KR101328604B1

KR101328604B1 - 누공 치료를 위한 자가 및 동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포 조성물

Info

Publication number: KR101328604B1
Application number: KR1020090050869A
Authority: KR
Inventors: 이성구; 김미형
Original assignee: (주)안트로젠
Priority date: 2009-04-28
Filing date: 2009-06-09
Publication date: 2013-11-11
Also published as: HK1164144A1; IL215491A0; JP2012525377A; IL215491A; US20120020937A1; CN102421444B; KR20100118491A; KR20120055509A; CN102421444A; DK2425844T3; JP5647230B2; WO2010126194A1; EP2425844A4; ES2479621T3; EP2425844B1; EP2425844A1; US20150376573A1

Abstract

본 발명은 누공 치료를 위해 인간의 지방 조직에서 유래한 스트로마 줄기세포(stromal stem cell)를 임상에 사용하기 유효한 양으로 생산하는 방법 및 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 기존의 표준배양법을 개선하여 임상적으로 유효한 수의 지방조직 유래 스트로마 줄기세포를 단기간에 효과적으로 생산할 수 있으며, 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 지방조직 유래 스트로마 줄기세포를 포함하는 지방 줄기세포 조성물은, 기존의 방법에 따라 생산된 세포 조성물에 비해 분화능력(multipotency)과 면역조절능력이 우수하여 누공 치료에 더욱 적합하며, 특히 동종의 지방 유래 줄기세포는 면역반응이 억제되어 임상적 용도가 우수하다.

지방조직 유래 스트로마 줄기세포, 누공, 동종 이식

Description

누공 치료를 위한 자가 및 동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포 조성물{AUTOLOGOUS AND ALLOGENIC ADIPOSE TISSUE-DERIVED STROMAL STEM CELLS COMPOSITION FOR TREATMENT OF FISTULA}

본 발명은 누공 치료를 위해 인간의 지방 조직에서 유래한 스트로마 줄기세포(stromal stem cell)를 임상에 사용하기 유효한 양으로 생산하는 방법 및 조성물에 관한 것으로, 스트로마 줄기세포는 자가 및 동종의 지방조직으로부터 얻을 수 있다.

재생의학은 손상되거나 기능이 저하된 조직 및 기관을 치료하기 위한 방법으로서 주로 다분화능을 가진 줄기세포를 이용한 세포 기반 치료제(cell-based therapy)와 관련된다. 재생의학에 이용 가능한 성체 줄기세포의 주된 공급원 중 하나인 골수는 체외에서 증식이 가능하고 근육세포, 심근세포, 뼈세포, 지방세포, 연골세포, 신경세포 등 다양한 세포로 분화가 가능하다. 또한 면역조절 기능을 가지므로 동종의 골수이식, 또는 자가면역질환 등에 면역억제제로 사용할 수 있다.

지방조직 또한 줄기세포를 다량 포함하고 있어, 지방조직 유래 줄기세포를 생체이식 재료로 이용하고자 하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 지방조직에는 신체의 어느 부위에서보다 많은 줄기세포가 존재하고(동량의 골수에서 분리할 수 있는 줄기세포의 1,000배 이상), 이 줄기세포는 골수 줄기세포와 같은 다분화능을 가지고 있어 연골, 뼈, 지방, 근육세포 등으로 분화할 수 있다. 또한 지방조직 유래 스트로마 줄기세포는 골수 유래 줄기세포와 세포표면 마커의 발현양상이 유사하고 in vivo, in vitro에서 자가 또는 동종의 면역반응을 조절하는 기능을 갖는다.

누공(fistula)은 신체에 비정상적으로 생긴 통로를 말하며 여러 가지 원인에 의해 신체의 여러 부위에 생길 수 있다. 가장 빈번하게 발생하는 누공은 항문과 직장을 포함하는 장관계에 주로 위치하고 있으며, 특히 치루는 항문샘에 생긴 염증이 피부 바깥으로 퍼져나가면서 고름 같은 분비물이 나오는 질환으로 치질의 약 20%를 차지한다.

치루는 직장관과 항문 주변 피부 사이의 비정상적 통로로 항문보다 열려진 다른 부위를 통해서 변이 비정상적으로 배출되는 결과를 낳는다. 주된 원인인 항문직장 농양(anorectal abscess)이 생기고 이것이 밖으로 배농되면서 누관이 형성된 것을 치루(fistula in ano)라고 한다. 즉, 농양이 터지면서 직장이나 항문관 안쪽부터 항문 주변의 피부까지 길게 구멍이 뚫린 것을 말하며, 치루는 항문기능에 중요한 역할을 하는 외항문괄약근과의 관계에 따라 다음 4 가지로 분류한다:

① 내항문괄약근과 외항문괄약근 사이로 누관이 형성된 경우인 괄약근간 치루(intersphincteric type); ② 외항문괄약근을 뚫고 누관이 형성된 경우인 괄약근 관통 치루(transsphincteric type); ③ 외항문괄약근의 상부로 누관이 형성된 경우인 괄약근상부 치루(suprasphincteric type); 및 ④ 1차 누공이 항문선와에 형성되 지 않고 상방의 직장 근처에 형성된 경우인 괄약근외부 치루(extrasphincteric type).

치루의 원인은 주로 항문주위 분비선의 감염 때문인 것으로 알려져 있으며, 이외에도 결핵(tuberculosis)이나 크론씨병(Crohn's disease), 암, 백혈병, 백혈구 감소증 등에 의해 치루가 발생하기도 한다. 크론씨병은 만성적이고 재발을 잘하는 창자의 염증을 특징으로 하는 병으로, 희귀 질환으로 지정되어 있다. 크론씨병으로 인한 누공은 치루뿐 아니라 질과 연결되는 직장질루, 장관 쪽으로 형성되는 장관루 등이 있다.

누공은 수술적 처치가 일반적인 치료 방법이다. 직장 항문 주변에 발생한 누공 치료의 가장 중요한 점은 항문괄약근의 정상기능을 유지시키며 완치시키는 것이다. 그러나, 누공은 수술 후에도 재발하기 쉽고 항문기능장애로 인한 대변실금이 생기기도 하는 등 현재의 수술법으로는 좋은 치료효과를 얻기가 어렵다.

