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KR101318320B1 - 백신용 담체 단백질 - Google Patents

백신용 담체 단백질 Download PDF

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KR101318320B1
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박스터 헬쓰케어 에스에이
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Abstract

본 발명은 다당류-기반 백신을 포함하는 개량된 항원-기반 백신용의 개량된 담체 단백질을 제공한다. 본 발명에서는 파상풍 독소 단편 C를 유리하게 사용한다.

Description

백신용 담체 단백질{CARRIER PROTEIN FOR VACCINES}
본 발명은 다당류(polysaccharide)-기반 백신을 포함하는 개량된 항원-기반 백신용의 개량된 담체 단백질에 관한 것이다.
담체 단백질에 대한 다당류의 접합(conjugation)은 다당류의 면역화를 보다 효과적으로 행할 수 있다. 파상풍 유독소(Tetanus toxoid)는 이러한 능력으로 수십년 동안 담체로서 사용되어 왔으며, 이것의 안정성 측면은 최소한 과거의 사용 배경을 근거로 확립되어왔다.
파상풍 독소용의 구조적 유전자는 클론화되고 서열화되어 왔다. Fairweather et al., J. Bacteriol. 165:21-27(1986); Fairweather et al., Nuci. Acid Res. 14: 7809-7812(1986). 상기의 연구들은 1315 아미노산을 포함하는 150 kD 단백질로서 파상풍 독소의 구조를 확인하였다. 파상풍 천연 독소의 결합부분을 구성하는 단편 C는 독소의 파파인 분할에 의해 생성되는 52 kD 폴리펩티드이며, C-말단에서 451 아미노산에 대응된다. 도 1을 참조하기 바란다.
파상풍 유독소는 2~3개의 일반 T-세포 에피토프(epitope)를 포함하는 것으로 알려져왔다. Demotz et al., J. Immunol 142:394-402(1989). 상기 특징은 인간에게 있어서 파상풍 유독소를 높은 효율로 만드는 것이다. 유독소의 단편 C는 비독성인 것으로 보여져 왔다. 또한, 상기 단편은 프라임드 도너(primed donor)에 의해 인지된 적어도 하나의 일반 면역성 T 세포 에피토프를 함유한다. Valmori et al., J. Immunol 149:717-21(1992);Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immumol. 19:2237(1989).
최근 다양한 세균감염을 타깃으로 하는 협막 다당류(capsular polysaccharide,CP) 접합 백신이 개발 및 임상 평가 중에 있다. 단일주입으로 조합된 복합 CP 혈청형(serotype)의 함유물이 최근 연구중에 있다. 그러나, 단일 다가 주입에 CP 접합백신의 조합은 상이한 성분 간에 경쟁을 유발할 수 있으며, 임의의 개별적 접합의 면역성에 악영향을 미칠 수 있다. Fattom et al., Vaccine 17:126-33(1999).
파상풍 유독소는 다량류 백신에서 증가된 용도가 발견되고 있다. 예방접종한 인구가 전체적으로 내성 및/또는 과민증을 포함한 위험과 함께, 파상풍에 대한 노출 발생의 염려가 있다. 예를들어, 쥐에 담체의 면역량 주입에 이어 선택적으로 합텐-담체 접합으로 면역하는 것은 항합텐(antihapten) 항체 반응을 억제한다. 상기 담체-유도 에피토프성 억제는 번갈아 선택적으로 항합텐 반응을 억제할 수 있는 담체-특이성 T 세포의 유도에 관련될 수 있다. 에피토프성 억제는 합텐과 담체 에피토프 사이에서 담체 에피토프 및 항원성 경쟁에 특이적 클론의 팽창을 통해 유도될 수 있다. Schutze et al. J. Immunol. 37: 2635-40(1989). 인간에게 있어서, 담체 단백질에 대한 우선적 면역성은 합성 접합 백신에 대한 혈청반응을 조절하는 것으로 논증되어왔다. Di John et al., Lancet 2(8677):1415-8(1989). Barrington et al.(Infect & Immun.61:432-8,1993)은 백신 경쟁과 함께 예비면역(preimmunization)에 의한 인플루엔자균(Haemophilus influenzae) b형 접합백신에 항체 반응의 에피토프성 억제가 발견되었음을 보여주었다. 최근에, Burrage et al.(Infect & Immun. 70:4946-54,2002)는 파상풍 담체 단백질과 함께 예비면역에 의한 수막염균 C 접합 백신에 대해 항체 반응의 에피토프성 억제를 보여주었다. 쥐에게 있어서, 폐렴구균 및 수막염균 다당류-파상풍 접합의 항체 반응에 대한 에피토프성 억제는 파상풍 유독소와 운반 프라이밍(priming)의 다량 복용 후 관찰되었다(Peeters et al. Infect & Immun 59:3504-10,1991). 이들 잠재적인 악영향으로 인해서 파상풍 유독소의 경우, 과거에는 더 이상 투여될 수 없었으며, 따라서, 개량된 담체가 요구되고 있다.
