KR101342488B1 - 테트라펩타이드 및 이를 함유하는 피부노화 방지 및 항염효능의 화장료 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 화학식 1과 화학식 2로 표시되는 테트라펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선, 항염용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 테트라펩타이드는 콜라겐 분해효소인 MMPs생성 억제로 인한 주름 개선효과와 더불어 염증 억제 효과를 나타냄으로써 주름 및 염증개선에 탁월한 효능을 갖는 화장료를 제공한다. 특히, 상기 주름개선 및 항염용의 테트라펩타이드는 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 포클린징, 바디오일, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스 또는 비누형태 등의 다양한 기초 화장료 조성물에 첨가하여 사용할 수 있으며 피부자극이 없고 피부안정성도 우수한 특징을 갖는다.
[화학식 1]
R-R1-Gly-Leu-Phe
[화학식 2]
R-Gly-Leu-Phe-R2
(상기 화학식 1 및 화학식 2에서, R은 수소 또는 탄소수 1~18의 아실기 중에서 선택되거나 또는 적어도 하나 이상의 이중결합을 포함하는 알케닐기이며, Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe이 될 수 있다. 또한 화학식 1과 화학식 2 중의 R1 및 R2로 표시되는 부분은 각각 아미노산, 특히 20개의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(Phenylglycine)중에서 선택될 수 있으며 C-말단은 카복실산 또는 아마이드 형태가 될 수 있다.)
[화학식 1]
R-R1-Gly-Leu-Phe
[화학식 2]
R-Gly-Leu-Phe-R2
(상기 화학식 1 및 화학식 2에서, R은 수소 또는 탄소수 1~18의 아실기 중에서 선택되거나 또는 적어도 하나 이상의 이중결합을 포함하는 알케닐기이며, Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe이 될 수 있다. 또한 화학식 1과 화학식 2 중의 R1 및 R2로 표시되는 부분은 각각 아미노산, 특히 20개의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(Phenylglycine)중에서 선택될 수 있으며 C-말단은 카복실산 또는 아마이드 형태가 될 수 있다.)
Description
본 발명은 신규한 테트라펩타이드(Tetrapeptide) 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지, 피부 주름 개선 및 항염용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 특히 본 발명은 피부 주름 개선용 화장품 적용에 가장 중요한 요소인 콜라겐 분해 효소의 합성 및 발현 억제와 자외선에 의해 증가하는 싸이토카인을 감소시킴으로써 피부 노화 방지, 피부 주름 개선 및 항염 효능을 가지는 신규한 테트라펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성에 관한 것이다.
산업이 발달하고 인간의 평균수명이 길어짐에 따라 피부의 기능과 외적인 미와 관련해서 노화가 피부에 미치는 영향에 대한 관심이 크게 증가하고 있다. 피부는 외부 환경과 직접적으로 맞닿아 있기 때문에 외상, 감염, 자외선을 포함한 외적 요인으로부터 신체를 보호하는 중요한 장벽 역할을 하는 다양한 세포와 구조로 이루어진 복잡한 기관이다. 피부는 크게 표피, 진피, 피하조직으로 이루어져 있다. 표피는 주로 케라티노싸이트(Keratinocytes)와 색소를 내는 멜라노싸이트(Melanocytes)와 랑게르한스(Langerhans) 세포로 이루어진 얇은 층조직이고, 진피는 주로 섬유아세포종(Fibroblasts)에 의해 생성되는 세포 외 조직단백질로 이루어져 있으며, 지방세포(Sebocytes)로 구성되어 있는 피하조직은 결합조직의 틀을 담당한다. 가장 많이 존재하는 단백질인 타입 Ⅰ 콜라겐(Type I collagen)은 다른 타입의 콜라겐(Collagen), 엘라스틴(Elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan), 파이브로넥틴(Fibronectin) 외의 다른 세포 외 조직 단백질과 더불어 결합조직을 구성한다. 새로 생성된 타입 Ⅰ 프로콜라겐(Type I procollagen)은 진피의 세포 외 공간으로 분비된 후 피브릴로제네시스(Fibrillogenesis) 과정을 거쳐 피부에 탄성과 강도에 기여하는 콜라겐을 생성한다.
피부 노화는 유전적, 환경적 노출(UV 조사, 기계적인 충격), 호르몬 변화, 대사적 과정(활성산소종, 당, 알데하이드와 같은 반응성이 큰 화합물)에 의해 영향을 받는다. 이러한 요인들은 피부의 구조, 기능, 겉모습의 축적된 변화를 초래한다. 인간의 피부 노화는 두 다른 생물학적 과정에 따라 시간이 지나면서 나타나는 내적 노화와 지속적인 빛 노출, 스트레스, 흡연 등과 같은 환경에 의한 외적 노화(광노화)로 구분된다. 임상학적으로 내적 노화된 피부에서는 얇고 건조하고 창백하며 탄성을 잃고 많은 잔주름을 띄는 특징을 지니는 반면 빛, 흡연 등 외적 환경에 의해 노화가 진행된 피부의 경우 깊은 주름, 반점의 착색과 거친 피부가 관찰되는 등 피부에 더 큰 영향을 가하게 된다. 비록 연대학적으로 나이든 피부와 광노화된 피부는 형태학적 조직학적으로 차이가 있어 외관이 확연히 구분되지만 최근 연구 결과들에 의하면 두 노화들이 모두 콜라겐 분해효소(MMPs)의 발현 촉진, 프로콜라겐의 합성 감소, 결합조직의 손상과 같은 신호전달 경로를 포함한 중요한 분자적 특징을 공유한다고 보고 되어 있다. 환경에 의한 영향은 내적인 요인보다 피부에 미적 질이나 조직에 더욱더 명백한 변이를 주는데, 가장 치명적인 외부적 요인은 UV 조사이다. 이러한 분자적 메커니즘의 일치는 UV 조사가 인간 피부의 연대학적 나이에 의한 노화의 중요 측면들을 가속화하는 것으로 여겨진다.
조직학적 관점에서 피부노화는 피부의 진피에서 메트릭스(Matrix)를 형성하는 세포 외 조직(Extracellular matrix proteins) 조성의 변화로 나타난다. 진피 세포 외 조직 중 콜라겐 단백질들은 피부에 강도와 장력을 부여하며 이로 인해 외부의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하며 진피층의 90%를 차지하고 있어 콜라겐의 감소는 피부 노화와 주름형성에 밀접한 관련이 있다. 건강한 진피의 주요 가교 구성 성분들은 타입Ⅰ콜라겐과 타입Ⅲ콜라겐이다. 하지만 광노화에 의해 손상된 피부에서는 이 두 콜라겐의 전구체가 확연히 감소하였고 이들의 감소가 임상학적 심각성과 연관되어 있다. 콜라겐은 노화가 진행되면서 분해되기도 하나 자외선 같은 자극에 노출되게 되면 콜라겐 분해효소들(MMPs)의 생합성이 증가하면서 콜라겐 합성이 감소하게 되어 주름이 형성된다. 콜라겐 분해효소들(MMPs)은 아연-의존적인 세포 내 단백분해 효소로 진피의 세포 외 구조의 성분들을 분해시키거나 재구조화시킬 수 있는 물질로서 그 중 MMP-1은 진피의 콜라겐에 작용하여 분절시킨다. 따라서 이 효소의 합성 양과 활성도의 조절이 주름에 중요한 요인으로 작용한다.
