KR101308898B1 - 신규 항-α-시누클레인 단일클론항체 및 이를 이용한 ＥＬＩＳＡ 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 1) α-시누클레인의 120번째 내지 140번째 서열(서열번호 1) 또는 2) α-시누클레인의 61번째 내지 95번째 서열(서열번호 2) 및 120번째 내지 140번째 서열을 동시에 특이적으로 결합하는 항-α-시누클레인 단일클론항체; 및 이를 이용한 α-시누클레인 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항-α-시누클레인 단일클론항체 및 ELISA 방법을 이용할 경우, 다양한 생물학적 샘플에서 다양한 형태의 α-시누클레인을 고감도로 검출하고 정량적으로 분석할 수 있다.

Description

신규 항-α-시누클레인 단일클론항체 및 이를 이용한 ＥＬＩＳＡ 시스템{A NOVEL ANTI-α-CYNUCLEIN MONOCLONAL ANTIBADY AND ELISA SYSTEM USING THE SAME}

본 발명은 1) α-시누클레인의 120번째 내지 140번째 서열(서열번호 1) 또는 2) α-시누클레인의 61번째 내지 95번째 서열(서열번호 2) 및 120번째 내지 140번째 서열을 동시에 특이적으로 결합하는 항-α-시누클레인 단일클론항체; 및 이를 이용한 ELISA 시스템에 관한 것이다.

전시냅스 말단(pre-synaptic terminal)에 풍부하게 존재하는 작은 신경 단백질인 α-시누클레인의 비정상적인 응집은 다양한 퇴행성뇌질환(예를 들어, 파킨슨병, 루이소체 치매, 다계통 위축 등)의 발병원인 중 하나이다(Cookson MR. The biochemistry of Parkinson's disease. Annu Rev Biochem, 2005; 74: 29-52). 파킨슨병과 관련된 전형적인 병리학적 현상은 섬유성 α-시누클레인 응집체의 존재로 인해 특징지어지는 루이축삭(Lewy neurites) 및 루이소체(Lewy bodies)로 알려진 세포내 단백질 축적을 포함한다. 분자유전학 연구는 α-시누클레인에 대한 유전자 SNCA에서 몇 몇 드문 가족성 파킨슨병과 돌연변이의 관계를 규명하였다(Chartier-Harlin MC, Kachergus J, Roumier C, Mouroux V, Douay X, Lincoln S, Levecque C, Larvor L, Andrieux J, Hulihan M, Waucquier N, Defebvre L, Amouyel P, Farrer M, Destee A. Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet, 2004; 364: 1167-9; Ibanez P, Bonnet AM, Debarges B, Lohmann E, Tison F, Pollak P, Agid Y, Durr A, Brice A. Causal relation between alpha-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet, 2004; 364: 1169-71; Kruger R, Kuhn W, Muller T, Woitalla D, Graeber M, Kosel S, Przuntek H, Epplen JT, Schols L, Riess O. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease [letter]. Nat Genet, 1998; 18: 106-8; Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, Ide SE, Dehejia A, Dutra A, Pike B, Root H, Rubenstein J, Boyer R, Stenroos ES, Chandrasekharappa S, Athanassiadou A, Papapetropoulos T, Johnson WG, Lazzarini AM, Duvoisin RC, Di Iorio G, Golbe LI, Nussbaum RL. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science, 1997; 276: 2045-7; Singleton AB, Farrer M, Johnson J, Singleton A, Hague S, Kachergus J, Hulihan M, Peuralinna T, Dutra A, Nussbaum R, Lincoln S, Crawley A, Hanson M, Maraganore D, Adler C, Cookson MR, Muenter M, Baptista M, Miller D, Blancato J, Hardy J, Gwinn-Hardy K. alpha-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science, 2003; 302: 841). 더욱 중요한 것은 최근 GWAS(genome-wide association study)에 의해 상기 유전자가 산발적인 파킨슨병에 대한 감수성 위치(susceptibility locus)에 존재한다는 것이 밝혀졌다는 것이다.