현재의 환자들과 관련된 다수의 악영향을 피하기 위해, 본 발명은 파상풍 유독소의 단편 C를 기반으로 하는 담체를 제공한다.
본 발명의 하나의 양태에 따라서, 파상풍 유독소의 단편 C를 사용하는 면역성 접합백신의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 파상풍 유독소 단편 C 단백질 부분에 공유결합된 하나 이상의 타깃 병원체로부터 하나 이상의 다당류 부분을 포함하는 접합 항원이 제공된다. 여기에서 사용된 바와 같이, "타깃 병원체"는 세균성 또는 균성 병원체와 같은 포유류 또는 조류의 면역시스템에 의해 인지될 수 있는 다당류 에피토프를 포함하는 외인성 병원체(exogenous pathogen)를 언급할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 파상풍 유독소 단편 C 단백질 부분에 공유결합된 하나 이상의 타깃 병원체로부터 하나 이상의 다당류 부분을 포함하는 접합 항원을 포함하는 백신이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 파상풍 유독소 단편 C 단백질 부분에 공유결합된 하나 이상의 타깃 병원체로부터 하나 이상의 다당류 부분을 포함하는 접합 항원을 포함한 백신의 유효량을 포유류 또는 조류에 접종하는 단계를 포함하는, 포유류 또는 조류에서의 타깃 병원체에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 닭, 칠면조, 에뮤(emus), 타조, 및 기타 상업적으로 중요한 새들과 같은 조류에게 실행될 수 있다. 상기 방법은 설치류, 말, 소, 기타 통상의 중요 포유류 군, 개과, 고양이과, 기타 반려 동물, 및 인간과 같은 포유류에 대해 바람직하게 실행된다. 바람직하게, 상기 방법은 인간에게 실행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 파상풍 유독소 단편 C 단백질 부분에 공유결합된 하나 이상의 타깃 병원체로부터 하나 이상의 다당류 부분을 포함하는 접합 백신을 포함한 백신의 유효량을 포유류 또는 조류에 접종하는 단계를 포함하는, 타깃 병원체에 의해 포유류 또는 조류의 다음의 감염을 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 닭, 칠면조, 에뮤(emus), 타조, 및 기타 상업적으로 중요한 새들과 같은 조류에게 실행될 수 있다. 상기 방법은 설치류, 말, 소, 기타 통상의 중요 포유류 군, 개과, 고양이과, 기타 반려 동물, 및 인간과 같은 포유류에 대해 바람직하게 실행된다. 바람직하게, 상기 방법은 인간에게 실행될 수 있다.
도 1은 파상풍 독소의 개략적인 묘사도이다.
도 2는 천연 및 재조합 TTc의 프로필(profile) 및 분자량을 나타내는 도면이다.
도 3은 파상풍 유독소의 단편 C, 재조합 단편 C, 및 파상풍 유독소와 GCMP 접합의 비교를 나타낸다.
도 4는 파상풍 유독소 및 파상풍 유독소의 재조합 단편 C와 수막염균 접합의 비교를 나타낸다.
도 5는 파상풍 유독소 또는 파상풍 유독소의 재조합 단편 C와 GBSP 접합에 의해 유도된 형특이적(type specific) IgG를 나타낸다.
도 6은 신생 쥐 모델에서 GBSP 접합의 효능을 나타낸다.
여기에서 처음 기재한 바와 같이, 종종 "TTc"로 언급되는 파상풍 독소의 단편 C는 세균성 또는 균성 감염에 대한 보호용의 협막 다당류 백신과 같은 다당류용 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 항원에 접합될 경우, 단편 C는 면역반응을 유도하는 항원의 능력이 단편 C에 대한 접합을 통하여 향상되는 것을 의미하는 항원의 면역성을 증가시킬 수 있다. 상기의 향상은 종종 담체 효과로 언급되어왔으며, 본질적으로 T-비의존성 항원으로부터 T-의존성 항원으로 다당류가 변환되는 것이다. 다당류 TTc 접합으로 면역된 동물에게 있어서의 뚜렷한 파상풍 독소항체의 중화 및 결과로 생긴 뚜렷한 담체 능력의 보존과 함께 천연 파상풍 유독소의 인지 능력의 저하로 인해 파상풍 유독소용 TTc 치환체를 제조하기에 이르렀다.
