KR101308515B1 - 질편모충 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 질편모충의 검출 방법 - Google Patents
질편모충 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 질편모충의 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 질편모충의 Actin 6을 증폭 대상으로 하는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 질편모충 검출용 프라이머 세트, 이 프라이머 세트를 포함하는 질편모충 검출용 조성물, 상기 조성물을 이용하여 질편모충을 검출하는 방법 및 상기 조성물을 포함하는 질편모충 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명을 이용하는 경우, 짧은 시간 내에 정확한 질편모충 검출이 가능하며, 값비싼 장비 및 기술이 별도로 요구되지 않는바, 질편모충증의 조기 진단에 활용할 수 있을 뿐 아니라 정확한 감염규모를 파악할 수 있어 관련 질병의 대책 마련 및 예방에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 질편모충 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 질편모충의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 질편모충을 검출하기 위하여 제작한 프라이머 세트, 이를 포함하는 질편모충 검출용 조성물, 이 조성물을 이용하여 질편모충을 검출하는 방법 및 이 조성물을 포함하는 질편모충 검출용 키트에 관한 것이다.
질편모충 (Trichomonas vaginalis)은 주로 성적 접촉에 의해 남, 여 사이에서 전염되는 편모충으로 질편모충증을 유발하며 전 세계적으로 가장 널리 확산되어 있는 비 바이러스성 (nonviral) 성매개질환 (sexually transmitted disease; STD)으로 알려져 있다.
우리나라의 경우, 부인과를 찾은 환자의 약 10.4%가 질편모충 감염자인 것으로 밝혀져 있고 최근 미국의 통계자료에 따르면 미국 여성 가운데 매년 5 백만 명이 감염되는 것으로 알려져 있으며 젊은 성인 여자의 2.3% 남자는 1.7%가 감염되어 있는 것으로 보고되어 있다. 그러나 성병이나 출산을 이유로 산부인과를 찾는 여성의 경우는 비율이 더욱 높아 각각 28% 와 34%에 이르는 것으로 보고되어 있다. 최근 연구 결과에 따르면 청소년기의 여성에 있어 질편모충에 의한 질편모충증은 임질보다 더 일반적이며, 때때로 무증상으로 몇 달간 지속되다가 세균질증과 혼돈을 일으키는 것으로 알려져 있다. 질편모충증의 증상은 여성에게는 가려움증, 냄새, 분비물의 증가를 유발하고 남성에게는 요도염의 일반적인 원인으로 성적인 접촉에 의해 전파된다는 정도만 알려져 왔으나 최근 질편모충증이 조기양막파열, 조산, 저체중, 사산, 신생아 사망 등과 남성에게서는 만성전립선염 등과 관계가 있다고 보고되고 있다.
최근에 질편모충에 대한 다양한 진단법이 개발되어 미국을 포함한 여러 국가의 실제 감염규모와 감염으로 인한 심각한 예후가 속속 밝혀지기 시작하면서 주목 받기 시작하였다. 현재 질편모충증의 진단에 사용하고 있는 진단방법은 검출 대상에 따라 크게 원충검출, 항원검출, 유전자검출로 나눌 수 있다. 원충 검출법에는 습식도말법과 배양법이 있고, 항원검출법에는 급속항원 테스트 (Rapid antigen test)가 있고, 유전자 검사법에는 PCR법, 비증폭 RNA 테스트, 전사매개 증폭법(TMA)이 있다. 질편모충증과 관련된 여러 질병들에 대한 이해가 점점 높아감에도 불구하고 아직 국내에서는 습식도말을 통한 현미경 검사와 배양법에 의한 검사를 주로 실시하고 있다. 그러나 현미경 검사법은 감도가 낮고 또한 배양법에 의한 진단은 배양기와 같은 장비와 배양 시작 후 확인하기까지 많은 시간이 많이 걸리기 때문에 정확한 초기 진단이 어려워 적절한 치료시기를 놓치게 쉽다.
