KR101357237B1 - Ｐｃｒ 앰플리콘의 희석 단계를 포함하는 ｄｎａ 용융 분석을 이용한 ｓｎｐ 지노타이핑 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PCR 앰플리콘의 희석 단계를 포함하는 DNA 용융(melting) 분석을 이용한 SNP 지노타이핑(genotyping) 방법에 관한 것으로, SNP 지노타이핑을 위한 DNA 용융 분석에서 PCR 앰플리콘의 희석에 의해 비표지 프로브(unlabeled probe)의 결합 효율 및 대립 유전자(allelic identities)의 식별력(discrimination)을 높이고 SNP 판별용 프로브의 3’-말단 변형(modification)의 필요성을 없앨 수 있는 장점이 있다.

Description

ＰＣＲ 앰플리콘의 희석 단계를 포함하는 ＤＮＡ 용융 분석을 이용한 ＳＮＰ 지노타이핑 방법{SNP genotyping method using the melting analysis comprising a dilution step of PCR amplicon}

본 발명은 PCR 앰플리콘(amplicon)의 희석 단계를 포함하는 DNA 용융(melting) 분석을 이용한 SNP 지노타이핑(genotyping) 방법에 관한 것으로, SNP 지노타이핑을 위한 DNA 용융 분석에서 PCR 앰플리콘의 희석에 의해 비표지 프로브(unlabeled probe)의 결합 효율 및 대립 유전자(allelic identities)의 식별력(discrimination)을 높이고 SNP 판별용 probe의 3’-말단 변형(modification)의 필요성을 없앨 수 있는 장점이 있다.

인간 게놈 서열의 0.1% 이상을 차지하는 Polymorphic single nucleotides (SNPs)는 복잡한 질환을 포함하는 인간 표현형 변이들(phenotypic variations)을 연결짓는 주제가 되어왔다 (The International HapMap Consortium, 2005). 상대적으로 단시간에 다수의 SNPs를 지노타이핑(genotyping)하기 위한 다양한 하이스르풋 플랫폼(high throughput platforms)들이 개발되어 게놈-와이드 연관 분석 (GWAS)와 같은 대규모 분석을 위해 성공적으로 적용되어 왔다(Ragoussis, 2009). 이들 플랫폼은 일반적으로 표적 DNA 혼성화 및 몇몇 경우 생화학 반응들을 통해 100만개 서열 변이까지 식별할 수 있는 한정된 개수의 올리고뉴클레오티드 프로브들이 작은 칩(chip)에 밀도있게 배열되어 전체 게놈(genome)의 분석을 매우 빠르게 이루어질 수 있다(Kennedy et al., 2003; Ohnishi et al., 2001; Steemers et al., 2006).

상기 GWAS의 성공은 천식(asthma), 당뇨병(diabetes) 및 관상동맥심질환(coronary heart disease)을 포함하는 복잡한 형질들과 관련된 수많은 SNP들의 동정을 초래하였다 (http://www.genome.gov/gwastudies/). 이들 연구는 일반적으로 주어진 집단에서 특정 형질(들)과 관련된 SNP들을 소규모 SNP들의 지노타이핑에 적합한 플랫폼을 이용하여 다른 집단들에서 확인하기 위한 반복연구를 수반한다(Chanock et al., 2007). GWAS 플랫폼에 사용되는 생화학적 반응들에 더하여, 라이게이션 매개 반응(ligation mediated reactions), 엔도뉴클레아제 절단(endonuclease cleavage), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 질량분광분석법(mass spectrophotometry), 및 고해상도 DNA 용융(high resolution DNA melting)을 포함하는 다양한 접근법들이 이 목적으로 적용되었다(Fakhrai-Rad et al., 2002; Hardenbol et al., 2003; Jurinke et al., 2002; Kutyavin et al., 2006; Wittwer et al., 2003).

비대칭 증폭 앰플리콘 또는 작은 크기 앰플리콘에 적용되는 비표지 올리고뉴클레오티드 프로브 (이하 UOP)의 용융 분석을 이용한 SNP 지노타이핑은 상대적으로 더 간단하고 더 저렵한 대안으로서 SNP 대립인자(alleles)들을 식별하는데 성공적이었다(Erali et al., 2008; Liew et al., 2007). 후기(late) PCR 사이클, 즉 편평기(plateau phase)에서 농도의 PCR 앰플리콘들은 심각한 자체 재-어닐링(self re-annealing)을 나타내어 프라이머(primer)들이 그들의 표적 서열에 부착할 수 있는 기회를 빼앗아간다(Gevertz et al., 2005). 이들 방법에서, 형광 DNA 결합 염료(dye)를 이용한 용융으로부터 충분한 시그날을 얻을 정도로 UOP가 그 표적 서열에 어닐링하기 위해서는 표적 서열의 선택적 강화(enrichment) 또는 약한 재-어닐링 율(re-annealing rate)를 갖는 작은 크기의 앰플리콘를 이용할 수 밖에 없었다.