피부에 손상을 가하는 환경적 요인 중에서 가장 유해한 요소인 자외선은 전자기파 스펙트럼에서 200nm 와 400nm 사이의 파장대를 말하며, 파장의 길이에 따라 UVA(320-400 nm), UVB(280-320nm) 와 UVC(200-280nm)로 나누어 진다. UVC는 오존층에 의해 차단되기 때문에 인간 피부에 해롭게 작용하는 태양복사는 UVA와 UVB이다. UVA 복사는 UVB 복사보다 덜 강하지만 피부 침투성이 높은 특징을 가지고 있고 UVA에 의한 피부 손상은 선번(sunburn), 암, 피부노화 등이 알려져 있다. 인간의 건강과 관련하여 가장 위험한 환경적 발암 인자로 알려져 있는 UVB 복사는 홍반과 썬번(sunburn) 이외에도 유전자 손상과 피부암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 광노화에 의해 손상된 피부의 가장 큰 변화는 피부의 깊은 부분인 진피에서 일어나며 연결 조직의 분해, 콜라겐 함량의 감소와 변형된 엘라스틱 섬유의 축적을 유발한다.
피부 주름 개선 물질로 가장 대표적인 것이 레티놀(Retinol)과 레티노이드(Retinoids)라고 명명되는 그 유도체들로써 건선, 노화, 암, 여드름 등 다방면에서 좋은 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 또한 이 레티노이드는 피부에 도포하였을 때 콜라겐분해효소(MMP-1)를 저해함으로서 콜라겐의 손실을 방지하고 콜라겐 형성을 자극함으로써 내인성 및 광노화를 방지하고 회복시키는 것으로 알려져 있다. 하지만 이러한 효과에도 불구하고 피부에 도포하였을 때 홍반, 가려움, 건선, scaling 등의 국소적 피부자극 반응을 일으킨다고 알려져 있다. 따라서 생체에 안전하고 기존의 물질보다 콜라겐분해효소(MMP-1)를 억제하고 콜라겐 합성능이 좋은 새로운 주름개선 물질 개발이 요구되고 있다.
UV 조사에 의한 피부의 손상은 주름 형성뿐만 아니라 염증반응도 일으키는 것으로 알려져 있다. 피부 손상에 관해 위에서 언급한 생체 기작과 더불어 피부는 IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α를 포함하는 수많은 싸이토카인(Cytokines)을 분비하는 것으로 알려져 있다. 가장 치명적인 외부자극 중 UVB 조사는 케라티노사이트(Keratinocytes)가 Tumour necrosis factor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β), IL-6, IL-10 과 IL-8을 세포 외로 분비하도록 자극한다. UVA 조사는 진피층의 섬유아세포로부터 이러한 싸이토카인들의 생성을 가중시킬 뿐만 아니라 MMP-1 같은 콜라겐 분해효소를 유도하는 것으로 알려져 있다. 태양광에 노출된 피부는 이러한 싸이토카인들의 분비로 인해 지속적인 염증반응을 촉진시킨다. 만성적인 염증과 여러 암 생성의 관계는 잘 알려져 있을 뿐만 아니라 여러 종양 실험에서도 잘 나타나있다. 여러 외부자극에 의해 싸이토카인들을 생산하도록 유도된 피부세포는 싸이토카인 조절능력을 잃게 되고 결국 암을 포함한 여러 피부 질환을 일으키게 된다. 따라서 UV자극에 의해 손상되는 피부 노화와 더불어 지속적인 싸이토카인들에 의한 염증반응을 억제하는 물질의 개발이 또한 요구되고 있다.
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이러한 배경하에 본 발명자들은 테트라펩타이드의 노화방지 및 주름 개선, 항염 효과를 확인하기 위하여 피부 섬유아세포종(human skin fibroblasts)세포주와 UVA/UVB lamp를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 콜라겐과 콜라겐 분해효소(MMPs)의 생합성 능력을 레티노이드와 비교 검색하였고, 케라티노사이트(Keratinocytes), 섬유아세포종(human skin fibroblasts)과 UVB lamp를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 UV조사에 의해 증가한 싸이토카인들의 감소를 확인하고 테트라펩타이드(Tetrapeptide)의 주름개선 효과와 항염 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서 본 발명의 목적은 인체에 무해하며 피부 침투성이나 안정성이 뛰어난 신규한 테트라펩타이드(Tetrapeptide) 및 이를 함유하는 노화방지, 주름개선 및 항염 효과를 나타내는 피부 외용 약학 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 테트라펩타이드는 하기 화학식 1과 화학식 2로 표시된다.
[화학식 1]
R-R1-Gly-Leu-Phe
[화학식 2]
R-Gly-Leu-Phe-R2
(상기 화학식 1 및 화학식 2에서, R은 수소 또는 탄소수 1~18의 아실기 중에서 선택되거나 또는 적어도 하나 이상의 이중결합을 포함하는 알케닐기이며, Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe이 될 수 있다. 또한 화학식 1과 화학식 2 중의 R1 및 R2로 표시되는 부분은 각각 아미노산, 특히 20개의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(Phenylglycine)중에서 선택될 수 있으며 C-말단은 카복실산 또는 아마이드 형태가 될 수 있다.)
상기에서, R은 수소 또는 에타노일, 옥타노일, 테트라데카노일, 헥사데카노일 및 옥타데카노일로 이루어진 아실기부터 선택되는 것이 바람직하다. 특히, 상기 R이 테트라데카노일 또는 헥사데카노일이고, 표시되는 트리펩타이드의 아미노산 중 Leu 는 L-Leu으로 Phe는 L-Phe인 것이 바람직하고, 상기 C-말단은 카복실산인 것이 더욱 바람직하다.
상기 R1은 글리신(glycine), 루신(leucine), 라이신(lysine), 세린(serine)으로 이루어진 아미노산으로부터 선택되는 것이 바람직하고, R2는 시스틴(cystein), 글루타믹산(glutamic acid), 페닐알라닌(phenylalanine), 글리신(glycine), 이소루신(isoleucine), 발린(valine), 프롤린(proline), 루신(leucine), 세린(serine), 트리오닌(thrionine), 트립토판(tryptopane), 티로신(tyrosine)으로 이루어진 아미노산으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 특히, 상기 R1은 글리신(glycine) 그리고 R2는 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 트리오닌(thrionine), 트립토판(tryptopane), 티로신(tyrosine)으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상기한 테트라펩타이드를 유효성분으로 하는 항노화 및 항염제 조성물을 제공한다. 특히, 상기한 테트라펩타이드가 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001~10 중량%로 포함되는 항노화 및 항염제 조성물을 제공한다. 이러한 항노화제 조성물은 화장료 조성물이거나 의약 조성물일 수 있다. 이러한 조성물은 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 포클린징, 바디오일, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스 또는 비누형태로 형성될 수 있다.
본 발명은 피부자극이 없고 피부안정성도 우수한 신규한 테트라펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조성물이 콜라겐 분해효소인 MMP-1생성 억제, 콜라겐 생합성 증진효과로 인한 주름 개선효과와 더불어 염증 억제 효과를 나타냄을 확인하였고, 이에 이것을 주름 및 염증 개선에 탁월한 효능을 갖는 피부 약학 조성물 및 화장료 조성물로 사용하는 것이다.