여기에 나타낸 데이타는 TTc 및 재조합 TTc(rTTc)가 다당류용 담체로서 사용할 수 있으며, 다당류-특이성 IgG 항체에 의하여 파상풍 유독소의 것과 동일한 면역반응을 유도할 수 있다. 도 2를 참조하기 바란다. 상기 항체들은 세균을 사멸시킬 수 있는 능력을 측정한 바, 높은 기능활성을 갖는다.
단편 C(TTc)는 하기 도 1에 나타낸 바와 같이, 아미노산 위치 865-1315의 카르복실-말단 부분에 관련된다. 따라서, 본 발명의 문맥에서, 단편 C는 전체 파상풍 유독소 분자의 잔여부의 적어도 일부로부터의 분리를 의미하며, 파파인 또는 기타 프로테아제와 유독소의 소화에 의해서, 또는 단편의 재조합 발현을 통하여 수행될 수 있다. 단편 C의 재조합 발현은 미국특허 제 5,443,966호에 개시되어 있다. 따라서, 단편 C에 접합된 항원을 포함하는 백신은 비-단편 C(즉, 도 1의 B 단편)의 적어도 일부가 부족할 것이다.
물론, 분자의 담체 능력에 악영향을 주지 않고 변형체를 얻기 위해서, TTc 서열에 대한 다양한 첨가, 삭제 및 치환이 실행될 수 있다. 예를들어, 보존성(conservative) 및 반(semi) 보존성 아미노산 치환이 시작될 수 있다. 예시적인 보존성 아미노산 치환은 특별히 한정되지 않지만, 알라닌이 세인(seine); 아르기닌이 리신;아스파리긴(asparigine)이 글루타민 또는 히스티딘; 아스파르테이트(aspartate)가 글루타메이트; 시스테인이 세인; 글루타민이 아스파리긴; 글루타메이트가 아스파르테이트; 글리신이 프롤린(proline); 히스티딘이 아스파리긴 또는 글루타민; 이소류신(isoleucine)이 류신 또는 발린(valine); 류신이 발린 또는 이소류신; 리신이 아르기닌(arginine), 글루타민, 또는 글루타메이트; 메티오닌(methionine)이 류신 또는 이소류신; 페닐알라닌이 티로신, 류신 또는 메티오닌; 세린이 트레오닌(threonine); 트레오닌이 세린; 트립토판이 티로신; 티로신이 트립토판 또는 페닐알라닌; 발린이 이소류신 또는 류신;으로 변형하는 것을 포함한다. 단백질 공학분야에서 당업자들에게 명백한 바와 같이, 여기에서 언급한 보존성 및 반 보존성 변형은 TTc의 인지된 항원/면역성 부분의 바깥부분에서 이루어지는 것이 바람직하다. 다양한 목적(가령, 단백질 정제의 용이함을 위해 폴리펩티드 "태그(tag)"의 부가)을 위해 변형에 대한 적절한 부위는 C-말단 및 N-말단 부분을 포함한다.
변형은 게놈의 또는 cDNA 클로닝 방법을 이용하는 재조합 기술에 의해 만들어질 수 있다. 부위-특이적 및 영역-직접 돌연변이 생성 기술이 적용될 수 있다. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY vol.1,ch.8(Ausubel et al. eds., J. Wiley & Sons 1989 & Supp. 1990-93); PROTEIN ENGINEERING(Oxender & Fox eds., A. Liss, Inc. 1987)를 참조하기 바란다. 또한, 링커스캐닝(linkerscanning) 및 PCR-매개 기술이 돌연변이 생성에 이용될 수 있다. PCR TECHNOLOGY(Erlich ed., Stockton Press 1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY vols.1 & 2, supra를 참조하기 바란다. 상기의 어떤 기술을 이용하는 단백질 서열화, 구조 및 모델링 접근법은 PROTEIN ENGINEERING, loc. cit. 및 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY vol.1 & 2 supra에 개시되어 있다. 필요하다면, 조합 화학, 바이오패닝(biopanning) 및/또는 페이지(phage) 발현 기술을 이용함으로써, 단편 C에 대한 다른 변화를 실행할 수 있다.
단편 C의 펩티드 의태(mimetic)는 Saragovi et al., Science 253:792-95(1991) 및 기타 논문에서 약술된 접근법으로 제조할 수 있다. 의태는 단백질 2차 구조의 원소를 모방한 펩티드-함유 분자이다. 예를 들면, Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds.,(Chapman and Hall, New York,1993)를 참조하기 바란다. 펩티드 의태의 용도 이면에 근원이 되는 원리는, 간략하게 단백질의 펩티드 골격이 항체 및 항원의 것과 같이 분자 상호작용을 촉진하는 방식으로 아미노산 측쇄에 배향하도록 존재하는 것이다. 본 발명에 따른 펩티드 의태 담체를 숙주에 투여할 경우, 면역반응을 도와준다.
