KR101322282B1

KR101322282B1 - 젤라틴 유래 효소분해물을 함유하는 골 성장 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR101322282B1
Application number: KR1020090119149A
Authority: KR
Inventors: 장애라; 함준상; 김동훈; 김혜경; 임강현; 오미화; 이승규
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2009-12-03
Filing date: 2009-12-03
Publication date: 2013-10-25
Anticipated expiration: 2029-12-03
Also published as: KR20110062429A

Abstract

본 발명은 젤라틴 유래 효소분해물을 함유하는 골 성장 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 조골세포를 유의적으로 증식시키고 뼈의 길이를 효과적으로 성장시켜 성장기 어린이를 위한 식품원으로 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 특히 골강도 증진 및 성장촉진용으로 용이하게 사용 가능한 젤라틴 유래 효소분해물(저분자 펩타이드)을 유효성분으로 포함하는 골 성장 촉진용 조성물에 관한 것이다.

젤라틴, 효소분해물, 골 성장 촉진

Description

젤라틴 유래 효소분해물을 함유하는 골 성장 촉진용 조성물{Composition for bone growth promotion comprising Gelatin hydrolysates}

본 발명은 젤라틴 유래 효소분해물을 함유하는 골 성장 촉진용 조성물에 관한 것이다.

최근 고령화 사회로 진입함에 있어 노인들의 골절과 바쁜 현대생활로 인해 청소년들의 식품섭취의 불균형이 증가하면서 골다공증의 증가 등, 각종 뼈 질환이 사회문제가 되고 있다. 우리나라의 골다공증 환자는 약 1,000만 명 정도로 추정되고 있으며 2010년에는 1,600만 명 정도로 예상되고 있다.

우리나라 여성의 42.6%가 골다공증 또는 골감소증을 보이고 50, 60, 70대로 진행될수록 골다공증 비율이 2배 이상 증가하고 있다.

한국여의사회와 여성부공동으로 30~70대 여성 660명의 골다공증 진단 결과, 골감소증은(골밀도-1.0 ~ -2.5%) 233명으로 35.3%이었고 골다공증(골밀도 -2.5 이상)은 48명으로 7.3%를 나타내었고, 또한 50대의 5.1%가 골다공증이었고 60대는 12.4%, 70대는 26%가 골다공증이었다.

노화로 인한 65세 이상의 노인성골다공증과 여성호르몬 부족으로 오는 폐경 후 골다공증뿐만 아니라 칼슘의 섭취 부족과 같은 잘못된 식사 습관에서 골다공증이 젊은 사람들에게서 발생하고 있다. 또한, 최근 20여 년간 초중고생의 골절율은 2배 이상 증가하였고 골다공증을 예방하기 위해서라도 성장기에 식품을 통해 최대 골량을 높이고 관리하는 것이 중요하다.

영양은 외부의 물리적인 부하에 대하여 뼈의 구조적 저항력의 유지에 매우 중요한 역할을 한다[Bonjour JP,J. Am Coll Nutr. 2005, 24(6), 526S-536S]. 적당한 비타민 D의 섭취와 함께 칼슘의 섭취와 더불어 단백질은 뼈의 건강에 있어 매우 중요한 영양소이며 골다공증의 예방에 역할을 하게 된다. 특히, 동물성 단백질은 만성적 대사산증, 즉 요에 칼슘이 빠져나오는 증상(calciuric)에 의한 뼈 건강의 악화와 광물질 파괴를 촉진한다는 연구보고도 있지만 단백질의 섭취가 감소하면 뼈 건강에 부정적인 역할을 하는 것도 밝혀졌다. 따라서, 단백질의 선택적인 결핍은 뼈의 무게, 미세구조와 뼈강도 급격한 감소 및 골다공증의 특징을 일으키게 된다고 볼 수 있다. 노인의 경우 단백질 섭취 감소 시 흔히 엉덩이 뼈 골절이 나타나는 것이 관찰되었고 이러한 환자에게 케이신 단백질을 급여한 결과 골절 후 뼈 손실을 감소시켰으며 근육 강도도 증가시키고 합병증을 감소시키고 병원입원일자를 감소시켰다. 실험실실험이든 임상실험이든지 결과를 종합해보면 상대적으로 높은 단백질 섭취는 즉 동물성 단백질이든 식물성 단백질이든 섭취 후 뼈 무기질 량을 증가시키고 골다공증유발의 골절율을 감소시키고, 또한 단백질의 섭취는 IGF-1을 증진시키는데 이는 골격발달과 뼈의 형성에 영향을 미치는 긍정적인 역할을 하는 요소로서 작용한다. 결론적으로 단백질은 칼슘과 비타민 D와 함께 골다공증의 예방에 필수적이다.