아직 국내 질편모충증의 진단에는 습식도말법과 세포진(Pap)을 이용한 현미경 검사를 위주로 실시하고 있다. 습식도말법에 의한 현미경 검사법은 감도와 특이성이 현저히 낮아 선진국에서는 PCR 또는 배양법에 의한 검사를 추가로 실시하고 있으며 새로운 고감도 진단법을 개발하기 위해 많은 노력을 기울이고 있다. 최근 질편모충증을 포함한 각종 성매개질환의 감염이 증가하고 있어 정확한 감염 규모를 파악하고 예방과 대책 마련을 위해 기존의 질편모충 진단법보다 감도가 뛰어나고 특이성이 높은 진단법의 개발은 필수적이다.
특히, PCR을 이용하는 경우, 비싼 장비와 복잡한 조작 및 숙련된 기술이 요구되는 바, 이는 질편모충증의 검출에 장애요인으로 작용할 수 있다.
상기 종래의 문제점을 해결하기 위하여 본 출원의 발명자들은 빠른 시간 내에 적은 양의 시료로도 정확한 질편모충 검출이 가능한 방법의 개발을 위하여 예의 노력한 결과, 질편모충을 검출할 수 있는 프라이머 세트와 이를 이용하여 질편모충을 검출하는 방법을 개발하기에 이르렀다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 질편모충 검출용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 질편모충 검출용 조성물을 제공함에 있다.
또한 본 발명의 또다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 질편모충 검출용 키트를 제공함에 있다.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 이용하여 질편모충을 검출하는 방법을 제공함에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제 1프라이머 쌍;
서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제 2프라이머 쌍; 및
서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제 3프라이머 쌍으로 이루어진 질편모충 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 질편모충 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물에 시료를 혼합하여 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 질편모충 검출 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 서열 증폭은 고리매개등온증폭법일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트 및 이를 포함하는 질편모충 검출용 조성물을 이용하는 경우, 진단의 정확성 및 특이성을 높이며, 진단 시간을 단축시키고 간단한 조작이 가능한 바, 질편모충의 조기 진단에 활용할 수 있을 뿐 아니라 정확한 감염 규모를 파악할 수 있어 관련 질병의 대책 마련 및 예방에 기여할 수 있다.
도 1은 후보 유전자에 대한 질편모충의 LAMP (고리매개등온증폭) 반응 결과를 나타낸 도이다. β-tubulin, TVK, Actin6 각각에 대하여 LAMP용 프라이머를 제작하여 질편모충 genomic DNA 100pg를 이용하여 LAMP 반응을 수행한 결과 Actin 6에서만 반응 산물을 확인하였다.
도 2는 Actin 6 유전자를 증폭대상으로 한 질편모충의 LAMP 반응의 감도를 측정한 결과를 나타낸 도이다. 질편모충의 게놈 DNA를 연속으로 희석한 후 LAMP 반응을 수행한 결과 질편모충의 게놈 DAN가 1pg만 있어도 검출이 가능함을 알 수 있었다.
도 3은 Actin 6 유전자를 타겟으로 한 LAMP 반응 증폭 산물의 실시간 검출 결과를 나타낸 도이다. 반응액 내에서 1pg만 있어도 40분 내에 증폭이 일어남을 확인하였다.
도 4는 LAMP 반응 산물의 전기영동과 제한효소 처리 분석 결과 및 Actin 6 유전자를 표적으로 한 질편모충의 LAMP 반응과 PCR의 검출 감도의 비교 결과를 나타낸 도이다. LAMP 반응에서 Actin 6 유전자가 증폭되었는지를 확인하기 위하여 Actin 6을 절단하는 제한효소 Hind Ⅲ 제한효소를 처리한 결과 예상한 DNA 절편이 관찰되었다. 또한, LAMP와 PCR의 검출 감도를 비교한 결과 PCR의 경우 DNA 농도가 10pg이상일 때 겸출되는 반면 LAMP 반응의 경우 DNA 농도가 1pg (10-12g)만 있어도 검출되는 것을 확인하였다.