α-시누클레인은 세포기질 단백질이지만, 소량은 소포(vesicle)에 존재하며, 엑소시토시스에 의해 분비될 수 있다(Lee H-J, Patel S, Lee S-J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-cynuclein and its aggregates. J Neurosci, 2005; 25: 6016-24). α-시누클레인은 인체 혈액 및 뇌척수액에서 일관되게 검출된다(Borghi R, MarcheseR, Negro A, Marinelli L, Forloni G, Zaccheo D, Abbruzzese G, Tabaton M. Full length alpha-synuclein is present in cerebrospinal fluid from Parkinson's disease and normal subjects. Neurosci Lett, 2000; 287: 65-7; El-Agnaf OM, Salem SA, Paleologou KE, Cooper LJ, Fullwood NJ, Gibson MJ, Curran MD, Court JA, Mann DM, Ikeda S, Cookson MR, Hardy J, Allsop D. Alpha-synuclein implicated in Parkinson's disease is present in extracellular biological fluids, including human plasma. Faseb J, 2003; 17: 1945-7). 세포외 α-시누클레인은 신경세포사 및 신경염증을 유발할 수 있고, 뇌에서 응집체 퍼짐(aggregate spreading)의 매개체가 될 수 있기 때문에, 파킨슨병 및 관련질병에 있어 중요한 단백질이 될 수 있다(Desplats P, Lee HJ, Bae EJ, Patrick C, Rockenstein E, Crews L, Spencer B, Masliah E, Lee SJ. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009; 106: 13010-5; Lee H-J, Suk JE, Patrick C, Bae EJ, Cho JH, Rho S, Hwang D, Masliah E, Lee S-J. Direct transfer of alpha-synuclein from neuron to astroglia causes inflammatory responses in synucleinopathies. J Biol Chem, 2010a; 285: 9262-72).

혈액 및 뇌척수액 α-시누클레인의 레벨이 실질적 조직사이의(parenchymal interstitial) α-시누클레인 레벨을 나타내는 것인지는 규명해야 할 것으로 남아있다. 그럼에도 불구하고, 파킨슨병의 발병에 있어 최근 밝혀진 α-시누클레인의 역할은 민감한 정량적 분석방법의 개발에 대한 요구를 더욱 증가시켰다.

이에 본 발명자는 뇌척수액 또는 혈장과 같은 조직샘플 및 체액에서 다양한 형태의 α-시누클레인을 정량화할 수 있는 분석법을 완성하기 위하여, 신규 항체를 개발하고, 종특이성 및 멀티메릭 스테이트 특이성(multimeric state specificity)을 가진 ELISA 시스템을 개발하였다. 본 발명자는 본 발명에 따른 ELISA 시스템을 통하여 단량체 및 다량체 α-시누클레인 뿐만 아니라, 인간 및 마우스 α-시누클레인을 검출할 수 있었다.

본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 1) α-시누클레인의 120번째 내지 140번째 서열; 또는 2) α-시누클레인의 61번째 내지 95번째 서열 및 120번째 내지 140번째 서열을 동시에 특이적으로 결합하는 신규 항-α-시누클레인 단일클론항체를 개발하고, TSA(Tyramide signal amplification) 방법을 적용하여 ELISA 시스템의 감도(sensitivity)가 개선된다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국, 본 발명은 1) α-시누클레인의 120번째 내지 140번째 서열; 또는 2) α-시누클레인의 61번째 내지 95번째 서열 및 120번째 내지 140번째 서열을 동시에 특이적으로 결합하는 항-α-시누클레인 단일클론항체; 및 이를 이용한 고감도 ELISA 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 α-시누클레인의 1) α-시누클레인의 120번째 내지 140번째 서열; 또는 2) α-시누클레인의 61번째 내지 95번째 서열 및 120번째 내지 140번째 서열을 동시에 특이적으로 결합하는 항-α-시누클레인 단일클론항체; 및 이를 이용한 고감도 ELISA 시스템을 제공한다.

본 발명은 α-시누클레인의 1) α-시누클레인의 120번째 내지 140번째 서열; 또는 2) α-시누클레인의 61번째 내지 95번째 서열 및 120번째 내지 140번째 서열을 동시에 특이적으로 결합하는 항-α-시누클레인 단일클론항체; 및 이를 이용한 고감도 ELISA 시스템을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 항체 및 분석방법은 다양한 생물학적 샘플에서 고감도를 나타내는, 다양한 형태의 α-시누클레인 검출 및 정량적 분석에 있어서 유용한 도구로 사용될 수 있다.