본 발명에서, 발명자들은 앰플리콘 희석(dilution)이 UOP의 표적 어닐링 기회를 높일 수 있는 다른 조건을 초래할 수 있다는 것을 발견하였다. 발명자들은 희석 PCR 앰플리콘에 적용된 UOPs의 용융 분석이 지노타이핑(genotyping) 목적에 사용될 수 있는지를 시험하였다. 그 결과 앰플리콘 희석에 이은 UOPs의 적용이 더 단순하고, 신속하며 비용효율적인 SNP 지노타이핑방법을 제공할 수 있음을 증명하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 더 단순하고, 신속하며 비용효율적인 DNA 용융 분석을 이용한 SNP 지노타이핑 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 폴리머라제(polymerase)의 불활성화를 통해 3’-말단 변형(modification)의 필요성을 없앨 수 있는 DNA 용융 분석을 이용한 SNP 지노타이핑 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 DNA 용융 분석을 이용한 SNP 지노타이핑 방법을 제공한다: 1) SNP 부위를 포함하는 표적 서열을 PCR 증폭하는 단계; 2) 상기 증폭된 PCR 앰플리콘을 희석(dilution)하는 단계; 3) 상기 희석된 PCR 앰플리콘을 형광 DNA 결합 염료의 존재하에 비표지 올리고뉴클레오티드 프로브(unlabeled oligonucleotide probe)와 결합시키는 단계; 4) 상기 결합된 산물의 온도를 점차 올려가면서 상기 프로브가 용융함에 따라 변해가는 형광강도를 측정(DNA 용융 분석)하는 단계, 및 5) 상기 온도변화에 따른 형광강도의 변화곡선의 미분곡선을 얻은뒤, SNP의 각 타입을 대표하는 피크(peak)의 존재유무에 따라 SNP를 타이핑(typing)하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 1)의 PCR증폭단계에서 비표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 함께 넣어주지 않고 PCR 증폭후에 따로 넣어주는 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법을 제공한다. 종래의 DNA 용융 분석을 이용한 SNP 지노타이핑 방법에서는 PCR 증폭단계에서 프로브를 함께 넣어주었기 때문에 프로브가 PCR증폭과정에 관여하지 않도록 probe의 3’-말단 변형(modification)이 필요하였으나, 본 발명에서는 PCR 증폭후 프로브를 따로 넣어주며 PCR 앰플리콘의 희석에 의해 폴리머라제(polymerase)의 불활성화를 통해 프로브의 3’-말단 변형의 필요성을 없앨 수 있다. 또한, 종래 방법에서는 프로브가 PCR증폭과정에 관여하지 않도록 프로브의 서열이 프라이머(primer)의 서열과 중복되지 않도록 디자인할 필요가 있었으나, 본 발명에서는 프로브가 PCR 증폭과정에 관여될 가능성이 없으므로 프로브 서열을 프라이머 서열에 구애받지 않고 자유롭게 디자인할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 2) 단계에서 상기 PCR 앰플리콘은 증류수 또는 PCR 반응버퍼에 2~10 배 희석하는 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법을 제공한다. 바람직하게는 본 발명은 최종적으로 상기 3) 단계에서 probe 용액과 섞어후 최종 PCR 산물의 희석배수가 6배 내지 96배, 더욱 바람직하게는 20배 내지 50배인 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법을 제공한다. 본 발명의 도 1에서는 6배 내지 96배 희석수준에서 지노타입(genotype)을 판별할 수 있음을 보여주었으며, 특히 24 및 48 배 희석수준에서 지노타입(genotype)을 가장 선명하게 판별할 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기 2) 단계에서 상기 PCR 앰플리콘의 희석에 의해 비표지 프로브의 결합 효율을 높이고 SNP간의 식별력(discrimination)을 높이는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 상기 2) 단계에서 상기 PCR 앰플리콘의 희석에 의해 고상 매질에 물리/화학적으로 고정된 비표지 프로브의 결합 효율을 높이고 SNP간의 식별력(discrimination)을 높일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 3) 단계에서 비표지 프로브는 칩(chip), 비드(bead), 튜브, 플레이트 등과 같은 고상 매질에 물리/화학적으로 고정된 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법을 제공한다. 상기 비표지 프로브는 고상 매질에 고정된 상태에서 희석된 PCR 산물과의 결합 및 변성과정을 거치게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 1) 단계에서 상기 PCR 증폭은 다중 SNPs를 한꺼번에 증폭하는 멀티플렉싱(multiplexing) PCR 인 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 2) 단계에서 상기 PCR 앰플리콘의 희석에 의해 폴리머라제의 불활성화를 통해 프로브의 3’-말단 변형의 필요성을 없애는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 3) 단계에서 상기 희석된 PCR 앰플리콘을 형광 DNA 결합 염료와 상기 SNP에 상보적인 서열을 갖는 비표지 올리고뉴클레오티드 프로브 용액과 혼합한 다음, 상기 혼합물을 가열하여 이중나선 PCR 산물의 변성을 유도한후 프로브의 TM보다 낮은 온도에 방치하여 프로브가 표적 SNP 부위에 결합하도록 하는 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 4) 단계에서 DNA 용융 분석은 실시간 열순환기(Realtime thermal cycler)를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 SNP 지노타이핑 방법의 바람직한 예를 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.