뼈 강도를 증진시키고 성장을 촉진시키고 골다공증의 예방을 위해 여러 가지 칼슘 보강용 단백질 또는 펩타이드 소재가 개발되었다. 현재까지는 우유에서 유래된 카세인포스포펩타이드(casein phosphopeptide, CPP)가 대표적이며 섭취 시 칼슘의 용해성을 증진시켜 칼슘 흡수를 돕는 것으로 알려져 있다.

CPP는 소화관 내에서 카세인의 분해에 의해 얻어지며 랫트에서 뼈의 석회화(calcification)를 돕는 것으로 알려지고 있다. 이러한 CPP는 칼슘을 킬레이팅하고 칼슘인산염의 침강을 막아주어 용해 칼슘 이용성을 증가시킨다.

계란의 난황 내 존재하는 단백질 중 포스비틴을 이용하여 칼슘의 가용성을 증진시켜 칼슘 흡수를 증진시켜 골 대사를 촉진시킨다는 연구결과도 있다.

생선 뼈에서 추출한 올리고인산펩타이드와 칼슘의 결합력을 단백질 분해효소를 이용하여 증가시킨 후 칼슘 흡수 촉진제로의 이용가능성을 제시하였다[Jung et al., British Journal of Nutrition, Vol 95, p 124-128, 2006].

두유에서 골의 미네랄 밀도(BMD)와 물리적인 뼈의 강도를 증진시킨다는 연구결과가 보고되었다[Omi et al., Journal of Nutritional Science and Vitaminology. Vol 40, p 201-211, 1994.〕 이는 두유에 포함된 펩타이드 때문인 것으로 생각되어지고 있으며, 고분자 및 저분자량의 펩타이드군으로 분리하여 골다공증을 유발한 실험동물에 4군으로 나누어서 투여한 결과, 골무기질밀도(BMD)와 골 강도는 두유, 고분자량의 두유 펩타이드 급여군, 저분자량의 펩타이드 급여군 모두 증가하였다. 또한, 소장 내 칼슘 흡수량은 유의적으로 증가하였다. 이러한 결과를 바탕으로 두유 내 펩타이드는 칼슘의 흡수율을 증진시킨 것으로 나타났으며 이로 인해 BMD와 골 강도를 증진시킨 것으로 사료된다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 젤라틴 효소분해물이 조골세포를 유의적으로 증식시키고 뼈의 길이를 효과적으로 증가시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 조골세포를 유의적으로 증식시키고 뼈의 길이를 효과적으로 증가시켜 성장 촉진 식품원이나 의약, 동물 사료 원료로 사용될 수 있는 젤라틴 효소분해물 함유 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 젤라틴 유래 효소분해물을 함유하는 골 성장 촉진용 조성물을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 젤라틴 유래 효소분해물을 함유하는 골 성장 촉진용 기능성 식품 또는 동물 사료도 포함한다.