도 1은 신규 α-시누클레인 모노클로날 항체의 특성을 규명한 것으로서, (A)는 웨스턴 블럿을 수행하여 α-시누클레인에 대한 신규 α-시누클레인 모노클로날 항체의 결합을 테스트한 것이며, (B)는 다른 시누클레인에 대한 신규 α-시누클레인 모노클로날 항체의 결합력을 테스트한 것으로, myc-태깅된 α-, β-, 및 γ-시누클레인을 발현하는 COS-7 세포 추출물을 사용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과이고, (C)는 재조합 마우스 및 인간 α-시누클레인에 대한 신규 α-시누클레인 모노클로날 항체의 결합을 테스트한 것이며, (D)는 신규 α-시누클레인 모노클로날 항체를 사용하여, 인간 또는 마우스 α-시누클레인을 발현하는 COS-7 세포의 면역형광 염색을 수행한 결과이다(스케일 바: 20 μm).
도 2는 ELISA를 통해 인간 α-시누클레인을 검출한 결과로서, (A)는 캡쳐 항체의 농도를 달리 처리하여 스탠다드 커브를 구한 것으로, 원-사이트 결합 모델의 비선형 회귀(non-linear regression) 피팅을 도시한 것이며, (B)는 세포성 단백질 추출물이 혼합된 재조합 단백질을 사용하여 ELISA를 수행한 결과이고, (C)는 ELISA를 수행하여 쥐와 인간의 α-시누클레인을 테스트한 결과 인간 α-시누클레인에만 특이적으로 검출됨을 확인한 결과이며, (D)는 ELISA를 수행하여 α-, 및 β-시누클레인을 테스트한 결과 α-시누클레인에만 특이적으로 결합함을 확인한 결과이다.
도 3은 항체 62(클론 62, 캡쳐) 및 항체 274(클론 274, 리포터)를 이용한 샌드위치 ELISA를 수행하여 마우스 뇌 추출물(A)및 컨디션드 배지(B)로부터 인간 α-시누클레인을 검출한 결과로서, (A)는 야생형(C57BL6), α-시누클레인 넉아웃 (αSKO), 및 α-시누클레인 A53T tg 마우스 (A53T)로부터 마우스 뇌 추출물을 수득하여 ELISA를 수행한 결과이며, (B)는 α-시누클레인을 과발현하는 분화된 SH-SY5Y 세포로부터 컨디션드 배지를 추출한 후, 다양하게 희석하여 ELISA를 수행한 결과이다.
도 4는 ELISA를 수행하여 마우스 및 인간 α-시누클레인을 검출한 결과로서, (A)는 마우스 및 인간 α-시누클레인을 이용하여 스탠다드 커브를 구한 결과이고, (B)는 야생형 (C57BL6), α-시누클레인 넉아웃 (αSKO), 및 α-시누클레인 A53T tg 마우스 (A53T)로부터 마우스 뇌 추출물을 수득하여 ELISA를 수행한 결과이다.
도 5는 ELISA를 수행하여 멀티머 α-시누클레인을 검출한 결과로서, (A)는 α-시누클레인 단량체 (M) 및 피브릴 (F)의 웨스턴 블럿 및 전자 현미경 결과를 나타낸 것이며, (B)는 단량체 및 피브릴 형태의 재조합 α-시누클레인을 이용하여 ELISA를 수행한 결과이고, (C)는 야생형 및 A53T tg 마우스 추출물을 이용하여 α-시누클레인 응집체를 검출한 결과이며, (D)는 ELISA에 사용한 마우스 뇌 추출물을 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과이다.
도 6은 TSA에 의해 ELISA의 감도가 증가된 결과를 나타낸 것으로서, (A)는 TSA 방법을 사용하여 α-시누클레인 검출 감도가 증가된 결과를 나타낸 것이며, (B)는 (A)의 인셋을 확대한 것이다.
도 7은 ELISA에 사용된 TSA 방법을 도식화한 것이다.

본 발명은 1) α-시누클레인의 120번째 내지 140번째 서열; 또는 2) α-시누클레인의 61번째 내지 95번째 서열 및 120번째 내지 140번째 서열을 동시에 특이적으로 결합하는 항-α-시누클레인 단일클론항체를 제공한다.

