KR101331119B1 - 신규한 클로스트리디움속 미생물 및 이를 이용한 에탄올 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 에탄올 생산능이 있는 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) 신규 균주 및 이를 이용하여 에탄올을 생산하는 방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 클로스트리디움속 미생물, 상기 미생물을 함유하는 조성물 및 상기 미생물을 이용한 에탄올 생산 방법에 관한 것이다.
최근 가장 주된 생물 연료로 인정받고 있는 에탄올은, 옥수수 녹말, 카사버녹말, 사탕수수당 등을 이용하여 생산되고 있다. 그러나 이러한 식품이나 동물 사료 재원을 이용한 에탄올의 생산은 전 세계적으로 "식량이냐 연료냐?"라는 분쟁을 야기하였고 지속가능한 바이오 에탄올 생산을 위한 비식용 대체 생물자원 확보가 불가피하게 되었다. 현재 리그노셀룰로스(lignocellulose)를 주성분으로 하는 농업 부산물 (옥수수 대, 밀 및 보리 짚, 사탕수수 버개스)이나 에너지 작물(switch grass, banagrass, 포플러, 참억새 등)이 대체 자원으로 가장 각광 받고 있다.
리그노셀룰로스 생물 자원을 이용하여 에탄올을 생산하는 방법으로는 원료에 포함되어 있는 리그노셀룰로즈를 전처리하여 당으로 전환한 후 생물학적 발효과정을 적용하는 공정이 가장 많이 사용되어 왔으나, 전처리과정의 경제성, 에탄올 발효가 용이하지 않은 당의 존재, 발효 저해산물 생산 등의 문제를 가지고 있다(Sun, Y., Cheng, J., 2002. Bioresource Technology 83, 1-11.; Munasinghe, P. C. and S. K. Khanal, 2010. Bioresource Technology, 101, 5013-5022.).
최근 이러한 단점을 극복할 수 있는 바이오에탄올 생산공정으로 생물원료를 열분해하여 합성가스(syngas, CO와 H2, CO2 혼합 가스)화한 후, 화학 촉매를 이용하거나(Fischer-Tropsch 공정) 미생물을 이용하여 에탄올을 생산하는 공정이 관심을 받고 있다(Wilkins, M. and H. K. Atiyeh, 2011. Current opinion in Biotechnology 22, 326-330). 그러나 화학 촉매를 이용한 합성가스의 에탄올화는 현실적으로 상업화가 어려운 공정으로 평가됨에 따라 합성가스 발효 공정에 대한 관심의 고조와 이에 대한 연구가 최근 활발하게 이루어지고 있다(Heiskanen, H., Virkajarvi, I., Viikari, L., 2007. Enzyme and Microbial Technology 41, 362-367). 합성가스 발효는 생물 원료의 질이나 상태에 관계없이 전량을 원료로 사용할 수 있으며, 복잡한 전처리 과정이나 촉매가 필요하지 않으며, 합성가스의 CO:H2 비율 의존도가 낮고, 상온에서 반응이 가능하다는 등의 장점을 가지고 있다. 물론 합성가스 발효 공정도 낮은 수율, 합성가스의 낮은 용해도 등이 산업화를 제한하는 요인으로 작용하고 있으나 이러한 단점을 극복하기 위해 합성가스 발효 미생물 탐색, 미생물 대사 공정 제어, 발효 공정의 최적화 조건 확립, 반응기 디자인에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다(Heiskanen, H., Virkajarvi, I., Viikari, L., 2007. Enzyme and Microbial Technology 41, 362-367.; Henstra, A.M., Sipma, J., Rinzema, A., Stams, A.J.M., 2007. Current Opinion in Biotechnology 18, 200-206).
