KR101332420B1

KR101332420B1 - 김치 유래 박테리오신을 생산하는 류코노스톡 시트리움 ｂｓ14 및 그 균주의 용도

Info

Publication number: KR101332420B1
Application number: KR1020110137515A
Authority: KR
Inventors: 한남수; 안지은; 엄현주
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2013-11-22
Anticipated expiration: 2031-12-19
Also published as: KR20130070274A

Abstract

본 발명은 신규한 류코노스톡 시트리움 균주 및 균주가 생산하는 박테리오신 및 그 용도에 관한 것으로 보다 상세하게는 김치에서 분리되었으며 항균활성이 우수하고 내산성, 내열성을 갖는 류코노스톡 시트리움 BS14 및 그 배양액은 생균제, 식품첨가제, 사료 첨가제 등 건강기능소재 및 발효제품의 제조에 이용될 수 있다.

Description

김치 유래 박테리오신을 생산하는 류코노스톡 시트리움 ＢＳ14 및 그 균주의 용도{Novel Leuconostoc citreum BS14 producing class II bacteriocin isolated from kimchi and use of the same}

김치는 각종 채소를 소금에 절인 후 여러 가지 부재료와 양념을 혼합하여 발효시킨 것으로 주재료로 배추, 부 재료로 무, 마늘, 생강, 파, 고춧가루, 젓갈 등을 사용한다(Cheigh & Park 1994). 김치 속의 유산균은 생균제(probiotics)로 영양학적 장점들이 부각되면서 김치 유산균의 활용에 그 관심이 집중되고 있다. 김치는 절임 식품으로 살균처리 없이 저온에서 유통되기 때문에 리스터리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 감염될 위험이 있으며 이 외에도 원재료부터 장독성 대장균(Escherichia coli)나 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 등 유해 미생물에 오염될 수 있다. 특히 상업용 김치에 대한 수요가 증가하고 천연 식품 첨가물에 대한 소비자들의 선호 증가에 따라 김치 제조 산업에서 박테리오신과 같은 항균활성이 우수한 유산균 스타터를 개발하여 상기 유해 미생물을 저해하기 위한 연구들이 진행되고 있다.

한편 박테리오신은 미생물이 생산하는 항균물질로 항생제와는 달리 단백질로 구성되어 인체에 들어오게 되면 소화 기관 내에서 단백질 가수분해 효소에 의해 쉽게 분해되어 인체에 무독성이고 잔류성인 장점이 있다. 박테리오신의 크게 세가지로 분류할 수 있는데 Class I은 5kDa이하의 작은 펩타이로로 lanthionine, methyl-lanthionine, dehydrobutyrine, dehydroalanine과 같은 아미노산으로 구성되어 modified된 것이 특징이며 nisin이 ClassI 그룹에 해당한다. ClassII는 열에 안정하고 10kDa이하의 non-modified 펩타이드로 구성되며 세 개의 subclass가 존재한다. ClassIIa는 열에 안정하고 리스테리아 모노사이토제네스를 강하게 저해하며 N 말단에 YGNGV-C의 특정 아미노산 서열을 갖는 특징이 있으며 ClassIIb는 두개의 펩타이드로 구성된 박테리오신 그룹이며 ClassIIc는 그 외 박테리오신 그룹이고 분자량이 큰 박테리오신은 ClassIII에 속하며 최근 cyclic bacteriocin을 ClassIV로 분류하기도 한다.

류코노스톡(Leuconostoc) 속은 그람 양성, 카탈라제 음성의 통성 혐기성균으로 김치 내에서 이상젖산발효를 통해 당 발효 최종 대사산물로 젖산을 생성하고 탄산가스를 생산하여 김치의 독특한 풍미를 생성하며 김치에서 발견되는 여러 가지 미생물 중 주 발효균으로 발효초기에 번식하여 김치환경을 산성화하고 혐기 상태로 만들어 잡균인 호기성 세균의 생육을 억제시키는 중요한 역할을 한다. 또한 메센테리신(mesentericin), 류코신(leucocin)과 같은 박테리오신을 생산하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 박테리오신을 생산하는 류코노스톡을 스타터로 사용하였을 때 김치 발효 초기에 생육하여 김치의 적절한 맛과 산도를 부여하고 김치 산패를 유발하는 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum)을 경쟁적으로 억제하여 김치의 저장성을 연장시킬 수 있을 것으로 예상된다.

락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)가 생산하는 니신(nisin)은 대표적인 박테리오신으로 미국, 유럽 등 세계 여러 나라에서 치즈산업이나 통조림 산업에서 식품 보존제로 사용하고 있으며 그 외 소시지 및 육제품, 우유 및 유제품과 같은 발효식품에서 분리한 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로코커스(Enterococcus), 페디오코커스(Pediococcus) 속이 생산하는 박테리오신을 이용한 식품의 유통기간 연장 대한 연구가 많이 이루어져 왔다. 반면 채소발효식품에서 분리한 유산균이 생산하는 박테리오신에 대한 연구는 미미한 편이며 더욱이 류코노스톡 속이 생산하는 박테리오신에 대한 연구는 류코노스톡 메센터로이드 가 생산하는 메센터리신(mesentericin)이나 류코신(leucocin) 외에는 수행된 바가 거의 없다. 따라서 박테리오신을 생산하는 류코노스톡 속 균주를 이용하여 김치의 품질을 향상시키고 기능성을 증가시킬 수 있는 새로운 스타터 개발이 필요하다.