본 발명은 또한, 1) 캡쳐 항체를 플레이트에 첨가하여 배양한 다음, PBST(phosphate-buffered saline)로 1회 이상 세척하는 단계; 2) 블러킹 버퍼를 첨가하여 반응시킨 다음, PBST(phosphate-buffered saline)로 1회 이상 세척하는 단계; 3) 계열희석(serial dilutions)시킨 재조합 α-시누클레인 단량체 또는 피브릴(fibril)을 첨가하여 반응시킨 다음, PBST(phosphate-buffered saline)로 1회 이상 세척하는 단계; 4) 비오틴화된 리포터 항체를 첨가하여 반응시킨 다음, PBST(phosphate-buffered saline)로 1회 이상 세척하는 단계; 5) 아비딘-컨쥬게이티드 페록시다아제를 첨가하여 반응시키는 단계; 6) 바이오티닐화 티라마이드 용액을 첨가하여 반응시킨 다음, PBST(phosphate-buffered saline)로 1회 이상 세척하는 단계; 7) 아비딘-컨쥬게이티드 페록시다아제를 첨가하여 반응시키는 단계; 8) 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 용액을 첨가하여 반응시키는 단계; 9) 상기 반응을 중단시킨 다음, 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 고감도 ELISA 시스템을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험 재료

재조합 인간 α-시누클레인 및 재조합 마우스 α-시누클레인은 ATGen (Sungnam, South Korea)으로부터 구입하였다. α-시누클레인 단일클론항체(Syn-1)은 BD Biosciences(San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다. 단일클론항체 이소타이핑 키트(monoclonal antibody isotyping kit)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 고정화 단백질 A/G(Immobilized protein A/G), 항체 결합 버퍼(antibody binding buffer) 및 용출 버퍼(elution buffer)는 Pierce (Rockford, IL, USA)로부터 구입하였다.

항체 기탁

다음의 하이브리도마 세포주를 2010년 12월 30일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다;

항체명칭 기탁번호

클론 62 KCTC 11838BP

클론 274 KCTC 11839BP

실시예 1: 항-α- 시누클레인 모노클로날 항체 제작 및 생산

재조합 인간 α-시누클레인과 완전프로인트항원보강제(Freund's complete adjuvant, Sigma)를 암컷 Balb/C 마우스의 복강내 투여하였다. 상기 1차 투여 후 30일이 지난 다음 동량의 추가투여량(booster dose)를 항원보강제 없이 마우스에 투여하였다. 상기의 방법으로 면역화시킨 마우스로부터 수득한 비장세포를 골수종세포에 융합시키고(MacDonald G, Primrose S, Biggins K, Bowman JM, Berczi I, Friesen AD, Sehon AH. Production and characterization of human-human and human-mouse hybridomas secreting Rh(D)-specific monoclonal antibodies. Scand J Immunol, 1987; 25: 477-83), 하이브리도마 세포를 수득하여 ELISA를 수행함으로써 α-시누클레인 면역반응성을 측정하였다.

하이브리도마 세포를 10% FBS(fetal bovine serum, Hyclone Laboratories, Inc.) 및 100 μM 하이포크산틴(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 포함된 DMEM 배지(clone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA)으로 배양하고, D-PBS로 세척한 다음, 상기 기재한 방법으로 7일 동안 FIA(Freund's incomplete adjuvant, Sigma)와 함께 Balb/C 마우스에 주입하였다. 주입 후 7일이 지난 다음, 마우스에서 복수(Ascites fluid)를 수득하여, 동량의 IgG 결합 버퍼(Pierce)를 섞어준 다음, 단백질 A/G 컬럼에 적용하였다. 용출된 IgG를 HBSS(Hank's buffered salt solution)로 투석한 다음, 동결건조시켜 -80℃에 보관하였다.

실시예 2: 세포 배양 및 단백질 발현

형질전환된 아메리칸 원숭이 신장 세포주(COS-7(ATCC, Manassas, VA, USA))를 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지에서 배양한 다음, 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 pcDNA3.1 mychis 벡터에 존재하는 α-, β-, 및 γ-시누클레인을 세포에 트랜스펙션시켰다.

실시예 3: 세포 추출물 및 뇌 추출물 준비

세포추출액은 아래와 같이 준비하였다(Lee H-J, Shin SY, Choi C, Lee YH, Lee S-J. Formation and removal of alpha-synuclein aggregates in cells exposed to mitochondrial inhibitors. J Biol Chem, 2002; 277: 5411-7).

세포를 PBS로 세척한 다음, 추출버퍼(PBS/1% Triton X-100/단백질 분해효소 저해제 칵테일)를 첨가하였다. 얼음 상에서 10분간 둔 다음, 세포 추출액을 16,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여, 상등액을 수득하였다.

뇌 추출물은 아래와 같이 준비하였다.