누공 수술법으로는 누관절개술, 세톤(seton)법, 전진판(advanced flap) 이용법, 근충전술(muscle filling procedure), 피브린 글루(fibrin glue) 이용법 등이 있다. 이 중 피브린 글루는 피브리노겐과 트롬빈을 섞어 섬유소응괴(fibrin clot)를 만들어 외과 영역에서 봉합제(surgical sealant)로 사용해왔는데, 치루에서는 외공을 통해 누관에 주사하여 누관과 내공을 채워 막는 방법에 이용된다.

최근 줄기세포 연구가 활발해지면서 줄기세포를 누공 부위에 이식하여 치루를 치료하는 방법이 시도되고 있다. Mizuno 등(Plast . Reconstr . Surg . 2002, 109:199-209)은 지방조직으로부터 분리한 성체 줄기세포가 근육 등으로 분화한다는 것을 입증하였고, Damian 등(Dis Colon Rectum 2005, 48:1416-1423)은 1상 임상시험을 통해 지방조직 유래 줄기세포가 크론씨병 환자에서 치루를 치료하는 데 안전하게 사용할 수 있음을 보여주었다. 또한, 크론씨병 환자에서 직장질루를 치료하기 위해 성체 줄기세포를 이식한 결과, 줄기세포 이식 후 3개월이 경과한 후에도 대변실금이 없었다고 한다.

지방 유래 스트로마 세포는 비교적 체외배양이 용이한 것으로 알려져 있다. 그러나, 임상적으로 유효한 세포수를 얻기 위해서는 비교적 다량의 지방조직이 필요하고 장기간의 세포배양 시간이 필요하다. 특히, 크론병과 같이 만성적이고 재발을 잘하는 환자의 누공 치료를 위해서는 다량의 세포가 필요하며, 보다 개선된 세포배양법이 필요하다. 또한, 동종의 지방 유래 스트로마 세포를 이용할 수 있다면 임상적으로 매우 유용할 것이다.

WO 2006/136244(2006. 12. 28)에는 지방 조직 유래 스트로마 줄기세포의 누공 치료에 관한 용도가 개시되어 있다. 그러나, 환자 자신의 지방조직 유래 줄기세포를 이용하므로 지방조직이 충분하지 않은 환자나 지방조직에 포함된 줄기세포의 양이 현저히 적은 경우, 그리고 환자 자신의 줄기세포를 체외배양하는 데 실패한 경우는 임상적으로 적절히 치료할 수 없다. 특히, 크론병으로 인해 누공이 생긴 환자의 경우 심각한 장관계 염증을 동반하여 지속적인 체중감소를 야기시키기 때문에 대체로 신체질량지수(Body Mass Index)가 낮은 경우가 많으며, 이러한 환자의 경우에는 충분한 양의 지방 유래 스트로마 세포를 확보하는 데 어려움이 있다. 또한, 질환이 장기간 지속되고 악화되면서 한 환자에서 여러 개의 누공이 발생하는 경우 가 많고 누공의 크기도 상당히 커져 있어, 이들 환자의 치료를 위해서는 다량의 줄기세포가 필요하다.

한편, 지방 유래 스트로마 세포를 체외배양할 때 기존의 특허(WO 2007/011797, USP 6,777,231 등)나 논문(Tissue Engineering 7(2), 211-228, 2001) 등에 개시된 표준 세포배양법을 사용할 경우, 체외 세포배양에 장시간이 소요되어 임상적으로 유효한 세포수를 얻기에 어려움이 있으므로 실제 임상 적용에 있어 실효성이 떨어진다. 아직 그 원인은 명확히 밝혀진 바 없으나, 지방 줄기세포의 증식율은 개개인에 따라 다르게 나타나며 체외배양에서 지방 유래 스트로마 세포의 증식이 원활하게 이루어지지 않아 세포배양에 실패하는 경우가 생길 수 있다. 뿐만 아니라, 지방 줄기세포의 다분화능, 면역반응 조절능을 포함하는 생물학적 기능은 공여자에 따라 서로 다른 특성을 보일 수 있으므로, 임상적으로 효과적인 동종의 지방 줄기세포를 이용함으로써 누공의 치료효과를 높일 수 있다.

본 발명은 인간의 지방조직에서 분리한 스트로마 줄기세포를 누공 치료에 이용하기 위한 것으로, 임상적으로 유효한 수의 스트로마 세포를 얻기 위한 더욱 개선된 생산 방법 및 이로부터 얻어진 누공 치료를 위한 지방 줄기세포 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 동종의 지방조직 유래 스트로마 줄기세포를 포함하는, 누공 치료를 위한 지방 줄기세포 조성물을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 지방조직 유래 스트로마 줄기세포를 포함하는 지방 줄기세포 조성물의 제조방법을 제공한다:

(a) 대상으로부터 지방조직을 얻는 단계;

(b) 지방조직으로부터 스트로마-혈관 분획(stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 단계;

(c) 스트로마-혈관 분획을 기질배지에서 배양하는 단계;

(d) 스트로마-혈관 분획을 성장인자인 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식 배지에서 배양하여 지방 유래 스트로마 줄기세포를 배양하는 단계; 그리고

(e) 배양된 지방 유래 스트로마 줄기세포를 적어도 1계대 이상 계대배양하는 단계.

또한, 본 발명에서는 상기 방법에 따라 제조된 지방 줄기세포 조성물, 그리고 이를 환자의 누공 내부에 투여하는 단계를 포함하는 누공 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 누공 치료를 위해 인간의 지방조직에서 유래한 스트로마 줄기세포(stromal stem cell)를 임상에 사용하기 유효한 양으로 생산하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이식에 사용하는 지방 유래 스트로마 세포는 자가 또는 동종의 지방조직으로부터 얻을 수 있다. 특히 본 발명에 따른 동종의 지방 유래 스트로마 세포는 대상 환자로부터 지방조직을 채취하지 않으면서 치료에 이용할 수 있고, 보다 우수한 치료효과를 갖는 지방 줄기세포를 선별하여 치료에 이용할 수 있으므로 임상적으로 큰 장점을 갖는다.