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1019970025595호는 '박테리오신을이용한 구강위생용 및 방취용양치조성물 및 그제조방법'에 관한 것으로, 박테리오신 생산 균주 배양액 0.01-10.0중량% 또는 이 균주들이 생산하는 박테리오신 0.001-10.0ppm을 함유하는 양치 조성물을 제공하고, 보다 특별하게는 락토코커스 스피시스 HY49(동일 출원인에 의해 대한민국, 특허청에 계류중인 특허출원 제94-22715호의 기탁번호 제KFCC-10842호) 균주의 배양조성물 0.01-10.0중량% 또는 이 균주들이 생산하는 박테리오신 0.001-10.0ppm을 함유하는 구강위생용 및 방취용 양치 조성물 및 그 제조방법을 제공한다고 기재되어 있으며,

관련 다른 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020020026081호는 '김치 저장성 연장용 균주 엔테로코커스 히래 및 이를이용한 김치 제조방법'에 관한 것으로, 김치로부터 분리한 젖산균 엔테로코커스 히래(Enterococcus hirae )와 그 생성물인 박테리오신(bacteriocin) 및 푸말산을 이용한 저장성이 향상된 김치의 제조방법에 관한 것이고, 김치에서 박테리오신 생산능이 우수한 젖산균을 스크리닝하여 엔테로코커스 히래(KFCC11210)로 분리동정하는 단계와, 그 균주를 배양하여 생성된 박테리오신 정제물을 얻는 단계와, 김치 1g당 엔테로코커스 균주를 105-109 CFU 또는 그 균주로부터 얻은 박테리오신 정제물을 0.3-3.0 AU가 되도록 김치양념에 각각 첨가하거나 혹은 이들과 함께 고순도 푸말산을 0.01 내지 0.1%가 되도록 김치양념에 첨가하여 김치를 제조하는 단계를 포함하여 김치의 산도, 젖산균의 증식 및 환원당의 감소를 억제함으로서 8℃를 기준으로 하여 김치의 저장성이 최소 3일에서 최대 20일까지 연장되는 효과와 동시에 김치의 풍미를 유지할 수 있고 젖산균 및 그 생성물을 이용한 김치 제조방법은 유통과정 중에 쉽게 변질되는 김치의 저장성을 효과적으로 연장할 수 있으므로 맛있는 김치를 장기간 공급할 수 있게 되어 김치산업의 경쟁력 제고 및 우리나라 식품의 세계화에 크게 기여할 것으로 생각된다고 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규 유산균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 생균제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 항균제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 식품 첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 신규한 류코노스톡 시트리움 BS14 (KACC16475)을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 류코노스톡 시트리움 BS14는 김치로부터 분리한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 류코노스톡 시트리움 BS14으로부터 유래한 박테리오신 단백질을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 121℃에서 안정성을 가지며, pH2-9까지 범위에서 항균력을 유지하며, 트립신, 프로테이즈 K, 알파-키모트립신에 의해서 박테리오신의 항균력이 완전히 소실되는 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 류코노스톡 시트리움 BS14 균주 또는 그 균주 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물에 대한 항균 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 미생물은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus facalis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 바실러스 속(Bacillus sp.), 스트렙토코거스 뮤탄스(Spreptococcus mutans), 리스테리아 노모사이토제네스(Listeria monocytogenes), 장티푸스 균(Salmonella typhimurium), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 니그레센스(Provotella nigrescens), 셀레노모나스 녹시아(Selenomonas noxia), 및 대장균(E. coli)로 구성된 군으로부터 선택된 미생물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 류코노스톡 시트리움 BS14 균주를 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.

본 발명의 생균제 조성물 제조는 배양이 완료된 후, 신속하게 원심분리하여 균체를 회수한 다음, 동결보호제(0.5∼5%, 탈지분유, 말토덱스트린, 트레할로스, 유당, 만니톨, 사이클로덱스트린 등 함유)와 1:1 비중으로 혼합한 후 동결건조를 실시한다. 동결건조 완료된 미생물동결건조물을 필요한 경우 다른 미생물 동결건조물과 1.0×10⁶cfu/g∼1.0×10¹⁰cfu/g 수준으로 혼합하여 본 발명의 생균제 조성물을 제조한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 류코노스톡 시트리움 BS14 균주 또는 그 균주 배양액을 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 류코노스톡 시트리움 BS14 균주 또는 그 균주 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서, 담체로서 사용될 수 있고 올리고사카라이드, 인슐린, 락티톨, 락토수크로오스, 락툴로오스, 피로덱스트린, 효모 및 효모 유도체, 비타민, 특히 비타민 E로부터 선택되는, 영양 물질 및/또는 프리바이오틱(prebiotic) 물질이 사료 및 식품 첨가제에 추가로 함유되는 경우, 본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서와 같이, 사용되는 미생물들의 소화관내 생존 조건이 현저히 개선되고, 사용되는 미생물(들)은 소화관에서 신속하고 신뢰할 만하게증식할 수 있지만 동시에 병원균의 증식은 경쟁적 배제에 의해 감소하거나 억제됨이 특히 보장된다. 사용되는 영양 물질 및/또는 프리바이오틱 물질로 인해, 병원균이 아니라 사용되는 미생물(들)에 증식 이점이 제공된다.