단백질 분해효소 저해제 칵테일을 포함한 PBS에 분리한 뇌를 넣고 초음파 분해(sonication)하여, α-시누클레인 넉아웃[B6;129X1-Snca<tm1Rosl>/J], A53T tg[B6.Cg-Tg(Thy1-SNCA*A53T)1Sud/J], 및 C57BL6 마우스 뇌 균질현탁액을 수득하였다. 그런 다음, 16,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 상등액과 펠렛을 수득하였다. 펠렛은 10분 동안 끓이고, PBS에서 초음파 분해한 다음, 16,000 ×g에서 원심분리하여 조직파편(debris)를 제거하였다.

실시예 4: 웨스턴 블럿

선행논문에 기재된 바와 같이 웨스턴 블럿을 수행하였다(Lee H-J, Shin SY, Choi C, Lee YH, Lee S-J. Formation and removal of alpha-synuclein aggregates in cells exposed to mitochondrial inhibitors. J Biol Chem, 2002; 277: 5411-7). 후지필름(FUJIFILM) 발광 이미지 분석기 LAS-3000 및 멀티 게이지(v3.0) 소프트웨어(FUJIFILM, Tokyo, Japan)를 이용하여 화학발광을 측정하였다.

실시예 5: 닷 블럿 분석( Dot Blot Analysis )

재조합 α-시누클레인 단백질(1 μg)을 나이트로셀룰로오스 페이퍼로 블러팅한 후 건조시키고, 멤브레인을 세척버퍼로 적신 다음 실시예 4에서 수행한 방법과 같이 웨스턴 블럿을 수행하였다.

실시예 6: 면역형광 염색법

세포 염색은 선행논문(Lee H-J, Shin SY, Choi C, Lee YH, Lee S-J. Formation and removal of alpha-synuclein aggregates in cells exposed to mitochondrial inhibitors. J Biol Chem, 2002; 277: 5411-7)에 기재된 방법으로 수행하였다.

폴리-L-라이신으로 코팅된 커버슬립 상에 배양한 세포를 PBS로 녹인 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 세포에 0.1% Triton X-100을 처리한 후, 블러킹 용액(5% BSA/ 3% 염소혈청 in PBS)에 둔 다음, 블러킹 용액에 희석시킨 1차 항체를 처리하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음, 형광 염색약 Cy2-로다민 레드 X-접합 2차 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)를 처리하고, PBS로 세척하였다. TOPRO-3 염색약(Invitrogen)으로 핵을 염색시키고, 커버슬립을 안티페이드 시약(Invitrogen)이 든 슬라이드 상에 고정시켰다. 올림푸스 FV1000 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(Center Valley, PA, USA)을 이용하여 세포를 관찰하였다.

실시예 7: 항체 비오틴화

리포터 항체 0.5 mg과 1 mg/ml EZ-링크 설포-NHS-SS-바이오틴 40 ㎕(Pierce)를 혼합한 다음, 실온에서 30분 동안 로테이션시켰다. 결합하지 않은 바이오틴은 PBS 버퍼로 투석시켜 제거하였다.

실시예 8: ELISA

96-웰 ELISA 플레이트(Maxisorp; Nunc, Rochester, NY, USA)에 50 mM 카르보네이트 버퍼(pH 9.6)에 녹인 1 μg/ml 캡쳐 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 두어 코팅하였다. 플레이트를 PBST(phosphate-buffered saline with 0.05% Tween 20)로 5번 세척하였다. 슈퍼블럭 T20 PBS 블러킹 버퍼(Pierce)를 첨가하여 강하지 않게 흔들어주면서 실온에서 1시간 동안 두었다. 블러킹하는 동안, 계열희석(serial dilutions)시킨 재조합 α-시누클레인 단량체 또는 피브릴(fibril)을 사용하여 스탠다드를 준비하였다.

PBST를 사용하여 다시 5번 세척하고, 샘플 및 스탠다드를 강하지 않게 흔들어주면서 실온에서 2.5시간 동안 두었다. PBST를 사용하여 다시 5번 세척하고, 블러킹 버퍼에 넣은 바이오틴화된 리포터 항체 1 μg/ml을 첨가하여, 실온에서 1.5시간 두었다.

플레이트를 PBST로 5번 세척한 다음, 블러킹 버퍼에 1:1500으로 희석시킨 아비딘-컨쥬게이티드 페록시다아제(ExtrAvidin; Sigma)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 두었다.