현재까지 합성가스를 발효하는 것으로 알려진 세균은, Clostridium ljungdahlii(Klasson, K.T., Ackerson, M.D., Clausen, E.C., Gaddy, J.L., 1992. Enzyme and Microbial Technology 14(8), 602-608.; Phillips, J.R., Clausen, E.C., Gaddy, J.L., 1994. Applied Biochemistry and Biotechnology 45(6), 145-157.; Younesi, H., Najafpour, G., Mohamed, A.R., 2005. Biochemical Engineering Journal 27, 110-119.), Clostridium autoethanogenum(Abrini, J., Naveau, H., Nyns, E.-J., 1994. Archives of Microbiology 161 (4), 345-351.), Clostridium carboxidivorans P7(Ahmed, A., Lewis, R.S., 2007. Biotechnology and Bioengineering 97 (5), 1080-1086.; Rajagopalan, S., Datar, P., Lewis, R.S., 2002. Biomass and Bioenergy 23(6), 487-493.), Clostridium ragsdalei P11(US Patent No. 7,704,723) 등이 있다. 이들 세균은 에너지와 성장에 요구되는 acetyl-CoA를 합성하기 위해 ''Wood-Ljungdahl'' 경로라 불리는 acetyl-CoA pathway를 이용하는 것으로 알려져 있으며, 이 과정 중 다음과 같은 반응을 통하여 에탄올과 아세트산이 생성된다(Vega, J.L., Prieto, S., Elmore, B.B., Clausen, E.C., Gaddy, J.L., 1989. Appl. Biochem. Biotechnol. 20 (21), 781-797).
6CO + 3H2O --> C2H5OH + 4CO2 (1)
6H2 + 2CO2 --> C2H5OH + 3H2O (2)
4CO + 2H2O --> CH3COOH + 2CO2 (3)
2CO2 + 4H2 --> CH3COOH + 2H2O (4)
현재까지 보고된 미생물의 합성가스 발효를 통한 에탄올 수율은 만족할 수준이 되지 못할 뿐만 아니라, 성장을 위해 요구하는 고가의 효모 추출물 (yeast extract), 탄소원, 특정 pH 완충제 등은 합성가스 발효의 상용화를 지연시키는 요인으로 작용하고 있다(Saxena, J., Tanner, R.S., 2011. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 38, 513-521). 따라서, 새로운 합성가스 발효 미생물의 확보가 지속적으로 요구됨에 따라, 본 발명자들은 이에 대한 연구를 계속하여 신규한 발효 물을 개발하기에 이르렀다.
미국 등록특허 7,704,723
[비특허문헌]
Klasson, K.T., Ackerson, M.D., Clausen, E.C., Gaddy, J.L., 1992. Enzyme and Microbial Technology 14(8), 602-608.
Phillips, J.R., Clausen, E.C., Gaddy, J.L., 1994. Applied Biochemistry and Biotechnology 45(6), 145-157.
Younesi, H., Najafpour, G., Mohamed, A.R., 2005. Biochemical Engineering Journal 27, 110-119.
Abrini, J., Naveau, H., Nyns, E.-J., 1994. Archives of Microbiology 161 (4), 345-351.
본 발명의 목적은 합성가스 발효 미생물인 신규한 클로스트리디움 속 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발효 미생물을 포함하는 에탄올 생산용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발효 미생물을 이용하여 에탄올을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 에탄올 생산능이 있는 신규한 발효 미생물인 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) SG02 KCTC 12038BP를 제공한다.
다른 측면에서 본 발명은 CO 가스원 및 제1항의 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) SG02 KCTC 12038BP를 포함하는 에탄올 생산용 조성물을 제공한다.
상기 CO 가스원은 합성가스(Syngas)일 수 있다.
상기 조성물은 이스트 추출물을 더 포함할 수 있다.
상기 조성물의 pH는 6.0일 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은, CO 가스를 상기 신규 발효 미생물로 발효시켜서 에탄올을 생산하는 단계를 포함하는 에탄올 생산 방법을 제공한다.