1) 앰플리콘(amplicon)과 프로브(probe)의 설계단계

- 프라이머(primer)의 TM값이 가급적 58-60℃ 사이로 설계한다.

- 앰플리콘(amplicon)의 TM값이 가급적 75-85℃ 사이로 설계한다.

- 프로브(probe)의 TM값이 가급적 62-72℃ 사이로 설계한다.

- SNP에 의해 프로브(probe)의 TM값이 가급적 3℃ 이상 벌어지도록 설계한다.

2) 표적 사슬을 PCR 증폭하는 단계,

- 앰플리콘(amplicon)의 합성이 PCR증폭 단계에서 편평기(plateau)에 이를때까지 증폭한다.

- 필요시 멀티플렉싱(multiplexing) PCR을 수행할 수 있다.

3) 상기 PCR 앰플리콘(amplicon)을 어느 정도 희석(dilution)하는 단계,

- 증류수에 2~10배 희석하거나,

- PCR 반응 산물과 유사한 조성액에 2~10배 희석한다.

4) 상기 희석된 PCR 앰플리콘(amplicon)을 형광 DNA 결합 염료의 존재하에 비표지 올리고뉴클레오티드 프로브(unlabeled oligonucleotide probe)와 결합시키는 단계,

- 상기 희석액을 DNA 결합 형광 염료(dye)와 특정 SNP에 대한 비표지 올리고뉴클레오티드 프로브(unlabeled oligonucleotide probe)가 섞여있는 프로브(probe) 용액과 혼합한다. 이때 PCR 산물의 최종 희석수준이 20~50배 정도 되도록 한다.

5) 용융 분석(Melting analysis)하는 단계,

- 실시간 열순환기(Realtime thermal cycler)를 사용하여 상기 혼합물을 95℃로 가열하여 이중나선 PCR 산물의 변성을 유도하고 프로브(probe)의 TM보다 5℃ 정도 낮은 온도에 30~300초간 방치하여 프로브(probe)가 표적 DNA에 결합하도록 한다.

- 온도를 점차 올려가며 (0.1℃/sec) 프로브(probe)가 용융함에 따라 변해가는 형광수준을 획득한다.

6) SNP 타이핑(typing) 단계.

- 상기에서 얻어진 온도 변화에 따른 형광수준의 변화곡선의 미분곡선을 얻은 뒤, SNP의 각 타입을 대표하는 피크(peak)의 존재 유무에 따라 SNP를 타이핑(typing)한다.

형광 DNA 결합 염료의 존재하에 다형성(polymorphic) DNAs을 위한 비표지 올리고뉴클레오티드 프로브(probe)를 이용한 polymorphic single nucleotides (SNPs) 지노타이핑(genotyping)을 위해 DNA 용융 분석(melting analysis)을 적용하는 것은 프로브가 PCR 증폭된 표적 서열과 효율적으로 연합하기 위한 반응 조건을 필요로 한다. 본발명자들은 희석된 PCR 앰플리콘에 비표지 프로브를 적용하면 후속 프로브 용융에 의해 얻어지는 형광 시그날이 대립인자 동정(allelic identities)를 식별하는데 충분한 조건을 제공한다는 것을 실험적으로 증명하였다. 본 발명의 방법은 주어진 샘플에 다중(multiple) SNPs들을 커버하는 멀티플렉싱(multiplexing) PCR기술에 가장 효과적으로 사용될 수 있다. 즉, 앰플리콘 희석(dilution) 단계가 2가 양이온 킬레이션(divalent cation chelation)을 통해 폴리머라제(polymerase)를 불활성화 할 수 있기 때문에 종래 멀티플렉싱 PCR에 필수적이었던 프로브의 3’-말단 변형(modification)의 필요성을 없앨 수 있다. 따라서, 본 발명은 저렴한 시약들과 통상적인 실험실 장비들을 이용하여, 더 신속하고, 단순하며 비용효율적인 SNP 지노타이핑 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 시험된 SNP들의 서열 구조 및 용융 커브 분석(melting curve analysis)을 나타낸 것이다.
도 2는 용융 분석(melting analysis)에 대한 앰플리콘 Tm의 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 멀티플렉싱(multiplexing) PCR에 의해 생성된 앰플리콘들을 이용한 용융 분석(melting analysis)를 나타낸 것이다.
도 4는 20개의 SNP 부위에 대한 다중 PCR을 통해 생성된 앰플리콘들의 변성 분석을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: PCR

