KR101325322B1 - Ｂｃｒ-ｂｃｒ-ａｂｌ 융합 유전자를 포함한 정량분석용 표준 플라스미드 및 이를 이용한 ｂｃｒ-ａｂｌ 유전자의 정량분석 방법 - Google Patents
Ｂｃｒ-ｂｃｒ-ａｂｌ 융합 유전자를 포함한 정량분석용 표준 플라스미드 및 이를 이용한 ｂｃｒ-ａｂｌ 유전자의 정량분석 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 BCR-BCR-ABL 융합 유전자를 포함한 정량분석용 표준 플라스미드 및 이를 이용한 BCR-ABL 유전자의 정량분석 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 서열번호 7로 표시되는 BCR-BCR-ABL 유전자의 염기서열을 포함하는 백혈병의 예측 또는 진단을 위한 정량분석용 표준 플라스미드 및 상기 표준 플라스미드를 이용하여 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 정량 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 백혈병의 예측 또는 진단을 위한 정량분석용 표준 플라스미드는 백혈병 특이 유전자인 BCR-ABL 및 모든 세포내에서 비교적 안정적으로 일정량 발현되는 BCR 유전자가 융합된 BCR-BCR-ABL가 도입되어 있어, 하나의 플라스미드에 2개의 표준물질이 함께 포함되어 있기 때문에 PCR을 통한 백혈병 진단시 상기 플라스미드를 표준정량곡선 산출을 위한 용도로 사용할 경우, 기존 PCR 방법에 비해 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 간편하고 정확하게 측정할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 BCR-BCR-ABL 융합 유전자를 포함한 정량분석용 표준 플라스미드 및 이를 이용한 BCR-ABL 유전자의 정량분석 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 BCR-BCR-ABL 유전자를 포함하는 백혈병의 예측 또는 진단을 위한 정량분석용 표준 플라스미드 및 상기 표준 플라스미드를 이용하여 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.
백혈병은 혈액-형성 조직의 악성 종양을 말하는 것으로서, 바이러스가 동물에게 여러 형태의 백혈병을 야기시킨다고 알려져 있으나, 인간의 백혈병 원인은 아직까지 많이 알려져 있지 않다. 백혈병이 악성으로 변형되는 것은 통상적으로 후속적인 증식 및 클론확장과 함께 둘 이상의 단계를 거쳐 단일 세포 내에서 발생하며, 특정 염색체 전좌가 백혈병 세포의 모폴로지 및 특정 임상의 특성에 관여한다고 알려져 있다.
또한, 백혈병은 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라골수성 백혈병과림프성 백혈병으로 나눌 수 있고, 진행속도에 따라 급성백혈병과 만성백혈병으로 나뉜다. 림프성 백혈병은 림프계 혈액세포가, 골수성 백혈병은 골수계 혈액세포가, 그리고 만성골수성백혈병은 성숙기에 있는 세포가 변이되어 발생하며, 급성골수성백혈병은 비교적 초기단계의 조혈과정에서 분화를 시작하는 골수계 모세포의 장애로 초래된다.
이중, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML)은 골수 내에 존재하는 조혈모세포(hematopoietic stem cell) 상의 염색체 이상으로부터 그 증상이 시작된다고 알려져 있다. 구체적으로, 조혈모세포 내에 존재하는 염색체 9번과 22번 말단에 위치한 일부 영역에서 상호 교환(translocation)이 생기게 되어, 그 결과 해당 염색체들의 말단 부위에 각각 위치하고 있는 ABL(Abelson oncogene) 유전자와 BCR(Breakpoint cluster region) 유전자 사이에 비정상적인 융합이 일어나고 이로부터 BCR-ABL 이라는 불리는 새로운 유전자가 만들어지게 된다. 또한 이러한 BCR-ABL 유전자로부터 발현되는 BCR-ABL 단백질은 세포내에서 중요한 신호전달 물질들을 인산화 (phosphorylation)시키는 타이로신 카이나제(tyrosine kinase)의 기능을 가진다. 따라서 세포분열과 관련된 세포 내 신호전달 체계를 활성화시키고, 한편으론 세포자살 유도작용(apoptosis)과 관련된 신호 전달물질들을 억제하여 비정상적으로 혈액세포를 증가시키는 작용을 한다.
한편, 현재 사용되고 있는 만성 골수성 백혈병을 진단하는 방법으로는 조직학적인 방법인 혈액 검사와 세포 유전학적 검사인 필라델피아 염색체의 검사가 사용되고 있다. 그러나 염색체 이상이 있는 부위에서 일어나는 유전자 이상을 검사하여 BCR-ABL 융합 유전자를 발견하는 것도 중요한 진단법 중 하나이다. 또한 만성 골수성 백혈병의 진단뿐만 아니라 만성 골수성 백혈병 환자의 예후를 평가하기 위해서 BCR-ABL 융합 유전자의 표현 정도에 따른 질환의 진행 정도를 평가하고, 이를 예후 평가에 이용하고자 하는 새로운 노력들이 연구되고 있다. 또한, 만성 골수성 백혈병의 재발 유무와 BCR-ABL 융합 유전자의 표현량은 매우 밀접한 연관성이 있으므로 BCR-ABL 융합 유전자의 검사는 매우 중요하다.
따라서 보다 용이하게 BCR-ABL 융합 유전자의 재조합 정도를 정량하고 이를 이용하여 백혈병을 손쉽게 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있는데, 예컨대, FISH(Fluorescent in situ hybridization)를 이용한 진단 방법(Tkachuk et al., Science, 250,4980:559-562,1990), 체세포 DNA에 대한 PCR을 이용한 방법(Dobrovic et al., Blood , 72(6):2063-2065, 1998), RT-PCR(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 이용한 방법(Lee et al., Blood, 73(8):2165-2170) 및 네스티드(nested) PCR을 이용한 방법(Hessner et al., Genet , Anal . Tech . Appl ., 11(4):90-94, 1994) 등이 개발된 바 있다.
즉, BCR-ABL 유전자의 발현 확인을 통한 만성 골수성 백혈병의 진단 및 예후 평가 방법은 다양한 이식 전 치료 방법들의 효과를 평가하기 때문에 보다 정확하게 이식 시기를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 이식 후의 재발과 관련된 예후까지도 어느 정도 정확히 예측할 수 있는 것으로 알려져 있다.