플레이트를 PBST로 5번 세척한 다음, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 용액(Sigma) 100 ㎕를 각 웰에 첨가한 후 흔들어주면서 15분 동안 두었다. 2N H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시키고, 스펙트라맥스 190 분광광도계(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

시그널을 증폭시키기 위해 아비딘-페록시다아제 반응 후 바이오티닐화 티라마이드 용액(희석액에 1:100으로 희석; Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)을 첨가하여 실온에서 15분간 반응시켰다. PBST로 5번 세척하고, 아비딘-페록시다아제 반응을 반복한 다음, 상기 기재한 바와 같이 그 다음 반응을 수행하였다.

실시예 9: 신규 α- 시누클레인 단일클론항체의 특성 규명

본 발명자들은 인간 α-시누클레인에 대한 신규 마우스 모노클로날항체를 개발하고, 상기 항체의 특이성을 테스트하였다. 이뮤노블럿 분석은 항체 62, 169, 171 및 274가 전신(full length) 재조합 α-시누클레인에 결합할 수 있음을 규명하였다(도 1A.) 상기 4가지 항체들은 α-시누클레인에 특이적으로 결합하지만, β- 또는 γ-시누클레인에는 특이적으로 결합하지 않았다(도 1B). 항체 62는 마우스 α-시누클레인 및 인간 α-시누클레인 모두에 결합했지만, 항체 169, 171 및 274는 인간 α-시누클레인에만 특이적으로 결합하였다(도 1C). 이는 인간 또는 마우스 α-시누클레인을 과발현시키는 COS-7 세포의 면역형광 세포 염색(immunofluorescence cell staining)을 통해 최종 확인되었다(도 1D).

상기 항체의 에피토프를 규명하기 위하여, α-시누클레인 단백질의 재조합 단편 1-60, 1-95, 61-140 및 96-140 및 α-시누클레인 결실 구조체 1-100 및 1-120을 발현시키는 COS-7 세포의 세포 추출물을 사용하여 닷 블럿 분석(dot blot analysis)을 수행하였다(표 1).

에피토프 맵핑

이소타입

1-60

1-95

1-100

1-120

61-140

96-140

1-140

IgG1

IgG2a

IgG2b

IgG3

IgM

IgA

62

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169

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171

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274

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Syn1

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그 결과, 항체 62 및 274는 재조합 단편 96-140에 특이적으로 결합할 수 있지만, 결실 구조체 1-120에는 특이적으로 결합하지 못함을 확인하였다. 이는 상기 항체의 에피토프가 α-시누클레인의 먼 C 말단(far C-terminal end)인 120-140 위치에 존재함을 의미하는 것이다.

항체 169 및 171은 재조합 단편 61-140에 특이적으로 결합하지만, 재조합 단편 96-140에 결합하지 못하였다. 이는 α-시누클레인의 61-96 부위가 항체결합에 필수적이라는 것을 의미하는 것이다.

그러나, C-말단 결실 구조체 1-100 및 1-120은 상기 2개의 항체에 결합하지 못하였다. 이는 120-140 및 61-95 부위가 항체 인식에 필수적임을 의미하는 것이다. 그리고, 항체 이소타입 분석을 통해 항체 62, 274, 169 및 171이 IgG2a 임을 확인하였다(표 1).

실시예 10: 신규 항체를 이용한 인간 α- 시누클레인 ELISA 감도 개선

신규 α-시누클레인 항체를 이용하여 샌드위치 ELISA를 수행하였다.

본 발명자는 캡쳐 항체로 항체 62를 사용하고, 리포터 항체로 비오틴화-항체 274를 사용하여 재조한 인간 α-시누클레인 단백질을 계열희석시킨 것을 테스트하였다(도 2A). 표준 곡선의 모양을 0.95~0.999의 r²를 가지는 원-사이트 결합 모델의 비선형 회귀(non-linear regression)에 피팅시키고, 도 2A에 도시된 바와 같은 결과를 얻었다. 본 발명의 항체를 이용한 ELISA는 5 ng/ml 이하의 낮은 분석 검출 한도를 가질 만큼, 기존 기술 대비 우수한 감도를 나타내었다(van Geel WJ, Abdo WF, Melis R, Williams S, Bloem BR, Verbeek MM. A more efficient enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of alpha-synuclein in cerebrospinal fluid. J Neurosci Methods, 2008; 168: 182-5). 캡쳐 항체의 농도(0.2 μg/ml 및 1 μg/ml)를 증가시킴에 따라 감도 역시 증가하였고(도 2A), 캡쳐 항체 1 μg/ml은 이후의 분석방법을 위해 사용되었다.