도 1 은 테트라펩타이드(A440_19)의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예로서 도1에서 확인한 안전한 농도에서 테트라펩타이드(A440_19)에 의한 MMP-1 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 3은 본 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1에 대한 테트라펩타이드(A440_19)의 MMP-1 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 4는 본 발명의 실시예로서 UVB 조사에 의해 증가한 MMP-1에 대한 테트라펩타이드(A440_19)의 MMP-1 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 5는 본 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1에 대한 테트라펩타이드(A440_19)의 MMP-1 저해능력을 레티닐팔미테이트(Retinyl Palmitate)와 비교 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 6은 본 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1에 대한 테트라펩타이드(A440_19)의 MMP-1 저해능력을 레티놀(Retinol)과 비교 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 7은 본 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 감소한 프로콜라젠 타입1에 대한 테트라펩타이드(A440_19)의 프로콜라젠 타입1(Procollagen Type I)증진 능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 8은 본 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 변화한 세포 외 단백질 mRNA 발현 변화에 대해 테트라펩타이드(A440_19)가 미치는 영향을 나타낸 도표이다.
도9는 본 발명의 실시예로서 도8에서 나온 결과 중 MMP-1 발현량을 덴시토미터(Densitometer)로 수치화 하여 도표로 나타낸 것이다.
도10은 본 발명의 실시예로서 도8에서 나온 결과 중 프로콜라젠 타입 1 (Procollagen Type I) 발현량을 덴시토미터(Densitometer)로 수치화 하여 도표로 나타낸 것이다.
도11은 본 발명의 실시예로서 도8에서 나온 결과 중 파이브로넥틴(Fibronectin)의 발현량을 덴시토미터로 수치화 하여 도표로 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예로서 진피세포(Skin Firoblasts)에서 테트라펩타이드(A440_19)의 UVB 조사에 대해 증가한 IL-1b와 IL- 6와 IL-8 싸이토카인(Cytokine) 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 13은 본 발명의 실시예로서 표피 중 케라티노사이트 (Keratinocytes) 세포에서 테트라펩타이드(A440_19)의 UVB 조사에 대해 증가한 IL1-α, IL-1β와 IL- 6와 IL-8 싸이토카인(Cytokine) 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 14은 본 발명의 실시예로서 테트라펩타이드(A440_19)의한 주름 개선효과를 임상실험에서 확인하여 도표로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예로서 도1에서 확인한 안전한 농도에서 테트라펩타이드(A440_19)에 의한 MMP-1 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 3은 본 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1에 대한 테트라펩타이드(A440_19)의 MMP-1 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 4는 본 발명의 실시예로서 UVB 조사에 의해 증가한 MMP-1에 대한 테트라펩타이드(A440_19)의 MMP-1 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 5는 본 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1에 대한 테트라펩타이드(A440_19)의 MMP-1 저해능력을 레티닐팔미테이트(Retinyl Palmitate)와 비교 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 6은 본 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1에 대한 테트라펩타이드(A440_19)의 MMP-1 저해능력을 레티놀(Retinol)과 비교 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 7은 본 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 감소한 프로콜라젠 타입1에 대한 테트라펩타이드(A440_19)의 프로콜라젠 타입1(Procollagen Type I)증진 능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 8은 본 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 변화한 세포 외 단백질 mRNA 발현 변화에 대해 테트라펩타이드(A440_19)가 미치는 영향을 나타낸 도표이다.
도9는 본 발명의 실시예로서 도8에서 나온 결과 중 MMP-1 발현량을 덴시토미터(Densitometer)로 수치화 하여 도표로 나타낸 것이다.
도10은 본 발명의 실시예로서 도8에서 나온 결과 중 프로콜라젠 타입 1 (Procollagen Type I) 발현량을 덴시토미터(Densitometer)로 수치화 하여 도표로 나타낸 것이다.
도11은 본 발명의 실시예로서 도8에서 나온 결과 중 파이브로넥틴(Fibronectin)의 발현량을 덴시토미터로 수치화 하여 도표로 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예로서 진피세포(Skin Firoblasts)에서 테트라펩타이드(A440_19)의 UVB 조사에 대해 증가한 IL-1b와 IL- 6와 IL-8 싸이토카인(Cytokine) 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 13은 본 발명의 실시예로서 표피 중 케라티노사이트 (Keratinocytes) 세포에서 테트라펩타이드(A440_19)의 UVB 조사에 대해 증가한 IL1-α, IL-1β와 IL- 6와 IL-8 싸이토카인(Cytokine) 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 14은 본 발명의 실시예로서 테트라펩타이드(A440_19)의한 주름 개선효과를 임상실험에서 확인하여 도표로 나타낸 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 테트라펩타이드는 하기 화학식 1과 화학식 2로 표시된다.
[화학식 1]
R-R1-Gly-Leu-Phe
[화학식 2]
R-Gly-Leu-Phe-R2
(상기 화학식 1 및 화학식 2에서, R은 수소 또는 탄소수 1~18의 아실기 중에서 선택되거나 또는 적어도 하나 이상의 이중결합을 포함하는 알케닐기이며, Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe이 될 수 있다. 또한 화학식 1과 화학식 2 중의 R1 및 R2로 표시되는 부분은 각각 아미노산, 특히 20개의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(Phenylglycine)중에서 선택될 수 있으며 C-말단은 카복실산 또는 아마이드 형태가 될 수 있다.)
상기에서, R은 폴리펩타이드의 N-말단에 결합하는 잔기로서 R의 구체적인 예로는 수소 또는 아세틸, 프로파노일, 부타노일, 펜타노일, 헥사노일, 옥타노일, 노나노일, 데카노일, 도데카노일, 테트라데카노일, 헥사데카노일, 옥타데카노일 등과 같은 아실기가 포함될 수 있다. 특히 R은 수소, 아세틸, 옥타노일, 테트라데카노일, 헥사데카노일 또는 옥타데카노일 중에서 선택되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 R이 테트라데카노일 또는 헥사데카노일인 경우, 항노화 효과가 더욱 우수하다. R은 또한 최소한 하나 이상의 이중결합을 포함하는 알케닐 그룹일 수도 있다. 특히, 상기 R이 테트라데카노일 또는 헥사데카노일이고, 상기 C-말단은 카복실산인 것이 더욱 바람직하다.
화학식 1 중 R1 로 표시되는 아미노산은 20종의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(phenylglycine) 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 세린(serine), 아스파틱산(aspartic acid), 글루타믹산(glutamic acid), 발린(valine), 트리오닌(thrionine), 알지닌(arginine), 라이신(lysine), 프롤린(proline), 루신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 이소루신(isoleucine), 히스티딘(histidine), 티로신(tyrosine), 메타이오닌(methionine), 시스틴(cystein), 트립토판(tryptopane), 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 페닐글리신(phenylglycine) 등이 있으며, 이 중 바람직하게는 글리신(glycine), 루신(leucine), 라이신(lysine), 세린(serine) 중에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 글리신(glycine)인 경우이다.
화학식 2 중 R2 로 표시되는 아미노산은 20종의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(phenylglycine) 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 세린(serine), 아스파틱산(aspartic acid), 글루타믹산(glutamic acid), 발린(valine), 트리오닌(thrionine), 알지닌(arginine), 라이신(lysine), 프롤린(proline), 루신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 이소루신(isoleucine), 히스티딘(histidine), 티로신(tyrosine), 메타이오닌(methionine), 시스틴(cystein), 트립토판(tryptopane), 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine) , 페닐글리신(phenylglycine) 등이 있으며, 이 중 바람직하게는 시스틴(cystein), 글루타믹산(glutamic acid), 페닐알라닌(phenylalanine), 글리신(glycine), 이소루신(isoleucine), 발린(valine), 프롤린(proline), 루신(leucine), 세린(serine), 트리오닌(thrionine), 트립토판(tryptopane), 티로신(tyrosine) 중에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 R2 로 표시되는 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 트리오닌(thrionine), 트립토판(tryptopane), 티로신(tyrosine) 인 경우이다.