"합성가스(syngas)" 라는 용어는 수소와 일산화탄소의 변동하는 양을 함유하는 가스 혼합물에 주어지는 이름이다. 생성 방법의 예는 수소를 생성하기 위한 액체 탄화수소 또는 천연 가스의 스팀 개질, 석탄의 가스화 및 폐기물 에너지 (waste-to-energy) 가스화 설비의 몇몇 종류를 포함한다. 이름은 메탄올 또는 암모니아를 생성하기 위해 그리고 합성적 천연 가스 (SNG) 를 생성하는 데에 중간물로서 이들을 사용하는 데에서 비롯된다. 합성가스는 또한 Fischer-Tropsch 합성을 통하여 윤활제 또는 연료로서 사용하기 위해 합성 석유를 생성하는 데 중간물로서 사용되고 그 전에 Mobil 메탄올을 가솔린 처리하는 데 사용된다. 합성가스는 주로 수소, 일산화탄소, 그리고 매우 종종 몇몇 이산화탄소로 이루어지고, 천연 가스의 절반 미만의 에너지 밀도를 갖는다. 합성가스는 연소 가능하고 종종 다른 화학 물질의 생성을 위해 중간물 또는 연료 소스로서 사용된다.
본 발명은 CO 가스원 및 제1항의 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) SG02 KCTC 12038BP를 포함하는 에탄올 생산용 조성물을 제공하는데, 상기 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) SG02 KCTC 12038BP은 에탄올 생산에 필요한, 이 기술분야에 널리 알려진, 유효한 양이 포함될 수 있다.
본 발명의 신규한 클로스트리디움 속(Clostridium sp.)은 에탄올 생산능이 우수한 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 SG02 균주의 위상차 현미경 사진이다.
도 2는 이스트 추출물이 본 발명의 SG02 균주의 성장(OD600)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 탄소원의 종류가 SG02 균주의 CO 소모에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 소원의 종류가 SG02 균주의 CO2 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 탄소원의 종류가 SG02 균주의 에탄올 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 탄소원의 종류가 SG02 균주의 pH에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 이스트 추출물이 SG02 균주의 성장(OD600)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 이스트 추출물이 SG02 균주의 CO 소모에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 9는 이스트 추출물이 SG02 균주의 에탄올 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 배지의 초기 pH가 SG02 균주의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 배지의 초기 pH가 SG02 균주의 CO 소모에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 12는 배지의 초기 pH가 SG02 균주의 CO2 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 13은 배지의 초기 pH가 SG02 균주의 에탄올 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 14는 배지의 버퍼 완충능이 SG02 균주의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 15는 배지의 버퍼 완충능이 SG02 균주의 CO 소모에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 16은 배지의 버퍼 완충능이 SG02 균주의 CO2 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 17은 배지의 버퍼 완충능이 SG02 균주의 에탄올 및 아세트산 생성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 18은 배지의 버퍼 완충능이 SG02 균주 배양액의 pH에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 2는 이스트 추출물이 본 발명의 SG02 균주의 성장(OD600)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 탄소원의 종류가 SG02 균주의 CO 소모에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 소원의 종류가 SG02 균주의 CO2 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 탄소원의 종류가 SG02 균주의 에탄올 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 탄소원의 종류가 SG02 균주의 pH에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 이스트 추출물이 SG02 균주의 성장(OD600)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 이스트 추출물이 SG02 균주의 CO 소모에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 9는 이스트 추출물이 SG02 균주의 에탄올 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 배지의 초기 pH가 SG02 균주의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 배지의 초기 pH가 SG02 균주의 CO 소모에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 12는 배지의 초기 pH가 SG02 균주의 CO2 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 13은 배지의 초기 pH가 SG02 균주의 에탄올 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 14는 배지의 버퍼 완충능이 SG02 균주의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 15는 배지의 버퍼 완충능이 SG02 균주의 CO 소모에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 16은 배지의 버퍼 완충능이 SG02 균주의 CO2 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 17은 배지의 버퍼 완충능이 SG02 균주의 에탄올 및 아세트산 생성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 18은 배지의 버퍼 완충능이 SG02 균주 배양액의 pH에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 방법
1-1: 배지 조성
합성가스 발효 미생물의 농화를 위해 기본 배지로 사용한 Pfenning's mineral solution, Pfenning's trace metal 용액, 비타민 용액을 각각 Miller와 Wolin에(Miller, T.L., Wolin, M.J., Applied Microbiology. 27(5), 985-987)의해 수정, 제안된 Hungate 기법을 이용하여 제조하여 배양 용기인 세럼 바틀(Wheaton)에 분주한 후 균주 접종 전에 적정 비율로 혼합하였다(표 1). 환원제로는 Na2S를 0.05%(최종 농도, w/v), 레독스 인디케이터로 resasurin 0.1% (최종 농도, w/v), 성장촉진제로 이스트 추출물 0.01%(최종 농도, w/v), 메탄생성균 성장억제제로 BESA (2-bromoethanesulfonic acid) 4.2% (최종 농도, w/v)를 최종적으로 첨가하여 pH를 6.0으로 조절한 후 접종을 실시하였다. 모든 시약은 Sigma-Aldrich사(USA)의 제품을 사용하였으며 배지 조성 시 혐기 조작을 위해 순도 99.99% N2 가스(Union Gas)를 사용하였다.