검정대상 SNP를 포함하는 유전체상의 작은 조각을 10~50 ng의 유전체 DNA를 주형으로 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 단순 PCR 증폭반응은 10회의 반복주기로 구성되며 첫회 94℃ 20초, 64℃ 15초 72℃를 기본으로하여 매 반복회 마다 annealing반응시 0.5℃의 온도를 낮추어 가는 단계를 거친 후, annealing 반응을 57℃ 20초간 진행하는 반복주기를 40회 추가로 수행하였다. 다중 PCR 증폭반응은 Henegariu 등(Henegariu et al., 1997)이 추천하는 방법을 따랐다. 반응 시료를 95’C 10분간 방치하여 효소를 활성화 시키고 95℃ 20초, 55℃ 25초, 65℃ 2분의 기본반응을 40회 반복하였다. 각 SNP에 대해 PCR 반응산물의 Tm값이 Idaho Technology사에서 배포하는 TM Utility v1.5 프로그램에 의해 75~85℃의 범위에 놓이도록 프라이머를 제작하였다.

실시예 2: 지노타이핑( Genotyping )

PCR 반응 산물과 이의 증류수 희석액을 5배 부피의 5nM Syto® 9 (Invitrogen^TM)과 12.5 mM의 EDTA 및 5 mM의 Tris (pH 8.0)가 포함된 probe 용액과 섞어서 최종 PCR 산물의 희석배수가 6X 내지 96X가 되게 한 후 Lightcycler® 2.0 instrument (Roche Diagnostics)를 사용하여 온도반응을 실시하였다. 반응은 95℃ 5초간 변성시키고 60℃에서 1분간 상보적 나선간의 annealing을 유도한 뒤온도를0.1℃/초로 점차 올리면서 형광을 측정하였다. Genotype은 각 UOP가 변성되는 온도에 기초하여 결정하였다

실험결과

결과1 . 희석이 프로브 ( probe ) 결합에 미치는 영향

PCR amplicon의 희석이 주어진 UOP로 하여금 표적 나선에 대한 결합이 이의 변성을 통해 다형성 염기를 구분할 수 있을 만큼 효과적인지를 검증하기 위해서 3종의 서로 다른 PCR amplicon을 사용하여 실험을 수행하였다. 알려진 SNP rs748514, rs2001599 또는 rs17170583 각각을 포함하는 세 곳의 염색체 부위의 113, 71, 95bp에 해당하는 작은 DNA 조각을 PCR 증폭하였다. 각 산물에 대한 UOP를 하나의 나선에 상보적이면서 크기가 32-44 염기를 갖고 변성온도(Tm)가 완전상보적 결합의 경우 68-71℃ 가 되도록 제작하였다 (표 1 참조).

SNP에 대해 3개의 유전자형이 두 번씩 나타나도록 각 SNP 별로 6개의 유전체 DNA를 선발하여 해당 DNA 조각을 PCR을 통해 증폭하였다. PCR 산물의 일부를 사용하여 2배씩 연속 희석액을 만든 뒤 이를 6배 부피의 형광염료 SYTO9과 해당 UOP가 들어있는 UOP 용액과 섞었다. 이 혼합액의 이중나선 DNA를최초 95℃에서 최초 변성시킨 후 유리 미세관에서 UOP들이 표적 나선에 결합하도록 하였다. 온도를 점차 올려가며 발광되는 형광의 수준을 얻었으며 그 결과를 도 1b에 제시하였다. 이때 각 희석수준에서 SNP rs748514의 경우 변성곡선과 negative 미분곡선을 나타내었고, 나머지 두 SNP rs2001599 과 rs17170583에 대해선negative 미분곡선만을 나타내었다. 변성곡선만으로는 각 유전자형을 판별하기에 불충분하였지만 negative 미분곡선으로부터는 genotype을 선명하게 판별할 수 있었으며 이는 특히 24 및 48 배 희석수준에서 더욱 두드러졌다. Amplicon 이중나선에 대한 UOP 이중나선의 상대적 비율은 희석수준이 높아질수록 커지는 걸로 나타났다.