또한, 본 발명에서는 자가 또는 동종의 지방조직으로부터 분리한 스트로마-혈관 분획(stromal vascular fraction, SVF)을 배양하는 데 있어서 기질배지, 증식배지를 적절히 사용하여 배양함으로써, 임상적으로 유효한 수의 스트로마 줄기세포를 단기간 내에 효과적으로 얻는 것을 특징으로 한다. 특히, 본 발명의 방법에서는 성장인자인 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor)를 포함하는 증식배지를 이용함으로써 줄기세포의 배양시간을 획기적으로 단축시킬 수 있으며, 개체 차에 따라 상이하게 나타나는 성장속도를 용이하게 조절할 수 있다. 더욱이 본 발명의 방법에 의해 생산된 지방 줄기세포는 기존의 세포배양법으로 생산된 세포에 비해 분화율과 면역조절능이 우수하다.

환자의 지방조직이 풍부하여 지방흡입수술로 얻을 수 있는 지방조직량이 많 은 경우에는 분리한 지방조직 유래 줄기세포를 순수하게 정제하여 이용할 수 있다. 그러나, 대부분의 경우 이식에 충분한 양의 지방조직 유래 줄기세포를 얻기 위해서는 증식 과정을 수행하여야 한다. 즉, 지방흡입수술로 얻은 지방조직량, 지방조직으로부터 분리한 지방조직 유래 스트로마 줄기세포수 및 이식에 필요한 세포수를 계산하여 임상적으로 유효한 수의 세포를 얻기 위해 증식배양 및 계대배양을 실시해야 한다. 동종이식을 위해서는 스트로마-혈관 분획(stromal vascular fraction, SVF)에 포함되어 있는 면역세포, 섬유모세포(fibroblast) 등 면역반응을 유발할 수 있는 세포군을 충분히 제거하고 스트로마 줄기세포의 단일세포군(homogenous population)을 생성하기 위해 계대배양을 실시하는 것이 바람직하다. 계대배양은 적어도 1 계대 이상 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "기질배지"는 스트로마-혈관 분획을 배양하기 위한 배지로서 DMEM 배지, 또는 DMEM/F12 등의 적절한 세포 배양배지에 10% FBS, 1% 항생제가 포함되어 있다. "증식배지"는 지방 유래 줄기세포의 증식을 위해 사용되는 배지로서 기질배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 배양방법에 의하면 지방조직 유래 줄기세포의 doubling time은 평균 48시간으로, 종래의 배양방법(WO 2007/011797)에 따른 평균 72∼120 시간에 비해 현저히 개선된 효과를 제공한다. 도 1a에 나타낸 바와 같이 P1 이후부터 계대 평균일수는 본 발명의 배양조건에서 평균 4일이며 기존 배양방법은 7일이므로, 본 발명의 방법에 따르면 세포 생산일수를 획기적으로 줄일 수 있다. 예를 들 어, 공여된 지방조직(lipoaspirate) 50 ㎖를 이용하여 지방 줄기세포 1×10⁸ cells을 얻기 위해서는, 기존 배양법에서는 최소 30일의 배양시간이 소요되나 본 발명의 방법에 따라 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor)를 추가로 포함하는 증식배지에서 배양할 경우에는 약 15일 정도면 가능하다. 또 다른 예로 공여된 지방조직(lipoaspirate)이 50 ㎖ 미만일 경우, 기존의 배양법으로는 임상적으로 유효한 수의 지방 줄기세포를 얻는 것이 어렵지만, 본 발명에서는 이를 극복할 수 있는 개선된 배양법을 제공한다.

또한, 스트로마 줄기세포 배양시 지방조직 공여자에 따라 doubling time에서 많은 차이를 보이지만, 본 발명의 방법에 따르면 공여자간 개체 차이에 의한 배양시간의 차이를 최소화할 수 있다. 결과적으로 본 발명에 따른 세포 배양방법은 누공 치료를 위해 임상적으로 유효한 세포수를 확보하기에 적합하다.

일반적으로 체외배양을 통해 계대수가 증가될수록 줄기세포의 분화능은 감소하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 줄기세포의 다분화능을 유지하는 배양법이 필요하다. 본 발명에 따른 방법으로 배양할 경우, 기존 배양법으로 배양한 줄기세포에 비해 근세포, 뼈세포 등으로 분화되는 능력이 더 우수하게 나타났다. 또한, 본 발명의 방법으로 배양한 지방조직 유래 스트로마 줄기세포는 고유의 면역조절능을 잘 유지하고 있을 뿐 아니라 더욱 우수한 효과를 나타냈다. 즉, 본 발명에 따라 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor)를 추가로 포함하는 증식배지에서 배양할 경우, 줄기세포의 고유한 성질인 다분화능 및 면 역조절능을 더욱 잘 유지하므로 임상적으로 우수하다.

지방조직 유래 스트로마 줄기세포는 동종의 면역세포에 대해 면역반응을 유발하지 않고 오히려 유도된 면역반응을 억제하는 면역조절 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 누공 치료를 위해 동종의 지방 줄기세포를 사용할 수 있음을 제시한다. 일례로 크론씨병 환자의 말초혈액 단핵구를 활성화시키는 조건에서 지방 줄기세포를 첨가할 경우 면역반응을 억제할 수 있는데, 이때 동종 줄기세포는 자가 줄기세포와 동등하거나 더욱 우수하게 작용한다. 따라서, 동종의 지방 줄기세포는 크론씨병으로 인한 누공 및 기타 누공의 치료를 위해 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 이식에 사용하는 스트로마 줄기세포는 1∼10 계대 배양을 통해 얻을 수 있으며 이들 세포는 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상이 CD10, CD13, CD29, CD44, CD59, CD71, CD90, CD105, Oct 4에 대해 양성이고 CD34, CD45, CD104, CD106, Stro-1 에는 음성인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 명세서에서 "스트로마-혈관 분획(stromal vascular fraction, SVF)"은 지방조직에서 분리된 세포로, 지방조직을 콜라게나제 효소 처리 후 원심분리 과정을 통해 성숙한 지방세포는 대부분 제거되고 남은 세포군을 의미한다.