도 5는 질편모충의 DNA를 정제까지 상당한 시간이 소요되는 일반적인 방법을 사용하여 분리하지 않고, 단순히 끓여서 확보한 후 DNA를 포함하는 세포용해액에 대한 LAMP 반응과 PCR의 검출 감도의 비교 결과를 나타낸 도이다. 질편모충 102개를 단순히 끓여 준비한 세포용해액에 대해서 LAMP 반응의 경우 102, 101, 100 (1) 개 모두 균일하게 증폭된 반응 양상이 관찰되었으나 기존 PCR 방법의 경우 증폭반응이 매우 희석 정도에 따라 약해져서 100 (1) 개의 경우 양성반응이 매우 미약하게 관찰되었다.
도 6는 질염이 있는 환자 10명을 대상으로 LAMP 반응을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 정확하게 질편모충이 감염된 환자에서만 양성반응이 나타나는 것을 확인하였고 질염을 유발하는 대표적인 곰팡이류인 칸디다균(Candida albicans)와 교차반응이 없는 것을 확인하였다.
도 2는 Actin 6 유전자를 증폭대상으로 한 질편모충의 LAMP 반응의 감도를 측정한 결과를 나타낸 도이다. 질편모충의 게놈 DNA를 연속으로 희석한 후 LAMP 반응을 수행한 결과 질편모충의 게놈 DAN가 1pg만 있어도 검출이 가능함을 알 수 있었다.
도 3은 Actin 6 유전자를 타겟으로 한 LAMP 반응 증폭 산물의 실시간 검출 결과를 나타낸 도이다. 반응액 내에서 1pg만 있어도 40분 내에 증폭이 일어남을 확인하였다.
도 4는 LAMP 반응 산물의 전기영동과 제한효소 처리 분석 결과 및 Actin 6 유전자를 표적으로 한 질편모충의 LAMP 반응과 PCR의 검출 감도의 비교 결과를 나타낸 도이다. LAMP 반응에서 Actin 6 유전자가 증폭되었는지를 확인하기 위하여 Actin 6을 절단하는 제한효소 Hind Ⅲ 제한효소를 처리한 결과 예상한 DNA 절편이 관찰되었다. 또한, LAMP와 PCR의 검출 감도를 비교한 결과 PCR의 경우 DNA 농도가 10pg이상일 때 겸출되는 반면 LAMP 반응의 경우 DNA 농도가 1pg (10-12g)만 있어도 검출되는 것을 확인하였다.
도 5는 질편모충의 DNA를 정제까지 상당한 시간이 소요되는 일반적인 방법을 사용하여 분리하지 않고, 단순히 끓여서 확보한 후 DNA를 포함하는 세포용해액에 대한 LAMP 반응과 PCR의 검출 감도의 비교 결과를 나타낸 도이다. 질편모충 102개를 단순히 끓여 준비한 세포용해액에 대해서 LAMP 반응의 경우 102, 101, 100 (1) 개 모두 균일하게 증폭된 반응 양상이 관찰되었으나 기존 PCR 방법의 경우 증폭반응이 매우 희석 정도에 따라 약해져서 100 (1) 개의 경우 양성반응이 매우 미약하게 관찰되었다.
도 6는 질염이 있는 환자 10명을 대상으로 LAMP 반응을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 정확하게 질편모충이 감염된 환자에서만 양성반응이 나타나는 것을 확인하였고 질염을 유발하는 대표적인 곰팡이류인 칸디다균(Candida albicans)와 교차반응이 없는 것을 확인하였다.