그러나 백혈병을 진단하는 상기 종래 방법들의 경우, BCR -ABL 재배열이 일어난 개별세포를 직접 검출하는 FISH 방법은 만성 골수성 백혈병의 초기에는 검출이 어려운 단점이 있고, RT-PCR 방법은 민감도는 뛰어나나, 일반적으로 매우 희귀한 만성 골수성 백혈병 환자의 경우를 진단할 수 있는 프라이머를 포함하고 있지 않기 때문에 반드시 세포 유전학적인 방법이 필요하다. 따라서 만성 골수성 백혈병으로 의심되는 환자인 경우 증식 세포의 추출과 배양 등 여러 가지 요건이 충족되어야 하는 세포 유전학적 분석방법을 수행해야 하는 번거로움이 있다. 또한 기존의 RT-PCR 방법은 BCR-ABL 유전자의 분석을 위해 각 타입별로 분리된 반응을 시행하여 분석을 진행해야 하므로 그 방식이 복잡할 뿐만 아니라 정확한 진단을 위해 표준화도 확립되지 않은 상태에 있다.
그러므로 BCR-ABL 융합유전자의 발현 정도를 쉽고 빠르게 또한 정확하게 확인함으로써 만성 골수성 백혈병을 진단할 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 재조합된 유전자, BCR-ABL의 양을 측정하여 백혈병을 예측 또는 진단하는 과정에서 시료 안에 존재하는 BCR-ABL의 양을 정량적으로 정확하게 검출할 수 있는 정량분석용 표준 플라스미드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 정량분석용 표준 플라스미드를 이용하여 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 정량 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 7로 표시되는 BCR-BCR-ABL 유전자의 염기서열을 포함하는 백혈병의 예측 또는 진단을 위한 정량분석용 표준 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 플라스미드는 도 2의 유전자 지도를 갖는 pBCR-BCR-ABL일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백혈병은 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML) 및 급성 림프구성 백혈병(ALL)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은,
상기 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 준비하는 단계;
농도별로 희석한 상기 표준 플라스미드와 생물학적 시료로부터 수득한 핵산을 주형으로 BCR-ABL 및 BCR 유전자에 특이적인 검정용 PCR 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
상기 희석한 표준 플라스미드를 이용하여 수행한 PCR 산물의 양을 측정하여 표준 정량곡선을 산출하는 단계; 및
상기 생물학적 시료로부터 수득한 핵산을 대상으로 수행한 PCR 산물의 양을 상기 표준 정량곡선에 도입하여 상기 시료의 BCR-ABL 및 BCR의 발현양을 계산하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 상기 표준 플라스미드를 이용하여 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 정량 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR 프라이머 세트는 BCR-ABL 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 또는 BCR 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료로부터 수득한 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표준 정량곡선은 농도별로 희석한 제1항에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 수행한 PCR 결과로부터 BCR-ABL에 대한 Cp값 ; 및 BCR에 대한 Cp값을 이용하여 산출되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR은 RT-PCR(reverse transcriptase PCR), RQ-PCR(real time quantitative PCR) 및 실시간 PCR(real time PCR) 방법으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 백혈병의 예측 또는 진단을 위한 정량분석용 표준 플라스미드는 백혈병 특이 유전자인 BCR-ABL 및 모든 세포내에서 비교적 안정적으로 일정량 발현되는 BCR 유전자가 융합된 BCR-BCR-ABL가 도입되어 있어, 하나의 플라스미드에 2개의 표준물질이 함께 포함되어 있기 때문에 PCR을 통한 백혈병 진단시 상기 플라스미드를 표준정량곡선 산출을 위한 용도로 사용할 경우, 기존 PCR 방법에 비해 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 간편하고 정확하게 측정할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 제조한 표준 플라스미드에 함유된 BCR-BCR-ABL 융합 유전자의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 제조한 백혈병의 예측 또는 진단을 위한 정량분석용 표준 플라스미드의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3a 및 3b는 본 발명에 따른 정량분석용 표준 플라스미드를 이용한 RQ-PCR을 통해 산출된 표준 정량곡선 그래프를 나타낸 것으로서, 3a는 BCR 유전자에 대한 표준 정량곡선 그래프이고, 3b는 BCR-ABL 유전자에 대한 표준 정량곡선 그래프를 나타낸 것이다.
도 4a 및 4b는 본 발명에 따른 정량분석용 표준 플라스미드를 이용한 RQ-PCR을 통해 산출된 표준 정량곡선 그래프를 나타낸 것으로서, 4a는 BCR-ABL 유전자에 대한 표준 정량곡선 그래프와 증폭 곡선 그래프이고, 4b는 BCR 유전자에 대한 표준 정량곡선 그래프와 증폭 곡선 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 제조한 백혈병의 예측 또는 진단을 위한 정량분석용 표준 플라스미드의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3a 및 3b는 본 발명에 따른 정량분석용 표준 플라스미드를 이용한 RQ-PCR을 통해 산출된 표준 정량곡선 그래프를 나타낸 것으로서, 3a는 BCR 유전자에 대한 표준 정량곡선 그래프이고, 3b는 BCR-ABL 유전자에 대한 표준 정량곡선 그래프를 나타낸 것이다.
도 4a 및 4b는 본 발명에 따른 정량분석용 표준 플라스미드를 이용한 RQ-PCR을 통해 산출된 표준 정량곡선 그래프를 나타낸 것으로서, 4a는 BCR-ABL 유전자에 대한 표준 정량곡선 그래프와 증폭 곡선 그래프이고, 4b는 BCR 유전자에 대한 표준 정량곡선 그래프와 증폭 곡선 그래프를 나타낸 것이다.
본 발명은 백혈병을 예측 또는 진단하는 과정에서 시료에 존재하는 백혈병의 진단 마커인 BCR-ABL의 발현양을 정확하게 분석할 수 있도록 BCR-ABL 및 내부표준물질인 BCR 유전자를 포함하는 정량분석용 표준 플라스미드를 제공함에 그 특징이 있으며, 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 7로 표시되는 BCR-BCR-ABL 유전자의 염기서열을 포함하는 백혈병의 예측 또는 진단을 위한 정량분석용 표준 플라스미드를 제공함에 그 특징이 있다.