"지방 유래 스트로마 줄기세포(adipose-derived stromal stem cells)"는 스트로마-혈관 분획에서 얻어지는 중간엽 줄기세포를 의미한다. 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cells, ASC), 지방 유래 성체 줄기세포(adipose-derived adult stem cells, ADAS), 지방 줄기세포와 동일하게 표현될 수 있다.

본 발명에서 "누공"은 신체에 비정상적으로 생긴 통로를 말한다. 누공의 예로는 치루, 항문직장루, 직장질루, 방광질루, 장관루, 분변루 등을 포함하며, 이에 한정되지는 않는다.

"동종 이식"은 타인 또는 같은 종의 다른 개체로부터 특정 조직이나 장기, 또는 세포를 이식받는 것으로, 자기 조직이나 장기, 세포를 사용하지 못할 경우 다른 사람이나 다른 동물로부터 조직이나 장기 또는 세포를 이식받는 것을 의미한다.

본 발명은 자가 또는 동종 지방조직에서 스트로마-혈관 분획을 얻는 단계, 그리고 지방 유래 스트로마 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는데, 이와 관련된 방법은 이미 여러 문헌에 발표된 바 있다. 본 발명에서는 미국특허 제6,777,231호에서 제시한 방법을 개선함으로써, 치루 치료를 위해 임상적으로 효과적인 세포의 생산 방법을 제시한다. 구체적으로, 미국특허 제6,777,231호에서는 지방흡입으로 얻어진 지방조직을 콜라게나제로 처리하여 스트로마-혈관 분획을 얻고, 얻어진 세포군을 10% 우혈청이 포함되어 있는 DMEM 또는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth) 배지로 구성되는 기질배지에서 배양한 후, 세포가 80-90% 정도 자라면 계대배양을 실시한다. 반면, 본 발명에서는 스트로마-혈관 분획을 기질배지(stromal media)에서 24시간 배양한 후 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor)를 추가로 포함하는 증식배지에서 세포 배양하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 따르면, 증식배지에 적절한 농도, 바람직하게는 0.1∼100 ng/㎖, 더욱 바람직하게는 1∼10 ng/ ㎖ 농도의 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor)를 첨가해줌으로써, 줄기세포의 다분화능이 유지되는 상태에서 세포증식속도가 향상되므로 보다 개선된 생산방법을 제시한다.

본 발명에서 지방 유래 스트로마 줄기세포는 주로 인간의 피하지방조직으로부터 지방흡입(liposuction)이나 외과적 절제수술 방법으로 얻을 수 있는데, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 이식에 사용하기 위한 자가 및 동종 지방 유래 스트로마 줄기세포는 다음 과정에 따라 얻어질 수 있는데, 세포배양에 사용되는 기본배지는 이에 한정되지 않는다.

(1) 지방흡입으로 얻어진 지방조직으로부터 스트로마-혈관 분획의 분리.

지방조직을 KRB 용액으로 세척하고 콜라게나제(collagenase)로 처리한 후 원심분리하여 상층의 지방층을 제거하고, 하층에 생리학적으로 적합한 식염수용액(예: 인산염완충용액, PBS)을 넣어 현탁시킨 다음 원심분리하여 하층의 스트로마-혈관 분획을 회수한다.

(2) 스트로마-혈관 분획을 기질배지(stromal media)에서 배양.

스트로마-혈관 분획을 기질배지에 현탁시켜 10,000∼40,000 cells/㎠의 농도로 배양용기에 접종한 후 배양한다. 기질배지는 10% 우혈청이 포함되어 있는 DMEM 또는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth) 배지로, 약 24 시간 배양한다.

(3) 증식배지(expansion media)에서 배양.

기질배지를 제거한 후, 증식배지에서 배양하여 부착성세포를 증식시킨다. 증식배지는 10% 우혈청, 0.1∼100 ng/㎖ 농도의 EGF(epidermal growth factor) 또는 0.1∼100 ng/㎖ 농도의 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM 또는 DMEM/F12로, 부착성인 지방 유래 스트로마 줄기세포를 신속하게 증식시켜 세포 양을 단기간에 다량으로 증가시키는 작용을 한다.

(4) 계대 배양

세포가 배양용기 바닥의 80∼90%를 채우면 증식배지를 제거하고 트립신 처리를 통해 세포를 배양용기에서 떼어낸다. 계대배양을 위해서는 세포를 1:3∼1:4로 희석하여 새로운 배양용기에서 증식배지와 함께 배양한다. 이와 같은 방법으로 추가적인 계대배양이 가능하다.

(5) 면역반응 조절 작용 확인

동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포는 그 종류(개체)에 따라 면역조절능이 다르게 나타나므로, 적어도 1계대 이상 계대배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포의 면역조절능을 확인하여 면역억제능력이 뛰어난 동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포를 선택하여 사용할 경우 자가세포에 비해 임상적으로 효과적이다.

본 발명의 배양 방법은 기존의 표준배양법을 개선한 것으로 임상적으로 유효한 수의 지방조직 유래 스트로마 줄기세포를 단기간에 효과적으로 생산할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 지방조직 유래 스트로마 줄기세포를 포함하는 지방 줄기세포 조성물은, 기존의 방법에 따라 생산된 세포 조성물에 비해 분화능력(multipotency)과 면역조절능력이 우수하여 누공 치료에 더욱 적합하다. 특히, 동종의 지방 유래 줄기세포는 임상적 용도에서 우수성이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인간 지방 유래 스트로마 줄기세포의 배양 방법

지방조직은 보통 지방흡입술로 얻을 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

지방 흡입에 의해 얻어진 지방 조직으로부터 다음과 같이 지방 유래 스트로마 줄기세포를 분리하였다: 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 KRB 용액으로 3∼4 회 세척하였다. 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37 ℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20 ℃, 1200 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액인 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기질배지를 넣어 현탁시킨 후, 20 ℃, 1200 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마-혈관 분획으로, 상층액을 제거하였다.