단편 C는 현재의 실행에서 방법론에 의해 세균성 또는 균성 협막 다당류와 같은 다당류에 접합될 수 있다. 예를들어, 다당류는 약간의 기본 조건하에서의 처리를 통해 디아실레이트화(deacylate)될 수 있으며, 시아노보로하이드라이드(Cyanoborohydride) 음이온과 같은 환원제로 환원성 아미노화(reductive amination)를 통해 단편 C에 접합될 수 있다. EP 0658118B1를 참조하기 바란다. 기타 결합 접근법은 WO 0010599A2, 미국공개특허출원 제2001/0014332A1에 개시된 것을 실시예에서와 같이 당업자라면 이용 가능하다. 다른 접합 접근법으로서 바이 유전자 스페이서(bigenic spacer)를 사용하는 방법이 Marburg et al.,(J.Am Chem,Soc 108,5282, 1986)에 기재되어 있고, 미국특허 4,695,624; 미국특허 4,830,852; 미국특허 4,882,317;및 미국특허 5,623,057호에 재시되어 있다.
백신의 타입 및 특성을 규정하는 다당류의 소스는 세균 및 균류를 포함한 광범위한 소스로부터 얻을 수 있다. 세균의 예로는: 그룹 A, B, C, Y, W135 및 X를 포함하는 수막염균(Neisseria meningitidis); 그룹 A, B, 및 C를 포함하는 연쇄구균(streptococcus); 타입 1, 2, 3, 4, 6A, 6B, 9, 14, 18F, 19F, 및 23을 포함하는 폐렴구균(pneumococcus); 타입 5 및 8을 포함하는 황색 포도당구균(Staphylococcus aureus); 타입 b를 포함하는 인플루엔자균; 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis); 캠피로박터 균속(Campylobacter spp.); 장침입성 대장균(Enteroinvasive Escherichia coli) 분리물; 살모넬라균(Salmonella typhii); 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae); 이질간균 (Shigellaflexneri); 부루세라속균(brucella spp.); 야토병원균(Francicella tularensis); 및 페스트균(Yersinia pestis);을 포함한다. 특히, 수막염균, 인플루엔자균, 폐렴구균 및 연쇄구균으로부터의 항원을 TTc에 접합하는데 사용될 수 있다. 예시적인 균류는 캔디다 알비칸(Candida albicans), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)를 포함한다. 표준 탄수화물화학을 사용하여 천연 CPs의 하나 이상의 특징을 갖는 합성 다당류가 백신으로서 적용될 수 있다.
변형체을 포함하여 단편 C는 본 파상풍 유독소와 동일한 방식으로 담체로서 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 접합용 제형은 UNITED STATES PHARMACOPEIA AND NATIONAL FORMULARY(USP 24-NF19); REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES; HANDBOOK ON PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS(2d ed., Wade and Weller eds., 1994)에 기재된 바와 같이, 수용성 용액, 염, 보존제, 완충제 등의 비-독성 첨가제를 포함한다. 비-수용성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 및 에틸올레이트(ethyoleate)와 같은 주입가능한 유기 에스테르가 있다. 수용성 용매로는 물, 알콜/수용성 용액, 식염수, 염화나트륨, 링거 포도당 등과 같은 비경구적 부형약을 포함한다. 정맥내 부형약은 유동액 및 영양보충제를 포함한다. 보존제는 항균제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스를 포함한다. 결합 조성물의 다양한 성분들의 pH 및 추출 농도는 당업자에 의해 조절된다. GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS(9th ed.)를 참조하기 바란다. 또한, 하나 이상의 보조제는 백신 조성물에 첨가될 수 있다. 기타 조절제가 백신업계의 당업자들에게 알려져 있지만, 백반(수산화 알루미늄)은, 이러한 용도로서 일반적으로 수용가능한 조절제의 예이다.