본 발명은
서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제 1프라이머 쌍;
서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제 2프라이머 쌍; 및
서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제 3프라이머 쌍으로 이루어진 질편모충 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
서열번호 1 내지 6의 프라이머 서열정보는 아래와 같다.
| 프라이머이름 |
서열정보 |
|
| TvA6-F3 |
5'-GCTTCTCACAGAGCGTGG-3' | 서열번호1 |
| TvA6-B3 | 5'-GCTCATTGCCGATTGTGATG-3' | 서열번호2 |
| TvA6-FIP |
5'-AGGGCGACATAGCAAAGCTTCTGCTTTCAACACAACAGCCG-3' | 서열번호3 |
| TvA6-BIP |
5'-TGCTGAAATGGAGAAGGCCGCCGTTGCCATCTGGAAGTGTG-3' | 서열번호4 |
| TvA6-LF | 5'-CTTGATGTCACGAACGATTTCCTTT-3' | 서열번호5 |
| TvA6-LB | 5'-TACAGACTCCTCCATCAACGT-3' | 서열번호6 |
서열번호1의 TvA6-F3는 Trichomonas vaginalis Actin 6 - forward outer pimer,
서열번호2의 TvA6-B3는 Trichomonas vaginalis Actin 6 - backward outer pimer,
서열번호3의 TvA6-FIP는 Trichomonas vaginalis Actin 6 - forward internal primer,
서열번호4의 TvA6-BIP는 Trichomonas vaginalis Actin 6 - backward internal primer,
서열번호5의 TvA6-LF는 Trichomonas vaginalis Actin 6 - loop forward primer,
서열번호6의 TvA6-LB는 Trichomonas vaginalis Actin 6 - loop backward primer,
를 의미한다.
본원 발명에서 사용하는 용어인 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphosphate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본원 발명에서 사용하는 용어인 “검출”은 시료에서 다른 미생물뿐만 아니라 동종의 트리코모나스종에서 Trichomonas vaginalis를 분리하여 식별할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 증폭 대상이 되는 질편모충의 Actin 6의 유전자 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 유전자 데이터베이스에 공개된 Trichomonas vaginalis Actin type 6의 DNA 염기서열 가운데 등온고리매개증폭법 (LAMP) 프라이머 디자인 소프트웨어인 PreimerExplorer을 이용하여 프라이머쌍을 디자인하였다. Genbank accession number AF237734에서 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 질편모충 검출용 조성물을 제공한다.
질편모충 검출용 조성물에는 상기의 프라이머 세트 이외에, 중합효소, Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP을 포함할 수 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본원 발명의 6개의 프라이머 세트는 DNA를 증폭시킬 수 있는 고리매개등온증폭 (Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP) 반응 방법에만 이용될 수 있다. 6개의 프라이머 세트 중 2개(F3-forward outer primer, B3-backward outer primer)만 일반 PCR에 사용할 수 있다.
본 발명에서의 고리매개등온증폭이란 기존의 PCR법과 유사하지만 기존의 PCR법이 변성(denaturation), 접합(annealing), 신장(extension) 세 가지 단계를 거치면서 온도의 변화를 주어야 하는 반면, 등온증폭법은 일정한 온도에서 변성, 접합 및 신장이 가능하다. 고리매개등온증폭에서는 특히 Bst . DNA polymerase를 사용하며, 이 Bst . DNA polymerase는 일반 PCR의 Taq . DNA polymerase와는 달리 helicase의 성격을 가지고 있어 DNA의 이중나선 구조를 열에 의한 변성을 거치지 않고 Tm 값에 가까운 접합 온도에서 변성, 접합 및 신장이 수행된다. ( http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_stearothermophilus 참고)
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 질편모충 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 당업계에 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물에 시료를 혼합하여 염기 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 질편모충 검출 방법을 제공하며,
질편모충의 검출 방법의 예로는 1)상기 프라이머를 포함하는 조성물과 시료를 혼합하는 단계, 2)상기 혼합물에 대하여 DNA 서열 증폭 방법을 이용하여 서열을 증폭하는 단계, 및 3)상기 증폭물을 측정하는 단계로 이루어 질 수 있다.