일반적으로 백혈병의 진단 및 치료 과정 중 질환 관련 특이유전자의 양을 정확하게 측정하는 것은 매우 중요한 일이다. 특히 백혈병의 경우, 질환 관련 특이유전자들을 가진 백혈구의 수가 진단 초기에는 상대적으로 낮아 이들의 존재 여부 및 존재량을 측정하여 질환을 진단하기에는 많은 어려움이 있다.
지금까지 백혈병 관련 특이유전자로 알려진 대표적인 것으로는, 급성 림프구성 백혈병의 경우 TEL-AML1, BCR-ABL, MLL aberration, TCR 및 Ig 유전자 등이 있으며, 급성 골수성 백혈병의 경우, AML1-ETO, BCR-ABL, PML-RARa 및 FLT3 유전자 등이 관련되어 있고, 만성 골수성 백혈병의 경우에는 BCR-ABL 유전자가 대표적인 특이 유전자로 알려져 있다.
이에 본 발명에서는 상기 백혈병 관련 특이 유전자들 중에서 다양한 종류의 백혈병 발병에 영향을 주는 BCR-ABL 유전자 및 내부표준물질로 BCR 유전자를 포함하는 플라스미드를 제작한 다음, 상기 플라스미드를 이용하여 백혈병 진단 시 표준이 될 수 있는 표준 정량곡선을 산출함으로써 종래 기술에 비해 보다 정확하고 수월하게 백혈병을 진단 및 예측할 수 있는 정량분석 방법을 최초로 제공하였다.
본 발명에서 사용한 상기 BCR-ABL 유전자는 특히 만성 골수성 백혈병의 발생에 가장 중요한 요인으로 작용하는 염색체 이상 유전자로 알려져 있다. 즉, 만성 골수성 백혈병에서 발견되는 상기 염색체 이상은 9번 염색체와 22번 염색체에 있는 염색체의 일부가 서로 자리를 이동하여 생긴 것으로서, 이것을 필라델피아 염색체(Ph) 라고 부른다. 따라서 필라델피아 염색체는 결국 9번 염색체에 있던 정상적인 C-ABL 유전자의 일부가 22번 염색체에 있는 정상적인 BCR 유전자의 일부와 결합한 것으로서 일명BCR-ABL 융합 유전자라고 일컬으며, 이 새로운 유전자의 형성은 상기 유전자로부터 발현되는 단백 효소에 의해 세포질 내의 여러 기질 단백질이 자극되어 전달된 신호가 혈액세포의 핵 속으로 전달되면서 혈액 세포의 이상적인 증식이 일어나게 되고, 각종 혈액 세포들의 수명이 비정상적으로 늘어나게 되어 백혈병의 특징적인 증상과 인체의 여러 이상을 초래하게 된다.
한편, 본 발명에서는 염색체 이상 유전자인 BCR-ABL 유전자의 검출 방법으로 PCR 방법을 사용하였는데, PCR 방법은 DNA 또는 RNA로 구성된 증폭하고자 하는 표적유전물질, 표적유전물질의 증폭이 개시되는 부위에 상보적으로 부착될 수 있는 프라이머 쌍, 새로이 생성된 DNA의 직접적인 재료가 되는 4 종류의 dNTP 및 DNA의 합성을 주도하는 DNA 중합효소들을 반응용 튜브 내에서 혼합한 후, 열변성(denaturation) 단계, 프라이머 부착(primer annealing) 단계 및 중합효소반응(polymerase extension) 단계라는 3가지의 기본적인 온도 단계로 이루어진 하나의 순환주기를 여러 차례 거치면서 표적유전물질을 지수적으로 증폭하는 방법이다.
이러한 PCR 기법은 DNA 또는 RNA로 구성된 극미량의 유전 물질을 빠른 시간내에 많은 양으로 증폭해낸다는 특성으로 여러 분야에서 널리 사용되고 있으며, 생체 내에 존재할 수 있는 병원균 또는 바이러스의 검색, 태아를 비롯한 인간의 유전병 검진, 혈흔이나 머리카락 및 기타 가검물을 이용한 법의학적 응용과 친자 확인에의 응용, 종간의 유전적 유사도를 이용한 진화 및 분류학에서의 응용 등 그 범위는 대단히 넓다.
그러나 PCR이 갖는 특성 중 가장 큰 단점이 되는 것은 지수적 복제과정 중에 나타나는 샘플간의 미세한 증폭효율 차이에 의하여 증폭반응 후 산물의 커다란 양적 차이를 초래하는 것으로, 동일한 시료와 조건으로 증폭을 하더라도 동일한 결과를 기대하기가 어렵고 결국은 최초 사용된 시료내 특정 유전물질의 정량적 분석이 증폭 산물의 양을 통해 정확히 판별하기가 불가능하다. 또한, 이러한 증폭효율의 차이는 시료 내에 존재하는 미량의 반응저해 물질과 Mg2 + 이온의 농도, 반응 시 열순환 과정의 횟수와 PCR에 사용되어지는 증폭용 튜브 및 사용 기기 등에 따라서도 결과가 변하게 되므로 이론적으로 정확한 증폭량을 계산해 내기는 불가능하다.