본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서와 같이 제올라이트, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 트레할로오스, 키토산, 알루미늄 실리케이트, 특히 과립형 벤토나이트, 전분, 탈지 우유 분말, 유청(sweet-whey) 분말, 말토덱스트린, 락토오스, 인슐린, 덱스트로오스, 식물성 오일, 또는 물 또는 생리적 식염수 용액으로부터 선택되는 용매로부터 선택되는 추가의 담체가 함유됨에 따라, 한편으로는 미생물들이 소화관에 균일하게 분포될 수 있게 하고, 다른 한편으로는 경쟁적 배제를 위해 추가로 도움을 제공할 수 있다.

추가의 바람직한 구체예에 따르면, 대장, 소장 등과 같은 요망되는 사용 위치에 따라 미생물의 활성을 정확하고 선택적으로 방출시킬 수 있도록, 본 발명에 따른 사료 및/또는 음용수 첨가제를 현탁된 형태, 분말 형태 또는 캡슐화된 형태로 사용하는 것이 특히 유리한 것으로 판명되었다. 또한, 처리하려는 동물의 전체 소화계에 걸쳐 활성을 보장할 수 있도록, 현탁된 사료 및/또는 식품 첨가제와 캡슐화된 사료 및/또는 식품 첨가제의 혼합형태를 사용하는 것이 물론 가능하다.

추가의 바람직한 구체예에 따르면, 사료 첨가제 및/또는 식품 첨가제는 1% 내지 99%, 특히 50% 내지 95%의 담체 또는 천연 물질을 추가로 함유한다. 담체 또는 천연 물질이 추가로 함유된다는 사실로 인해, 사용되는 미생물의 증식을 보조하거나 촉진함으로써 소화관으로부터 병원균을 추가로 제거하는 것이 가능해진다.

본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서와 같이 사료가 사료 kg 당 0.01 g 내지 10 g, 특히 사료 kg 당 0.025 g내지 2.5 g의 양의 사료 첨가제를 수성 현탁액으로서 함유함에 따라, 한편으로는 사료 첨가제가 사료와 함께 동물에 의해 용이하게 섭취되고 다른 한편으로는 사료 섭취 전에 사료의 표면에 이미 존재하는 병원균이 사료 첨가제에 의해 공격을 받거나 제거되거나 분해됨이 보장된다.

사료에 대해 그리고 동물의 소화관에서 사료 첨가제의 특히 양호한 효과를 달성하기 위해, 사료는 바람직하게는 사료 첨가제를 20 g/t 내지 20 kg/t, 특히 100 g/t 내지 2.5 kg/t의 양으로 함유함으로써, 한편으로는 충분한 양의 미생물을 제공하고 다른 한편으로는 위장관 환경으로부터의 병원균의 안전한 분해 또는 제거를 보장한다.

적합한 동물 사료의 예는 청초(green fodder), 저장 목초(silage), 건초(dried green fodder), 뿌리, 덩이줄기, 다육질 과일, 곡물 및 종자, 양조용 곡물, 찌꺼기(pomace), 양조용 효모, 증류 잔사, 제분 부산물, 당 및 전분 생산 및 오일생산의 부산물 및 각종 음식물 쓰레기이다. 개량을 위해 상기 유형의 사료를 특정한 사료 첨가물(예를 들어, 항산화제)또는 각종 물질(예를 들어, 미네랄 혼합물, 비타민 혼합물)과 혼합할 수 있다. 특수한 가축 사료는 또한 특정 종 및 이들의 발달 단계에 적합화된다. 이는 예를 들어, 새끼돼지 사육에 있어서 그렇다. 프리스타터 및 스타터 사료가 사용된다.

본 발명의 생산물을, 동물의 사료에 직접 첨가하거나 그밖에 다른 사료 첨가물과 혼합하거나 또는 실제의 사료에 예비혼합을 통해 첨가할 수 있다. 본 생산물을 먹이와 건식 혼합하거나 추가의 가공(예: 압출) 전에 첨가하거나 혼합물에 계

량하여 분산시킬 수 있다. 생산물의 개개의 성분을 별도로 사료의 개개의 성분에 첨가하는 것이 또한 가능하다. 상기 목적을 위해 생산물의 농도를 0.25 내지 7.5중량% (먹이를 기준으로), 바람직하게는 0.75 내지 4.0 중량%로 사용하는 것이 편리하다.

본 발명에 따른 조성물의 활성성분(예, 박테리아 세포)은 투여되는 종의 조직과 생리학적으로 적합한(즉, 인간 소비(consumption) 또는 동물 소비에 적합한) 담체와 배합된다. 본 발명의 이러한 일면에 따른 담체는 정제, 캡슐 또는 분말 형태로의 제형화를 위한 고체-기제의 건조 물질일 수 있다. 또한, 담체는 액체 또는 겔 형태로의 제형화를 위한 액체 또는 겔-기제 물질일 수 있다. 담체의 특정 형태 및 최종 제형은 일부 선택되는 투여경로에 따라 달라진다.

건조 제형에 전형적인 담체로는 트레할로스, 말토-덱스트린, 쌀가루, 미결정성 셀룰로오스(MCC), 마그네슘 스테아레이트, 이노시톨, 플룩토 올리고사카라이드(FOS), 글루코--올리고사카라이드(GOS), 덱스트로오스, 수크로오스 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 조성물이 건성이고 조성물을 케이크화(cake)(즉, 구성성분 포자, 염, 분말 및 오일의 부착)시킬 수 있는 증발유를 포함하는 경우, 구성성분을 분포시키고 케이크화를 방지하는 건조 충진제(dry filler)를 포함하는 것이 바람직하다. 예시적인 안티케이크화제(anti-caking agent)로는 MCC, 탈크, 규조토, 비정질 실리카, 젤라틴, 사카로오스, 탈지분유 분말, 전분 등이 포함되며, 이들은 전형적으로 대략 1 내지 95 중량%의 양으로 첨가된다. 이후 재수화되거나(예, 액제) 건조 상태로 제시되는(예, 츄어블 웨이퍼(chewable wafer), 펠렛 또는 정제) 건조 제형이 최초 수화된 제형보다 바람직하다는 것이 이해될 것이다. 건조 제형(예, 분말)은 상업적으로 입수가능한 식품(예, 액제, 정제 식품 또는 음료수)을 보충하는데 사용될 수 있다.