다당류 결합 백신의 부분으로서 단편 C는, 통상적으로 1회 투여분(유아 및 성인) 또는 일차 면역용 다수회 분리 투여분(유아 처방), 및 경시적 이차 예방주사(booster shot)로서 투여될 것이다. 특이적 투여수준 및 약학적 유효량은 임의의 개별 환자의 나이, 체중 및 성별에 따라 달라질 수 있다. 비록 대부분의 백신은 사실이지만, 표준화 값을 확립하여, 그룹 모집단 또는 소집단 전체에 걸쳐서 유효한 일반적인 복용량을 개발, 확립할 수 있다. 일반적으로, 5~100㎍, 바람직하게는 10~50㎍을 함유하는 백신은 새끼 포유류에게 있어서, 병원성 그램 음성 또는 그램 양성 유기체의 협막 다당류에 대한 항체의 유효수준을 유도하는데 적절하며, 적정 등을 통하여 더 규정할 수 있다. 따라서, 소량의 소정 투여량은 1회의 주입으로 소정 접합체의 동일량보다 더욱 우수할 것으로 기대된다.
본 발명을 설명하는 하기의 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: rTTc 접합체의 제조
수막염균 C(GCMP), Y(GYMP) 및 W(GWMP) 다당류의 제조:
수막염균 C, Y 및 W 다당류는 포도당 및 이스트 추출물을 함유하는 발효 배양액으로부터 정제하였다.
디(De)-O-아세틸화(dOA) GCMP는 미국특허 제5,425,946호에 기재한 바와 같이 제조하였다.
디-O-아세틸화 GCMP는 하기와 같이 제조하였다:
다당류는 300kDa MWCO 박막을 갖는 UF로 포집한다:
무세포(cell-free) 정밀여과된 발효 침투액의 약 13L를 Biomax 300K Pellicon 막(0.5㎡)을 사용하여 약 1리터로 UF에 의해 농축한다. 농축된 농축액은 1M NaCl에 대하여 12회, 증류에 대하여 10회 다이어필터링(diafiltering)한다. 약 0.2L로 더 농축한 다음 수집하였다.
다당류의 염기성 가수분해:
300K 보존액(ca 5㎎ PS/mL)을 2N NaOH의 최종농도로 조절하였고, 16-18시간동안 80℃로 세팅된 오븐에 방치하였다. 반응혼합물을 50℃ 미만으로 냉각시킨 후, 증류수 10L로 희석하였다. 30kDa MWCO Pellicon(펠리콘) 막으로 농축한 후, 농축된 농축액은 1M NaCl에 대하여 12회, 증류수에 대하여 10회 다이어필터링한다. 약 0.2L로 더 농축한 다음 수집하였다.
dOA GYMP 의 산성 가수분해:
농축용액을 테프론 반응용기에 옮기고, 아세트산 나트륨(NaOAc)을 0.1N의 최종농도로 부가하였다. 반응혼합물을 6N HCl를 사용하여 pH5로 조절하고, 70℃로 세팅된 수조에 방치하였다. 다당류가 수퍼로즈(Superose) 12(Pharmacia) 컬럼을 사용한 SEC-MALLS로 측정하여 대략 10-20kDa의 타깃 MW에 도달할 때까지 65rpm으로 교반하였다.
단편 dOA 다당류의 재( Re )-N- 아세틸화 :
용액의 pH를 6N HCl 용액으로 8로 조절한 다음, 무수초산을 0.8M 무수초산의 최종농도로 상온에서 적가하였다. 반응혼합물 pH를 7~9로 유지하는데 SN NaOH를 사용하였다. 반응종결 후, 반응혼합물의 pH는 13으로 상승되었고, 혼합물을 추가적으로 1.5시간동안 교반하였다. 다음에, 반응 pH는 6N HCl 용액을 이용하여 pH 8로 조절하였다. 반응혼합물을 1M NaCl의 4L에 붓고 Biomax 100K Pellicon 막(0.5㎡)을 사용하여 약 1리터로 농축하고 투과액을 수집하였다. 100K 최종 투과액은 Biomax 5K Pellicon 막(0.5㎡)을 사용하여 약 1리터로 UF에 의해 농축하였다. 농축된 농축액은 증류수로 10배 다이아필터링한 다음, 약 0.2L로 농축하고 수집하였다. 다음에, 단편 다당류는 소듐 메타페리오데이트(Sodium Metaperiodate)로 활성화하고 시알산 잔여물에서 알데히드기를 생성하였다.
다음에, 산화된 다당류는 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)를 사용하여 환원 아민화반응으로 파상풍 유독소(Serum Statens Institute, Copenhagen,Denmark) 또는 파상풍 독소 C 단편(rTTc)의 재조합 타입(E coli)(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)로 접합하였다. Roche의 파상풍 독소 C 단편 및 파파인(List Biological Laboratories, Inc. Campbell,CA) 소화 후 파상풍 독소(TTc)로부터 분리된 C 단편의 재조합 타입의 생화학적 비교는 양 단백질이 동일한 것으로 나타났다(동일 AA 조성, MALDI-TOFF로 측정한 동일 MW, 및 HPLC에 의한 동일한 용출액). 하기 도 2를 참조하기 바란다.
