의하여 다제내성 단백질 발현이 저하되거나 기능이 감소하는 경우와 돌연변이 헌팅틴 단백질의 응집이 관찰되는 것은 상관관계가 있음을 확인하였다.
실시예
5:
microRNA27a
의 퇴행성 신경질환 치료효과 실험
다양한 후보물질을 대상으로 본 발명의 퇴행성 신경질환 치료물질 스크리닝 실험을 진행하였다. 헌팅턴병 모델 생쥐의 분화된 신경 세포에 후보물질을 접촉시켜 ABC 수송체의 활성이 증가하는지 여부를 확인하였다. 그 결과 microRNA27a가 ABC 수송체 중 하나인 MDR1의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(결과미도시).
상기 발굴된 후보물질인 microRNA27a를 헌팅턴병 in vitro 모델에 처리하여 실시예 2에서와 동일한 방법으로 돌연변이 헌팅틴의 응집율 변화를 관찰하였다.
그 결과 [도 9] 및 [도 10]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 microRNA27a를 처리한 경우 돌연변이 헌팅틴의 응집이 감소하는 것을 확인하였다.
이로서 본 발명의 스크리닝 방법은 퇴행성 신경질환 치료물질 발굴에 효과적이며, 본 발명의 microRNA27a는 퇴행성신경질환 치료에 효과적임을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 퇴행성 신경질환에 대한 새로운 발병기전을 확립할 수 있으며, 아직까지 치료 약물이 없었으나 새로운 발병기전을 기반으로 새로운 신경질환 치료방법 및 효과적인 약물 발굴과 치료제 개발방법 및 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 퇴행성 신경질환 외 ABC 수송체 이상에 의한 질환의 예방 또는 치료에도 효과적이어서 산업상이용가능성이 높다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (10)
- 삭제
- 다음의 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 물질 스크리닝 방법.
a) 헌팅턴병 모델 생쥐의 분화된 신경 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 후보물질을 접촉시킨 신경세포 및 후보물질을 접촉시키지 아니한 신경세포의 ABC 수송체 활성 및 발현량을 측정하는 단계.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- microRNA27a(accession No NR_029501)을 유효성분으로 함유하는 헌팅턴 병 예방 또는 치료용 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 microRNA27a는 서열번호 1로 표시되는 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
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