화학식 1과 화학식2에 표시되는 폴리펩타이드의 아미노산은 L-form과 D-form의 아미노산을 포함할 수 있으며 모든 아미노산이 L-form을 가지는 것이 보다 바람직하다. 또한 테트라펩타이드의 C-말단은 카복실산 또는 아마이드 형태가 선택될 수 있으며, 바람직하게는 카복실산 형태를 가진다.
본 발명에 따른 테트라펩타이드는 통상적인 펩타이드 합성기를 사용한 고체상 방법에 의하여 합성될 수 있다. 통상적으로, 사용되는 아미노산은 N-말단이 보호된 형태 그리고 반응성 측쇄가 보호된 형태로 사용된다. N-말단을 보호하는 보호기로는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc)가 일반적으로 사용된다. 반응성 측쇄를 보호하기 위한 보호기로는 트리페닐메틸, 부틸옥시카르보닐, t-부틸에스테르, 펜타메틸크로만-6-술포닐 등이 사용된다. 본 발명에서 사용되는 아미노산은 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc)로 N-말단이 보호될 수 있다.
고체상 반응을 위하여 사용되는 수지는 폴리펩타이드의 C-말단의 형태가 카복실산인지 아마이드 형태인지에 따라 다르게 적용한다. C-말단의 형태가 카복실산인 경우는 2-클로로트리틸 클로라이드(2-Chlorotrityl chloride, CTC), 4-벤질옥시벤질알콜(Wang), 하이드록시메틸페녹시아세틸(HMPA) 수지가 사용될 수 있으며, C-말단의 형태가 아마이드인 경우는 수지의 말단이 아민기로 만들어진 것으로서, 예를 들어 트리알콕시벤즈하이드릴아민 (Trialkoxybenzhydrylamine, Rink amide), 메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지가 사용될 수 있다.
위의 모든 수지를 사용함에 있어서 펩타이드는 C-말단에서부터 N-말단 방향으로 합성된다. 커플링시 아미노산의 카르복실기를 활성제로 활성화시키고, 커플링 후 N-말단의 보호기는 피페리딘으로 제거되고, 다음 커플링이 수행된다. 카르복실기 활성제로는 HATU(N-[(dimethylamino-)-1H -1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(1-hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAt) 혹은 HBTU(N-[(1H-benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole, HOBt)에 DIEA(N,N-diisopropylethylamine)가 함께 이용 될 수 있고, N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)와 첨가 보조제로 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 혹은 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)이 함께 사용될 수 있다. 본 발명에서는 4개의 아미노산이 커플링 된 후에는 N-말단의 아민기는 원하는 아실기를 가지는 아실 활성체, 예를 들어, 아실안하이드라이드(acyl anhydride)와 DMAP(4-(N,N-dimethylamino)pyridine))를 함께 반응하여 N-말단에서 아마이드 결합을 형성하거나 카르복실산(Fatty acid)과 N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 혹은 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)이 함께 사용되어 아마이드 결합을 형성할 수 있다. 그런 후 트리플루오로아세트산(TFA)을 포함하는 절단용액에 의하여 폴리펩타이드 유사체는 고체 수지로부터 분리되고 또한 그것의 측쇄에 결합된 보호기가 제거된다.
본 발명은 또한 이러한 테트라펩타이드를 포함하는 항노화제 또는 항염제 조성물을 제공한다. 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 항노화 및 항염용 화장료에 0.0001~10중량%로 함유하는 것이 바람직하며, 0.001~5중량%로 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 함량이 0.0001 중량% 미만일 경우에는 효과가 미미하고, 10중량% 이상인 경우에는 사용량에 따른 경제성이 결여될 경향이 높아진다.
상기 화학식 1과 화학식 2의 테트라펩타이드를 포함하는 화장료는 이미 알려진 화장료 제조방법에 의해 화장료를 제조할 수 있고, 일반적인 피부 화장료에 한정되지 않고 의약부외품, 외용 의약품에도 적용할 수 있다. 이들의 제형은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 포클린징, 바디오일, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스 또는 비누형태로 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그리고 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기한 테트라펩타이드 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형, 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
이하, 다음은 상기와 같이 구성된 본 발명에 대해 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서는 자명할 것이다.
<실시예 1> 시료준비 (합성 및 분리정제)
[화학식 1]
R-R1-Gly-Leu-Phe
[화학식 2]
R-Gly-Leu-Phe-R2
| 화합물 이름 | 펩타이드서열 | 화합물 이름 | 펩타이드서열 |
| A440_1 | Myr-GLFA | A440_21 | Myr-AGLF |
| A440_2 | Myr-GLFC | A440_22 | Myr-CGLF |
| A440_3 | Myr-GLFD | A440_23 | Myr-DGLF |
| A440_4 | Myr-GLFE | A440_24 | Myr-EGLF |
| A440_5 | myr-GLFF | A440_25 | myr-FGLF |
| A440_6 | myr-GLFG | A440_26 | myr-GGLF |
| A440_7 | myr-GLFH | A440_27 | myr-HGLF |
| A440_8 | myr-GLFI | A440_28 | myr-IGLF |
| A440_9 | myr-GLFK | A440_29 | myr-KGLF |
| A440_10 | myr-GLFL | A440_30 | myr-LGLF |
| A440_11 | myr-GLFM | A440_31 | myr-MGLF |
| A440_12 | myr-GLFN | A440_32 | myr-NGLF |
| A440_13 | myr-GLFP | A440_33 | myr-PGLF |
| A440_14 | myr-GLFQ | A440_34 | myr-QGLF |
| A440_15 | myr-GLFR | A440_35 | myr-RGLF |
| A440_16 | myr-GLFS | A440_36 | myr-SGLF |
| A440_17 | myr-GLFT | A440_37 | myr-TGLF |
| A440_18 | myr-GLFV | A440_38 | myr-VGLF |
| A440_19 | Myr-GLFW | A440_39 | Myr-WGLF |
| A440_20 | myr-GLFY | A440_40 | myr-YGLF |
상기 표 1에서 myr은 테트라데카노일 그룹, 즉 미리스토일(myristoyl) 그룹을 의미한다.