더 나은 감도를 위해선 UOP가 표적 나선에 잘 결합하는 게 중요하다. Amplicon의 희석은 UOP에 결합하는 표적 나선의 분율을 증가시키는 한편 표적나선의 절대량을 감소시켜 높은 수준의 신호를 얻는데 방해가 될 수 있다. 우리의 Data는 24-48배의 희석수준에서 최고의 감도를 얻는 것으로 나타났다

결과 2. 앰플리콘(amplicon)의 크기가 지노타이핑(genotyping)의 감도에 미치는 영향

다음으로 amplicon의 희석이 이외의 요인들 중 이 방법의 감도에 미치는 영향을 조사하였다. 염기 조성이나 크기와 같은 amplicon의 화학적 특성은 amplicon의 재결합에 영향을 미침으로서 UOP의 표적 나선에 대한 결합속도에도 영향을 줄 것이므로 첫 번째 고려대상이었다. 이 문제를 살펴보기 위해서 SNP rs7518199를 포함하는 유전체 염기서열에 대해 여러 개의 프라이머를 제작하여 이들의 조합을 통해 이 SNP를 포함하는 다양한 크기와 Tm 값을 갖는 amplicon을 생산하도록 하였다.

주어진 SNP의 모든 유전자형이 두번씩 나타나도록 여섯개의 유전체 시료를 선발하여 Tm 값이 서로 다른 5종의 DNA조각을 증폭하였다. Amplicon의 2배 및 48배 희석수준에서 위에 제시한 조건과 동일한 열반응을 통해 negative 미분곡선을 얻어서 도 2c에 제시하였다. 2배 희석수준에서 genotype이 뚜렷하게 구분되는 경우는 Tm값이 가장 낮고 크기가 가장 작은 A amplicon 뿐이었다. 다른 amplicon들은 약하거나 구별되지 않는 UOP peak을 보였는데 이는 분명하게 작은 크기와 낮은 Tm 값을 갖는 amplicon이 UOP에 보다 더 잘 결합한다는 것을 보여주는 것이다. 반면에 모든 amplicon들을 48배 희석수준에서분석했을 때에는 각 genotype을 분명하게 구별할 수 있었다. 이러한 관찰은 amplicon의 희석이 UOP가 표적 나선에 잘 결합할 수 있는 환경을 제공한다는 것을 다시 한번 시사한다.

결과 3. 멀티플렉싱 ( multiplexing ) PCR 과의 조합

우리의 genotyping 방법은 PCR 증폭과 UOP 용액에 amplicon을 희석하는 것을 포함하는 DNA 변성분석 등 서로 구별되는 두과정으로 이루어 진다. 후자의 경우는 10분 미만으로 매우 빠르게 수행할 수 있으므로 한 시간 이상이 소요되는 PCR 반응이 이 분석의 속도를 제한하게 된다. 이러한 관점에서 멀티플렉싱 PCR반응의 도입은 이 방법의 처리 효율을 크게 개선시킬 수 있다. 이러한 시도의 성공 가능성을 검증하기 위해서 알려진 SNP를 포함하는 10개의 서로다른 염기서열을 16개의 유전체 시료를 주형으로하여 한 튜브에서 동시에 증폭하였다 (염기서열 정보는 하기 표 1을 참조).

[표 1]

분석에 사용된 amplicon들과 probe들의 구조. 각 amplicon을 생성하기 위한 프라이머는 푸른색으로 표시하였다. Probe의 염기서열은 밑줄 글자로 표시하였다. 다형성 염기는 amplicon의 주변 염기서열 가운데에 붉은색으로 나타냈으며, R, Y, S, W 및 M은 각각 G/A, C/T, C/G, T/A 및 C/A 염기 다형성을 나타낸다. 프로브의 방향성 (F, 정방향; R, 역방향)과다형성 부위에 해당하는 염기를 표시하였다. 목록에 나열된 모든 amplicon들은 다중PCR에 의해 동시에 증폭되었다. 단순PCR 분석은rs748514, rs2001599과rs17170583에 대해서 수행되었다.

** SNP rs7518199에 대해 제시된 프라이머들은 또한 도 2의 amplicon A를 증폭하기 위해 사용되었다. 도 2의 다른 amplicon들은 다음과 같이 여러 프라이머들의 조합에 의해 생성되었다. amplicon B를 위한 F1 (5’-GCTGGGATCTCAGCCTACA-3’) 과 R1 (5’-AGTGAGCATGACTCCTTTGC-3’); amplicon C를 위한 F1 과 R2 (5’-GATCAGGCTGCACTGTGG-3’); amplicon D를 위한 F2 (5’-GAGTGAACGGGGCTGGGT-3’) 과 R2; amplicon E를 위한 F3 (5’-CAGTAGTGTCGGGAGCAA-3’) 과 R3 (5’-CCAGGTGACACTGAGCCA-3’).

40배의 amplicon 희석수준에서 10개의 SNP에 대한 genotyping을 해당 UOP의 결합과 변성과정을 통해 순차적으로 분석하였다. 각 SNP에 대한 형광 프로필의 negative 미분곡선을 도 3에 두가지의 양식으로 나타내었다. 하나는 amplicon과 UOP의 변성 양상이 동시에 나타난 것(왼쪽)이고 다른 하나는 UOP만의 변성을 나타낸 것(오른쪽)이다. 어느 SNP에 상관 없이 모든 시료에서 SNP의 genotyping을 실시할 수 있었다. 또한 UOP만의 변성을 보여주는 좁은 온도 범위의 형광 프로필만으로도 SNP를 typing하는데 충분한 정보를 담고 있었다.