따라서 이러한 점을 극복하기 위해, 최대측정치 PCR 방법(MPN-PCR method)이 개발되었는데, 이 방법은 표적유전물질이 포함된 시료를 여러 차례 반복 희석해가며 PCR을 수행한 후 증폭산물의 최소농도를 찾고 이를 이용하여 표적유전물질의 농도와 해당 시료의 양을 알아내는 방법으로 많은 횟수의 PCR을 수행하여야 하는 단점이 있으며, 증폭에 요구되는 표적유전물질을 포함한 시료라 할지라도 PCR을 저해하는 여러 가지 요인이 존재하는 경우 증폭산물을 만들지 못할 수 있어서 신뢰할만한 정확한 정량이 어렵다는 단점을 가지고 있다. 또 다른 방안으로는 경쟁적 중합효소 연쇄반응(competitive PCR)이 있는데, 표적유전물질과 유사한 내부표준물질(competitor) 혹은 내부표준이라 불리는 인공적으로 제작된 표적 DNA를 분석하고자 하는 표적유전물질이 포함된 DNA 시료와 함께 증폭하는 방법이다. 이를 위해서는 표적유전물질과 동일한 프라이머(primer) 부착부위를 포함하면서 동일한 증폭효율을 가지고 있어 표적유전물질과 경쟁적으로 증폭이 되고 증폭되는 부위의 크기가 표적유전물질의 크기와 달라서 증폭 이후에는 겔 상에서의 전기영동이나 크로마토그래피 등의 방법으로 표적유전물질의 증폭산물과 구분되어질 수 있는 증폭산물을 낼 수 있는 특성의 내부표준물질의 제작이 선행되어야 한다. 이렇게 준비된 내부표준물질은 희석배율을 달리하여 미지량의 표적유전물질과 함께 증폭에 참여하게 되며 이후 두 증폭산물의 양을 비교함으로써 증폭에 사용된 증폭대상물질의 양을 간접적으로 알아내는 방법이다. 그러나 이러한 방법을 사용하여 백혈병을 진단할 경우, 적절하게 사용할 수 있는 내부표준물질이 마땅치가 않았으며, 내부표준물질을 사용하는 경우에 있어서도, BCR-ABL 유전자가 포함된 플라스미드 및 내부표준물질이 포함된 플라스미드를 별도로 제작한 후, 이를 각각 농도별로 희석하여 PCR 반응시킨 후, 표준곡선을 산출하는 과정에서 상기 유전자가 포함된 각각의 플라스미드를 사용함으로써 오차 등이 발생하는 문제가 있다.
따라서 본 발명은 BCR-ABL 및 BCR 유전자가 하나의 플라스미드에 존재하며, PCR을 이용한 백혈병의 예측 또는 진단과정에서 오차 없이 정확한 결과를 도출할 수 있는 정량분석용 표준 플라스미드를 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 "진단"이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 백혈병 특이 유전자의 발현 유무를 확인하여 백혈병의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 "진단"은 백혈병 특이 유전자인 BCR-ABL 유전자의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 백혈병의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, BCR-ABL 및 BCR 유전자 포함된 정량분석용 표준 플라스미드를 제조하기 위해, 백혈병 세포주인 K562 세포로부터 RNA를 추출한 후, BCR-ABL 및 BCR 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 이후, PCR 증폭된 상기 BCR-ABL 단편 및 BCR 단편을 다시 TOPO 벡터로 옮겨 BCR-ABL 및 BCR 유전자가 융합된 BCR-BCR-ABL 함유 플라스미드를 제조하였고, 제조된 상기 플라스미드의 개열지도를 도 2에 나타내었고, 상기 플라스미드에 포함된 BCR-BCR-ABL 융합 유전자의 모식도를 도 1에 나타내었으며, 이를 "pBCR-BCR-ABL 벡터"로 명명하였고, 상기 BCR-BCR-ABL 융합 유전자의 서열을 서열목록 7에 나타내었다.
따라서 바람직하게 본 발명에 따른 정량분석용 표준 플라스미드는 서열번호 7로 표시되는 BCR-BCR-ABL 유전자의 염기서열을 포함할 수 있으며, 상기 표준 플라스미드는 도 2의 유전자 지도를 갖는 pBCR-BCR-ABL 플라스미드일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 표준 플라스미드는 PCR 방법에서 정확성이 우수한 정량분석용 표준치를 제공하기 위해 내부표준물질로서 BCR 유전자를 사용하였다. 상기 "내부표준물질"이라 함은 PCR 과정에서 실험결과를 정확히 측정할 수 있는 대조군으로서의 역할을 할 수 있는 물질을 말하는 것으로서, 본 발명에서는 BCR-ABL 유전자 이외에도 특히 BCR 유전자를 사용하였는데, 이는 BCR 유전자는 비발현 유전자(pseudogene)가 아니며, 세포 내에서 너무 많은 또는 너무 적은양이 아닌 일정수준의 발현정도를 유지하는 특성이 있고, 백혈병 환자의 세포 및 정상인의 세포에서 발현수준이 유사하며, 세포 주기에 비의존적일 뿐만 아니라, X 염색체에 위치되어 있지 않으며, 특히 각 백혈병의 타입(AML, ALL 또는 CML)에서 발현의 큰 차이가 없는 특징이 있으므로, 내부표준물질로 사용하기에 아주 적합하다고 할 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명에 따른 정량분석용 표준 플라스미드를 이용하여 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 정량 분석하는 방법을 제공할 수 있으며, 바람직하게 상기 정량 분석 방법은, 상기 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 준비하는 단계; 농도별로 희석한 상기 표준 플라스미드와 생물학적 시료로부터 수득한 핵산을 주형으로 BCR-ABL 및 BCR 유전자에 특이적인 검정용 PCR 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 희석한 표준 플라스미드를 이용하여 수행한 PCR 산물의 양을 측정하여 표준 정량곡선을 산출하는 단계; 및
상기 생물학적 시료로부터 수득한 핵산을 대상으로 수행한 PCR 산물의 양을 상기 표준 정량곡선에 도입하여 상기 시료의 BCR-ABL 및 BCR의 발현양을 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 "생물학적 시료"란 백혈병이 발생 또는 진행 정도에 따른 환자 또는 백혈병으로 의심되는 환자로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 수득한 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
또한, 상기 BCR-ABL 및 BCR 유전자에 특이적인 검정용 PCR 프라이머는 BCR-ABL 유전자 및 BCR 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있으며, 상기 프라이머는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 5로 나타내는 BCR-ABL 유전자 및 서열번호 6으로 나타내는 BCR 유전자 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 일 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머" 란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 BCR-ABL 및 BCR 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게, BCR-ABL 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있고, BCR 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.
또한, 상기 생물학적 시료로부터 핵산을 얻는 단계는 통상의 DNA 또는 RNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 백혈병의 예측 및 진단을 보다 정확하게 정량분석하기 위한 방법으로는 PCR 방법을 사용할 수 있는데, 상기 PCR 방법으로는 이에 제한되지는 않으나, RT-PCR(reverse transcriptase PCR), RQ-PCR(real time quantitative PCR) 및 실시간 PCR(real time PCR) 방법을 수행할 수 있으며, 바람직하게는 실시간 정량적 중합효소연쇄반응인 RQ-PCR을 수행할 수 있다.