스트로마-혈관 분획을 기질배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기질배지, 또는 기질배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 1 ng/㎖ 농도로 포함된 배지, 또는 기질배지에 표피세포 성장인자(EGF)가 5 ng/㎖ 농도 로 포함된 배지를 이용하여 증식시켰다. 지방 유래 스트로마 줄기세포가 배양용기의 80-90% 정도로 자라면 트립신 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 얻어진 세포를 증식배지로 1:3∼1:4로 희석하여 계대 배양을 수행하였다.

도 1a는 기질배지 또는 증식배지에서 배양한 지방 줄기세포의 CPDL을 나타낸 그래프이고, 도 1b는 기질배지 또는 증식배지에서 20일간 배양한 지방 줄기세포의 수득율을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 기질배지에 bFGF 또는 EGF를 첨가한 증식배지에서 배양할 경우, 세포의 성장속도는 표준배지인 기질배지에서보다 약 3배 정도 빠른 것으로 나타났다. 1.5×10⁶세포를 각각의 배지에서 20일 동안 배양하였을 때 평균세포수득율은 기질배지에서는 9.7×10⁶, 증식배지에서는 1.9×10⁸으로, 증식배지에서 약 20배 증가된 세포를 얻을 수 있었다.

다음 표 1은 배양배지에 따른 doubling time, 세포수득율을 나타낸다.

	기질배지	기질배지 + bFGF
Doubling time	122시간	48시간
세포수득율*	9.7 × 10⁶	1.9 × 10⁸

* 1.5×10⁶세포를 각각의 배지에서 20일 동안 배양하여 얻어지는 평균세포수

지방 줄기세포는 10계대 이상까지 증식속도 및 표현형(phenotype)의 변화없이 계대배양이 가능한 것으로 알려져 있다. 기질배지를 이용한 표준배양법으로 1×10⁶개의 지방 줄기세포를 10계대까지 배양하였을 때 얻을 수 있는 세포수는 약 3.8×10⁹개인 반면 본 발명에서 개시한 증식배지에서 배양할 경우 약 1.5×10¹³개로 약 4000배의 세포수를 얻을 수 있었다.

지방흡입을 통해 얻어진 지방조직 50 ㎖, 100 ㎖를 각각의 배지 조건에서 배양하여 1×10⁸세포를 얻는 데 필요한 배양시간은 아래 표 2와 같다.

	기질배지	기질배지 + bFGF
50 ㎖	최소 30일	15일 이내
100 ㎖	최소 20일	13일 이내

아직 그 원인은 명확히 밝혀진 바 없으나 지방 줄기세포의 증식율은 개개인에 따라 다르게 나타나며, 체외배양에서 지방 유래 스트로마 세포의 증식이 원활하게 이루어지지 않아 세포배양에 실패하는 경우가 생길 수 있다.

아래 표 3은 서로 다른 7명의 공여자로부터 얻은 지방조직 50 ㎖에서 지방 줄기세포를 얻어 각각의 배양조건에서 배양한 결과이다. 본 발명에 따른 증식배지에서 배양할 경우 1×10⁸세포를 얻는 데 필요한 배양시간은 13∼18일인 반면, 표준배양법의 기질배지에서 배양한 경우 4개의 롯트에서 25∼35일이 소요되었고, 3개의 롯트에서는 생산이 불가능하였다.

로트 번호	증식배지 (기질배지 + bFGF)	기질배지
# 1	16일	26일
# 2	18일	35일
# 3	13.5일	생산 불가
# 4	13일	27.5일
# 5	13.7일	25일
# 6	14일	생산 불가
# 7	14.5일	생산 불가

실시예 2: 인간 지방 유래 스트로마 줄기세포의 세포표면 마커

상기 실시예 1에서 수득한 지방 유래 스트로마 줄기세포를 1.5 ㎖ 원심분리용 튜브에 옮겨 FACS 염색 용액(1% 우태아혈청이 포함된 인산염 완충용액) 1 ㎖를 넣고 잘 섞은 다음, 10,000 rpm으로 5 초 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 FACS 염색 용액 1 ㎖에 재부유시켜 10,000 rpm으로 5 초 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 FACS 염색 용액 300 ㎕에 재부유시켰다. 샘플 수에 따라 원심분리용 튜브 당 약 0.5∼1.0×10⁶ 개의 세포가 포함되도록 새로운 튜브에 분주하고 항체를 첨가한 후 4 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다. FACS 염색 용액 1 ㎖에 재부유시켜 10,000 rpm으로 5 초 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. FACS 고정액 400∼500 ㎕를 첨가하여 재부유시키고 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 다음 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 증식시킨 지방 줄기세포는 CD10, CD13, CD29, CD44, CD59, CD71, CD90, CD105, Oct4에 대하여 95% 이상 양성반응을 보인 반면, STRO-1, CD34, CD45, CD104, CD106에 음성인 면역학적 특성을 나타내었다. 단, CD34는 제공된 지방 조직 롯트에 따라 p0에서 5∼10%의 세포에서 양성반응을 나타내기도 하였다. 배양조건에 따른 차이는 관찰되지 않았다.

계대

p0

p1

p2

p3

배양
방법

기질
배지

EFG

FGF

기질
배지

EFG

FGF

기질
배지

EFG

FGF

기질
배지

EFG

FGF

CD10

+

CD13

+

CD29

+

CD34

-/+

-

CD44

+

CD45

-

CD59

+

CD71

+

CD90

+

CD105

+

STRO-1

-

실시예 3: 인간 지방 유래 스트로마 줄기세포의 분화능

실시예 2와 같은 방법으로 배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포가 배양용기의 80∼90%로 자라면 트립신 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다.

각기 다른 배양배지로 배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포의 근세포 분화능력을 확인하기 위하여 4-웰의 각 웰에 5,000 개/㎠가 되도록 접종하고, 80% 찰 때까지 각 배지로 교환하며 배양하였다. 지방 유래 스트로마 줄기세포가 배양용기의 100%로 차면 프로모셀 근세포 분화배지로 교환하고 2주 동안 근세포로의 분화를 유도하였다. 근세포로의 분화율을 확인하기 위하여 다음과 같이 면역형광염색을 수행하였다: 인산염 완충용액으로 3 회 세척하고, 4%의 포름알데히드를 포함하는 인산염 완충용액으로 30 분 동안 고정시켰다. 인산염 완충용액으로 3 회 세척하고 5% 정상 염소 혈청(normal goat serum)과 0.1% Triton X-100을 포함하는 인산염 완충용액으로 30 분 동안 침투(permeablization) 및 블로킹(blocking)을 수행하였다. 근세포 특이적으로 표지하는 데스민과 미오신 1차 항체를 포함하는 인산염 완충용액을 첨가한 후 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후 인산염 완충용액으로 3회 세척하고, 2 차 항체로 30분 동안 반응시켰다. 인산염 완충용액으로 3 회 세척한 후 마운팅 용액으로 도포하고 형광현미경으로 관찰하였다.