상기 접합체의 물리화학적 특성의 몇가지를 하기 표 1에 나타내었다.
접합체 [PS]
(㎍/mL)		 [단백질]
(㎍/mL)		 [PS]/
[단백질]		 수율 PS
%		 수율 단백질
%
GCMP-rTTc 347.1 441.0 0.787 27.8 88.2
GCMP-TT 294.2 621.2 0.474 11.3 71.4
GYMP-RTTc 166.4 379.0 0.439 13.3 75.8
GYMP-TT 167 656.3 0.254 25 98
GWMP-RTTc 261.1 391.2 0.667 20.9 78.2
GWMP-TT 69.5 200.9 0.346 8.3 60
임상적으로 가장 중요한 그룹 B 연쇄구균(GBS) 혈청형의 세가지(Ia, Ⅲ 및 Ⅴ) 다당류는 파상풍 유독소 및 rTTc에 환원 아민화반응으로 결합되었다. 미국특허 제 5,993,825호를 참조하기 바란다. 하기 표 2는 상기 특성 중 몇개를 나타낸다.
접합체 [PS]
(㎍/mL)		 [단백질]
(㎍/mL)		 [PS]/
[단백질]		 수율 PS
%		 수율 단백질
%
GBS Ia-RTTc 307 279 1.1 25 59
GBS Ia-TT 200 240 0.8 23 60
GBS Ⅲ-RTTc 273 360 0.8 24 72
GBS Ⅲ-TT 264 460 0.6 14 46
GBS Ⅴ-RTTc 341 370 0.9 26 84
GBS Ⅴ-TT 218 305 0.7 19 70
환원 아민화반응 이외에, 파상풍 C 단편에 상기 다당류를 결합하는 다른 방법은 WO0010599 A2 특허출원에 개시되어 있다. 이 방법은 부분적으로 또는 전체적으로 디(de)-아세틸화 다당류의 재-N-아크릴올레트화(acryloylation)에 이어 pH9-10에서 담체 단백질로 활성화된 다당류의 직접결합을 포함한다. 화학반응은 다당류의 불포화 N-아크릴오일기에 있어서의 단백질(리시닐 잔기의 u-NH2)에 대한 일차 아미노기의 미첼 부가반응(michael addition)이다.
실시예 2: rTTc 접합체의 임상 평가
수막염균 접합의 효능-면역화 스케줄: 4-6주의 스위스 웹스터 암컷 쥐에 TT(파상풍 유독소) 또는 rTTc에 접합된 다당류 2㎍을 0, 28 및 42일에 피하주사로 면역시켰다. 동물들은 0, 28, 및 52일에 출혈하였다. 다당류-특이성 IgG는 코팅 항원으로 각각 C, Y, 또는 W 다당류 인간혈청 알부민 접합체를 사용하여 ELISA로 측정하였고, 파상풍 접합 백신에 대해서도 유사한 방식으로 제조하였다. 접합에 대한 상승된 파상풍 독소 항체는 코팅 항원으로 파상풍 유독소로 ELISA로 측정하였다. 항혈청(antisera)의 항체-보체 매개 사멸은 보체의 소스로서 어린 토끼 혈청을 사용한 혈청살균 분석(SBA)으로 정하였다.
GCMP의 TTc, rTTc 및 TT 접합체와의 비교를 위해 상기 접합에 대한 효능(다당류-특이성 IgG 및 혈청 세균력)을 하기 도 3에 나타내고, 도 4에는 TT 또는 rTTc에 결합된 GYMP, GWMP 및 GCMP의 접합체에 대한 면역반응의 상응관계을 나타낸다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 수막염균 rTTc 접합은 그들의 대응하는 TT 구조와 비교하여, 효능면에서 큰 차이를 보이지 않는다. 또한, 항-파상풍 반응 및 항-파상풍 C 단편(TTc)은 ELISA 시리즈로 측정하였다. GCMP-TT 접합에 대한 항혈청 내의 중요한 항-파상풍 반응은 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 TTc 및 rTTc GCMP 접합으로 상승된 혈청에서 기본적으로 파괴되었다.