다른 단백질의 존재하에서도 본 발명에 따른 방법을 사용하여 α-시누클레인을 검출할 수 있는지 파악하기 위하여, 본 발명자는 최소량의 내재성 α-시누클레인을 포함하는 랫 프라이머리 성상세포(primary astrocyte) 세포 추출물 0.1 mg/ml 과 재조합 인간 α-시누클레인을 혼합하였다. 그 결과, 세포 추출물의 첨가는 α-시누클레인의 특이적 검출에 영향을 주지 않았다(도 2B). 항체 274는 인간 α-시누클레인에만 결합하여, 본 발명에 따른 ELISA는 인간 α-시누클레인만을 검출하였고, 마우스 α-시누클레인을 검출하지 못했다(도 2C).

본 발명에 따른 분석법은 α-시누클레인에 특이적이며, β-시뉴클레인을 인식하지 못하였다(도 2D).

실시예 11: 마우스 뇌 추출물 및 컨디션드 배지( conditioned medium )에서 인간 α- 시누클레인 검출

본 발명에 따른 ELISA를 이용하여 뇌 추출물에서 α-시누클레인을 검출할 수 있는지 규명하기 위하여, 야생형(C57BL6), α-시누클레인 넉아웃(αSKO), 및 α-시누클레인 A53T tg 마우스 (A53T)로부터 마우스 뇌 추출물을 수득하여 상기 분석법을 수행하였다(도 3A). 상기 추출물 중 오직 A53T tg 마우스만이 인간 α-시누클레인을 발현하였다. 상기 분석결과를 통해, α-시누클레인이 A53T tg 마우스의 뇌 추출물에서만 검출되고, C57BL6 및 αSKO 뇌 추출물에서는 검출되지 않음을 확인할 수 있었다.

소량의 α-시누클레인은 신경세포에서 분비된다(Lee H-J, Patel S, Lee S-J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J Neurosci, 2005; 25: 6016-24); 세포외 α-시누클레인은 발병기전에 있어 중요한 역할을 할 것이다(Lee S-J, Lee H-J, Masliah E. Multiple non-cell autonomous actions of alpha-synuclein in neurodegenerative diseases: Is there a direct link Cell Cycle, 2010b; 9: 2696-7).

본 발명에 따른 ELISA 방법을 이용하여 배양한 세포의 컨디션드 배지에서 분비된 α-시누클레인이 존재유무를 검출하기 위하여, α-시누클레인을 과분비하는 분화된 SH-SY5Y 세포로부터 배지를 수거하였다(도 3B). 라이소좀 억제제 바필로마이신 A1(BafA1)을 상기 세포에 처리할 경우 α-시누클레인의 분비가 증가하는 것은 공지된 사실이다(Jang A, Lee H-J, Suk JE, Jung JW,Kim KP, Lee S-J. Non-classical exocytosis of alpha-synuclein is sensitive to folding states and promoted under stress conditions. J Neurochem, 2010; 113: 1263-74). 본 발명의 분석방법을 통해 컨디션드 배지 속에 α-시누클레인이 존재함을 확인하였다; 고농도의 α-시누클레인은 BafA1을 처리한 컨디션드 배지에서도 검출되었다.

실시예 12: ELISA 를 이용한 마우스 및 인간 α- 시누클레인 검출

본 발명자는 Syn-1 항체(BD Bioscience) 및 항체 62를 사용하여 인간 및 마우스 α-시누클레인을 검출할 수 있는 ELISA로 개발하였다. 두 항체는 모두 인간 및 마우스 α-시누클레인 단백질을 인식하였다(도 1C). 캡쳐 항체로 Syn-1 항체를 사용하고, 리포터 항체로 비오틴화-항체 62를 사용하여, 본 발명자는 유사한 감도를 가지는 마우스 및 인간 α-시누클레인을 검출하였다(도 4A).

CC57BL6(내재성 마우스 α-시누클레인), αSKO, 및 A53T tg 마우스(내재성 마우스 α-시누클레인 및 인간 α-시누클레인 발현)에서 추출한 마우스 뇌 추출물을 본 발명의 ELISA로 테스트한 결과, 내재성 α-시누클레인은 C57BL6 야생형 마우스에서만 검출되고, αSKO 마우스 추출물에서는 검출되지 않았다(도 4B). A53T tg 마우스 추출물은 고농도의 α-시누클레인을 포함하고 있는데, 이는 내재성 마우스 α-시누클레인뿐만 아니라, 인간 α-시누클레인을 발현하기 때문이다. 상기 실험결과는 웨스턴 블럿으로 동일함을 다시 확인하였다.