본 발명의 시료로는 여성의 자궁경부, 항문 인후의 분비액에서 채취하거나, 남성의 경우 요도 분비물, 전립선액, 인후, 항문의 분비액에서 채취할 수 있으며, 그 범위를 제한하지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
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실시예1
> 시료 및 방법
1-1: 질편모충으로부터 게놈
DNA
의 분리
배양하고 있는 질편모충을 PBS로 세척한 후 DNeasy DNA purification kit (Qiagen company)를 이용하여 게놈 DNA를 순수 분리하였다. 이렇게 분리된 게놈 DNA를 고리매개등온증폭 (LAMP)법에 이용하였으며 동일한 게놈 DNA를 이용하여 PCR법과의 감도 및 특이성 비교실험과 교차반응 확인실험을 수행하였다.
1-2: 설계한 3개의
프라이머
세트를 이용한
고리매개등온증폭(LAMP)법
고리매개등온증폭에 사용할 각기 다른 유전자에 대해 3 종류(TVK, Actin 6, β-tubulin)의 프라이머 세트를 설계한 후 탈염 (desalting) 또는 HPLC 칼럼(column)으로 정제하여 사용하였다(도1). 질편모충으로부터 추출한 1μl의 게놈 DNA에 12.5μl의 고리매개등온증폭(LAMP) 반응혼합물 (40mM Tris-HCl, pH 8.8, 20 mM KCl, 16mM MgSO4, 20mM (NH4)2SO4, 0.2% Tween 20, 1.6M Betaine, 2.8mM dNTP)과 1μl(8 units) Bst DNA polymerase, 1.3μl 프라이머 혼합액을 첨가한 후 9.2μl의 증류수를 가하여 최종 부피가 25μl가 되도록 하였다. 프라이머 혼합액은 설계한 5개 프라이머 세트의 각각을 구성하는 6개의 프라이머 (F3, B3, FIP, BIP, LF, BF)를 조금씩 다른 농도로 혼합하여 사용하였다. 우선 F3 프라이머 (1번)와 B3 프라이머 (2번)를 최종농도가 각각 0.2μM이 되도록 하고 FIP 프라이머 (3번)와 BIP 프라이머 (4번)를 각각 최종농도가 1.6μM, LF 프라이머 (5번)와 LB 프라이머 (6번)를 각각 최종농도가 0.8μM이 되도록 혼합하여 만들었다. 이렇게 만들어진 반응용액을 실시간 항온탁도측정기를 사용하여 64 ℃ 1 시간 동안 반응한 후 80℃에서 2분간 두어 반응을 종료한 다음 LAMP 반응의 증폭 산물을 확인하였다. 실시간 탁도 그래프 외에도 1.5 % 한천젤(agarose gel)에서 전기영동을 실시하고 브롬화 에티듐 (ethidium bromide)용액을 가하여 자외선에서 관찰하였다.
1-3: 선택된
프라이머
세트를 이용한
고리매개등온증폭(LAMP)법
질편모충 검출을 위한 고리매개등온증폭(LAMP)법에 사용하는 반응액은 최종 부피 25μl내에 8 U Bst DNA polymerase, 1.4mM dNTP혼합액, 0.8M Betaine, 20mM Tris-HCl (pH 8.8), 10mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 8mM MgSO4, 0.1 % Tween-20, 0.2μM TvA6-F3 (1번) 및 TvA6-B3 (2번) 프라이머, 1.6μM TvA6-FIP (3번) 및 TvA6-BIP (4번) 프라이머, 0.8μM TvA6-LF (5번) 및 TvA6-LB (6번)이 되도록 혼합하고 여기에 질편포충의 게놈 DNA를 혼합하여 제작하였다. 이렇게 완성된 반응액을 64℃에서 60분간 처리한 후 결과를 확인하였다.
<
실시예2
> 증폭 후보유전자의 선택
등온증폭반응 (LAMP)의 증폭 후보 유전자를 발굴하기 위하여 질편모충의 게놈 DNA 전체를 검토한 결과, 종간 보존성이 높은 유전자인 TVK, Actin 6, β-tubulin을 선택하여 LAMP 프라이머를 제작하였다. 각각의 프라이머와 질편모충 게놈 DNA 100pg을 이용하여 64℃에서 60분간 LAMP반응을 수행한 결과 Actin 6에서만 반응 산물을 확인하였다 (도1참조).