적합한 액체 또는 겔-기제 담체로는 물 및 생리식염수; 우레아; 알콜 및 유도체(예, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올); 글리콜(예, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등)이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게도, 수-기제 담체는 중성의 pH 값(즉, pH 7.0)을 갖는다.

메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤질 알콜 및 에틸렌디아민 테트라아세테이트 염을 비롯한 방부제가 또한 담체내에 포함될 수있다. 본 발명의 조성물은 또한 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜(MW=800 내지 20,000의 바람직한 분자량을 가짐)과 같은 가소제를 포함할 수 있다. 담체의 조성은 활성성분의 약리활성 또는 본 발명에 따른 박테리아 균주의 생육성을 유의적으로 방해하지 않는한 변화될 수 있다. 본 발명의 이러한 일면에 따라 사용될 수 있는 담체의 다른 형태가 이후에 기술된다.

본 발명의 조성물의 영양 보충제 성분은 비타민, 미네랄, 필수 또는 비필수 아미노산, 카보하이드레이트, 지질, 식료품, 건강보조식품 등을 포함하는 당업계에 널리 알려진 각종 영양제중 어느 것을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 섬유질, 효소 및 다른 영양소를 포함할 수 있다. 바람직한 섬유질로는 차전초, 쌀 겨, 귀리 겨, 옥수수 겨, 밀 겨, 과일 섬유질 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 락타아제, 아밀라아제, 글루카나아제, 카탈라아제 등과 같은 건강보조 또는 보충 효소가 또한 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 비타민으로는 비타민 B, C, D, E, 엽산, K, 니아신 등이 포함된다. 일일 소비하도록 권장된 일일권장량(RDA)의 것들이 전형적인 비타민이다.

본 발명의 조성물은 의도한 용도에 따라 제형화된다. 통상적인 제형화 기술의 재고는 문헌["The Theory and Practice of Industrial Pharmacy" (Ed. Lachman L. et al, 1986) or Laulund (1994)]에서 찾아볼 수 있다.

임의의 경우에, 적합한 투여 경로로는 예를 들어 경막내, 직접 내실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사 뿐만 아니라 근육내, 피하 및 골수 주사를 포함하여 국소, 질내, 경요도, 경구, 직장, 경점막, 특히 경비, 장관내 또는 비경구 전달이 포함될 수 있다.

주사용의 경우, 본 발명의 활성 성분은 수성 용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액, 이를테면 핸크 용액(Hank's solution), 링거액, 또는 생리학적 염 완충액으로 제형화될 수 있다.

경점막 투여의 경우, 장벽을 침투하기에 적합한 침투제가 제형화에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.

경구 투여의 경우, 화합물은 활성 화합물을 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용가능한 담체와 배합함으로써 쉽게 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 환자의 경구 섭취를 위해 본 발명의 화합물을 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔, 시럽제,슬러리, 현탁제 등으로서 제형화할 수 있게 한다. 경구 사용을 위한 약리학적 제제는 고형 부형제를 사용하고 생성된 혼합물을 임의로 분쇄하고, 필요에 따라 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물을 처리하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 특히 충진제(filler), 예컨대 락토오스, 수크로오스, 만니톨 또는 솔비톨을 비롯한 당; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트리가칸트 검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 소듐 카보메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리학적으로 허용가능한 폴리머이다. 필요에 따라, 붕괴제, 이를테면 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 소듐 알기네이트와 같은 그의 염이 첨가될 수 있다.

적합한 코팅에 의해 당의정 코어가 제공된다. 이를 위해, 임의로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티탄, 래커(lacquer) 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축 당 용액이 사용될 수 있다. 식별을 위해 또는 활성 화합물 용량이 상이한 배합물임을 특징화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 염료 또는 안료가 첨가될 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 약학조성물로는 젤라틴과 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제로 제조된 연성 밀봉 캡슐 뿐만 아니라 젤라틴으로 제조된 압입형 캡슐제(push-fit capsule)가 포함된다. 압입형 캡슐제는 락토오스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 임의로 안정화제와의 혼합물로 활성성분을 포함할 수 있다. 연성 캡슐제의 경우, 활성성분은 적합한 액체, 예컨대 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 선택되는 투여 경로에 적합한 용량이어야 한다.

본 발명의 조성물이 경장적으로-코팅된(enterically-coated) 서방성 캡슐 또는 정제로 캡슐화될 수 있음이 이해될 것이다. 경장적 코팅은, 위장관을 통과하기 때문에 소장에 도달할 때까지 캡슐/정제가 완전하게(즉, 용해되지 않게) 유지되게한다.

구강 투여의 경우, 조성물은 통상의 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.

비강내 흡인에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 활성성분은 적합한 분사제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용함으로써 가압팩 또는 분무기로부터 통상 에어로졸 분무제의 형태로 전달된다. 가압형 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하도록 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다(미국특허 제 6,448,224호 참조). 디스펜서로 사용하기 위해 락토오스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제와 화합물의 분말 혼합물을 함유하는 예를 들어 젤라틴의 캡슐제 및 카트리지로 제형화될 수 있다.