다음으로 각각이 알려진 AffymetricsGeneChip Human Mapping 500K set에도 식재되어있는 알려진 20개의SNP가 각각 포함된 20개의 유전체 조각을 다중 PCR반을을 통해 동시에 증폭하는 실험을 실시하였다. GeneChip 분석을 통해 각 SNP의 genotype을 알고있고 또한 모든 유전자형을 대변할 수 있는 10개의 유전체를 선발하여 PCR 주형으로 사용하였다. 20개의 UOP 각각의 변성곡선의 양상들이 다양하게 나타났다. 18개의 amplicon들이 다중 PCR반응에서 다양한 수준의 효율로 증폭되었다 (Supplementary Figure 1). 18개 UOP의 변성곡선으로부터 분명하게 genotype을 결정할 수 있었으나 나머지는 그렇지 못했다. GeneChip의 분석 결과와 비교한 결과 두 genotyping 방법 사이에 불일치는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 amplicon 특이적인 UOP를 사용하여 18개 이상의 amplicon으로 구성된 복잡한 혼합물에서도 genotyping이 유효함을 설명해준다.

도 1은 대상 SNP의 염기서열 구조 및 변성곡선 분석을 나타낸 것이다.. A. 주어진 SNP들을 포함하는 amplicon들의 염기서열 및 프라이머(파란색) 정보를 보여주고 있다. 염기서열 위쪽에 등록번호를 표시하였다. 각 SNP는 배경 염기서열 사이에 다형성을 나타내는 붉은색 글자로 표시하였다 (R, A/G; Y, C/T). UOP 염기서열은 화살표선으로 표시하여 염기서열과 방향성을 지시하였다. 다형성 부위에 해당하는 염기는 붉은색으로 표시하였다. B. 표시된 것처럼 6-96배 사이의다양한 희석수준에서 주어진 SNP에 해당하는amplicon 변성곡선(rs748514 한정, 왼쪽)과 변성곡선의 negative 미분곡선을 얻었다. 완전 상보결합과 단일 불일치 염기 상보결합에 대응하는 UOP의 negative 변성곡선을 6배 희석수준에서 각각 파란색과 붉은색의 화살머리로 표시하였다.

도 2는 Amplicon의 Tm이 변성분석에 미치는 영향을 나타낸 것이다. A. 괄호안에 표시된 것처럼 다양한 크기와 Tm을 가지면서 SNP rs751819를 포함하는 amplicon(A-E)들을 유전체DNA(coil)상의 SNP를 기준으로 상대적 위치를 표시하였음. 공통적으로 사용된 UOP probe을 점선으로 유전체 DNA 아래쪽에 표시하였음. B. PCR amplicon들을 2% 아가로스 젤에서 분리하였다. 마커 DNA들의 크기는 그림의 왼쪽에 표시하였다.C. 각 amplicon의 2배와 48배 2가지의 희석수준에 해당되는 negative 미분곡선을 표시하였다.

도 3은 멀티플렉싱 PCR반응에 의해 생성된 amplicon들의 변성 분석을 나타낸 것이다. 주어진 SNP에 대해 negative 미분곡선을 두 개의 온도범위, 즉 모든 이중나선의 변성양상을 보여주는 범위와 UOP 이중나선만을 보여주는 범위에서 각각 얻었다.

도 4는 20개의 SNP 부위에 대한 멀티플렉싱 PCR을 통해 생성된 amplicon들의 변성 분석을 나타낸 것이다. 주어진 SNP에 대한 negative 미분곡선을 UOP 이중나선의 변성양상만을 보여주는 온도범위에서 얻었다. 2개의 SNP를 제외한 18개의 SNP에 대해서 genotype을 분명하게 결정할 수 있었다.

결과 해석

여기에서 사용한 genotyping 방법의 원리는 PCR 증폭주기의 plateau phase 시기와 같이 고농도로 존재하는 변성된 PCR amplicon의 나선들은 배타적으로 재결합하는 특성 때문에 프라이머와 같이 작은 크기이며 어느 나선에도 상보적인 oliconucleotide들이 표적 나선에 결합하기 어렵다는 관찰에 기초한다. Amplicon DNA의이러한 배타적 재결합은 주형의 증폭이 거의 일어나지 않는 PCR plateau phase의 형성을 설명해 주는 듯 하다(Gevertz et al., 2005). Amplicon 재결합의 강도는 희석을 통해 그 농도를 낮춰 줌으로서 약화시킬 수 있을 것이다. 이로 인해 우리의 분석에서 사용된 UOP와 같이 작은 크기의 상보적 분자들의 활성이 가시적으로 드러날 수 있다. 다형성 염기에 따라 해당 UOP가 표적 나선에 대해 완전히 또는 단일 염기 불일치하게 상보적이게 되며 이는 변성시 그 양상이 달라지게 되는데,이는 DNA 결합 형광 염료의 존재에서 쉽게 관찰되므로 주어진 SNP의 다형성 염기를 구별할 수 있는 방법을 제공한다.