본 발명에 의한 젤라틴 효소분해물을 유효성분으로 하는 골 성장 촉진용 조성물은, 경구 투여가 가능한 것으로 기능성 식품, 의약품, 동물의 사료로서 이용 가능하며, 특히 골다공증의 예방, 증상 개선의 효과를 줄 수 있는 소재로서 유용하다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 조골세포를 유의적으로 증식시키고 뼈의 길이를 효과적으로 성장시켜 성장기 어린이를 위한 식품원으로 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 특히 골 강도 증진 및 성장촉진용으로 용이하게 사용 가능한 젤라틴 유래 효소분해물(저분자 펩타이드)을 유효성분으로 포함하는 골 성장 촉진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에는 일상생활에서 쉽고 저렴하게 섭취 가능한 뼈 강화작용이 있고 성장을 촉진시키는 조성물로서 식품, 음료, 의약품, 동물 사료 등에 광범위하게 사용이 가능한 소재를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명의 효소분해물의 원료로 사용되는 젤라틴은 동물의 표피, 뼈, 내장 등에서 사용될 수 있으며, 특히 우피, 돈피, 닭껍질, 닭날개, 닭발 등의 다양한 가축의 껍질에서 얻어질 수 있다. 본 발명에서 이용한 뼈 강화 조성물은 돈피에서 유래한 콜라겐을 젤라틴화시켜 얻은 물질로서 (주)젤텍에서 구입하여 이용하였다.

돈피는 고대부터 이용되어온 식품으로서 주요 구성성분은 수분 61.48%, 조단백질 34.44%, 조지방 2.71%, 조회분이 1.42%를 보이며 조단백질 중 70% 이상이 콜라겐(Type I)으로 이루어져 있다.

콜라겐은 결합조직의 주된 단백질로서 인간 체내의 단백질의 30%를 차지한다. 피부와 뼈에 많이 분포하며 피부 단백질의 70%, 연골의 50%를 차지한다. 이는 인간 체내의 뼈와 피부, 내장기를 둘러싸는 막, 관절연골, 눈의 각막에 존재하고 특히 뼈를 구성하는 칼슘의 접착제로서 기능을 하고 있다.

뼈는 복잡한 조직으로서 주요기능은 물리적인 힘과 파손에 대해 저항의 목적이 있다. 뼈의 강도는 뼈 조직의 양뿐만 아니라 품질에 따라 달라지는데 뼈의 기하학적인 모양과 형태, 해면골의 미세구조, 미네랄, 콜라겐에 의해 특징 지워진다. 뼈 품질의 다른 결정인자들은 서로 밀접하게 연결되어 있는데 특히 미네랄과 콜라겐이 주 역할을 담당한다. 따라서, 물리적인 힘 앞에서 뼈의 강도는 Type I 콜라겐과 미네랄의 상관관계에 의해 달라진다.

인간의 몸에는 뼈를 형성하는 골아세포와 뼈를 파괴하는 파골세포가 있는데 뼈의 재흡수(파골세포) 과정인 오래된 뼈나 불필요한 뼈를 파괴하는 속도가 새로운 뼈를 형성(골아세포, 뼈의 외부 세포 매트릭스를 구성하고 연결하고 있으며, 지속적인 미네랄화도 조정하는 역할함)하는 속도보다 더 빠를 경우 골다공증이 발생할 수 있다. 또한, 성장기 어린이와 청소년의 뼈의 양 끝단에는 연골세포의 집합체인 성장 연골층이 있는데, 이것이 골단이 되면 골아세포가 형성되어 뼈로 변하기 때문에 세로방향을 성장하여 즉 키가 커지게 된다.

젤라틴의 효소분해를 위해 사용되는 단백질 가수분해 효소로는 알칼레이스(alcalase^?), 프로타멕스(protamex^?) 및 플라보르자임(flavorzyme^?) 중에서 선택된 1종 이상 사용할 수 있다.