[표 1] 배지 조성
1-2: 시료 채취 및 농화 배양
합성가스 발효 미생물 분리용 시료로는, 혐기성 소화조 슬러지, 토양, 토끼분을 각각 채취하여 혐기적인 상태로 유지한 상태로 실험실로 운반한 후, 슬러지 시료 2 ml을 20 ml의 배지에, 고체 시료(토양 및 토끼분) 1 g에 멸균된 Pfenning's mineral solution 10 ml을 첨가하여 현탁한 후 현탁액 2 ml을 배지 20 ml에 첨가하였으며, 이 모든 접종 조작은 Miller와 Wolin에 의해 제안된 혐기 조작 기법을 준수하며 수행하였다. 접종 후 60 ml 세럼 바틀에(Wheaton) CO 가스(99.99%, Union Gas) 20 ml을 첨가하여 세럼 바틀 내 압력을 160 - 165 kPa로 유지한 후 30℃, 150 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 기간 중 지속적으로 GC/TCD 를 이용하여 세럼 바틀 헤드스페이스 내 가스 농도를 분석하여 CO가 소모된 경우 CO를 재충전하는 동시에 계대배양을 반복적으로 실시하여 농화배양을 실시하였다.
1-3: 가스 크로마토그래피를 이용한 분석 방법
배양 용기로 사용된 세럼 바틀의 헤드스페이스 가스 조성은 TCD(thermal conductivity detector)가 부착된 가스 크로마토그래피(Agilent 7890, Agilent Technologies)를 이용하여 H2, CH4, CO2 분석을 수행하였다. 100/120 carbosieve sⅡ packed column(Supelco)을 사용하였으며, 헬륨을 캐리어 가스(30 mL/min)로, 인젝터, 디텍터 온도는 각각 150℃, 225℃, 오븐 온도는 35℃에서 7분 경과 후 32 ℃/min의 속도로 225 ℃까지 온도가 상승되는 조건에서 분석을 수행하였다. CH4(30± 2%, v/v), H2(30±2%), CO2(40±2%) 조성의 표준가스(Scott Specialty Gases, Plumsteadville)를 이용하여 검량선을 작성한 수 각 가스 성분의 농도를 측정하였다.
에탄올 및 아세트산 분석에는 FID(flame ionization detector)와 PB-FFAP (J&W) column (30 m x 320 μm x 0.25 μm)이 장착된 가스 크로마토그래피(HP 6890)를 이용하였다. 헬륨을 캐리어 가스(35 mL/min)로, 인젝터, 디텍터 온도는 각각 250℃, 250℃, 오븐 온도는 40℃에서 5분 경과 후 10 ℃/min의 속도로 250℃까지 온도가 상승되는 조건에서 분석을 수행하였다.