<
실시예3
>
고리매개등온증폭방법의
감도 측정
표1의 Actin 6에 대한 LAMP용 프라이머를 이용하여 감도 측정을 수행하였다. 질편모충 게놈 DNA를 10배씩 연속적으로 희석한 후 LAMP반응을 수행한 결과, 질편모충 게놈 DNA가 1pg만 있어도 검출이 가능한 것을 확인하였다 (도2참조).
<
실시예
4>
고리매개등온증폭방법에서의
증폭 시간 측정
질편모충 게놈 DNA를 단계 희석한 시료에 대하여 실시간 항온탁도측정기를 사용하여 LAMP반응의 증폭 산물을 확인하였다. 그 결과 반응액 내에서 질편모충 게놈 DNA가 1pg만 존재하여도 40분 내에 증폭이 일어나는 것을 확인하였다 (도3참조).
<
실시예
5>
증폭산물의
확인
전기영동 결과 확인된 사다리형 LAMP 증폭산물이 Actin 6 유전자를 표적으로 특이적으로 증폭된 반응산물인지를 확인하기 위해, 제한효소처리에 따른 분석(restriction enzyme analysis)을 수행하였다. 도 4에서 나타난 바와 같이, 질편모충 LAMP 반응산물을 Actin 6 유전자내에 절단 부위를 가지는 Hind III 제한효소를 처리하였을 때 예상되었던 DNA 단편이 관찰되었으며, 이 결과부터 LAMP 반응 산물은 Actin 6 유전자를 표적으로 증폭되었음을 확인할 수 있었다.
<
실시예
6>
고리매개등온증폭법과
PCR
의 감도 비교
LAMP반응과 PCR의 검출 감도를 비교하기 위하여 질편모충의 게놈 DNA를 연속 희석한 시료에 대하여 LAMP와 PCR을 수행하였다. PCR에 사용하는 프라이머 세트는 LAMP assay에 사용한 TvA6-F3 프라이머와 TvA6-B3 프라이머를 사용하였다. 질편모충으로부터 추출한 1μl 의 게놈 DNA에 2μl의 PCR 반응 혼합물 (100mM Tris-HCl, pH 8.3, 500mM KCl, 20mM MgCl2, enhancer solution)과 1μl 2.5mM dNTP, 0.2μl (1 unit) i-TaqTM DNA polymerse (Intron, Korea), 1μl F3 primer, 1μl B3 primer을 첨가한 후 13.8μl의 증류수를 가하여 최종 부피가 20μl가 되도록 하였다. 반응용액을 94 ℃에서 5 분간 전배양 (pre-incubation) 한 후 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초씩 35회 반복한 후 72℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1.5% 겔에서 전기영동을 실시하고 브롬화 에티듐 (ethidium bromide)용액을 가하여 자외선에서 관찰하였다.
그 결과, PCR의 경우 DNA 농도가 10pg 이상일 때 검출되는 반면 LAMP assay의 경우는 1pg (10-12g)만 있어도 검출되는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 실제 LAMP 반응이 PCR보다 10배 높은 감도를 보여주고 있다 (도4 참조).