상기 RQ-PCR이란 증폭하고자 하는 표적유전자의 염기서열에 대해 상보적인 탐식유전자에 발광물질을 부착하고, 유전자 증폭의 초기에 유리되어 발광하는 형광을 측정함으로써 보다 특이적으로 실시간에 증폭 유전자의 양을 정확하게 정량할 수 있는 방법이다.
이러한 RQ-PCR의 경우, 다양한 소식자가 이용되지만 최근 가장 많이 사용되고 있는 대표적인 것으로는 SYBR Green I 염색시료 및 TaqMan 프로브가 있다. 상기 SYBR Green I 염색시료를 사용할 경우에는 상기 시료가 두 가닥(double-strand, ds) DNA의 minor groove에 결합하여 PCR 증폭산물을 검출하는데, 즉 이중 가닥의DNA가 많으면 많을수록 형광을 증가시키나 염색시료가 PCR 반응에는 영향을 미치지 않는다. SYBR Green I 염색시료는 PCR 과정에서 생긴 어떠한 이중가닥 DNA에도 결합하므로 대상 염기서열(target sequence)에 관계없이 이용할 수 있는 장점이 있으나 때로는 비특이적 산물을 검출하여 특이도가 떨어지므로 PCR 조건을 특이성이 높게 유지하는 것이 좋다. 또한, TaqMan 프로브(hydrolysis probe)를 사용할 경우에는 RQ-PCR에서 PCR 증폭산물을 검출하는데 Taq DNA polymerase의 5'-exonuclease 활성도와 FRET (fluorescent resonant energytransfer) 원리가 이용된다. TaqMan 소식자는 올리고뉴클레오티드로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 사이의 특이한 서열 주형으로서 양쪽 끝에 리포터 프라이머의 5' 말단으로부터 3' 말단으로 연장되면서 리포터 시약을 소식자의 5' 말단에 붙어있는 리포터 시약을 끊고 분리된다.
또한, RQ-PCR은 실시간으로 매주기마다 유전자의 증폭을 분석할 수 있는데, 이 분석의 시작은 PCR 일정 주기 후에 축적된 증폭 산물의 양에 의해서 검출하기 보다는 처음으로 PCR 증폭산물이 나타날 때부터 측정할 수 있다.
RQ-PCR의 정량분석은 통상적으로 증폭 플롯(amplification plot)을 이용하여 분석되어 지는데 이 그래프는 발광신호(Y축)와 PCR 사이클 수(X축)로 이루어져 있다. 초기 PCR 과정에서는 발광신호 전달의 변화가 거의 없는데, 보통 이때를 'baseline'으로 정의하고 'threshold'는 baseline 때의 발광도 보다는 더 높은 값으로 정하는데, 일반적으로 컴퓨터 소프트 프로그램에 의해 자동으로 정해진다. 또한, RQ-PCR에서 중요한 인자로서 Cp값을 들 수 있는데, 이는 프로브의 분리에 의해 생기는 형광의 양이 기본 값 이상의 일정한 기준 값에 도달하는 증폭 주기를 말하는 것으로서, 정확한 양을 알지 못하는 유전자의 정량은 우선 이 Cp 값과 표준곡선을 통하여 계산될 수 있으며, 이러한 계산은 Cp 값의 생산, 표준곡선의 준비 및 초기 유전자의 양이 함께 지원되는 소프트웨어를 이용하여 자동으로 얻을 수 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명의 일실시예를 통해 본 발명에서 제작한 내부표준물질인 BCR와 백혈병 특이 유전자인 BCL-ABL 유전자를 함께 함유한 표준 플라스미드를 이용하여 RQ-PCR을 통해 표준곡선을 작성하였는데, 즉, 각 농도별로 희석한 pBCR-BCR-ABL 플라스미드를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 이용한 RQ-PCR을 수행한 후, 각 농도별로 희석한 샘플로부터 Cp값을 계산하여 미지 시료의 정량을 위한 표준곡선을 얻을 수 있었다(실시예 2 참조).
본 발명에서 상기 "표준 정량곡선" 이란 농도를 알고 있는 표준시료, 즉 본 발명에 따른 BCR 및 BCR-ABL 융합 유전자를 포함하는 표준 플라스미드를 대상으로 프라이머를 이용하여 BCR-ABL Cp값 및 BCR의 Cp값을 측정하고, 이 값을 회귀분석(regression analysis)하여 얻은 농도별 BCR-ABL Cp값 및 BCR의 Cp값의 선형의 관련성을 나타내는 함수식을 의미하며, 일반적으로 프로그램을 통해 얻을 수 있다. 상기 표준 정량곡선은 단순회귀모형의 기울기와 절편은 n개의 자료 쌍을 통하여 최소제곱법으로 추정될 수 있으며, 이런 방법으로 얻은 적합된 회귀식(fitted regression equation)에 미지의 분석시료의 BCR-ABL Cp값 및 BCR의 Cp값을 대입함으로써, 분석시료의 BCR-ABL 융합유전자의 발현양을 계산할 수 있다.
따라서 상기 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 PCR을 수행함으로써 산출되는 상기 표준 정량곡선은 농도별로 희석한 본 발명의 표준 플라스미드에 대한 PCR 결과로부터 BCR-ABL에 대한 Cp값; 및 BCR에 대한 Cp값을 이용하여 산출될 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 상기 Cp값을 RQ-PCR 기기에 포함되어 있는 소프트웨어에 의해 자동적으로 계산하였다.