단백질 가수분해효소와 젤라틴은 1: 50 ~ 500의 중량비로 사용되는 것이 바람직하다. 효소의 반응시간, 온도, pH는 각 이용하는 효소에 따라 다를 수 있 지만 각각 2 ~ 24시간, 30 ~ 60 ℃, 6.0 ~ 9.0의 조건에서 수행하는 것이 좋다. 얻어진 효소분해물을 적절히 탈염한 후 한외여과, 겔 여과 및 각종 크로마토그래피, 멤브레인 필터, 등전점을 이용한 방법 등으로 분리 및 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기의 방법으로 분리한 젤라틴 가수분해물은 젤 여과 및, 멤브레인필터 등에 의한 분자량의 분포가 200 ~ 50,000 Da, 바람직하게는 200 ~ 3,000 Da 부분이 적합하다.

상기의 뼈 강화 조성물에 있어서 젤라틴 단백질 가수분해물은 조골세포 증식 촉진 활성이 젤라틴 단백질 가수분해물 무첨가 처리군인 대조군에 비하여 20.00%이상의 높이는 것이 바람직하다. 또한, 실험동물 랫트의 경골의 길이를 20 um/day 이상 증가시키는 것이 바람직하다. 상기의 조골세포 증식촉진 활성 측정에는 마우스 유래 조골세포인 MC3T3-T1 세포나 인간 유래의 조골 세포성인 U2OS 세포를 사용한 정법으로 수행하였고 뼈 길이의 측정은 Sprague-Dawley계 랫트를 이용하여 평가하였다.

이렇게 하여 얻어진 젤라틴 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 성장기 어린이 성장 촉진제뿐만 아니라 골 질환 예방 및 치료용 물질로서 사용 가능하다. 상기 골 질환으로는 골다공증, 골절, 골밀도 감소증 등이 바람직하다.

본 발명은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 젤라틴 효소분해물을 0.1 내지 50 중량%를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 경구 투여용으로 사용한다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투 여량은 젤라틴 효소분해물의 양을 기준으로 0.1 내지 500 mg/kg이고, 바람직하게는 30 내지 80 mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 60 mg/kg이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 젤라틴 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 골 성장 촉진용 및 골 질환 예방, 개선용 기능성 식품을 포함한다.

본 발명에 따른 기능성 식품은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량음료, 미네랄워터, 알코올음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.

본 발명의 젤라틴 효소분해물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 젤라틴 효소분해물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모 노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01 ~ 0.04 중량부, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 중량부 범위에서 선택하는 것이 바람직하다.

상기 외에 본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일주스, 과일주스음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 젤라틴 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 골 성장 촉진용 및 골 질환 예방 및 개선용 동물 사료첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 젤라틴 효소분해물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피 틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 젤라틴 효소분해물을 함유하는 동물 사료는 보조성분으로 아미노

산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

또한, 젤라틴 효소분해물이 포함되는 동물 사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 본 발명에 따른 젤라틴 효소분해물을 포함한 동물용 사료 배합방법은, 젤라틴 효소분해물을 동물 사료에 건조 중량기준으로 사료 1 ㎏당 약 1 g 내지 100 g의 양으로 혼입한다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

(1) 젤라틴 분획의 가수화

도 1에 제시한 대로 돈피 젤라틴(주, 젤텍)에 5배의 물을 가하여 10분 동안 방치한 후 1시간 동안 200 rpm의 속도로 80 ℃의 조건에서 교반하여 수화시켰다. 그 후 하얀 거품을 걷어내고 노란색의 젤라틴 용액을 얻었다.

(2) 젤라틴 효소분해물의 제조
본 실시예에서 사용되는 알칼레이스(Alcalase; A), 프로타멕스(Protamax; P), 플라보르자임(Flavorzyme; F)은 노보자임(Novozyme)사에서 판매하고 있는 단백질 가수분해 효소의 상품명이다. 상기 알칼레이스(Alcalase)는 바실러스 리케니포르미스(bacillus licheniformis) 균주를 배양시켜 얻은 효소이다. 상기 프로타멕스(Protamax)는 바실러스 리케니포르미스(bacillus licheniformis)와 바실러스 아밀로리퀘타(bacillus amyloliquefa) 균주를 배양시켜 얻은 효소이다. 상기 플라보르자임(Flavorzyme)은 아스퍼질러스 오리재(aspergillus oryzae) 균주를 배양시켜 얻은 효소이다.