<
실시예
7>
고리매개등온증폭법과
PCR
의 세포
용해물에
대한 감도 비교
질편모충의 DNA를 정제까지 상당한 시간에 소요되는 일반적인 방법을 사용하여 분리하지 않고 단순히 끓여서 확보한 후 DNA를 포함하는 세포용해액에 대한 LAMP 반응과 PCR의 검출 감도를 비교하였다 그 결과, 질편모충 102 개를 단순히 끓여 준비한 세포용해액에 대해서 LAMP 반응의 경우 102, 101, 100 (1) 개 모두 균일하게 증폭된 반응 양상이 관찰되었으나 기존 PCR 방법의 경우 증폭반응이 매우 희석 정도에 따라 약해져서 100 (1) 개의 경우 양성반응이 매우 미약하게 관찰되었다 (도 5참조)
<
실시예
8>
고리매개등온증폭법을
이용하여
질염환자에서
질편모충 검출 및 교차반응 확인
10명의 질염 환자 임상시료 (질분비물)를 대상으로 질편모충 Actin 6 유전자를 표적으로 하는 LAMP 반응을 실시하였다. 질편모충질염의 확진을 위해 배양법에 의한 검사를 병행하였다. 이와 아울러 대표적인 다른 질염의 원인균인 칸디다균(Candida albicans -Ca)을 대상으로한 교차반응 실험을 수행하였다. 질염환자의 질분비물을 DNeasy DNA purification kit (Qiagen company)를 이용하여 게놈 DNA를 순수 분리하였고 분리된 1μl의 게놈 DNA에 고리매개등온증폭(LAMP)과 Bst DNA polymerase, 프라이머 혼합액을 첨가하여 반응 용액을 만들었다. 이렇게 만들어진 반응용액을 실시간 항온탁도측정기를 사용하여 LAMP 반응의 증폭 산물을 확인하였다.
표2와 도6에 나타난 바와 같이, 10명의 질염환자로부터 질편모충 Actin 6 유전자를 표적으로 하는 LAMP 반응에서 30분내에 양성 반응이 관찰되었으며, 이들 환자 모두 3-4일 경과 후 배양액에서 질편모충이 증식하고 있는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 질편모충 Actin 6 유전자를 표적으로 하는 LAMP 반응이 매우 정확하며 신속하게 (30분이내) 질편모충을 검출할 수 있음을 나타내었으며, 또한 다른 질염 원인균인 칸디다와 교차반응이 없다는 것을 나타내었다. 따라서 질편모충 Actin 6 유전자를 표적으로 하는 LAMP 반응은 신속하고 감도 높은 진단법으로 여성의 질편모충 질염뿐 아니라 현재까지 검출이 매우 어려운 것으로 알려진 질편모충에 의한 남성의 요도염과 전립선염 진단에도 활용할 수 있어 정확한 진단, 치료 및 예방과 감염 확산에 대한 대책 마련에 활용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (8)
- 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제 1프라이머 쌍;
서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제 2프라이머 쌍; 및
서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제 3프라이머 쌍으로 이루어진 질편모충 검출용 프라이머 세트.
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 질편모충 검출용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 고리매개등온증폭용인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제2항 또는 제3항의 조성물을 포함하는 질편모충 검출용 키트.
- 제2항 또는 제3항의 조성물에 시료를 혼합하여 염기서열을 증폭하는 단계를 포함하는 질편모충의 검출 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 방법은 1)상기 프라이머를 포함하는 조성물과 시료를 혼합하는 단계, 2)상기 혼합물에 대하여 DNA 서열 증폭 방법을 이용하여 서열을 증폭하는 단계, 및 3)상기 증폭물을 측정하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 질편모충의 검출 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 서열 증폭은 고리매개등온증폭법을 이용하는 것을 특징으로하는, 질편모충의 검출 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 시료는 여성의 자궁경부, 항문 인후의 분비액, 남성의 요도 분비물 전립선액, 인후 및 항문의 분비액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 질편모충의 검출 방법.
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| KR1020120030041A KR101308515B1 (ko) | 2012-03-23 | 2012-03-23 | 질편모충 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 질편모충의 검출 방법 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101552159B1 (ko) | 2015-03-10 | 2015-09-10 | 경기대학교 산학협력단 | 고리-매개 등온 증폭법을 이용한 진균성 질병 검출 방법 |
| CN109034114A (zh) * | 2018-08-22 | 2018-12-18 | 上海掌门科技有限公司 | 一种耳诊方法、设备、系统及计算机可读介质 |
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2012
- 2012-03-23 KR KR1020120030041A patent/KR101308515B1/ko active Active
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