ELISA(IU/mL)
이중 항원 간접 TT 간접 rTTc
0일 28일 38일 52일 38일 52일 38일 52일
GCMP-TT 〈0.002 4.98 72.1 54.5 170.3 102.6 7.2 10.4
GCMP-rTTc 〈0.002 〈0.02 〈0.002 0.006 0.12 0.20 13.6 19.7
GCMP-TTc 〈0.002 〈0.02 〈0.002 0.003 0.001 0.05 0.55 2.3
항 rTTc Mab 24.0 20.1 20.1
세가지 분석법이 사용되었다: (a) 파상풍의 이중 항원 ELISA, (b) 간접 파상풍 IgG ELISA,(Rristiansen et al., APMIS 105:843-53(1997), (c) 간접 재조합 파상풍 독소 단편 C IgG ELISA. 분석은 하룻밤동안 4~8℃에서 하였다. 분석 a 및 b 플레이트는 탄산염 완충용액 pH9.6에서 1:10000으로 희석된 lot 57 SSI 파상풍 유독소로 코팅하였으며, 하룻밤동안 4~8℃에서 배양하였다. 분석 c용 플레이트는 재구성 재조합 파상풍 독소 단편 C(rTTc)-lot 85161832, Roche으로 탄산염 완충용액 pH 9.6에서 1㎍/㎖로 희석된 0.1M NaHCO3에서 수행되었으며, 상온에서 2시간동안 배양하였다. 각 코팅의 하나의 플레이트는 시료 및 표준물질의 동일한 예비-희석을 적용하였다. 배양은 하룻밤동안 4~8℃에서 수행하였다.
검출을 위해, Biotin-TT/HRP-스트렙타비딘 시스템이 분석 (a)에 사용되었으며, HRP-염소 항-쥐 IgG(Fc) 1:5000이 분석 (b) 및 (c)에 사용되었다. 1㎎/mL의 농도로 색원체 O-페닐렌 디아민(OPD)을 기질로 사용하였으며, 반응은 2M H25O4로 중단하였다. OD(광학밀도)는 492nm로 기록하였다. 데이타는 기준선 방법(reference line method)을 사용하여 분석하였다.
항-rTTc MAb는 이중 항원 ELISA로부터의 결과를 바탕으로 IgG ELISA 데이타를 표준화하는데 사용하였다. rTTc에 대한 MAb는 코팅한 천연 파상풍 유독소 및 단편 C와 마찬가지로 동일한 정도의 수용성 유독소를 인지한다. 또한, rTTc에 대한 상승된 항체는 ELISA의 세가지 타입으로 측정할 수 있음을 나타낸다.
표 3에 나타낸 데이타는 상당히 큰 항-파상풍 IgG 반응이 GCMP-TT 접합에 대한 항혈청내에서 측정되었음을 나타내지만, TTc 및 rTTc GCMP에 대하여 상승된 혈청에서는 실제로 상기 반응이 결여되었다.
담체 단백질로서 TT 또는 rTTc를 사용하는 GBS 접합은 보호적 면역반응을 유도하는 것에 대한 그들의 능력을 평가하였다. 여기에 기재한 바와 같이, 제조한 1가 타입 Ia, Ⅲ, 및 Ⅴ 접합의 효능은 Madoff et al. Infec. & Immun. 60:4989-94(1992)의 신생 쥐 모델로 평가하였다. 동물들(CD1 암컷 쥐)은 조합 4가 백신 혼합물을 접종하였거나, 0 및 21일에 접합된 타입의 다당류 각 1 p.g.를 각 동물들에게 투여하였다. 백신은 수산화알루미늄(Superfos, Denmark)에 흡수되었다. 쥐들은 21일에 수정되었다. GBS 타입 Ia(090), GBS 타입 Ⅲ(M781) 또는 GBS 타입 Ⅴ(CJ111)으로 신생 쥐들이 출산된 다음, 48시간 후에 면역성을 시험하였다. 각 개별적 접합에 의해 유도된 GBS 형-특이적 다당류 IgG는 하기 도 5에 나타내었다. 데이타는 타입 Ia 및 Ⅲ-rTTc 접합이 그들의 대응하는 TT 부분보다 더 우수한 다당류-특이적 IgG 역가가 아니라면 유사하게 유도되지만, 타입 Ⅴ-rTTc 접합은 그들의 대응하는 TT보다 상당히 높은 타입의 Ⅴ 특이적 IgG를 유도하는 것을 나타낸다.
효능은 항체 대리수준과 상관있는 신생 쥐의 경쟁으로부터 얻어진 것이다. 즉, 타입 Ⅴ 경쟁에 대하여 Ⅴ-rTTc 접합(ca 85% 효능)이 Ⅴ-TT(ca 65%) 보다 상당히 우수한 보호성을 갖는 반면, 유사한 보호성은 Ia에 대하여 타입 Ia 및 Ⅲ GBS 유기체로 거의 100%에 가까운 효능, 대응하는 rTTc 또는 TT 접합의 하나로 Ⅲ에 대하여 90~95% 경쟁을 제공한다. 도 6을 참조하기 바란다. 쥐 모델에 있어서, 타입 Ⅴ 경쟁이 다당류 접합으로 수반되는 면역화를 극복하는 것이 가장 어렵고, 타입 Ⅴ 다당류의 담체 단백질로서 파상풍 단편 C가 전체 파상풍 분자보다 명백히 더 우수한 담체 단백질임을 나타내는 점을 주목해야 한다.