그러므로 본 발명자들은 본 발명의 표준 플라스미드의 경우, 시료에 존재하는 BCL-ABL 유전자의 함량을 정량분석하기 위해 표준물질로 BCL-ABL 뿐만 아니라 BCR 유전자를 동시에 사용할 수 있음에 따라 기존의 방법에 비해 보다 수월하고 정확하게 정량값을 보정할 수 있다는 사실을 알 수 있었고, 궁극적으로 측정된 결과에 대한 신뢰성을 높일 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
또한, 본 발명에 따른 상기 PCR을 이용한 정량분석은 시중에서 시판되고 있는 PCR 반응기기를 사용하여 수행할 수 있는데, 상기 반응기기로는 이에 제한되지는 않으나, LightCyclerTM(Roche, Germany), ABI PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems, USA), iCyclerTM(Bio-Rad, USA) 등을 사용할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 백혈병을 진단할 경우, 상기 백혈병으로는 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML) 및 급성 림프구성 백혈병(ALL)등을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
BCR
-
ABL
과
BCR
를 포함하는 표준 플라스미드의 제조
본 발명자들은 PCR 방법으로 오차를 줄이고 정량적으로 정확하게 백혈병을 예측 또는 진단 할 수 있도록 정량분석용 표준값을 제공할 수 있는 표준 플라스미드를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
<1-1>
RNA
분리와
cDNA
합성
백혈병 세포주인 K562 세포로부터 총 RNA를 추출하였는데, RNA의 추출은 당업계에 공지된 트리졸 시약을 이용하여 수행하였고, 추출한 RNA를 대상으로 로슈사로부터 구입한 Transcriptor First Strand cDNA 합성 키트를 사용하여 상기 키트의 제조사에서 공지한 방법에 따라 cDNA를 합성하였다. 이후, 합성된 상기 cDNA를 주형으로 하고, FastStart Taq DNA polymerase 및 dNTPack(로슈사)와 BCR-ABL 및 BCR 유전자를 각각 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때, 상기 PCR 수행을 위해 사용한 시약 및 프라이머 서열은 하기에 기재된 바와 같으며, 상기 BCR-ABL을 증폭할 수 있는 프라이머는 정방향 프라이머의 경우, 5' 말단에 EcoRI의 제한효소 사이트가 인지할 수 있는 부위를 추가하여 제작하였고, 역방향 프라이머의 경우, 5' 말단에 XhoI 제한효소 사이트가 인지할 수 있는 부위를 추가하여 제작하였으며, 상기 BCR를 증폭할 수 있는 프라이머는 정방향 프라이머의 경우, 5' 말단에 HindIII의 제한효소 사이트가 인지할 수 있는 부위를 추가하여 제작하였고, 역방향 프라이머의 경우, 5' 말단에 EcoRI 제한효소 사이트가 인지할 수 있는 부위를 추가하여 제작하였다. 또한, PCR 반응은 94℃에서 3분간 DNA를 변성시키고, 이후 94℃에서 30초, 63℃에서 30초 및 72℃에서 30초 반응을 30회 반복 수행한 후, 72℃에서 5분간 연장반응 시켰다.
| 5X 버퍼 | 5 ㎕ |
| 25mM MgCl2 | 3 ㎕ |
| 10mM dNTP | 1 ㎕ |
| Taq (5U/㎕) | 0.4 ㎕ |
| Forward 프라이머 (25 uM) | 1 ㎕ |
| Reverse 프라이머 (25 uM) | 1 ㎕ |
| 증류수 | 33.6 ㎕ |
| cDNA | 5 ㎕ |
| 총 부피 | 50 ㎕ |
| 프라이머 종류 | 프라이머 서열 | 서열번호 |
| BCR-ABL F | 5'-gcg cga att cgt gca gag tgg agg gag aac-3' | 1 |
| BCR-ABL R | 5'-gcg cct cga ggc cat cag aag cag tgt tga-3' | 2 |
| BCR F | 5'-gcg caa gct tag agg tcc aag gtg ccc tac-3' | 3 |
| BCR R | 5'-gcg cga att cca agg acc agc tgt cag tca-3' | 4 |
그 결과, 상기 PCR 반응을 통해 K562 세포로부터 분리 및 증폭된 BCR 및 BCR-ABL은 각각 증폭산물로서 544bp 및 709bp의 DNA 단편을 수득하였고, 이들의 염기서열을 서열번호 5(BCR 염기서열) 및 서열번호 6(BCR-ABL 염기서열)에 각각 기재하였다.
<1-2> BCR-ABL과 BCR 유전자를 함유함 표준 플라스미드 제조
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 PCR 산물들을 pCR2.1-TOPO 벡터내로 도입하여 BCR-ABL과 BCR 유전자를 포함하는 표준 플라스미드를 제조하였다. 이를 위해, 먼저 상기 <1-1>의 PCR 산물을 Wizard SV Gel 및 PCR Clean-up 시스템(프로메가)을 이용하여 겔로부터 각각 정제한 후, EcoRI 제한효소를 이용하여 절단시킨 후, 다시 아가로즈 겔에 전기영동하여, 제한효소가 처리된 BCR-ABL 및 BCR DNA 단편을 확인하였다. 이후, 다시 Wizard SV Gel 및 PCR Clean-up 시스템(프로메가)을 이용하여 겔로부터 DNA 단편들을 각각 분리한 다음, BCR-ABL 및 BCR DNA 단편을 EcoRI 점착성 말단을 이용하여 결합시켰다. 이후, 상기 결합된 BCR-BCR-ABL DNA 단편은 당업계에 공지된 TOPO 클로닝 반응(상온에서 5분간 반응, TOPO TA 클로닝 키트, 인비트로젠사)을 수행하여 pCR2.1-TOPO 벡터내로 도입시켜, 도 2의 개열지도를 갖는 pBCR-BCR-ABL 표준 플라스미드를 제작하였다. 또한, 상기 플라스미드내로 도입된 BCR-ABL 및 BCR DNA의 단편 모식도는 도 1에 나타내었으며, 상기 플라스미드에 도입된 BCR-BCR-ABL 융합 유전자의 염기서열은 서열번호 7에 나타내었다.
또한, 상기 본 발명에서 제조한 pBCR-BCR-ABL 표준 플라스미드는 DNA는 공지된 유전자를 상업적으로 입수할 수 있는 벡터에 삽입시켜 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있었는 바, 별도로 기탁하지 않았다.