위의 표1에 제시된 본 발명의 화합물 A440 series 를 합성하기 위해 메리필드(Merrifield)의 SPPS(Solid Phase Peptide Synthesis) 방법(J. Am. Chem. Soc., 85(14), 2149-2154)을 이용하였다. 발명의 펩타이드 합성을 위해 2-클로로트리틸 클로라이드(CTC) 수지를 이용하여 합성을 시작하였으며, 첫 단계의 Fmoc(9-fluorenylmethoxy carbonyl) 아미노산은 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine, DIEA)를 사용하여 디클로로메탄(dichloromethane, DCM) 용매 하에서 커플링한다. 그 다음 단계의 Fmoc 아미노산부터는 HATU(N-[(dimethylamino-)-1H -1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 혹은 HBTU(N-[(1H-benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)에 DIEA(N,N-diisopropylethylamine)를 함께 사용하여 커플링을 해나가는 방법으로 펩타이드의 사슬을 연장시켰다. 이때, C-말단에서부터 N-말단 방향으로 합성해 나가며, 아미노말단에 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% piperidine 용액으로 Fmoc기를 제거(Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide (1 ed.). CRC Press. 848)하고 DMF(Dimethylforamide)으로 여러번 씻어준 다음 커플링 해나가는 방법으로 진행된다. 마지막으로 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% piperidine 용액으로 Fmoc기를 제거하고 카르복실산과 N, N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)을 함께 사용하여 아실기를 커플링한 다음 DMF로 여러 번 세척하여 건조시켰다. 여기에 TFA(Trifuloroacetic acid)-H2O-Triisopropylsilane(95:2.5:2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 2 내지 3시간 반응시켜 보호기(Protecting group)의 제거 및 resin으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸에테르(diethylether)로 펩타이드를 침천시켰다. 상기의 방법으로 얻은 crude 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴(acetonitrile)과 물의 구배 용매조성으로 RP-HPLC(2996 Detector, 515 Pump, Waters)을 이용하여 순도를 확인하였으며, 순도확인 결과 95%이하의 펩타이드는 Prep-LC로 분리 정제하여 95% 이상의 펩타이드를 얻었다. 이 펩타이드의 정확한 성분확인을 위하여 Elemental Analyzer(EA1112, CE Instrument, Italy)로 원소분석을 한 결과, 펩타이드의 원소별 함유량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 원소별 함유량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다. 이때 C-말단이 아마이드 형태의 화합물인 경우 트리알콕시벤즈하이드릴아민 (Rink amide) 수지를 이용하였으며, 2-클로로트리틸 클로라이드(CTC)를 이용한 펩타이드 합성시의 첫번째 커플링 방법을 제외한 다음 단계방법부터 동일하게 커플링을 진행하였다. 이렇게 합성된 모든 화합물들도 항노화 및 항염효과를 측정하는데 이용되었다.
<실시예 2> 피부노화 방지 및 피부주름 개선 효과
인간의 진피 세포를 이용하여 화합물 테트라펩타이드의 피부 노화 방지 효과와 피부주름 개선 효과를 실험하였다.
피부에 주름이 생성되는 것은 피부의 노화가 진행되거나 자외선 같은 자극에 노출되게 되면서 콜라겐 분해효소들(MMPs)의 생합성이 증가함에 따라 콜라겐 합성이 감소하기 때문이다. 따라서 MMP-1과 같은 콜라겐 분해효소의 생합성양을 감소 시키고 자외선에 의해 급감하는 Procollagen 1 양을 증진 시키는 것으로 피부 주름을 예방, 개선할 수 있다.
본 실험은 피부 섬유아세포종(human skin fibroblsts, Hs68) 세포주와 테트라펩타이드를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 MMP-1의 생합성 양과 mRNA 발현양을 평가함으로써 테트라펩타이드의 피부 노화 방지 효과를 확인하였고, 피부 섬유아세포종(human skin fibroblst, Hs68) 세포주와 UVA/UVB lamp를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 자외선 조사에 의한 노화에 미치는 테트라펩타이드의 활성을 측정함으로써 피부주름 개선 효과를 측정하였다.
(1) 세포주 및 세포배양
실험에 사용된 세포주는 human skin fibroblasts Hs68세포(ATCC, USA) 를 사용하였다. Hs68 세포는 37°C, 5% CO2의 조건에서 10% FBS (Gibco Co), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 사용하여 배양하였다(Incubator; Thermo-scientific, USA). Hs68 세포는 100 cm2 플라스크 (Corning, USA)에서 충분히 증식시킨 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS로 씻어준 후 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 배양기에서 3분간 처리한 다음 트립신-EDTA 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 10 ㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:5의 분할율 (split ratio)로 37℃, 5% CO2의 조건에서 계대배양하였다.
(2 ) 세포
생존률
측정
Hs68 (Human skin fibroblasts)를 1*104 cells/well 농도로 96 well plate에 분주하여 37℃, 5% CO2의 조건에서 24 시간 배양하고 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양하였다. 배양상등액을 제거하고 무혈청배지 100㎕와 MTT용액(3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)2,5디페닐테트라졸리움브로마이드(5mg/㎖)을 각각 10㎕씩 넣고 3시간 동안 배양 후 배지를 제거한다. 각 well 에 100㎕ 의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)용액을 첨가하고 포마젠(Formazan)을 용해시킨 후 마이크로 플레이트 판독기(Microplate reader, Tecan)을 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정, 아래의 수학식 1과 같이 세포 생존률(%)을 환산하였다.
[수학식1]
세포 생존률(%) = (Ss)/Sc×100
Ss: 시료를 처리한 군의 흡광도
Sc: 시료를 처리하지 않은 군의 흡광도
아래의 표2는 테트라펩타이드를 10ppm 처리한 후 세포독성을 실험한 결과를 나타낸 것이다. 도1은 아래의 표2에서 보여주는 것과 같이 세포독성이 없고 MMP-1 저해 효과가 가장 좋았던 테트라펩타이드 중 하나인 화합물A440_19의 세포독성을 다양한 농도에서 실험한 결과를 내타낸 도표이다. 도1에 나타난 바와 같이, MTT 분석결과 1 내지 30ppm까지 95% 이상의 세포 생존률을 보여 화합물A440_19가 안전한 원료임을 확인하였다.
|
화합물
이름 |
서열 |
세포
생존률 (%) |
화합물
이름 |
서열 |
세포
생존률 (%) |
| A440_1 | myr-GLFA | 100 | A440_21 | myr-AGLF | 100 |
| A440_2 | myr-GLFC | 95 | A440_22 | myr-CGLF | 97 |
| A440_3 | myr-GLFD | 87 | A440_23 | myr-DGLF | 101 |
| A440_4 | myr-GLFE | 100 | A440_24 | myr-EGLF | 100 |
| A440_5 | myr-GLFF | 102 | A440_25 | myr-FGLF | 100 |
| A440_6 | myr-GLFG | 85 | A440_26 | myr-GGLF | 101 |
| A440_7 | myr-GLFH | 101 | A440_27 | myr-HGLF | 98 |
| A440_8 | myr-GLFI | 100 | A440_28 | myr-IGLF | 87 |
| A440_9 | myr-GLFK | 95 | A440_29 | myr-KGLF | 100 |
| A440_10 | myr-GLFL | 97 | A440_30 | myr-LGLF | 102 |
| A440_11 | myr-GLFM | 100 | A440_31 | myr-MGLF | 96 |
| A440_12 | myr-GLFN | 98 | A440_32 | myr-NGLF | 100 |
| A440_13 | myr-GLFP | 23 | A440_33 | myr-PGLF | 101 |
| A440_14 | myr-GLFQ | 97 | A440_34 | myr-QGLF | 102 |
| A440_15 | myr-GLFR | 103 | A440_35 | myr-RGLF | 99 |
| A440_16 | myr-GLFS | 75 | A440_36 | myr-SGLF | 100 |
| A440_17 | myr-GLFT | 101 | A440_37 | myr-TGLF | 97 |
| A440_18 | myr-GLFV | 98 | A440_38 | myr-VGLF | 98 |
| A440_19 | myr-GLFW | 102 | A440_39 | myr-WGLF | 101 |
| A440_20 | myr-GLFY | 103 | A440_40 | myr-YGLF | 20 |
(3 ) 화합물
테트라펩타이드의
MMP
-1 생성 억제 효과
인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblasts)를 1*106cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO2의 조건에서 24 시간 배양하였다. 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양한다. 배양이 끝난 배지를 원심분리기로 죽은 세포와 분리하여 얻은 상등액 100㎕를 MMP-1 항체가 코팅된 (anti-MMP-1 antibody coated) 96well plate(머크 사, 미국. Cat#: MK101)에 넣고 어두운 곳에서 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline(PBS)으로 4회 세척한 후 100 ㎕ HRP-conjugate 된 2차 항체용액를 넣어 1시간 동안 배양한다. 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 4회 세척 후 100 ㎕ TMB 용액을 넣어 실온에서 15분간 반응시킨 후 100 ㎕의 1M 황산을 넣어 반응을 종료시킨다. 마이크로 플레이트 판독기(microplate reader, Tecan)을 이용하여 450/595nm에서 흡광도를 측정하였다. MMP-1 생성 억제율(%)은 아래의 수학식 2와 같이 환산하였다.