도 2a는 기질배지 또는 증식배지에서 배양한 지방 줄기세포의 근세포분화능을 보여주는 사진이다(X 40). 도 2a에서 보듯이, 기질배지에서 배양한 것보다 기질배지에 bFGF를 첨가한 증식배지에서 배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포에서 데스민과 미오신에 양성인 세포가 더 많이 관찰되었다. 즉, 본 발명에 따라 기질배지에 bFGF를 첨가하여 지방 유래 스트로마 줄기세포를 배양하였을 때 근세포로의 분화율이 향상된 것을 확인할 수 있다.

각기 다른 배양배지로 배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포의 뼈세포 분화능력을 확인하기 위하여, 12-웰의 각 웰에 20,000 개/㎠가 되도록 접종하고, 100% 찰 때까지 각 배지로 교환하며 배양하였다. 지방 유래 스트로마 줄기세포가 배양용기의 100%로 차면 100 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 nM 글리세로인산염, 100nM 덱사메타손, 10 nM 비타민 D3가 포함된 뼈세포 분화배지로 교환하고 4주 동안 뼈세포로의 분화를 유도하였다. 뼈세포로의 분화율을 확인하기 위하여 von-Kossa 염색을 수행하였다. 인산염 완충용액으로 3 회 세척하고, 4%의 포름알데히드를 포함하는 인산염 완충용액으로 20 분 동안 고정시켰다. 3차 증류수로 3 회 세척하고 5% 질산은 용액을 첨가하고 UV에 1시간 동안 노출하였다. 3차 증류수로 3회 세척한 후 5% 티오황산나트륨 용액을 첨가하여 2 분 동안 반응시키고 3차 증류수로 3회 세척하였다. 지용성 마운팅 용액으로 도포한 후 현미경으로 관찰하였다.

도 2b는 기질배지 또는 증식배지에서 배양한 지방 줄기세포의 뼈세포분화능을 보여주는 사진이다(X 40). 도 2b에서 보듯이, 기질배지에서 배양한 것보다 기질배지에 EGF또는 bFGF를 첨가한 증식배지로 배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포에서 von-Kossa 염색이 더 많이 되어 뼈세포로의 분화율이 증가한 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에 따라 기질배지에 bFGF또는 EGF를 첨가한 증식배지에서 지방 유래 스트로마 줄기세포를 배양하였을 때 줄기세포의 분화능이 향상된 것을 알 수 있다.

실시예 4: 인간 지방 유래 스트로마 세포의 면역조절기능

조직 적합성 항원(Human Leukocyte Antigen; HLA) 분석 결과 다양한 조합의HLA type Ⅰ, Ⅱ를 갖는 7 종류의 사람 말초혈액단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell; PBMC)와 지방 유래 스트로마 줄기세포를 선택하여 혼합 림프구 반응(Mixture Lymphocyte Reaction; MLR)을 수행하였다. U-bottom 96-웰 플레이트의 각 웰에 반응세포(responder cell)로 각 롯트의 인간 혈액 유래 말초혈액단핵세포를 2×10⁵/웰이 되도록 첨가하고, 자극세포(stimulator)로 각 롯트의 지방 유래 스트로마 줄기세포를 2×10⁴개를 첨가하였다. 양성 대조군으로 PBMC 2×10⁴개를 미토마이신 C(mitomycin C) 처리하여 첨가하였다. 반응 시작 후 3일째 상등액을 수집하여 분비된 IFN-γ 량을 ELISA 법을 이용하여 측정하였다.

도 3a는 지방 줄기세포의 면역반응 유도능을 보여주는 도면으로, 여기에 나타난 바와 같이, 양성대조군인 말초혈액단핵세포의 경우 동종의 말초혈액단핵세포와 반응하여 다량의 IFN-γ를 분비한 반면, 상기 실시예 1에 따라 배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포와의 반응에서는 IFN-γ의 분비가 되지 않거나 자가의 말초혈액단핵세포와 비슷한 정도의 IFN-γ 분비량을 나타냈다. 즉, 지방 유래 스트로마 줄기세포는 동종의 말초혈액단핵세포에 대하여 면역반응을 유발하지 않는 것이 확인된다.

또 다른 실시예로, 서로 다른 인간 혈액 유래 말초혈액단핵세포 2 롯트를 U-bottom 96-웰 플레이트의 각 웰에 2×10⁵개/웰의 양으로 접종하여 면역반응을 유발한 후, 상기 실시예 1에 따라 배양한 동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포 5,000, 10,000, 20,000 개를 각각 첨가하여 72시간 동안 배양하고 상등액을 채취하여 IFN-γ 분비량을 측정하였다.

도 3b는 MLR에서 지방 줄기세포의 면역반응 억제능을 보여주는 도면으로, 여기에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에 따라 배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포를 첨가하였을 때 첨가한 세포수에 비례하여 면역반응이 억제되는 것이 확인된다. 즉, 지방 유래 스트로마 줄기세포는 동종의 T세포에 의해 면역반응을 유발하지 않으며 면역반응 발생시에 면역세포에 의해 다량 분비되어 면역반응성을 증가시키는 역할을 하는 IFN-r의 분비량을 현저히 감소시키는 역할을 함으로써 면역억제능을 가진다.