실시예 2: 합성가스 발효 미생물 SG02의 분리 및 그 특성
연속적 계대배양을 통해 배양체의 CO 발효능을 측정한 결과, 혐기소화조 슬러지를 접종원으로 하여 실시한 배양체에서 합성가스 발효를 이용하여 에탄올을 생산하는 균주를 선별하여 "SG02 균주"라 명명하였다. SG02 균주는 몇 종의 Clostridia 세균 및 uncultured bacteria와 99%의 상동성을 보였으며 subterminal endospore를 형성하는 세균인 것으로 밝혀졌다(표 2 및 도 1).
국외 연구진에 의해 보고된 ethanogenic acetogen과 SG02와의 계통발생학적 유사성을 분석하기 위하여 16S rRNA 염기서열을 이용하여 상호간의 상동성을 분석한 결과, SG02는 기존의 합성가스 발효 미생물과는 50% 이하의 유사성을 갖는 것으로 분석되었다(표 3). SG02 균주의 서열은 서열번호 1에 기재하였다. 이러한 결과는 보 발명에서 분리된 합성 가스 발효 미생물 SG02가 기존의 미생물과는 다른 신규한 미생물임을 의미한다. 이 SG02 균주는 "클로스트리디움 속(Clostridium sp.) SG02"로 명명되었고, 2011년 10월 19일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁되었으며, 기탁번호는 KCTC 12038BP이다.
[표 2] 16S rRNA 염기서열 분석을 이용한 SG02 세균의 계통분류학적 특징
[표 3]
16S rRNA 염기서열에 기초한 SG02 균주와 기존의 ethanogenic 합성가스 발효 미생물 간의 상동성
실시예 3: 분리 균주 SG02의 합성 가스 발효 특성 분석
3-1: 성장 기질의 영향
현재까지 알려진 대부분의 합성가스 발효 미생물은 미생물의 성장을 촉진하기 위하여 글루코오스(glucose)나 프럭토오스(fructose)와 같은 당이나 피루베이트, 말레이트와 같은 탄소원을 배지에 제공하는 것으로 보고되어 왔다. 이에 본 발명에서는 가장 보편적으로 사용되는 탄소원인 글루코오스와 프럭토오스를 배지에 첨가하여, 분리된 SG02 균주의 성장 변화 여부를 조사하였다. 도 2에 나타난 것과 같이, SG02의 성장은 이스트 추출물의 존재가 매우 중요한 것으로 나타났으며 글루코오스나 프럭토오스의 첨가 유무에 상관없이 이스트 추출물 첨가 시 최고 OD가 2배 정도 증가하는 것으로 조사되었다.
SG02 균주에 의한 CO의 소모는 0.3% 이스트 추출물(YE) 배지에서 가장 빠르게 나타났으며, 그 다음으로는 글루코오스 배지에서, 그 외의 배지에서는 뚜렷한 차이를 보이지 않았다(도 3). 즉, 도 3을 보면, 최초에 165 mg/L로 존재하던 CO가 시간이 경과함에 따라 감소하는데, 0.3% 이스트 추출물에서 가장 빨리 감소함을 알 수 있다. 기질의 분해 산물인 CO2는 YE를 첨가한 배지에서 상대적으로 빠르게 생산되는 것으로 관찰되었다(도 4).
에탄올 생산은 이스트 추출물+글루코오스(Y+G), 글루코오스(G), 이스트 추출물+프럭토오스(Y+F), 프럭토오스(F), 이스트(Y) 순으로 나타났다(도 5). 글루코오스나 프럭토오스가 에탄올 생산에 기질로 사용되었다기 보다는, 글루코오스나 프럭토오스의 발효에 의해 배지의 pH가 낮아짐에 의한 것이라 분석된다. 도 6에 나타난 것과 같이, 이스트 추출물만 첨가된 배지를 제외하고는 배양 1.5일 경과 후 배지의 pH가 5.5 이하고 급격히 낮아지는데, 이러한 pH의 변화는 ethanogenic acetogen의 대사에 있어서 acidogenic phase에서 solventogenic phase로 전환되기 위한 필수적인 조건으로 알려져 있다 (Kundiyana, D.K., Wilkins, M.R., Maddipati, P., Huhnke, R.L., 2011. Bioresource Technology 102, 5794-799; Maddipati, P., Atiyeh, H.K., Bellmer, D.D., Huhnke, R.L., 2011. Bioresource Technology 102, 6494-6501). 이스트 추출물만 첨가된 배지에 상대적으로 높은 농도로 축적된 아세트산의 농도는 이스트 추출물 배지의 높은 pH(6.0 수준) 때문인 것으로 설명될 수 있다.