[수학식2]
MMP-1 생성 억제율(%) = [1 - (Ms)/Mc]×100
Ms: 시료를 처리한 군의 흡광도
Mc: 컨트롤 군의 흡광도
도2는 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 외부 자극을 주지 않은 자연노화상태에서 양성대조군인 레티노익산, TGF-β1과 비교하여 화합물A440_19의 MMP-1 합성 억제능을 시험한 결과를 나타낸 도표이다. 상기와 같이 실험한 결과 화합물A440_19의 농도를 5, 10, 20, 30ppm으로 처리 하였을 때 농도가 증가할수록 MMP-1 저해효과가 커짐을 보였고 10ppm 이상의 농도에서는 효과가 일정한 것을 확인하였다. 가장 큰 MMP-1 합성 저해효과를 보인 10ppm에서는 82%의 MMP-1 저해효과를 보임으로써 레티노익산 76%, TGF-β1 85% 와 비교해도 손색없는 MMP-1 억제효과를 보였다.
(4) 화합물
테트라펩타이드의
UVA
또는
UVB
조사에 의한
MMP
-1 생성 억제 효과
인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblasts)를 1*106cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO2의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 PBS 1㎖씩을 넣은 후 UVA(sankyo lamp, korea), UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 각30 J/cm2 또는50 mJ/cm2 자외선을 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양한다. 배양이 끝난 배지를 원심분리기로 죽은 세포와 분리하여 얻은 상등액 100㎕를 MMP-1 항체가 코팅된 (anti-MMP-1 antibody coated) 96well plate(머크 사, 미국. Cat#: MK101)에 넣고 어두운 곳에서 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 4회 세척한 후 100 ㎕ HRP-conjugate 된 2차 항체를 넣어 1시간 동안 배양한다. 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 4회 세척 후 100 ㎕ TMB 용액을 넣어 실온에서 15분간 반응시킨 후 100 ㎕1M 황산을 넣어 반응을 종료시킨다. 마이크로 플레이트 판독기(microplate reader, Tecan)을 이용하여 450/595nm에서 흡광도를 측정, 아래의 수학식 3과 같이 MMP-1 생성 억제율(%)을 환산하였다.
[수학식3]
MMP-1 생성 억제율(%) = [(Mu-Ms)/( Mu -Mc)]×100
Mc: 컨트롤군의 흡광도
Mu: UVA 또는 UVB를 조사한 군의 흡광도
MS: UVA또는 UVB 조사 후 시료를 처리한 군의 흡광도
아래의 표3은 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 UVA 조사 자극에 의해 증가한 MMP-1 생성에 대해 테트라펩타이드의 MMP-1 생성 억제능을 시험한 결과를 나타낸 표이다. 각 테트라펩타이드의 처리 농도는 10ppm 이다. 표3에서 보는 바와 같이 화합물A440_19를 비롯하여 화합물A440_4, 화합물A440_5, 화합물A440_6, 화합물A440_13, 화합물A440_16 화합물A440_17, 화합물A440_20 등에서 UV 자극에 의해 증가한 MMP-1 생성을 저해시키는 것을 확인하였다.
| 화합물이름 | 서열 | MMP -1 저해율(%) | 화합물이름 | 서열 | MMP -1 저해율(%) |
| A440_1 | myr-GLFA | (7) | A440_21 | myr-AGLF | 2 |
| A440_2 | myr-GLFC | 82 | A440_22 | myr-CGLF | 20 |
| A440_3 | myr-GLFD | 6 | A440_23 | myr-DGLF | 5 |
| A440_4 | myr-GLFE | 109 | A440_24 | myr-EGLF | 15 |
| A440_5 | myr-GLFF | 129 | A440_25 | myr-FGLF | (21) |
| A440_6 | myr-GLFG | 119 | A440_26 | myr-GGLF | 100 |
| A440_7 | myr-GLFH | (28) | A440_27 | myr-HGLF | 13 |
| A440_8 | myr-GLFI | 73 | A440_28 | myr-IGLF | 25 |
| A440_9 | myr-GLFK | (44) | A440_29 | myr-KGLF | 40 |
| A440_10 | myr-GLFL | 55 | A440_30 | myr-LGLF | 35 |
| A440_11 | myr-GLFM | 18 | A440_31 | myr-MGLF | 12 |
| A440_12 | myr-GLFN | (1) | A440_32 | myr-NGLF | 1 |
| A440_13 | myr-GLFP | 141 | A440_33 | myr-PGLF | 5 |
| A440_14 | myr-GLFQ | 27 | A440_34 | myr-QGLF | 0 |
| A440_15 | myr-GLFR | 21 | A440_35 | myr-RGLF | 25 |
| A440_16 | myr-GLFS | 102 | A440_36 | myr-SGLF | 33 |
| A440_17 | myr-GLFT | 132 | A440_37 | myr-TGLF | 15 |
| A440_18 | myr-GLFV | 98 | A440_38 | myr-VGLF | 19 |
| A440_19 | myr-GLFW | 163 | A440_39 | myr-WGLF | 21 |
| A440_20 | myr-GLFY | 145 | A440_40 | myr-YGLF | (120) |
도 3은 본 발명의 일 실시예로서 표2에서와 같이 세포독성이 없고 표3에서 나타내는 것과 같이 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1생성을 가장 많이 감소시킨 화합물A440_19의 MMP-1 합성 억제효과를 다양한 농도에서 시험한 결과이다.
도 4는 화합물A440_19의 UVB 조사에 대한 MMP-1 합성 억제 효과를 시험한 결과를 나타낸 도표이다. 상기와 같이 실험한 결과 도3과 도4에서 보여주는 것과 같이 UVA에 의해 급증한 MMP-1 생성량이 화합물A440_19의 10ppm 처리군에서 128%, UVB 에 의해 급증한 MMP-1 에 대해서도 테트라펩타이드 10ppm 처리군에서 137% 감소하는 것을 확인하였다.
도 5는 화합물A440_19의 UVB 조사에 대한 MMP-1 합성 억제 효과를 레티닐팔미테이트(Retinyl Palmitate)와 비교 시험한 결과를 나타낸 도표이다. 레티닐팔미테이트를 10, 20, 25ppm 단독 처리하거나 화합물A440_ 19을 동시에 처리하여 MMP-1 생성 억제율을 확인하였다. 그 결과 테트라펩타이드(A440_19)을 단독으로 처리하거나 레티닐팔미테이트를 동시에 처리하였을 경우가 레티닐팔미테이트를 단독으로 처리하였을 경우에 비해 훨씬 MMP-1 감소율이 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 6은 화합물A440_19의 UVB 조사에 대한 MMP-1 합성 억제 효과를 레티놀(Retinol)과 비교 시험한 결과를 나타낸 도표이다. 레티놀 5ppm 이상에서는 독성을 나타내었기에 5ppm 단일 농도로 실험을 진행하였다. 위의 도 5와 같은 방식으로 실험한 결과 화합물A440_ 19을 단독으로 처리하거나 레티놀을 동시에 처리하였을 경우가 레티놀을 단독으로 처리하였을 경우에 비해 훨씬 MMP-1 감소율이 높은 것을 확인할 수 있었다. 도5와 도6으로부터 화합물A440_19는 레티놀 유도체들과 함께 처리해도 MMP-1 저해능이 저해 받지 않을 뿐만 아니라 레티놀 유도체들과 비교했을 때 더 뛰어난 항노화 효과를 갖는 것을 확인하였다.