본원에 기술된 제제는 비경구 투여를 위해 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 제형화될 수 있다.

살아있는 박테리아 세포의 비경구 투여에 대한 다수의 예가 당업계에 공지되어 있다[참조예, Tjuvajev (2001) J. Control Release 74 (1-3): 313-5. Rosenberg (2002) J. Immunother. 25: 218-25; Sheil (2004) Gut 53 (5): 694-700; 및 Matsuzaki (2000) Immunol. Cell Biol. 78(1): 67-73]. 본 발명의 박테리아 세포가 또한 면역반응을 조절하도록 약독화된 형태(attenuated form)로 투여될 수 있음이 이해될 것이다[Matsuzaki (2000) Immunol. Cell Biol. 78 (1): 67-73].

주사용 제형은 임의로 첨가되는 방부제와 함께 단위 투여형, 예를 들어 앰풀(ampoule) 또는 다중투여(multidose) 용기로 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클의 현탁제, 용액제 또는 에멀젼일 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 제제(formulatory agent)를 함유할 수 있다.

비경구 투여용 약학조성물은 활성제제의 수용액을 수-가용성 형태로 포함한다. 또한, 활성성분의 현탁제는 적합한 유성 또는 수성 기제 오일 주사 현탁제로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 참깨유와 같은 지방유, 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세리드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르가 포함된다. 수성 주사 현탁제는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 솔비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁제는 또한 적합한 안정화제 또는 활성성분의 용해도를 증가시켜 고농도의 용액제를 제조가능케 하는 제제를 함유할 수 있다.

또한, 활성성분은 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어 발열원이 없는 멸균수 기제 용액과 함께 구성하기 위해 분말 형태일 수 있다.

본 발명의 제제는 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상의 좌제 기제를 사용하여 좌제 또는 정체 관장제와 같은 직장형 조성물로 제형화될 수 있다.

생식기 적용에 적합한 제형으로는 크림, 연고, 로션, 젤리, 용액제, 유제, 스프레이 또는 포말 제형이 포함된다.

본 발명의 약학조성물은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정화, 분말화, 유화, 캡슐화,인트래핑(entrapping) 또는 동결건조 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 박테리아 균주 및/또는 조성물은 상술한 바와 같은 특정 장애를 치료하기 위해 확인된 제품에 포함될 수 있다.

전형적으로, 제품은 박테리아 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 함유하는 패키지(package)의 형태로 또는 포장재와 결합된 형태이다. 포장재는 박테리아의 생육성을 유지하도록 선택되며, 예를 들어 패키지 성분의 용도에 대한 라벨 또는 설명서를 포함한다. 설명서는 본 발명의 방법 또는 조성물에 대해 본 명세서에 설명된 바와 같은 패키지 성분의 용도, 내용물(예, 속, 종, 균주명), 보존기간 말기에 생육가능한 박테리아의 최소 수, 적합한 저장 조건 및 소비자 정보를 위한 상세한 회사 연락처를 표시한다. 라벨은 또한 제품의 신선도와 관련된 정보를 제공할 수 있다. 이 정보는 제조일, "판매 유효 기한(sell by date)" 또는 "품질 유지 기한(best before date)"을 포함할 수 있다. 제품이 상인 또는 소비자에 의해 처리되어야할 때 "품질 유지" 기한이 명시된다. 대안적으로 또는 추가적으로 "액티브 라벨링(active labeling)"이 사용될 수 있다. 예를들어, 미국특허 제 4,292,916, 5,053,339, 5,446,705 및 5,633,835 호에는 부패하기 쉬운 제품의 보존기간을 모니터링하기 위한 변색 디바이스(color changing device)가 설명되어 있다. 이들 디바이스는 반응이 시작되도록 반응층과 물리적으로 접촉시킴으로써 개시되며, 이 행위는 통상적으로 포장시에만 수행될 수 있다. 이 접근법은 모든 유통망 도처에서 신선도를 떨어뜨리는 식료품의 부패를 모니터링하는데 적합하다. 미국특허 제 5,555,223호에는 타이머 시계를 정확한 생산시간으로 설정하는 단계를 포함하여 포장에 타이밍 표시기(timing indicator)를 부착하는 방법이 개시되어 있다.

이하 본 발명은 설명한다.

본 발명은 신규 유산균을 개발하고자 김치로부터 류코노스톡 및 배양액을 이용하여 항균활성이 우수하고 내산성 및 내열성을 확인하여 김치의 품질을 향상시키고 유통기간을 연장하는 스타터로 개발 가능성 여부를 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 김치를 비롯한 다양한 발효식품에 유해한 균의 생육을 저해할 수 있는 넓은 항균 스펙트럼을 가지면서, 또한 다양한 환경에 안정한 박테리오신 생산 유산균을 분리하기 위하여, 김치로부터 다양한 류코노스톡 예상균주를 선발하였고, 가장 항균활성이 높은 류코노스톡 시트리움 BS14를 제공한다.

또 본발명은 본 유산균을 포함하는 배양액을 제공한다.