3-2: 이스트 추출물이 SG02 균주의 합성 가스 발효에 미치는 영향
현재까지 알려진 합성가스 발효 ethanogenic acetogen은 이스트 추출물, 펩톤, 펩토오스, 면 종자 추출물(cotton seed extract)과 같은 성장촉진제를 필요로 하고 있다. 본 발명에서는 SG02 균주의 성장, CO 소모, 에탄올 생산에 이스트 추출물의 농도가 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다.
SG02의 성장은 이스트 추출물의 농도가 높을수록 촉진되는 경향을 보이고 있다(도 7). 그러나 0.5% 이상의 경우에는 최고 OD에는 유의한 영향 없이 지체기(lag phase)가 증가하는 결과를 보이고 있다 (2일 --> 6일). 이스트 추출물 0.1% 농도 이하에서는 최고 OD나 지체기에는 별 영향이 관찰되지 않고 유사한 수준의 성장이 일어나는 것으로 분석되었다.
SG02 균주의 배양액 내 세포 밀도(cell density)는 CO 소모 속도와 유의한 관계가 없는 것으로 관찰되었으나 배양액이 지체기에 머무는 동안에는 CO의 소모가 일어나지 않는 것으로 나타났다(도 8). 배양액에 첨가된 이스트 추출물의 농도와는 무관하게 배양 중 발생된 CO2의 농도는 267 - 398 mg/L 범위인 것으로 분석되었다.
SG02의 성장은 이스트 추출물의 농도가 높을수록 촉진되는 경향을 보이고 있다(도 7). 그러나 0.5% 이상의 경우에는 최고 OD에는 유의한 영향 없이 지체기(lag phase)가 증가하는 결과를 보이고 있다 (2일 --> 6일). 이스트 추출물 0.1% 농도 이하에서는 최고 OD나 지체기에는 별 영향이 관찰되지 않고 유사한 수준의 성장이 일어나는 것으로 분석되었다.
이스트 추출물의 농도가 높을수록 SG09 균주의 에탄올 생산은 증가하는 경향을 보인다(도 9)
3-3: 배지의 초기 pH가 SG02 균주에 미치는 영향
대부분의 합성가스 발효세균은 중성 pH에서 성장이 빠르고 약 pH 5.0 수준 이하에서 에탄올 생산이 낮은 것으로 알려져 있다. SG02 균주는 pH 6.0에서 성장이 가장 빠르게 관찰되었으며(도 10), CO의 소모 (도 11), CO2의 발생이(도 12) 가장 빠르게 나타났다.
배양액의 pH는 SG02 세균의 성장, 기질인 CO의 소모, 에탄올과 아세트산의 생산과 밀접한 관계를 갖는다(도 13). pH 6 조건에서 배양 후 6일차부터 에탄올 생산이 급격하게 이루어졌다.
3-4: 배지의 버퍼 완충능(buffering capacity)이 SG02 균주의 CO 발효에 미치는 영향
Kundiyana 등은 (Kundiyana, D.K., Wilkins, M.R., Maddipati, P., Huhnke, R.L., 2011 Bioresource Technology 102, 5794-799) Clostridium ragsdalei를 이용한 에탄올 생산에 있어서 배양액의 버퍼 완충능(buffering capacity)이 에탄올 수율에 영향을 미친다는 연구 결과를 보고하였다. 이에 본 발명에서는 배지의 버퍼 완충능이 SG02 균주의 생장에 미치는 영향을 분석하였다.