실시예 5: 동종의 인간 지방 유래 스트로마 세포의 면역조절기능

동종 및 자가의 지방 유래 스트로마 줄기세포의 면역억제능을 확인하기 위하여 서로 다른 4명의 공여자로부터 얻은 말초혈액단핵구(PBMC)를 PHA(phyto-hemagglutinin)으로 활성화시키고 IFN-γ, TNF-α분비량을 측정하였다. 96-웰 플레이트에 각각에 자가 또는 동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포 10,000개를 접종한 후 말초혈액단핵구 1×10⁵개/웰씩을 접종하여 PHA로 면역반응을 유발하고 72시간 후 상층액을 채취하여 IFN-γ, TNF-α 분비량을 측정하였다.

도 4a는 PHA로 자극된 면역반응에 대한 자가 및 동종 지방 줄기세포의 IFN-γ 억제능을 보여주는 도면이고, 도 4b는 PHA로 자극된 면역반응에 대한 자가 및 동종 지방 줄기세포의 TNF-α 억제능을 보여주는 도면이다. 도 4a와 도 4b에서 보듯이, 상기 실시예 1에 따라 배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포를 첨가하였을 때 자가 또는 동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포 모두에서 IFN-γ, TNF-α 분비량이 현저히 감소되었다. 특히, 동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포는 그 종류(개체)에 따라 면역조절능이 다르게 나타나므로 면역억제능력이 뛰어난 동종의 지방 유래 스트로마 세포를 스크리닝하여 사용할 경우 자가세포에 비해 임상적으로 효과적일 수 있다.

즉, 동종의 지방 유래 줄기세포는 면역세포를 활성화시키는 마이토겐 (mitogen)에 의해 유도된 면역반응을 조절하여 면역억제능력을 가지며 자가 유래 지방 줄기세포와 동등하거나 우수한 능력을 갖는다.

실시예 6: 기질배지 또는 증식배지에서 생산한 인간 지방 유래 스트로마 세포의 면역조절능

기질배지 또는 증식배지에서 생산한 인간 지방 유래 스트로마 줄기세포의 면역조절능을 비교하기 위하여 서로 다른 3명의 공여자로부터 얻은 지방 줄기세포를 기질배지 또는 본 발명에서 개시한 증식배지로 각각 배양하였다. 서로 다른 3명의 공여자로부터 얻은 말초혈액단핵구(PBMC)를 PHA(phyto-hemagglutinin)으로 활성화시키고 위의 지방 줄기세포를 첨가하여 IFN-γ 및 TNF-α의 분비량을 측정하였다. 96-웰 플레이트에 각각의 지방 유래 스트로마 줄기세포 10,000개를 접종한 후 말초혈액단핵구 1×10⁵개/웰씩을 접종하여 PHA로 면역반응을 유발하고 72시간 후 상층액을 채취하여 IFN-γ 및 TNF-α의 분비량을 측정하였다.

도 5는 PHA로 자극된 면역반응에 대한, 기질배지 및 증식배지에서 배양한 지방 줄기세포의 IFN-γ 및 TNF-α 억제능(n=9)을 보여주는 도면이다. 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에 따라 증식배지에서 배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포를 첨가하였을 때 기질배지에서 생산한 줄기세포에 비해 IFN-γ 및 TNF-α 억제능이 유의성 있게 증가된 것을 알 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 방법으로 생산된 지방 유래 줄기세포는 기존의 표준배양법으로 생산된 세포에 비해 마이토겐 (mitogen)에 의해 유도된 면역반응을 보다 효과적으로 억제하였다.

실시예 7: 인간 지방 유래 스트로마 세포의 ECM 분비능

상기 실시예 1에서 배양한 지방 유래 스트로마 세포를 4-웰의 각 웰에 접종하여 배양용기에 부착시켰다. 인산염 완충용액으로 3 회 세척하고, 4%의 포름알데히드를 포함하는 인산염 완충용액으로 30 분 동안 고정시켰다. 인산염 완충용액으로 3 회 세척하고 5% 정상 염소 혈청(normal goat serum)과 0.1% Triton X-100을 포함하는 인산염 완충용액으로 30 분 동안 침투(permeablization) 및 블로킹(blocking)을 수행하였다. 1차 항체를 포함하는 인산염 완충용액을 첨가한 후 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후 인산염 완충용액으로 3회 세척하고, 2 차 항체로 30분 동안 반응시켰다. 인산염 완충용액으로 3 회 세척한 후 마운팅하고 형광현미경으로 관찰하였다.

도 6은 지방 줄기세포의 세포외기질 단백질 분비능을 보여주는 사진(X 40)으로, 여기에 나타난 바와 같이 본 발명에 따라 배양한 지방 줄기세포는 콜라겐 타입 Ⅰ, 타입 Ⅲ, 타입 Ⅳ, 타입 Ⅴ, 파이브로넥틴 및 라미닌에 양성반응을 나타내었다. 즉, 본 발명에 따라 배양한 지방 유래 스트로마 세포는 콜라겐 타입 Ⅰ, 타입 Ⅲ, 타입 Ⅳ, 타입 Ⅴ, 파이브로넥틴 및 라미닌 등 다양한 종류의 세포외기질을 발현하므로 체내에 이식하였을 때 세포의 생착 및 새로운 조직의 형성을 용이하게 할 수 있다.

실시예 8: 지방 유래 스트로마 줄기세포의 크론성 누공 치료예

상기 실시예 1의 방법으로 배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포의 임상적 적용을 위해 크론성 치루환자를 대상으로 임상시험을 실시하였다. 제조된 세포들은 1∼3 계대 배양하였고 1∼2×10⁷ 세포/㎖ 농도의 세포를 누공 크기에 따라 4∼14 ㎖ 용량으로 누공벽을 따라 이식하였다. 세포이식 후 누공은 피브린 글루로 채워주었다.