본 발명의 류코노스톡 시트리움 BS14 세포는 2011년 11월 04일 대한민국 수원시 권선구 서둔동 농업생명공학연구원 소재 한국농업미생물자원센터에 기탁번호 (KACC16475)로 기탁하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규한 김치 유래 류코노스톡 시트리움 BS14는 김치의 산패를 유도하는 락토바실러스 플란타륨과 다양한 유해 미생물을 억제하는 강한 항균활성과 내산성, 내열성이 우수한 특징을 가지고 있다. 따라서 류코노스톡 시트리움 BS14는 김치에 첨가하여 미생물의 생육을 억제하거나 조절하여 효과적으로 김치의 저장성과 안전성을 향상시킬 수 있는 스타터로 이용될 수 있다. 또한 균주 배양액을 회수하여 식품이나 사료, 의약, 화장품 등 다양한 분야에 첨가제로 활용될 수 있다.

도 1은 류코노스톡 시트리움 BS14(Leuconoctoc citreum BS14)이 생산하는 조박테리오신의 항균활성을 나타낸 도면이다. (1) 리스테리아 모노사이토제네스 ATCC19115(Listeria monocytogenes ATCC19115), (2) 대장균 KCTC 1467(E. coli KCTC1467), (3) 락토바실러스 플란타륨 KCTC3104 (Lactobacillus plantarum KCTC3104)
도 2는 류코노스톡 시트리움 BS14(Leuconoctoc citreum BS14)의 생육시간에 따른 항균활성 관계를 나타낸 도면이다.
도 3은 주사전자현미경으로 류코노스톡 시트리움 BS14(Leuconoctoc citreum BS14)이 생산하는 조박테리오신에 의하여 발효식품에 존재하는 대표적인 유해균과 발효식품을 시게하는 원인균에 처리하여 세포가 파괴되는 현상을 촬영한 그림이다. (1) 리스테리아 모노사이토제네스 ATCC19115(Listeria monocytogenes ATCC19115), (2) 대장균 KCTC1467(E. coli KCTC1467), (3) 락토바실러스 플란타륨 KCTC3104(Lactobacillus plantarum KCTC3104)
도 4는 류코노스톡 시트리움 BS14(Leuconoctoc citreum BS14)이 PCR 증폭 및 류코노스톡 시트리움 KM20의 박테리오신과 아미노산 서열 분석을 한 그림이다. (1) 상기 발명 균주의 PCR 증폭, (2) 류코노스톡 시트리움 BS14(Leuconoctoc citreum BS14)와 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) KM20의 아미노산 서열 비교
도 5는 SDS-PAGE를 통한 류코노스톡 시트리움 BS14가 생산하는 조박테리오신의 분자량 측정을 측정한 그림이다. (1)은 SDS-PAGE 후 젤 위에 리스테리아 모노사이토제네스 ATCC 19115(Listeria monocytogenes ATCC19115)를 중층하여 생성된 투명환을 나타낸 사진이며, (2)은 류코노스톡 시트리움 BS14이 생성하는 조박테리오신 용액을 황산암모늄으로 침전한후 SDS-PAGE 전기영동 결과이다.
도 6은 류코노스톡 시트리움 BS14와 Class IIa 및 IId 박테리오신 간의 계통수 분석한 그림이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

김치로부터 유산균의 분리 및 박테리오신 생산 균주의 동정

(1) 유산균 분리

유산균을 분리하기 위해 사용한 김치는 지역 김치제조공장에서 공수한 수출 김치와 가정 김치, 일반 편의점에서 판매하는 김치를 구입하여 4℃에서 보관하여 사용하였다. 김치로부터 총 유산균의 분리를 위해 PES 배지(Difco Co., USA) 및 MRS 배지(Difco Co., USA)에 도말하여 30℃에서 배양하였다.

김치의 전처리 방법은 4℃ 김치를 무균적으로 20g 취하여 0.85% NaCl 용액180ml로 희석하고, stomacher로 5분간 균질화하여 이 후 0.85% NaCl 용액 9ml이 담긴 튜브를 멸균하여 준비하고 준비된 튜브에 단계적으로 희석하여 샘플을 준비하였다. 이 후 MRS 평판배지에 도말하여 배양한 뒤 생성된 단일 집락을 무작위로 취하여 형태학적, 생물학적으로 동정하였다.

(2) 박테리오신 생산 균주의 선발

준비된 김치 샘플을 MRS 평판배지에 도말하여 30℃에서 배양하여 단일 집락을 형성하면 이 후 Spot-on-the-lawn법을 이용하여 박테리오신 생산 여부를 확인하였다. 이 때 실험에 사용한 감수성 균주로 김치의 지표 위해 미생물인 리스테리아 모노사이토제네스 ATCC19115(Listeria monocytogenes ATCC 19115)와 대장균 KCTC1467(E. coli KCTC 1467), 김치의 산패를 유도하는 락토바실러스 플란타륨 KCTC 3104( Lactobacillus plantarum KCTC 3104)를 각각의 선택배지에 (agar 0.7% w/v)에 접종한 뒤 중층하였고 이 후 저해환을 생성하는 단일 집락을 박테리오신 생산 균주로 간주하여 선발하였다.

분리된 박테리오신 생산 균주는 그람 염색을 통한 형태학적으로 조사하였고 분자생물학적 동정을 위해 API 50 CHL kit (BioMerieux, France)를 사용하여 조사였으며 최종적인 동정을 위해 Uuniversal bacterial primer pair; 27F (5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 및 1492R (5'GGTTACCTTGTTACGACTT -3', for PCR amplification of the 16S rRNA gene (ca. 1500 bp product)를 이용해 SolGent Co. Ltd. (Daejon, Korea)에 의뢰하여 16s rRNA 유전자 분석을 실시하였다.