동일한 조건의 CO 및 이스트 추출물 농도에서 SG02 균주는 100% 버퍼 완충능를 갖는 배지에서 약 2배 정도 빠른 성장 속도를 보였다(도 14). 또한 버퍼 완충능이 낮은 배지에서는 지체 시간(lag time)이 2-3배로 증가하는 결과를 나타내었다.
버퍼 완충능이 낮은 배지에서는 CO의 소모와 CO2의 생산성도 낮아지는 것으로 분석되었다(도 15 및 16). 그러나 성장과 CO 소모가 저조한 조건에서도 에탄올 생산성은 매우 향상되는 것으로 나타났다 (도 17). 이론적 에탄올/CO 수율에 대비했을 때, 본 발명에 따른 100% 완충 배지에서의 에탄올 수율은 이론치의 12.8%, 50% 완충액은 54.2%, 0% 완충액은 33.0%에 달하는 것으로 분석되었다. Kundiyana 등도(2011) 0% 완충액에서 에탄올 수율이 2.6배 증가하고 아세트산 수율은 2.4배 감소하는 결과를 보고하였다.
SG02 균주의 최고 에탄올 수율은 0.1 g/L 수준으로 30℃, 이스트 추출물 농도 0.1%, 100% 버퍼 완충능, CO 분압 0.47 atm, 질소 분압 1.18 atm , 총 압력 1.65 atm의 가장 기본적인 배양조건에서 얻어진 수율이다. 이 수준의 수율은 CO 연속 주입 시스템에서 Cotter et al.(Cottera, J.L., Chinnb, M.S., Grundenc, A.M., 2009. Enzyme and Microbial Technology 44, 281-288.)이 Clostridium autoethanogenum과 Clostridium ljungdahlii을 이용하여 얻은 수율 (69 - 230 mg/L), Hurst & Lewis (Hurst, K.M. Lewis, R.S. 2010. Biochemical Engineering Journal 48, 159-165)가 0.5 PCO/2.0 Pr 조건에서 얻은 수율 (12 mg/L)과 견줄 수 있는 값이다.
그러나 발효 산물의 배지 내 농도는 제공된 기질의 농도와 상관 관계를 갖기 때문에 반드시 에탄올/CO 수율을 평가하여 균주의 에탄올 생산성을 평가해야 한다.
Ethanogenic acetogen의 CO만을 기질로 한 에탄올 생산은 세포 생산으로 CO가 소모되지 않는다는 가정 하에 다음 식으로 표현될 수 있다.
6CO + 3H2O ---> C2H5OH + 4CO2
즉, CO 6 mole 당 에탄올 1 mole, CO2 4 mole이 생산되게 된다.
상기 식에 의거해 소모된 CO 전량이 에탄올로 전환될 때의 에탄올 전환율을 100%라 할 때, SG02는 12.9 - 54.2%의 에탄올 전환율을 나타내고 있다. 따라서 세균의 성장이 일어나는 과정에서 이 수준의 에탄올 전환율을 고려한다면 SG02 균주의 CO 발효(혼합가스 발효)를 통한 에탄올 생산성은 매우 높은 것으로 평가할 수 있다.
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Claims (6)
- 에탄올 생산능이 있는 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) SG02 KCTC 12038BP.
- CO 가스원 및 제1항의 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) SG02 KCTC 12038BP를 포함하는 에탄올 생산용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 CO 가스원은 합성가스(Syngas)인 에탄올 생산용 조성물.
- 제2항에 있어서 상기 조성물은 이스트 추출물을 더 포함하는 것인 에탄올 생산용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물의 pH는 6.0인 조성물.
- 제2항의 에탄올 생성용 조성물의 CO 가스를 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) SG02 KCTC 12038BP가 발효시켜 에탄올을 생성시키는 단계를 포함하는 에탄올 생산 방법.
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