상기에서 얻은 젤라틴 용액의 pH를 7.0으로 조절하고 젤라틴 용액 100 g에 1 g의 AP(Alcalase＋Protamex), PF(Protamex＋Flavorzyme), FA(Flavorzyme＋Alcalse), APF(Alcalase＋Protamex＋Flavorzyme[노보자임사 제품])을 첨가하여 50 ℃에서 각각 4, 12, 24시간동안 분해한 후, 염을 제거하고 멤브레인 필터를 이용하여 젤라틴 효소분해물을 50 kDa 이하, 50 kDa ~ 3kDa 사이, 3 kDa 이하 크기의 분해물로 분리하였다. 효소분해물을 분해시간, 처리효소, 분자량 크기로 나누어 36개의 분해물을 준비하고 양성대조군으로서 효소분해 전 젤라틴을 준비하였다. 이들 샘플에 대한 설명은 다음 표 1에 나타내었다.

[표 1]

(3) 젤라틴 효소분해물의 조골세포 증식 촉진 활성의 측정

상기 (2)에서 얻은 젤라틴 가수분해물의 마우스 골아세포인 MG-63 조골세포주 증식 활성은 BrdU를 이용하여 측정하였다.

즉, Roche(독일)사의 Cell Proliferation ELISA, BrdU(colorimetric) Kit를 이용하여 측정하였다. 계대 배양한 MG-63 조골세포주를 1×10⁴개 전후로 96 웰 플레이트에 분주하여 안정화시켰다. 이후 각 37개의 시료를 적량 처치하고 BrdU를 각 웰에 처리하여 12 ~ 16시간동안 배양하였다. 이후 각 세포를 고정액을 사용하여 고정한 다음 anti BrdU 용액을 이용하여 BrdU를 찾고 기질액과 반응시켜 발색시켰다. 충분히 발색하면 25 ㎕의 1M H₂SO₄ 용액을 처치하여 발색을 정지시키고 450 nm의 흡광도에서 측정하였다. 다양한 효소와 분해온도, 분해시간에 따라 분리한 젤라틴 가수 분해물을 10배로 희석하여 측정한 결과, #2, #6, #10, #22, #25, #26, #27, #28, #29, #30에서 유의적으로 높은 조골세포 증식능이 관찰되었고 조골세포 증식 효과는 2번 효소(Protamex＋Flavorzyme)를 처리하여 분해한 샘플이 다른 효소를 처리하여 분해한 샘플에 비해 대체적으로 높은 효과를 나타냈다(도 3). 분자 크기별로 보면, 3 kDa 이하 처리군에서 비교적 높은 조골세포 증식능을 보였는데 분해시간은 4시간 또는 12시간 효소 처리한 군에서 높은 증식능을 보였으며, 24시간 동안 효소 처리한 군의 경우에는 증식이 관찰되지 않았다. 결국, 가장 경제적이고 높은 조골세포 증식 효과를 갖는 분해물의 특성을 종합해 보면, 분자크기는 3 kDa 보다 작으면서 PF 효소를 처리한 샘플이 가장 안정적이고 우수한데, 4시간 또는 12시간 처리한 경우에만 효과가 있었으나, 유의적 차이가 없으므로 보다 처리시간이 짧아 경제적인 4시간 처리 샘플을 가장 조골세포 증식능이 높은 분획으로 선정하였다. 추후 동물을 이용한 성장실험을 진행할 경우, 이 #26번(44.12% 증식 효과) 시료로 하는 것이 가장 바람직한 것으로 판단되어 선택하였다.