그 결과는 NCBI blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 사용하여 해석하였다.

그 결과, 선발된 균주는 그람 양성 구균이며 불투명한 유백색의 집락으로 16s rRNA 분석 결과 류코노스톡 시트리움 HM058527.1과 100% 상동성을 나타내었다.

이에 상기 균쥬는 류코노스톡 시트리움으로 동정하였고 류코노스톡 시트리움 BS14로 명명하여 한국농업미생물자원센터에 2011년 11월 04일자로 기탁하였다(KACC16475).

표 1은 본 발명에 따른 유산균의 탄수화물 발효패턴 분석 결과를 나타낸 표이다.

박테리오신의 특성 확인

(1) 조박테리오신 제조

분리한 류코노스톡 시트리움 BS14를 30℃에서 24시간 전배양한 후 100mL MRS broth에 1% 접종하여 30℃에서 18시간 배양하였다. 이 후 배양액을 원심분리(10,000xg, 10min, 4℃)하고 상등액을 회수하여 0.45㎛ 막필터로 제균한 뒤 pH를 6.8로 보정한 상등액을 염과 젖산을 제거하기 위해 투석막(MW < 1000; Spectra / Por 6 membrane, Spectrum Laboratories Inc., CA, USA)에 넣고 polyethylene glycol #6000(Samchun chemical Co., Pyeongtaek, Korea)으로 농축하였다. 이 후 0.02 M sodium phosphate buffer를 이용하여 투석한 후 -70℃에서 저장하여 사용하였다.

(2) 생육시간에 따른 항균 활성 측정

류코노스톡 시트리움 BS14를 100ml MRS 액체 배지에 접종하여 30℃에서 배양하면서 600nm에서 생육곡선을 측정하였다. 동시에 배양액을 회수하여 조박테리오신을 분리하고 AWDA(agar well diffusion assay)를 이용하여 배양 시간에 따른 항균활성을 측정하였다. 이 때 리스테리아 모노사이토제니스 ATCC19115 (Listeria monocytogenes ATCC19115)는 지시균주로 사용하였고, 상등액은 두 배씩 희석하여 환이 생성되지 않는 최대 희석배수의 역수에 단위계수를 곱하여 AU/ml로 나타내었다.

상기 균주의 생육곡선과 생육시간에 따른 항균활성을 도 2로 나타내었다.

류코노스톡 시트리움 BS14는 24시간에 생육이 정지되었고, 항균활성은 시간에 따라 증가하면서 24시간 최고에 도달하였다가 이 후 항균활성이 점차 저하되었다. 이는 배양액 중 단백질 분해 효소에 의해 박테리오신이 분해되어 항균활성이 저하되는 것으로 예상된다.

(2) 박테리오신의 저해 활성 범위 측정

분리 균주의 항균 활성을 측정하기 위해 MRS 고체배지에 위에 페이퍼 디스크 (8mm)를 올려놓은 후 조제한 조박테리오신 용액을 50ul를 흡수시키고 지시 균주를 접종한 0.7% (v/v) BHI soft agar를 중층하였다.

구체적으로는 30℃에서 24시간 배양 시킨 후 디스크 주변에 생성된 저해환의 직경으로 항균 활성을 측정하였으며 분리 균주가 생산하는 박테리오신의 저해 활성 범위를 측정하기 위한 실험에 사용된 지시 균주와 결과는 다음 표 2와 같다.

항균활성 표기

-: 투명환 검출 안됨

+: 투명환 검출되지만 측정불가

표 2는 류코노스톡 시트리움 BS14가 생산하는 조박테리오신의 항균활성 범위를 측정한 표이다.

본 발명에서 분리한 류코노스톡 시트리움 BS14는 락토바실러스 브레비스를 제외한 다양한 유산균을 저해하였고, 그람 양성이며 식중독을 유발하는 바실러스 속, 황색 포도상 구균, 리스테리아 모노사이토제니스, 충치 유발 균주인 스트렙토코커스 뮤탄스를 저해하였다.

뿐만 아니라 일반적인 박테리오신은 그람 음성 유해 균주에 대한 저해 활성이 미약하지만 상기 균주는 대장균, 살모넬라 및 치주염을 유발하는 다양한 유해 미생물을 저해하여 항균 스펙트럼이 넓고 강력한 항균 활성을 나타낸다.

(3) 박테리오신의 안정성

온도, pH, 효소처리에 따른 박테리오신의 안정성을 확인하기 위하여 조박테리오신을 각 40, 60, 80, 100℃에서 30분, 121℃에서 15분간 열처리한 후 진공 농축한 후 항균력의 변화를 측정하였다.

pH에 따른 항균력의 변화 측정을 위해서 pH 2-5 (50mM citrate buffer), pH 6-7 (50mM phosphate buffer), pH 8-9 (50mM Tris-HCl buffer) 완충 용액을 제조하고 조박테리오신과 동량 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 후 진공 농축하여 항균력을 측정하였다.

각종 효소에 대한 영향을 보기 위해 알파-아밀레이즈(a-amylase; EC 3.2.1.1; sigma, USA), 리파아제(lipase; EC 3.1.1.3; sigma, USA), 트립신(trypsin: EC 3.4.21.4; sigma, USA)은 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)에 녹여 사용하였고 프로테이즈 K(proteinase K; EC 3.4.21.64; sigma, USA), 알파-키모트립신(chymotrypsin; EC 3.4.21.1; sigma, USA)은 50mM sodium phosphate buffer(pH 7.5)로 효소액(1mg/ml)을 제조하여 조박테리오신과 1:1로 37℃에서 4시간 반응시킨 후 진공 농축하여 항균력의 변화를 측정하였다.