UOP는 다른 genotyping 방법에서도 활용되었는데, 이때 PCR 반응은 작은 크기의 amplicon을 증폭하거나, 표적 나선이 우월하게 증폭되도록 하는 방식으로 PCR 반응을 설정하였다. 이는 한 튜브안에서닫힌 상태로 단일 SNP를 typing하는 것을 목적으로 하여 amplicon의 배타적 재결합의 강도를 완화하거나 회피하는 절차를 적용한 것이다. 전자의 경우 표적나선의 비대칭적 축적을 생성하고 후자의 경우 작은 amplicon의 재결합강도가 큰 것보다작은 점을 활용한 것이다. 두 분석 방식은 단순하며 경제적인 방법을 제공하나, 다중 PCR을 통한 방법과 다양한 염기서열 배경에의 적용가능성(특히 후자의 경우)을 해결할 필요가 있다.

PCR 증폭단계와 희석과정 포함한 genotyping 단계를 분리함으로써 이점을 얻을 수 있다.Genotyping 단계는 그 특성상 수분밖에 걸리지 않으므로 다중 PCR 증폭반응을 통해 처리 수율을 크게 증가시킬 수 있다. 또한 PCR amplicon을 2가 양이온 킬레이터인 EDTA가 포함된 UOP 용액에 희석함으로써 열 안정성DNA 중합효소를 불활성화 시킬 수 있으므로 닫힌 튜브 반응에서 UOP가 중합효소의 기질로 작용하는 것을 방지하기 위해 반드시 도입하는 UOP의 3’말단 수정의 필요성을 감해준다. 또한 반응 튜브 또는 플레이트의 미량의 오염이 genotyping 반응에 크게 영향을 주지 않으므로 이들을 재활용할 수 있다는 점에서 genotyping 비용을 더욱 저감할 수 있다.

우리의 방법은 분석 절차나 분석 기전을 이해하는데 있어서 매우 단순한 것이다. 따라서 주어진 SNP에 대해 절차와 분석 인자들을 최적화 하기가 용이하다. 그럼에도 이 방법을 더 잘 적용하기 위해서 몇 가지 절차상 요건들에 대해 고찰해 보겠다. UOP에 의해 높고 구별되는 신호를 얻는 조건을 우선 고려하여야 한다. 염기쌍의 수가 많아질수록 DNA 이중나선에 결합하는 형광염료가 많아지므로 더 큰 형광신호를 획득할 수가 있다. 따라서 화학적 특성에 의해 분석이 방해 받지 않는 수준에서 UOP의 염기 수를 최대화하는 것이 바람직하다. 예를 들면, amplicon의 Tm을 낮은 수준으로설계하는 것이바람직하므로 (아래 참조) UOP의 길이를 늘리게 되면 UOP의 Tm이 amplicon의 Tm 과 비슷해져서 amplicon의 변성 피크와 UOP의 변성 피크가 겹쳐지는 결과가 초래되고 결국 genotyping을 어렵게 할 수 있다.

우리가 얻은 결과들은 amplicon의 희석이 재결합 반응이 amplcon의 이중나선 형성 보다는 UOP 이중나선 형성 쪽을 선호함을 설명해준다. 그러나 amplicon의 희석과정은 동시에 이용 가능한 UOP가 결합할 표적 나선의 양을 감소시킴으로써 형성될 UOP 이중나선의 절대량을 낮은 수준에 머물게 한다. 우리가 얻은 결과에 의하면 PCR amplicon을 24-48배 수준으로 희석했을 때 최고의 UOP 신호를 주는 것으로 나타났다.

Amplicon 이중나선의 Tm (그리고 이에 수반되는 amplicon의 크기) 또한 중요한 고려 요소이다. 높은 Tm 을 갖는 amplicon들은 낮은 값을 갖는 것들 보다 더 높은 재결합율을 갖는다. 하나의 UOP에 대해 상복적 염기서열을 갖지만 서로다른 Tm 값을 갖는amplicon들은 변성후 이중나선을 형성하는 속도가 Tm 값에 의해 결정되는 것으로 나타난다. 가장 낮은 Tm 값을 갖는 amplicon은 가장 낮은 재결합율을 보였고 Tm 값이 가장 높은 amplicon은 가장 높은 재결합율을 보였다. 따라서 PCR amplicon들의 Tm 값을 UOP 이중나선의 Tm값과 구별되는 범위에서 낮게 제한하는 것이 요구된다. 이러한 점에서 UOP 염기서열과 amplicon 증폭용 프라이머 염기서열간의 부분적 겹침이 분석을 방해하지 않는다는 점을 주목할 필요가 있다. 이러한 예는 rs17170538, rs7518199 및 다른 SNP들의 분석에서 살펴볼 수가 있으며, 이러한 점은 PCR amplicon의 Tm 값을 낮게 설계하는데 도움이 된다.