(4) 뼈 성장 촉진 효과

골 성장 촉진 활성은 Sprague-Dawley계 랫트를 이용하여 평가하였다. 상기에서 44.12%의 높은 조골세포 증식 효과를 보였던 젤라틴 가수분해물(#26)을 Normal군(대조군)은 증류수를 경구 투여하였고, 샘플 A 투여군은 각각 2개 농도(5 및 1 ml/kg, B.W.), 샘플 B 투여군은 각각 2개 농도(200 및 40 mg/kg, B.W.)로 실험 개시일부터 5일간 매일 1회 투여하였다. 그 후 기본시료(대조군)를 투여한 경우의 골의 신장과 비교하여 촉진효과를 평가하였다. 시험기간 중, 랫트가 음료수와 사료를 자유로이 섭취하도록 하고, 기본사료로서 MF(상품명, 오리엔탈 효모제)를 사용하였다. 흰쥐의 골 성장에 대한 샘플 A, B의 효능을 관찰하기 위하여 골 성장 측정을 위해 Hansson이 처음 시도한 방법을 사용하였다. 이는 정상적인 골 대사를 관찰하기 위한 방법으로 형광인자가 칼슘과 킬레이트 결합을 통해 골에 침착되는 현상을 이용한 것이다. 골 생성이 가장 활발한 성장기에 골 성장판 하부의 골신생부에 가장 많이 침착하여 선을 형성하는데 이를 이용하여 1회 투여한 후 일정기간 후에 형광선과 성장판 사이의 길이를 형광현미경으로 관찰하여 성장한 길이를 측정하였다. 모든 실험군에 똑같이 실험 개시 후 4일째에 칼세인(calcein: 10 mg/kg, i.p.: Sigma, U.S.A.)을 투여하였다.

형광인자 투여 1일 후에 흰쥐를 해부하였다. 흰쥐의 좌우 족경골 (tibia)을 떼어내어 2시간 동안 0.1 M phosphate buffered formalin 고정액에 고정시킨 다음, 탈회시켜 2~3일 동안 방치한 후, 동결에 대한 보호를 위해 30% 수크로스에 담가 4 ℃에서 하룻밤동안 유지하였다. 고정된 골 조직을 동결한 후 sliding microtome(HM440E, Zeiss, Germany)을 사용하여 족경골(tibia) 근위 (proximal part)부의 시상절편(sagital section)을 매 60 ㎛씩 수집하였다. 수집한 절편을 슬라이드 글라스 위에 올리고 건조한 후 형광현미경을 이용하여 골 조직 내 형광인자의 침착으로 형성된 선과 성장판 사이의 길이를 측정하여 골 성장 지표로 사용하였다. 흰쥐의 장골 길이성장을 측정한 결과, Normal군에서 404.0 ± 11.6 ㎛의 길이 성장을 나타내었고, 샘플 A 투여군에서 각각 468.4 ± 27.3 ㎛ 및 450.2 ± 29.1 ㎛의 길이 성장을 나타내었고, 샘플 B(200 및 40 mg/kg) 투여군에서 각각 406.1 ± 21.5 ㎛ 및 385.0 ± 12.9 ㎛의 길이 성장을 나타내었다. 이는 젤라틴 가수분해물(#26번)을 고농도와 저농도로 하여 급여한 랫트의 경골의 길이가 대조군과 비교하여 각각 64.4 ㎛와 46.2 ㎛로 길어졌으며, 효소분해하지 않은 젤라틴단백질을 고농도와 저농도로 급여한 랫트의 경골길이는 대조군과 비교하여 각각 2.1 ㎛, -19 ㎛의 차이를 보여, 젤라틴 가수분해물(3 kDa 이하, 4시간 분해, protamex＋flavorzyme 효소 처리)의 섭취가 골 성장 촉진 활성을 높이는 것으 로 확인되었다(도 4).