실시예 13: ELISA 를 이용한 α- 시누클레인 응집체( aggregate ) 검출

ELISA를 이용하여 α-시누클레인을 검출하기 위하여, 본 발명자는 캡쳐 및 리포터 항체로 항체 62를 사용하여 El-Agnaf의 논문에 기재된 방법을 수행하였다(El-Agnaf OM, Salem SA, Paleologou KE, Curran MD, Gibson MJ, Court JA, Schlossmacher MG, Allsop D. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J, 2006; 20: 419-25). 캡쳐 및 리포터 항체로 동일한 항체를 사용함으로써, 에피토프가 이미 캡쳐 항체에 결합하고 있기 때문에, 단량체 단백질은 리포터 항체에 결합할 수 없다. 그러나, 다량체 단백질은 다수의 에피토프가 뭉쳐진 형태로 존재하고 있기 때문에 결합할 수 있다. 이 분석방법은 재조합 인간 α-시누클레인 단량체 및 피브릴을 사용하여 수행되었다. 피브릴 준비물은 SDS-저항성 고분자량(high molecular weight) 형태를 포함하고 있었고, 전자현미경 검사법을 통해 피브릴의 전형적인 아밀로이드 형태를 확인할 수 있었다(도 5A). ELISA는 응집된 형태의 α-시누클레인은 검출하였지만, 단량체는 검출하지 못하였다(도 5B).

C57BL6, αSKO, 및 A53T tg 마우스의 뇌 추출물을 분석한 결과는 α-시누클레인의 올리고머 형태는 오직 A53T tg 마우스 뇌 추출물에서만 검출되었음을 보여주다(도 5C). 추출물을 웨스턴 블럿 분석한 결과는 A53T tg 마우스에 고분자량 α-시누클레인이 존재하나, 다른 추출물에는 존재하지 않음을 나타내었다(도 5D).

상기 결과는 다량체 α-시누클레인은 본 발명의 ELISA 시스템을 사용하여 감도 및 특이성을 가지고 검출될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.

실시예 14: 티라마이드 시그널 증폭( Tyramide Signal Amplification ; TSA )을 이용한 ELISA 의 감도 증가

ELISA의 감도를 증가시키기 위하여, 본 발명자는 티라마이드 시그널 증폭방법을 적용시켰다. 공지된 ELISA 방법에 아비딘-접합 페록시다아제를 포함하는 배양단계를 적용한 다음, 비오티닐화 티라마이드(Perkin Elmer)를 첨가하였다. 결합한 페록시다아제의 애쥬번트 영역에서 복합적인 티라마이드 증착(deposition) 시그널을 현저히 증가시킴으로써, 검출 감도를 증가시켰다(도 7). TSA 방법은 항체 274 및 62를 사용하여 ELISA 시스템 상에서 테스트하였다. 그 결과, 감도는 도 6A에 도시된 바와 같이 현저히 증가하였다. 분석방법의 낮은 감도는 1 ng/ml 이하 까지로 개선되었다(도 6B).

한국생명공학연구원 KCTC11838BP 20101230 한국생명공학연구원 KCTC11839BP 20101230

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Claims (11)

1. 기탁번호가 KCTC 11838BP인 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고, 면역글로블린 아형이 IgG2a이며, 서열번호 1로 표시되는 21 개의 아미노산 서열을 갖는 인간 α-시누클레인의 C 말단 부분 120 내지 140 번 아미노산 위치에 존재하는 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체를 캡쳐 항체로 이용하되, 상기 캡쳐 항체의 농도는 1 μg/ml이며,
   기탁번호가 KCTC 11839BP인 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고, 면역글로블린 아형이 IgG2a이며, 서열번호 1로 표시되는 21 개의 아미노산 서열을 갖는 인간 α-시누클레인의 C 말단 부분 120 내지 140 번 아미노산 위치에 존재하는 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체를 바이오틴과 결합시켜 리포터 항체로 이용하되, 아비딘-컨쥬게이티드 페록시다아제, 바이오티닐화 티라마이드 용액, 아비딘-컨쥬게이티드 페록시다아제, 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘 용액을 차례로 첨가하여 반응시키는 과정을 포함하는 인간 α-시누클레인을 검출하는 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법.
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