본 발명의 분석방법에 기초하여 PCR amplicon과 UOP에 대한 바람직한 설계 지침을 제안할 수 있다.

- 최적의 수행을 위해서 프라이머의 Tm값은 58~62℃ 사이에 있어야 한다.

- Amplicon의 Tm 값은 75~85℃ 범위로 하되 낮은 값이 더 좋다

- UOP의 Tm 값은 표적 나선과 와전한 또는 불완전한 상보적 결합을 하는 것에 상관없이 62℃ ~ 72℃ 사이에 놓이도록 하며, 두 가지 결합조건에서 형성된 UOP의 Tm 값의 차이가 최소 3℃ 이상 되도록 한다.

결론적으로, UOP probe가 일정조건아래서 수행된 단순한 변성분석을 통해 SNP genotyping 목적으로 효과적으로 사용될 수 있음을 밝혔다. 이러한 조건에는 SNP를 포함하는 PCR amplicon의 크기를 작게 설계하는 것과 PCR amplicon을 희석하는 것을 포함한다. 우리의 분석방법은 일반적 실험실 장비인 실시간 thermoCycler장비 외에는 특별한 장비를 필요로 하지 않는다. 분석 절차는 단순, 신속하고 소요되는 시약들의 비용은 저렴하다. 이 방법이 제공하는 장점들로 인해 우리의 방법은 SNP genotyping에 대한 실용적이고 경제적인 대안을 제시해준다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 SNP 지노타이핑(genotyping)을 위한 DNA 용융 분석에서 PCR 앰플리콘의 희석(dilution)에 의해 비표지 프로브의 결합 효율 및 대립 유전자(allelic identities)의 식별력(discrimination)을 높이고 멀티플렉싱(multiplexing) PCR에서 3’-말단 변형(modification)의 필요성을 없앨 수 있는 장점이 있다.

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Claims (10)

1. 다음 단계들을 포함하고, 하기 1)의 PCR증폭단계에서 비표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 함께 넣어주지 않고 PCR 증폭후에 따로 넣어주는 것을 특징으로 하는 DNA 용융 분석을 이용한 SNP 지노타이핑(genotyping) 방법:
   1) SNP 부위를 포함하는 표적 서열을 PCR 증폭하는 단계;
   2) 상기 증폭된 PCR 앰플리콘을 희석(dilution)하는 단계;
   3) 상기 희석된 PCR 앰플리콘을 형광 DNA 결합 염료(dye)의 존재하에 비표지 올리뉴클레오티드 프로브(unlabeled oligonucleotide probe)와 결합시키는 단계;
   4) 상기 결합된 산물의 온도를 점차 올려가면서 상기 프로브가 용융함에 따라 변해가는 형광강도를 측정(DNA 용융 분석)하는 단계,
   5) 상기 온도변화에 따른 형광강도의 변화곡선의 미분곡선을 얻은뒤, SNP의 각 타입을 대표하는 피크(peak)의 존재유무에 따라 SNP를 타이핑(typing)하는 단계.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 2) 단계에서 상기 PCR 앰플리콘은 증류수 또는 PCR 반응버퍼에 2~10 배 희석하는 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 3) 단계에서 프로브 용액과 섞은 후 최종 PCR 산물의 희석배수가 6배 내지 96배인 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 2) 단계에서 상기 PCR 앰플리콘의 희석에 의해 비표지 프로브의 결합 효율을 높이고 SNP간의 식별력(discrimination)을 높이는 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법
6. 제1항에 있어서, 상기 3) 단계에서 probe는 특정 고상 매질에 물리 또는 화학적으로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 1) 단계에서 상기 PCR 증폭은 다중 SNPs를 한꺼번에 증폭하는 멀티플렉싱(multiplexing) PCR 인 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 2) 단계에서 상기 PCR 앰플리콘의 희석에 의해 폴리머라제의 불활성화를 통해 프로브의 3’-말단 변형(modification)의 필요성을 없애는 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 3) 단계에서 상기 희석된 PCR 앰플리콘을 형광 DNA 결합 염료와 상기 SNP에 상보적인 서열을 갖는 비표지 올리고뉴클레오티드 프로브 용액과 혼합한 다음, 상기 혼합물을 가열하여 이중나선 PCR 산물의 변성을 유도한후 프로브의 TM보다 낮은 온도에 방치하여 프로브가 표적 SNP 부위에 결합하도록 하는 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 4) 단계에서 DNA 용융 분석은 실시간 열순환기(Realtime thermal cycler)를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑 방법.
    

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