(5) 성장판 연골세포 대사 증진 효과

상기와 같이 매 60 ㎛씩 수집한 절편을 슬라이드 글라스 위에 올리고 건조한 후 cresyl violet 염색한 다음 성장판의 높이를 측정하였다. 성장판의 높이를 측정한 결과, Normal군에서 561.4 ± 5.7 ㎛의 성장을 나타내었고, 샘플 A(5 및 1 ml/kg, p.o.) 투여군에서 각각 586.9 ± 15.1 ㎛ 및 626.3 ± 10.7 ㎛의 성장을 나타내었고, 샘플 B(200 및 40 mg/kg) 투여군에서 각각 561.5 ± 5.0 ㎛ 및 596.9 ± 4.5 ㎛의 성장을 나타내어 성장판 연골세포 대사를 촉진을 통한 뼈 길이 증가 효과를 볼 수 있었다(도 5). 성장판은 골 조직을 폭발적으로 생성하는 특수한 조직으로 유소아, 청소년기까지만 가지고 있는 성장에 필수적인 조직이다. 따라서, 성장이 촉진되려면 성장판의 기능이 촉진되어야 하며, 이에 수반되어 성장판의 구조 또한 증식되어 성장판의 크기가 늘어나게 된다. A사진의 위 화살표는 성장판 연골세포가 증식되기를 기다리고 있는 휴지기의 성장판 연골세포가 보이고 아래에는 납작한 핵이 여러 개 뭉쳐져 있는 모양의 증식부의 성장판 연골세포가 보인다. 증식부 아래에는 성장판 연골세포가 2 ~ 5배 정도 커져 있는 모습을 볼 수 있는데 이것이 비대부이다. 아래 화살표는 연골세포 안에 골주(뼈대)가 되어 골화되는 골화부이다. 골화부가 납작하게 되고 연골세포가 세포 자연사 과정을 거쳐 제거되고 나면 뼈만 남게 되어 골 성장이 완료되게 된다. 추가로 추후에 리모델링에는 조골세포와 파골세포가 관여하여 모양을 다듬게 된다.

실시예 2: 독성시험

본 발명의 젤라틴 효소분해물에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다. 젤라틴 효소분해물을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 10 g/㎏을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없었다.

제제예 1: 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

본 발명의 젤라틴 효소분해물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

본 발명의 젤라틴 효소분해물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 환의 제조

본 발명의 젤라틴 효소분해물 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

제제예 2: 기능성 식품의 제조

본 발명의 젤라틴 효소분해물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

<2-1> 밀가루 식품의 제조

본 발명의 젤라틴 효소분해물 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

<2-2> 유제품( dairy products )의 제조

본 발명의 젤라틴 효소분해물 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-3> 음료의 제조

본 발명의 젤라틴 효소분해물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제제예 3: 동물 사료의 제조

젤라틴 효소분해물............................240 g

부형제 (말분)................................760 g

상기의 성분을 가지고 대한약전 산제제법에 준하여 제조하였다.

상기의 혼합물의 조성비는 비교적 사료 조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 사료조성물 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 대한약전 산제제법에 준하여 제조에 사용할 수 있다.

도 1은 골 성장 촉진용 젤라틴 효소분해물의 분리과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 3 kDa 이하, 4시간 분해, PF 효소 처리한 젤라틴 분해물의 사진이다.

도 3은 젤라틴 효소분해물의 조골세포 증식 효과를 나타낸 것이다.

도 4는 젤라틴 효소분해물(#26, 3 kDa 이하, 4시간 분해, PF 처리)의 농도별 처리가 동물의 경골성장에 미치는 효과(um/day)를 나타낸 것이다.

도 5는 젤라틴 효소분해물(#26, 3 kDa 이하, 4시간 분해, PF 처리)의 성장판에 미치는 효과(A: 정상군의 성장판, B: #26 시료 투여군의 성장판)를 나타낸 것이다.