(5) 화합물
테트라펩타이드(A440_19)의
UVA
조사에 의해 감소한 프로콜라겐 합성 증진 효과
인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblasts)를 1*106cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO2의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 PBS 1㎖씩을 넣은 후 UVA 조사장치(Sankyo, Japan)에 의해 30 J/cm2 자외선을 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 세포 용해 완충액(lysis buffer)(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10％ glycerol, 5 mM EGTA, 1 mM sodium orthovanadate, 10 mM NaF, 12 mM bglycerophosphate, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 mg/ml aprotinin, and 1％ NP40)으로 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 26,000 g에서 15분간 원심분리하여 세포 추출물을 분리한 Bradford 단백질 측정법으로 단백질 양을 측정하여 동량을 맞추고 95℃에서 5분간 가열하여 단백질을 변성시킨 후 20㎍을 10% SDS-PAGE 전기영동을 걸어준다. 전기영동을 걸어준 젤을 나이트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)에 단백질을 이동(transfer)시킨 후 TBST 버퍼에 용해시킨 5% 스킴밀크에서 1시간 동안 배양시킨 후 프로콜라겐 1(Santa Cruze Biotechnology, CA) 항체를 TBST 버퍼에 1:100으로 희석한 용액에 3시간 동안 쉐이킹하면서 배양시킨다. 항체용액을 제거하고 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 5분씩 3회 세척한 후 HRP-conjugate 된 2차 항체를 TBST 버퍼에 1:2000으로 희석한 용액에 1시간 동안 배양한다. 멤브레인을 세척한 후, ECL 용액을 뿌려 imaging densitometer [Labworks ver.4.6. (image acquisition and analysis software), UVP, CA]를 이용하여 측정하였다.
이 때 대조군에는 항-튜불린 항체(Sigma)를 이용하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 화합물A440_19의 UVA조사에 대해 감소한 procollagen 1 생합성 증진 효과를 실험한 도표이다. 음성대조군(negative control)은 UVA를 조사한 군으로 프로콜라겐 생성량 100%을 기준으로 했을 때 UVA 조사 후 시험물질인 화합물A440_19를 처리한 군에서 243%로 프로콜라겐 타입1이 증가한 것을 확인하였다. 따라서 화합물A440_19가 UVA 조사에 의해 감소한 프로콜라겐 생합성양을 촉진한 것을 확인하였다.
(6) 화합물
테트라펩타이드(A440_19)의
세포 외 단백질
mRNA
의 발현
인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblasts)를 1*106cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO2의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 PBS 1㎖씩을 넣은 후 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 80mJ/cm2 자외선을 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 RNA extraction kit(invitrogen, 한국)을 이용하여 RNA 를 분리한 후, cDNA를 합성하였다. MMP-1, Procollagen 1, Fibronectin의 mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), MMP-1의 primer sequence는 아래의 표4와 같다. 각 primer를 각각 1 μL (0.5 μg/μL)씩 가하고 합성된 cDNA에 DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube ((주)바이오니아, 한국)에 첨가하여 Denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 60℃에서 30초, extension은 72℃에서 2분 동안 30cycle로 진행하였다. PCR 생성물은 1% agarose gel에서 non-specific PCR product나 primer dimer 등이 없는지를 확인하였고, 생성물의 양을 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다.
| 유전자이름 | Forward primer (5' → 3') | Reverse primer (5' → 3') |
| MMP-1 | ATT CTA CTG ATA TCG GGG CTT TGA | ATG TCC TTG GGG TAT CCG TGT AG |
| Procollagen Type 1 | CTC GAG GTG GAC ACC ACC CT | CAG CTG GAT GGC CAC ATC GG |
| Fibronectin | ACC ACG TAG GAG AAC AGT | ACA GTA TTG CGG GCC AG |
| GAPDH | CAA AAG GGT CAT CAT CTC TG | CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG |
도8은 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 양성대조군인 레티노익산과 TGF-β과 비교하여 화합물A440_19가 UVA조사에 의해 변화된 세포 외 단백질인 MMP-1, 프로콜라겐 타입 1(Procollagen Type I), 파이브로넥틴(Fibronectin) mRNA 발현에 미치는 영향을 PCR실험을 통해 확인한 결과이다. 상기와 같이 실험한 결과 화합물A440_19의 농도를 2, 5, 10, 20ppm 처리하였을 때 농도 의존적으로 MMP-1 mRNA 발현 저해효과가 커지고 UVA에 의해 감소한 프로콜라겐 타입 1, 파이브로넥틴 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 도9, 도10 과 도11은 도8에서 보여지는 밴드들을 덴시토미터(Densitometer)를 사용하여 수치화하여 도식화 한 자료이다. 도9는 MMP-1, 도10은 Procollagen type I, 도 11은 Fibronectin의 발현량을 나타낸다.
<실시예 3> 피부 항염효과
인간의 섬유아세포종(human skin fibroblasts, Hs68) 세포주와 표피 케라티노사이트(Keratinocytes, HaCaT) 세포를 이용하여 화합물 테트라펩타이드의 항염 효과를 실험하였다. 피부의 만성적인 염증과 여러 암 생성과의 관계는 잘 알려져 있을 뿐만 아니라 여러 종양 실험에서도 잘 나타나 있다. 여러 외부자극에 의해 싸이토카인들을 생산하도록 유도된 케라티노사이트는 싸이토카인 조절능력을 잃게 되고 결국 암을 포함한 여러 피부 질환을 일으키게 된다.
본 실험은 피부 표피 케라티노사이트(human keratinocytes, HaCaT) 세포주와 UVB 램프를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 자외선 조사에 의해 발현하는 대표적인 싸이토카인인 Interleukin-1α(IL-1α), Interleukin-1β(IL-1β)와 Interleukin 6(IL-6)와 Interleukin 8(IL-8) mRNA 발현양을 평가함으로써 테트라펩타이드의 염증 억제 효과를 확인하였다.
(1) 세포주 및 세포배양
실험에 사용된 세포주는 인간 섬유아세포종(human skin fibroblasts, Hs68)과 Human Keratinocytes의 일종인 HaCaT 세포를 사용하였다. Hs68과 HaCaT 세포는 37°C, 5% CO2의 조건에서 10% FBS (Gibco Co), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 사용하여 배양하였다(Incubator; Thermo-scientific, USA). HaCaT 세포는 100 cm2 플라스크 (Corning, USA)에서 충분히 증식시킨 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS로 씻어준 후 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 배양기에서 3분간 처리한 다음 트립신-EDTA 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 10 ㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:5의 분할율 (split ratio)로 37℃, 5% CO2의 조건에서 계대배양하였다.