<실시예 2>
본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용한 RQ-PCR 표준정량곡선 측정 일반적으로 RQ-PCR(Real-time Quantitative PCR)은 기존의 PCR 방법으로는 거의 불가능했던 PCR을 이용한 핵산(DNA 또는 RNA)의 정량을 손쉽고 빠르게 할 수 있는 기술로서, 기존 PCR의 후기 분석에 따른 비정량적 요소를 제거하고 실시간으로 분석 가능하여 빠른 시간 내에 정량분석이 가능하게 하는 유전자 정량 분석법으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 BCR-BCR-ABL 융합 유전자를 함유한 본 발명의 표준 플라스미드를 이용하여 RQ-PCR 방법으로 백혈병을 진단시, 보다 정확한 표준정량분석 그래프(즉, 표준치)를 제공할 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해, 상기 제조된 BCR-BCR-ABL 유전자 함유 표준 플라스미드를 DEPC 처리된 증류수로 연속 희석하여 주형 DNA(즉, s1:2x106 copies/, s2:2x105 copies/, s3:2x104 copies/, s4:2x103 copies/, s5:2x102 copies/, s6:2x10 copies/)를 각각 준비하고, 상기 실시예 1에서 사용한 서열번호 1 내지 4의 프라이머를 사용하여 동일 조건하에서 RQ-PCR을 수행하였다. 이후, 각각 다른 농도로 희석된 표준 플라이스미드를 사용하여 증폭된 산물을 통해 RQ-PCR 기기에 구비된 소프트웨어를 통해 BCR-ABL 및 BCR의 Cp값을 측정하였고, 이로부터 BCR-ABL 및 BCR에 대한 표준 정량곡선을 산출하였다. 또한, 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 실제적으로 환자 샘플을 대상으로 BCR-ABL의 유전자를 정량할 수 있는지를 조사하기 위해 백혈병 환자로 판정된 환자들의 혈액으로부터 DNA를 추출한 후, 상기 서열번호 1 내지 4의 프라이머를 사용하여 RQ-PCR을 수행하였고, PCR 수행결과 얻어진 결과를 가지고 상기 표준 정량곡선과 비교함을 통해 환자샘플에 함유된 BCR-ABL을 포함하는 cDNA의 복제수를 계산하였다. 이때, 상기 Cp값은 프로브의 분리에 의하여 생기는 형광의 양이 기본 값 이상의 일정한 기준 값에 도달하는 증폭 주기를 말하며, 정확한 양을 알지 못하는 유전자의 정량은 Cp 값과 표준 곡선을 통하여 계산되어진다. 즉, RQ-PCR 분석에서 표준 샘플(cDNA) 및 환자 샘플(cDNA)의 Cp값은 Roche사의 RT(real-time) 시퀀스 검출 소프트웨어용 설정값에 따라 계산하였고, 이후 BCR-ABL 및 BCR 표준곡선은 분자수의 로그값에 대한 threshold cycle를 플로팅(plotting)하여 계산하였으며, 증폭 곡선 그래프로부터 계산된 방정식을 이용하여 각 샘플에 함유된 cDNA의 정확한 복제수를 계산하였다. 상기 실험에서 RQ-PCR을 통해 도출된 증폭된 BCR-ABL 유전자 및 BCR 유전자의 Cp 값은 하기 표 3 및 표 4에 기재하였으며, 이로부터 계산된 정량 표준곡선은 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같다.
| 샘플 (표준플라스미드 사용) |
Cp | 농도 | 환자샘플 | Cp | 농도 |
| s1 | 20.25 | 10000000 | 샘플 1 | 35.43 | 492 |
| s2 | 23.79 | 1000000 | 샘플 2 | 30.96 | 9280 |
| s3 | 27.23 | 100000 | 샘플 3 | 22.19 | 2860000 |
| s4 | 31.16 | 10000 | |||
| s5 | 34.18 | 1000 | |||
| s6 | 37.64 | 100 | |||
| 증류수 |
| 샘플 (표준플라스미드 사용) |
Cp | 농도 | 환자샘플 | Cp | 농도 |
| s1 | 20.54 | 10000000 | 샘플 1 | 24.15 | 956000 |
| s2 | 24.00 | 1000000 | 샘플 2 | 24.19 | 931000 |
| s3 | 27.64 | 100000 | 샘플 3 | 22.93 | 2140000 |
| s4 | 31.54 | 10000 | |||
| s5 | 34.18 | 1000 | |||
| s6 | 43.73 | 100 | |||
| 증류수 |
그 결과, 본 발명에서 제조한 BCR-ABL 및 BCR 유전자가 포함된 표준 플라스미드를 이용하여 RQ-PCR을 수행한 결과, 상기 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 RQ-PCR 반응을 통해 표준 정량곡선을 얻을 수 있었으며, 특히 표준 정량곡선을 위한 표지 마커(즉, 내부표준물질)로 BCR-ABL 및 BCR 유전자가 하나의 플라스미드안에 존재하고 있어, 상기 BCR-ABL 및 BCR 유전자가 각각 별도로 포함된 표준 플라시미드를 사용할 경우에 비해 발생하는 오차 등을 줄일 수 있는 장점이 있다는 것을 알 수 있었다.
또한, 상기 실시예를 통해 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 백혈병 환자 샘플에 존재하는 BCR-ABL 유전자의 정량분석 결과, 환자샘플 1의 경우, BCR-ABL-BCR(%)는 0.05%(492/956000 x 100)인 것으로 나타났고, 환자샘플 2의 경우에는 1.00%(9280/931000 x 100)인 것으로 나타났으며, 환자샘플 3의 경우에는 133.64%(2860000/2140000 x 100)인 것으로 나타났다. 따라서 상기 본 발명에 따른 방법의 경우, 환자의 샘플 내에 존재하는 매우 적은 양의 BCR-ABL 유전자 양도 정확하게 측정 가능함을 알 수 있었다.
<실시예 3>
본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용한 RQ-PCR 증폭곡선 측정
본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용한 경우, 백혈병의 발병여부를 정확하게 진단할 수 있는지 백혈병 환자의 샘플, 즉 환자로부터 수득한 혈액샘플을 가지고 RQ-PCR을 수행하였다. 이때 RQ-PCR의 수행은 상기 실시 예 2의 조건과 동일하게 수행하였고, 대조군으로서 기존 방법, 즉 BCR-ABL 유전자가 포함된 플라스미드와 BCR 유전자가 포함된 플라스미드를 각각 별도로 제작하여 사용하는 기존 RQ-PCR 방법을 사용하였다. 본 발명에 따른 새로운 플라스미드 사용과 기존 플라스미드 사용의 정확한 비교분석을 위해서 환자혈액으로부터 RNA 추출, cDNA 합성을 진행하고 동일한 cDNA를 사용하여 RQ-PCR 비교실험을 진행하였으며, 각 샘플에 대해서는 데이터의 정확성을 테스트하기 위해서 두 번씩의 반복 실험이 이뤄졌다.