Claims

젤라틴 유래 효소분해물을 유효성분으로 함유하며,

상기 효소분해물은 분자량이 200 ~ 3,000 Da이고,

상기 효소분해물은 바실러스 리케니포르미스(bacillus licheniformis)와 바실러스 아밀로리퀘타(bacillus amyloliquefa) 균주를 배양시켜 얻은 프로타멕스와 아스퍼질러스 오리재(aspergillus oryzae) 균주를 배양시켜 얻은 플라보르자임으로 이루어진 단백질 가수분해효소를 동시에 사용한 분해물인 것을 특징으로 하는 골 성장 촉진용 식품 조성물.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 효소분해물은

1) 젤라틴을 가수화하여 젤라틴 용액을 얻는 단계

2) 젤라틴 용액을 pH 6 ~ 9 조건 하에서 프로타멕스 및 플라보르자임인 단백질 가수분해 효소를 첨가 후 30 ~ 60℃에서 4 ~ 12시간 효소 분해하는 단계 및

3) 상기 분해물을 탈염하여 분자량별로 분해물을 제조하는 단계를 포함하여 이루어진 효소분해물을 제조하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 식품 조성물.
삭제
제 4항에 있어서, 상기 단백질 가수분해 효소와 젤라틴이 1 : 50 ~ 500의 중량비로 사용되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
청구항 1의 식품 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 골 성장 촉진용 기능성 식품.
삭제
젤라틴 유래 효소분해물을 유효성분으로 함유하며,

상기 효소분해물은 분자량이 200 ~ 3,000Da이고,

상기 효소분해물은 바실러스 리케니포르미스(bacillus licheniformis)와 바실러스 아밀로리퀘타(bacillus amyloliquefa) 균주를 배양시켜 얻은 프로타멕스와 아스퍼질러스 오리재(aspergillus oryzae) 균주를 배양시켜 얻은 플라보르자임으로 이루어진 단백질 가수분해효소를 동시에 사용한 분해물인 것을 특징으로 하는 골 성장 촉진용 약학 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 효소분해물은

1) 젤라틴을 가수화하여 젤라틴 용액을 얻는 단계

2) 젤라틴 용액을 pH 6 ~ 9 조건 하에서 프로타멕스 및 플라보르자임인 단백질 가수분해 효소를 첨가 후 30 ~ 60 ℃에서 4 ~ 12시간 효소 분해하는 단계 및

3) 상기 분해물을 탈염하여 분자량별로 분해물을 제조하는 단계를 포함하여 이루어진 효소분해물을 제조하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 골 성장 촉진용 약학 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 단백질 가수분해 효소와 젤라틴이 1 : 50 ~ 500의 중량비로 사용되는 것을 특징으로 하는 골 성장 촉진용 약학 조성물.
젤라틴 유래 효소분해물을 유효성분으로 함유하며,

상기 효소분해물은 분자량이 200 ~ 3,000Da이고,

상기 효소분해물은 바실러스 리케니포르미스(bacillus licheniformis)와 바실러스 아밀로리퀘타(bacillus amyloliquefa) 균주를 배양시켜 얻은 프로타멕스와 아스퍼질러스 오리재(aspergillus oryzae) 균주를 배양시켜 얻은 플라보르자임으로 이루어진 단백질 가수분해효소를 동시에 사용한 분해물인 것을 특징으로 하는 골 성장 촉진용 사료용 조성물.
제 12항에 있어서, 상기 효소분해물은

1) 젤라틴을 가수화하여 젤라틴 용액을 얻는 단계

2) 젤라틴 용액을 pH 6 ~ 9 조건 하에서 프로타멕스 및 플라보르자임인 단백질 가수분해 효소를 첨가 후30 ~ 60 ℃에서 4 ~ 12시간 효소 분해하는 단계 및

3) 상기 분해물을 탈염하여 분자량별로 분해물을 제조하는 단계를 포함하여 이루어진 효소분해물을 제조하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 골 성장 촉진용 사료용 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 단백질 가수분해 효소와 젤라틴이 1 : 50 ~ 500의 중량비로 사용되는 것을 특징으로 하는 골 성장 촉진용 사료용 조성물.
청구항 12의 사료용 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 골 성장 촉진용 동물 사료.