(2)
UVB
자극에 의한 피부 염증 관련 유전자의
mRNA
억제효능
인간 섬유아세포종(human skin fibroblasts, Hs68)과 Human Keratinocytes (HaCaT)세포를 각각 6*105cells/well 농도로 60mm 접시에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO2의 조건에서 24 시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 serum-free DMEM으로 교체하였다. 각 well plate에 PBS 3㎖씩을 넣은 후 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 100mJ/cm2 UVB를 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 A440_19를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 RNA extraction kit(invitrogen, 한국)을 이용하여 RNA 를 분리한 후, cDNA를 합성하였다. Interleukin-1α(IL-1α), Interleukin-1β(IL-1β), Interleukin 6(IL-6), Interleukin 8(IL-8) mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Interleukin-1α(IL-1α), Interleukin-1β(IL-1β), Interleukin 6(IL-6), Interleukin 8(IL-8)의 primer sequence는 표5와 같다. 각 primer를 각각 1 μL (0.5 μg/μL)씩 가하고 합성된 cDNA에 DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube ((주)바이오니아, 한국)에 첨가하여 Denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 56℃에서 30초, extension은 72℃에서 2분 동안 30cycle로 진행하였다. PCR 생성물은 1% agarose gel에 로딩하여 non-specific PCR product나 primer dimer 등이 없는지를 확인하였고, 생성물의 양을 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다. Densitometer로 수치화한 mRNA량은 GAPDH수치로 나누어 정량 하였다.
| 유전자 이름 | Forward primer (5' → 3') | Reverse primer (5' → 3') |
| IL-1α | CTC TCT GAA TCA GAA ATC CTT CTA TC | CTA GTC AAA TTT CAC TGC TTC ATC C |
| IL-1β | TGG AGA ACA CCA CTT GTT GCT CCA | AAA CAG ATG AAG TGC TCC TTC CAG G |
| IL-6 | GCC TTC GGT CCA GTT GCC TT | GCA GAA TGA GAT GAG TTG TC |
| IL-8 | ATG ACT TCC AAG CTG GCC GTG GCT | TCT CAG CCC TCT TCA AAA ACT TCT C |
| GAPDH | CAA AAG GGT CAT CAT CTC TG | CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG |
[표 5]에서 언급된 유전자의 억제효능을 측정한 결과는 다음 도12, 도13에 기재하였다. 도12는 인간 진피 세포(Hs68)에서의 싸이토카인(Cytokine)의 mRNA 발현억제능을 도식화 한 것이고 도13은 케라티노싸이트(HaCat)에서 UV 자극에 의한 싸이토카인(Cytokine)의 mRNA 발현 억제능을 나타낸 것이다.
상기와 같이 실험한 결과 화합물 A440_19는 UVB 조사에 의해 증가된 싸이토카인인 IL-1α ,IL-1β, IL-6와 IL-8의mRNA를 효과적으로 억제시켰고, 이는 화합물 화합물 A440_19가 우수한 항염 효과를 보이는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 5> 임상에서의 주름 개선 효과
아래 표6에 나타낸 조성으로 로션을 제조하여 인체에 대한 주름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.
| 유상 | 수상 | ||
| 성분 | 함량(중량%) | 성분 | 함량(중량%) |
| Mineral Oil | 6.0 | Glycerin | 4.0 |
| Stearic acid | 2.7 | Methyl paraben | 0.5 |
| Cetyl alcohol | 2.0 | TEA | 0.5 |
| Propyl paraben | 0.05 | Distilled water | 82.647 |
| Tween 60 | 1.2 | ||
| Aracel 83 | 0.4 | ||
| 화합물 A440_19 | 0.003 | ||
(1) 화합물
테트라펩타이드(A440_19)의
주름개선 효과 평가
23명의 30-65세의 건강한 한국 여성들에게 화합물 테트라펩타이드를 함유하는 로션을 매일 아침 저녁 2회씩 적당량을 눈가 주름을 포함한 얼굴 안쪽부터 바깥쪽으로 피부결을 따라 흡수시키도록 하여 3개월간 연속적으로 바르게 하였다.
주름정도 측정 대상 부위는 피험자의 눈가부위로서, 얼굴을 반쪽으로 나누어 왼쪽과 오른쪽을 측정부위로 하였다. 주름정도 측정을 위하여 피험자는 측정부위를 물로 씻은 후 실내온도 20~25℃, 습도 40~60%의 항온항습 조건의 대기실에서 30분간 안정을 취하여 피부표면 온도와 습도를 측정공간의 환경에 적응하게 하였으며, 안정하는 동안의 수분 섭취는 제한하였다. 객관적 측정을 위하여 연구자 1인이 측정하며, 제품 사용 전인 방문1과 제품 사용 4, 8, 12주 후인 방문2, 방문3, 방문4의 각 측정 시에 동일한 부위를 측정할 수 있도록 하였다.
각 피검자의 주름 개선효과를 시험제품 사용 전과 사용 후 4, 8, 12주에 시험제품과 대조제품을 적용한 부위에 대하여 제작한 피부모사판을 Visiometer SV600(Courage-Khazaka electronic GmbH, Germany)을 이용하여 transparancy profilometry analysis를 실시하여, 주름의 파라미터인 R1, R2, R3, R4, R5를 분석하였다(R1: Skin roughness, R2: Maximum roughness, R3: Average roughness, R4: Smoothness depth, R5: Arithmetic average roughness).
이 시험은 한국의 임상전문 업체인 P&K 피부임상연구센터를 통해 진행되었으며, 그 결과를 도14에 나타내었다.
도14에서 나타내듯이 화합물 A440_19를 함유한 실시예에서 피부주름 파라미터인 R1, R2, R3, R4, R5을 모두 확연히 감소시킨 것으로 보아 피부 주름 개선 효과가 매우 우수함을 확인하였다.
이상에서 본 발명의 우수한 주름개선 효과등과 안전성은 앞서 기술한 실시예와 구체예에 대해서 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 당연한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
Claims (10)
- 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 테트라펩타이드.
[화학식 1]
R-R1-Gly-Leu-Phe
[화학식 2]
R-Gly-Leu-Phe-R2
(상기 화학식 1 및 화학식 2에서, R은 테트라데카노일이며, Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe이 될 수 있다. 또한 화학식 1과 화학식 2 중의 R1은 글리신(glycine), 루신(leucine), 라이신(lysine), 세린(serine)으로 이루어진 아미노산으로부터 선택되고 R2는 시스틴(cystein), 글루타믹산(glutamic acid), 페닐알라닌(phenylalanine), 글리신(glycine), 이소루신(isoleucine), 발린(valine), 프롤린(proline), 루신(leucine), 세린(serine), 트리오닌(thrionine), 트립토판(tryptopane), 티로신(tyrosine)으로 이루어진 아미노산으로부터 선택되는 것이며, C-말단은 카복실산 또는 아마이드 형태가 될 수 있다.) - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 R1은 글리신(glycine) 그리고 R2는 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 트리오닌(thrionine), 트립토판(tryptopane), 및 티로신(tyrosine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 테트라펩타이드. - 제1항에 있어서,
상기 표시되는 테트라펩타이드의 아미노산 중 Leu 는 L-Leu이고, Phe는 L-Phe이며, C-말단은 카복실산 형태인 것을 특징으로 하는 테트라펩타이드. - 제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 테트라펩타이드를 유효성분으로 하는 항노화, 주름개선 또는 항염 화장료 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 조성물은 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 포클린징, 바디오일, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스 또는 비누형태를 가지는 화장료 조성물. - 삭제
- 제7항에 있어서,
상기 테트라펩타이드가 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001~10 중량%로 포함되는 화장료 조성물.
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