표 3은 다양한 처리에 따른 류코노스톡 시트리움 BS14 조박테리오신의 안정성을 나타낸 표이다.

류코노스톡 시트리움 BS14가 생산하는 조박테리오신을 각각 60, 80, 100℃에서 30분, 121℃에서 15분간 처리한 후 열처리에 따른 항균력의 변화를 조박테리오신을 첨가하지 않는 대조구와 비교해 보았을 때 저해환의 크기에는 변화가 거의 없었고 지시균주와 관계없이 온도의 변화가 박테리오신의 항균력에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.

또한 다양한 pH조건에서 박테리오신의 항균력을 측정하였을 때 pH2-9까지 항균력을 안정하게 유지하는 것으로 보아 다양한 pH범위에서 안정한 것을 알 수 있다.

뿐만 아니라 다양한 효소처리에 대한 영향을 측정한 결과 알파-아밀레이즈 처리에서는 항균력의 변화가 미미하였고 리파아제 처리 후에는 항균력이 무처리구에 비해 약간 저하되었지만 단백질 가수 분해 효소인 트립신, 프로테이즈 K, 알파-키모트립신에 의해서 박테리오신의 항균력이 완전히 소실되어 지질이나 당이 항균력에 영향을 주지 않는 것을 추측할 수 있으며 본 연구에서 분리된 박테리오신은 단백질로 구성된 물질임을 확인할 수 있다.

(4) 주사전자현미경 관찰을 통한 조박테리오신의 항균 기작

리스테리아 모노사이토제네스 ATCC19115, 대장균 KCTC1467, 락토바실러스 플란타륨 KCTC3104은 BHI 액체 배지에 1% 접종 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 이후 원심분리 하여 세포를 회수하고 생리식염수로 세척한 다음 조박테리오신을 처리하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 조박테리오신을 처리한 지시균주들의 세포 포면은 주사전자현미경 (scanning electron microscope S-2500C; Hitachi, Japan)으로 촬영하였다.

15,000배에서 촬영한 결과 조박테리오신을 처리하였을 때 무처리구에 비해 세표 표면에 구멍이 생기고 울퉁불퉁해지는 것으로 보아 일반적인 박테리오신이 세포벽에 구멍을 형성하여 세포 내 물질의 유출을 유도함으로써 세포사멸을 유도하는 것과 유사하다.

(5) 박테리오신 유전자 증폭

김치에서 분리한 류코노스톡 시트리움 BS14로부터 genomic DNA extraction kit (Solgent, Korea)를 이용하여 genomic DNA를 분리하였고 류코노스톡 시트리움 KM20 (Leuconostoc citreum KM20; GenBank No. NC 010471)에서 박테리오신을 생산하는 uviB 유전자로부터 uviB_F 5'CTATTGAAATAAATTGCCCA-3', uviB_R 5'ATGCAAAAAGATGAATTATG-3'primer를 제작하여 PCR을 수행하였다.

PCR을 위한 반응조건은 95℃에서 5분간 predenatureation한 후, 95℃ 1분간 denaturation하고 45℃에서 45초 annealing, 72℃ 1분 extension을 35회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 처리한 후 반응을 중단하였다.

그 결과 294bp에서 증폭된 것을 확인하였고 류코노스톡 시트리움 KM20가 생산하는 박테리오신으로 알려진 UviB 유전자와 염기서열을 비교한 결과 98%의 상동성을 보였다.

또한 11번 위치에서 A에서 G, 116번 위치에서 C에서 T, 268 위치에서 T에서 A로 서열이 바뀌면서 아스파탐(asparatate)가 글리신(glycine)으로 트레오닌(threonine)이 이소루신(isoleucine)으로 페닐알라닌(phenylalanine)이 이소루신(isoleucine)으로 아미노산 서열이 전환된 것을 확인하였다.

(6) 박테리오신 SDS-PAGE

상기 균주의 조박테리오신의 분자량을 확인하기 위해 SDS-PAGE 법을 이용하였고 4% 스토킹 겔 (stacking gel)과 16% 러닝 겔(running gel)을 사용하였다. 전기영동 한 후 한 쪽 겔은 코마시 브릴리언트 R-250를 이용하여 염색하여 단백질 분자량을 확인하였고 다른 한 겔은 리스테리아 모노사이토제네스 ATCC19115를 접종한 BHI 배지를 중층하여 항균활성 여부를 확인하였다.

그 결과 도 5에서 보여주는 바와 같이 2.5-3kDa 정도의 분자량을 확인하였다.

(7) 계통수 분석

유산균이 생산하는 박테리오신의 유전정보는 Biocyc(http://biocyc.org/), NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), BAGEL 2(http://bagel2.molgenrug.nl/ index.php)로부터 수집하였고 Vector NTI^TM suite 8과 GeneDoc version 2.4 software를 이용하여 분석하였다.

상기 발명에서 분리한 류코노스톡 시트리움 BS14는 항리스테리아, 내열성을 갖는 약 3kDa의 분자량을 가진 Class IIa 박테리오신으로 예상된다.

농업생명공학연구원

KACC16475

20111104

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류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) BS14 (KACC16475) 균주 또는 그 균주 배양액을 유효성분으로 포함하는 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus facalis), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 니그레센스(Provotella nigrescens), 및 셀레노모나스 녹시아(Selenomonas noxia)에 대한 항균 조성물.
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