그 결과, 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 백혈병 환자 샘플에 존재하는 BCR-ABL과 BCR 유전자의 정량을 분석한 결과, 환자샘플 1의 경우 기존방법으로 수행하였을 때에는 두 번의 반복 실험에서 BCR-ABL/BCR(%) 값의 차이가 1.13배로 나왔고 본 발명의 방법으로 수행한 경우에는 1.05배로 측정되었다. 또한, 환자샘플 2의 경우도 기존 방법으로 수행하였을 때에는 두 번의 반복 실험에서 BCR-ABL/BCR(%) 값의 차이가 1.13배로 나왔고 본 발명의 방법으로 수행한 경우에는 1.11배로 측정되었다(도 4 참조). 플라스미드의 정확도에 따라서 환자 샘플에서의 측정되는 유전자의 양이 달라지므로, BCR-ABL과 BCR에 대한 각기 다른 플라스미드를 사용하는 기존 방법에 비해서 하나의 플라스미드를 사용할 때 환자 샘플에서 측정되는 유전자 양의 차이가 적어짐을 알 수 있다. 이러한 결과를 토대로, 본 발명에 따른 방법의 경우 기존의 PCR 방법에 비해 PCR의 효율 및 정확도를 향상시킬 수 있어 궁극적으로 적은양의 샘플만으로도 백혈병의 진단을 효과적으로 수행할 수 있음을 알 수 있었다. 또한 기존 방법에서는 BCR-ABL 유전자와 BCR 유전자에 대해서 각기 다른 2세트의 플라스미드를 준비해야하는 번거로움이 있지만, 새로 발명한 플라스미드를 사용하므로 한 세트의 플라스미드를 준비하여 BCR-ABL 유전자와 BCR 유전자의 양을 모두 측정할 수 있는 장점이 있다. 결론적으로 BCR-ABL 유전자가 포함된 플라스미드와 BCR 유전자가 포함된 플라스미드를 별로로 제작한 후에 이를 각각 농도별로 희석하여 표준곡선을 산출하는 것에 비해서, BCR-ABL 유전자와 BCR 유전자를 모두 포함하는 플라스미드를 제작하여 표준곡선을 산출함으로써 종래 기술에 비해 보다 정확하게 백혈병을 진단 및 모니터링 할 수 있는 정량분석을 제공할 수 있다.
참고적으로, PCR에서는 1사이클마다 DNA가 2배씩 지수 함수적으로 증가해 일정 이상의 사이클을 반복하면 DNA양은 평형상태(plateau)에 달한다. 이렇게 증폭하는 DNA양을 실시간으로 모니터링한 그래프가 증폭 곡선이며, 도 4에서는 DNA농도(실제의 증폭 산물량)를 붉은 선으로 나타냈고, 그것을 형광에 의해 검출한 신호의 강도를 초록형광으로 나타냈다. PCR 증폭 산물량이 형광 검출할 수 있는 양에 이르면 증폭 곡선은 급격히 상승하기 시작해 지수 함수적으로 신호가 상승한 후 평형상태(plateau)에 이른다.
따라서 초기의 DNA 양이 많을수록 증폭 산물량은 빠르게 검출 가능한 양에 다다르게 되므로, 증폭 곡선이 가파르게 상승한다. 따라서 다른 농도로 희석된 상기 표준 플라스미드를 사용하여 RQ-PCR을 실시하면, 초기 DNA 양이 많은 차례로 일정한 간격으로 나란해진 증폭 곡선을 얻을 수 있다. 여기서, 적당한 곳에 반응을 일으키는 최소의 역가를 설정하면 반응을 일으키는 최소의 역가와 증폭 곡선이 만나는 점 인 CT값이 산출된다. CT값과 초기 주형량의 사이에는 직선 관계가 있어, 도 4와 같은 검량선을 작성할 수 있다.
따라서 본 발명자들은 PCR 방법을 통해 백혈병 진단을 예측 또는 진단할 경우, 본 발명에서 제조한 표준 정량분석용 플라스미드를 이용한다면, BCR-ABL 및 BCR 유전자에 대한 표준 정량곡선을 하나의 플라스미드를 통해 산출할 수 있으므로 보다 간단하고 정확하게 백혈병의 조기 진단 및 환자의 예후 모니터링에 유용하게 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (8)
- 서열번호 7로 표시되는 BCR-BCR-ABL 유전자의 염기서열을 포함하는 백혈병의 예측 또는 진단을 위한 정량분석용 표준 플라스미드.
- 제1항에 있어서,
상기 플라스미드는 도 2의 유전자 지도를 갖는 pBCR-BCR-ABL인 것을 특징으로 하는 백혈병의 예측 또는 진단을 위한 정량분석용 표준 플라스미드. - 제1항에 있어서,
상기 백혈병은 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML) 및 급성 림프구성 백혈병(ALL)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백혈병의 예측 또는 진단을 위한 정량분석용 표준 플라스미드.
- 제1항에 따른 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 준비하는 단계;
농도별로 희석한 상기 표준 플라스미드와 생물학적 시료로부터 수득한 핵산을 주형으로 BCR-ABL 및 BCR 유전자에 특이적인 검정용 PCR 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
상기 희석한 표준 플라스미드를 이용하여 수행한 PCR 산물의 양을 측정하여 표준 정량곡선을 산출하는 단계; 및
상기 생물학적 시료로부터 수득한 핵산을 대상으로 수행한 PCR 산물의 양을 상기 표준 정량곡선에 도입하여 상기 시료의 BCR-ABL 및 BCR의 발현양을 계산하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 정량 분석하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 PCR 프라이머는 BCR-ABL 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 또는 BCR 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 제1항에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 정량 분석하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 시료로부터 수득한 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는, 제1항에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 정량 분석하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 표준 정량곡선은 농도별로 희석한 제1항에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 수행한 PCR 결과로부터 BCR-ABL에 대한 Cp값; 및 BCR에 대한 Cp값을 이용하여 산출되는 것을 특징으로 하는, 제1항에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 정량 분석하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 PCR은 RT-PCR(reverse transcriptase PCR), RQ-PCR(real time quantitative PCR) 및 실시간 PCR(real time PCR)로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 제1항에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 시료에 존재하는 BCR-ABL의 발현양을 정량 분석하는 방법.
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