Lf 단위로 측정한 잔여 TT 활성에서와 마찬가지로 GBS TT 및 rTTc 접합으로 생성된 항-파상풍 반응을 표 4에 나타내었다.
백신 평균 IU/mI %〉= 0.01
IU/mI		 평균 LF/ml 예상 %
PBS ND nd 〈0.007 NA
GBSPIa-TT 40.0 100 0.261 6.5
GBSPIarTTc 0.0034 10 〈0.007 NA
GBSPⅢ_TT 19.0 100 0.094 2.4
GBSPⅢrTTc 〈0.002 0 〈0.007 NA
GBSPⅤ-TT 27.8 100 0.059 1.5
GBSPⅤ_rTTc 0.0124 30 〈0.007 NA
상기 연구는 단백질 농도가 10㎍/mL이고, 예상 농도가 TT에 대해서는 4Lf/mL 및 rTTc에 대해서는 10Lf/mL로 세팅한다는 가정을 바탕으로 한다.
상기 표 4의 데이터는 rTTc 접합에 의해 유도된 혈청 내의 항-파상풍 IgG 반응은 대응하는 TT 접합에 의해 유도된 반응과 비교할 때, 극적으로 감소하는 것을 나타낸다. 또한, GBS 다당류에 대한 C 단편의 접합 후 유지된 파상풍 독소 B-세포 에피토프의 수가 대응하는 TT 접합체에 보존된 동일한 B-세포 에피토프와 비교할 때, 0으로 감소한다. 따라서, 하기 표 3 및 4에 나타낸 데이타는 담체 단백질로서 파상풍을 함유하는 다당류 접합 백신에 대한 항체 반응의 잠재적 담체-유도 에프토프성 억제를 극복한다는 본 발명의 장점을 뒷받침하며 그에 대한 충분한 설명을 제공한다.
이상으로 구체적인 실시형태를 나타내는 상세한 설명, 특정 실시예 및 결과를 예시적인 구현예로 제공하였으나, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아님을 이해하여야 한다. 여기에 포함된 논의, 개시 및 데이타로부터 당업자라면 본 발명의 범위내에서 다양한 변화 및 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 따라서 이들 역시 본 발명의 일부로서 고려해야 한다.

Claims (11)

  1. 유효한 항-파상풍 반응의 발생없이 환자에게서 협막 다당류 항원의 면역원성을 증진시키기 위한 의약의 제조방법으로서, 상기 방법은
    파상풍 독소 단편 C에 상기 협막 다당류 항원을 접합시켜 접합 백신을 얻는 단계 및
    상기 접합 백신을 상기 의약의 제조에 사용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 항원은 세균(bacterium)으로부터의 협막 다당류인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 세균은 수막염균 그룹 A, B, C, Y, W135 및 X; 연쇄구균 그룹 A, B, 및 C; 폐렴구균 타입 1, 2, 3, 4, 6A, 6B, 9, 14, 18F, 19F, 및 23; 황색 포도당구균 타입 5 및 8; 및 인플루엔자균(Haemophilus influenzae) 타입 b로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항원은 균류(fungus)로부터의 협막 다당류인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 균류는 캔디다 알비칸(Candida albicans) 및 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 담체-유도 에피토프성 억제없이 환자에게서 협막 다당류 항원에 대한 항체 반응을 이끌어내기 위한 의약의 제조방법으로서, 상기 방법은
    파상풍 독소 단편 C를 포함하는 담체에 상기 협막 다당류 항원을 접합시켜 접합 백신을 얻는 단계 및
    상기 접합 백신을 상기 의약의 제조에 사용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항원은 세균으로부터의 협막 다당류인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 세균은 수막염균 그룹 A, B, C, Y, W135 및 X; 연쇄구균 그룹 A, B, 및 C; 폐렴구균 타입 1, 2, 3, 4, 6A, 6B, 9, 14, 18F, 19F, 및 23; 황색 포도당구균 타입 5 및 8; 및 인플루엔자균 타입 b로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 세균은 결핵균; 캠피로박터 균속; 대장균; 살모넬라균; 비브리오 콜레라; 이질간균; 부루세라속균; 야토병원균; 및 페스트균으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 항원은 균류로부터의 협막 다당류인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 균류는 캔디다 알비칸 및 크립토코커스 네오포르만스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

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