이식예 1: 본 환자는 24세 여성환자로 10년 전에 크론씨병 진단을 받고 2년전 fistulectomy 시술을 받았으며 1년 6개월 후 재발하여 재수술을 받았다. Azathioprine, Remicade 등을 투여받았으나 병세의 호전이 없었다. 치루의 계속적인 재발과 염증으로 인해 지방 줄기세포 시술 대상인 치루 크기가 5.5(깊이)×2(직경) ㎝로 농양의 배출이 많고 상당히 악화되어 있었다(도 7a). 환자의 복부에서 약 50 ㎖의 지방을 채취하여 3계대까지 배양하여 총 2.8×10⁸ 개의 세포를 얻었으며 총 배양기간은 21일이었다. 세포이식 전 큐렛을 실시하여 염증 부분을 제거하고 2×10⁷ 세포/㎖ 농도의 세포를 치루관의 안쪽부터 치루관을 따라 이식해주었다. 세포의 이식이 끝난 후 피브린 글루를 이용하여 치루관을 채워주었다. 세포이식 후 2주 추척 관찰에서 치루관이 거의 막히고 외부 개구의 대부분에서 상피화가 일어났으며 8주 추적관찰에서는 치루 부위가 완전히 막히고 외부개구가 완전히 상피화된 것이 관찰되었다(상피화된 부분을 약간 스크래핑하여 내부치루관이 완전히 막힌 것을 확인하였음).

이식예 2: 본 환자는 24세 남성환자로 약 10년 전에 크론씨병 진단을 받고 약 3년 전부터 3차례에 걸쳐 fistulectomy 시술을 받았으며 계속적인 재발과 재수술을 반복하였다. 스테로이드, Remicade 등을 투여받았으나 병세의 호전이 없었다. 치루의 계속적인 재발과 염증으로 인해, 지방 줄기세포 시술 대상인 치루는 10시 방향으로 항문에서 1 ㎝ 거리에 위치하며 크기가 7(깊이)×1(직경) ㎝로 농양의 배출이 많고 상당히 악화되어 있었다(도 7b). 환자의 복부에서 약 70 ㎖의 지방을 채취하여 3계대까지 배양하여 총 3×10⁸ 개의 세포를 얻었으며 총 배양기간은 20일이었다. 세포이식 전 큐렛을 실시하여 염증 부분을 제거하고 2×10⁷ 세포/㎖ 농도의 세포를 치루관의 안쪽부터 치루관을 따라 이식해주었다. 세포의 이식이 끝난 후 피브린 글루를 이용하여 치루관을 채워주었다. 세포이식 후 2주 추척관찰에서 이식 전 7 ㎝였던 치루관의 반 이상이 막혀 3 ㎝ 깊이의 관으로 되었으며, 8주 추적관찰에서는 치루 부위가 완전히 막히고 외부개구가 완전히 상피화된 것이 관찰되었다(상피화된 부분을 약간 스크래핑하여 내부치루관이 완전히 막힌 것을 확인하였음).

도 7은 지방 줄기세포 이식 전후를 보여주는 치루 사진이다.

이상의 임상예에서 보듯이, 약물에 반응하지 않고 지속적으로 재발하며 현재까지의 시술방법으로 치료가 어려운 치루에 대해 본 발명에 따른 방법으로 배양한 지방 줄기세포를 적용한 결과 효과적으로 치료된 것을 알 수 있다. 특히, 이식예 1과 2에서와 같이 치루의 직경이 1 ㎝ 이상이고 깊이가 5 ㎝ 이상인 심각한 크기의 치루관을 치료할 수 있는 방법은 아직까지 없었다. 해당 치루에 이식하기 위한 세포의 생산을 위해, 실시예 1에서 제시한 개선된 배양방법을 적용하여 다량의 지방 줄기세포 배양이 가능하였다. 본 발명의 방법에 따르면 WO 2006/136244(2006. 12. 28)에 개시된 방법에 비해 2∼3회의 계대배양에서 10배 이상의 지방조직 유래 스트로마 줄기세포를 확보할 수 있으며, 치료결과 또한 우수하여 임상적으로 보다 개선된 치료방법임을 알 수 있다.

도 1a는 기질배지 또는 증식배지에서 배양한 지방 줄기세포의 CPDL을 나타낸 그래프이고, 도 1b는 기질배지 또는 증식배지에서 20일간 배양한 지방 줄기세포의 수득율을 나타낸 그래프이다.

도 2a는 기질배지 또는 증식배지에서 배양한 지방 줄기세포의 근세포분화능을 보여주는 사진이고(X 40), 도 2b는 기질배지 또는 증식배지에서 배양한 지방 줄기세포의 뼈세포분화능을 보여주는 사진이다(X 40).

도 3a는 지방 줄기세포의 면역반응 유도능을 보여주는 도면이고, 도 3b는 MLR에서 지방 줄기세포의 면역반응 억제능을 보여주는 도면이다.

도 4a는 PHA로 자극된 면역반응에 대한 자가 및 동종 지방 줄기세포의 IFN-γ 억제능을 보여주는 도면이고, 도 4b는 PHA로 자극된 면역반응에 대한 자가 및 동종 지방 줄기세포의 TNF-α 억제능을 보여주는 도면이다.

도 5는 PHA로 자극된 면역반응에 대한, 기질배지 및 증식배지에서 배양한 지방 줄기세포의 IFN-γ 및 TNF-α 억제능(n=9)을 보여주는 도면이다.

도 6은 지방 줄기세포의 세포외기질 단백질 분비능을 보여주는 사진이다(X 40).

도 7은 지방 줄기세포 이식 전후를 보여주는 치루 사진이다.

Claims

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다음 단계를 포함하는 지방 유래 스트로마 줄기세포를 포함하는 지방 줄기세포 조성물의 제조방법:

(a) 대상으로부터 지방조직을 얻는 단계;

(b) 지방조직으로부터 스트로마-혈관 분획(stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 단계;

(c) 스트로마-혈관 분획을 기질배지에서 배양하는 단계;

(d) 스트로마-혈관 분획을 성장인자인 EGF 또는 bFGF를 각각 1∼10 ng/㎖ 농도로 포함하는 증식 배지에서 배양하여 지방 유래 스트로마 줄기세포를 배양하는 단계; 그리고

(e) 배양된 지방 유래 스트로마 줄기세포를 적어도 1계대 이상 계대배양하여, 80% 이상이 CD34 음성인 지방 줄기세포 조성물을 얻는 단계에 추가로,

적어도 1계대 이상 계대배양한 지방 유래 스트로마 줄기세포의 면역조절능을 확인하여 면역억제능력이 뛰어난 지방 유래 스트로마 줄기세포를 선택하는 단계.
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제 5 항에 있어서, 지방조직을 얻는 대상이 동종인 방법.
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